Desenvolvimento de um Método Multi-Resíduo Para a Determinação de Poluentes Emergentes por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência com Deteção de Massa, Após Extração em Fase Sólida

Desenvolvimento de um método multi‐resíduo para a determinação de poluentes emergentes por cromatografia líquida de ultra eficiência com deteção de massa, após extração em fase sólida Departamento de Química e Bioquímica Mestrado em Química 2014 Candidato: Inês Mafalda Oliveira Castro Ribeiro, Nº 200502736, 2005027[email protected]p.pt Orientação FCUP: Paulo Almeida, [email protected] Orientação Empresa: Maria de Fátima Alpendurada, mfalpendura[email protected] Empresa: Instituto da Água da Região Norte - IAREN Departamento de Química e Bioquímica Mestrado em Química 2014 À minha família Inês de Castro Ribeiro i Agradecimentos À Professora Doutora Maria de Fátima Alpendurada, diretora do IAREN, pela oportunidade proporcionada, por todo o conhecimento, apoio e orientação concedidos. Ao Professor Doutor Paulo Almeida, pela preciosa ajuda, paciência, apoio e orientação. À Engª Ana Guimarães pela supervisão, orientação, pelo conhecimento transmitido, pelo inestimável apoio, empenho e dedicação dispensados ao longo de todo o estágio. Aos meus pais, Rui e Luísa, agradeço todo o esforço que foi feito para me proporcionar a educação a que tive acesso. Por sempre estarem presentes, pelo amor, carinho e apoio. À minha irmã, Ana, por ser uma companheira de vida e me compreender como ninguém. Ao meu namorado Daniel pelo amor, apoio incondicional e infinita paciência. Às minhas amigas da FCUP, Ana, Amélia e Tânia que percorreram este caminho comigo e estiveram comigo nos bons e maus momentos. À minha amiga Alda, agradeço para além da amizade de longa data, o incentivo e apoio ao longo desta etapa. A todos os funcionários do IAREN, Vera, Cláudia, Dª Lurdes, Marta Teixeira, Marta Lima, Juliana, Andreia, Dª Maria José e Luís pela boa receção, amizade e simpatia. ii Inês de Castro Ribeiro Inês de Castro Ribeiro iii Resumo Neste trabalho, foi desenvolvido um método de determinação de 26 fármacos e estrogénios utilizando as técnicas de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UPLC) acoplada à deteção por espectrometria de massa (MS). Como os compostos estão presentes na água em concentrações muito baixas (na ordem dos ng.L-1) foi necessário utilizar a extração em fase sólida (SPE) de forma a estes poderem ser detetados e quantificados por MS. Para além da extração por SPE, foi também otimizado o método de determinação por on-line-SPE-UPLC-MS/MS, onde todo o processo de extração, separação e deteção é automatizado e acontece numa única etapa e em tempos mais curtos. Estes métodos otimizados foram aplicados em amostras de água do Rio Leça. Na otimização do método de determinação dos compostos por UPLC-MS/MS, foram testadas as composições da fase móvel e modo de preparação das soluções de injeção. A fase móvel composta por água e metanol e a preparação da solução com acidificação com ácido fórmico (10mM) foram as condições testadas que permitiram melhores resultados de modo a obter a separação, deteção e quantificação dos analitos. Na extração em fase sólida, a coluna escolhida e que providenciou a extração de todos os compostos foi a coluna com características de equilíbrio hidrofílico – lipofílico (HLB). Na otimização do método on-line-SPE-UPLC-MS/MS foram testados,no UPLC, gradientes de fase móvel de metanol e água sendo a temperatura da coluna de 40ºC. O eluente usado no SPE-online foi metanol 5% em água. Estas condições foram as que garantiram melhor separação dos 26 analitos estudados. Pelo método de determinação por UPLC-MS/MS com prévia extração por SPE, foram detetados e quantificados, em amostras de água do Rio Leça, os fármacos ketoprofeno ; bezafibrato; diclofenac; azitromicina; bisoprolol; ibuprofeno; gemfibrozil e alprazolam. Os limites de deteção e quantificação para estes compostos variaram entre 0,0006 - 0,57 µg.L-1 e 0,002 – 0,8 µg.L-1, respetivamente. A taxa média de recuperação para a extração destes compostos foi da ordem de 89,3%. Inês de Castro Ribeiro xi Índice de Figuras Figura 1 - Fluxograma representativo da via de chegada dos fármacos às águas de consumo (adaptado) 5 ............................................................................................................. 19 Figura 2 - Classes terapêuticas detetadas no meio ambiente. Dados recolhidos de 134 artigos publicados entre 1997 e 2009. 10 .............................................................................. 20 Figura 3 - Figura esquemática da composição geral de um sistema cromatográfico adaptado [19]25 Figura 4 - Relação entre a altura de pratos teóricos e a velocidade linear para diferentes diâmetros das partículas de enchimento 22................................................................................ 26 Figura 5 - Exemplos da estrutura do material de enchimento das colunas cromatográficas ACQUITY UPLC BEH C18 e C8, BEH Shield RP18 e BEH Phenyl ........................... 27 Figura 6 - Representação esquemática do funcionamento da ionização por Electrospray [20] ...... 28 Figura 7 - Representação esquemática do analisador de Triplo Quadrupolo [20] .......................... 29 Figura 8 - Esquema representativo das diferentes fases da extração por SPE 25 .......................... 30 Figura 9 - Esquema do funcionamento do sistema de extração por SPE on-line ........................... 31 Figura 10 - Programa Intellistart ® usado na determinação dos parâmetros de espectrometria de massa ...................................................................................................................... 34 Figura 11 - Fotografia do sistema UPLC-MS/MS, Waters Corp ..................................................... 36 Figura 12 - Fotografia da coluna ACQUITY® UPLC BEH C18, 150 x 2,1 mm, 1,7 μm .................. 37 Figura 13 - Gradiente e fases móveis utilizadas ........................................................................... 37 Figura 14 – Esquema constituição dos adsorventes usados neste estudo, HLB e MAX, respetivamente33 ...................................................................................................... 38 Figura 15 - Fotografia do ASPEC XL - soild phase extraction autosampler, Gilson ....................... 39 Figura 16 - Fotografia do equipamento utilizado na secagem das colunas - VacElut SPS 24, Varian40 Figura 17 - Fotografia das colunas Oasis HLB e Oasis MAX, respetivamente. .............................. 40 Figura 18 - Fotografia do Sistema de colunas de extração por SPE on-line - Oasis HLB direct connect HP 20µm, 2.1x30 mm, Waters® .................................................................. 41 Figura 19 - Rio Leça – Ponte do Carro – local onde foi recolhida a amostra ................................. 46 Figura 20 - Fotografias do procedimento de recolha da amostra no Rio Leça e transporte da mesma. .................................................................................................................... 46 Figura 21 - Comparação dos sinais obtido após extração com colunas HLB e MAX dos vinte e seis fármacos e estrogénios usados na escolha da coluna .............................................. 51 Figura 22 - Gráfico sinal obtido para cada composto vs volume extraído, usado na determinação do volume de rotura.................................................................................................. 52 xii Inês de Castro Ribeiro Inês de Castro Ribeiro xiii Índice de Tabelas Tabela 1 - Fármacos e estrogénios estudados neste trabalho, grupo terapêutico, fórmula molecular, massa molar, pKa e num CAS. ................................................................ 22 Tabela 2 - Condições utilizadas no detetor de massa ................................................................... 35 Tabela 3 - Parâmetros de espectrometria de massa e iões monitorizados .................................... 35 Tabela 4 - Condições otimizadas para a extração dos 26 compostos pelo método de on-line-SPEUPLC-MS/MS........................................................................................................... 42 Tabela 5 - Concentrações usadas nas curvas de calibração para o método de SPE offline para os compostos ................................................................................................................ 43 Tabela 6 - Concentrações usadas nas curvas de calibração para o método de SPE online para os compostos ................................................................................................................ 43 Tabela 7 - Composição das fases móveis testadas para a otimização do processo cromatográfico48 Tabela 8 - Parâmetros obtidos da curva de calibração dos 26 fármacos e estrogénios pelo método de injeção direta ....................................................................................................... 49 Tabela 9 - Método de extração por SPE offline utilizado neste estudo .......................................... 50 Tabela 10 - Gradientes e condições de composição de eluente e temperatura da coluna testados no método de extração por on-line-SPE-UPLC-MS/MS ............................................ 54 Tabela 11 - Gama de trabalho para os 26 fármacos e estrogénios, as equações da reta e coeficientes de correlação para a gama de linearidade obtida no método de extração por SPE off-line ........................................................................................................ 55 Tabela 12 - Gama de trabalho para os 26 fármacos e estrogénios, as equações da reta e respetivos coeficientes de correlação para a gama de linearidade obtida no método de extração por SPE on-line ..................................................................................... 56 Tabela 13 - Valores dos limites de deteção e quantificação obtidos pelo método de SPE off-line e on-line ...................................................................................................................... 57 Tabela 14 - Resultados média concentração, desvio padrão e coeficiente de variação dos 26 compostos em estudo pelo método de extração por SPE off-line .............................. 58 Tabela 15 - Resultados média concentração, desvio padrão e coeficiente de variação dos 26 compostos em estudo pelo método de extração por SPE on-line .............................. 59 Tabela 16 - Percentagem de recuperação dos compostos usando o método de SPE off-line e desvio padrão relativo .............................................................................................. 60 Tabela 17 - Percentagem de recuperação dos compostos usando o método de SPE on-line e desvio padrão relativo .............................................................................................. 60 Tabela 18 - Valores da média das concentrações obtidas na amostra do rio Leça pelo método de SPE-on-line-UPLC-MS/MS ....................................................................................... 61 xiv Inês de Castro Ribeiro Inês de Castro Ribeiro xv Acrónimos ACN – Acetonitrilo AINE - Anti Inflamatórios Não Esteroides APCI – Ionização Química à Pressão Atmosférica (Atmospheric-Pressure Chemical Ionization) BSM - Sistema de Solvente Binário (Binary Solvent Manager) ESI – Ionização de Nebulização Eletrónica (Electro Spray Ionization) FEDESA – Federação Europeia de Saúde Animal HLB – Equilíbrio Hidrofílico - Lipofílico (Hydrophilic-Lipophilic-balanced) HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography) IFARMED – Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde LC – Cromatografia Líquida (Liquid Chromatography) LC-MS/MS – Cromatografia Líquida Acoplada a Espectrometria de Massa Sequencial (Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry); LD – Limite de Detecção LQ – Limite de Quantificação MAX – Mixed-mode cation Exchange sorbent MeOH – Metanol MS – Espectrometria de Massa (Mass Spectrometry); QSM - Sistema de Solvente Quaternário (Quaternary Solvent Manager) Re – Recuperação SPE – Extracção em fase sólida (Solid Phase Extraction) TIC – Total Ion Chromatogram UPLC-MS/MS – Cromatografia Líquida de Ultra - Eficiência Acoplada a Espectrometria de Massa Sequencial (Ultra Performance Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry) 16 Inês de Castro Ribeiro 1 INTRODUÇÃO 1.1. APRESENTAÇÃO ESTÁGIO O estágio descrito neste relatório teve lugar no IAREN (Instituto da Água da Região Norte) e realizou-se entre os meses de Setembro de 2013 a Junho de 2014 no âmbito do estágio curricular do 2º ciclo de estudos em Química da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto. O IAREN é uma entidade de utilidade pública fundada em Março de 1991.Trata-se de uma associação, sem fins lucrativos, que congrega a Universidade do Porto, Autarquias, Serviços Municipalizados, Administrações Regionais de Saúde e Empresas Privadas. As instalações atuais situam-se em Matosinhos desde 2003. Este instituto tem como objetivo o exercício da atividade científica e tecnológica em Investigação e Desenvolvimento Experimental (I&DE) e outras atividades científicas e tecnológicas no domínio da qualidade da água. 1.2. OBJETIVO DO TRABALHO O presente trabalho desenvolvido teve como principal objetivo o desenvolvimento de um método de determinação de fármacos e estrogénios em águas do rio Leça usando a Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência com deteção por espetrometria de massa e a Extração em Fase Sólida. Desenvolveu-se em paralelo um método de deteção e determinação dos mesmos fármacos e estrogénios utilizando uma técnica CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO Inês de Castro Ribeiro 17 automatizada de on-line-SPE-UPLC-MS/MS. Após a otimização dos métodos, os mesmos foram testados em amostras de água do Rio Leça. 1.3. ESTRUTURA RELATÓRIO Neste relatório de estágio, é apresentada inicialmente uma introdução sobre poluentes emergentes (Capítulo 2), fazendo uma breve referência aos compostos mais utilizados, via de chegada à população e ecotoxicidade dos mesmos. No Capítulo 3 são abordadas de forma mais teórica as técnicas que foram utilizadas na execução deste trabalho. De seguida é apresentada a execução experimental subdividida pelos métodos utilizados (Capítulo 4). Posteriormente é feita a apresentação dos resultados e respetiva discussão (Capítulo 5). Por último, no Capítulo 6, encontram-se resumidas as principais ilações referentes a todo o projeto. 18 Inês de Castro Ribeiro 2 POLUENTES EMERGENTES O desenvolvimento de métodos analíticos mais sensíveis têm permitido a identificação e quantificação de compostos químicos em concentrações cada vez menores.1 Nos últimos 20 anos tem havido uma maior preocupação quanto à presença de certos compostos químicos denominados poluentes emergentes, devido ao aumento da presença destes em águas residuais.2 Estes poluentes são produtos químicos sem estatuto regulamentar, cujos efeitos sobre o meio ambiente e a saúde humana são ainda desconhecidos.3 Destes compostos, denominados poluentes emergentes, fazem parte alguns fármacos de diferentes classes terapêuticas como: analgésicos, anti-inflamatórios, antibióticos, antidepressivos, diuréticos, contrastes de raio X, desreguladores endócrinos, além de componentes usados em filtros UV, surfatantes e produtos de higiene pessoal. 4 CAPÍTULO 2. POLUENTES EMERGENTES Inês de Castro Ribeiro 19 Figura 1 - Fluxograma representativo da via de chegada dos fármacos às águas de consumo (adaptado) 5 Depois de administrados, muitos fármacos são transformados em metabolitos e excretado através de fezes e urina numa mistura que pode conter fármaco que não foi metabolizado pelo organismo e os seus metabolitos. A maioria das ETAR´s convencionais usa diversos mecanismos de remoção de compostos orgânicos. No entanto, muitos dos desreguladores endócrinos e fármacos apresentam características físico-químicas que favorecem a sua permanência no efluente final, sem remoção significativa destes poluentes.6 A contaminação com fármacos surge mais frequentemente em águas residuais municipais que potenciam a libertação destes compostos diretamente no meio ambiente. Os efluentes domésticos e hospitalares representam uma parte significativa de contaminação por produtos farmacêuticos.7. Estes fármacos quase sempre persistem e possuem bioacumulação no ambiente, principalmente no meio aquático8 (Figura 1). As classes terapêuticas que mais prendem, atualmente, a atenção da comunidade científica são anti-inflamatórios não esteroides (AINE), antibióticos e hormonas sexuais,9 como é apresentado na Figura 2. CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS 26 Inês de Castro Ribeiro A principal diferença no princípio geral usado em UPLC é a fase estacionária que usa partículas no seu enchimento com diâmetros inferiores a 2 µm, enquanto nas colunas usadas em HPLC convencional as partículas têm tipicamente tamanhos entre os 3 e os 5 µm. O princípio subjacente desta evolução é governado pela equação de Van Deemter (equação 1). Esta equação é uma fórmula empírica que descreve a relação entre H e v - a velocidade linear (fluxo da fase móvel) e a altura de prato teórico (eficiência da coluna). 𝐻 = 𝐴 + 𝐵 𝑣+ 𝐶 ∙ 𝑣 𝐸𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1 Em que A, B e C são termos e v corresponde à velocidade linear do fluxo de gás de arraste. O termo A é independente da velocidade e é menor quanto menores forem as partículas de enchimento da coluna. O termo B diz respeito à tendência de difusão axial das moléculas. Este termo é dividido pela velocidade, v, devido ao facto do seu efeito ser diminuído com o aumento do fluxo. C é a resistência cinética do processo de equilíbrio da separação e traduz-se pelo intervalo de tempo envolvido no movimento do gás na fase estacionária e é proporcional a v.20 Como se pode verificar na Figura 4, partículas menores podem reduzir significativamente a altura equivalente do prato teórico resultando numa maior eficiência e achatamento da curva de Van Deemter. Consequentemente, o aumento da taxa de fluxo da fase móvel não tem consequências negativas na eficiência, ao contrário do que era verificado em partículas maiores.21 Figura 4 - Relação entre a altura de pratos teóricos e a velocidade linear para diferentes diâmetros das partículas de enchimento 22 O aparecimento do UPLC exigiu o desenvolvimento de um novo sistema instrumental para cromatografia líquida, para poder tirar partido do desempenho de separação. A CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS Inês de Castro Ribeiro 27 pressão utilizada nestes sistemas também é muito mais elevada (de 8000 a 15000 psi) comparando com a pressão utilizada em HPLC (de 2500 a 5000 psi).20 As colunas e o seu empacotamento usado nesta técnica também possuem características diferentes. As colunas ACQUITY UPLC BEH C18 e C8 (Figura 5) têm características mais universais, por incorporarem ligações químicas de ligandos trifuncionais providenciando o uso de compostos com intervalos de pH maiores. As colunas com o enchimento BEH Shields RP18 e BEH Phenyl são usadas como complemento das anteriores de forma a providenciar maior seletividade e tempos de vida. 20 Figura 5 - Exemplos da estrutura do material de enchimento das colunas cromatográficas ACQUITY UPLC BEH C18 e C8, BEH Shield RP18 e BEH Phenyl As vantagens deste sistema são atribuídas à diminuição do tempo de análise, e o aumento da sensibilidade, ao aumento do alcance dos métodos multiresíduo, ao grande poder de resolução, aos custos de operação mais reduzidos e à diminuição do consumo de solventes. A principal desvantagem deve-se sobretudo ao uso de pressões elevadas que exigem mais manutenção do equipamento e reduzem o tempo de vida das colunas. DETEÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSA 3.1.2. A espectrometria de massa é uma das técnicas analíticas mais versáteis e é usada nas mais diversas áreas da ciência devido à sua precisão e sensibilidade. A espectrometria de massa (MS) é uma técnica que mede com precisão a massa molecular de moléculas e átomos convertendo-as em iões carregados, podendo também CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS 28 Inês de Castro Ribeiro ser determinada a estrutura de uma molécula. Esta técnica é também capaz de fornecer informação quantitativa de determinado analito a níveis muito baixos. A medição por espectrometria de massa utiliza moléculas carregadas porque, ao contrário das espécies neutras, é mais fácil de manipular o seu movimento e direção e, assim, serem detetados. Numa primeira fase existe a ionização, que converte as moléculas ou átomos do analito em espécies iónicas em fase gasosa. Numa segunda fase, há separação e análise de massa com base na razão massa-carga (m/z) e, finalmente, a corrente de iões resultante desta separação de massas é medida, amplificada e convertida numa informação digital que é traduzida em forma de espectro. Existem diversos métodos de ionização que são utilizados em LC-MS como ionização química, ionização eletrónica, APCI (Atmospheric-Pressure Chemical Ionization), MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) e Electrospray (ESI) – usado neste estudo Este tipo de ionização (ESI), representado na Figura 6, é o processo de formação de gotas altamente carregadas sob o efeito de um intenso campo elétrico à pressão atmosférica. A evaporação do solvente converte essas gotas carregadas em iões em fase gasosa. A solução da amostra flui através de um capilar metálico que é mantido a voltagens elevadas (3 – 4kV). A diferença de potencial entre o capilar e o contra elétrodo produz um campo electroestático, formando uma névoa de iões carregados à medida que a solução passa pela fonte. A evaporação das gotas carregadas é assistida pelo fluxo de azoto quente. Os iões do analito de interesse são depois dirigidos, através de uma série de lentes até ao espectrómetro de massa. Figura 6 - Representação esquemática do funcionamento da ionização por Electrospray [20] O analisador do tipo triplo-quadrupolo (Figura 7) é o mais usado em sistema MS/MS. É constituído por três quadrupolos em série em que cada quadrupolo é composto por quatro barras de metal alinhadas paralelamente. CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS Inês de Castro Ribeiro 29 Figura 7 - Representação esquemática do analisador de Triplo Quadrupolo [20] No primeiro quadrupolo (Q1), os iões são separados de acordo com a razão massa carga, m/z, e dirigidos para o segundo quadrupolo (Q2) onde estes são sujeitos a dissociação induzida por colisão (CID). No terceiro quadrupolo (Q3) são novamente separados e encaminhados para o detetor.23 3.2. SPE – SOLID-PHASE-EXTRACTION – EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA A extração em fase sólida é uma técnica muito usada e popular na preparação de amostras devido à sua rapidez e seletividade. A versatilidade desta técnica permite usá-la para diversos fins tais como a purificação, pré-concentração, dessalinização e derivação. Nos últimos anos, tem havido um aumento no uso de SPE como etapa de preparação das amostras no estudo e desenvolvimento de metodologias analíticas, muito devido ao facto do aumento da variedade de materiais adsorventes usados na extração em fase sólida. 24 O princípio da extração por SPE envolve a partição do soluto por duas fases: a fase sólida (adsorvente) e a fase líquida (matriz da amostra ou solvente com analito). O SPE permite-nos limpar interferentes numa matriz e/ou concentrar o analito o suficiente para ser detetado.25 O processo típico de extração em fase sólida envolve quatro passos. No primeiro, a coluna de SPE é acondicionada com um solvente de polaridade adequada. Num segundo passo, é feita a lavagem com solvente semelhante ao da amostra. Posteriormente, fazendo passar a amostra com o analito, este é retido no adsorvente enquanto os outros compostos (sem interesse analítico) são eluídos. A última etapa, envolve a utilização de um solvente com mais afinidade com o analito, que o remove do adsorvente para ser recolhido. (Figura 8) CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS 30 Inês de Castro Ribeiro Figura 8 - Esquema representativo das diferentes fases da extração por SPE 25 A seleção do adsorvente apropriado depende dos mecanismos de interação entre o adsorvente (fase sólida) e o analito. Estas interações, por sua vez, dependem das propriedades hidrofóbicas, polares e iónicas tanto do analito como da fase sólida. Os mecanismos de retenção mais comuns em SPE são baseadas nas forças de Van der Waals, pontes de hidrogénio, dipolo-dipolo e electroestáticas. Os diferentes adsorventes apresentam propriedades que podem ser aplicadas a uma grande variedade de compostos. Existem três tipos distintos de extração: Extração em fase normal – Envolve um analito polar, uma matriz moderada mente apolar (ex: acetona, hexano) e uma fase estacionária polar. A retenção do analito nestas condições deve-se às interações (pontes de hidrogénio e interações π–π) entre o grupo funcional polar do analito e aos grupos polares do adsorvente da fase estacionária. O uso de solventes mais polares do que a matriz da amostra permite a quebra destas ligações, eluindo os compostos adsorvidos pela fase sólida. Os materiais adsorventes polares usam como base gel de sílica modificada com grupos hidroxilo. Extração por permuta iónica - baseia-se nas atrações electroestáticas entre o grupo funcional com carga do analito e os grupos com carga que estão ligados à superfície de sílica da fase estacionária; os compostos aniónicos são isolados no grupo de uma amina quaternária ligada à superfície da sílica do adsorvente. Os catiónicos por sua vez são isolados usando grupos de ácido sulfónico ligados à superfície de sílica. Extração em fase reversa - envolve matriz (fase móvel) com propriedades polares ou moderadamente polares e uma fase sólida (fase estacionária) com propriedades apolares. A retenção de analitos orgânicos, existentes em soluções polares (água), neste Inês de Castro Ribeiro 31 tipo de materiais adsorventes devem-se sobretudo às forças de van der Waals. Solventes não tão polares são usados para eluir o composto, pois são capazes de quebrar estas forças entre o composto e o adsorvente em materiais de fase reversa. Os materiais usados em extração por SPE em fase reversa são baseados em carbono (grafite), polímeros (estireno/divinilbenzeno), polímeros revestidos e ligações de sílica (ambos revestidos com polímeros hidrofóbicos). 25 Neste trabalho, a extração por SPE tem o objetivo de concentrar o analito, uma vez que os compostos em estudo se encontram de forma muito diluída nas matrizes naturais e é necessária a sua concentração para poder ser detetada. 3.3. ON-LINE-SPE-UPLC-MS/MS No método de extração por SPEon-line, consegue-se uma maior rapidez no processo de extração, uma redução do volume utilizado da amostra, uma simplificação do processo de preparação da amostra e uma diminuição do consumo de solventes. Além disso, obtém-se maior reprodutibilidade dos resultados nos ensaios efetuados.26 Figura 9 - Esquema do funcionamento do sistema de extração por SPE on-line No processo de SPE on-line convencional, existe um sistema de bombas quaternário que permite, através de um software, programar todo o processo que já foi referido anteriormente em SPE off-line, de acondicionamento, lavagem e eluição. É possível utilizar gradientes de 4 diferentes solventes, usando colunas de extração apropriadas para o SPE on-line, com grande durabilidade. A amostra é injetada num loop de 5,00 mL e o sistema quaternário de solvente (QSM) vai arrastar a amostra até à primeira coluna de extração onde é concentrado o analito. O sistema de solvente binário (BSM) elui, através de um gradiente o analito dessa coluna, CAPÍTULO 3. TÉCNICAS UTILIZADAS 32 Inês de Castro Ribeiro levando-o de seguida para a coluna cromatográfica onde ocorre a separação. Enquanto este processo acontece, o QSM, reequilibra a segunda coluna de extração preparando-a para a segunda amostra. Esta segunda amostra é injetada novamente no loop e arrastada pelo QSM, efetuando o mesmo processo que foi feito na primeira coluna, em que é eluído pelo BSM até à coluna cromatográfica enquanto o QSM reequilibra novamente a coluna 1 e assim sucessivamente. (Figura 9) O sistema on-line-SPE-UPLC-MS/MS usado neste trabalho trata-se de um sistema adaptado pelo fabricante especificamente para o equipamento existente no laboratório e é usado num método de determinação de pesticidas em águas de consumo humano em análise de rotina. Neste sistema não existe a bomba quaternária sendo utilizado um sistema isocrático que permite o acondicionamento, lavagem e colocação da amostra na coluna. Inês de Castro Ribeiro 33 4 EXECUÇÃO EXPERIMENTAL 4.1. PREPARAÇÃO E ACONDICIONAMENTO DE SOLUÇÕES Neste trabalho foram utilizados padrões dos seguintes fármacos e estrogénios apresentados na Tabela 1 (Pág. 22). Estes foram adquiridos à Fluka, Sigma e Riedel-deHaën. As soluções padrão stock individuais foram preparadas em metanol com uma concentração de cerca de 1000 mg.L-1, armazenadas à temperatura de -18ºC e abrigadas da luz. A solução da mistura de todos os compostos foi também preparada em metanol com cerca de 10,0 mg.L-1, à exceção do Bromazepam, Alprazolam e Diazepam que foram usados numa mistura em separado com uma concentração de 1,00 mg.L-1. Tanto os solventes usados na extração por SPE como as fases móveis usadas no LC foram preparadas com água ultrapura (ultrapure MilliQ water - Millipore, Molsheim, France), ácido fórmico a cerca de 98% (Fluka, Germany), metanol e acetonitrilo (Carlo Erba), ambos com purezas compatíveis para uso em HPLC. CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL 34 Inês de Castro Ribeiro 4.2. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE UPLC-MS/MS Em UPLC-MS/MS, é necessário inicialmente ajustar as condições de deteção. Depois deste passo, passar-se-á a otimização das condições de separação por cromatografia líquida com as condições de deteção otimizadas anteriormente e dadas ao sistema. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE DETEÇÃO 4.2.1. O primeiro passo foi a otimização das condições do método de espectrometria de massa. Os 26 fármacos e estrogénios em estudo neste trabalho foram estudados no detetor de massa triplo quadrupolo (UPLC-MS/MS, Waters), em modo positivo e negativo, com a utilização da opção Intellistart ® do software. (Figura 10) Usaram-se soluções padrão preparadas em metanol, com concentração de cerca de 10 mg/L e injetaram-se, até 3 compostos em simultâneo, diretamente no detetor de massa. A informação adquirida para cada composto é dada através de um relatório gerado que nos indica o ião precursor, os dois iões filhos, e respetiva energia de cone, a energia de colisão e o modo de ionização. As condições usadas no detetor de massa são apresentadas na Tabela 2. Estes parâmetros são alteráveis mas usaram-se os mesmos que foram utilizados no método já desenvolvido e referido de determinação de estrogénios. Figura 10 - Programa Intellistart ® usado na determinação dos parâmetros de espectrometria de massa CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL Inês de Castro Ribeiro 35 Tabela 2 - Condições utilizadas no detetor de massa Na Tabela 3 encontram-se os parâmetros determinados para a criação do método de LCMS. No primeiro passo é feito um Scan que encontra o ião principal e efetua um varrimento de voltagens de cone de modo a apresentar a mais adequada para posterior deteção. Num segundo passo, é feito o Daughter Scan com o propósito de encontrar os principais fragmentos do ião principal e onde são encontradas as melhores energias para esses fragmentos. Na tabela 3, encontram-se os parâmetros de espectrometria de massa e iões monitorizados obtidos para cada um dos compostos em estudo. Tabela 3 - Parâmetros de espectrometria de massa e iões monitorizados Composto Ião precursor Ião Filho 1 Energia cone (eV) Ião Filho 2 Energia cone (V) Energia de colisão (eV) Modo ESI Hidroclorotiazida 296,0 205,1 23 269,2 19 52 - Paracetamol 152,0 92,9 21 110,0 18 38 + Ciprofloxacina 232,2 245,3 2 231,3 38 42 + Bisoprolol 326,3 74,0 26 116,1 18 46 + Omeprazole 344,2 179,1 29 194,1 14 28 - Furosamida 329,1 78,0 30 205,1 23 36 - Azitromicina 749 83,0 48 158,2 40 58 + Indapamida 366,2 117,2 35 132,1 16 43 + Paroxetina 330,2 69,99 28 192,3 21 40 + Nimesulida 307,1 198,3 26 229,1 28 32 - Ketoprofeno 255,2 105,1 24 177,2 18 38 + Naproxeno 229,1 141,1 48 170,2 17 15 - Fluoxetina 310,2 43,98 13 148,1 8 22 + Estrona 269,3 145,1 38 183,2 36 70 - 17-αEtinilestradiol 295,3 145,1 36 159,1 40 40 - Bezafibrato 360,2 85,0 16 274,3 18 34 - β-estradiol 271,2 145,2 42 183,2 38 68 - Condições MS Temperatura (fonte) Temperatura desolvatação Fluxo gás cone Fluxo desolvatação Gás de colisão 150ºC 350°C 1 L.H-1 845 L.H-1 Árgon CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL 42 Inês de Castro Ribeiro As condições usadas que permitiram melhores resultados encontram-se descritas na Tabela 4 Tabela 4 - Condições otimizadas para a extração dos 26 compostos pelo método de on-line-SPEUPLC-MS/MS T coluna (ºC) 40 Eluente %5 MeOH em água Gradiente da fase móvel % Metanol % Água t/min 15 100 100 15 15 85 0 0 85 85 5,00 7,00 7,10 12,0 A calibração efetuada para este método deve possuir pelo menos 5 pontos, devendo obter linearidade ao longo da gama de trabalho. As gamas de trabalho escolhidas foram separadas em dois grupos de compostos com duas gamas de trabalho diferentes. A gama mais alta engloba nove padrões de 0,075 ug.L-1 a 7,5 ug.L-1 e a segunda de 0,01 a 1 ug.L-1. Estes valores foram escolhidos de acordo com uma prévia determinação de limites de quantificação. 4.5. VALIDAÇÃO Os parâmetros a estudar dependem das características do método, do tipo e complexidade da amostra e da experiência que o laboratório possa ter na utilização do método. Depende ainda do propósito do método, podendo alguns dos parâmetros abaixo apresentados não serem avaliados, se tal for adequado. Os parâmetros de validação de métodos analíticos incluem: especificidade, seletividade, capacidade de identificação, gama de trabalho, linearidade, sensibilidade, exatidão, precisão (repetibilidade, precisão intermédia e reprodutibilidade), limite de deteção (LD), limite de quantificação (LQ) e robustez. Deve salientar-se que o método pode ser considerado validado mesmo que alguns parâmetros não se enquadrem nos limites estabelecidos na literatura, desde que sejam conhecidos e também adequados aos objetivos do estudo a ser realizado. Neste trabalho, ambos os métodos não possuem informação suficiente para serem validados uma vez que devido á escassez de tempo não foi possível testar diversos parâmetros. Assim, os parâmetros que foram avaliados foram: a gama de trabalho, a linearidade, os limites de deteção e quantificação, repetibilidade e percentagem de recuperação para os dois métodos. CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL Inês de Castro Ribeiro 43 LINEARIDADE/GAMA DE TRABALHO 4.5.1. A linearidade traduz a proporcionalidade entre a propriedade medida e a concentração do analito dentro de um intervalo específico. Este intervalo deve conter pelo menos 5 concentrações (pontos) diferentes. O ajuste dos dados ao modelo selecionado foi feito através de um coeficiente de correlação que deverá ser o mais próximo de 1. Para a determinação da linearidade foi preparada uma curva de calibração com nove pontos, sendo que a gama de trabalho não foi a mesma para todos os compostos. Os 26 compostos foram divididos em 3 gamas de trabalho para a extração por SPE off-line e 2 para o método de SPE on-line. As concentrações dos padrões usados nas curvas de calibração para os dois métodos encontram-se nas Tabela 5 e Tabela 6. Tabela 5 - Concentrações usadas nas curvas de calibração para o método de SPE offline para os compostos SPE off-line Concentração em µg.L-1 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Ciprofloxacina 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2,5 5,0 7,5 Omeprazole Simvastatina 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 Azitromicina Restantes compostos 0,001 0,0025 0,005 0,0075 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 Tabela 6 - Concentrações usadas nas curvas de calibração para o método de SPE online para os compostos SPE on-line Concentração em µg.L-1 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Grupo A 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 2,5 5,0 7,5 Grupo B 0,01 0,025 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL 44 Inês de Castro Ribeiro Em que: Grupo A: Hidroclorotiazida, Ketoprofeno, Bezafibrato, Naproxeno, Diclofenac, Estrona, βestradiol, 17α-Etinilestradiol, Fluoxetina, Azitromicina, Ciprofloxacina, Omeprazole, Furosamida, Bisoprolol e Paroxetina Grupo B: Nimesulida, Ibuprofeno, Desogestrel, Progesterona, Paracetamol, Indapamida, Gemfibrozil, Simvastatina, Alprazolam, Diazepam, Bromazepam Os padrões foram injetados e procedeu-se à construção das curvas de calibração. Verificou-se uma relação linear em muitos compostos, no entanto noutros verificou-se uma relação exponencial. Nesses casos reduziu-se a gama de trabalho para o mínimo de 5 pontos a fim de obter linearidade. LIMITE DE DETEÇÃO (LD) E LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ) 4.5.2. O limite de deteção é considerado como a menor concentração em analito presente na amostra que pode ser detetado sob as condições experimentais estabelecidas para o método analítico utlizado. Para o caso de métodos cromatográficos a estimativa do limite de deteção (LD) pode ser feita tendo em conta a seguinte relação: 𝐿𝐷 =3,3 × 𝑆𝑦 𝑥 ⁄ 𝑚 𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 2 onde: Sy/x é o desvio residual da curva de calibração m é o declive da reta O limite de quantificação (LQ) é a menor concentração em analito que pode ser determinada numa amostra, com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas, de acordo com a seguinte equação: 𝐿𝑄 =10 ×𝑆𝑦 𝑥 ⁄ 𝑚 𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 3 CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL Inês de Castro Ribeiro 45 REPETIBILIDADE 4.5.3. A repetibilidade do método de SPE-off-line foi estudada através da injeção de 3 replicados do padrão 5 - 0,75 µg-L-1 para a ciprofloxacina e omeprazole, 0,1 µg-L-1 para a simvastatina e azitromicina e 0,01 µg-L-1 para os restantes compostos. A repetibilidade do método de SPE-on-line foi estudada através da injeção de 5 replicados independentes do padrão 5 - 0,75 µg-L-1 para o grupo A, 0,1 µg-L-1 para o grupo B. Depois de aplicado o método foram obtidas as áreas em replicado, e calculou-se a média e o coeficiente de variação. O cálculo do coeficiente de variação (CV) foi feito de acordo com a equação 4. 𝐶𝑉(%)=𝐷𝑃 ×100 𝑐𝑜𝑛𝑐.𝑚é𝑑𝑖𝑎 𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 4 RECUPERAÇÃO 4.5.4. A percentagem de Recuperação foi feita segundo a equação abaixo: % 𝑅𝑒 = 𝑐𝑜𝑛𝑐 (𝑒𝑛𝑠𝑎𝑖𝑜 𝑟𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜) 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑐𝑜𝑛𝑐 (𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜) 𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 5 A percentagem de recuperação é calculada dividindo o valor experimental da concentração da amostra fortificada com o padrão 5 pelo seu valor esperado, ou seja, pela soma da concentração obtida na amostra e da concentração conhecida do padrão 5. 4.6. APLICAÇÃO DO MÉTODO A UMA AMOSTRA DO RIO LEÇA RECOLHA DA AMOSTRA 4.6.1. As amostras analisadas neste trabalho foram recolhidas no dia 2 de Julho de 2014 no Rio Leça no local da Ponte do Carro entre a freguesia de Santa Cruz do Bispo e Guifões no Concelho de Matosinhos (Figura 19). CAPÍTULO 4. EXECUÇÃO EXPERIMENTAL 46 Inês de Castro Ribeiro Figura 19 - Rio Leça – Ponte do Carro – local onde foi recolhida a amostra Foram recolhidos 2,5 L de água de Rio e o transporte foi feito em arcas refrigeradas (Figura 20). No laboratório, a amostra foi acidificada com ácido fórmico a 10 mM da mesma forma que foram acidificadas as soluções padrão usadas no processo de otimização do método. Na Figura 20, apresentam-se algumas fotografias representativas do processo de recolha da amostra. Figura 20 - Fotografias do procedimento de recolha da amostra no Rio Leça e transporte da mesma. ANÁLISE DA AMOSTRA 4.6.2. Procedeu-se à análise da amostra pelos dois métodos otimizados e descritos anteriormente – on-line e off-line-SPE-UPLC-MS/MS. Para cada um dos métodos, a amostra e os padrões de calibração foram sujeitos às mesmas condições. A análise de cada amostra é feita posteriormente a uma calibração. Inês de Castro Ribeiro 47 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO DE UPLC-MS/MS Na otimização do método cromatográfico, foi inicialmente testada a composição da fase móvel. Para as condições iniciais, partiu-se de um gradiente e composição de fases móveis de um protocolo já existente no laboratório, o qual está devidamente certificado para os compostos (Estrona-3-sulfato, 17β-Estradiol, 17α-Estradiol, 17α-Etinilestradiol, Estrona, Diclofenac e Ibuprofeno). 34 Foram efetuados 5 testes (Tabela 7) de modo a conseguir a composição que conseguisse separar de forma eficiente os diferentes compostos presentes na mistura. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 48 Inês de Castro Ribeiro Tabela 7 - Composição das fases móveis testadas para a otimização do processo cromatográfico Teste Composição orgânica Composição aquosa Preparação solução 1 ACN H2O em 10 mM ácido fórmico H2O 2 ACN H2O em 10 mM ácido fórmico H2O em 10 mM ácido fórmico 3 ACN H2O H2O 4 MeOH H2O H2O 5 MeOH H2O H2O em 10 mM ácido fórmico Foi testada a fase móvel de acetonitrilo e água acidificada com ácido fórmico (10 mM) e usado o gradiente descrito no protocolo existente e uma solução de 1 mg.L-1 de uma mistura de todos os fármacos e estrogénios preparada em água. (exceto o bromazepam, diazepem e alprazolam, que foram adicionados ao estudo numa fase posterior) Os resultados obtidos não foram satisfatórios, devido ao facto de não se conseguir obter, no cromatograma, os picos da maior parte dos compostos. Apenas se conseguiram separar e identificar a azitromicina e os estrogénios β-estradiol, 17-α-etinilestradiol, estrona e desogestrel. Decidiu-se então, com base em alguma literatura 7,35,36, testar a fase móvel metanol e água usando as mesmas condições utilizadas anteriormente. O metanol, comparado com o acetonitrilo, é economicamente mais vantajoso e ambientalmente menos desfavorável. Foi finalmente testada a fase móvel com metanol e água acidificando a solução de mistura com ácido fórmico 10 mM 37 e os resultados foram satisfatórios uma vez que se conseguiram separar e identificar todos os picos dos fármacos e estrogénios em estudo num tempo de 12 min. No Anexo A, encontra-se o cromatograma representativo dos 26 compostos separados pelo método otimizado de UPLC-MS/MS. Uma vez conseguidas e definidas as condições para a separação de todos os compostos injetando diretamente no UPLC-MS/MS, com uma concentração de 0,1 mg.L-1, procedeuse a calibração dos compostos usando padrões contendo uma mistura de todos os fármacos e estrogénios com concentração de 5; 7,5; 10; 25; 50; 75 e 100 µg.L-1. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inês de Castro Ribeiro 49 Tabela 8 - Parâmetros obtidos da curva de calibração dos 26 fármacos e estrogénios pelo método de injeção direta Composto Declive Ord. Origem RSQ Tr/min Hidroclorotiazida 112,75 ± 0,03 -51 ± 1 0,9996 2.02 Paracetamol 1345,28 ± 0,03 958 ± 2 0,9995 2.17 Ciprofloxacina 835,48 ± 0,04 -1769 ± 2 0,9993 4,76 Bisoprolol 24206 ± 39 17383 ± 2 0,9993 7,45 Omeprazole 11,6 ± 0,1 -61 ± 6 0,9944 7,51 Furosamida 153,26 ± 0,05 -127 ± 3 0,9986 4,04 Azitromicina 22,3 ± 0,6 81 ± 32 0,9941 9,33 Indapamida 1327,72 ± 0,03 -491 ± 2 0,9996 6,53 Paroxetina 14993,86 ± 0,05 336 ± 3 0,9990 8,74 Nimesulida 691,05 ± 0,06 1307 ± 4 0,9979 7,90 Ketoprofeno 677,93 ± 0,08 -1744 ± 5 0,9968 6,27 Naproxeno 130,55 ± 0,09 -334 ± 5 0,9962 6,58 Fluoxetina 22719,50 ± 0,03 -12182 ± 2 0,9995 9,10 Estrona 115,40 ± 0,03 -264 ± 2 0,9994 8,42 17-α-etinilestradiol 7,63 ± 0,06 -23,297 ± 4 0,9982 8,36 Bezafibrato 251,43 ± 0,06 -544± 4 0,9979 6,48 β-estradiol 16,03 ± 0,08 45 ± 5 0,9971 8,36 Diclofenac 213,51 ± 0,08 -410 ± 5 0,9970 7,70 Progesterona 1933,94 ± 0,09 -4119 ± 6 0,9960 9,00 Ibuprofeno 200,9 ± 0,1 -269 ± 6 0,9948 8,19 Gemfibrozil 546,03 ± 0,1 -532 ± 6 0,9951 8,97 Desogestrel 189,84 ± 0,5 32119 ± 33 0,9391 8,67 Simvastatina 539,55 ± 0,07 -1557 ± 4 0,9975 9,45 Bromazepam 452,57 ± 0,07 -1259 ± 5 0,9972 7,10 Diazepam 2412,74 ± 0,06 -639 ± 3 0,9984 8,51 Alprazolam 3244,84 ± 0,06 -2092 ± 3 0,9984 8,01 Na Tabela 8, encontram-se descritos os valores obtidos de declive, ordenada na origem, coeficiente de correlação das curvas de calibração e tempo de retenção para todos os compostos pelo método de injeção direta. 5.2. OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO POR SPE (SOLID PHASE EXTRACTION) Após a aquisição das curvas de calibração pelo método de injeção direta, avançou-se para a extração por SPE off-line. Para isso, testaram-se dois tipos de colunas (HLB e MAX) e volume de rotura da coluna escolhido. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 50 Inês de Castro Ribeiro ESCOLHA DA COLUNA PARA EXTRAÇÃO POR SPE 5.2.1. No teste das colunas, as condições de extração usadas foram as mesmas do protocolo interno de extração de fármacos já existentes no laboratório e devidamente validados. Estas condições são apresentadas na Tabela 9. Para cada coluna extraíram-se o mesmo volume de solução, 500mL, com concentração de 0,1ugL-1. O extrato foi reconstituído num volume de 500 µL para garantir uma concentração de 1000 vezes e posteriormente foi injetado diretamente no UPLC-MS/MS, utilizando as condições descritas anteriormente. Tabela 9 - Método de extração por SPE offline utilizado neste estudo Solução mistura de compostos 0,1µgL-1 + 10mM HCOOH Acondicionamento 3mL + 3mL meOH Lavagem Água ultrapura Extração 500 mL Amostra/ Padrões Lavagem Água ultrapura Secagem em vácuo Eluição 3mL + 3mL de MeOH Evaporação Até à secura em corrente de azoto Reconstituição 500µL em 25:75 de MeOH:H2O Atendendo aos resultados da extração e sinal direto obtido pela análise por UPLCMS/MS observa-se que em 13 compostos os colunas MAX providenciam valores maiores do que com colunas HLB. No entanto, o sinal resultante da extração por estes últimos existe em todos os compostos, o que não se verifica com as colunas MAX para o fármaco furosemida e diclofenac em que se obtém um sinal residual. Os gráficos que representam os diferentes sinais obtidos para os dois tipos de colunas encontram-se na Figura 21. Perante estes resultados, optou-se pela HLB. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inês de Castro Ribeiro 51 Figura 21 - Comparação dos sinais obtido após extração com colunas HLB e MAX dos vinte e seis fármacos e estrogénios usados na escolha da coluna As colunas MAX são utilizadas em extrações de permuta iónica e são baseadas em ligações electroestáticas. Estas são também mais adequadas à extração compostos mais ácidos. Para que esta troca de iões ocorra tanto a fase estacionária como a amostra deve estar a um pH em que ambos estejam carregados. 32 O método de extração escolhido é o que mais se adequa a este tipo de colunas (HLB) uma vez que o acondicionamento é feito com metanol (polar) que permite a penetração no material adsorvente. A lavagem é feita com água ultrapura molhando a superfície de sílica. Faz-se passar a amostra onde os analitos são retidos no adsorvente. A segunda lavagem com água ultrapura permite a remoção de impurezas. A eluição é feita com um solvente polar (metanol), retirando os analitos adsorvidos no material da fase sólida.25 AVALIAÇÃO DO VOLUME DE ROTURA 5.2.2. Entende-se por volume de rotura o volume mais elevado de amostra que é possível passar através da coluna de extração e que proporciona a recuperação máxima do composto. A partir de determinado volume percolado de amostra, a retenção no adsorvente deixa de ser a máxima possível, sendo este volume variável de acordo com cada composto e o adsorvente em causa. 38 Os quatro volumes testados (100, 250, 500 e 750 mL), contendo a mesma concentração de analito e submetidos a iguais condições de extração, foram analisados no UHPLC- CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 58 Inês de Castro Ribeiro REPETIBILIDADE 5.4.3. A repetibilidade do método de SPE off-line foi estudada através da injeção de 3 replicados do padrão 5 - 0,75 µg-L-1 para a ciprofloxacina e omeprazole, 0,1 µg-L-1 para a simvastatina e azitromicina e 0,01 µg-L-1 para os restantes compostos. A repetibilidade do método de SPE on-line foi estudada através da injeção de 5 replicados independentes do padrão 5 - 0,75 µg-L-1 para o grupo A, 0,1 µg-L-1 para o grupo B. Na Tabela 14 e Tabela 15, estão os valores da média da concentração obtida na análise do padrão 5, o desvio padrão e o coeficiente de variação calculado através da equação 4 para os métodos de extração por SPE-online e SPE-on-line. Tabela 14 - Resultados média concentração, desvio padrão e coeficiente de variação dos 26 compostos em estudo pelo método de extração por SPE off-line SPE off-ine Composto Média / µg.L-1 Desvio Padrão CV (%) Hidroclorotiazida 0,010 0,00084 8,8 Ketoprofeno 0,009 0,0010 11,9 Bezafibrato 0,013 0,00029 2,2 Naproxeno 0,007 0,00093 13,4 Diclofenac 0,010 0,00022 2,2 Estrona 0,013 0,0012 9,6 β-estradiol 0,010 0,00095 9,4 17α-Etinilestradiol 0,010 0,00039 4,2 Fluoxetina 0,011 0,00068 6,1 Azitromicina 0,095 0,0026 2,7 Ciprofloxacina 0,711 0,055 7,9 Omeprazole 0,623 0,103 16,6 Furosamida 0,010 0,00023 2,4 Bisoprolol 0,010 0,00050 4,9 Paroxetina 0,010 0,00055 5,5 Nimesulida 0,010 0,00072 7,1 Ibuprofeno 0,009 0,00080 9,1 Desogestrel 0,009 0,00098 10,6 Progesterona 0,009 0,0014 15,0 Paracetamol 0,009 0,0012 13,2 Indapamida 0,011 0,00057 5,4 Gemfibrozil 0,010 0,00051 5,2 Simvastatina 0,091 0,017 18,8 Alprazolam 0,008 0,0014 17,7 Diazepam 0,009 0,00039 4,3 Bromazepam 0,010 0,00066 6,4 CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inês de Castro Ribeiro 59 Tabela 15 - Resultados média concentração, desvio padrão e coeficiente de variação dos 26 compostos em estudo pelo método de extração por SPE on-line SPE on-line Composto Média / µg.L-1 Desvio Padrão CV (%) Hidroclorotiazida 0,80 0,04 5,23 Ketoprofeno 0,78 0,04 5,40 Bezafibrato 0,64 0,06 9,40 Naproxeno 0,87 0,14 15,8 Diclofenac 0,76 0,11 14,0 Estrona 0,67 0,16 24,1 β-estradiol 0,68 0,13 18,4 17α-Etinilestradiol 0,75 0,10 13,1 Fluoxetina 0,83 0,13 15,6 Azitromicina 0,71 0,12 16,4 Ciprofloxacina 0,64 0,05 8,06 Omeprazole 0,81 0,12 14,7 Furosamida 0,79 0,05 6,00 Bisoprolol 0,65 0,10 15,1 Paroxetina 0,73 0,04 5,09 Nimesulida 0,103 0,007 7,06 Ibuprofeno 0,097 0,010 9,85 Desogestrel 0,096 0,013 13,4 Progesterona 0,10 0,012 12,5 Paracetamol 0,10 0,01 7,77 Indapamida 0,096 0,005 5,22 Gemfibrozil 0,10 0,01 15,3 Simvastatina 0,10 0,02 19,1 Alprazolam 0,12 0,01 8,44 Diazepam 0,087 0,045 51,9 Bromazepam 0,125 0,004 3,64 Os valores obtidos pelo estudo de repetibilidade para o coeficiente de variação, em percentagem, encontram-se todos abaixo de 20% para todos os compostos nos dois diferentes métodos, com exceção da estrona no método de extração por SPE-on-line. RECUPERAÇÃO 5.4.4. A percentagem de recuperação foi calculada de acordo com a equação 5. Nas tabelas 16 e 17 apresentam-se os valores de percentagem de recuperação do método para as técnicas de SPE-off-line e SPE-on-line, respetivamente. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 60 Inês de Castro Ribeiro Tabela 16 - Percentagem de recuperação dos compostos usando o método de SPE off-line e desvio padrão relativo SPE off-line Composto Recuperação (%) RSD Composto Recuperação (%) RSD Hidroclorotiazida 88,1 15,78 Bisoprolol 92,6 7,10 Ketoprofeno 106,8 2,17 Paroxetina 108,3 6,7 Bezafibrato 82,4 8,53 Nimesulida 83,9 2,8 Naproxeno 97,3 7,07 Ibuprofeno 108,9 10,16 Diclofenac 75,7 10,10 Desogestrel 64,0 13,6 Estrona 97,8 24,9 Progesterona 90,8 17,0 β-estradiol 85,6 8,4 Paracetamol 105,6 2,6 17α-Etinilestradiol 97,2 7,9 Indapamida 51,2 2,0 Fluoxetina 94,2 6,4 Gemfibrozil 89,9 15,1 Azitromicina 103,2 2,01 Simvastatina 118,1 5,3 Ciprofloxacina 106,3 10,9 Alprazolam 88,6 7,8 Omeprazole 58,1 13,4 Diazepam 74,8 8,4 Furosamida 96,8 6,86 Bromazepam 54,7 6,9 Tabela 17 - Percentagem de recuperação dos compostos usando o método de SPE on-line e desvio padrão relativo SPE on-line Composto Recuperação (%) RSD Composto Recuperação (%) RSD Hidroclorotiazida 109,3 10,8 Bisoprolol 77,7 12,1 Ketoprofeno 75,8 7,7 Paroxetina 76,3 21,9 Bezafibrato 82,7 10,6 Nimesulida 75,8 6,1 Naproxeno 71,39 11,3 Ibuprofeno 110,4 11,1 Diclofenac 81,4 7,6 Desogestrel 79,9 13,4 Estrona 94,8 8,3 Progesterona 85,8 14,4 β-estradiol 119,1 18,7 Paracetamol 102,1 5,9 17α-Etinilestradiol 79,4 18,9 Indapamida 62,7 7,1 Fluoxetina 101,4 11,6 Gemfibrozil 99,1 7,6 Azitromicina 85,3 17,7 Simvastatina 100,6 7,6 Ciprofloxacina 92,0 14,0 Alprazolam 76,1 13,5 Omeprazole 94,6 15,4 Diazepam 63,7 4,7 Furosamida 104,1 4,9 Bromazepam 103,8 5,2 Dos resultados apresentados nas Tabelas 16 e 17 verifica-se que as percentagens de recuperação dos compostos estudados variam entre 51.2% e 118,1% para o método com extração por off-line-SPE e entre 62,7% e 110,4% para o método com extração por SPEon-line. Nos dois métodos a percentagem média de recuperação é de 89,3 para o SPEoffline e de 88,7 para o SPE-on-line. CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inês de Castro Ribeiro 61 5.5. APLICAÇÃO DOS MÉTODOS A AMOSTRAS DO RIO LEÇA As amostras do Rio Leça foram analisadas pelo método de SPE-off-line-UPLC-MS/MS e pelo método de SPE-online-UPLC-MS/MS sendo usado o método da curva de calibração. No método de SPE-offline, o extrato obtido foi medido três vezes pelo método de injeção direta no UPLC-MS/MS. Para a análise da amostra pelo método de on-line-SPE-UPLCMS/MS, foram realizadas 5 medições independentes. Na Tabela 18, é apresentado a média da concentração obtida para cada composto, desvio padrão e coeficiente de variação. Tabela 18 - Valores da média das concentrações obtidas na amostra do rio Leça pelo método de SPE-on-line-UPLC-MS/MS Composto SPE off-line SPE on-line Rio Leça µg.L-1 RSD Rio Leça µg.L-1 RSD Hidroclorotiazida 0,15 (c) - 0,17 (b) 10,41 Ketoprofeno 0,049 9,1 0,053 (b) 17,99 Bezafibrato 0,074 10,6 0,090 (b) 0,64 Naproxeno 0,053 25,3 0,046 (a) 2,18 Diclofenac 0,058 14,5 0,071 (a) 15,37 Estrona - - - - β-estradiol - - - - 17α-Etinilestradiol - - - - Fluoxetina - - - - Azitromicina 0,027 12,3 - - Ciprofloxacina - - - - Omeprazole - - - - Furosamida 0,051 (c) 9,8 0,059 (a) 1,31 Bisoprolol 0,065 14,8 0,21 (b) 11,18 Paroxetina - - - - Nimesulida - - 0,020 (a) 5,2 Ibuprofeno 0,019 15,7 0,016 (a) 6,94 Desogestrel - - - - Progesterona - - - - Paracetamol 0,001(a) 15,8 - - Indapamida - - 0,01 (b) 207,04 Gemfibrozil 0,008 5,4 - - Simvastatina - - - - Alprazolam 0,006 4,8 0,005 (a) 12,4 Diazepam 0,001 (c) 70,3 - - Bromazepam - - - - (a) - valores inferiores a LD; (b) - valores inferiores ao LQ e superiores ao LD; (c) – valor está fora da gama de trabalho CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 62 Inês de Castro Ribeiro Os resultados obtidos para o método de análise por UPLC-MS/MS com extração por SPE-off-line encontram-se abaixo daqueles que foram conseguidos com o método automatizado de on-line-SPE-UPLC-MS/MS. Isto poderá dever-se a eventuais perdas no processo de extração off-line-SPE, uma vez que este possui mais passos e, como tal, introduz mais erros. No entanto esses valores, ao contrário do método automatizado, estão acima do LQ obtido para esse método, com a exceção da hidroclorotiazida e a furosemida, que se encontram acima do limite mais alto da gama de trabalho e o diazepam que se encontra abaixo do limite mais baixo. Os compostos azitromicina, paracetamol, gemfibrozil e diazepam foram apenas detetados pelo método de determinação usando a extração por off-line-SPE. Os compostos nimesulida e indapamida apenas foram detetados pelo método de determinação por on-line-SPE-UPLC-MS/MS. Os resultados obtidos da análise da amostra por on-line-SPE-UPLC-MS/MS para os fármacos detetados estão abaixo do limite de deteção e quantificação calculados teoricamente. Os fármacos hidroclorotiazida, ketoprofeno, bezafibrato, bisoprolol e indapamida encontram se acima do limite de deteção mas abaixo do limite de quantificação. Os restantes compostos não foram detetados. Inês de Castro Ribeiro 63 6 CONCLUSÃO No decorrer do desenvolvimento do trabalho foram otimizados alguns parâmetros e condições experimentais no método de análise por UPLC-MS/MS. Esses parâmetros, tais como, as condições de ionização e fragmentação e a composição da fase móvel, foram efetuados no sentido de proporcionar a melhor separação cromatográfica dos 26 compostos em estudo e a sua deteção e quantificação. A deteção por espectrometria de massa por triplo quadrupolo, no modo positivo e negativo para aquisição de dados, revelou ser adequada em termos de sensibilidade e especificidade, garantindo também uma boa avaliação quantitativa dos analitos. As condições cromatográficas de separação pelo método direto demonstraram uma boa separação dos fármacos e estrogénios, com picos bem definidos e boa quantificação dos padrões e amostras, num intervalo de 12 minutos. Essas condições são constituídas por uma fase móvel com gradiente de água e metanol e a preparação da solução, acidificada com ácido fórmico 10 mM. Para a extração em fase sólida, SPE, foi a coluna de extração HLB a que mostrou ser mais adequado aos compostos em estudo e o volume de rotura de 500 mL o volume para o qual a retenção do adsorvente é máxima. CAPÍTULO 6. CONCLUSÃO 64 Inês de Castro Ribeiro Assim, na análise da água do Rio Leça por UPLC-MS/MS com prévia extração por SPE foram detetados e quantificados os fármacos ketoprofeno (0,049 µg.L-1); bezafibrato (0,074 µg.L-1); naproxeno (0,053 µg.L-1); diclofenac (0,058 µg.L-1); azitromicina (0,027 µg.L-1); bisoprolol (0,065 µg.L-1); ibuprofeno (0,019 µg.L-1); gemfibrozil (0,008 µg.L-1) e alprazolam (0,006 µg.L-1). Os limites de deteção e quantificação também foram avaliados e encontram-se abaixo dos valores de concentração obtidos para estes fármacos com exceção do paracetamol. Os fármacos hidroclorotiazida e furosemida e diazepam apresentam valores de concentração fora da gama de trabalho determinada para cada composto. O método on-line-SPE-UPLC-MS/MS garantiu com as condições escolhidas – gradiente temperatura da coluna e composição do eluente - uma boa separação dos compostos também em 12min. No entanto, este método necessita de alguns ajustes a fim de poder apresentar uma melhor separação e definição dos picos dos compostos diazepam, fluoxetina, paroxetina e azitromicina. Para o método de determinação por on-line-SPE-UPLC-MS/MS, obtiveram-se limites de deteção altos, quando comparados com o anterior método. Os valores de concentração dos compostos detetados, presentes também na amostra sujeita ao processo de extração manual foram ketoprofeno (0,053 µg.L-1); bezafibrato (0,090 µg.L-1); naproxeno (0,046 µg.L-1); diclofenac (0,071 µg.L-1); bisoprolol (0,21 µg.L-1); ibuprofeno (0,016 µg.L-1); e alprazolam (0,005 µg.L-1) com exceção da azitromicina, paracetamol, gemfibrozil e diazepam, que este método não detetou e a indapamida (0,01 µg.L-1); e a nimesulida (0,020 µg.L-1) que foi detetada por este método mas não pelo anterior. Estes valores encontram-se todos abaixo do LQ teoricamente calculado. Este estudo é o início de um caminho que pode vir a ser feito no âmbito de determinação e quantificação de diversos poluentes emergentes. Inês de Castro Ribeiro 65 BIBLIOGRAFIA 66 Inês de Castro Ribeiro Bibliografia 1. Fármacos, A. D. E., Águas, E. M. & Ms, P. O. R. S. ANÁLISE DE FÁRMACOS EM ÁGUAS POR SPE-UPLC-ESI-MS/MS. Quim. Nov. 37, 138–149 (2014). 2. Deblonde, T., Cossu-Leguille, C. & Hartemann, P. Emerging pollutants in wastewater: a review of the literature. Int. J. Hyg. Environ. Health 214, 442–8 (2011). 3. Rosal, R. et al. Occurrence of emerging pollutants in urban wastewater and their removal through biological treatment followed by ozonation. Water Res. 44, 578–88 (2010). 4. Lopez de Alda, M. J., Díaz-Cruz, S., Petrovic, M. & Barceló, D. Liquid chromatography-(tandem) mass spectrometry of selected emerging pollutants (steroid sex hormones, drugs and alkylphenolic surfactants) in the aquatic environment. J. Chromatogr. A 1000, 503–26 (2003). 5. Kümmerer, K. 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