Avaliação de polimorfismos nos genes do factor estimulante de colónias de macrófagos (CSF-1) e no seu receptor (CSF-1 R) em doentes com cancro do pulmão

! !!!!!! ! ! ! ! AVALIAÇÃO!DE!POLIMORFISMOS!NOS!GENES!DO!FACTOR! ESTIMULANTE!DE!COLÓNIAS!DE!MACRÓFAGOS!(CSF$1)!E!NO!SEU! RECEPTOR!(CSF$1&R)!EM!DOENTES!COM!CANCRO!DO!PULMÃO! ! ! ! ANA!RITA!DA!SILVA!LOPES! Dissertação!de!Mestrado!em!Medicina!e!Oncologia!Molecular! ! ! ! Porto!|!Outubro!2012! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!! ! ! ! ! ! ! Ana!Rita!da!Silva!Lopes! ! AVALIAÇÃO!DE!POLIMORFISMOS!NOS!GENES!DO!FACTOR!ESTIMULANTE!DE! COLÓNIAS!DE!MACRÓFAGOS!(CSF$1)!E!NO!SEU!RECEPTOR!(CSF$1&R)!EM!DOENTES! COM!CANCRO!DO!PULMÃO! ! ! ! Dissertação!de!Candidatura!ao!grau!de!Mestre!em!Medicina!e!Oncologia!Molecular,! submetida!à!Faculdade!de!Medicina!da!Universidade!do!Porto! ! Orientador! Professor!Doutor!Rui!Manuel!de!Medeiros!Melo!Silva! Professor!Associado!com!Agregação! Instituto!de!Ciências!Biomédicas!de!Abel!Salazar!da! Universidade!do!Porto! Co@orientador! Mestre!Ana!Luísa!Pequeno!Coelho! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INFORMAÇÃO!TÉCNICA! TÍTULO! Avaliação!de!polimorfismos!nos!genes!do!factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos!(CSF$1)!e! no!seu!receptor!(CSF$1&R)!em!doentes!com!cancro!do!pulmão! Dissertação!de!Candidatura!ao!grau!de!Mestre!em!Medicina!e!Oncologia!Molecular,!submetida!à! Faculdade!de!Medicina!da!Universidade!do!Porto! ! AUTOR! Ana!Rita!da!Silva!Lopes! ! DATA! Outubro!de!2012! ! EDITOR! Ana!Rita!da!Silva!Lopes! MORADA! Praceta!Cidade!Salamanca,!nº!21,!4º!U! 3000Z109!Coimbra! CORREIO!ELETRÓNICO! anaritasil[email protected]! ! 1ª!EDIÇÃO! Outubro!de!2012! ! ! Agradecimentos! Gostaria! de! agradecer! a! algumas! pessoas! que! foram! fundamentais! na! concretização! deste! projeto! de! investigação,! embora! muitas! outras! também! tenham! sido! importantes...! a! todos,! Muito!Obrigada!! Agradeço! à! Comissão! de! Coordenação! do! Mestrado! em! Medicina! e! Oncologia! Molecular,! nomeadamente! ao! Professor! Doutor! Henrique! Almeida,! pela! possibilidade! de! conclusão! do! Mestrado,! mesmo! após! a! sua! interrupção! por! motivos! pessoais! e! que! se! mostrou! sempre! colaborante!e!disponível.! Agradeço! também! aos! meus! orientadores,! o! Professor! Doutor! Rui! Medeiros! e! Mestre! Ana! Coelho,! pela! forma! como! me! acolheram! no! Grupo! de! Oncologia! Molecular! do! Centro! de! Investigação! do! IPO! Porto,! assim! como! pela! possibilidade! de! integrar! os! seus! projetos! de! investigação!relativos!ao!cancro!do!pulmão.! À! Dra.! Ana! Nogal! e! Dra.! Mónica! Gomes,! por! tudo! o! que! me! ensinaram! sobre! as! técnicas! desenvolvidas!neste!mestrado,!assim!como!por!toda!a!ajuda!e!compreensão!que!me!deram!no! trabalho! experimental.! De! um! modo! geral,! agradeço! também! a! todos! os! que! colaboram! no! Grupo!de!Oncologia!Molecular!e!que!me!ajudaram!sempre!que!necessário.! Ao!Doutor!António!Araújo,!pela!sua!amabilidade!de!enviar!as!amostras!dos!seus!doentes!para!o! laboratório! Por!último,!agradeço!à!minha!família!por!todo!o!seu!apoio!na!concretização!dos!meus!objectivos.! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Abreviaturas! ! VII! Abreviaturas! ! B! ! bFGF! Factor!de!crescimento!básico!dos!fibroblastos! ! ! C! ! CCL! Ligando!de!quimiocina! CCR! Receptor!de!quimiocina! CD! Grupo!de!diferenciação!(cluster&of&differentiation)! CFUZC! Unidade!formadora!de!colónias!dependente!de!CSFZ1! CPPC! Cancro!do!pulmão!de!pequenas!células! CPNPC! Cancro!do!pulmão!de!não!pequenas!células! CSFZ1! Factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos! CSFZ1!R! Receptor!do!factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos! CTLAZ4! Antigénio!4!associado!ao!linfócito!T!citotóxico! CXCL! Ligando!de!quimiocina! CXCR! Receptor!de!quimiocina! ! ! D! ! DNA! Ácido!Desoxirribonucleico! dNTPs! Didesoxirribonucleosídeos!trifosfatados! DPOC! Doença!Pulmonar!Obstrutiva!Crónica! ! ! E! ! EGF! Factor!de!crescimento!epidérmico! ! ! F! ! FEV1! Volume!expiratório!forçado!no!primeiro!segundo! FGF! Factor!de!crescimento!dos!fibroblastos! ! ! G! ! GMZCSF! Factor!estimulante!de!colónias!de!granulócitos!e!macrófagos! ! ! H! ! HIF! Factor!induzido!pela!hipóxia! HLAZDR! Complexo!major!de!histocompatibilidade!(human&leukocyte&antigen)& ! & I! ! IC95%! Intervalo!de!confiança!a!95%! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Abreviaturas! ! VIII! IGF! Factor!de!crescimento!semelhante!à!insulina! IL! Interleucina! ILZ1Rα! Cadeia!α!do!receptor!da!interleucina!1! iNOS! Sintetase!do!óxido!nítrico!induzível! IPZ10! Interferon&gamma$induced&protein&10& IPO! Instituto!Português!de!Oncologia! ! ! L! ! LPS! Lipopolissacarídeo! ! ! M! ! MZCSF! Factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos! mCSFZ1! Isoforma!membranar!do!factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos! MCPZ1! Monocyte&chemoattractant&protein$1& MDC! Quimiocina!derivada!dos!macrófagos! MHC! Complexo!major!de!histocompatibilidade! MIG! Monokine&induced&by&gamma&interferon& MMP! Metaloproteinase!da!matriz! mRNA! Ácido!ribonucleico!mensageiro! MRP! Proteínas!mielóide!relacionadas! ! ! N! ! NCBI! National&Center&for&Biotechnology&Information& NK! Natural&killer& NO! Óxido!nítrico! NOS! Sintetase!do!óxido!nítrico!! NSCLC! Non$small&cell&lung&cancer& ! ! O! ! OMS! Organização!Mundial!da!Saúde! OR! Odds&ratio& ! & P! ! pb! Pares!de!bases! PCR! Polymerase&Chain&Reaction! PDGF! Factor!de!crescimento!derivado!de!plaquetas! ! ! R! ! RANTES! Quimiocina!normalmente!expressa!e!segregada!por!linfócitos!T,! regulada!na!ativação! RECIST! Response&Evaluation&Criteria&in&Solid&Tumors& RFLP! Restriction&Fragment&Length&Polymorphism& Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Abreviaturas! ! IX! ROS! Espécies!reativas!de!oxigénio! RR! Risco!relativo! ! ! S! ! SNP! Single&nucleotide&polymorphism& ! ! T! ! TAMs! Macrófagos!associados!a!tumores!(tumor$associated¯ophages)! TARC! Quimiocina!do!timo!regulada!por!ativação! TBE! Tris$borate&EDTA&buffer! TGF! Factor!de!transformação!do!crescimento! Th! Linfócitos!T!helper! TNF! Factor!de!necrose!tumoral! ! ! U! ! uPA! Ativador!de!plasminogénio!tipo!urocinase! uPAR! Receptor!do!ativador!de!plasminogénio!tipo!urocinase! ! & V! ! VEGF! Factor!de!crescimento!endotelial!vascular! VPF! Factor!de!permeabilidade!vascular! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ABSTRACT! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Abstract! ! XIX! Cancer!is!a!complex!disease!characterized!by!genetic!and!epigenetic!alterations!of!tumour!cells,! which! establish! an! interaction! with! the! different!cells! of! stroma,! among! which! the! tumourZ associated! macrophages! (TAMs)!are! included.! Several! studies! have! shown! that! these! macrophages! may! participate! in! promotion! of! tumour! development! and! their! malignant! transformation,! and! the! macrophage! colonyZstimulating! factor! (CSFZ1)! is! crucial!for! the! recruitment,!survival,!proliferation!and!differentiation!of!macrophages!in!tissues.! Lung!cancer!is!one!of!the!most!common!cancers!worldwide!and!has!a!high!mortality,!for!which! the!level!of!CSF$1!gene!expression!has!been!described!as!a!poor!prognosis!factor!and!an!inverse! relationship!between!tissue!levels!of!TAMs!and!diseaseZfree!survival!has!also!been!described.! Smoking! is! the! main! risk! factor! for! lung! cancer,! but! differences! in! susceptibility! to! its! development,! as! well! as! differences! in! its! clinical! course! and! response! to! therapy,! justify! research!on!genetic!polymorphisms!as!a!source!of!interZindividual!variability.! In! this! work,! we! developed! a! study! caseZcontrol,! with! the! aim! of! evaluating! the! influence! of! genetic!polymorphisms!CSF$1&R!A2033T!and!CSF$1$347C/T!(SNP!rs1058885)!in!susceptibility!to! nonZsmall!cell!lung!cancer!(NSCLC),!response!to!therapy!and!overall!survival.!431!patients!and! 514!individuals!without!known!malignant!disease!were!included.!The!individuals!of!both!groups! were!genotyped!by!PCRZRFLP!and!Real$Time!PCR!for!the!polymorphisms!CSF$1& R!A2033T!and! CSF$1&Z347C/T,!respectively.!The!statistical!analysis!was!performed!with!the!aid!of!SPSS!(version! 17.0).! The!results!showed!that!TT!genotype!of!polymorphism!CSF$1&R!A2033T!is!a!risk!factor!for!NSCLC! in!nonZsmokers!(OR=3.897,!95%CI!1.296!to!11.720,!p=0.01),!but!presenting!an!opposite!effect!in! individuals!with!current!or!past!history!of!smoking!(OR=0.410,!95%CI!0.169!to!0.990,!p=0.041).! Furthermore,!it!has!been!also!found!that!this!TT!genotype!of!polymorphism!CSF$1&R!A2033T!is! associated! with! an! increased! risk! of! distant! metastasis! (OR=2.479,! 95%CI! 0.989! to! 6212,! p=0.046),! especially!for!the! histology! type! of! adenocarcinomas! (OR=3.882,! 95%CI! 1.035! to! 14.568,!p=0.032).!Regarding!the!polymorphism!CSF$1!Z347C/T,!it!was!found!that!patients!with! histologic!type!of!undifferentiated!carcinoma!and!T!allele!carriers!had!a!higher!overall!survival! (23.8! months)! compared! with! patients! with! genotype! CC! (9! 3! months),! with! a! statistically! significant!difference!(p=0.036).! This! study! is! the! first! evidence! of! the! influence! of! genetic! polymorphisms! of! CSF$1!and! its! receptor!on!susceptibility!to!lung!cancer!development,!as!well!as!on!its!prognosis.! Keywords:!CSFZ1,!CFSZ1!receptor,!gene!polymorphism,!SNP,!non!small!cell!lung!cancer! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 1. INTRODUÇÃO! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 3! ! 1.1 Carcinogénese!e!Sistema!Imunitário! O! desenvolvimento! de! células! neoplásicas! tem! origem! em! células! normais! do! organismo! humano,! que! adquirem! progressivamente! características! que! lhes! permitem! o! crescimento! tumoral! e! disseminação! metastática,! e! que! correspondem! a! alterações! do! genoma,! nomeadamente!mutações! em! oncogenes! e! genes! supressores! tumorais! [1,! 2].! Uma! das! características!fundamentais!das!células!neoplásicas!é!a!sua!maior!capacidade!de!proliferação! celular,! quer! por! controlo! da! produção! de! factores! de! crescimento,! desregulação! dos! mecanismos!de!sinalização!intracelular!ou!evasão!dos!mecanismos!reguladores!do!crescimento! e! divisão! celular.! Outras! características! das! células! neoplásicas! incluem! a! sua! resistência! aos! mecanismos!de!morte!celular!como!a!apoptose,!um!potencial!replicativo!ilimitado!por!ativação! da! telomerase,! a! promoção! da! angiogénese,! a! sua! capacidade! de! invasão! local! e! de! metastização!(Figura!1).! ! Figura! 1!–!Mecanismos!propostos!para!a!transformação!neoplásica,!incluindo!as!alterações! adquiridas! pelas!células!malignas!e!nas!diferentes!células!do!estroma!tumoral!(adaptado!de![2]).! ! Além!das!células!neoplásicas,!os!tumores!correspondem!a!tecidos!complexos!constituídos!por! vários!tipos!de!células,!tais!como!fibroblastos,!células!endoteliais!e!células!do!sistema!imune,! que!constituem!o!estroma!e!que!interagem!entre!si,!contribuindo!também!para!a!carcinogénese.! Neste! estroma! celular,! existe! evidência! científica! que! as! células! do! sistema! imune! podem! promover!ativamente!o!crescimento!tumoral,!uma!vez!que!têm!capacidade!de!promoverem!a! angiogénese,!a!proliferação!das!células!neoplásicas!e!a!capacidade!de!invasão,!assim!como!de! modulação!da!resposta!imunitária![2].! De! acordo! com! a! hipótese! da! imunovigilância,! o! sistema! imunitário! reconhece! as! células! malignas! como! agentes! estranhos,! promovendo! a! sua! eliminação,! o! que! pode! ocorrer! pela! reação!contra!antigénios!tumorais!específicos!ou!contra!antigénios!associados!a!tumores,!que! correspondem! a! moléculas! que! são! expressas! de! modo! diferente! pelas! células! neoplásicas! e! !"#$%&'(&$')#*+&,-$' $./,-$$&,-$'(-'*,-$*01-2+&' !"#$%&'(#'(-$+,.03%&' /-4&'$0$+-1#'01.20+5,0&' 67.0$03%&'(-'01&,+#40(#(-' ,-/40*#8"#' 92:#1#3%&'2#'/,&1&3%&'(#' *#,*02&;<2-$-' 68"#3%&'(#'02"#$%&'-' 1-+#$8=#3%&' 92(.3%&'(#' #2;0&;<2-$-' 92$+#>040(#(-';-2?10*#' -'1.+#3@-$' A-$0$+B2*0#'C'1&,+-' *-4.4#,' D-$,-;.4#3%&'(&'1-+#>&40$1&' *-4.4#,'-2-,;<8*&' 68"#3%&'*&2$+#2+-'(#' $02#40=#3%&'/,&40)-,#8"#'' Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 4! Outubro!de!2012! ! células!normais![3].!Contudo,!temZse!verificado!que,!nesta!!interação!entre!o!tumor!e!o!sistema! imunitário,! ocorre! um! processo! designado! por! “cancer& immunoediting”,! com! três! cenários! possíveis!(Figura!2):!eliminação!do!tumor!pelo!sistema!imunitário;!ou!equilíbrio!entre!o!tumor!e! sistema!imunitário,!com!seleção!imune!de!células!menos!imunogénicas;!ou!evasão!tumoral,!em! que!há!o!crescimento!de!clones!neoplásicos!que!resistem!à!destruição!pelo!sistema!imunitário! [4].! ! Figura!2!–!Interacção!do!sistema!imunitário!na!carcinogénese,!podendo!ocorrer!a!eliminação!tumoral,!um! estado!de!equilíbrio!ou!a!evasão!tumoral.!Como!indicado!pelas!setas,!o!sistema!imunitário!pode!eliminar! as!células!neoplásicas!na!fase!de!eliminação!ou!de!equilíbrio,!adquirindo!as!características!de!um!tecido! normal.!γδ!–!linfócitos!T!γδ!,!CD4+!Z!linfócitos!T&helper;!CD8+!Z!linfócitos!T!citotóxicos;!Mac!–!macrófagos;! NKT!–!células!natural&killer!T!(adaptado!de![4]).! ! Existe!também!evidência!científica!que!as!células!neoplásicas!manipulam!o!sistema!imunitário!a! favor!do!seu!desenvolvimento,!quer!pela!sua!capacidade!de!evasão!da!destruição!imunológica,! particularmente!pelos!linfócitos!B!e!T,!macrófagos!e!células!NK,!quer!pela!indução!de!respostas! inflamatórias!promotoras!do!crescimento!tumoral,!evidenciando!assim!uma!dicotomia!no!papel! do! sistema! imunitário! na! carcinogénese,! que! simultaneamente! antagoniza! e! promove! o! desenvolvimento! e! progressão! dos! tumores! [5].! De! facto,! a! inflamação! pode! contribuir! para! várias! das! características! próprias! das! células! neoplásicas! através! da! secreção! de! moléculas! bioactivas!para!o!microZambiente!tumoral,!incluindo!factores!de!crescimento!que!perpetuam!a! proliferação,! factores! de! sobrevivência! que! limitam! a! morte! celular,! substâncias! próZ angiogénicas,! enzimas! modificadoras! da! matriz! extracelular,!que! facilitam! a! angiogénese,! invasão!e!metastização,!assim!como!substâncias!químicas!mutagénicas,!como!espécies!reactivas! de!oxigénio![2,!5].! Esta!dicotomia!das!células!imunitárias! como!promotoras!e! antagonizadoras!da!carcinogénese! pode!ser!explicada!de!acordo!com!as!diferentes!funções!do!sistema!imunitário:!a!eliminação!de! agentes!infecciosos!através!de!uma!resposta!imunitária!adaptativa!em!associação!com!o!sistema! imunitário!inato!e,!por!outro!lado,!a!participação!da!resposta!imunitária!inata!na!cicatrização!e! eliminação!de!restos!celulares,!através!de!mecanismos!alternativos!de!ativação!de!macrófagos,! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 5! ! neutrófilos!e!células!progenitoras!mielóides! [5].!São!estas!células!do!sistema!imunitário!inato! que! constituem! as! principais! fontes! de! factores! de! crescimento,! substâncias! angiogénicas! e! factores!remodeladores!da!matriz,!que!são!úteis!na!cicatrização,!mas!que!também!podem!ser! manipuladas!para!favorecer!a!progressão!neoplásica,!estando!descrito!que!algumas!subZclasses! de!linfócitos!B!e!T!podem!facilitar!o!recrutamento,!ativação!e!persistência!destes!macrófagos!e! neutrófilos!promotores!da!cicatrização!e!da!carcinogénese![2,!5].! No!estroma!tumoral,!os!macrófagos!representam!até!50%!da!massa!tumoral!e!assim!constituem! uma! população! celular! proeminente,! com! funções! importantes! na! carcinogénese! [6].! Os! macrófagos!na!periferia!dos!tumores!podem!promover!a!invasão!local!por!fornecerem!enzimas! degradadoras! da! matriz! como! as! metaloproteinases! e! proteases!de! cisteína! catepsina! [2]! e,! assim,!as!células!neoplásicas!podem!secretar!substâncias!quimioatractoras!para!recrutar!estas! células!inflamatórias!próZinvasoras.! Os!macrófagos!promotores!da!invasão!são!ativados!pela!ILZ4!produzida!pelas!células!neoplásicas! [2].! Num!modelo! experimental! de! cancro! da! mama! metastático,! os! macrófagos! associados! a! tumores! (TAMs)! fornecem! EGF!(factor! de! crescimento! epidérmico)! às! células! neoplásicas! da! mama,!enquanto!que!as!células!neoplásicas!estimulam!reciprocamente!os!macrófagos!com!CSFZ 1! (factor! estimulante! de! colónias! de! macrófagos),! sendo! que! estas! interações! concertadas! facilitam!a!invasão!tumoral!no!sistema!circulatório!e!disseminação!metastática![7].! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 12! Outubro!de!2012! ! 1.4 CSF@1!e!seu!receptor! CSFZ1,!também!conhecido!como!MZCSF,!é!um!factor!de!crescimento!polipeptídico!dimérico!que! atua!através!do!receptor!de!membrana!tirosina!cinase!(CSFZ1!R),!codificado!pelo!protoZoncogene! c$fms! [18].! A! expressão! do! oncogene! c$fms!ativado! em! células! susceptíveis! garante! o! fornecimento!sustentado!de!sinais!para!crescimento!celular,!na!ausência!de!estimulação!pelo! seu!ligando!(CSFZ1),!causando!assim!a!transformação!neoplásica,!tendo!sido!identificado!que!a! mutação!ativadora!provoca!uma!alteração!no!domínio!extracelular!de!ligação!ao!ligando![42].! CSFZ1!é!um!factor!de!crescimento!hematopoiético!que!regula!especificamente!a!sobrevivência,! proliferação! e! diferenciação! de! células! da! linhagem! mononuclear! fagocítica,! nomeadamente! CFUZC,!monoblasto,! próZmonócito,!monócito!e!macrófago.!A!maior!diferenciação!celular!está! associada! a! um! aumento! da! expressão! de! CSFZ1! R,! em! que! as! células! adquirem! apenas! capacidade! de! resposta! a! CSFZ1,! que! é! assim! um! indicador! específico! de! diferenciação! da! linhagem! mononuclear! fagocítica! [43].! Além! disso,! e! como! já! referido! anteriormente,! CSFZ1! participa! na! quimiotaxia! dos! macrófagos! [44].! A! síntese!de! CSFZ1! ocorre! principalmente! em! fibroblastos,! mas! também! pode! ser! induzida! em! células! endoteliais,! monócitos! e! macrófagos! [45].!Mais!recentemente,!temZse!evidenciado!o!papel!do!CSFZ1!nas!respostas!imunológicas,!no! metabolismo! ósseo!através! da! remodelação! óssea! pelos! osteoclastos,! no! trato! intestinal,!na! fertilidade!e!gravidez,!sugerindo!assim!que!CSFZ1!é!mais!uma!citocina!do!que!apenas!um!factor! de!crescimento.! Em! indivíduos! normais,! CSFZ1! é! normalmente! detectado! no! soro! (2,4! ng/mL! ou! 120! unidades/mL)!e!tem!sido!também!proposta!a!sua!utilização!como!marcador!tumoral!para!várias! neoplasias!associadas!ao!aumento!dos!seus!níveis!séricos,!incluindo! cancro!do!pâncreas![46],! colorectal![47],!mama![48],!ovário![49],!endométrio![50],!colo!do!útero![51],!cabeça!e!pescoço! [52],!assim!como!para!cancro!do!pulmão![53].! CSFZ1! R! é! uma! glicoproteína! transmembranar! integral,! com! 972! aminoácidos,! incluindo! um! segmento!extracelular!de!512!aminoácidos!com!o!domínio!de!ligação!ao!CSFZ1,!um!segmento! transmembranar!com!25!aminoácidos!e!um!domínio!intracelular!de!435!aminoácidos!que!inclui! todas!as!sequências!necessárias!para!a!atividade!tirosina!cinase![45].!Existem!duas!isoformas!de! CSFZ1!R!devido!a!diferentes!vias!de!processamento,!mas!sem!diferenças!quanto!à!afinidade!para! o! ligando:! a! isoforma! dos! macrófagos! e! monócitos! é! uma! isoforma! menor,! enquanto! que! a! isoforma!presente!no!trofoblasto!tem!mais!15!aminoácidos!no!seu!N!terminal![54].! A!especificidade!do!CSFZ1!para!o!seu!receptor!foi!demonstrada!com!um!modelo!animal!com!uma! mutação!null&de!CSFZ1!R,!que!apresentava!um!fenótipo!semelhante!ao!modelo!animal!com!uma! mutação!null!de!CSFZ1![55]!e!sabeZse!que!todas!as!isoformas!de!CSFZ1!apresentam!ligação!ao! CSFZ1!R.! Através!de!splicing!alternativo!e!diferente!processamento!proteolítico!pósZtranslacional,!CSFZ1! pode! ser! secretado! para! a! circulação! como! glicoproteína! ou! proteoglicano! de! sulfatos! de! condroitina!ou!ser!expresso!como!glicoproteína!membranar!na!superfície!das!células!produtoras! de! CSFZ1! [56],! sendo! todas! estas! isoformas! biologicamente! ativas.! A!isoforma! membranar! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 13! ! estimula!o!crescimento!das!células!da!medula!óssea!por!uma!via!de!sinalização!justácrina!por! contacto!direto!com!células!que!apresentam!o!CSFZ1!R.!! Em! termos! fisiológicos,! temZse! verificado! que! a! expressão! in& vivo!de! CSFZ1! ocorre! em! localizações!específicas!de!vários!tecidos,!incluindo!o!epitélio!mamário,!dada!a!contribuição!dos! macrófagos! no! desenvolvimento! da! glândula! mamária,! assim! como! em! osteoblastos!para! garantir!a!localização!de!osteoclastos!com!CSFZ1!R!nos!locais!de!remodelação!óssea!e!em!células! endoteliais,!que!participam!no!recrutamento!das!populações!de!monócitos!circulantes![35].! A! descoberta! das! funções! fisiológicas! de! CSFZ1! deveZse! a! um! modelo! animal! de! rato! osteopetrótico! (op/op),! que! sofre! de! osteopetrose! congénita! por! deficiência! grave! de! osteoclastos!devido!a!uma!mutação!no!gene!de!CSF$1,!com!consequente!ausência!da!sua!síntese! [57].!Para!avaliar!a!função!do!CSFZ1!na!carcinogénese,!foi!desenvolvido!um!modelo!animal!de! cancro!da!mama!com!uma!mutação!recessiva!null!no!gene!CSF$1&(Csf1op)!e!verificouZse!que!a! ausência! de! CSFZ1! não! afectava! o! aparecimento,! nem! o! crescimento! dos! tumores! mamários,! mas!afectava!a!progressão!para!doença!maligna!e!o!aparecimento!de!metástases!pulmonares,!o! que! se! encontrava! correlacionado! com! o! recrutamento! de! macrófagos! e! aumento! da! sua! densidade!tecidular![18].!Neste!mesmo!estudo,!verificouZse!que!a!expressão!de!CSFZ1!R!estava! restrita!aos!macrófagos,!ao!contrário!dos!tumores!em!humanos,!sugerindo!assim!que!o!CSFZ1! promove!a!metastização!através!do!recrutamento!e!polarização!dos!TAMs![18].! Este! modelo!animal! também! permitiu! verificar! que! o! CSFZ1! é! importante! na! formação! do! estroma!e!na!angiogénese!em!tumores!murinos!de!cancro!do!pulmão![58].!Pelo!contrário,!em! linhas! celulares! de! cancro! do! pulmão,! a! transdução! com! o! gene! humano! de! CSF$1!não! se! associou! com! um! aumento! da! proliferação! in& vitro!e! apresentando! mesmo! um! efeito! antiZ tumoral,!com!diminuição!do!número!de!metástases!ganglionares,!hepáticas!e!renais![59].! TemZse! também! verificado! uma! sobreZexpressão!de! CSFZ1! e! CSFZ1! R! em! células! tumorais!de!! mama,!útero!e!ovário,!em!que!um!elevado!nível!de!expressão!se!correlaciona!com!um!maior! grau!histológico,!maior!invasão!tumoral!e!pior!prognóstico![60,!61],!assim!como!em!tumores!de! células!mielóides!e!linfóides![56].!Num!estudo!de!imunohistoquímica!em!doentes!com!cancro!da! mama,!verificouZse!que!a!expressão!de!CSFZ1!está!diretamente!corelacionada!com!maior!risco! de!metastização!e!pior!prognóstico![62].! Também!a!expressão!de!CSFZ1!R!se!encontra!associada!ao!risco!de!recidiva!local!em!doentes! com!cancro!da!mama,!embora!sem!relação!com!a!metastização!à!distância![63].!A!coZexpressão! de!CSFZ1!e!seu!receptor!foi!também!já!observada!noutras!neoplasias,!como!cancro!da!próstata! [64],! colo! do! útero! [65],! endométrio! [61],! ovário! [66],! linfoma! de! Hodgkin! [67]! e! leucemia! mielóide!aguda![68].! A!coZexpressão!de!CSFZ1!e!seu!receptor!nestas!células!sugere!que!o!CSFZ1!possa! promover!a! invasão!tumoral!por!ação!direta!em!células!tumorais!que!expressam!CSFZ1!R!atuando!como!um! factor!de!crescimento!autócrino!para!as!células!tumorais,!embora!também!possa!interagir!com! outras!células!do!sistema!imunitário!que!expressam!o!CSFZ1!R!como!TAMs,!modulando!assim!a! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 14! Outubro!de!2012! ! resposta! imunitária! [18],! o! que! sugere! uma! ação! autócrina! e! parácrina! de! CSFZ1! na! invasão! tumoral.! Evidência! experimental! fundamenta! a! ação! autócrina! de! CSFZ1! produzido! por! tumores! na! promoção!do!crescimento!e!invasão!das!células!tumorais!no!estroma:!em!linhas!celulares!de! carcinoma!do!pulmão!(A549!e!CaluZ1),!com!expressão!de!baixos!níveis!de!CSFZ1!R,!a!exposição! CSFZ1!associouZse!a!um!aumento!da!capacidade!de!invasão![69],!sugerindo!assim!o!papel!do!CSFZ 1!no!aumento!do!potencial!metastático!de!células!tumorais!com!expressão!de!CSFZ1!R.! A! medição! dos! níveis! circulantes! de! CSFZ1! também!tem! sido! utilizada! em! doentes! com! carcinoma!da!mama,!endométrio!e!ovário,!quer!para!detecção!precoce,!quer!como!factor!de! prognóstico!e!na!monitorização!da!resposta!à!terapêutica![50,!60,!70].!Num!estudo!prospectivo! com!cancro!da!mama,!os!níveis!plasmáticos!de!CSFZ1!foram!mais!elevados!nos!casos!de!doença! localmente!avançada!ou!metastizada![48],!o!que!se!encontra!de!acordo!com!o!papel!do!CSFZ1!na! metastização,!anteriormente!referido!em!modelos!animais.! É! de! salientar! que! as! diferentes! isoformas! de! CSFZ1! podem! apresentar! funções! opostas! na! progressão! tumoral,! estando! descrito! que,! em! estudos! in& vitro!com! linhas! celulares!de! glioblastoma!T9,!a!expressão!isolada!da!isoforma!membranar!(mCSFZ1)!induzia!um!efeito!antiZ tumoral!mediado!por!macrófagos,! o! que! não! se! verificava! com! as! isoformas! secretadas! [71].! Estes! resultados! também! foram! confirmados! in&vivo,! em! que! a! implantação!intracraniana! de! células!de!glioblastoma!T9!transfectadas!com!mCSFZ1!se!associava!com!uma!rejeição!de!80%!do! tumor! ! e! consequente! sobrevivência! dos! ratos,! estando! associada! a! uma! marcada! infiltração! tumoral!por!macrófagos,!enquanto!que!!células!T9!transfectadas!com!a!isoforma!secretada!eram! sempre! fatais! [72].! Estes! estudos! sugerem! assim! que! a! isoforma! membranar! pode! induzir! a! citotoxicidade!dos!macrófagos!e!a!imunidade!sistémica,!enquanto!que!as!isoformas!secretadas! podem! inibir! a! resposta! imunitária,! sendo! de! realçar! que! a! maioria! do! CSFZ1! expresso! em! cancros! da! mama,! endométrio! e! ovário! corresponde! às! isoformas! secretadas! [60],! as! quais! podem!saturar!os!receptores!de!CSFZ1,!impedindo!assim!a!interação!da!isoforma!membranar,!o! que!constitui!um!mecanismo!de!evasão!à!resposta!imunitária.! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 15! ! 1.5 Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R! O!cancro!constituiu!uma!doença!multifactorial,!cuja!etiologia!é!influenciada!pela!interação!de! factores! genéticos! e! ambientais.! Assim,! a! variabilidade! genética! pode! explicar! diferenças! em! termos! de! susceptibilidade! para! o! desenvolvimento! e! progressão! das! neoplasias,! bem! como! diferenças!na!resposta!à!terapêutica!em!termos!de!eficácia!ou!perfil!de!reações!adversas,!o!que! constitui!o!âmbito!da!farmacogenómica![73].!Com!o!desenvolvimento!do!Projeto!do!Genoma! Humano,!verificouZse!que!o!número!de!genes!existentes!era!de!apenas!30.000!a!35.000!e!que!as! sequências! codificantes!de! proteínas! correspondiam! a! aproximadamente!1,5%! do! genoma! humano![74].! Os!polimorfismos! genéticos! são! variantes! nos! genomas! individuais!e,! por! definição,! os! alelos! formados!existem!em!indivíduos!normais,!tendo!o!alelo!menos!comum!uma!frequência!de,!pelo! menos,!1%![75].!O!tipo!mais!comum!de!polimorfismo!corresponde!a!substituições!de!um!único! nucleótido! (SNP),! correspondendo! a! 90%! dos! polimorfismos! genéticos! [75].! Estas! diferentes! sequências! de! DNA! podem! ser! responsáveis! por! distintos! papéis! moleculares! funcionais! e! contribuir!para! a! variabilidade! interZindividual,! podendoZse! correlacionar! com! variações! fenotípicas!relevantes!em!medicina.!Vários!estudos!de!associação!têm!evidenciado!a!correlação! entre! os! polimorfismos! genéticos! e! a! susceptibilidade! para! determinadas!doenças! e! sua! evolução!clínica,!inclusive!em!várias!neoplasias![76,!77].! Os! genes! de! citocinas! são! altamente! polimórficos! e,! como! os! polimorfismos! se! encontram! frequentemente! em! regiões! que! regulam! a! transcrição!ou! eventos! pósZtranscricionais,! estes! polimorfismos! podem! ser! funcionalmente! importantes.! Vários! estudos! já! demonstraram! a! associação!de!alguns!destes!polimorfismos!com!a!susceptibilidade!para!cancro!e!sua!gravidade! [5],!sugerindo!assim!que!algumas!citocinas!podem!ser!genes!modificadores!da!carcinogénese.! O!gene!CSF$1!encontraZse!localizado!no!braço!curto!do!cromossoma!1!(1p21Zp13)![78]!e!contém! 18.898!pb,!com!10!exões!e!9!intrões,!codificando!uma!proteína!com!554!aminoácidos![35,!79].! No!National&Center&for&Biotechnology&Information!(NCBI),!estão!descrito!385!SNPs!no!gene!CSF$1& humano!e!a!escolha!dos!SNPs!a!avaliar!no!presente!trabalho!teve!em!conta!a!sua!frequência!na! população,!o!seu!provável!impacto!em!termos!de!expressão!génica!e!características!da!proteína! sintetizada,!assim!como!disponibilidade!de!técnicas!para!a!sua!detecção!e!evidência!prévia!da! associação!com!outras!patologias.! Neste!contexto,!foi!selecionado!o!SNP!rs1058885!(Z347!C/T),!que!é!um!polimorfismo!missense!no! exão!6,!com!substituição!de!uma!leucina!por!prolina!na!posição!408![80],!que!está!localizada!no! C!terminal!da!proteína!precursora!de!CSFZ1!e!cuja!consequência!funcional!ainda!não!se!encontra! esclarecida,!embora!se!saiba!que! estes!aminoácidos! apresentam! propriedades! físicoZquímicas! semelhantes,! em! termos! de! tamanho! médio! e! hidrofobicidade,! e! se! tenha! verificado! que! os! resíduos!do!N!terminal!sejam!suficientes!para!a!atividade!biológica!do!CSFZ1!humano!em!células! murinas!da!medula!óssea![81].!A!frequência!do!alelo!C!é!de!0,426!e,!num!estudo!de!coorte!com! 9960!indivíduos!(98%!de!caucasianos!e!62%!do!sexo!feminino),!verificouZse!uma!frequência!do! alelo!T!de!0,67,!sem!qualquer!diferença!entre!género!e!grupos!etários![82].! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 16! Outubro!de!2012! ! O!gene!CSF$1&R!encontraZse!no!cromossoma!5q33Zq35,!estando!descrito!o!SNP!A2033T!no!intrão! 11,!localizado!77!pb!a!jusante!de!um!local!de!ligação!para!o!factor!de!transcrição!Runx!I!e!2033! pb!da!extremidade!3’!do!intrão!11,!e!que!foi!identificado!como!factor!de!susceptibilidade!para!a! Doença!de!Crohn![83].! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 17! ! 1.6 Cancro!do!Pulmão! O! cancro! do! pulmão! compreende! tumores! com! origem! no! epitélio! respiratório! (brônquios,! bronquíolos! e! alvéolos),! assim! como! mesoteliomas,! linfomas! e! sarcomas.! Em! termos! histopatológicos,!e!de!acordo!com!a!classificação!da!OMS,!o!adenocarcinoma!é!o!mais!frequente! (32%),! seguido! do! carcinoma!epidermóide! ou!de! células! escamosas! (29%),! carcinoma! de! pequenas! células! (18%)! e! carcinoma! de! grandes! células! (9%)! [84].! Nos! últimos! 25! anos,! o! adenocarcinoma!substitui!o!carcinoma!epidermóide!como!o!tipo!histológico!mais!frequente!e!a! incidência!do!carcinoma!de!pequenas!células!tem!vindo!a!diminuir.! Histologicamente,!o!cancro!do!pulmão!é!dividido!em!dois!grandes!grupos,!o!dos!carcinomas!do! pulmão!de!pequenas!células!(CPPC)!e!o!de!não!pequenas!células!(CPNPC).!Dentro!deste!último,! incluemZse!os!carcinomas!epidermóides,!os!adenocarcinomas!e!os!tumores!de!grandes!células,! entre!outros!tipos!histológicos.!Além!da!sua!maior!incidência,!o!CPNPC!apresenta!pior!resposta!à! radioterapia! (30Z50%)! e! quimioterapia! de! associação! (20Z35%),!embora! a! cirurgia! ou! radioterapia!sejam!curativas!para!CPNPC!com!doença!não!metastizada![84],!tendoZse!verificado! o!aparecimento!de!vários!fármacos!nos!últimos!anos!que!têm!melhorado!o!seu!prognóstico.! O!cancro!do!pulmão!tem!sido!a!neoplasia!mais!comum!a!nível!mundial!durante!várias!décadas!e,! em!2008,!calculouZse!uma!estimativa!de!1,61!milhões!de!novos!casos,!representando!12,7%!de! todos!os!diagnósticos!de!neoplasias![85]!(Figura!5).!Além!disso,!o!cancro!do!pulmão!é!a!causa! mais! comum! de! morte! oncológica,! com! 1,38! milhões! de! mortes! (18,2%! no! ! total),! estando! associado!a!uma!elevada!fatalidade!(razão!entre!mortalidade!e!incidência!de!0,86)![85].! ! Figura!5!–!Taxas!de!incidência!anuais!do!cancro!de!pulmão!por!100.000!indivíduos,!em!ambos!os!sexos!em! 2008!(adaptado!de![85]).! ! Com!base!nestes!mesmos!dados!estatísticos!referentes!à!situação!mundial!em!2008,!verificouZse! que! o! cancro! do! pulmão! foi! a! neoplasia! mais! diagnosticada! no! sexo! masculino! (aproximadamente!1,1!milhões!de!casos,!16,5%!no!total),!correspondendo!também!à!principal! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 18! Outubro!de!2012! ! causa!de!morte!oncológica!nos!homens!(951!mil!mortes,!22,5%!do!total),!enquanto!que,!no!sexo! feminino,! verificouZse! que! o! cancro! do! pulmão! corresponde! à! quarta! neoplasia! mais! frequentemente!diagnosticada!(513!mil!casos,!8,5%!de!todos!os!cancros)!e!à!segunda!causa!de! morte!por!cancro!(427!mil!mortes,!12,8%!do!total)![85,!86].!A!maioria!dos!casos!ocorre!agora!nos! países!em!desenvolvimento!(55%)![85],!o!que!corresponde!a!um!grande!aumento!nos!últimos! anos!e!temZse!também!verificado!um!aumento!da!incidência!desta!neoplasia!no!sexo!feminino! nos!últimos!anos!em!vários!países![86],!o!que!se!associa!à!evolução!dos!hábitos!tabágicos.! O!tabagismo!constitui!a!principal!causa!de!cancro!do!pulmão,!o!que!foi!estabelecido!desde!os! finais!da!década!de!1950![87],!sendo!atualmente!responsável!por!80%!dos!cancros!do!pulmão!no! sexo!masculino!e,!pelo!menos,!50%!dos!casos!no!sexo!feminino!a!nível!mundial![86].!Existe!uma! clara! relação! doseZresposta! entre! o! risco! de! cancro! do! pulmão! e! o! número! de! cigarros! consumidos!por!dia!e!a!duração!do!tabagismo!ao!longo!da!vida![88],!tendoZse!verificado!uma!OR! de!23,9!para!fumadores!atuais!e!7,5!para!exZfumadores!no!sexo!masculino,!com!valores!de!8,7! para!fumadores!atuais!e!2,0!para!exZfumadores!no!sexo!feminino!numa!revisão!de!10!estudos! casoZcontrolo! a! nível! europeu,! o! que! corresponde! a! riscos! atribuíveis! superiores! a! 80%! nos! homens!e!cerca!de!60%!nas!mulheres![89].!Apesar!o!tabagismo!aumentar!o!risco!de!todos!os! tipos! histológicos! de! cancro! do! pulmão,! temZse! verificado! um! maior! risco!relativo! para! carcinomas!de!células!escamosas!e!de!pequenas!células!em!comparação!com!adenocarcinomas! [89].! A! exposição! passiva! ao! fumo! de! tabaco! a! nível! ambiental! é! também! um! factor! de! risco! conhecido! para! cancro! do! pulmão,! estando! descrito! um! aumento! do! risco! em! 15Z20%! [90].!! Além! do! tabaco,! outros! factores! de! risco! têm! sido! identificados,! tais! como! a! exposição! ocupacional! e! ambiental! a! carcinogéneos,! como! asbestos,!alcatrão,! arsénico,! rádon,! crómio,! níquel,!e!hidrocarbonetos!aromáticos!policíclicos![91].! O!cancro!do!pulmão!apresenta!geralmente!um!mau!prognóstico,!pois!a!maior!parte!dos!casos!é! diagnosticada!como!doença!avançada!e!a!taxa!de!sobrevida!global!aos!5!anos!continua!a!ser! reduzida!(15%)![84],!embora!se!tenha!assistido!ao!seu!aumento!nos!últimos!anos!devido!aos! avanços! terapêuticos.! Deste! modo,! justificaZse! a! realização! de! investigação! no! sentido! de! identificar! novos! marcadores! moleculares! com! influência! na! susceptibilidade! para! o! aparecimento! do! cancro! do! pulmão,! assim! como! em! termos! de! prognóstico! e! resposta! à! terapêutica,! o! que! constitui!o! objectivo! deste! projeto! de! investigação,! o! qual! apenas! foi! desenvolvido!em!doentes!com!CPNPC!dada!a!sua!maior!incidência.! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! Outubro!de!2012! 19! ! 1.7 Inflamação!no!Cancro!do!Pulmão!de!Não!Pequenas!Células! A!relação!entre!inflamação!crónica!e!carcinogénese!encontraZse!já!bem!estabelecida,!inclusive! para!o!cancro!do!pulmão.!De!facto,!o!tabaco,!além!do!efeito!carcinogénico!direto,!está!associado! à! infiltração! pulmonar! por! várias! células! do! sistema! imunitário,! como! macrofágos,! células! dendríticas,!linfócitos!e!granulócitos,!com!consequente!ativação!local!e!produzindo!assim!uma! resposta! imunitária! que! pode! favorecer! a! proliferação! de! células! em! transformação! maligna.! Também! a! DPOC,! caracterizada! por! uma! resposta! inflamatória! anormal!responsável! pela! remodelação!das!vias!aéreas!e!destruição!proteolítica!dos!alvéolos,!se!encontra!associada!a!um! maior! risco! de! desenvolvimento! de! cancro! do! pulmão,! mesmo! considerando! variáveis! de! confundimento! como! o! tabagismo:! um! FEV1!<70%!que! o! previsto!associaZse! com! um! risco! relativo!de!cancro!do!pulmão!de!2,23!(IC95%! 1,73Z2,86)!no!sexo!masculino!e!de!3,97!(IC95%! 1,93Z8,25)! no! sexo! feminino! [92].! Outras! patologias! respiratórias,!em! que! a! inflamação! é! patogénica,! têm! sido! associadas! ao! desenvolvimento! do! cancro! do! pulmão,! como! a! fibrose! pulmonar!idiopática!que!se!associou!a!um!risco!sete!vezes!superior!(RR!7,31,!IC95%!4,47Z11,93),! independentemente!da!história!de!tabagismo![93].! Existem!dados!contraditórios!sobre!o!efeito!da!resposta!inflamatória!no!cancro!do!pulmão!e!a! sua! relação! com! a! sobrevida.! Alguns! estudos! sugerem! que! um! aumento! da! resposta! linforeticular! conferia! uma! vantagem! em! termos! de! sobrevida,! mas! outros! estudos! têm! verificado!que!a!infiltração!tumoral!com!células!imunitárias!está!associada!a!pior!prognóstico,!o! que!depende!especialmente!do!tipo!especifico!de!resposta!imunitária!e!da!localização!dentro! das!diferentes!partes!do!tumor![94].!No!que!concerne!aos!TAMs,!também!têm!sido!realizados! estudos!sobre!a!relação!entre!a!infiltração!tumoral!e!o!prognóstico!do!CPNPC,!mas!também!com! resultados!contraditórios.!Em!doentes!com!CPNPC!sujeitos!a!ressecção!cirúrgica!(estadiamento! TNM!I!a!IV),!a!densidade!de!macrófagos!CD68+!nas!ilhotas!tumorais!foi!identificado!como!um! factor!preditivo!da!sobrevida!independente,!com!base!numa!técnica!de!imunohistoquímica:!a! sobrevida!aos!5!anos!foi!de!52,9%!nos!doentes!com!uma!densidade!de!macrófagos!nas!ilhotas! tumorais! superior! à! mediana! versus& 7,7%! quando! a! densidade! de! macrófagos! era! inferior! à! mediana![95].! Os!mesmos!resultados!foram!verificados!noutro!estudo!com!CPNPC,!em!que!os!doentes!com! maior!densidade!de!macrófagos!nas!ilhotas!tumorais!apresentavam!uma!sobrevida!aos!5!anos! de! 63,9%! versus!38,9%! nos! doentes! com! menores! densidades! de! macrófagos!e! assim!a! contagem! de! macrófagos! nas! ilhotas! tumorais!foi! identificado! como! um! factor! prognóstico! independente!da!sobrevida![96].!Contudo,!outro!estudo!identificou!a!densidade!de!macrófagos! CD68+!no! estroma! tumoral! como! factor! de! prognóstico! em!doentes! com! CPNPC,! que! estava! associada!a!uma!menor!sobrevida!e!existindo!maior!quantidade!de!macrófagos!no!estroma!do! que!nas!ilhotas!tumorais!(7,2!versus!4,2!por!campo!de!maior!ampliação,!p=0,040)![97].! Outro!estudo!envolvendo!adenocarcinomas!do!pulmão!demonstrou!que!a!maior!infiltração!por! TAMs!CD68+!estava!associada!a!maior!densidade!de!microvasos!e!pior!prognóstico,!verificandoZ se!uma!maior!densidade!de!macrófagos!no!estroma![98].!Resultados!semelhantes!foram!obtidos! noutro! estudo! com! CPNPC,! em! que! a! densidade! de! macrófagos! CD68+!apresentou! uma! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Introdução! 20! Outubro!de!2012! ! correlação!positiva!com!a!contagem!de!microvasos!e!uma!correlação!negativa!com!a!sobrevida! livre!de!doença![23].!Também!se!comprovou!a!correlação!de!TAMs!com!linfangiogénese!periZ tumoral!em!doentes!com!adenocarcinoma!do!pulmão,!em!que!se!verificou!que!o!tempo!médio! de!sobrevida!foi!de!25!e!11!meses!no!grupo!de!doentes!com!baixa!contagem!de!TAMs!e!elevada! contagem!de!TAMs,!respectivamente![99].! Ohri! et& al!demonstrou! que! estes! macrófagos! nas! ilhotas! tumorais!apresentam! preferencialmente! um! fenótipo! M1! citotóxico! antiZtumoral! usando! uma! técnica! imunohistoquímica:! no! grupo! de! doentes! com! maior! sobrevida,! a! densidade! de! macrófagos! positivos!para!marcadores!do!fenótipo!M1!(HLAZDR,!iNOS,!MRP!8/14!e!TNFZα)!nas!ilhotas!foi!de! 70%!versus!38%!para!os!marcadores!do!fenótipo!M2!(CD163!e!VEGF),!sendo!a!sobrevida!aos!5! anos!superior!a!75%!quando!a!expressão!de!M1!nas!ilhotas!era!superior!à!mediana!versus!<5%! quando!a!expressão!era!inferior!à!mediana![100].! Resultados!semelhantes!foram!observados!noutro!estudo,!em!que!a!contagem!dos!diferentes! fenótipos! também! foi! feita! por! imunohistoquímica! (CD68/HLAZDR! como! marcadores! de! macrófagos!M1!e!CD68/CD163!como!marcadores!de!macrófagos!M2),!em!que!se!identificou!a! densidade!de!macrófagos!M1!nas!ilhotas!tumorais!como!um!factor!preditivo!independente!do! tempo! de! sobrevida! dos! doentes.! Aproximadamente! 70%! dos! TAMs! eram! macrófagos! M2,! enquanto!que!os!restantes!30%!eram!M1!e,!quando!comparando!as!suas!densidades!entre!o! grupo!de!doentes!com!sobrevida!longa!(5!anos!em!média)!e!sobrevida!curta!(1!ano!em!média),! não!se!verificaram!diferenças!relativamente!aos!macrófagos!M2,!enquanto!que!a!densidade!de! macrófagos!M1!nas!ilhotas!tumorais!(≈70/mm2)!e!no!estroma!(≈34/mm2)!do!grupo!de!sobrevida! longa!era!significativamente!maior!que!no!grupo!de!sobrevida!curta!(densidade!de!macrófagos! M1!nas!ilhotas!tumorais!≈7/mm2!e!no!estroma!13/mm2)![101].! Relativamente!ao!papel!de!CSFZ1!e!seu!receptor!no!cancro!do!pulmão,!um!estudo!identificou!a! expressão!de! CSF1!com!factor!de!mau!prognóstico!em!doentes!com!carcinoma!epidermóide,! estadios!IZIIIA!(HZ=3,5!IC95%!1,5Z8,5,!p=0,005)![102].!Os!TAMs!isolados!de!amostras!histológicas! de!CPNPC!apresentaram!uma!elevada!produção!de!ILZ10!e!não!de!ILZ12,!o!que!é!coincidente!com! um! fenótipo! M2,! assim! como! um! aumento! da! expressão! de! várias! citocinas! e! enzimas! relacionadas!com!a! invasão!e!metastização,!em!que! a!expressão!de! MMP9! se! correlacionava! com! a! progressão! da! doença! [103].! Também! a! expressão! de! ILZ10! por! macrófagos! foi! identificada! como! factor! preditivo! independente! de! estadio!de!doença!avançada!em!doentes! sujeitos!a!ressecção!cirúrgica!por!CPNPC,!estando!assim!associada!a!pior!sobrevida!global![104].! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 2. OBJECTIVOS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Material!e!Métodos! 28! Outubro!de!2012! ! 3.3 Genotipagem!do!Polimorfismo!CSF$1&R!A2033T! A!caracterização!genotípica!dos!indivíduos!recrutados!relativamente!ao!polimorfismo!CSF$1& R! A2033T!foi!realizada!através!da!técnica!de!PCRZRFLP!(Polymerase&Chain&Reaction&$& Restriction& Fragment&Length&Polymorphism),!com!base!no!protocolo!descrito!por!ZapataZVelandia!et&al![83]! e!Leung!et&al![105],!em!que!se!procedeu!à!optimização!da!técnica!com!redução!do!tempo!de! digestão!pela!enzima!de!restrição,!de!overnight¶!3!horas.! Na!reação!de!PCR,!foi!utilizado!cerca!de!20!ng!de!DNA!de!cada!amostra,!o!que!corresponde!a!um! volume!de!2!μL.!O!volume!de!reação!foi!de!50!μL!e!a!mistura!de!reação!incluiu!10!μL!de!Tampão! de!Reação!de!PCR,!1U!de!Taq!DNA!Polimerase,!!2!mM!de!MgCl2!(GoTaq®&Flexi&DNA&Polymerase!#! M8305),!0,2!mM!de!dNTPs!(Fermentas,&#R0192)!e!0,2!μM!de!cada!um!dos!primers!(forward!5’Z TTC!TCT!GAG!CAG!CTC!CAA!TGZ3’!e!reverse!5’Z!CCA!CAG!ACA!GGC!CAC!TTC!TTZ3’).! As!condições!de!amplificação!utilizadas!basearamZse!numa!desnaturação!inicial!a!94oC!durante!3! minutos,! seguida! de! 3! ciclos! de! 30! segundos! a! 94oC! (desnaturação),! 30! segundos! a! 65oC! (emparelhamento)! e! 30! segundos! a! 72oC! (extensão),! e! subsequentemente! 32! ciclos! de! 30! segundos!a!94oC!(desnaturação),!30!segundos!a!63oC!(emparelhamento)!e!30!segundos!a!72oC! (extensão),!aos!quais!se!seguiu!uma!etapa!de!extensão!final!de!5!minutos!a!72oC.!A!reação!foi! efectuada!num!termociclador!programável!BioRad®.! Para!confirmar!a!correta!amplificação!dos!produtos!de!DNA!obtidos!por!PCR!e!o!seu!respectivo! peso!molecular!(510!pb),!analisaramZse!12!μL!do!produto!de!PCR!por!electroforese!em!gel!de! agarose!a!1,5%!(p/v),!corado!com!brometo!de!etídeo!(10!μg/mL).!Os!géis!foram!preparados!em! tampão!TBE,!o!qual!também!foi!utilizado!como!fase!móvel!na!electroforese.!As!amostras!foram! aplicadas!no!gel!e!foi!utilizado!um!marcador!de!peso!molecular!de!100!pb!(Fermentas&#SM0243).! A!visualização!dos! géis!foi!efectuada!com!um!transiluminador!Gel!DocXR,!usando!o! software! Quantity&One®,!Biorad!(Figura!6).! ! Figura!6!Z!Gel!de!agarose!a!1,5%!(p/v)!com!o!produto!de!PCR!da!região!CSF$1&R!A2033T!(banda!de!510!pb)! e!marcador!de!peso!molecular!de!100!pb.! ! Para! a! determinação! dos! genótipos! do! polimorfismo! CSF$1& R!A2033T,! procedeuZse! à! reação! enzimática!de!10!μL!de!produto!de!PCR!de!cada!amostra!com!6U!da!enzima!de!restrição!PvuII! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Material!e!Métodos! Outubro!de!2012! 29! ! (Fermentas,!#ER0631),!num!volume!final!de!reação!de!30,1!μL.!As!amostras!foram!incubadas!a! 37oC,!durante!3!horas.!Os!produtos!resultantes!da!digestão!do!fragmento!amplificado!do!gene! CSF$1& R,! contendo! a! sequência! de! interesse,! foram! observados! por! electroforese! em! gel! de! agarose!a!3%!(p/v),!corado!com!brometo!de!etídio!(10!μg/mL)!e!preparado!em!tampão!TBE,!o! qual!também!foi!utilizado!como!fase!móvel!na!electroforese.! A!técnica!de!PCRZRFLP!anteriormente!descrita!permite!a!identificação!dos!diferentes!genótipos! do! polimorfismo! CSF$1& R!A2033T!porque! a! digestão! enzimática! resulta! em! três! padrões! de! bandas!distintos:!no!genótipo!AA,!ocorre!digestão!pela!enzima!de!restrição!e!observamZse!dois! fragmentos! de! restrição! com! 246! pb! e! 264! pb;! no! genótipo! TT,! não! se! verifica! digestão! do! produto!de!PCR!e! assim!há!apenas!a!obtenção!de! um!fragmento!amplificado!com! 510!pb;!a! presença!de!três!bandas,!com!246,!264!e!510!pb!corresponde!ao!genótipo!AT!(Figura!7).!Para! garantia!de!qualidade,!os!resultados!de!discriminação!genotípica!foram!repetidos!em!10%!dos! casos!e!foram!analisados!e!confirmados!por!dois!investigadores!independentes.! ! Figura!7!@!Gel!de!agarose!a!3%!(p/v)!com!o!produto!de!PCRZRFLP!da!região!CSFZ1!R!A2033T!e!marcador!de! peso!molecular!de!100!pb,!com!observação!dos!três!genótipos!possíveis!do!polimorfismo:!genótipo!TT! com!banda!de!510!pb;!genótipo!AA!com!bandas!de!246!e!264!pb;!genótipo!AT!com!bandas!de!246,!264!e! 510!pb.!! ! 3.4 Genotipagem!do!Polimorfismo!CSF$1&@347C/T! A! caracterização! do! polimorfismo! CSF$1& Z347C/T! foi! realizada! por! discriminação! alélica,! utilizando! a! técnica! PCR! em! tempo! real,! com! recurso! a! sondas! específicas,! TaqMan®& SNP& Genotyping& Assay!C_! _! _1806488_10! (Applied& Biosystems),! executando! o! procedimento! laboratorial!fornecido!pelo!fabricante.!As!sondas!marcadas!com!fluorocromos!eram!específicas! para! cada! alelo:! VIC! –! alelo! C,! FAM! –! alelo! T! (CCAGGCTCTCCCAGGATCTCATCAC![C/T]! GCGCCCCCAGGGCCTCAGCAACCCC).! !!" !#"!#"##" !!" Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Material!e!Métodos! 30! Outubro!de!2012! ! A!reação!de!amplificação,!que!perfez!um!volume!de!reação!final!de!6!μL/amostra,!continha!2,5! μL! de! 2x! Taqman& Universal& Master& Mix,! 0,125! μL! de! 40x! Single&Nucleotide& Polymorphism& Genotyping&Assay,!2,375!μL!de!água!bidestilada!estéril!(Braun®)!e!1!μL!de!DNA!(cerca!de!10!ng).! As!condições!de!amplificação!basearamZse!na!ativação!da!Taq!DNA!Polimerase!a!95oC!durante! 10!minutos,!seguindoZse!45!ciclos!de!92oC!por!15!segundos!para!desnaturação!e!de!60oC!durante! 1!minuto!para!emparelhamento!dos!primers!e!extensão.! A!amplificação!foi!detectada!e!analisada!com!recurso!ao!aparelho!Real$Time!7300!ABI,!utilizando! o! software!7300! System& Sequence& Detection!(versão! 1.2.3.! Applied& Biosystems),! tal! como! apresentado!na!Figura!8.!Para!garantia!de!qualidade,!os!resultados!de!discriminação!genotípica! foram!repetidos!em!10%!dos!casos!e!foram!analisados!e!confirmados!por!dois!investigadores! independentes.! ! Figura!8!–!Resultados!do!PCR!em!tempo!real!para!o!polimorfismo!CSF$1&Z347C/T.! ! 3.5 Análise!Estatística! A!análise!estatística!dos!resultados!obtidos!foi!realizada!com!o!auxílio!do!programa!estatístico! Statistical&Package&for&Social&Sciences!Z!SPSS!(versão!17.0,!SPSS!Inc.).! A! análise! estatística! de! variáveis! categóricas! foi! efectuada! considerando! as! distribuições! genotípicas!estratificadas!de!acordo!com!os!grupos!(CPNPC!e!Controlos),!com!as!características! clínicoZpatológicas! dos! doentes!(estadiamento! TNM,! tipo! histológico! e! hábitos! tabágicos).! A! análise! pelo! teste!QuiZQuadrado! (χ2)! foi! utilizada! para! comparação! das! diferentes! variáveis! categóricas!com!determinação!do!valor!de!p,!que!foi!considerado!estatisticamente!significativo! quando!inferior!a!0,05.!! O!risco!para!ser!diagnosticado!com!CPNPC!associado!aos!genótipos!foi!calculado!através!do!odds& ratio!(OR)!e!respectivo!intervalo!de!confiança!95%!(IC95%).!O!odds&ratio!é!uma!estimativa!do! !"#$%"&"'()*+,-./."$(, 01234,-.5.+,6, 01234,-.5.+,0, 7+&+8"9:;$+#,00, 7+&+8"9:;$+#,66, 75<5%+8"9:;$+#,60, 0+'<%+.+, =59(;>+, Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Material!e!Métodos! Outubro!de!2012! 31! ! risco!relativo!para!determinado!acontecimento!num!estudo!casoZcontrolo!e!permite!avaliar!a! associação!entre!os!genótipos!de!CSF$1!e!CSF$1&R!e!o!risco!para!cancro!do!pulmão.! O!equilíbrio!de!HardyZWeinberg!foi!testado!através!de!um!teste!goodness&of&fit!de!Pearson,!de! forma!a!comparar!as!frequências!alélicas!observadas!com!as!esperadas.! ObtiveramZse!as!curvas!de!probabilidade!de!sobrevida!(sobrevida!global)!usando!o!modelo!de! KaplanZMeier!e!a!comparação!entre!as!curvas!de!sobrevida!foi!analisada!estatisticamente!com! os!testes! LogZRank! e! de! Breslow.! A! duração! da! sobrevida! global! foi! calculada! com! base! nos! registos!clínicos!de!cada!doente,!sendo!definida!como!o!intervalo!de!tempo!entre!o!diagnóstico! e!a!morte!ou!a!última!avaliação!clínica!do!doente.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 4. RESULTADOS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Resultados! Outubro!de!2012! 35! ! 4.1 Caracterização!da!Amostra! Neste!trabalho!experimental,!foram!recrutados!431!doentes!do!IPOZPorto,!de!raça!caucasiana,! com!diagnóstico!histopatológico!de!cancro!de!pulmão!(grupo!de!casos)!e!514!indivíduos!sem! doença!oncológica!conhecida,!de!raça!caucasiana!e!que!correspondiam!a!dadores!de!sangue!do! IPOZPorto! (grupo! controlo),! perfazendo! um! total! de! 945! indivíduos.! As! características! demográficas! e! clínicoZpatológicas! dos! indivíduos! recrutados! neste! estudo! encontramZse! descritas!na!Tabela!1.!As!amostras!utilizadas!para!a!genotipagem!foram!recolhidas!após!prévio! consentimento! de! todos! os! indivíduos! (casos! e! controlos),! de! acordo! com! a! Declaração! de! Helsínquia.! ! Tabela! 1! –! Características! demográficas! e! clínicoZpatológicas! do! grupo! de! casos! com! CPNPC! e! grupo! controlo.! ! Casos! (n=431)! Controlos! (n=514)! ! n! %! n! %! Género! ! ! ! ! Masculino! 338! 78,4! 263! 51,2! Feminino! 93! 21,6! 251! 48,8! Idade!(anos)! ! ! ! ! Média!±!DesvioZPadrão! 63,0!±!10,3! ! 56,3!±!8,4! ! Mínimo!–!Máximo! 30!–!87! ! 34!–!90! ! Tabagismo! ! ! ! ! Fumadores! 215! 49.9! 50! 9.7! ExZfumadores! 98! 22.7! 92! 17.9! Não!fumadores! 114! 26.5! 216! 42.0! Sem!informação! 4! 0.9! 156! 30.4! Tipo!Histológico! ! ! ! ! Epidermóide! 165! 38,3! ! ! Adenocarcinoma! 207! 48,0! ! ! Carcinoma!de!Grandes!Células!! 14! 3,2! ! ! Carcinoma!Indiferenciado! 40! 9,3! ! ! Outros! 5! 1,2! ! ! Estadio! ! ! ! ! I! 46! 10,7! ! ! II! 31! 7,2! ! ! III! 192! 44,5! ! ! IV! 162! 37,6! ! ! ! 4.1.1 Grupo!de!Casos!–!Doentes!com!Cancro!do!Pulmão!de!Não!Pequenas!Células! Foram!analisadas!amostras!de!431!indivíduos!com!diagnóstico!de!CPNPC!no!IPOZPorto,!com!uma! idade! média! de! 63,0±10,3! anos,! 78,4%! do! sexo! masculino! e! 72,6%! com! história! actual! ou! passada! de! tabagismo.! Além! disso,! os! doentes! foram! caracterizados! em! relação! a! vários! parâmetros! clínicoZpatológicos,! como! estadiamento! e! tipo! histológico,! conforme! descrito! na! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Resultados! 36! Outubro!de!2012! ! Tabela! 1,! salientandoZse! o! facto! da! maior! parte! dos! doentes! se! apresentar! com! doença! localmente!avançada!(estadio!III,!44,5%)!e!metastática!(estadio!IV,!37,6%).! 4.1.2 Grupo!Controlo! No!grupo!controlo,!foram!recrutados!514!indivíduos!sem!doença!oncológica!conhecida!e!que! correspondiam! a! dadores! de! sangue! do! IPOZPorto,! com! uma! idade! média! de! 56,3±8,4! anos,! 51,2%!do!sexo!masculino!e!27,6%!com!história!actual!ou!passada!de!tabagismo!(Tabela!1).! 4.2 Associação!do!Polimorfismo!CSF$1&R&A2033T&na!susceptibilidade!para! Cancro!do!Pulmão!de!Não!Pequenas!Células! A!distribuição!da!frequência!dos!genótipos!do!polimorfismo!CSF$1&R!A2033T!no!grupo!controlo!e! no!grupo!de!casos!com!CPNPC!encontraZse!descrita!na!Tabela!2.!A!distribuição!das!frequências! genotípicas!de!ambos!os!grupos!está!de!acordo!com!o!esperado!segundo!os!princípios!de!HardyZ Weinberg!(controlos!p=0,626,!casos!p=0,146).! No!grupo!controlo,!correspondente!a!450!indivíduos,!67,6%!apresentam!o!genótipo!AA,!28,4%! genótipo! AT! e! 4,0%! genótipo! TT.! Foram! também! verificadas! frequências! semelhantes! dos! genótipos!no!grupo!de!casos,!que!incluiu!398!doentes!com!CPNPC!(66,6%!genótipo!AA,!28,1%! genótipo! AT! e! 5,3%! genótipo! TT),! não! se! tendo! verificado! diferenças! estatisticamente! significativas!na!distribuição!dos!genótipo!entre!o!grupo!controlo!e!o!grupo!de!casos.! A!comparação!das!frequências!genotípicas!do!polimorfismo!CSF$1&R!A2033T!no!grupo!controlo!e! grupo!de!casos!segundo!um!Modelo!Recessivo,!considerando!os!indivíduos!portadores!do!alelo! A!(genótipos!AA!e!AT)!versus&indivíduos!não!portadores!do!alelo!A!(genótipo!TT),!encontraZse! descrita!na!Tabela!2.!Nesta!análise,!verificaZse!que!os!portadores!do!alelo!A!correspondem! a! 96%!dos!indivíduos!do!grupo!controlo!e!94,7%!dos!doentes!com!CPNPC,!não!se!tendo!verificado! associação!estatisticamente!significativa!entre!o!alelo!A!do!polimorfismo!CSF$1& R!A2033T!e!a! susceptibilidade!para!aparecimento!de!CPNPC!(OR=1,337;!IC95%=0,702Z2,547;!p=0,376).! ! Tabela! 2! –!Frequências!genotípicas!e!alélicas!do!polimorfismo!CSF$1&R!A2033T!no!grupo!controlo!e!no! grupo!de!casos!com!CPNPC!(OR!–!odds∶!IC95%Z!intervalo!de!confiança!a!95%,!p!–!valor!de!p!obtido! pelo!teste!χ2.! ! CSF$1&R!A2033T! OR! IC95%! p! ! n!(%)! ! Controlos! (n=450)! Casos! (n=398)! Genótipos! AA! 304!(67,6)! 265!(66,6)! ! ! 0,675! TT! 18!(4,0)! 21!(5,3)! ! ! ! AT! 128!(28,4)! 112!(28,1)! ! ! ! Modelo!Recessivo! Portador!A! 432!(96,0)! 377!(94,7)! 1,00! referência! __! TT! 18!(4,0)! 21!(5,3)! 1,337! 0,702Z2,547! 0,376! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Resultados! Outubro!de!2012! 37! ! Com!o!objectivo!de!avaliar!a!influência!deste!polimorfismo!nos!diferentes!tipos!histológicos,!foi! realizada! uma! análise! estratificada! por! tipo! histológico,! não! se! tendo! evidenciado! diferenças! estatisticamente! significativas! das! frequências! genotípicas! e! alélicas! nos! diferentes! tipos! histológicos!(Tabela!3).! ! Tabela!3!–!Distribuição!das!frequências!de!portadores!do!alelo!A!e!do!genótipo!TT!do!polimorfismo!CSF$1& R!A2033T! no! grupo! de! casos! com! CPNPC,! de! acordo! com! o! tipo! histológico! (OR! –! odds& ratio;! IC95%Z! intervalo!de!confiança!a!95%,!p!–!valor!de!p!obtido!pelo!teste!χ2).! ! CSF$1&R!A2033T! OR! IC95%! p! ! n!(%)! ! Portador!A! TT! Controlos!(n=450)! 432!(96,0)! 18!(4,0)! 1,00! referência! __! Epidermóides!(n=145)! 140!(96,6)! 5!(3,4)! 0,857! 0,313Z2,351! 0,764! Adenocarcinoma!(n=197)! 184!(93,4)! 13!(6,6)! 1,696! 0,814Z3,533! 0,154! Carcinoma!de!Grandes! Células!(n=7)! 7!(100,0)! 0!(0)! __! __! __! Carcinoma!Indiferenciado! (n=37! 35!(94,6)! 2!(5,4)! 1,371! 0,306Z6,152! 0,679! Outros!(n=2)! 2!(100,0)! 0!(0)! __! __! __! ! Para!avaliar!a!influência!do!polimorfismo!CSF$1&R!A2033T!no!risco!para!progressão!do!CPNPC,!foi! realizada! uma! análise! estatística! para! comparação! dos! estadios! de! doença! localizada! ou! localmente! avançada! (estadios! I,! II! e! III)! versus!doença! metastática! (estadio! IV),! o! que! se! encontra!descrito!na!Tabela!4.!Nesta!análise,!foram!incluídos!394!casos!com!CPNPC,!dos!quais! 241! apresentaram! um! estadio! I! a! III! (61,17%),! enquanto! que! 153! doentes! apresentaram! um! estadio!IV!com!metastização!à!distância!(38,83%).!VerificouZse!também!que!o!genótipo!TT!era! apresentado!por!3,3%!dos!doentes!com!estadios!de!doença!localizada!ou!localmente!avançada!e! por!7,8%!dos!casos!com!doença!metastática.!A!análise!dos!resultados!indica!que!indivíduos!com! genótipo! TT! apresentam! um! risco! acrescido,! de! cerca! de! 2.5! vezes,! para! apresentarem! metastização!à!distância!na!altura!do!diagnóstico,!comparativamente!a!doentes!com!genótipos! portadores!do!alelo!A!(OR!=!2,479,!IC95%!0,989Z6.212,!p=0,046).! ! Tabela!4!–!Distribuição!das!frequências!de!portadores!do!alelo!A!e!do!genótipo!TT!do!polimorfismo!CSF$1& R!A2033T!no!grupo!de!casos!com!CPNPC,!de!acordo!com!o!estadiamento!clínicoZpatológico!(OR!–!odds& ratio;!IC95%Z!intervalo!de!confiança!a!95%,!p!–!valor!de!p!obtido!pelo!teste!χ2).! ! CSF$1&R!A2033T! OR! IC95%! p! ! n!(%)! ! Portador!A! (n=374)! TT! (n=20)! Estadios!IZIII! (n=241)! 233!(96,7)! 8!(3,3)! 1,00! Referência! ! Estadio!IV! (n=153)! 141!(92,2)! 12!(7,8)! 2,479! 0,989Z6,212! 0,046! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Discussão! Outubro!de!2012! 45! ! Nos! últimos!anos,! temZse! assistido! a! muitos! avanços! científicos! ao! nível! da! oncologia! e! da! investigação!translacional,! que! têm!permitido! a!compreensão! dos! mecanismos! moleculares!e! celulares!responsáveis!pelo!aparecimento!e!evolução!natural!das!doenças,!assim!como!explicar! diferenças! em! termos! de! prognóstico! e! resposta! à! terapêutica.! O! cancro! esporádico! é! considerado! uma! doença! multifactorial,! que! tem! na! sua! génese! factores! genéticos! e/ou! ambientais!de!acordo!com!o!tipo!de!neoplasia.! A!carcinogénese!é!um!processo!complexo!e!gradual,!que!envolve!a!aquisição!de!várias!mutações! genéticas! e! alterações! epigenéticas,! o! que! provoca! alteração! das!funções! celulares,! como! a! proliferação,! diferenciação,! invasão! e! metastização.!A! inflamação! crónica! em! vários! órgãos! aumenta! o!risco!de!desenvolvimento! de!cancro,!estando! bem!estabelecida!a!relação! entre!a! inflamação!e!a!carcinogénese!pulmonar.!De!facto,!a!inflamação!crónica!das!vias!aéreas!associaZ se! a! alterações! nas! citocinas,! quimiocinas! e! factores! de! crescimento! sintetizados! pelos! macrófagos!alveolares,!linfócitos,!neutrófilos,!células!endoteliais!e!fibroblastos![106].!Também!já! se! encontra! bem! estabelecido! que! o!fumo! do! tabaco! é! um! potente! indutor! do! estado! inflamatório!das!vias!aéreas!e!constitui!a!principal!causa!de!cancro!do!pulmão![107].! Vários! estudos! têm! demonstrado! que! a! exposição! crónica! ao! fumo! de! tabaco! provoca! um! aumento! do! número! de! macrófagos! alveolares! nos! lavados! broncoZalveolares! de! fumadores,! mas!que!se!associa!a!uma!diminuição!significativa!da!sua!capacidade!fagocitária,!o!que!conduz!a! uma!diminuição!dos!mecanismos!de!defesa!a!nível!pulmonar![108].!Além!disso,!os!macrófagos! alveolares! sintetizam! muitos! mediadores! inflamatórios,! substâncias! oxidantes,! proteínas! e! proteinases!em!resposta!à!exposição!ao!fumo!de!tabaco,!mas!com!um!perfil!diferente!dos!não! fumadores,!o!que!indica!que!o!tabaco!altera!as!funções!imunes!destes!macrófagos![108].! Neste! contexto,! justificaZse! a! realização! de! estudos! que! pretendem! avaliar! o! papel! dos! macrófagos! na! carcinogénese!pulmonar! e! este! trabalho! de! investigação! focouZse! especificamente!no!factor!estimulante!de!colónias!de!macrófagos!(CSFZ1)!e!seu!receptor,!com!o! objectivo!de!aprofundar!os!mecanismos!moleculares!subjacentes!à!carcinogénese!de!modo!a! explicar! diferenças! em! termos! de! risco! para! desenvolvimento! do! cancro! do! pulmão,! nomeadamente!após!exposição!ao!tabaco,!e!resposta!à!terapêutica.! Os!principais!objectivos!deste!estudo!consistiram!na!análise!da!frequência!dos!polimorfismos! genéticos!CSF$1&R!A2033T!e!CSF$1&Z347C/T&em!doentes!com!CPNPC!e!em!indivíduos!sem!doença! oncológica!conhecida,!e!na!avaliação!da!existência!de!associação!entre!as!frequências!destes! polimorfismos!e!a!susceptibilidade!para!a!doença!e!resposta!farmacogenómica!à!quimioterapia,! de!acordo!com!as!características!clínicoZpatológicas.!Apesar!da!maior!parte!dos!casos!de!cancro! do!pulmão!se!associarem!ao!tabagismo,!vários!estudos!de!epidemiologia!molecular!sugerem!que! os!polimorfismos!genéticos!possam!actuar!como!modificadores!do!risco!ambiental!para!o!cancro! do!pulmão![109].! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Discussão! 46! Outubro!de!2012! ! 5.1 Associação!do!Polimorfismo!CSF$1&R&A2033T&na!susceptibilidade!para! Cancro!do!Pulmão!de!Não!Pequenas!Células! Skrzypski!et&al!verificou!que!elevados!níveis!de!expressão!de!CSFZ1!estavam!associados!a!menor! sobrevida! em! carcinoma! de! células! epidermóides! do! pulmão! (estadio! IZIIIA)! [102],! o! que! se! relaciona!com!o!facto! de!uma!maior!densidade!de!TAMs!conferir!pior!prognóstico!a!doentes! com!CPNPC,!existindo!um!mecanismo!de!sinalização!recíproca!entre!as!células!neoplásicas!do! pulmão! e! macrófagos! à! custa! de! CSFZ1! e! seu! receptor! [23].! Contudo,! ainda! não! se! encontra! totalmente! esclarecido! a! contribuição! dos! macrófagos! na! carcinogénese! pulmonar,! existindo! resultados! contraditórios! [95,! 96],! que! se! encontram! provavelmente! relacionados! com! a! localização! tecidular! dos! macrófagos! (ilhotas! tumorais! versus!estroma)! e! vias! de! ativação! predominantes![100,!101].! As!frequências!observadas!para!o!polimorfismo!CSF$1&R&A2033T!foram!de!67,6%,!28,4%!e!4,0%! para!os!genótipos!AA,!AT!e!TT,!respectivamente,!no!grupo!controlo!e!de!66,6%,!28,1%!e!5,3%!no! grupo! de! casos.! Em! relação! à! susceptibilidade! para! o! desenvolvimento! do! CPNPC,! não! se! verificou!nenhuma!associação!estatisticamente!significativa!entre!os!diferentes!portadores!do! alelo!A!versus!genótipo!TT!(OR=1,337;!IC95%=0,702Z2,547;!p=0,376).! Contudo,!nos!indivíduos!não!fumadores,!os!resultados!apresentados!sugerem!que!o!genótipo!TT! se! encontra! associado! a! maior! susceptibilidade! para! o! aparecimento! do! CPNCP! (OR=3,897,! IC95%=1,296Z11,720,! p=0,01),! evidenciando! um! efeito! oposto! no! grupo! dos! fumadores! e! exZ fumadores,!em!que!o!genótipo!TT!diminuiu!o!risco!para!o!desenvolvimento!do!cancro!do!pulmão! (OR=0,410,!IC95%!0,169Z0,990,!p=0,041).!No!grupo!dos!não!fumadores,!os!resultados!obtidos! poderão! ser! interpretados! como! o! efeito! do! polimorfismo! CSF$1& R& A2033T!no! recrutamento,! sobrevivência,! proliferação! ou! diferenciação! dos! macrófagos,! enquanto! que! o! seu!efeito! antagónico! nos! fumadores! e! exZfumadores,! sugere! uma! interação! deste! polimorfismo! com! o! tabaco.! De!facto,!além!do!efeito!carcinogénico!direto!do!tabaco,!estes!resultados!podem!sugerir!que!o! tabaco!pode!alterar!a!resposta!imunitária!individual!e!condicionar!assim!diferentes!riscos!para! cancro! do! pulmão.! O! tabaco! parece! alterar! a! via! de! ativação! dos! macrófagos,! embora! com! resultados! contraditórios:! Shaykhiev!et& al!associou! o! tabagismo! à! via! de! ativação! alternativa! (fenótipo!M2)![110],!enquanto!que!Hodge!et&al!verificou!um!predomínio!do!fenótipo!M1![111].! Como!a!via!alternativa!de!ativação!dos!macrófagos!se!associa!a!um!efeito!antiZtumoral,!o!efeito! do!tabaco!na!polarização!dos!macrófagos!poderá!condicionar!diferentes!susceptibilidades!para!o! aparecimento!do!cancro!do!pulmão!e!assim!se!poderá!interpretar!a!interação!do!polimorfismo! CSF$1&R&A2033T!com!o!tabagismo.!! Tal! como! se! tem! verificado! que! diferenças! de! polarização! dos! macrófagos! se! encontram! associados! a! um! maior! potencial! de! metastização,! neste! estudo! também! se! verificou! que! o! genótipo!TT,!além!de!alterar!o!risco!para!o!aparecimento!de!cancro!do!pulmão,!pode!constituir! um! factor! de! mau! prognóstico,! uma! vez! que! se! encontra! associado! a! um! maior! risco! de! metastização! (OR! de! 2,479,! IC95%! 0,989Z6.212,! p=0,046).! Contudo,! apesar! da! diferença! ser! estatisticamente! significativa,! a! inclusão! da! unidade! no! intervalo! de! confiança! implica! a! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Discussão! Outubro!de!2012! 47! ! confirmação! deste! resultado! e! a! utilização! de! uma! maior! amostra,! antes! de! assumir! esta! conclusão.! É!também!de!referir!que!o!significado!biológico!do!polimorfismo!CSF$1&R!A2033T!ainda!não!se! encontra! estabelecido! e,! apesar! de! polimorfismos! intrónicos! não! influenciarem! a! expressão! genética,!nem!a!função!da!proteína!codificada,!sabeZse!que!substituições!de!nucleótidos!nestas! regiões! pode! resultar! em! alterações! do! processamento! do! mRNA!e! seu! tempo! de! meiaZvida! [112].! O&splicing!alternativo! contribui! para! a! variabilidade! das! proteínas! sintetizadas!e! várias! doenças!têm!sido!associadas!com!variantes!genéticas!raras!que!afectam!os!padrões!de!splicing.! Apesar!de!ainda!não!estar!bem!esclarecido!a!contribuição!de!variações!naturais!da!sequência!do! DNA,! incluindo! SNPs,! nos! diferentes! padrões! de! splicing,! um! estudo! evidenciou! associações! entre!padrões!de!splicing!e!SNPs,!que!se!encontravam!desde!2!pb!até!1000!pb!do!início!do!exão! [113].! 5.2 Associação!do!Polimorfismo!CSF$1&@347C/T&na!susceptibilidade!para!Cancro! do!Pulmão!de!Não!Pequenas!Células! As!frequências!observadas!para!o!polimorfismo!CSF$1!Z347C/T!foram!de!42,1%,!45,5%!e!12,4%! para!os!genótipos!TT,!TC!e!CC,!respectivamente,!no!grupo!controlo!e!46,3%,!43,5%!e!10,2%!para! os!genótipos!TT,!TC!e!CC,!respectivamente,!no!grupo!de!casos!com!CPNPC.!Estas!frequências! estão!de!acordo!com!outros!estudos!em!populações!caucasianas!saudáveis![79,!82].!Não!foram! observadas! diferenças! estatisticamente! significativas! entre! o! grupo! de! casos! e! de! controlos,! tendo!em!conta!os!vários!genótipos!do!polimorfismo.! Também!não!se!verificou!nenhuma!associação!estatisticamente!significativa!entre!os!portadores! do! alelo! T! versus!homozigótico! CC! em! relação! à! susceptibilidade! para! o! desenvolvimento! do! CPNPC!(OR=1,247,!IC95%=0,822Z1,892,!p=0,298).! Contudo,!uma!vez!que!CSF$1!Z347C/T!corresponde!a!uma!polimorfismo!missense!no!exão!6,!seria! de! esperar! que! esta! substituição! de! aminoácidos! pudesse! contribuir! para! uma! alteração! da! estrutura! e! funções! deste! factor! de! crescimento.! Contudo,! sabeZse! que! este! polimorfismo! corresponde!a!uma!substituição!de!aminoácidos!no!C!terminal!da!proteína!precursora!de!CSFZ1!e! já!se!verificou!que!os!resíduos!do!N!terminal!são!suficientes!para!a!atividade!biológica!do!CSFZ1! humano!em!células!murinas!da!medula!óssea![81].! 5.3 Influência!dos!Polimorfismos!CSF$1&R&A2033T&e!CSF$1&@347C/T&na!resposta! farmacogenómica!de!doentes!com!Cancro!do!Pulmão!de!Não!Pequenas! Células! A!farmacogenómica!estuda!a!influência!da!variabilidade!genética!nos!efeitos!dos!fármacos!em! termos! de! eficácia! e! segurança,! permitindo! assim! a! individualização!dos! tratamentos!e! a! optimização! da! resposta! à! terapêutica! [73].! O! tratamento! do! CPNPC! localmente! avançado! e! metastático! baseiaZse! na! administração! de! quimioterapia! com! sais! de! platina!como! quimioterapia! de! primeira! linha,! existindo! vários! protocolos! estabelecidos! de! associação! de! cisplatina!ou!carboplatina!com!um!fármaco!de!segunda!geração![114,!115].! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Discussão! 48! Outubro!de!2012! ! Após! análise! estatística! dos! resultados! obtidos,! verificouZse! que! os! polimorfismos! CSF$1& R& A2033T! e! CSF$1! Z347C/T!não! alteravam! a! sobrevida! global! dos! doentes! submetidos! a! quimioterapia!de!primeira!linha.!Contudo,!quando!o!grupo!de!casos!foi!estratificado!de!acordo! com! o! tipo! histológico,! os! resultados! demonstraram! uma! associação! estatisticamente! significativa!entre!os!diferentes!genótipos!de!CSF$1!Z347C/T!(homozigótico!CC!versus!portador! de! alelo! T)! e! o! tempo! de! sobrevida! para! doentes! com! o! tipo! histológico! indiferenciado.! A! sobrevida!global!média!é!de!23,8!meses!(IC95%!14,2Z33,4!meses)!para!doentes!portadores!do! alelo!T!versus!9,3!meses!(IC95%!5,7Z12,9!meses)!para!doentes!com!genótipo!CC!(p=0,036),!o!que! se!traduz!num!aumento!da!sobrevida!global!média!em!cerca!de!14,5!meses!para!os!portadores! do!alelo!T.! Apesar!de!estar!bem!estabelecido!que!o!estroma!tumoral!regula!a!progressão!neoplásica,!o!seu! papel!na!resposta!à!terapêutica!ainda!não!se!encontra!bem!esclarecido.!Contudo,!um!estudo! com!modelos!animais!verificou!um!aumento!da!infiltração!de!macrófagos!em!tumores!mamários! após!quimioterapia!com!paclitaxel,!assim!como!um!aumento!dos!níveis!das!proteases!catepsinas.! Em!cultura,!verificouZse!que!estes!macrófagos!com!expressão!de!catepsinas!protegiam!as!células! tumorais!da!morte!celular!induzida!por!paclitaxel,!sendo!este!efeito!revertido!após!inibição!das! catepsinas.! Além! disso,! também! se! demonstrou! que! os! macrófagos! protegiam! as! células! tumorais!de!morte!celular!induzida!por!outros!citotóxicos,!como!o!etopósido!e!doxorrubicina,!o! que!já!não!se!verifica!para!a!gemcitabina!e!carboplatina![116].! Outro! estudo! também! verificou! que! a! quimioterapia! com! doxorrubicina! aumentava! os! níveis! tumorais!de!CCL2!e!CCL12,!que!são!ligandos!do!receptor!CCR2!expresso!nos!monócitos!e!que! participam!no!seu!recrutamento!para!os!locais!de!inflamação,!verificando!que!esta!infiltração! tumoral! por! células! mielomonocíticas! se! associava!a! pior! resposta! à! quimioterapia! com! doxorrubicina!ou!cisplatina![117].! Também!se!verificou!que! os!citotóxicos!induzem!as! células! epiteliais!mamárias!a!sintetizar!factores!de!recrutamento!de!monócitos/macrófagos,!incluindo! CSFZ1!e!ILZ34,!que!promovem!a!infiltração!de!macrófagos!dependente!de!CSFZ1!R.!Pelo!contrário,! o!bloqueio!do!recrutamento!de!macrófagos!com!antagonistas!de!CSFZ1!R!em!associação!com! paclitaxel!aumentava!a!sobrevida!de!ratos!portadores!de!tumores!mamários!através!da!redução! da!taxa!de!crescimento!do!tumor!primário!e!redução!da!metastização!pulmonar.! Estes! resultados! recentes! [116,! 117]! têm! assim! sugerido! que! as! células! imunes! do! microambiente!tumoral!podem!contribuir!para!a!resposta!à!quimioterapia,!verificandoZse!uma! pior!resposta!com!a!infiltração!por!macrófagos,!que!parece!ser!induzida!pelas!próprias!células! tumorais! e! assim! se! pode! justificar! que! os! polimorfismos! de! CSF$1!e! seu! receptor! possam! influenciar!a!sobrevida!global!dos!doentes!com!CPNPC!após!quimioterapia.! Além!da!influência!do!polimorfismo!CSF$1!Z347C/T!na!resposta!à!terapêutica!relacionada!com! células!do!estroma!tumoral,!estes!resultados!também!podem!sugerir!a!importância!do!próprio! sistema!imunitário!na!evolução!natural!do!CPNPC.!Como!já!referido,!o!sistema!imunitário!tanto! pode!participar!numa!resposta! antiZtumoral!através!da!imunovigilância,!como! numa! resposta! próZtumoral,!relacionada!com!a!imunosupressão!e!manipulação!do!sistema!imunitário!a!favor!do! crescimento!tumoral![3].!Deste!modo,!tem!sido!investigada!na!prática!clínica!a!importância!da! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Discussão! Outubro!de!2012! 49! ! imunoterapia! para! promover! uma! resposta! imunitária! antiZtumoral!mais! eficaz,! através! da! administração!de!anticorpos!ou!linfócitos!T!específicos!de!tumores!(imunoterapia!passiva)!ou! administração!de!vacinas!com!antigénios!tumorais!para!desencadear!uma!resposta!imunitária! (imunoterapia! activa)! [3].! Vários! fármacos! imunomoduladores! têm! também! demonstrado! utilidade!clínica!no!cancro!do!pulmão,!como!ipilimumab,!um!anticorpo!monoclonal!antiZCTLAZ4! com! consequente! activação! dos! línfócitos! T! específicos! de! tumores,! e! talactoferrina,! um! activador!das!células!dendríticas,!que!se!encontram!actualmente!em!Fase!III!dos!ensaios!clínicos! [118].! Existe!também!evidência!científica!que!a!magnitude!da!resposta!imunitária!contra!o!cancro!do! pulmão!se!correlaciona!com!o!prognóstico!e!evolução!da!doença,!em!que!análises!retrospectivas! das!amostra!histológicas!sugeriram!que!as!respostas!imunes!celulares!contra!as!células!tumorais! se! associa! a! melhor! prognóstico! [118].! Analisando! mais! especificamente! a! contribuição! dos! macrófagos! na! resposta! imunitária,! Kawai! et& al!não! verificou! nenhuma! correlação! entre! a! densidade!celular!de!macrófagos!(CD68+)!e!a!resposta!à!quimioterapia,!embora!tenha!verificado! que!as!ilhotas!tumorais!com!maior!densidade!de!TAMs!em!comparação!com!o!estroma!tinham! um!tempo!de!sobrevida!maior!(440!dias!versus!199!dias,!p<0,001),!o!que!salienta!a!importância! do!sistema!imunitária!no!prognóstico!do!cancro!do!pulmão,!independentemente!da!abordagem! terapêutica! [119].! Neste! contexto,! o! polimorfismo! CSF$1! Z347C/T!poderá! alterar! a! sobrevida! global,! não! através! da! modulação! da! resposta! à! terapêutica,! mas! sim! pela! modulação! da! resposta!imunitária!antiZtumoral.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 6. CONCLUSÃO!E!PERSPECTIVAS! FUTURAS! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Conclusão!e!Perspectivas!Futuras! Outubro!de!2012! 53! ! O! papel! do! estroma! tumoral! nas! diversas! etapas! da! carcinogénese!encontraZse! já! bem! estabelecido,!com!implicações!desde!a!promoção!tumoral!até!à!metastização,!estando!as!células! imunitárias!relacionadas!quer!com!o!controlo!do!crescimento!tumoral,!quer!com!a!promoção! tumoral.!Com!este!trabalho,!pretendeuZse!avaliar!mais!especificamente!um!factor!estimulante! da! proliferação! e! diferenciação! dos! macrófagos! (CSFZ1)! que! pode! contribuir! para! a! carcinogénese!pulmonar,!considerando!uma!perspectiva!de!como!a!variabilidade!genética!pode! contribuir!para!diferenças!na!susceptibilidade!ao!desenvolvimento!desta!neoplasia!e!resposta!à! terapêutica.! Os!polimorfismos!CSF$1&R!A2033T!e!CSF$1&Z347C/T!foram!já!identificados!como!factores!de!risco! para!algumas!doenças!do!sistema!imunitário,!como!Doença!de!Crohn!e!periodontite!agressiva,! não!tendo!sido!realizados!estudos!em!doenças!neoplásicas.!Este!trabalho!constitui!a!primeira! evidência! de! como! polimorfismos! genéticos! de! CSF$1!e! seu! receptor! influenciam! a! susceptibilidade! para! o! cancro! do! pulmão! e! sua! gravidade,! assim! como! a! resposta! à! quimioterapia!numa!perspectiva!de!farmacogenómica.!De!acordo!com!os!resultados!obtidos,!o! polimorfismo!CSF$1& R!A2033T!parece!influenciar!a!susceptibilidade!para!o! cancro!do!pulmão,! mas! apenas! nos! não! fumadores,! e! encontraZse! associado! a! maior! risco! de! progressão! para! doença!metastática.!Pelo!contrário,!o!polimorfismo!CSF$1&Z347C/T!parece!influenciar!apenas!a! resposta!à!terapêutica!e!consequente!sobrevida!global,!salientando!assim!o!papel!que!o!estroma! celular!pode!ter!também!na!resposta!à!quimioterapia.! Estudos!posteriores!passarão!pela!replicação!do!presente!estudo!numa!amostragem!maior!de! casos!e!controlos,!de!forma!a!confirmar!os!resultados!obtidos.!Para!uma!melhor!interpretação! destes!resultados,!seria!importante!esclarecer!as!consequências!funcionais!destes!polimorfismos! em!termos!de!expressão!genética,!proteína!sintetizada!e!sua!função.!Apesar!de!estudos!prévios! em! cancro! do! pulmão! terem! já! identificado! a! expressão! de! CSFZ1! como! factor! de! mau! prognóstico!e!se!tenha!associado!um!aumento!de!TAMs!a!uma!menor!sobrevida!global,!seria! interessante!a!realização!de!estudos!imunoZhistoquímicos!e!de!quantificação!de!mRNA!de!modo! a!determinar!o! nível!de! expressão!de! CSFZ1! e!a! caracterização!dos!macrófagos!nas! amostras! histológicas! dos! doentes! incluídos! neste! estudo,! estabelecendo! as! vias! de! polarização! preponderantes.!Adicionalmente,!poderá!ser!analisada!a!interacção!de!CSFZ1!e!seu!receptor!com! outras!moléculas!importantes!para!a!carcinogénese!e!com!outros!mediadores!inflamatórios.!A! continuação! deste! trabalho! passará! também! pela! realização! deste! estudo,! não! apenas! em! cancro!do!pulmão,!mas!também!em!outras!neoplasias!malignas,!nomeadamente!no!cancro!da! mama,!que!constitui!a!principal!área!de!investigação!sobre!o!papel!do!CSFZ1!e!seu!receptor.! O! melhor! conhecimento! da! interacção! das! moléculas! do! estroma! celular! e,! mais! especificamente,! do! sistema! imunitário,! com! as! células! neoplásicas! permitirá! uma! melhor! compreensão!do!comportamento!do!tumor,!podendo!contribuir!para!a!definição!de!grupos!de! indivíduos!com!maior!susceptibilidade!para!o!desenvolvimento!de!determinada!neoplasia,!com! o!objectivo!de!implementar!estratégias!de!prevenção!ou!de!diagnóstico!precoce.!Além!disso,! permitirá!a!estratificação!dos!doentes!de!acordo!com!novos!factores!de!prognóstico!moleculares,! o! que! se! traduzirá! na! seleção! da! abordagem! terapêutica,! considerando! não! apenas! as! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Referências!Bibliográficas! 60! Outubro!de!2012! ! 64.!Savarese,! D.M.,! et! al.,!Expression& and& function& of& colony$stimulating& factors&and& their& receptors&in&human&prostate&carcinoma&cell&lines.!Prostate,!1998.!34(2):!p.!80Z91.! 65.!Kirma,! N.,! et! al.,! Elevated& expression& of& the& oncogene& c$fms& and& its& ligand,& the& macrophage&colony$stimulating&factor$1,&in&cervical&cancer&and&the&role&of&transforming& growth&factor$beta1&in&inducing&c$fms&expression.!Cancer!Res,!2007.!67(5):!p.!1918Z26.! 66.!Kacinski,!B.M.,!CSF$1&and&its&receptor&in&breast&carcinomas&and&neoplasms&of&the&female& reproductive&tract.!Mol!Reprod!Dev,!1997.!46(1):!p.!71Z4.! 67.!Paietta,!E.,!et!al.,!Expression&of&the¯ophage&growth&factor,&CSF$1&and&its&receptor&c$ fms&by&a&Hodgkin's&disease$derived&cell&line&and&its&variants.!Cancer!Res,!1990.!50(7):!p.! 2049Z55.! 68.!Wu,!K.F.,!et!al.,!Enhancement&of&J6$1&human&leukemic&cell&proliferation&by&membrane$ bound& M$CSF& through& a& cell$cell& contact& mechanism& II.& Role& of& an& M$CSF& receptor$like& membrane&protein.!Leuk!Res,!1998.!22(1):!p.!55Z60.! 69.!Filderman,! A.E.,! et! al.,! Macrophage& colony$stimulating& factor& (CSF$1)& enhances& invasiveness&in&CSF$1&receptor$positive&carcinoma&cell&lines.!Cancer!Res,!1992.!52(13):!p.! 3661Z6.! 70.!Price,!F.V.,!et!al.,!Colony$stimulating& factor$1& in& primary& ascites& of& ovarian& cancer& is& a& significant&predictor&of&survival.!Am!J!Obstet!Gynecol,!1993.!168(2):!p.!520Z7.! 71.!Jadus,! M.R.,! et! al.,! Macrophages& kill& T9& glioma& tumor& cells& bearing& the& membrane& isoform& of& macrophage& colony& stimulating& factor& through& a& phagocytosis$dependent& pathway.!J!Immunol,!1998.!160(1):!p.!361Z8.! 72.!Graf,!M.R.,!et!al.,!Development&of&systemic&immunity&to&glioblastoma&multiforme&using& tumor& cells& genetically& engineered& to& express& the& membrane$associated& isoform& of& macrophage&colony$stimulating&factor.!J!Immunol,!1999.!163(10):!p.!5544Z51.! 73.!Evans,!W.E.! and!H.L.!McLeod,!Pharmacogenomics$$drug&disposition,& drug& targets,& and& side&effects.!N!Engl!J!Med,!2003.!348(6):!p.!538Z49.! 74.!Lander,!E.S.,!et!al.,!Initial&sequencing&and&analysis&of&the&human&genome.!Nature,!2001.! 409(6822):!p.!860Z921.! 75.!Brookes,!A.J.,!The&essence&of&SNPs.!Gene,!1999.!234(2):!p.!177Z86.! 76.!Erichsen,! H.C.! and! S.J.! Chanock,! SNPs& in& cancer& research& and& treatment.!Br! J! Cancer,! 2004.!90(4):!p.!747Z51.! 77.!Taylor,! J.G.,! et! al.,! Using& genetic& variation& to& study& human& disease.!Trends! Mol! Med,! 2001.!7(11):!p.!507Z12.! 78.!Morris,!S.W.,!et!al.,!Reassignment&of&the&human&CSF1&gene&to&chromosome&1p13$p21.! Blood,!1991.!78(8):!p.!2013Z20.! 79.!Wollmer,! M.A.,! et! al.,! Genetic& association& study& on& colony$stimulating& factor& 1& in& Alzheimer's&disease.!Neurodegener!Dis,!2006.!3(6):!p.!334Z7.! 80.!Gallicchio,!L.,!et!al.,!Single&nucleotide&polymorphisms&in&inflammation$related&genes&and& mortality&in&a&community$based&cohort&in&Washington&County,&Maryland.!Am!J!Epidemiol,! 2008.!167(7):!p.!807Z13.! 81.!Takahashi,!M.,!et!al.,!Amino$terminal®ion&of&human¯ophage&colony$stimulating& factor& (M$CSF)& is& sufficient& for& its& in& vitro& biological& activity:& molecular& cloning& and& expression&of&carboxyl$terminal&deletion&mutants&of&human&M$CSF.!Biochem!Biophys!Res! Commun,!1989.!161(2):!p.!892Z901.! 82.!Huang,!H.Y.,!et!al.,!Frequencies&of&single&nucleotide&polymorphisms&in&genes®ulating& inflammatory&responses&in&a&community$based&population.!BMC!Genet,!2007.!8:!p.!7.! 83.!ZapataZVelandia,! A.,! et! al.,! Association& of& the& T& allele& of& an& intronic& single& nucleotide& polymorphism&in&the&colony&stimulating&factor&1&receptor&with&Crohn's&disease:&a&case$ control&study.!J!Immune!Based!Ther!Vaccines,!2004.!2(1):!p.!6.! 84.!Fauci,! A.S.,! et! al.,! Harrison's& Principles& of& Internal& Medicine,! 2008,! McGrawZHill! Professional!Publishing:!New!York.! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Referências!Bibliográficas! Outubro!de!2012! 61! ! 85.!Ferlay,!J.,!et!al.,!Estimates&of&worldwide&burden&of&cancer&in&2008:&GLOBOCAN&2008.!Int!J! Cancer,!2010.!127(12):!p.!2893Z917.! 86.!Jemal,!A.,!et!al.,!Global&cancer&statistics.!CA!Cancer!J!Clin,!2011.!61(2):!p.!69Z90.! 87.!Doll,!R.,!Uncovering&the&effects&of&smoking:&historical&perspective.!Stat!Methods!Med!Res,! 1998.!7(2):!p.!87Z117.! 88.!Doll,! R.! and! R.! Peto,! Cigarette& smoking& and& bronchial& carcinoma:& dose& and& time& relationships&among®ular&smokers&and&lifelong&non$smokers.!J!Epidemiol!Community! Health,!1978.!32(4):!p.!303Z13.! 89.!Simonato,! L.,! et! al.,! Lung& cancer& and& cigarette& smoking& in& Europe:& an& update& of& risk& estimates&and&an&assessment&of&inter$country&heterogeneity.!Int!J!Cancer,!2001.!91(6):!p.! 876Z87.! 90.!Boffetta,!P.,!et!al.,!Multicenter&case$control&study&of&exposure&to&environmental&tobacco& smoke&and&lung&cancer&in&Europe.!J!Natl!Cancer!Inst,!1998.!90(19):!p.!1440Z50.! 91.!Alberg,! A.J.,! J.G.! Ford,! and! J.M.! Samet,! Epidemiology& of& lung& cancer:& ACCP& evidence$ based&clinical&practice&guidelines&(2nd&edition).!Chest,!2007.!132(3!Suppl):!p.!29SZ55S.! 92.!WasswaZKintu,!S.,!et!al.,!Relationship&between&reduced&forced&expiratory&volume&in&one& second&and&the&risk&of&lung&cancer:&a&systematic&review&and&meta$analysis.!Thorax,!2005.! 60(7):!p.!570Z5.! 93.!Hubbard,!R.,!et!al.,!Lung&cancer&and&cryptogenic&fibrosing&alveolitis.&A&population$based& cohort&study.!Am!J!Respir!Crit!Care!Med,!2000.!161(1):!p.!5Z8.! 94.!O'Callaghan,!D.S.,!et!al.,!The&role&of&inflammation&in&the&pathogenesis&of&non$small&cell& lung&cancer.!J!Thorac!Oncol,!2010.!5(12):!p.!2024Z36.! 95.!Welsh,! T.J.,! et! al.,! Macrophage& and& mast$cell& invasion& of& tumor& cell& islets& confers& a& marked&survival&advantage&in&non$small$cell&lung&cancer.!J!Clin!Oncol,!2005.!23(35):!p.! 8959Z67.! 96.!Kim,! D.W.,! et! al.,! High& tumour& islet& macrophage& infiltration& correlates& with& improved& patient&survival&but¬&with&EGFR&mutations,&gene©&number&or&protein&expression&in& resected&non$small&cell&lung&cancer.!Br!J!Cancer,!2008.!98(6):!p.!1118Z24.! 97.!Dai,!F.,!et!al.,!The&number&andµlocalization&of&tumor$associated&immune&cells&are& associated&with&patient's&survival&time&in&non$small&cell&lung&cancer.!BMC!Cancer,!2010.! 10:!p.!220.! 98.!Takanami,!I.,!K.!Takeuchi,!and!S.!Kodaira,!Tumor$associated¯ophage&infiltration&in& pulmonary& adenocarcinoma:& association& with& angiogenesis& and& poor& prognosis.! Oncology,!1999.!57(2):!p.!138Z42.! 99.!Zhang,! B.C.,! et! al.,! Tumor$associated& macrophages& infiltration& is& associated& with& peritumoral&lymphangiogenesis&and&poor&prognosis&in&lung&adenocarcinoma.!Med!Oncol,! 2011.!28(4):!p.!1447Z52.! 100.!Ohri,! C.M.,! et! al.,! Macrophages& within& NSCLC& tumour& islets& are& predominantly& of& a& cytotoxic&M1&phenotype&associated&with&extended&survival.!Eur!Respir!J,!2009.!33(1):!p.! 118Z26.! 101.!Ma,! J.,! et! al.,! The& M1& form& of& tumor$associated& macrophages& in& non$small& cell& lung& cancer&is&positively&associated&with&survival&time.!BMC!Cancer,!2010.!10:!p.!112.! 102.!Skrzypski,! M.,! et! al.,! Three$gene& expression& signature& predicts& survival& in& early$stage& squamous&cell&carcinoma&of&the&lung.!Clin!Cancer!Res,!2008.!14(15):!p.!4794Z9.! 103.!Wang,!R.,!et!al.,!Tumor$associated¯ophages&provide&a&suitableµenvironment&for& non$small&lung&cancer&invasion&and&progression.!Lung!Cancer,!2011.!74(2):!p.!188Z96.! 104.!Zeni,! E.,! et! al.,! Macrophage& expression& of& interleukin$10& is& a& prognostic& factor& in& nonsmall&cell&lung&cancer.!Eur!Respir!J,!2007.!30(4):!p.!627Z32.! 105.!Leung,!E.,!et!al.,!Colony$stimulating&factor$1&receptor&gene&polymorphisms&and&Crohn's& disease.!Int!J!Colorectal!Dis,!2007.!22(8):!p.!995Z6.! Polimorfismos!dos!genes!CSF$1!e!CSF$1&R&no!Cancro!do!Pulmão! Referências!Bibliográficas! 62! Outubro!de!2012! ! 106.!Gomperts,!B.N.,!et!al.,!Evolving&concepts&in&lung&carcinogenesis.!Semin!Respir!Crit!Care! Med,!2011.!32(1):!p.!32Z43.! 107.!Brody,! J.S.! and! A.! Spira,! State& of& the& art.& Chronic& obstructive& pulmonary& disease,& inflammation,&and&lung&cancer.!Proc!Am!Thorac!Soc,!2006.!3(6):!p.!535Z7.! 108.!Mehta,!H.,!K.!Nazzal,!and!R.T.!Sadikot,!Cigarette&smoking&and&innate&immunity.!Inflamm! Res,!2008.!57(11):!p.!497Z503.! 109.!Risch,!A.!and!C.!Plass,!Lung&cancer&epigenetics&and&genetics.!Int!J!Cancer,!2008.!123(1):!p.! 1Z7.! 110.!Shaykhiev,! R.,! et! al.,! Smoking$dependent& reprogramming& of& alveolar& macrophage& polarization:& implication& for& pathogenesis& of& chronic& obstructive& pulmonary& disease.!J! Immunol,!2009.!183(4):!p.!2867Z83.! 111.!Hodge,!S.,!et!al.,!Cigarette&smoke$induced&changes& to& alveolar¯ophage&phenotype& and& function& are& improved& by& treatment& with& procysteine.!Am! J! Respir! Cell! Mol! Biol,! 2011.!44(5):!p.!673Z81.! 112.!Balakrishnan,!V.S.,!M.!Rao,!and!B.L.!Jaber,!Genomic&medicine,&gene&polymorphisms,&and& human&biological&diversity.!Semin!Dial,!2005.!18(1):!p.!37Z40.! 113.!Hull,! J.,! et! al.,! Identification& of& common& genetic& variation& that& modulates& alternative& splicing.!PLoS!Genet,!2007.!3(6):!p.!e99.! 114.!Crino,! L.,! et! al.,! Early& stage& and& locally& advanced& (non$metastatic)& non$small$cell& lung& cancer:& ESMO& Clinical& Practice& Guidelines& for& diagnosis,& treatment& and& follow$up.!Ann! Oncol,!2010.!21!Suppl!5:!p.!v103Z15.! 115.!D'Addario,! G.,! et! al.,! Metastatic& non$small$cell& lung& cancer:& ESMO& Clinical& Practice& Guidelines&for&diagnosis,&treatment&and&follow$up.!Ann!Oncol,!2010.!21!Suppl!5:!p.!v116Z 9.! 116.!Shree,!T.,!et!al.,!Macrophages&and&cathepsin&proteases&blunt&chemotherapeutic&response& in&breast&cancer.!Genes!Dev,!2011.!25(23):!p.!2465Z79.! 117.!Nakasone,!E.S.,!et!al.,!Imaging&tumor$stroma&interactions&during&chemotherapy&reveals& contributions&of&theµenvironment&to&resistance.!Cancer!Cell,!2012.!21(4):!p.!488Z503.! 118.!Shepherd,!F.A.,!J.Y.!Douillard,!and!G.R.!Blumenschein,!Jr.,!Immunotherapy&for&non$small& cell&lung&cancer:&novel&approaches&to&improve&patient&outcome.!J!Thorac!Oncol,!2011.! 6(10):!p.!1763Z73.! 119.!Kawai,!O.,!et!al.,!Predominant&infiltration&of¯ophages&and&CD8(+)&T&Cells&in&cancer& nests&is&a&significant&predictor&of&survival&in&stage&IV&nonsmall&cell&lung&cancer.!Cancer,! 2008.!113(6):!p.!1387Z95.! ! ! !