Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis

Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis ANA RITA MARQUES DA SILVA DOUTORAMENTO EM MEDICINA DENTÁRIA PORTO | 2013 iii Aos meus Pais e aos meus Irmãos. iv Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva v “Morre lentamente quem passa os dias queixando-se da má sorte ou da chuva incessante, Desistindo de um projeto antes de iniciá-lo, não perguntando sobre um assunto que desconhece e não respondendo quando lhe indagam o que sabe.” Pablo Neruda “The only source of knowledge is experience.” Einstein vi Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva vii Tese submetida à Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto para candidatura à obtenção do grau de Doutor em Medicina Dentária Este trabalho foi realizado sob o regime de cotutela Internacional: FACULDADE DE MEDICINA DENTÁRIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO | PORTUGAL ORIENTADOR | Prof. Doutor Manuel Fontes de Carvalho COORIENTADORA | Prof.ª Doutora Irene Pina-Vaz FACULDADE DE ODONTOLOGIA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA | BRASIL ORIENTADOR | Prof. Doutor João Carlos Gomes viii Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva ix D DO OC CE EN NT TE ES S D DA A F FA AC CU UL LD DA AD DE E D DE E M ME ED DI IC CI IN NA A D DE EN NT TÁ ÁR RI IA A D DA A U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD DE E D DO O P PO OR RT TO O CONSELHO CIENTÍFICO Prof. Doutor Afonso Manuel Pinhão Ferreira Prof. Doutor Américo dos Santos Afonso Prof. Doutor António Cabral Campos Felino Prof. Doutor César Fernando Coelho Leal Silva Prof. Doutor Germano Neves Pinto Rocha Prof.ª Doutora Inês Alexandra Costa Morais Caldas Prof.ª Doutora Irene Graça Azevedo Pina Vaz Prof. Doutor João Carlos Antunes Sampaio Fernandes Prof. Doutor João Carlos Gonçalves Ferreira de Pinho Prof. Doutor João Fernando Costa Carvalho Prof. Doutor Jorge Manuel Carvalho Dias Lopes Prof. Doutor José António Macedo Carvalho Capelas Prof. Doutor José Carlos Reis Campos Prof. Doutor José Mário Castro Rocha Prof. Doutor Manuel José Fontes de Carvalho Prof.ª Doutora Maria Cristina P. C. M. Figueiredo Pollmann Prof.ª Doutora Maria Helena Guimarães Figueiral da Silva Prof.ª Doutora Maria Helena Raposo Fernandes Prof.ª Doutora Maria Lurdes Ferreira Lobo Pereira Prof. Doutor Mário Augusto Pires Vaz Prof. Doutor Mário Jorge Rebolho Fernandes Silva Prof. Doutor Mário Ramalho Vasconcelos Prof. Doutor Miguel Fernando Silva Gonçalves Pinto Prof. Doutor Paulo Rui Galrão Ribeiro Melo Prof. Doutor Ricardo Manuel Lobo Faria Almeida xvi Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva FIGURA 32 - COLOCAÇÃO DE CALDO DE BHI NO INTERIOR DOS CANAIS. ............................ 60 FIGURA 33 - HALOS (MM) DE INIBIÇÃO FORMADA PELAS MEDICAÇÕES INTRACANAL TESTADAS (1, CHX; 2, PC; 3, NIT; 4, DX; E 5, GEL DE NATROSOL) FACE ÀS BACTÉRIAS (A) E. COLI, (B) S. AUREUS, (C) E. FAECALIS, (D) P. AERUGINOSA E AO FUNGO (E) C. ALBICANS. ....................................................................................................... 66 FIGURA 34 – PLACAS DE MICRODILUIÇÕES DE 96 POÇOS COM AS DILUIÇÕES DAS MEDICAÇÕES INTRACANAL TESTADAS (CHX, PC, NIT, DX) CONTRA AS BACTÉRIAS (A) E. COLI, (B) S. AUREUS, (C) E.FAECALISI, (D) P. AERUGINOSA E O FUNGO (E) C. ALBICANS. . ............................................................................................................................ 70 FIGURAS 35 – HALOS (MM) DE INIBIÇÃO FORMADOS PELAS MEDICAÇÕES INTRACANAL TESTADAS ATRAVÉS DOS CANALÍCULOS DENTINÁRIOS FACE À ENTEROCOCCUS FAECALIS: (A) 1 – CHX; 2 – SM E 5 – DX; (B) 3 – PC E 4 – NIT.............................................. 73 FIGURA 36 - ANÁLISE DAS UFC’S DE UM DENTE DO GRUPO DO GEL DX: (A) UFC DE S1, APÓS 21 DIAS DE CONTAMINAÇÃO DOS ESPÉCIMES DENTÁRIOS COM E. FAECALIS. (B) UFC DE S2, APÓS 14 DIAS COM A MEDICAÇÃO INTRACANALAR. (C) UFC DE S3 APÓS 7 DIAS COM MEIO BHI NO INTERIOR DOS CANAIS. .................................................. 76 ÍNDICE DE FIGURAS xvii ÍNDICE DE TABELAS TABELA 1 - AGENTES NEUTRALIZANTES DE ACORDO COM O TIPO DE COMPOSTO. . ........ 35 TABELA 2 - DIVISÃO DOS ESPÉCIMES PELOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTAIS. ..... 46 TABELA 3 - DIVISÃO DOS DENTES PELOS DIFERENTES GRUPOS EXPERIMENTAIS. ........... 52 TABELA 4 - MÉDIAS E DESVIOS-PADRÃO DOS DIÂMETROS DOS HALOS (MM) DE INIBIÇÃO FORMADOS PELAS MEDICAÇÕES INTRACANAL TESTADAS CONTRA AS BACTÉRIAS DE GRAM POSITIVO, GRAM NEGATIVO E A UM FUNGO. . .............................. 67 TABELA 5 - MÉDIAS E DESVIO-PADRÃO DAS UFC DOS DIFERENTES GRUPOS EM FUNÇÃO DO TEMPO. .............................................................................................................. 77 xviii Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva ÍNDICE DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 - GRÁFICO DE BARRAS DA CIM DE CADA SOLUÇÃO COM AÇÃO ANTIMICROBIANA FACE À E. COLI (E.C.), S. AUREUS (S.A.), E. FAECALIS (E.F.), P. AERUGINOSA (P. A.) E O FUNGO C. ALBICANS (C.A.).......................................................... 71 GRÁFICO 2 - BOX-PLOT DOS VALORES DOS HALOS DAS DIFERENTES MEDICAÇÕES ATRAVÉS DOS DENTES APÓS 24H. TESTE KRUSKAL-WALLIS (Χ2=47.126; P<.001).* ....... 74 GRÁFICO 3 - QUANTIFICAÇÃO DAS UFC’S NOS GRUPOS/MEDICAÇÕES EM FUNÇÃO DO TEMPO: (S1) 1º MOMENTO – APÓS 21 DIAS DE CONTAMINAÇÃO, (S2) 2ºMOMENTO – APÓS 14 DIAS COM MEDICAÇÃO INTRACANALAR, (S3) 3º MOMENTO – APÓS 7 DIAS COM CALDO DE BHI. ANOVA DE MEDIDAS REPETIDAS NA ANÁLISE SO TEMPO E INTERAÇÃO TEMPO E GRUPO/MEDICAÇÃO. ....................................................................... 78 xix SÍMBOLOS E ABREVIATURAS °C | Graus Celsius µL | Microlitro ADN | Ácido desoxirribonucleico ATCC | American Type Culture Collection atm | Atmosfera(s) BDH | Banco de Dentes Humanos BHI | Brain Heart Infusion C. a. | Candida albicans CHX | Gel de clorohexidina a 2% CIM | Concentração Inibitória Mínima cm | Centímetros CO2 | Dióxido de carbono COEP | Comissão de Ética em Pesquisa CT | Comprimento de Trabalho DX | Gel de doxiciclina a 3% xx Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva E c. | Escherichia coli E.f. | Enterococcus faecalis EDTA | Ethylenediaminetetraacetic Acid EDTA Na2 | Ethylenedinitrilo Tetraacetic Acid Disodium Salt et al. | e outros EUA | Estados Unidos da América Fc | Fator de correção g | Grama(s) h | Hora(s) IA | Instrumento Anatómico IL | Illinois LPS | Lipopolissacarídeo MH | Muller Hinton MIC | Minimum Inibitory Concentration min | Minuto(s) mL | Mililitro(s) mm | Milímetro(s) MTAD | Mistura de Tetraciclina (doxiciclina), Ácido cítrico e um Detergente (Tween 80) n | Número de amostras nº | Número Na2HPO4 | Fosfato de disódico anidro NaClO | Hipoclorito de sódio NaH2PO4 | Fosfato de sódio monobásico anidro NaOH | Hidróxido de sódio NCCSL | National Comittee for Clinical Laboratory Standards NIT | Gel de nitrofurantoína a 3% p | Nível de significância P. a. | Pseudomonas aeruginosa PBSC | Suspensão de penicilina, bacitracina, estreptomicina e caprilato de sódio PC | Gel placebo rpm | Rotações por minuto S. a. | Staphylococcus aureus S1 | Primeira colheita após 21 dias de contaminação dos espécimes dentários com E. faecalis S2 | Segunda colheita após 14 dias com medicação intracanal S3 | Terceira colheita após 7 dias com caldo de BHI no interior do canal SM | Sem Medicação SF | Soro Fisiológico SPSS | Statistical package for the social sciences UEPG | Universidade Estadual de Ponta Grossa UFC | Unidades Formadoras de Colónias SÍMBOLOS E ABREVIATURAS xxi AGRADECIMENTOS Começo por agradecer à minha Família, em especial aos meus Pais e aos meus Irmãos, que me apoiaram e me incentivaram de uma forma incondicional, tornando possível a conclusão deste desafio. Três anos de muito trabalho, esforço e dedicação. Ao longo deste período, foram inúmeras as vivências e as pessoas que se cruzaram no meu percurso e que, direta ou indiretamente, me ajudaram e estimularam, viabilizando a concretização deste projeto. Realço aqui os agradecimentos: Ao Professor Doutor Manuel Fontes de Carvalho e à Professora Doutora Irene Pina-Vaz, orientador e coorientadora da minha tese em Portugal, por me terem sugerido e incentivado para este desafio; pela amizade, paciência, dedicação, xxii Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva disponibilidade e pela partilha dos conhecimentos fundamentais para a minha formação científica. Ao Professor Doutor João Carlos Gomes, orientador da minha tese no Brasil, por me ter recebido de braços abertos, por toda amizade, carinho, confiança e ajuda mesmo nos momentos mais difíceis; sem nunca esquecer a constante presença e apoio que acabaram por se transformar numa relação mais familiar. À Professora Doutora Osnara Mongruel Gomes, Coordenadora do Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Odontologia - UEPG, por todo o seu carinho, dedicação e preocupação pelos “filhos” estrangeiros. À Professora Doutora Elizabete Brasil dos Santos, pela sua boa disposição e alegria contagiante, pela amizade, confiança (mesmo quando as coisas não corriam bem), pela sua fantástica dedicação e preciosa ajuda, nunca esquecendo a contribuição académica dada para que pudesse concretizar todos os meus trabalhos. Acho que nunca vou ter palavras suficientes para lhe agradecer tudo o que fez por mim! Ao Professor Doutor Fábio André dos Santos e ao Professor Doutor Paulo Vitor Farago, por terem feito com que olhasse para a investigação com outros olhos. Por me terem ajudado a construir e a fazer com que a concretização deste projeto fosse possível. Foi um orgulho poder trabalhar com eles. Muito obrigada pela paciência, dedicação e amizade. Ao Professor Carlos Roberto Berger pela sua disponibilidade, ajuda no projeto e por me ter dado a oportunidade de assistir às suas aulas de Endodontia, podendo desta forma enriquecer os meus conhecimentos. Aos Professores do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade Estadual de Ponta Grossa, Alessando Loguercio, Alessandra Reis, Maiza Althaus e Denise Zanon, pelo apoio e pelo conhecimento adquirido em cada aula. AGRADECIMENTOS xxiii À Shelon Souza e à Janaina Diniz que, juntamente com a Professora Elizabete Brasil, me ensinaram e apoiaram em praticamente todo o trabalho no laboratório. Indescritível a simpatia, alegria, companheirismo e otimismo que reinava naquele laboratório, em grande parte graças à presença destas pessoas fantásticas. Posso dizer que fiz lá verdadeiras amigas! Muito obrigada por toda a ajuda, foram incansáveis. À Bete do laboratório de Farmacologia, que me apoiou e ajudou sempre que precisei. Ao Milano, pela sua simpatia, amizade e por não se ter importado de partilhar comigo o seu local de trabalho (sala de radiologia) durante alguns dias. À minha família “Pires”, por todo o apoio, ajuda e companheirismo, por terem estado ao meu lado nas alturas em que mais precisei. Sabe bem quando nos apercebemos que é preciso bem mais que um oceano para destruir os laços de uma verdadeira amizade. Aos meus colegas e amigos da turma do Mestrado e do Doutorado, por todo o carinho e amizade. Ao Sr. Noel Pires e ao Léo pela amizade e pelo carinho com que me trataram. Ao Daniel Herrera, pelas dicas e ajuda para a realização do projeto. À Cláudia Figueiredo pela amizade, carinho, paciência e por me ter dado uma enorme ajuda na análise estatística do projeto. Aos meus Amigos por continuarem a cruzar o meu caminho com sorrisos, abraços e, acima de tudo, amizade verdadeira. Agradeço ainda a todas as pessoas que, de alguma forma, colaboraram com a realização deste trabalho. AGRADECIMENTOS xxiv Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva xxv TRABALHOS E PUBLICAÇÕES Com base neste trabalho experimental, foram realizados os seguintes trabalhos e publicações: 1. Posters - New intracanal formulations: antimicrobial effect on the external root surface: Silva, A.R.; Santos, E.B.; Santos, F.A.; Gomes, J.C.; Carvalho, M.F.. 91th General Session & Exhibition of the IADR, Seattle, Washinton, USA, Março de 2013. - New intracanal formulations containing doxycicline or chlorexidine against Enterococcus faecalis: Silva, A.R.; Santos, E.B.; Farago, P.V.; Gomes, J.C.; 6Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Conclusion: From the two formulations suggested in this study, DX presented better antimicrobial effect against the microorganisms in the study (agar diffusion and MIC), supported by the effect on the external root surface and inside the root canal system. This new formulation containing DX can be considered as a possible intracanal dressing, namely in cases of endodontic failure. Key words Enterococcus faecalis, Endodontics, Doxycycline, Nitrofurantoin, Chlorhexidine ABSTRACT 7 1 INTRODUÇÃO Os microrganismos têm um papel etiológico crucial nas doenças pulpares e periapicais (1, 2). Assim, o objetivo principal do tratamento destas situações clínicas passa pela sua eliminação, permitindo, na maioria das vezes, a resolução do problema (3). Estes microrganismos desenvolvem-se no interior dos canais radiculares, sob a forma de biofilmes sésseis. O êxito do tratamento endodôntico estará dependente da eficácia da sua completa erradicação antes da obturação, ou, pelo menos, da redução microbiana para valores suscetíveis de permitir a cura (4-6). O insucesso do tratamento endodôntico tem sido atribuído à persistência de microrganismos no interior dos canais, os quais sobrevivem à preparação mecânica e química destes (20). Neste tipo de infeções secundárias, os microrganismos E. faecalis e C. albicans são frequentemente isolados, por vezes em monoinfeções (7, 8). 1 8Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Devido à complexidade do sistema de canais radiculares, a ação mecânica e química dos instrumentos e soluções irrigadoras não é, por vezes, suficiente para a total eliminação dos microrganismos. Surge, por isso, a necessidade de complementar o tratamento químico-mecânico com uma medicação intracanal, de forma a atingir microrganismos mais resistentes, presentes em locais menos acessíveis. Esta medicação deverá atuar no lúmen do canal principal (9-12) e difundirse através dos canais acessórios e túbulos dentinários, aumentando, desta forma, a possibilidade de atingir um maior número de microrganismos e melhorar a taxa de sucesso do tratamento endodôntico (12-14). A medicação intracanal ideal deverá possuir um amplo espetro de ação antimicrobiano, ter capacidade de difusão, e não apresentar citotoxicidade para os tecidos envolventes (15, 16). Apesar da grande variedade de medicação intracanal existente, há estudos que evidenciam que a pasta de hidróxido de cálcio é a que se aproxima mais da formulação ideal (17, 18). No entanto, esta não se mostrou igualmente eficaz para todos os microrganismos isolados nos canais radiculares (19). O gluconato de clorohexidina foi recentemente introduzido devido ao seu amplo espetro antibacteriano (20, 21). Este inclui grande parte dos microrganismos existentes na cavidade oral, como bactérias de gram positivo e negativo, esporos bacterianos e vírus lipofílicos (22-27). Devido a esta característica e ao facto de apresentar contínua disponibilidade em níveis terapêuticos (28-30), o seu uso em Endodontia tem sido proposto tanto sob a forma de solução de irrigação como de medicação intracanal (31, 32). A clorohexidina é também caracterizada pela sua capacidade de inibir a matriz metaloproteinase da dentina (22), apresentar uma elevada substantividade (23, 30) e ter uma ação mais eficaz na eliminação de E.faecalis e C. albicans, comparativamente ao hidróxido de cálcio (33, 34). No grupo das medicações intracanal estão também incluídos alguns antibióticos. As tetraciclinas apresentam um amplo espetro de ação (35). A capacidade bacteriostática (36) deste grupo de antibióticos pode ser considerada vantajosa, uma vez que não INTRODUÇÃO 9 promove a lise bacteriana e a consequente libertação de antigénios, nomeadamente endotoxinas (35). Para além da atividade antibacteriana, as tetraciclinas têm propriedades anti-inflamatórias, as quais poderão influenciar a cicatrização dos tecidos periapicais (37). Este grupo de antibióticos foi já usado em Endodontia, tanto em formulações de irrigação (21) como em medicação intracanal (38). Em 2003, foi introduzida uma solução de irrigação, MTAD (35), constituída por uma mistura de doxiciclina a 3%, ácido cítrico a 4,25% e um detergente a 0,5% (polissorbato 80) (39). Segundo alguns estudos, esta formulação apresentava-se como uma solução de irrigação promissora tanto pelo efeito antibacteriano face ao E. faecalis (40-42) como pela biocompatibilidade tecidular (43). No entanto, a acidez desta solução (pH=2,15) revelou poder ser a causa de alterações estruturais na dentina radicular (44, 45). A nitrofurantoína, frequentemente usada nas infeções do trato urinário, é eficaz contra grande parte das bactérias de Gram negativo e de Gram positivo, incluindo E. faecalis (46-50). Alguns estudos demonstraram que a nitrofurantoína é mais eficaz que a doxiciclina na eliminação de E. faecalis (50, 51). O objetivo deste estudo foi propor duas novas formulações de medicação intracanal, utilizando antibióticos, e avaliar, in vitro, qual teria a melhor capacidade de difusão, a menor concentração inibitória mínima (CIM) e o melhor potencial antimicrobiano como medicação intracanal, quando em contacto com alguns dos microrganismos frequentemente isolados em casos de insucesso endodôntico. INTRODUÇÃO 10 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 11 2 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA Muitos dos fracassos endodônticos são atribuídos à proliferação bacteriana que permanece após a preparação biomecânica e obturação dos canais radiculares, ou ainda devido à recontaminação causada pela perda de selamento coronário e/ou por uma obturação inadequada (8, 52-56). Outros fatores como a falha no isolamento absoluto durante o tratamento endodôntico e a instrumentação inadequada, bem como a não deteção de todos os canais radiculares existentes, podem conduzir a insucessos (8). Mesmo com um tratamento endodôntico meticuloso e cuidado, os fracassos podem ainda surgir devido à complexidade anatómica do sistema canalar. Este fator é o responsável pela não instrumentação e obturação das zonas de difícil acesso do sistema radicular, mesmo recorrendo às diversas técnicas e materiais inovadores (52). Existem ainda outros aspetos, não microbianos, que podem induzir uma inflamação periradicular mas que, devido à sua natureza não microbiana, encontram-se normalmente associados a uma reação transitória. Há ainda autores 2 12 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva que sugerem o envolvimento de fatores não microbianos intrínsecos ou extrínsecos, na origem de lesões periradiculares persistentes (57). No que diz respeito à etiologia microbiana, esta pode dever-se a fatores dependentes da restauração, como as propriedades químicas e físicas dos próprios materiais, e a fatores decorrentes do tratamento endodôntico, como as diferentes técnicas de obturação, bem como a presença ou ausência de smear layer (8, 52-55, 58, 59). Estas situações de infiltração vão permitir o acesso de microrganismos da cavidade oral e substâncias irritantes ao interior do canal obturado, com eventuais repercussões nos tecidos periapicais, podendo pôr em causa o sucesso do tratamento (56, 60-62). Há estudos que comprovam que a periodontite apical pós-tratamento endodôntico (periodontite secundária) apresenta uma contagem bacteriana mais baixa e com um menor número de espécies, comparativamente com a periodontite apical primária (8, 63-67). As bactérias isoladas nos casos de periodontite secundária são predominantemente de Gram positivo. Através de técnicas de cultura são isoladas, com elevada prevalência, bactérias anaeróbias facultativas, tais como Enterococcus, Streptococcus e Actinomyces; anaeróbias estritas como Peptostreptococcus; e fastidiosas como Dialister pneumosintes e Filifactor alocis (7). Nos casos de periodontite apical pós-tratamento endodôntico, ainda se realça a presença de E. faecalis e C. albicans pela sua frequência e elevada prevalência em relação às primárias (7, 8). Nestas situações, a presença do E. faecalis é mencionada por vários autores (8, 63, 64, 66, 67). O E. faecalis é caracterizado pela sua resistência à maioria da medicação intracanal com principal destaque para a pasta de hidróxido de cálcio (13, 16, 19, 67-69). Segundo Evans (2002), este facto deve-se não tanto a uma resposta adaptativa ao pH alcalino através da síntese de proteínas, mas sim ao funcionamento de uma bomba de protões capaz de acidificar o citoplasma, controlando desta forma o pH interno da bactéria (70). Uma outra característica de E. faecalis é a sua capacidade de resistir a CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA 13 longos períodos de escassez ou mesmo ausência de alimento, recuperando o suporte nutricional para a sua sobrevivência assim que entra em contato com um meio rico em nutrientes. Consegue, desta forma, manter as suas propriedades patogénicas durante o tratamento endodôntico e consequentemente o potencial de manter a infeção (71). Contudo, continua a ser necessário confirmar, através de estudos controlados, se E. faecalis é o patogénico de maior relevância nos casos de insucesso endodôntico. Todo este conhecimento taxonómico da população microbiana dos canais radiculares é frequentemente baseado em técnicas de cultura microbiológica. A aplicação de métodos de genética molecular aumentou o conhecimento sobre o espetro da população microbiana endodôntica, para além de ter confirmado muitos dos resultados obtidos através das técnicas de cultura clássica (72, 73). Com os avanços da biologia molecular será possível compreender um pouco mais sobre a complexa interação entre os fatores microbiológicos e o hospedeiro, e assim ter uma imagem mais clara sobre a patogénese da doença do ponto de vista subcelular (52, 74). Os avanços verificados na técnica de sequenciação do ADN e na biologia computacional têm também contribuído tanto para o conhecimento da população microbiana como da etiopatogenia da periodontite apical (73). A preparação química e mecânica dos canais reduz substancialmente a carga microbiana no seu interior. Contudo, estes estudos revelam que existem bactérias que poderão manter-se viáveis após a preparação do canal, podendo multiplicar-se durante o período entre sessões. O uso de medicação intracanal com propriedades antibacterianas poderá ajudar a evitar estas situações (75-78). Esta medicação poderá eliminar ou inibir a proliferação de bactérias resistentes à preparação química e mecânica dos canais, prevenindo a reinfeção por bactérias oriundas da cavidade bucal, mesmo que por qualquer motivo o canal fique exposto a esta (68, 78, 79). A medicação intracanal deve ter um amplo espetro antimicrobiano, não deve ser citotóxica e deve ter propriedades físico-químicas que permitam a difusão através dos túbulos dentinários e das ramificações laterais do sistema de canais radiculares (15, 16). Estes fármacos não devem interferir com a integridade da estrutura dentinária, CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA 14 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva sob o risco de comprometerem o sucesso de possíveis intervenções de reabilitação (80, 81). Várias foram as substâncias propostas para serem usadas como medicação intracanal. Dentre elas o hidróxido de cálcio, o paramonoclorofenol canforado, a clorohexidina e ainda os antibióticos de aplicação tópica. O hidróxido de cálcio, forte substância alcalina, é uma das medicações mais comuns pois possui grande parte das propriedades ideais de uma medicação intracanal. Destaca-se quer pelas suas propriedades antimicrobianas, quer pelas biológicas. A sua ação antimicrobiana está relacionada com a dissociação iónica dos iões de cálcio e hidroxilo, e com o seu efeito tóxico sobre as bactérias através da inibição das enzimas das membranas citoplasmáticas, que induzem alterações nos componentes orgânicos e no transporte de nutrientes (9, 68, 82). Perante isto, e devido ao pH de 12,5 do hidróxido de cálcio, várias bactérias encontradas nos canais radiculares infetados, são inviabilizadas após um curto período de tempo (13). Para que o hidróxido de cálcio seja eficaz como medicação intracanal, os iões hidroxilo devem ser capazes de difundir através dos túbulos dentinários e tecido pulpar. Contudo, foi comprovado que o valor do pH diminui à medida que aumenta a distância ao lúmen do canal radicular (17). Para além deste fator, alguns autores demonstraram que o pH da dentina pode permitir a sobrevivência ou crescimento de determinadas estirpes bacterianas, uma vez que a grande maioria cresce em ambientes com um pH entre 6 e 9 (17, 83). Porém, a medicação intracanal com hidróxido de cálcio continua a ter um papel fundamental em Endodontia, sendo indicada para várias situações clínicas. Outra medicação frequentemente usada em Endodontia é o paramonoclorofenol canforado. É um derivado fenólico que, apesar de ter um efeito tóxico nos tecidos periapicais, tem uma elevada atividade antisséptica. Para reduzir esta toxicidade e ao mesmo tempo manter, ou aumentar, a atividade antimicrobiana, têm sido propostas combinações do paramonoclorofenol com diferentes agentes, veículos e métodos de aplicação (13, 84, 85). CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA 15 No caso da associação do hidróxido de cálcio com o paramonoclorofenol, verificouse que esta mistura apresenta um espetro antibacteriano mais abrangente, eliminando microrganismos resistentes ao hidróxido de cálcio, e sendo mais rápido na sua eficácia antibacteriana quando comparado com o hidróxido de cálcio misturado com veículos inertes como a água, soro ou glicerina. O raio de ação antibacteriana também é maior, uma vez que atua em microrganismos que se encontram afastados do local preenchido pela pasta de hidróxido de cálcio (19, 86-90). Este facto deve-se aos compostos fenólicos que possuem uma baixa tensão superficial, conseguindo, mais facilmente, passar através dos túbulos dentinários (91). Relativamente à resposta dos tecidos periapicais, esta associação de hidróxido de cálcio com o paramonoclorofenol canforado tem apresentado bons resultados. Com esta associação há libertação de sais de cálcio paramonoclorofenolato juntamente com os grupos hidroxilo, ambos bactericidas. Estudos comprovaram que a resposta tecidular é favorecida pela libertação lenta desses sais de cálcio paramonoclorofenolato, em concentrações que não induzem a destruição dos tecidos (91, 92). O digluconato de clorohexidina é uma “bis-bis-guanida” de natureza catiónica com propriedades antibacterianas, antissépticas, com alguma substantividade e baixa toxicidade em mamíferos (25, 27, 93). Graças a estas características, tem sido usada em várias áreas da Medicina Dentária e também em Endodontia como solução de irrigação (31, 94) e medicação intracanal (9, 88, 95). O seu mecanismo de ação deve-se à interação da carga positiva da molécula com a carga negativa dos grupos fosfato existentes nas paredes celulares dos microrganismos (16, 96), que vão provocar a perda irreversível de constituintes citoplasmáticos, inibição enzimática e danos na membrana celular (20, 21, 27, 97). A clorohexidina a baixas concentrações provoca a perda de substâncias de baixo peso molecular, resultando num efeito bacteriostático. Em elevadas concentrações, a clorohexidina tem um efeito bactericida devido à precipitação e/ou coagulação de componentes citoplasmáticos (96, 98). CONTEXTUALIZAÇ ÃO DO PROBLEMA 22 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 2. Avaliar a ação antimicrobiana dos géis NIT e DX como medicação intracanal, na superfície externa da raiz a partir de uma adaptação do método de difusão em agar. 3Avaliar a ação antimicrobiana do gel DX como medicação intracanal, em dentes contaminados com E. faecalis, a partir de colheitas dos canais radiculares e cultura clássica. OBJETIVOS 23 4 METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 4.1 DELINEAMENTO DO TRABALHO EXPERIMENTAL E SELEÇÃO DOS DENTES O delineamento do trabalho experimental envolveu 3 fases. Na primeira analisou-se, qualitativamente, a ação antimicrobiana dos medicamentos manipulados para este estudo quando em contato com cinco espécies de microrganismos, envolvendo bactérias de Gram positivo, de Gram negativo e um fungo (Figura 1). Na segunda fase verificou-se a ação antimicrobiana e a capacidade de atuação na superfície externa da raiz (difusão através dos canalículos dentinários) dos medicamentos manipulados, usando culturas de E. faecalis em placas de agar (Figura 2). Na 4 24 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva terceira e última fase avaliou-se, in vitro, a ação antimicrobiana da DX como medicação intracanal em dentes infetados com E. faecalis, com o recurso a colheitas dos canais radiculares e cultura clássica (Figura 3). Para este estudo foram utilizados 50 dentes caninos humanos extraídos e desinfetados com 0,5% de cloramina, conservados em água destilada e utilizados antes de seis meses de armazenamento. Os elementos foram selecionados individualmente, considerando os seguintes critérios de inclusão: ausência de cárie ou fraturas, ausência de restaurações, ausência de dilacerações radiculares e não existência de tratamento endodôntico prévio. Foram obtidos no Banco de Dentes Humanos da Universidade Estadual de Ponta Grossa (BDH-UEPG) tendo sido protocolados e devidamente aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Ponta Grossa (COEP-UEPG), cujo documento de aprovação se encontra em anexo (protocolo:8876/12). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 25 Figura 1 - Cronograma da primeira fase do trabalho experimental . METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL Análise qualitativa da ação antimicrobiana dos medicamentos manipulados quando em contato com as cinco espécies de microrganismos em estudo 26 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 2 - Cronograma da segunda fase do trabalho experimental. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL Avaliação da ação antimicrobiana e da capacidade de atuação dos medicamentos manipulados na superfície externa da raiz (difusão através dos canalículos dentinários), usando meios de cultura com E. faecalis. Definição dos grupos de acordo com a medicação Incubação a 36°C durante 48h 27 Figura 3 - Cronograma da terceira fase do trabalho experimental. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL Avaliação in vitro da ação antimicrobiana da DX como medicação intracanal em dentes infetados com E. faecalis, com recurso a colheitas dos canais radiculares e cultura clássica. 28 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 4.2 ESTIRPE DOS MICRORGANISMOS Os microrganismos usados neste estudo fazem parte da American Type Culture Collection (ATCC), estirpes existentes no stock do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia da UEPG: - Enterococcus faecalis (ATCC nº 29203), - Staphylococcus aureus (ATCC nº 29213), - Escherichia coli (ATCC nº 25922), - Pseudomonas aeruginosa (ATCC nº 27853), - Candida albicans (ATCC nº 90028). 4.3 PREPARAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS AUXILIARES A SEREM UTILIZADAS Para a execução das preparações auxiliares utilizou-se, quando necessário, uma balança (Gettaka, BG 2000, São Paulo-Brasil), bem como o agitador mecânico eletrónico mini Q235 (Quimis – Modelo: 235-2, São Paulo-Brasil) (Figura 4). Figura 4 - (A) Balança e (B) agitador mecânico eletrónico mini Q235. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 29 4.3.1 MEDICAÇÕES INTRACANAL G GE EL L B BA AS SE E D DE E H HI ID DR RO OX XI IE ET TI IL LC CE EL LU UL LO OS SE E ( (N NA AT TR RO OS SO OL L® ®) ) A A 2 2% % – – 1 1L L Juntou-se 20g de hidroxietilcelulose a 2%, com 1g de metilparabeno e água destilada até perfazer os 100mL. Levou-se a lume brando mexendo lentamente com uma espátula. Assim que começou a ferver e a ganhar consistência, retirou-se do lume e deixou-se arrefecer (Figura 5) (43, 133-135). Figura 5 - Gel Base de Hidroxietilcelulose a 2% (Natrosol®). G GE EL L D DE E C CL LO OR RO OH HE EX XI ID DI IN NA A A A 2 2% % – – 1 10 00 0G G ( (C CH HX X) ) Num almofariz juntou-se 10g de digluconato de clorohexidina, 50g de propilenoglicol e 0,5g de Tween 80, misturando cuidadosamente até ficar homogéneo. Num goblet pesou-se 39,5g de gel base Natrosol® 2% e adicionou-se a preparação anterior mexendo até ficar um composto homogéneo com 100g de peso final (Figura 6 – M) (43, 133-135). G GE EL L P PL LA AC CE EB BO O 1 10 00 0G G ( (P PC C) ) Misturou-se num almofariz 50g de propilenoglicol com 0,5g de Tween 80. Num goblet pesou-se 0,76g de fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), 1,94g de METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 30 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva fosfato de disódico anidro (Na2HPO4) e 41,8g de gel base Natrosol® 2%, mexendo muito bem até dissolver todo o fosfato. A este preparado foi adicionado o anterior, tendo-se misturado até se obter um composto homogéneo com 100g de peso final (Figura 6 - N) (43, 133-135). G GE EL L D DE E N NI IT TR RO OF FU UR RA AN NT TO OÍ ÍN NA A A A 3 3% % - - 1 10 00 0G G ( (N NI IT T) ) Colocou-se 3g de nitrofurantoína num almofariz, triturou-se e, em seguida, dissolveu-se em 50g de propilenoglicol e 0,5g de Tween 80. Num goblet juntou-se 0,76g de NaH2PO4, 1,94g de Na2HPO4 e 43,8g de gel base Natrosol® 2%, mexeu-se bem até dissolver todo o fosfato. A este preparado foi adicionado o anterior, tendose misturado até se obter um composto homogéneo com 100g de peso final (Figura 6 - O) (43, 133-135). G GE EL L D DE E D DO OX XI IC CI IC CL LI IN NA A A A 3 3% % - - 1 10 00 0G G ( (D DX X) ) Juntou-se e triturou-se num almofariz 3,33g de cloridrato de doxiciclina (equivalente a 3g de doxiciclina) e 0,1g de metabissulfito de sódio (Figura 6 – B). Em seguida dissolveu-se com 50g de propilenoglicol e 0,5g de Tween 80 (Figura 6 - C,D). Num goblet juntou-se 0,76g de NaH2PO4, 1,94g de Na2HPO4 e 43,37g de gel base Natrosol® 2% e mexeu-se bem com uma vareta (Figura 6 – E, F, G). A este preparado foi adicionado o anterior até se obter um composto homogéneo com peso final de 100g (Figura 6 – H, I, J, P, L) (43, 133-135). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 31 METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 38 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 11 – Preparação das placas de agar para o método de difusão: (A) material utilizado durante o procedimento, (B) confeção de poços nas placas de MH com o auxílio dos tubos de vidro esterilizados, (C) aplicação das diferentes medicações nos respetivos poços, (D) placa de agar de MH com as várias medicações. Depois da incubação em estufa bacteriológica a 36°C durante 24h, determinaram-se os diâmetros dos halos da zona de inibição de crescimento microbiano, recorrendo a um paquímetro digital (Digimess, São Paulo, Brasil) e uma boa fonte de luz refletida. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 39 Foi considerada, como zona inibitória, a menor distância (mm) desde a margem externa do poço até ao ponto onde se verifica o início do crescimento bacteriano (Figura 12 e Figura 13). As medições foram feitas colocando o paquímetro digital de forma a obter três diferentes medições dos raios dos halos de inibição, calculando-se assim a média e o desvio padrão de cada halo (Figura 12 e Figura 13) (135). Figura 12 - Medição dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento de E. faecalis quando em contato com os diferentes tipos de medicações manipuladas. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 40 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 13 - Medição dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento de cada microrganismo para os diferentes tipos de medicações manipuladas. 4.4.2 AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DAS SUBSTÂNCIAS EM ESTUDO ATRAVÉS DO MÉTODO CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM). Preparação das suspensões de microrganismos referidas em 4.4.1 e de 50g de cada medicação intracanal sob a forma de solução, seguindo o protocolo descrito em 4.3.1, mas substituindo o gel base por água destilada. O processo de microdiluição foi baseado nas normas do NCCSL (137). Este processo iniciou-se com uma diluição de 1:2 a 0,01 g/mL no caso da solução de CHX, e de 0,015 g/mL no caso da NIT e DX, até uma diluição de 1:1024 com as concentrações de 1,95x10-5 g/mL e 2,93x10-5 g/mL respetivamente. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 41 Em cada microplaca estéril de 96 poços, inclusive nas placas com CHX (controlo positivo das medicações), deixou-se uma coluna de controlo positivo (bactéria com caldo MH) e uma coluna controle negativo (contendo só caldo MH). Em cada poço foram colocados: 170 µL de caldo MH, 10 µL da suspensão de bactéria e 20 µL de medicação (Figura 14) (137). Figura 14 – Método da CIM: (A,B) através da diluição da concentração da medicação com caldo de MH e suspensão de bactéria. Antes da incubação selaram-se as placas com tampa de plástico bem adaptada e com uma fita aderente de plástico para evitar a secagem. Em seguida as placas foram incubadas a 36°C durante 24h (137). Após o período de incubação, fez-se a leitura do CIM visualmente. Do último poço sem turvação foram recolhidos 100 µL da suspensão e semeados numa placa de MH com o auxílio de uma zaragatoa. A incubação foi feita a 36°C durante 24h para verificar o crescimento, ou não, de UFC. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 42 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 4.5 SEGUNDA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL 4.5.1 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE DIFUSÃO DA MEDICAÇÃO INTRACANAL ATRAVÉS DOS TÚBULOS DENTINÁRIOS P PR RE EP PA AR RA AÇ ÇÃ ÃO O D DO OS S D DE EN NT TE ES S Todos os procedimentos foram realizados por um mesmo operador previamente treinado, antes e durante a execução do estudo piloto. Para garantir a existência apenas de um canal, radiografaram-se todos os espécimes através de um sistema analógico de raio-x (Dabi Atlante, spectro 70, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil). Parâmetros do raio-x: Película intraoral - Dental Intraoral E-Speed Film, Kodak (Nova York, Estados Unidos da América (EUA)); distância foco filme 30 cm (Figura 15); tempo de exposição usado para pesquisa 0,20 segundos; incidências radiográficas nos sentidos mésio-distal e vestíbulo-lingual (Figura 16 – A,B). Películas reveladas numa processadora automática da marca Revell (Vila Moraes, São Paulo, Brasil), com temperatura entre os 28° e os 30°C e o tempo de processamento das periapicais entre 2-3 min (Figura 16 – C, Figura 17) (16, 126). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 43 Figura 15 – Distância foco-filme (30 cm). Figura 16 - Procedimento radiológico: (A,B) posicionamento dos espécimes dentários nas películas radiográficas; (C) processadora automática das películas radiográficas. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 44 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 17 - Incidências radiográficas dos caninos: (A) vestíbulo lingual e (B) mesio distal. Para que os espécimes perfizessem 15 mm de comprimento, a cada dente foi removida a coroa a 3 mm da junção amelo cementária permitindo acesso direto ao canal, e a porção apical da raiz a 12 mm da junção amelo cementária. Foi usada uma máquina de corte (Isomet 1000, Buehler, Ltda, Lake Bluff, Illinois (IL), EUA), com um disco diamantado (#7020, KG Sorensen, Barueri, São Paulo, Brasil), sob velocidade de 300 rpm e refrigeração constante com água (Figura 18) (138). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 45 Figura 18 - Procedimento de corte dos espécimes dentários: (A) máquina de corte com disco diamantado; (B) medição dos espécimes dentários; (C) corte dos espécimes; (D) aspeto final dos espécimes dentários. As superfícies externas das raízes foram limpas de tecidos moles e de resíduos utilizando-se curetas periodontais (Hu-Friedy, Chicago, IL,EUA) e água corrente, de modo a não danificar a superfície radicular. Com uma lupa graduada, inspecionou-se a existência de fraturas e/ou fissuras (139, 140). O acesso estandardizado foi executado por oclusal, usando uma turbina de alta velocidade com refrigeração de água e uma broca endo Z (Dentsply® Maillefer Instruments, Baillaigues, Switzerland) para sua uniformização (Figura 19 – A) (139, 140) . Retificou-se visualmente o comprimento de trabalho (CT), introduzindo-se uma lima 10K (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland) até esta aparecer ao nível apical. O CT foi estabelecido subtraindo 1mm ao comprimento estandardizado, ficando padronizado nos 14mm (59, 126). Para facilitar a irrigação fez-se a preparação cervical com brocas de Gates nº 2 e 3 (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland), introduzindo a nº 2 no canal até aos 10mm e a nº 3 com um recuo de 1 mm (Figura 19 – B). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 46 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 19 - Estandardização da cavidade de acesso: (A) uniformização da cavidade com turbina e broca endo Z; (B) preparação cervical com brocas Gates nº 2 e 3. O diâmetro apical foi determinado para que houvesse uma constituição de grupos o mais homogéneo possível. Usaram-se limas K manuais, começando com uma lima 10K inserida até ao CT. Aumentou-se progressivamente o número das limas até se encontrar um instrumento que ficasse bem adaptado no CT. O número da lima selecionada, instrumento anatómico (IA), foi registada para cada dente (141). G GR RU UP PO OS S E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AI IS S As raízes foram divididas em 5 grupos, 2 grupos de controlo de n=10 e 3 grupos experimentais, também, de n=10 (Tabela 2). Tabela 2 – Divisão dos espécimes pelos diferentes grupos experimentais. DIÂMETRO ANATÓMICO GRUPOS EXPERIMENTAIS Controlo Negativo (SM) Controlo positivo (CHX) PC NIT DX 15 1 1 1 1 1 20 1 1 1 1 1 25 2 2 2 2 2 30 2 2 2 2 2 35 2 2 2 2 2 45 1 1 1 1 1 55 1 1 1 1 1 Total 10 10 10 10 10 METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 47 Técnica Híbrida de instrumentação(142) De seguida procedeu-se à instrumentação dos cinquenta dentes segundo a técnica manual normalizada, usando os princípios da técnica de crown-down, combinando as brocas Gates-Glidden (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland) com as limas K (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland). Os primeiros dois terços cervicais dos canais,10 mm, foram inicialmente preparados com limas K (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland), a partir da lima #25 até à #35. Posteriormente, foram usadas brocas Gates-Glidden nº 2 e nº 3 (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland), utilizando a primeira com 10mm e a segunda com um recuo de 1 mm. Entre cada lima e broca utilizou-se uma lima K #10, com um comprimento de 15 mm, como lima de recapitulação e com o intuito de manter a patência. A instrumentação do terço apical iniciou-se a partir do IA, progredindo usando as três limas consecutivas acima deste IA (Figura 20). Cada instrumento foi intercalado com uma lima que passará 1 mm além do apex, sendo esta mais fina e dois números abaixo do IA (lima de patência). Por exemplo, considerando IA= K #25, a instrumentação será efetuada até à lima K #40 ao longo de todo o comprimento do canal (CT) e, entre cada uma delas, será usada a lima K #15, como lima de patência (75, 142). Figura 20 – Espécime dentário com instrumento anatómico (IA) K #25. Após esta instrumentação e considerando a última lima usada ao longo do CT, realizou-se a técnica step back com recurso às três limas seguintes, recuando em cada uma 1mm. A recapitulação fez-se com a última lima que foi até ao CT e a patência manteve-se com a lima mais fina (142). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 54 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 26 - Protocolo para evitar saturação do meio: (A) substituição de caldo contaminado (B,C) por caldo fresco de BHI. 1 1º º C CO OL LH HE EI IT TA A ( (S S1 1) ) E E M ME ED DI IC CA AÇ ÇÃ ÃO O I IN NT TR RA AC CA AN NA AL L Após este período, e sempre trabalhando no interior da câmara de fluxo laminar, os espécimes foram colocados numa plataforma de aço inoxidável estéril (Procind Mecânica e Instalações Industriais Ltad, Piracicaba, São Paulo, Brasil) (Figura 27 – A), onde se fez a irrigação dos canais radiculares com 1 mL de SF (Figura 27 – B). Os canais foram secos com 2 pontas de papel estéreis (Dentsply® Maillefer, Baillaigues, Switzerland) durante 3 segundos de forma a remover apenas o excesso de humidade, sem os secar na totalidade. As pontas de papel foram calibradas de acordo com a última lima usada no CT (14mm). Depois do canal estar relativamente seco, introduziu-se um terceiro cone igual aos anteriores, movimentando-o contra as paredes durante 60 segundos (Figura 27 – C,D) (66, 76), para efetuar a colheita da amostra bacteriana. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 55 Figura 27 - Protocolo da primeira colheita após 21 dias de contaminação: (A) colocação dos espécimes dentários na plataforma de aço inoxidável estéril; (B) irrigação com SF; (C) calibração do cone de papel; (D) cone de papel introduzido ao longo do CT com movimentos circulares contra as paredes do canal; (E) colocação da amostra bacteriana num eppendorf estéril com solução salina. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 56 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva De seguida, o terceiro cone foi transferido para tubos estéreis, tipo eppendorf, contendo 1 mL de solução salina (Figura 27 – E). Depois de agitados durante 1 min num aparelho vortex (Quimis® Q220A, Diadema, São Paulo, Brasil), as suspensões foram diluídas em série 1/10, 1/100 em solução salina estéril. 100 µL de cada diluição foram semeados em triplicado em placas de agar BHI (Figura 28) e incubadas numa estufa de CO2, a 36°C durante 48h. Figura 28 – (A) Sementeira das diluições em placas de agar BHI, (B) espalhamento com alças de drigalski. Após as 48h, procedeu-se à contagem do número de UFC existentes nas placas, determinando assim concentração inicial de E. faecalis. Com as raízes fixadas no suporte metálico, fez-se o preenchimento dos canais radiculares com a respetiva medicação: - Controlo negativo: sem medicação (SM), - Controlo positivo: gel de clorohexidina 2% (CHX), - Grupo experimental: gel com doxiciclina 3% (DX). Esta aplicação foi efetuada em câmara de fluxo laminar, com uma seringa e agulha até ao extravasamento do material (Figura 29). Após remoção do excesso da medicação, tanto os orifícios de entrada do canal como o apex foram selados com METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 57 cera utility (Coltène® Whaledent, Germany), previamente autoclavada (Autoclave – ALPHA) durante 30 min a 121°C e à pressão de 1 atm. Depois do preenchimento e selamento dos canais, os espécimes fixaram-se em placas de 24 poços de fundo plano (Coming Cell Culture, Coming, EUA) com a ajuda da cera utility (Coltène® Whaledent, Germany) previamente esterilizada. Figura 29 – Aplicação das diferentes medicações intracanal. Os poços foram preenchidos com caldo BHI até à linha amelo cementária dos espécimes (Figura 30) e em seguida colocou-se uma gaze humedecida com SF por cima dos espécimes. Tapou e vedou-se a placa para então ser levada à estufa a uma temperatura de 36°C durante 14 dias (76). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 58 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 30 - Preparação dos espécimes dentários para a incubação após S1: placas de 24 poços com os espécimes fixados e selados; poços preenchidos com caldo BHI. 2 2º º C CO OL LH HE EI IT TA A ( (S S2 2) ) A AP PÓ ÓS S M MA AI IS S 1 14 4 D DI IA AS S No final do período de incubação, trabalhando dentro do fluxo laminar, as raízes foram colocadas novamente no suporte de aço inoxidável previamente esterilizado. Fez-se então a sequência de irrigação: SF (1mL), solução neutralizante (1mL) durante 1min e novamente SF (1mL) (Figura 31). METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 59 Figura 31 – (A) Irrigação dos espécimes dentários com SF e (B) com solução neutralizante. Esta irrigação teve como objetivo minimizar as interferências pós tratamento destas substâncias químicas e, assim, evitar falsos negativos nos meios de cultura (135). Em seguida fez-se uma nova colheita (S2) com cones de papel esterilizados, seguindo os procedimentos explicados em S1. Os cones foram transferidos para os eppendorf estéreis contendo 1mL de solução salina e colocados durante 1 min num agitador de tubos vortex (Quimis® Q220A, Diadema, São Paulo, Brasil). Apenas para o Grupo SM as suspensões foram diluídas 1/10 em solução salina estéril. Para os Grupos CHX e DX semeou-se 100 µL da solução mãe; para o Grupo SM, para além de 100 µL da solução mãe, semeou-se o mesmo volume da diluição 10-1. Todas elas foram semeadas em triplicatas, em placas de agar BHI e incubadas numa estufa de CO2, a 36°C durante 48h; após a qual foi feita a contagem de UFC. No final da colheita as raízes foram colocadas em novas placas de 24 poços estéreis, devidamente seladas com cera utility (Coltène® Whaledent, Germany) previamente esterilizada. Nos poços e no interior do canal colocou-se caldo BHI, de forma a mantê-lo húmido (Figura 32). As placas, depois de devidamente seladas, foram deixadas na estufa a uma temperatura de 36°C durante 7 dias. Com esta METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 60 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva cultura pretendeu-se verificar a existência, ou não, de E. faecalis no interior dos canalículos. Figura 32 – Colocação de caldo de BHI no interior dos canais. 3 3º º C CO OL LH HE EI IT TA A ( (S S3 3) ) A AP PÓ ÓS S M MA AI IS S 7 7 D DI IA AS S Após este novo período de incubação, e na plataforma metálica previamente esterilizada, foi feita nova irrigação dos canais com 1mL de SF, seguindo-se a nova colheita (S3) de acordo com os procedimentos usados em S2. Foram contadas as UFC de E. faecalis e assim determinada a concentração. A pureza das culturas foi confirmada através da morfologia das colónias e coloração de Gram. METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 61 4.7 PROCEDIMENTOS ESTATÍSTICOS O estudo estatístico foi efetuado com recurso ao software de tratamento estatístico de dados IBM-SPSS, versão 19.0. Primeiramente procedeu-se a uma análise descritiva de todas as variáveis em estudo. Foram, assim, calculadas as médias e os desvios-padrão das variáveis numéricas e as frequências e percentagens das variáveis categoriais (145). Recorreuse também a gráficos de barras e gráficos Bloxplot. Na análise inferencial comparativa assumiram-se como diferenças estatisticamente significativas aquelas em que o valor de probabilidade associado (p) ao teste estatístico possuía um valor de pelo menos 0.05 (146). No cruzamento transversal de variáveis numéricas com uma variável independente constituída por cinco grupos com um número de efetivos de dez elementos, optou-se pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis. Na comparação das diferenças estatisticamente significativas entre os grupos efetuaram-se testes post-hoc recorrendo ao teste de Tamhane`s T2 por se tratar de um teste conservativo e assumir diferenças nas variâncias dos grupos (147). No cruzamento longitudinal das diferenças de uma variável em três pontos no tempo em função de uma variável categorial (grupos experimentais) considerou-se a aplicação de uma Anova de medidas repetidas onde se atendeu a teste intra-sujeitos (within subject) e entre grupos (between subjects) (148). Na aplicação desta técnica observou-se em todas as análises a existência de esfericidade, através do teste de Mauchly, e caso esta não pudesse ser assumida considerou-se a correção aos graus de liberdade proposta por Greenhouse and Greiser considerada como a abordagem mais restritiva (146). Apesar do número de casos por grupo ser relativamente reduzido, este encontra-se acima do ponto de corte referido na literatura (n=10) para aplicação de testes paramétricos em designs longitudinais, METODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 62 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva dado que estes não necessitam de amostras do tamanho das apontadas para os estudos transversais, isto porque se espera uma variabilidade inferior (149). M ETODOLOGIA DO TRABALHO EXPERIMENTAL 63 5 RESULTADOS 5.1 PRIMEIRA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL 5.1.1 AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DAS SUBSTÂNCIAS EM ESTUDO ATRAVÉS DO MÉTODO DE DIFUSÃO EM AGAR Comparando os géis Natrosol®, CHX, NIT e DX, relativamente ao seu comportamento antibacteriano quando em contato com os microrganismos E. coli, S. aureus, E. faecalis, P. aeruginosa e C. albicans, através do método de difusão de agar (Figura 33), verificou-se que as medicações tiveram diferentes comportamentos com os vários tipos de microrganismos. 5 70 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 34 – Placas de microdiluições de 96 poços com as diluições das medicações intracanal testadas (CHX, PC, NIT, DX) contra as bactérias (A) E. coli, (B) S. aureus, (C) E.faecalis, (D) P. aeruginosa e o fungo (E) C. albicans. Os resultados obtidos no CIM podem ser analisados através do Gráfico 1. Aqui é visível que o PC não evidenciou qualquer tipo de ação antimicrobiana. A CHX foi a que teve maior eficácia, uma vez que a uma concentração mínima de 1,95x10-5 g/mL apresentou ação antimicrobiana quando exposta aos vários microrganismos. De seguida, destaca-se a DX que a uma concentração de 1,88x10-3 g/mL inibiu o crescimento de P. aeruginosa, a 2,34x10-4 g/mL E. coli, a 4,69x10-4 g/mL C. albicans, e a 5,86x10-5 g/mL S. aureus e E. faecalis. Por fim, a NIT foi a que necessitou de maiores concentrações para ter ação antimicrobiana. Desta forma, o crescimento da C. albicans não foi inibido, E. faecalis e P. aeruginosa foram inibidos a uma concentração de 1,5x10-2 g/mL, e S. aureus a 7,5x10-3 g/mL. RESULTADOS 71 Gráfico 1 – Gráfico de barras da CIM de cada solução com ação antimicrobiana face à E. coli (E.c.), S. aureus (S.a.), E. faecalis (E.f.), P. aeruginosa (P.a.) e o fungo C. albicans (C.a.). Da cultura dos 100 µL dos últimos poços sem turvação verificou-se que só a CHX é que apresentou comportamento bactericida/fungicida quando em contacto com E. coli, S. aureus, E. faecalis, e com o fungo C. albicans. Quando na presença de P. aeruginosa, a CHX teve um comportamento bacteriostático. Relativamente à NIT e DX tiveram sempre um comportamento bacteriostático, independentemente do microrganismo. 1,95E-05 1,95E-05 1,95E-05 1,95E-05 1,95E-05 0,0075 0,0075 0,015 0,015 0,015 2,34E-04 5,86E-05 5,86E-05 1,88E-03 4,69E-04 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 E. c. S. a. E. f. P. a. C. a. Concentração medicação (g/mL) Microrganismos Chx. 2% Nitro. 3% Doxi. 3% RESULTADOS 72 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 5.2 SEGUNDA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL 5.2.1 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE DIFUSÃO DA MEDICAÇÃO INTRACANALAR ATRAVÉS DOS TÚBULOS DENTINÁRIOS A Figuras 35 mostra a área de inibição microbiana das várias medicações intracanais, através da superfície externa da raiz, perante o agar contaminado com E. faecalis. O registo destas medidas foi feito em mm e foi calculada a sua média. RESULTADOS 73 Figuras 35 – Halos (mm) de inibição formados pelas medicações intracanal testadas através dos canalículos dentinários face à presença de Enterococcus faecalis: (A) 1 – CHX; 2 – SM e 5 – DX; (B) 3 – PC e 4 – NIT. A partir do Gráfico 2, é visível que só a CHX e a DX apresentaram halos de inibição de crescimento 5,52 (±2,9) mm e 11,17 (±2,17) mm respetivamente, enquanto os grupos PC e NIT não inibiram o crescimento de E. faecalis (0,00 mm), tendo um comportamento semelhante ao controlo negativo (SM). O teste Kruskal-Wallis (χ2=47.126; p<.001) revelou diferenças significativas entre os grupos. Nos procedimentos de comparações múltiplas post-hoc foi possível observar diferenças significativas entre a CHX e DX e os outros grupos. RESULTADOS 74 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Gráfico 2 - Box-plot dos valores dos halos das diferentes medicações através dos dentes após 24h. Teste Kruskal-Wallis (χ2=47.126; p<.001). 5.3 TERCEIRA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL 5.3.1 AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTIMICROBIANA DAS SUBSTÂNCIAS EM ESTUDO EM DENTINA INFETADA A Figura 36 ilustra a variação das UFC’s de um dente ao longo dos três momentos do estudo em que se efetuaram as diferentes colheitas das amostras bacterianas (1º momento - 21 dias de contaminação dos espécimes dentários com E. faecalis (S1); 2º momento – 14 dias com medicação intracanal (S2); 3º momento – 7 dias com caldo de BHI (S3)). Grupo Gel Doxiciclina 3%Gel Nitrofurantoína 3% Gel PlaceboGel Clorhexidina 2%Sem Medicação Halo (mm) 14 12 10 8 6 4 2 0 RESULTADOS 75 RESULTADOS 76 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Figura 36 - Análise das UFC’s de um dente do grupo do Gel DX: (A) UFC de S1, após 21 dias de contaminação dos espécimes dentários com E. faecalis. (B) UFC de S2, após 14 dias com a medicação intracanal. (C) UFC de S3 após 7 dias com meio BHI no interior dos canais. Na Tabela 5 é possível analisar o número de UFC/mL de E. faecalis recuperadas do canal radicular, ao longo dos 3 momentos do trabalho experimental. Depois dos 21 dias de contaminação verificou-se a presença de E. faecalis em todos os dentes. O valor da média de UFC’s diminui em todos os grupos após os 14 dias com a medicação intracanal. No entanto, essa diferença foi mais acentuada nos grupos com medicação intracanal CHX e DX, do que no grupo SM. RESULTADOS 77 Após 7 dias com caldo de BHI no interior dos canais, os valores de UFC’s mantiveram-se baixos para os grupos CHX e DX, enquanto no SM aumentaram para valores idênticos aos níveis iniciais. Tabela 5 – Médias e desvio-padrão das UFC dos diferentes grupos em função do tempo (ANOVA de medidas repetidas na análise do tempo e interação tempo e grupo). Colheitas Bacterianas Grupos Experimentais (UFC/mL x 104) Sem Medicação (SM) (n=10) Clorohexidina (CHX) (n=10) Doxiciclina (DX) (n=10) S1 (21 dias) 2,63 ± 2,77 10,59 ± 9,17 11,89 ± 10,95 S2 (14 dias) 1,12 ± 1,37 0,08 ± 0,21 0,17 ± 0,19 S3 (7 dias) 2,63 ± 0,86 0,02 ± 0,02 0,11 ± 0,11 Tempo F (1,009) = 25,087; p = 0,000 Tempo x Grupo/Medicação F (2,018) = 5,231; p = 0, 012 S1após 21 dias de contaminação com E. faecalis; S2 - depois de 14 dias com medicação intracanal, S3 – após 7 dias com BHI. No Gráfico 3 é possível analisar a cinética dos diferentes grupos ao longo de todo o ensaio clínico. Para verificar se as alterações ao longo do tempo foram estatisticamente significativas foi usado o teste de medidas repetidas ANOVA, assumindo o valor de significância de pelo menos de 0,05. Foi também verificado e assumido a normalidade e homogeneidade da variância, usando o teste Mauchly’s sphericity, que permite efetuar o cálculo com a correção de Greenhouse-Geisser. A partir da ANOVA de medidas repetidas foi possível verificar a existência de diferenças estatisticamente significativas, quer nas UFC ao longo do tempo (p<0,001), quer nos grupos que também possuem diferenças entre eles nos três momentos (p=0,012). RE SULTADOS 78 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Analisando cada grupo individualmente, constatou-se que todos os grupos demonstraram diferenças estatisticamente significativas (SM p= 0,010, CHX p<0,001 e DX p=0,031). Entre o primeiro e o segundo momento do ensaio experimental, todos os grupos exibiram uma redução do número de UFC’s, onde se observou uma diferença significativa nos grupos DX (p=0,015) e CHX (p=0,999), contudo no grupo SM essa diminuição não foi suficiente para se verificar uma diferença estatisticamente significativa. Após o segundo momento, os grupos CHX e DX reduziram o número de UFC, mas não foi suficiente para que se verificasse uma diferença estatisticamente significativa, no entanto, o grupo SM revelou um aumento significativo das UFC (p=0.006). Gráfico 3 – Quantificação das UFC’s nos Grupos/Medicações em função do tempo: (S1) 1º momento – após 21 dias de contaminação, (S2) 2º momento – após 14 dias com medicação intracanal, (S3) 3º momento – após 7 dias com caldo de BHI. ANOVA de medidas repetidas na análise do tempo e interação tempo e grupo/medicação. RESULTADOS 79 6 DISCUSSÃO Organizou-se este capítulo em secções de forma a transmitir a discussão dos resultados referentes a cada um dos estudos parcelares efetuados, iniciando com algumas considerações gerais comuns a todos eles. 6.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS Apesar da grande variabilidade da medicação intracanal existente, não foi encontrada ainda a ideal. Por esta razão, tentou-se criar uma medicação que se aproximasse o mais possível dos requisitos ideais (15, 16). A solução de irrigação MTAD, uma mistura de tetraciclina (doxiciclina), ácido cítrico e detergente, foi a formulação base do presente estudo, uma vez que a sua ação antimicrobiana já tinha sido comprovada por outros autores (41, 125). 6 86 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva endodôntico, e a sua resistência e capacidade de multiplicação no interior dos canais (7, 8, 26, 65, 67, 155, 181), esta foi a bactéria selecionada para as restantes fases do trabalho experimental. 6.3 SEGUNDA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL Na segunda fase experimental, foi usada uma adaptação do teste de difusão em agar usando peças dentárias (143), numa tentativa de verificar a capacidade de difusão das novas formulações através dos túbulos dentinários e atividade antibacteriana perante E. faecalis. A importância da análise desta capacidade devese ao facto de a difusão de substâncias anti-bacterianas através dos túbulos dentinários poder aumentar a taxa de sucesso do tratamento endodôntico (12-14). Para além disso, pode também ser considerada uma via complementar para o tratamento da periodontite apical, dada a estreita relação entre o sistema de canais radiculares e o complexo periodontal, e ao efeito antibacteriano que poderá ter na superfície externa da raiz (143). Neste teste a DX apresentou a maior área de inibição, demonstrando um melhor efeito antibacteriano e/ou capacidade de difusão quando comparada com a NIT, PC e controlo positivo (CHX). A NIT e o PC não tiveram capacidade de exercer qualquer atividade antimicrobiana na superfície externa da raiz, durante o período de incubação. Nesta metodologia, quando a área de inibição microbiana é igual a zero pode significar que a medicação não apresentou qualquer efeito antimicrobiano, ou que não teve capacidade de difusão através dos túbulos dentinários e cemento. Apesar de a NIT ter apresentado efeito antibacteriano sobre E. faecalis na 1º fase experimental, a maior viscosidade da formulação pode ter dificultado a sua difusão através dos túbulos dentinários, justificando, assim, a ausência de halo observada DISCUSSÃO 87 neste teste de difusão. Devido à maior viscosidade, acredita-se que sendo aumentada a quantidade de detergente da medicação, poderia ser possível observar melhores resultados antimicrobianos na superfície externa da raiz. A presença de cemento pode afetar a capacidade de difusão das substâncias para o agar, embora este aspeto possa, segundo alguns autores, não interferir significativamente com as zonas de inibição de crescimento bacteriano (143). Nesta fase, continuou-se a usar a CHX como controlo positivo, quer pelos motivos supracitados, quer pelo facto de ter uma boa capacidade de difusão através da dentina (143). Analisando todo o desempenho das medicações durante as duas primeiras fases experimentais, verifica-se que o grupo DX é o que demonstra ter os melhores resultados. Perante isto e pelo facto da eficácia antimicrobiana contra E. faecalis já ter sido demonstrada por outros autores(40-42), optou-se por utilizar apenas esta medicação como grupo experimental na terceira e última fase do estudo. 6.4 TERCEIRA FASE DO TRABALHO EXPERIMENTAL Nesta fase experimental pretendeu-se avaliar a ação antimicrobiana da DX em dentina infetada com E. faecalis, comparando-a com o controlo positivo (CHX). Após os 14 dias com medicação, observou-se uma queda substancial dos números de UFC nos grupos DX e CHX, sugerindo que ambas as medicações apresentaram uma eficácia antibacteriana muito semelhante, sem diferenças significativas entre si. Outros autores tinham já demonstrado a eficácia antimicrobiana da solução de irrigação com doxiciclina (MTAD) e da medicação com clorohexidina contra E. faecalis (23, 123, 182). DISCUSSÃO 88 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva Depois do período de 7 dias com o caldo de BHI no interior dos canais, os grupos DX e CHX continuaram a apresentar uma diminuição do número de UFC. Apesar da redução não ter sido significativa, ela sugere alguma substantividade. A substantividade diz respeito à libertação progressiva e gradual de uma substância em níveis terapêuticos, num substrato, mais do que seria de se esperar através de um simples mecanismo de distribuição. É importante o uso de irrigantes e, principalmente, medicações intracanal com uma ação antimicrobiana residual, tanto para a prevenção de situações de reinfeção como para aumentar a probabilidade de sucesso do tratamento (183). No grupo SM, o número de UFC aumentou significativamente no mesmo período, igualando os valores obtidos na primeira colheita. Várias são as metodologias propostas para se fazerem estudos em dentina infetada. Apesar de grande parte dos estudos serem realizados em dentina bovina, o facto do diâmetro do túbulos ser maior comparativamente com a dentina humana, pode condicionar o nível de contaminação dos mesmos pelos microrganismos (184). Por este motivo, escolheu-se uma metodologia com dentina radicular humana já aplicada noutros estudos (96, 103). A diferença significativa do número de UFC observada entre os três grupos no final dos 21 dias de contaminação, pode ser explicada pela complexa variabilidade da estrutura dos túbulos dentinários (185, 186) em cada dente, e entre os vários tipos de dentes existentes (187). A contaminação inicial de 21 dias com E. faecalis, referida em vários estudos (76, 103), pretendeu recriar o ambiente das infeções persistentes, onde a desinfeção do sistema de canais radiculares é complicada devido à capacidade de invasão e de fixação das bactérias aos túbulos dentinários, em biofilmes organizados (188). Um aspeto que varia bastante nas várias metodologias é a colheita das amostras bacterianas (86, 189). Neste estudo, a colheita foi feita com pontas de papel esterilizadas introduzidas ao longo de todo o canal para absorver o seu conteúdo. Esta técnica tem a vantagem de poder ser realizada num estudo in vitro e/ou in vivo. Contudo, uma das suas limitações deve-se ao facto de só ser possível recolher os DISCUSSÃO 89 microrganismos que se encontram à superfície do canal radicular, excluindo os que se encontram no interior dos túbulos dentinários (86). Vários estudos (190-192) verificaram que as bactérias que sobrevivem à instrumentação e irrigação durante o tratamento endodôntico, rapidamente se multiplicam recolonizando os canais que ficaram vazios durante as sessões do tratamento. Assim, tal como foi feito por outros autores (86), a terceira colheita do nosso ensaio experimental pretendeu verificar a capacidade de recolonização dos canais após 7 dias (86, 103). O facto de termos optado pelo preenchimento dos poços com o caldo BHI deveu-se ao facto de a literatura sugerir que as bactérias existentes no interior dos túbulos dentinários podem recorrer aos fluídos do ligamento periodontal e osso alveolar para obter os nutrientes necessários para a sua sobrevivência (8, 66). Os dados obtidos ao longo de todo este estudo indicam que as novas formulações têm ação antibacteriana contra vários tipos de microrganismos. No entanto, constatou-se que a DX foi a que apresentou melhor desempenho, podendo eventualmente ponderar-se o seu uso como agente antimicrobiano em situações clínicas de insucesso endodôntico. DISCUSSÃO 90 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva 91 7 CONCLUSÃO Diante dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que tanto a formulação NIT como a formulação DX apresentaram ação antibacteriana contra diversos tipos de microrganismos frequentemente encontrados nos insucessos endodônticos. No entanto, a DX foi a que mostrou maior eficácia em baixa concentrações. Comparando a capacidade de difusão através dos túbulos dentinários, a DX foi a única, para além do controlo positivo (CHX), que apresentou ação antimicrobiana na superfície externa da raiz frente ao E. faecalis. A DX mostrou uma eficácia semelhante à do controlo positivo (CHX) na eliminação de E. faecalis do sistema de canais radiculares quando usada como medicação intracanal. 7 92 Ação antibacteriana de diferentes medicações intracanais frente a Enterococcus faecalis | Ana Rita Silva As novas formulações, particularmente a DX pode ser considerada como uma medicação intracanal promissora, aumentando a probabilidade de sucesso do tratamento de infeções persistentes. CONCLUSÃO 93 REFERÊNCIAS 1. Orstavik D, Haapasalo M. Disinfection by endodontic irrigants and dressings of experimentally infected dentinal tubules. Endod Dent Traumatol. 1990;6(4):142-9. 2. Baumgartner JC, Bakland LK, Sugita E. Microbiology of endodontics and asepsis in endodontic practice. Endodontics 2002. p. 63. 3. Spangberg LSW, Ingle JI, Bakland LK. Intracanal medication. Endodontics. 4th ed ed. Baltimore: Williams & Wilkins; 1994. p. 627-40. 4. Haapasalo M, Shen Y. Current therapeutic options for endodontic biofilms. 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