Optimização do Teor Lipídico da Dieta de Juvenis de Linguado (Solea senegalensis)

Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Mestrado em Controlo de Qualidade Optimização do Teor Lipídico da Dieta de Juvenis de Linguado (Solea senegalensis) Pedro Alexandre Coelho Borges Dezembro de 2008 Mestrado em Controlo de Qualidade 2008 Faculdade de Farmácia Optimização do Teor Lipídico da Dieta de Juvenis de Linguado (Solea senegalensis) Área: Água e Alimentos Orientadora: Prof. Doutora Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira Co-orientadora: Prof. Doutora Luísa Maria Pinheiro Valente i ÍNDICE Abreviaturas iii Agradecimentos iv Abstract v Resumo vi Índice de Tabelas e Figuras vii I - Revisão Bibliográfica 1 1 - INTRODUÇÃO 2 2 - MACRONUTRIENTES E SUA UTILIZAÇÃO 6 3 - LÍPIDOS 11 4 - ÁCIDOS GORDOS 13 4.1 - BIOSSÍNTESE E CONVERSÃO DE ÁCIDOS GORDOS 16 4.2 - ÁCIDOS GORDOS E DIETAS ENERGÉTICAS 20 5 - DEPOSIÇÃO E BIOSSÍNTESE LIPÍDICA NOS PEIXES 23 II – Parte Experimental 30 1 – INTRODUÇÃO 31 2 – BIOLOGIA DA ESPÉCIE 33 3 – MATERIAL E MÉTODOS 35 3.1 – DIETAS EXPERIMENTAIS 35 3.2 – ENSAIO DE CRESCIMENTO 36 3.3 – ANÁLISES QUÍMICAS 37 ii 3.4 – ANÁLISE ESTATÍSTICA 39 4 - RESULTADOS 40 5 – DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 45 III – Referências Bibliográficas 52 IV - Anexos 61 Anexo I – Determinação do Teor de Matéria Seca 61 Anexo II – Determinação da Energia Bruta 62 iii Abreviaturas AA – Ácido araquidónico ACoAC - Acetil-CoA carboxilase ATP – Adenosina trifosfato DHA – Ácido docosahexaenóico EFA – Ácido gordo essencial EPA – Ácido eicosapentaenóico FAME - Éster metílico de ácido gordo FAO – Food and Agriculture Organization FAS – Ácido gordo sintetase FID - Detector de ionização de chama FIT – Fat-inducing transcript G6P – Glicose-6-fosfato G6PD – Glicose-6-fosfato desidrogenase HDL – Lipoproteínas de elevada densidade HUFA – Ácido gordo altamente insaturado LN – Ácido linoleico LDL - Lipoproteínas de baixa densidade LNA – Ácido linolénico ME – Enzima málica MS – Matéria seca MUFA – Ácido gordo monoinsaturado NADPH – Fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido PUFA – Ácido gordo polinsaturado SFA – Ácido gordo saturado iv TAG – Triacilglicerol VLDL – Lipoproteínas de muito baixa densidade v Agradecimentos À Prof.ª Doutora Beatriz Oliveira, pela disponibilidade, orientação e sempre bom humor com que acompanhou todo o meu trabalho. À Prof.ª Doutora Luísa Valente, a co-orientadora deste trabalho, que já me conhece há alguns anos e desde então tem vindo a ajudar-me a apurar o sentido crítico e, principalmente, a organização. À Prof.ª Doutora Susana Casal, que com os seus conhecimentos e disponibilidade possibilitou a realização de parte deste trabalho. Às minhas amigas “laboratoriais”, as futuras doutoradas Cláudia e Joana e as mestrandas Sílvia e Catarina, que merecem uma especial menção, uma vez que esta tese é fruto da nossa convivência e trabalho. Durante este tempo sempre me apoiaram e tornaram os longos serões de trabalho muito mais agradáveis e fáceis, com a sua boa disposição. À minha família, que me apoiou sempre nas minhas escolhas. A todos os meus amigos que, sem saber, são parte essencial para eu me manter focado nos meus objectivos. À minha namorada, que sempre me apoiou e ajudou quando precisava. vi Abstract Over the last years, several aspects of Senegalese sole culture have been developed and optimized but dietary lipid level for optimal growth has never been determined. Hence, five isonitrogenous diets (56% dietary protein) with increasing dietary lipid levels (4, 8, 12, 16 and 20% DM) were fed to satiation to triplicate groups of 20 fish (mean initial weight of 10g). Fifteen tanks were randomly assigned one of the five diets. Feed was distributed using automatic feeders, and fish were fed over a 16-weeks period. At the end of the experiment fish fed on diets containing the two lowest dietary lipid levels (4 and 8%) showed a 3-fold body weight increase with significantly higher daily growth index than fish fed higher lipid levels (1.2 vs 0.8). Moreover, these fish displayed a significantly lower dry feed intake (12g/kg/day) and feed conversion ratio (1.0) compared to fish fed higher lipids levels (16-19g/kg/day and 2.0, respectively). Low dietary lipid levels (<12%) significantly improved nutrient retention and gain and hence growth, without major effects on whole body composition. Despite the slight alteration in n-3 PUFA muscle content in the fish fed low fat diets, this fish fed low dietary lipid still remains a rich n-3 PUFA product and generally maintained its nutritional value. These results evidenced a low lipid tolerance of Senegalese sole juveniles and suggest a maximal dietary inclusion level of 8% lipids for both optimal growth and nutrient utilization without compromising flesh quality. vii Resumo Nestes últimos anos, diversos aspectos do cultivo do linguado (Solea senegalensis) têm vindo a ser melhorados, mas o teor de lípidos ideal nunca foi testado para esta espécie. Neste trabalho, cinco dietas isoproteicas (56% MS) com diferentes teores lipídicos (4, 8, 12, 16 e 20% MS) foram distribuídas add libitum por grupos em triplicado de 20 peixes (peso médio inicial de 10g) que foram distribuídos aleatoriamente por quinze tanques. O alimento foi distribuído usando alimentadores automáticos durante um período de cerca de 16 semanas. No fim do ensaio, os peixes alimentados com as dietas com os teores mais baixos de lípidos (4 e 8% de lípidos) demonstraram um peso final três vezes superior ao inicial e uma taxa de crescimento diária significativamente superior à dos peixes alimentados com as dietas com teores lipídicos superiores (1,2 vs 0,8). Adicionalmente, estes peixes mostraram um consumo de matéria seca e uma conversão alimentar (12g/kg/dia e 1.0) inferior aos peixes alimentados com dietas com teores lipídicos superiores ou iguais a 12% (16-19g/kg/dia e 2.0, respectivamente) As dietas com os níveis lipídicos mais baixos (<12%) melhoraram significativamente a retenção e ganho de nutrientes e, consequentemente, o crescimento, sem provocar efeitos na composição corporal. Apesar da pequena alteração do teor de n-3 PUFA no músculo dos peixes alimentados com as dietas de baixo teor lipídico, este peixe mantém a sua qualidade nutricional e continua a ser um produto rico em n-3 PUFA. Estes resultados evidenciam uma baixa tolerância lipídica dos juvenis do linguado (Solea senegalensis) e sugerem uma inclusão máxima de 8% de lípidos na dieta para maximizar o crescimento sem comprometer a qualidade final do pescado. I - Revisão Bibliográfica 6 2 – MACRONUTRIENTES E SUA UTILIZAÇÃO A forma como os peixes utilizam os nutrientes está directamente relacionada com factores como a espécie, fase de desenvolvimento, sexo e estadio de maturação sexual, temperatura da água, frequência de alimentação e qualidade da dieta. Os nutrientes podem ser classificados em macronutrientes, dos quais fazem parte as proteínas, os lípidos e os hidratos de carbono, e micronutrientes, onde se incluem as vitaminas e os minerais. Todos os animais necessitam de energia e é através da metabolização destes macronutrientes da dieta que a obtêm. As proteínas são usadas, essencialmente, para a produção de novas proteínas (crescimento e reprodução) ou para substituição de outras já existentes (manutenção). Contudo, quando em excesso, podem ser utilizadas para fins energéticos (oxidação) (Wilson et al., 2002). As proteínas são os principais componentes dos tecidos do peixe, representando cerca de 65–75% do peso corporal, expresso em matéria seca. A proteína é digerida para obtenção dos aminoácidos, que são absorvidos no tracto intestinal e usados para os fins acima descritos. Os peixes não necessitam, propriamente, de proteína no seu sentido mais lato, mas sim de uma mistura equilibrada de aminoácidos. Grande parte dos trabalhos usam dietas semi-purificadas ou purificadas para estimar as necessidades proteicas brutas, onde, através de uma curva dose-resposta se estima a quantidade mínima de proteína necessária para obter o crescimento máximo (Wilson e Halver, 1986). Os peixes em geral, e os carnívoros em particular, têm necessidades proteicas muito superiores às dos mamíferos ou das aves (Cowey e Sargent, 1972). Esta observação levou a que muitos investigadores sugerissem que a eficiência de utilização da proteína seria menor nos peixes do que noutros vertebrados. Contudo, Tacon e Cowey (1985) verificaram que estes requisitos, quando expressos relativamente ao consumo e tamanho (g I - Revisão Bibliográfica 7 proteína/kg peso corporal/dia) eram similares. Como referido anteriormente, o perfil de aminoácidos deverá ser adequado para obter um crescimento óptimo. De forma a saber quais os aminoácidos indispensáveis e os dispensáveis, podem ser feitos ensaios para determinar os requisitos de aminoácidos, de um ponto de vista qualitativo. Num dos primeiros trabalhos realizados nesta área (Halver, 1957) compararam-se dietas com 70% de aminoácidos cristalinos, baseando-se no perfil de aminoácidos da proteína do ovo de galinha, proteína do ovo de salmão real (Oncorhynchus tshawytscha) e proteína do saco vitelino de salmão real. A dieta baseada na proteína de ovo de galinha foi a que promoveu um maior crescimento e eficiência alimentar sendo, por isso, usada como dieta controlo para estabelecer o requisito qualitativo de aminoácidos para o salmão real (Halver et al., 1959). Foram determinados, de entre os 18 aminoácidos mais comuns, quais os essenciais, comparando as taxas de crescimento de peixes alimentados com a dieta controlo e as dietas deficientes apenas num dos dezoito aminoácidos. Depois deste trabalho inovador, outros autores, utilizando o método aqui descrito, estabeleceram os requisitos para outras espécies (Wilson e Halver, 1986) e identificaram os mesmos 10 aminoácidos considerados indispensáveis para a maior parte dos animais: arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina. Os lípidos e os hidratos de carbono são, preferencialmente, usados por qualquer animal para fins energéticos. Os hidratos de carbono, apesar de serem uma fonte de energia relativamente fácil de utilizar, como o amido, não são muito utilizados pelos peixes, principalmente os marinhos, que são maioritariamente carnívoros. O amido é um polímero de açúcares simples, com ligações α-glicosídicas entre si, não sendo preciso um grande número de enzimas para a sua transformação em monómeros simples. As proteínas, por sua vez, são normalmente constituídas por cerca de 20 aminoácidos, sendo preciso uma grande diversidade de proteases específicas para reconhecer ligações entre diferentes I - Revisão Bibliográfica 8 aminoácidos. Tendo isto em conta, seria de esperar que os hidratos de carbono fossem utilizados preferencialmente como fonte de energia. Contudo, a explicação para a sua fraca utilização por parte dos peixes marinhos é bastante simples: milhares de anos num ambiente pobre em hidratos de carbono e hábitos alimentares maioritariamente carnívoros levaram a que este nutriente não fosse devidamente aproveitado. A anatomia do tracto intestinal dos peixes evoluiu segundo o tipo de regime alimentar para optimizar a ingestão, digestão e assimilação dos nutrientes (Rust et al., 2002). A alimentação dos peixes herbívoros é constituída, essencialmente, por fontes vegetais; nos omnívoros a sua alimentação é uma mistura de fontes vegetais e animais. Um peixe carnívoro consome fontes animais, consumindo raramente ou nunca fontes vegetais directamente e por isso mesmo tem uma dieta muito menos variada que a de um herbívoro ou de um omnívoro. Por outro lado, a densidade nutricional dos alimentos ingeridos é muito maior, necessitando de ingerir uma quantidade inferior para obter a mesma quantidade de nutrientes que um herbívoro ou um omnívoro. Tal como em mamíferos, o tipo de regime alimentar levou a uma diferenciação, quer a nível anatómico quer a nível enzimático que, consequentemente, leva a uma diferente utilização dos nutrientes, em especial dos hidratos de carbono. Em peixes, parece não haver nenhum requisito em hidratos de carbono (Wilson, 1994; Stone, 2003). Diversos autores constataram, após a ingestão de hidratos de carbono, que uma grande parte das espécies era intolerante à glicose, principalmente as carnívoras, as mais apreciadas pelos consumidores. Testes de glicose intraperitoniais e orais demonstraram que os peixes herbívoros e omnívoros são mais eficientes na utilização da glicose do que os peixes carnívoros (Stone, 2003). Quando alimentados com uma composição superior a 10% de hidratos de carbono digeríveis na dieta, diversas espécies carnívoras exibem sintomas semelhantes a animais diabéticos, não conseguindo regular a concentração de glicose no sangue (Wilson et al., 1994). Adicionalmente, verificou-se que I - Revisão Bibliográfica 9 níveis superiores a 10% resultavam em hiperglicemia, tamanho aumentado do fígado e do teor em glicogénio em truta arco-íris e salmão Atlântico (Brauge et al., 1994; Hauler, 1995). De facto, devido a estas constatações, inicialmente pensou-se que os peixes não tinham a capacidade de sintetizar insulina ou que os seus níveis seriam tão baixos que não seriam capazes de regular a concentração de glicose no sangue (Palmer e Ryman, 1972); a insulina e o glucagão são duas hormonas chave na regulação dos níveis plasmáticos de glicose (Mommsen, 2000; Hemre et al., 2002). Contudo, com o aparecimento de técnicas radioimunológicas, verificou-se que alguns peixes tinham valores em jejum idênticos aos de humanos (Stone, 2003). Apesar da existência de insulina a sua ordem de grandeza, em termos de actividade e quantidade, é bem distinta para diversas espécies, quando comparada com os valores de humanos, quer em níveis de jejum como pós-alimentação. Contudo, uma das explicações para a fraca utilização da glicose e a intolerância observada em algumas espécies parece residir nos transportadores de glicose. Em mamíferos, existem diversos tipos de transportadores de glicose no músculo, sendo dois dos principais o GLUT-1 e GLUT-4: o GLUT-1 facilita a entrada da glicose independentemente da acção da insulina; o GLUT-4 é dependente da acção da insulina para a entrada de glicose e é o responsável pelo efeito hipoglicémico em mamíferos (Wright et al. 2000). Este último, segundo alguns estudos, parece não existir em peixes (Stone, 2003). Também se deve ter em consideração as propriedades físicas e a complexidade molecular dos hidratos de carbono. Conforme a fonte, a sua utilização é variável. Em dietas para peixe a principal fonte de hidratos de carbono é, normalmente, o amido proveniente, essencialmente, de fontes vegetais. Dependendo da fonte (trigo, centeio, batata) a estrutura do amido é diferente, podendo alterar a sua disponibilidade (Stone, 2003). I - Revisão Bibliográfica 10 Aparentemente, o uso de hidratos de carbono como fonte energética para poupança de proteína parece ser uma opção no caso de peixes herbívoros ou omnívoros (Stone, 2003). A fraca utilização dos hidratos de carbono dietéticos pelos peixes carnívoros sugere que a formulação das suas dietas deve ter, como principal fonte energética, os lípidos. Como consequência, as dietas para peixes carnívoros serão sempre mais dispendiosas do que para peixes omnívoros ou herbívoros. I - Revisão Bibliográfica 11 3 - LÍPIDOS Os lípidos são, sem sombra de dúvida, as biomoléculas mais estudadas, sendo a sua importância e função muito frequentemente debatida em artigos científicos e conferências, no âmbito da nutrição de peixes. Este facto pode levar a pensar que estes são os nutrientes mais importantes e sobre os que mais se sabe. No entanto, sabe-se menos sobre as necessidades nutricionais em lípidos no peixe, ou mesmo de outro animal, do que qualquer dos outros nutrientes, daí haver tanta investigação na temática dos lípidos (Sargent et al., 2002). Podem enquadrar-se diversas moléculas naquilo a que se chama lípidos. Quimicamente, os lípidos são biomoléculas orgânicas formadas basicamente por carbono, hidrogénio e oxigénio, embora este numa percentagem muito mais baixa. Para além destes elementos, podem conter fósforo, azoto e enxofre. É um grupo de substâncias muito heterogéneas com apenas duas características em comum: 1 – São insolúveis ou parcialmente solúveis em água 2 – São solubilizadas em solventes orgânicos, como éter, clorofórmio, benzeno, etc. Os lípidos desempenham funções biológicas de extrema importância, quer a nível estrutural (membranas celulares), quer como reserva energética (gordura corporal). Podem ainda, entre outras funções, funcionar como mensageiros (hormonas). À semelhança do que acontece nos vertebrados superiores, também as principais classes de lípidos nos peixes são os triacilgliceróis (TAG), lípidos de armazenamento, e os fosfolípidos constituintes das membranas celulares (Figura 2). I - Revisão Bibliográfica 12 Os TAG são triésteres de glicerol e de três ácidos gordos, enquanto os fosfolípidos são ésteres de dois ácidos gordos e de um ácido fosfórico, associado a outro álcool (geralmente etanolamina, colina, serina ou inositol) por uma ligação diéster (Nelson e Cox, 2000). Os TAG constituem as principais reservas lipídicas nos peixes. Desta forma, a energia armazenada é menos susceptível à oxidação do que os hidratos de carbono ou as proteínas (De Silva e Anderson, 1995). Nas espécies marinhas podem-se ainda encontrar outras classes de lípidos, nomeadamente as ceras e os esteróis, onde o colesterol é, sem dúvida, o mais representativo e ao qual se atribui maior importância devido às suas funções biológicas (Sargent et al., 2002). Figura 2 – Principais classes de lípidos, excluindo os esteróis (adaptado de Nelson e Cox, 2000) Triacilgliceróis Lípidos de Membrana (polares) Fosfolípidos Glicolípidos Esfingolípidos Glicerofosfolípidos Esfingolípidos Lípidos de Armazenamento (neutros) I - Revisão Bibliográfica 13 4 – ÁCIDOS GORDOS Com a excepção do colesterol, todas as restantes classes lipídicas referidas contêm ácidos gordos, esterificados com um grupo álcool, como no caso dos glicéridos, e com o grupo amina, no caso dos esfingolípidos. Os ácidos gordos são designados com base no comprimento das suas cadeias carbonadas, grau de insaturação (número de ligações duplas) e pela posição das ligações duplas. Logo, C14:0 e C16:0 designam ácidos gordos com 14 e 16 carbonos, respectivamente, e sem ligações duplas. O primeiro número é referente ao número de carbonos que constituem a cadeia carbonada do ácido gordo, sendo o seguinte referente ao número de ligações duplas existentes. Quando há ligações duplas, elas são assinaladas utilizando-se dois tipos de nomenclatura distinta. O termo C18:1n-7 designa um ácido gordo com 18 carbonos cuja ligação dupla se encontra no carbono nº 7 a contar do grupo metilo da molécula. A designação C18:1 ∆ 11 representa o mesmo ácido gordo, mas neste tipo de nomenclatura, as ligações duplas são assinaladas por ∆, sendo a posição da ligação dupla contada a partir do carbono do grupo carboxilo. Ao longo deste trabalho será adoptada a primeira nomenclatura (contagem das ligações a partir do carbono do grupo metilo). Nos PUFA, com duas ou mais ligações, geralmente numa configuração cis, as ligações duplas são interrompidas por um CH 2 (Figura 3). Logo, ao especificar a posição da primeira ligação dupla toda a restante estrutura fica definida e apenas para as formas conjugadas esta regra não se aplica. Por vezes, na literatura podem ser encontradas designações diferentes para certos ácidos gordos. Geralmente, esses nomes reflectem a origem desses ácidos gordos, tal como Figura 3 – Ácido gordo polinsaturado I - Revisão Bibliográfica 14 o ácido palmítico (C16:0), que é abundante no óleo de palma, ou o ácido oleico (C18:1n-9) que pode ser encontrado abundantemente no azeite. Também podem ser encontrados na literatura nomes greco-latinos mais formalizados, tais como ácido eicosapentaenóico (EPA, C20:5n-3) e docosahexaenóico (DHA, C22:6n-3), reflectindo estas designações o número de carbonos (20 e 22) e de ligações duplas (5 e 6). De acordo com o número de ligações duplas que possuem, os ácidos gordos podem classificar-se em ácidos gordos saturados (SFA; sem ligações duplas), monoinsaturados (MUFA; apenas com uma ligação dupla), PUFA (2 a 6 ligações duplas), ou então altamente insaturados (HUFA). Este último é um termo mais usado em aquicultura, não havendo uma clara definição do termo, embora, segundo Sargent et al. (2002), possam ser definidos como ácidos gordos com cadeias carbonadas de 20 ou mais carbonos e com mais de duas ligações duplas. Os SFA estão naturalmente presentes em todas as gorduras animais e possuem cadeias carbonadas com 14 a 24 carbonos. São bastante abundantes nas membranas celulares, principalmente o ácido palmítico (C16:0), representado na Figura 4, esteárico (C18:0) e, em menor quantidade, araquídico (C20:0). COOH À semelhança dos SFA, os MUFA são encontrados naturalmente em todos os animais, possuindo cadeias carbonadas com cerca de 14 a 24 carbonos. Igualmente, surgem com maior frequência nas membranas celulares com cadeias carbonadas de C16, C18 e, em menor extensão, C20 (Figura 5). Figura 4 – Ácido palmítico I - Revisão Bibliográfica 15 HOOC Os PUFA podem ser encontrados em grande número em organismos marinhos, principalmente algas. Estes PUFA são geralmente da série n-3, contudo representantes da série n-6 e n-9 também podem ser encontrados. Nos peixes, os PUFA importantes são o ácido araquidónico (AA, C20:4n-6) e o seu precursor metabólico, o ácido linoleico (LN, C18:2n-6), juntamente com o ácido eicosapentaenóico, representado na Figura 6 (EPA; C20:5n-3), o ácido docosahexaenóico (DHA; 22:6n-3) e o precursor de ambos, o ácido linolénico (LNA; C18:3n-3). COOH Tal como na maioria dos vertebrados estudados até à data, o AA, o EPA e o DHA são ácidos gordos essenciais (EFA) para um desenvolvimento normal dos peixes. As suas funções bioquímicas, celulares e fisiológicas são idênticas em peixes e em vertebrados superiores, sendo basicamente: 1 - manter a integridade funcional e estrutural das membranas celulares; 2 - precursores de um grupo de hormonas biologicamente activas, conhecidas como eicosanóides. Estes últimos são produzidos por quase todo os tecidos do corpo e estão envolvidos numa grande variedade de mecanismos fisiológicos. Os lípidos são, usualmente, bem ou muito bem digeridos. A excepção acontece com ácidos gordos de elevado ponto de fusão, que são sólidos à temperatura à qual os peixes se encontram. O ponto de fusão dos TAG depende essencialmente da composição em ácidos gordos dos mesmos. Como consequência dos seus baixos pontos de fusão Figura 5 – Exemplo de um MUFA, ácido oleico Figura 6 – Ácido eicosapentaenóico I - Revisão Bibliográfica 22 obtido através do aumento do teor lipídico de uma dieta. Um estudo realizado por Perez e Oliva-Teles (1999) em robalo mostrou que os peixes alimentados com uma dieta com 24% de lípidos cresciam mais do que os peixes que continham, quer níveis inferiores (12 e 18%), quer níveis superiores (30%) de lípidos. Em rodovalho, existem igualmente evidências de que níveis superiores a 20% prejudicam o crescimento, verificando-se uma diminuição na taxa de crescimento (Cacerez-Martinez et al., 1984; Regost et al., 2001b). Já em halabote não se verificou nenhum efeito negativo na taxa de crescimento quando se fornece dietas com teores lipídicos até 28% (Berge e Storebaken, 1991; Aksnes et al., 1996; Grisdale-Helland e Helland, 1998; Martins et al., 2007). A quantidade de lípidos numa dieta, capaz de promover este efeito de protein sparing, é muito dependente da espécie e da sua forma de metabolizar os nutrientes da dieta. O estado de desenvolvimento dos animais também influencia a quantidade de lípidos a introduzir na dieta (Salhi et al., 1994; Vergara et al., 1999). A optimização de todos os parâmetros de uma dieta (dimensão, lípidos totais, hidratos de carbono, minerais, etc.) deve ser cuidadosamente avaliada e aplicada, de forma consciente, para suprir as necessidades nutricionais e potenciar o crescimento. I - Revisão Bibliográfica 23 5 - DEPOSIÇÃO E BIOSSÍNTESE LIPÍDICA NOS PEIXES As principais etapas do metabolismo lipídico nos peixes são actualmente conhecidas e apresentam grandes semelhanças com as dos mamíferos (Sheridan, 1988; Corraze, 2001). Os lípidos da dieta, sobretudo os TAG, são hidrolisados no lúmen do intestino, por lipases pancreáticas, a ácidos gordos livres e a 2-monoacilgliceróis. Os ácidos gordos absorvidos são re-esterificados nos enterócitos em TAG e fosfolípidos. Os lípidos re-sintetizados são maioritariamente incorporados em partículas de natureza lipoproteica, análogas aos quilomicrons dos mamíferos e às lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Estas lipoproteínas são transportadas, principalmente através do sistema linfático, para o fígado. Parte dos ácidos gordos absorvidos podem ainda ser transportados conjugados com a albumina, via sistema porta. Esta via parece ser apenas importante em situações de re-alimentação, após um jejum prolongado, e quando as concentrações de glicerol são limitantes (Santinha et al., 1999). No fígado, os lípidos provenientes da dieta, assim como os que são sintetizados de novo por esse órgão, são esterificados para formar novas lipoproteínas. Tal como nos vertebrados superiores, o transporte dos lípidos do fígado em direcção aos tecidos é assegurado por 3 categorias de lipoproteínas plasmáticas: VLDL, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e lipoproteínas de elevada densidade (HDL) (Sheridan, 1988). As lipoproteínas em circulação sofrem uma transformação intra-vascular pela acção das enzimas lipoproteína lipase e lecitina- -colesterol-acil-transferase (Sheridan, 1988). Os TAG, constituintes dos quilomicrons e das VLDL, são hidrolisados neste processo, permitindo que os ácidos gordos libertados sejam armazenados nos tecidos ou utilizados com fins energéticos. Nos mamíferos, o armazenamento dos lípidos provenientes da dieta, assim como os que são sintetizados de novo efectua-se, essencialmente, num tecido bem específico: o I - Revisão Bibliográfica 24 tecido adiposo. No entanto, nos peixes a deposição lipídica pode ter lugar em vários tecidos: tecido hepático, adiposo perivisceral, muscular e até mesmo no tecido subcutâneo (Figura 10). Figura 10 - Processos bioquímicos envolvidos na lipogénese (adaptado de Sheridan, 1988) No músculo branco, os lípidos são armazenados em pequenas formações do tecido adiposo inseridas entre as fibras musculares, enquanto no músculo vermelho estão também armazenados no interior das próprias fibras (Santinha et al., 1999). O teor lipídico dos peixes varia em função da idade e do estado fisiológico, aumentando geralmente ao longo do desenvolvimento ontogenético e com o tamanho dos animais. Tal como acontece no Homem e na maioria das aves (Hillgartner et al., 1995), nos peixes o fígado é, por excelência, o órgão da síntese de novo dos ácidos gordos (Likimani e Wilson, 1982; Henderson e Sargent, 1985; Sargent et al., 2002). Nos animais, quando os hidratos de carbono, lípidos e proteínas fornecidos na dieta excedem as necessidades do organismo em energia, são transformados em gordura (Maynard et al., 1979; Nelson e DEPOSIÇÃO Tecido adiposo perivisceral e subcutâneo Músculo branco e vermelho Fígado FÍGADO Lipogénese de novo a partir de hidratos de carbono e aminoácidos Esterificação dos ácidos gordos neossintetizados e exógenos INTESTINO Esterificação dos ácidos gordos da dieta Síntese de quilomicrons Lípidos da Dieta Digestão e Absorção Transporte de: Glicose e aminoácidos Ácidos gordos esterificados Ácidos gordos livres-albumina Transporte dos lípidos pelas VLDL, LDL e HDL I - Revisão Bibliográfica 25 Cox, 2000). Em situações de abundância de acetil-CoA (molécula constituída por 2 carbonos, precursora da síntese de ácidos gordos e produto resultante da sua oxidação), para além do fígado, também o tecido adiposo poderá sintetizar ácidos gordos de novo. Uma vez que esta síntese ocorre no citoplasma, torna-se necessário efectuar o transporte de acetil-CoA desde a mitocôndria, o que só é possível através de um mecanismo bioquímico designado por “lançadeira do grupo acetilo”. Através deste mecanismo, o citrato formado na mitocôndria no ciclo dos ácidos tricarboxílicos, também designado por ciclo de Krebs, difunde-se para o citoplasma, por condensação da acetil-CoA com oxaloacetato. O citrato reage com a CoA existente no citoplasma, numa reacção catalisada pela ATP citrato-liase, formando-se acetil-CoA e oxaloacetato. A acetil-CoA pode então ser utilizada na síntese de ácidos gordos de novo, sendo o oxaloacetato reduzido a malato. No ciclo do malato-piruvato, pela acção da enzima málica (ME), o malato é descarboxilado a piruvato, formando-se fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADPH). As vias metabólicas da síntese de ácidos gordos de novo nos mamíferos monogástricos envolvem a conversão de acetil-CoA proveniente da degradação dos hidratos de carbono, lípidos ou da desaminação dos aminoácidos, em ácido acil-CoA, através de uma série de carboxilações, condensações e reduções catalisadas pela acetil- -CoA carboxilase (ACoAC) e pelo complexo sintetase dos ácidos gordos (FAS). Tal como acontece nos mamíferos, nos peixes todos os passos da síntese do ácido palmítico, produto final da biossíntese lipídica de novo, são catalisados pelo complexo FAS. Os ácidos gordos insaturados ou de cadeia mais longa são produzidos a partir do ácido palmítico, por acção de sistemas de elongases e dessaturases, como referido anteriormente (Nelson e Cox, 2000). Durante a síntese de ácidos gordos é necessário poder redutor para a formação de duplas ligações, sendo este fornecido pelo NADPH. Os equivalentes I - Revisão Bibliográfica 26 redutores (NADPH) são cofactores essenciais na lipogénese, na medida em que são necessários à conversão de malonil-CoA a ácidos gordos de cadeia longa. A via das pentoses fosfato é uma alternativa à via glicolítica para a oxidação da glicose, formandose NADPH para sínteses redutoras, como as que ocorrem na biossíntese de ácidos gordos, e ribose para a produção de nucleótidos e ácidos nucleicos. Esta via metabólica é constituída por duas fases (Nelson e Cox, 2000): (1) A fase oxidante, na qual a glicose-6-fosfato (G6P - o substrato comum a todas as vias bioquímicas da glicose) sofre desidrogenação e descarboxilação, produzindo-se NADPH e ribulose-5-fosfato (Arnesen et al., 1993). A primeira reacção desta fase é catalisada pela enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD; EC 1.1.149), requerendose NADP + como receptor de hidrogénio para a oxidação da G6P, e produzindo-se NADPH (Bautista et al., 1988); (2) A fase não oxidante, em que a ribulose-5-fosfato pode ser convertida a ribose-5fosfato ou voltar à via glicolítica como frutose-6-fosfato ou gliceraldeído-3-fosfato. Uma fonte adicional de NADPH para a lipogénese pode ter ainda origem na conversão de citrato a α-cetoglutarato pela enzima isocitrato desidrogenase. A contribuição de cada um destes sistemas geradores de NADPH varia com a espécie, sendo no entanto a via das pentoses fosfato, seguida pelo ciclo malato-piruvato, as principais vias nos humanos e nos animais monogástricos (Iritani et al., 1984). Nos peixes, os processos envolvidos na lipogénese são idênticos aos descritos nos mamíferos (Iritani et al., 1984). No entanto, nestes animais as enzimas envolvidas na produção de NADPH pouco ou nada foram estudadas (Cowey e Walton, 1989). Apesar disso, as várias enzimas envolvidas na lipogénese foram já identificadas nos peixes, I - Revisão Bibliográfica 27 sabendo-se que a sua actividade específica é mais elevada no fígado do que no tecido adiposo do salmão (Oncorhynchus kisutch) (Lin et al., 1977a,b), da truta arco-íris (Baldwin e Reed, 1976), da enguia americana (Anguilla rostrata) (Aster e Moon, 1981) e do peixe-gato (Ictalurus punctatus) (Likimani e Wilson, 1982), sendo no entanto a sua importância individual ainda tema de debate (Dias et al., 1998). Há muito que se conhece o efeito depressivo do aumento do teor lipídico das dietas sobre a síntese de novo dos ácidos gordos (Corraze, 2001; Sargent et al., 2002). O aumento do teor lipídico alimentar causou um efeito inibitório sobre as enzimas da lipogénese hepática, em várias espécies, como o salmão (Lin et al., 1977a), salmão Atlântico (Salmo salar) (Arnesen et al., 1993), seriola (Seriola quinqueradiata) (Shimeno et al., 1996), peixe-gato (Ictalurus punctatus) (Likimani e Wilson, 1982), carpa comum (Shimeno et al., 1995), truta arco-íris (Dias et al., 1999) truta marisca (Salmo trutta) (Regost et al., 2001b) e robalo (Bautista et al., 1988; Dias et al., 1998; 1999). Pelo contrário, Regost e colaboradores (2001a; 2003) não encontraram nenhuma alteração clara na actividade das enzimas da lipogénese em rodovalhos em resposta a diferentes fontes lipídicas. Enquanto nos mamíferos dietas com um teor lipídico de apenas 2,5% podem causar uma inibição na lipogénese, nos peixes isto só se torna evidente quando o teor lipídico das dietas excede os 10% (Sargent et al., 2002). Como para a maioria das espécies, teores lipídicos de 10% não constituem dietas de elevado teor energético, pode considerar-se que apenas as dietas altamente energéticas têm capacidade de inibir a lipogénese nos peixes. Shimeno et al. (1995) observaram uma diminuição na actividade enzimática da lipogénese, gluconeogénese e degradação dos aminoácidos no hepatopâncreas de carpas alimentadas com 18% de gordura bruta em comparação com as carpas alimentadas com I - Revisão Bibliográfica 28 apenas 9%. Em truta arco-íris, a lipogénese diminui com o aumento da relação lípidos/hidratos de carbono na dieta (Brauge et al., 1995). Sánchez-Muros et al. (1996) demonstraram, em truta arco-íris, que dietas com elevados teores lipídicos causam uma diminuição significativa na actividade específica, na eficiência catalítica e na velocidade máxima da enzima G6PD. A diminuição da relação proteína digestível/energia digestível, através do aumento do teor lipídico, diminui igualmente a actividade de várias enzimas hepáticas na truta arco-íris e no robalo, como a FAS, a G6PD e a ME (Dias et al., 1999). Para além disto, a actividade destas enzimas é ainda inibida em resposta a um decréscimo da proteína alimentar, no fígado da seriola (Shimeno et al., 1996), da truta arco-íris (Barroso et al., 1994) e no hepatopâncreas de carpa (Kheyyali et al., 1989). O facto das dietas para peixes serem ricas em PUFA, potentes inibidores da lipogénese nos mamíferos, vem reforçar a ideia da inibição da lipogénese em resposta a elevados teores lipídicos (Herzberg, 1991). De acordo com Shikata et al. (1994) teores elevados de EPA e DHA na dieta tendem a inibir a actividade das enzimas da lipogénese no hepatopâncreas da carpa comum. Mais recentemente, demonstrou-se in vitro que a inclusão de EPA e DHA nas dietas induz a redução da actividade das enzimas da lipogénese nos hepatócitos da truta arco-íris (Alvarez et al., 2000). Dietas ricas em PUFA estão também negativamente correlacionadas com a actividade enzimática da lipogénese no salmão Atlântico (Menoyo et al., 2003). Assim, a quantidade e, em particular, o tipo de ácidos gordos incorporados nas dietas para peixe parecem ser factores de extrema importância nos estudos a realizar sobre a actividade enzimática da lipogénese. Além da composição nutricional das dietas, parece existir um período mínimo necessário à ocorrência das alterações enzimáticas. Segundo Lin et al. (1977b) são I - Revisão Bibliográfica 29 necessárias cerca de três semanas para observar alguma alteração na actividade das enzimas da lipogénese em resposta ao regime alimentar. Walzem et al. (1991) descreveram ainda uma correlação linear positiva entre a actividade das enzimas da lipogénese e o crescimento do animal (enquanto ganho de massa corporal). No entanto, Barroso et al. (1999) observaram uma diminuição dessa mesma actividade, expressa por unidade celular, com o tamanho do peixe, indicando que, à medida que o peixe cresce a quantidade de NADPH disponível por célula é menor. A temperatura é também um importante factor descrito na regulação da actividade das enzimas da lipogénese que deve ser tido em consideração (Voss e Jankowsky, 1986; Corraze et al., 1999). II - Parte Experimental II – Parte Experimental 31 1 - INTRODUÇÃO Como referido anteriormente, a indústria da aquicultura tem expandido na Europa durante as últimas décadas, mas apenas algumas espécies têm contribuído para esta expansão. O desenvolvimento da aquicultura no mediterrâneo deve-se essencialmente à produção de espécies como o robalo (Dicentrachus labrax), a dourada (Sparus aurata) e o rodovalho (Psetta maxima). Com as produções cada vez maiores destas espécies os preços por kg sofreram reduções levando à saturação do mercado. Há, portanto, a necessidade de encontrar novas espécies capazes de dinamizar este ramo da indústria e satisfazer as necessidades do consumidor. O linguado (Solea senegalensis) parece ser um candidato à altura deste desafio, principalmente devido ao seu elevado preço e procura nos mercados. Até à data, foram alcançados avanços significativos no que diz respeito a técnicas de maneio de larvas e sua alimentação (Dinis et al., 1999; Imsland et al., 2003; Engrola et al., 2005; 2007; Conceição et al., 2007). Todavia, pouco se sabe acerca dos requisitos nutricionais desta espécie durante a fase juvenil (Dias et al., 2004; Rema et al., 2007). O requisito proteico bruto foi estimado em cerca de 600g/kg de dieta (Rema et al., 2007), mas nada se sabe acerca do teor óptimo de lípidos. Na aquicultura, as dietas são formuladas com teores optimizados de gordura para que esta seja usada, preferencialmente, como fonte energética, em vez da fracção proteica. Com isto, para além de uma redução dos custos nas dietas, pretende-se aumentar o crescimento, reduzindo a quantidade de proteína utilizada em energia, o chamado protein sparing, e reduzir a matéria orgânica e as perdas de azoto para o meio ambiente (Lee, 1973; Cho et al., 1994; Hillestad e Johnsen, 1994; Kaushik, 1998; Company et al., 1999). II – Parte Experimental 38 Com o grupo inicial efectuou-se o mesmo protocolo e as amostras foram, então, liofilizadas para posterior análise. Com o liofilizado, procedeu-se à avaliação nutricional (humidade, cinzas, proteína bruta, gordura bruta e valor calórico). Todas as amostras foram analisadas no final da experiência, a fim de uniformizar as condições de análise, em duplicado, segundo a metodologia analítica de referência (AOAC, 2000): Matéria seca: determinada após secagem em estufa a 105ºC, durante 24h. (Anexo I). Cinzas totais: obtida após incineração em mufla, a 550ºC, durante 5h (AOAC – 942.05). Proteína bruta: obtida por determinação do teor em azoto pelo método de Kjeldahl, com um aparelho microKjedahl (Gerhardt) e usando o valor de 6,25 como factor de conversão proteico (AOAC – 2001.11). Gordura bruta: determinada por extracção com éter de petróleo, segundo adaptação do método de Sohxlet, num aparelho de extracção automática (Soxtherm-Gerhardt) (AOAC – 2003.05). Energia bruta: determinada por combustão completa em bomba calorimétrica (IKA C2000) (Anexo II). Para além da composição aproximada das carcaças dos peixes sujeitos aos diferentes tratamentos, foram analisados individualmente fígado, vísceras, pele dorsal e músculo dorsal para determinação do teor de lípidos totais (n = 9). Os lípidos totais foram determinados segundo o método de Folch (Folch et al., 1957). O método baseia-se na extracção dos lípidos totais pelo uso de solventes orgânicos. Após a II – Parte Experimental 39 extracção de lípidos, no músculo, prepararam-se os ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME), por metilação ácida (Santha e Ackman, 1990). Os FAME foram analisados num cromatógrafo gasoso (Crompack CP - 9001), equipado com um injector automático e com um detector de ionização de chama (FID) mantidos a 250ºC e a 270ºC, respectivamente. A separação foi conseguida com uma coluna capilar (Varian WCOT) de sílica fundida, com 50m×0,25mm×0,2µm, usando hélio como gás de arraste, com fluxo de 1,3ml/min. A temperatura do forno foi de 140ºC durante 11min, aumentada 5ºC/min até 220ºC, mantendo-se nesta temperatura durante 15min. Os ésteres de ácidos gordos foram identificados usando misturas conhecidas (Supelco, FAME 37 e PUFA 3) e a informação analisada com o software CP-Maitre (versão 2.5). 3.4 - ANÁLISE ESTATÍSTICA O tratamento estatístico dos dados foi efectuado recorrendo aos métodos descritos por Zar (1999). Todos os dados foram testados para homogeneidade de variância, utilizando o teste de Leven e depois submetidos a uma ANOVA a um factor, usando o software SPSS (versão 15.0). Quando a probabilidade do teste de homogeneidade de variância era inferior a 0,05, foi efectuado o teste não paramétrico equivalente à ANOVA a um factor (KruskalWallis). Quando estes testes exibiam p≤0,05 as médias individuais eram comparadas usando o teste de Tukey (Anova a 1 factor) ou o teste de Mann-Whitney (Kruskal-Wallis). II – Parte Experimental 40 4 - RESULTADOS No final da experiência (112 dias), em média, todos os peixes dos cinco tratamentos (L4, L8, L12, L16 e L20) triplicaram de peso. Os diferentes parâmetros de crescimento analisados nos juvenis de linguado, alimentados com as diferentes dietas experimentais, podem ser observados na Tabela III. Os peixes alimentados com dietas mais ricas em lípidos elevados (L12, L16 e L20) atingiram um peso final significativamente (p≤0,05) mais baixo (29-33g), quando comparados com os resultados obtidos com dietas com baixos teores lipídicos (L4 e L8). A taxa de crescimento diária variou entre 0,8 e 1,2 e foi significativamente afectada pelos teores de lípidos das dietas. Os peixes alimentados com as dietas mais ricas em lípidos exibiram taxas de crescimento mais baixas. Os valores de conversão alimentar variaram entre 1,0 (L4) e 2,2 (L20). Os peixes alimentados com as dietas L4 e L8 apresentaram os melhores resultados e os peixes alimentados com a dieta L20 apresentaram a pior conversão alimentar de todo o ensaio. Os valores observados para a eficiência proteica foram, em geral, elevados (acima de 1), apesar das diferenças significativas entre tratamentos, excepto para os peixes alimentados com a dieta L20, que exibiram uma eficiência proteica relativamente baixa (0,83). A ingestão de matéria seca variou significativamente (p≤0,05), aumentando com o teor de lípidos das dietas. Devido a este aumento, a ingestão dos restantes nutrientes apresentou a mesma tendência. . Tabela III – Efeito da incorporação de diferentes teores lipídicos no crescimento e consumo, após 112 dias, em linguado (média e desvio padrão (n=3)) Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Crescimento Peso médio inicial (g) 9,89 0,01 9,96 0,06 9,97 0,02 9,91 0,03 9,92 0,06 Peso médio final (g) 43,66 6,54 a 42,53 1,51 a 33,02 0,56 b 32,57 2,61 b 28,54 2,56 b Taxa de crescimento diária 1 1,22 0,16 a 1,20 0,03 a 0,94 0,02 b 0,93 0,07 b 0,81 0,08 b Taxa de conversão alimentar 2 1,04 0,05 c 1,15 0,03 c 1,66 0,09 b 1,68 0,06 b 2,16 0,18 a Eficiência proteica 3 1,70 0,08 a 1,56 0,04 a 1,06 0,06 b 1,04 0,04 b 0,83 0,07 c Consumo (g or kj/kg peso médio/dia) 4 Matéria seca 11,58 0,30 c 12,70 0,42 c 15,86 1,06 b 15,96 0,43 b 18,53 0,64 a Proteína 6,61 0,17 c 7,12 0,24 c 9,01 0,60 b 9,18 0,25 b 10,39 0,36 a Lípidos 0,47 0,01 e 1,07 0,04 d 2,17 0,14 c 2,77 0,07 b 4,17 0,14 a Energia (kJ) 2,38 0,06 c 2,77 0,09 c 3,63 0,24 b 3,80 0,10 b 4,55 0,16 a Tratamentos L20 L4 L8 L12 L16 Diferentes letras correspondem a diferenças significativas entre tratamentos (p≤0,05) 1 Taxa de crescimento diária = 100 x ((peso final) 1/3 - (peso inicial) 1/3 )/ dias 2 Taxa de conversão alimentar = consumo bruto na material seca / ganho de peso 3 Eficiência proteica = ganho de peso / proteína bruta ingerida 4 Consumo = consumo de nutriente / peso corporal médio (ABW = peso corporal inicial+peso corporal final)/2/dias 41 II – Parte Experimental 42 No final da experiência, não foram observadas diferenças significativas no teor de matéria seca, cinzas e energia dos juvenis de linguado alimentados com as diferentes dietas (Tabela IV). Contudo, nos peixes alimentados com as dietas L16 e L20 o teor proteico da carcaça foi significativamente inferior ( p≤ 0,05) ao dos peixes alimentados com a dieta L8. Quanto ao teor de lípidos, este foi significativamente superior ao dos peixes alimentados com a dieta L4. Média DP Média DP Média DP Média DP Média DP Composição corporal (%PF) Humidade 76,43 0,8 75,07 1,28 76,25 0,63 76,56 0,66 75,65 0,27 Cinzas 1,79 0,19 1,73 0,27 1,89 0,41 1,63 0,16 1,59 0,08 Proteína 17,69 0,35 ab 18,24 1,04 a 16,93 0,47 ab 15,98 0,54 b 16,18 0,42 b Lípidos 3,72 0,22 b 5,02 0,44 ab 5,14 0,1 ab 5,69 0,84 a 5,84 0,66 a Energia (kj) 5,61 0,13 6,17 0,33 5,82 0,03 5,85 0,38 5,98 0,11 Retenção (% consumo) 1 Matéria seca 22,57 0,12 a 21,92 1,36 a 14,19 0,21 b 13,71 0,63 b 11,34 1,12 b Proteína 30,23 0,61 a 28,89 2,07 a 17,87 0,25 b 15,97 0,42 bc 12,99 1,63 c Lípidos 82,47 1,84 a 53,57 4,67 b 23,9 1,95 c 21,24 4,19 c 13,47 1,8 c Energia (kj) 26,14 0,5 a 25,14 1,43 a 15,39 0,72 b 14,65 1,32 bc 11,5 1,04 c Ganho (g/kg ABW/dia) 2 Matéria seca 2,61 0,08 ab 2,78 0,16 a 2,25 0,12 bc 2,19 0,16 bc 2,1 0,18 c Proteína 2 0,09 a 2,06 0,13 a 1,61 0,08 b 1,47 0,07 b 1,35 0,15 b Lípidos 0,39 0 0,57 0,07 0,52 0,01 0,59 0,13 0,56 0,09 Energia (kj) 0,62 0,03 ab 0,7 0,05 a 0,56 0,01 ab 0,56 0,06 ab 0,52 0,05 b L20 L16 L12 Tratamentos L8 L4 A composição corporal inicial foi: Humidade = 75,65, Cinzas = 2.49; Proteína = 17,22; Lípidos = 4,53; Energia = 5,81 Diferentes letras correspondem a diferenças significativas entre tratamentos (p≤0,05) 1 Retenção = 100 x (Peso final x teor de nutriente na carcaça final – peso inicial x teor de nutriente na carcaça inicial) / nutriente consumido 2 Ganho = (nutriente na carcaça final - nutriente na carcaça inicial)/peso médio(ABW = peso corporal inicial+peso corporal final)/dias A retenção dos nutrientes e da energia foi igualmente afectada pelo aumento do teor de lípidos na dieta. Os peixes alimentados com as dietas de baixo teor lipídico (L4 e L8) exibiram uma retenção proteica, energética e lipídica superior à dos alimentados com as Tabela IV – Composição corporal (% ou kj/g em peso fresco), retenção (% do consumo) e ganho (g/kg/dia) nutricional de linguado alimentado com dietas com diferentes teores lipídicos durante 112 dias (média e desvio padrão (n=3)) II – Parte Experimental 43 dietas de alto teor lipídico. A mesma tendência foi observada para o ganho de nutrientes, excepto para o ganho lipídico onde não se observaram diferenças. O índice hepatossomático apresenta ligeiras diferenças entre tratamentos, contudo, tendo em conta que não houve diferenças significativas entre os peixes alimentados com as dietas L4 e L20, estas diferenças parecem não ser causadas pelo teor lipídico das dietas. No entanto, o índice viscerossomático foi nitidamente afectado pelo teor lipídico das dietas, com as dietas L16 (3,6%) e L20 (3,04%) a apresentarem os valores mais elevados (Tabela V). Tabela V – Índices somáticos (%), lípidos totais dos tecidos em peso fresco (%PF) e classes de ácidos gordos no músculo (g/100g ácido gordo) de linguado alimentado com dietas com diferentes teores lipídicos durante 112 dias (média e desvio padrão (n=6, excepto para os indices somáticos onde n=9)) Média Média Média Média Média IHS 1 0,83 0,22 ab 0,73 0,16 b 0,73 0,10 b 1,00 0,29 a 0,86 0,12 ab IVS 2 1,98 0,41 b 2,11 0,31 b 2,1 0,31 b 3,60 1,41 a 3,04 0,39 a Fígado Lípidos totais 9,38 2,14 8,81 0,98 8,02 1,98 10,10 1,81 9,09 1,26 Visceras Lípidos totais 3,33 0,39 b 3,17 0,17 b 3,96 0,78 ab 6,07 1,35 a 7,68 1,02 a Pele dorsal Lípidos totais 1,72 0,21 b 2,16 0,26 ab 2,15 0,39 ab 2,33 0,41 a 2,24 0,18 a Músculo Lípidos totais 2,06 0,50 2,74 1,24 3,05 1,38 2,20 0,63 2,35 0,54 ΣSFA 26,09 0,76 a 23,82 1,78 b 23,53 0,42 b 24,13 0,71 b 23,14 0,95 b Σ MUFA 22,17 2,63 b 26,57 2,94 a 29,37 2,81 a 26,93 1,48 a 27,67 1,65 a ΣPUFA 41,39 1,58 38,97 2,47 38,62 1,81 39,30 1,04 39,58 0,96 Σn-3 25,66 1,84 b 26,01 2,02 b 26,08 2,11 b 28,14 1,52 ab 29,31 1,39 a DHA/EPA 4,60 0,73 4,22 0,82 3,52 0,61 4,54 0,56 4,23 0,54 EPA/ARA 4,10 1,33 4,08 0,68 5,67 1,29 3,78 0,69 4,31 1,37 Tratamentos L4 L8 L12 L16 L20 DP DP DP DP DP Diferentes letras correspondem a diferenças significativas entre tratamentos (p≤0,05) 1 IHS, Índice hepatossomático = 100 x (peso do fígado/peso corporal), % 2 IVS, Índice viscerossomático= 100 x (peso da víscera/peso corporal), % ΣSFA = Soma de ácidos gordos saturados (C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0 e C24:0) ΣMUFA = Soma de ácidos gordos monoinsaturados (C16:1, C18:1, C20:1 e C22:1) ΣPUFA = Soma de ácidos gordos polinsaturados (C18:2n-6, C18:3n-6, C18:3n-3, C20:2n-6, C20:3n-3, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:4n-6, C22:5n-3 e C22:6n-3) Σn-3 = Soma de ácidos gordos da série n-3 (C18:3n-3, C20:3n-3, C20:5n-3, C22:5n-3 e C22:6n-3) II – Parte Experimental 44 Os teores lipídicos do fígado, vísceras, pele e músculo de linguado juvenil são apresentado na Tabela V. O teor lipídico da dieta afectou significativamente o teor de lípidos das vísceras e da pele, mas não do músculo ou do fígado. O teor lipídico das vísceras variou entre 3,3 e 7,7% (expresso em peso fresco), enquanto que o da pele variou entre 1,7 e 2,3% do peso fresco. Nos peixes alimentados com as dietas L16 e L20 observaram-se teores lipídicos superiores das vísceras e da pele, quando comparados com os peixes alimentados com a dieta L4. Apesar de entre os tratamentos restantes por vezes não serem detectadas diferenças significativas ( p≤ 0,05) para estes dois parâmetros, a tendência para o aumento do teor de lípidos nestes tecidos quando se aumenta o teor lipídico da dieta é evidente. Apesar de não serem detectadas diferenças no teor de lípidos do músculo, observaram-se diferenças significativas ( p≤ 0,05) na percentagem de ácidos gordos saturados. Os peixes alimentados com a dieta L4 continham mais SFA que os peixes alimentados com as dietas restantes (26% vs 23-24%). Nos MUFA observou-se o oposto, sendo neste caso detectado o valor mais alto nos peixes alimentados com a dieta L12. Os peixes alimentados com L4 apresentaram o teor mais elevado em PUFA (41%) enquanto quando alimentados com as dietas L16 e L20 apresentaram valores mais baixos (39%). Contrariamente, os teores de ácidos gordos n-3 são inferiores em L4 (26%), quando comparados com os peixes alimentados com a dieta L20 (29%). Os peixes alimentados com a dieta L4 apresentaram os valores mais elevados da relação DHA/EPA (4,6%). Contudo, tanto para os PUFA como para o índice DHA/EPA e EPA/ARA não se observaram diferenças significativas entre tratamentos. II – Parte Experimental 45 5 - DISCUSSÃO E CONCLUSÃO No final do ensaio, o peso médio final dos linguados triplicou em todos os tratamentos. A incorporação de teores de gordura superiores a 8% na dieta parece prejudicar o crescimento. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores em pregado, em que o aumento do teor de lípidos na dieta provocou uma redução do crescimento, quer em juvenis (Cacerez-Martinez et al. , 1984) quer em peixes de tamanho comercial (Regost et al. , 2001b). Uma redução do crescimento foi também observada em halabote quando os peixes eram alimentados com uma dieta com um teor lipídico de 30% e pobre em hidratos de carbono (Hamre et al. , 2003). Contudo, o aumento do teor lipídico de 10 até 21% não afectou o crescimento do linguado em trabalhos anteriores (Dias et al. , 2004), nem o crescimento de halabote de diferentes tamanhos com dietas com um teor lipídico entre 8 e 28% (Berge et al. , 1990; Asknes et al. , 1996; Grisdale-Helland e Helland, 1998; Helland e Grisdale-Helland, 1998; Martins et al. , 2008). Em oposição aos salmonídeos, ou a outras espécies de peixes marinhos onde a proteína da dieta pode ser direccionada para crescimento (Lee e Putnam, 1973; Hillestead et al. , 1994; Dias et al. , 1998; Company et al. , 1999), o aumento do teor de lípidos da dieta no linguado parece não ter benefício. Os valores elevados de ingestão (12-19g/kg de peso médio/dia) e baixos de conversão alimentar (1-2) reflectem a boa aceitação das dietas. Apesar de Dias et al. (2004) apresentarem valores similares de crescimento para peixes desta espécie alimentados com 11 ou 21% de lípidos na dieta, os valores de conversão alimentar no presente ensaio foram substancialmente melhores. Este facto pode dever-se ao melhoramento efectuado no protocolo de alimentação. No habitat natural, o linguado mantém-se enterrado na areia, inactivo, durante o período diurno, saindo à noite para se II – Parte Experimental 46 alimentar (Kruuk, 1963). Logo, em vez de se alimentar os peixes 18h por dia como adoptado por Dias et al. (1998), neste ensaio os peixes foram alimentados 24h por dia, dividindo a quantidade diária em cerca de 8 rações. No presente ensaio, o teor de lípidos da dieta afectou a ingestão e utilização dos nutrientes. As dietas com o teor lipídico mais baixo foram as mais eficientes na utilização dos nutrientes, como demonstrado pela baixa taxa de conversão alimentar, ingestão de nutrientes e alta eficiência proteica. Tendo em conta o referido, pode afirmar-se que o aumento da energia não proteica na dieta, para os teores de proteína e lípidos ensaiados, teve um efeito negativo na utilização dos nutrientes em linguado ( Solea senegalensis ). O linguado é considerado um peixe magro, com um teor de gordura baixo. Neste ensaio o teor de gordura corporal variou entre 4 e 6%, com o tratamento L4 a apresentar valores mais baixos que os tratamentos L16 e L20. Em rodovalho o teor de gordura das dietas afectou, igualmente, o teor de gordura corporal, com este último a aumentar com os lípidos da dieta (10 a 25% de lípidos) (Regost et al. , 2001b). Dias et al. (2004) também observaram este efeito em linguado alimentado com dietas com um alto teor de gordura (10 vs 21%), contudo apenas nas dietas com um baixo teor de hidratos de carbono digestíveis. O aumento de gordura corporal devido à ingestão de dietas com elevados teores lipídicos é uma observação bastante comum em salmonídeos, ou noutras espécies marinhas como dourada (Vergara et al., 1999), robalo (Peres et al. , 1999) ou halabote (Martins et al., 2008). Contudo, todas estas espécies apresentam um teor superior de gordura das carcaças quando comparadas com o linguado. O aumento do teor de lípidos das dietas resultou num decréscimo da retenção lipídica, mas em nenhuma alteração significativa no ganho lipídico. Por outro lado, tanto o ganho como a retenção proteica foram melhorados com o decréscimo do teor de lípidos das dietas. Em contraste, Dias et II – Parte Experimental 47 al. (2004) observaram que, esta mesma espécie, quando alimentada com uma dieta com 20% de lípidos obtinha um ganho proteico similar aos exemplares alimentados com uma dieta com 10% de lípidos. Contudo, os peixes alimentados com a dieta mais rica em lípidos apresentavam um ganho lipídico superior. Igualmente, em outras espécies de peixes planos como o rodovalho (Regost et al. , 2001b) e o halabote (Martins et al. , 2007) o aumento do teor lipídico das dietas não parece melhorar a utilização da proteína. Todavia, noutros estudos em halabote observou-se um efeito de poupança de proteína quando se aumentava o teor de lípidos da dieta. É necessário referir que as dietas não eram isoproteicas (Asknes et al. , 1996; Helland et al. , 1998). Em espécies como o salmão (Hillestead e Johansen, 1994), truta (Lee e Putnam, 1973), dourada (Santinha et al. , 1999) e robalo (Dias et al. , 1998) a retenção proteica pode ser melhorada com a substituição da proteína alimentar por lípidos. Contudo, em peixes planos esta temática parece controversa. Em linguado, um intervalo de teores lipídicos de 4 a 20% nunca tinha sido testado. Os resultados obtidos sugerem uma fraca utilização dos lípidos, mas, para se afirmar categoricamente tal, são necessários mais ensaios. O coeficiente de digestibilidade aparente poderia ser uma ferramenta útil para clarificar o porquê destas observações. Já foram efectuadas diversas tentativas no sentido de obter esta informação. No entanto, nenhum dos métodos utilizados até à data (decantação ou “ stripping ”) tiveram sucesso, devido essencialmente à morfologia do tubo digestivo e às propriedades físicas das fezes. A remoção do tubo digestivo e posterior recolha de fezes parece ser a única hipótese viável, contudo será preciso um grande número de exemplares. Será importante frisar que o protein sparing poderá não ter ocorrido devido ao elevado teor de proteína nas dietas experimentais. Dias et al. (1998), em robalo, observaram que um aumento no teor lipídico da dieta de 10 para 18% apenas era benéfico, para a utilização proteica, quando os peixes eram alimentados com baixos teores proteicos (40%). Estes resultados sugerem que, 54 Corraze G (2001) Lipid Nutrition. In: Nutrition and feeding of fish and crustaceans , pp. 111-130 [Guillaume J, Kaushik, S, Bergot, P, Métailler, K editors] Chichester, UK: Springer Praxis. D'Andrea S, Guillou H, Jan S, Catheline D, Thibault JN, Bouriel M, Rioux V, Legrand P (2002) The same rat delta 6-desaturase not only acts on 18but also on 24-carbon fatty acids in very-long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis. Biochem J 364 , 49-55. 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Fishbase (2008) Solea senegalensis. http://www.fishbase.org/Summary/SpeciesSummary.php?id=8852 (acedido em Dezembro 2008) 61 IV - Anexos ANEXO 1 Determinação do Teor de Matéria Seca (MS) Princípio: O teor em matéria seca de uma amostra é calculado pela variação de peso antes e após secagem numa estufa a 105ºC até obtenção de um peso constante. Aparelhos: Estufa - Binder Excicador Balança analítica Material: Cadinhos de porcelana/formas de alumínio (2 por amostra) Procedimento: 1) Após a identificação dos cadinhos/formas de alumínio, secar na estufa (Figura 13) durante 24 horas a 105ºC e deixar arrefecer num excicador (cerca de 30 min); 2) Pesar os cadinhos/formas de alumínio e registar os seus pesos; 3) Tarar os cadinhos/formas de alumínio e pesar 1g de amostra (0,5-1g mínimo); 4) De seguida, colocar os cadinhos/formas de alumínio com a amostra a secar na estufa a 105ºC durante 24h; 5) Após 24 horas na estufa, colocar os cadinhos/formas de alumínio no excicador durante cerca de 30 min para arrefecer; 6) Pesar os cadinhos/formas de alumínio com amostra e registar os pesos; 7) Calcular: % MS Peso final do cadinho com amostra (após 24h a 105 o C) Peso do cadinho vazio = Peso da amostra × 100 Figura 13 - Estufa 62 ANEXO II Determinação da Energia Bruta Princípio : A energia libertada na combustão de 1g de alimento ou combustível é o seu poder calórico que pode ser determinado através de uma bomba calorimétrica adiabática. O sistema de calorimetria representado na Figura 14 permite determinar a energia bruta da matéria orgânica, recorrendo a uma combustão por acção do oxigénio, no interior de um vaso de decomposição em condições pré-definidas. O calor que é libertado na combustão é absorvido pelo conteúdo do calorímetro e causa a elevação da temperatura da água que é cuidadosamente medida com um termómetro de precisão de Beckmann, antes e depois da reacção terminar, quando a temperatura no interior do calorímetro é novamente constante. A variação de temperatura ∆ T, observada no calorímetro, é proporcional ao calor que a reacção liberta ou absorve e depende da capacidade calorífica do calorímetro. Assim, pela medição directa de ∆ T, pode-se determinar a quantidade de energia bruta em função do peso da amostra. Para garantir resultados reprodutíveis o sistema é calibrado regularmente com ácido benzóico, com calor específico conhecido, para determinação da capacidade calorífica (valor C) do sistema. Figura 14 – Esquema de uma bomba calorímetrica Aparelhos: - Modelo: Sistema de calorimetria IKA C2000, - Marca: IKA-Werke GMBH & CO.KG, Staufen, Alemanha - Prensa, IKA C21 - Balança analítica Material - Fio de algodão - Crisol de quartzo/aço - O 2 63 Procedimento: 1. Ligar os aparelhos : a. Abrir registo da garrafa de O 2 ( Não mexer no registo do redutor ); b. Ligar IKA K600 (unidade de aquecimento/arrefecimento de água); 2. Preparação do recipiente de combustão a. Prensar a amostra na prensa IKA C21; b. Pesar a amostra dentro do crisol de quartzo/aço; c. Amarrar um fio de algodão no aro de ignição; d. Posicionar o crisol no aparador do crisol; e. Posicionar o fio de algodão dentro do crisol de modo a contactar com a amostra para permitir a combustão desta. A colocação indevida do fio causará a falha da ignição; f. Fechar o recipiente de combustão. g. Iniciar combustão