Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida

Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida Ana Elisabete Martins Alves Mestrado em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia 2013 Orientador Vasco Martins de Almeida, Professor Auxiliar, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Relatório de estágio de candidatura ao grau de Mestre em Biologia Celular e Molecular submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto. O presente trabalho foi desenvolvido sob a orientação científica do Professor Vasco Martins de Almeida e foi realizado no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade. Por motivos de confidencialidade empresarial, este Relatório de Estágio não especifica todos os procedimentos descritos, nem os materiais utilizados nos mesmos. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 4 Agradecimentos O presente trabalho foi realizado no Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade (CEIE) e permitiu a aquisição de experiência tanto a nível profissional como pessoal, não sendo possível sem o apoio constante que me foi dado. Assim, gostaria de agradecer a todos aqueles que de alguma forma me apoiaram e contribuíram para este relatório: Em primeiro lugar, queria agradecer ao meu orientador, o Professor Vasco Martins de Almeida, pela excelente oportunidade, pelo voto de confiança, pela disponibilidade e pela partilha de conhecimento durante todo este ano letivo; Agradeço, também, ao Doutor Joaquim Gonçalves e ao Doutor Jorge Braga pela oportunidade e confiança para estagiar no CEIE; À Doutora Isabel Damião por todo o apoio, disponibilidade, simpatia e partilha de conhecimento durante todo o estágio; À Rita Vaz agradeço toda a ajuda que me deu logo no início do estágio; Não podia deixar de agradecer à Patrícia Santos pelo companheirismo, entreajuda e amizade e à Raquel Carneiro pela solidariedade e amizade; Aos meus amigos por terem sido incansáveis e me apoiarem constantemente; Agradeço à minha família que sempre me apoiou e sem a qual esta oportunidade não teria sido possível. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 5 Resumo A infertilidade é a incapacidade de conceção após 12 meses de relações sexuais frequentes e desprotegidas e afeta, atualmente, cerca de 70 milhões de casais, verificando-se um aumento gradual deste número com o tempo. Existem diversos fatores, tanto de origem feminina, como masculina, que podem afetar a capacidade de procriação de um casal, sendo os fatores masculinos (isolados ou em combinação com outros) responsáveis por cerca de 50% dos casos de infertilidade. No entanto, em 20% dos casos não se verifica uma causa aparente para a infertilidade, designando-se infertilidade idiopática. O investimento na área da medicina reprodutiva induziu o desenvolvimento de diversas técnicas de reprodução humana assistida, permitindo um melhor tratamento dos casais inférteis e, consequentemente, um aumento das taxas de sucesso. Dentro das técnicas de reprodução assistida encontram-se a estimulação ovárica para posterior punção folicular, a fertilização in vitro, a injeção intracitoplasmática de espermatozoides, a transferência embrionária, a doação de ovócitos e de embriões e, por último, a criopreservação de gâmetas ou de embriões, que permite, também, a preservação da fertilidade. Devido à simplicidade da análise da amostra seminal e à, relativamente, alta probabilidade do fator ser de origem masculina, o espermograma é o ponto de partida na procriação medicamente assistida. Dependendo do fator ou fatores de infertilidade presentes, é estudada a melhor opção de tratamento, sendo já possível a obtenção de gravidez com todos os fatores de infertilidade masculinos com recurso a ICSI e a biópsia testicular. As taxas de sucesso obtidas com as diversas técnicas de reprodução humana assistida têm aumentado ao longo do tempo, sendo, em 2008, a taxa de gestação obtida após fertilização in vitro convencional de 32,5% e após injeção intracitoplasmática de espermatozoides, de 31,9%. A taxa de nascimentos após inseminação intrauterina, com a amostra seminal do paciente é de 9,1% e com esperma de dador é de 13,7%. A vitrificação de ovócitos e de embriões (principalmente em fase de blastocisto) apresenta taxas de sobrevivência e de sucesso significativamente maiores, comparativamente com o método de congelação lenta. A medicina reprodutiva é, assim, uma área em expansão, com rápida evolução, dificultando o seu acompanhamento e as respetivas consequências para os casais e FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 6 na saúde da descendência. Por este motivo têm-se levantado algumas questões, tanto a nível ético como legal, sendo recomendado que o crescimento e desenvolvimento das crianças nascidas com recurso a TRA sejam devidamente acompanhados. i Palavras-chave: Infertilidade, técnicas de reprodução humana assistida, FIV, ICSI, IIU, criopreservação, gâmetas, embriões, taxa de sucesso. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 7 Abstract Infertility is defined as the incapacity to conceive after 12 months of frequent and unprotected intercourse. Currently, it affects 70 million couples worldwide, with a probable increase of this proportion in the future. Infertility can result from female, male or both factors combined, whereas, sometimes the cause cannot be explained. Unexplained infertility represents 20% of all cases and male factors (alone or in combination with other factors) account for 35-50% of all cases of infertility. Considering the impact of infertility in our society, many investments have been done in order to develop new assisted reproductive technologies to gametes and embryos manipulation, allowing better outcomes in the treatment of infertile couples. ART include ovarian stimulation, in vitro fertilization, intracytoplasmic sperm injection, embryo transfer, gamete and embryo cryopreservation and oocyte and embryo donation. Semen analysis is the first attempt to determine whether the cause of infertility is due to problems in spermatogenesis since it is simple and prompt and almost half of all infertility cases are owing to male factors. Beyond that, with ICSI and testicular biopsy it is possible to achieve pregnancy in the presence of all male infertility factors. The outcomes obtained by assisted reproductive technologies have been increasing, being the gestational rate of IVF and ICSI of 32.5% and 31.9%, respectively, at 2008. The delivery rate after IUI is 9.1%, using sperm from woman’s partner and 13.8%, using donor sperm. Gametes and embryos cryopreservation, mainly by vitrification, has allowed the increase of both survival and success rates after thawing, particularly for blastocysts and oocytes, due to the low outcome achieved with the slow freezing method for both. Human assisted reproduction is in continuous expansion with a rate that does not allow legal and ethical current supervision, raising concerns about the safety of the couples and also in the health and future development of the child born after ART. i i Key words: Infertility, assisted human reproduction, IVF, ICSI, IUI, cryopreservation, gametes, embryos, success rate. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 8 Índice Agradecimentos 4 Resumo 5 Abstract 7 Lista de Tabelas 10 Lista de Figuras 11 Lista de Abreviaturas 18 1. Introdução 21 1.1 Fisiologia do eixo Hipotálamo-Hipófise 24 1.2 Anatomia e fisiologia do aparelho reprodutor masculino 25 1.3 Anatomia e fisiologia do aparelho reprodutor feminino 32 1.4 Fertilização 38 1.5 Implantação 40 1.6 Causas de infertilidade 42 1.6.1 Fatores masculinos 42 1.6.2 Fatores femininos 44 2. Análise da amostra seminal 47 2.1 Colheita 47 2.2 Análise 48 2.2.1 Exame macroscópico 48 Liquefação 48 Viscosidade 49 Volume 50 pH 50 Cor e cheiro 51 2.2.2. Exame microscópico 52 Motilidade 52 Vitalidade 54 Concentração 55 Hiposmolaridade 59 Morfologia 61 3. Preparação da amostra seminal 68 4. Métodos de recolha de espermatozoides 70 5. Estimulação ovárica 72 6. Punção folicular 74 FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 15 Figura 27 – Sistema de micromanipulação. Em a) é possível observar o microscópio invertido num suporte anti-vibração, os dois micromanipuladores e microinjetores. As seringas não são, no entanto, nítidas. A micropipeta holding encontra-se do lado esquerdo e a micropipeta ICSI do lado direito. 1h – micropipeta holding; 1I – micropipeta ICSI; 2h – Microinjetor da micropipeta holding; 2I – Microinjetor da micropipeta ICSI; 3h – Micromanipulador da micropipeta holding; 3I – Micromanipulador da micropipeta ICSI; 4 – placa de aquecimento. b) Ampliação das duas micropipetas. http://rmaess.tripod.com/IMAGENS.htm Figura 28 – Representação esquemática da placa de microinjeção preparada rotineiramente (a) e quando não se encontram espermatozoides móveis (b). A azul encontram-se as gotas com PVP, a rosa as microgotas com meio tamponado, a laranja a gota com os espermatozoides imóveis ou com a polpa testicular após TESE e a cinzento, o meio hipotónico. Figura 29 – Imobilização do espermatozoide. http://biogenecs.com.br/infert_icsi.htm Figura 30 – Principais passos da injeção intracitoplasmática de espermatozoides. a) Posicionamento do espermatozoide na ponta da micropipeta ICSI e penetração da zona pelúcida às 3 h. b) Injeção do espermatozoide. A invaginação demonstra a resistência oferecida pelo oolema ao avanço da micropipeta. c) Deposição do espermatozoide no ooplasma. O espermatozoide encontra-se assinalado pela seta. Figura 31 – Representação esquemática do Zygote scoring (Z-scoring), no qual o número, tamanho e alinhamento dos CPN são considerados. Adaptado de Scott, 2003. Figura 32 – Pré-zigotos observados 17 ± 1 h após a inseminação. a) Pré-zigoto observado 18 h após ICSI, a uma ampliação de 400×. Os 2 PN estão centrados e justapostos no citoplasma e apresentam, aproximadamente, o mesmo tamanho. Existe discrepância no número e no tamanho dos CPN entre os dois pronúcleos, o PN à direita demonstra menos CPN e maiores que o da esquerda. Verificam-se alguns detritos no EPV, que é ligeiramente aumentado. b) Pré-zigoto observado 16 h após FIV, a uma ampliação de 400×. Os PN são mais pequenos que o normal e não se encontram exatamente no centro do citoplasma. Os CPN são, também, pequenos e encontram-se alinhados na região de justaposição dos pronúcleos. Este zigoto foi transferido e implantou-se com sucesso. c) Pré-zigoto com os dois glóbulos polares e FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 16 os dois pronúcleos justapostos, no entanto de tamanhos diferentes. Estes apresentam CPN pequenos, que diferem tanto em número como no alinhamento entre os dois PN. Ampliação de 200×. Adaptado de Papale et al., 2012. Figura 33 – Pré-zigoto com alterações na distribuição dos PN pelo citoplasma e dos CPN, com o tempo, nomeadamente, 11,7 h (a), 15,4 h (b), 18,3 h (c) e 28,3 h (d) após ICSI. Ampliação de 400×. Adaptado de Papale et al., 2012. Figura 34 – Diagrama de um pré-zigoto, à esquerda, a evidenciar o eixo definido pelos pronúcleos paralelo ao eixo definido pelos glóbulos polares e à direita, um prézigoto com os PN justapostos e centrados. O eixo definido pelos pronúcleos é paralelo ao eixo definido pelos glóbulos polares. Cada PN tem um número diferente de CPN, que diferem, também, no alinhamento entre eles. Num dos PN, estão alinhados na região de justaposição e no outro encontram-se dispersos. É visível um halo com algumas inclusões. Adaptado de Papale et al., 2012. Figura 35 – Diagrama de um pré-zigoto a evidenciar um eixo definido pelos pronúcleos perpendicular ao eixo definido pelos glóbulos polares, à esquerda. À direita, encontra-se um pré-zigoto com os PN justapostos e centrados a definirem um eixo perpendicular ao definido pelos glóbulos polares. Os CPN apresentam tamanho aumentado e encontram-se alinhados na junção entre os PN. Ampliação de 200×. Adaptado de Papale et al., 2012. Figura 36 – Ilustração dos padrões de clivagem específicos e não específicos. O verde-escuro indica os padrões de clivagem específicos da fase de desenvolvimento do embrião e o verde-claro indica os padrões não específicos dos embriões em fase de clivagem. Adaptado de Hardarson et al., 2012. Figura 37 – Embriões com diferentes níveis de fragmentação. a) Embrião com dois dias, constituído por 4 blastómeros de tamanho semelhante, com menos de 10% de fragmentação. b) Embrião com 4 blastómeros de tamanho diferente e com 15-20% de fragmentação. c) Embrião com 4 blastómeros de tamanho diferente, com cerca de 40% de fragmentação. Adaptado de Prados et al., 2012. Figura 38 – Embrião com 2 blastómeros assimétricos, em que o maior apresenta 4 núcleos e o menor 2. Adaptado de Hardarson et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 17 Figura 39 – Blastocistos em diferentes fases de expansão. a) Blastocisto precoce, com um cavidade ainda muito pequena a formar-se no centro. b) Blastocisto inicial, com uma cavidade que ocupa mais de metade do volume do embrião. O volume total do embrião não se alterou, não sendo visível nenhuma alteração na zona pelúcida. No lado esquerdo do blastocisto, encontra-se uma MCI inicial. c) Blastocisto em expansão, apresentando um volume maior e uma ZP mais fina. d) Blastocisto expandido, com a zona pelúcida muito fina e a iniciar o processo de eclosão. Adaptado de Elder e Dale, 2011. e) Blastocisto em eclosão, com uma MCI grande e compacta às 8 horas. f) Blastocisto eclodido com a zona pelúcida vazia, sendo possível comparar o diâmetro do blastocisto, com o do embrião nas fases iniciais de desenvolvimento, quando se encontrava ainda dentro da ZP. Adaptado de Hardarson et al., 2012. Figura 40 – Blastocisto colapsado, que não permite uma classificação precisa da MCI e da TF. Adaptado de Hardarson et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 18 Lista de abreviaturas °C – Grau Celsius A0 – Espermatogónias do tipo A ABP – Proteína de ligação a androgénios ADN – Ácido desoxirribonucleico ARN – Ácido ribonucleico ART – Tecnologias de Reprodução Assistida ASRM – American Society of Reproductive Medicine ATP – Adenosina trifosfato Ca2+ - Iões de cálcio CASA – Computer-Aided Sperm Analysis CBAVD – Ausência bilateral congénita dos vasos deferentes CC – Citrato de clomifeno CGH – Comparative Genomic Hybridization cm – Centímetro COC – Complexo cumulus-ovócito CPA – Agentes crioprotetores CPMA – Centro de Procriação Medicamente Assistida CPN – Corpos Precursores do Nucléolo CR – Corpos refrateis D – Dia do desenvolvimento embrionário DGPI – Diagnóstico Genético Pré-Implantação DHT – Dihidrotestosterona DMSO – Dimetilsulfóxido ESHRE – European Society of Human Reproduction and Embryology ET – Transferência de Embriões FISH – Fluorescence In Situ Hybridization FIV – Fertilização In Vitro FSH – Hormona foliculoestimulante GC – Grânulos corticais GnRH – Hormona Libertadora de Gonadotrofinas GP – Glóbulo polar FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 19 h – Hora hCG – Gonadotrofina coriónica humana HIV – Vírus da imunodeficiência humana HOS – Teste de Hiposmolaridade HTF – Fluido tubar humano IA – Inseminação artificial ICSH – Hormona estimuladora das células intersticiais ICSI – Microinjecção intracitoplasmática de espermatozoides IIU – Inseminação intrauterina IM – Imobilidade IMC – Índice de Massa Corporal IMSI – Injeção intracitoplasmática de espermatozoides de elevada ampliação IU – Unidade internacional LH – Hormona Luteínizante LN2 – Azoto líquido M – Mol/L MI – Ovócito em metafase I MII – Ovócito em metafase II MCI – Massa celular interna MESA – Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration mL – Mililitro mm – Milímetro MSOME – Morfologia dos organelos de espermatozoides móveis NOA – Azoospermia não obstrutiva NP – Motilidade não progressiva (in situ) OMS – Organização Mundial de Saúde PCOS – Síndrome do Ovário Poliquístico PCR – Polymerase Chain Reaction PESA – Percutaneous Epididimal Sperm Aspiration PGC – Células germinativas primordiais PMA – Procriação Medicamente Assistida PN – Pronúcleo PR – Motilidade progressiva PROH – 1,2-propanediol PVP – Polivinilpirrolidona FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 20 PZD – Disseção parcial da zona pelúcida RHA – Reprodução Humana Assistida ROS – Espécies reativas de oxigénio rpm – Rotações por minuto sER – Agregados de retículo endoplasmático liso tubular SHO – Síndrome de hiperestimulação ovárica SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida SNP – Single Nucleotide Polymorphism SPZ – Espermatozoide SRY – Sex-determining region Y SUZI – Injeção subzonal de espermatozoides TE – Transferência de embriões a fresco TEC – Transferência de embriões criopreservados TESA – Testicular Sperm Aspiration TESE – Testicular Sperm Extraction TF – Trofoectoderme TRA – Tecnologias de Reprodução Assistida VG – Vesícula Germinal WHO – World Health Organization Xp – Braço curto do cromossoma X Xq – Braço longo do cromossoma X ZD – Drilling da zona pelúcida µL – Microlitro µm – Micrómetro FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 21 1. Introdução A Organização Mundial de Saúde (OMS) definiu saúde não como apenas a ausência de doença, mas um completo bem-estar físico, mental e social. A saúde reprodutiva está relacionada com o sistema reprodutor e todos os processos e funções que lhe estão associados, em qualquer fase da vida. Implica, deste modo, responsabilidade, satisfação e uma vida sexual segura, assim como, a capacidade de reprodução e a liberdade de decisão do melhor momento para a mesma. A fertilidade e a reprodução são cruciais para a sobrevivência das espécies (Bhasin, 2004), sendo a última uma das principais necessidades básicas dos humanos (Sharon, 2009). A definição de infertilidade segundo a OMS é a falha de conceção após doze meses de relações sexuais frequentes e desprotegidas. É importante não confundir infertilidade com esterilidade, que se refere a uma incapacidade de reprodução irreversível (Mosby's Medical Dictionary, 2009). A infertilidade cria um grande impacto tanto a nível social como psicológico tendo sido, por isso, reconhecida como doença, a nível mundial, pela OMS (Boivin et al., 2007). Quando a capacidade de procriar é ameaçada, todos os aspetos da vida do casal ou individual são afetados (Sharon, 2009). Tal como as mulheres, também os homens vivenciam sentimentos de baixa autoestima, isolamento, perda de controlo, falta de apetite sexual e depressão. Quando o tratamento não tem sucesso, sentimentos como rancor e culpa começam a surgir, aumentando à medida que novos tratamentos são iniciados (Sharon, 2009). As consequências sociais e psicológicas podem variar de acordo com o estado de desenvolvimento do país. Assim, enquanto nos países desenvolvidos, receio, culpa, autocensura, stress no casamento, depressão e desamparo são as consequências mais comuns, nos países em desenvolvimento estas consequências podem alcançar um nível mais alarmante, em que a violência doméstica e a completa perda de estatuto social se tornam realidade (Ombelet et al., 2008). Como a infertilidade é uma experiência exigente a nível psicológico para os casais, é necessário o suporte dos pacientes por parte de todos os profissionais que lidam com os tratamentos de reprodução humana assistida (RHA). Estes devem, portanto, compreender as necessidades emocionais dos casais e demonstrar sensibilidade perante as mesmas (Sharon, 2009). Segundo a OMS, a infertilidade pode ser classificada como primária, quando um casal nunca teve um filho, ou secundária, se pelo menos um dos elementos do casal já FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 22 conseguiu uma gravidez (mesmo em caso de gravidez ectópica ou aborto) (Mascarenhas et al., 2012). Apesar da frequente associação entre infertilidade e um fator feminino, problemas na função ou produção espermática, isolados ou em combinação com outros fatores são responsáveis por 35-50% de todos os casos de infertilidade (Silverberg e Turner, 2009). 20% dos casos são de origem desconhecida e, por isso, não podem ser atribuídos a nenhum dos sexos (Shah et al., 2003). Na ausência de uma causa aparente, a infertilidade é designada idiopática e revela-se um dos maiores desafios na área da medicina reprodutiva (Gianaroli et al., 2012). Embora boa informação seja escassa, pensa-se que a nível global mais de 70 milhões de casais sofram de infertilidade (Ombelet et al., 2008; Zhao et al., 2011), ou seja, um em cada sete casais é afetado por este problema (Kashir et al., 2012). A fecundabilidade, ou seja, a probabilidade de conceção por ciclo, do ser humano é bastante reduzida. Um casal jovem saudável, no pico da idade fértil (25 anos) apresenta uma fecundabilidade de apenas 20-25% (Shah et al., 2003). São necessários três meses para que 57% dos casais conceba e um ano para que esta percentagem aumente para 81% (Hassan e Killick, 2004). Considerando a reduzida fecundabilidade no pico da idade fértil, em conjunto com todos os problemas fisiológicos e psicológicos associados à infertilidade (Kashir et al., 2010) e com a percentagem gradual de pacientes que são afetados por esta doença (Ferraretti et al., 2012; Lee et al., 2012), é importante o investimento em técnicas de reprodução assistida (TRA). Este investimento por parte das instituições governamentais a nível mundial permite um progresso significativo na compreensão dos sistemas reprodutores masculino e feminino e das técnicas de criopreservação e manipulação de gâmetas (Cohen et al., 2005; Kashir et al., 2010). Contudo, espera-se que esta exigência crescente por tratamentos de infertilidade continue devido à necessidade não atendida na maioria dos países europeus (Dancet et al., 2012; Olsen et al., 1996). As técnicas de reprodução assistida consistem em qualquer tratamento ou procedimento que inclua a manipulação in vitro tanto de ovócitos como de espermatozoides ou embriões com o objetivo de conseguir uma gravidez. As TRA incluem, mas não se limitam a, fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões a fresco (TE) ou criopreservados (TEC), microinjeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), estimulação ovárica com gonadotrofinas exógenas e doação de gâmetas (ICMART e WHO, 2009). As TRA tornaram-se bastante comuns desde o nascimento de Louise Brown, primeira FIV bem-sucedida, em 1978 (McCulloh, 2012). Na última década, o recurso a técnicas FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 23 de reprodução assistida tem sofrido um aumento de 5-10% por ano (Zhao et al., 2011) e o seu sucesso (número de nados-vivos por ciclo iniciado) tem melhorado de uma forma gradual e impressionante, encontrando-se por volta dos 41% (McCulloh, 2012). Globalmente, cerca de 1 milhão de TRA são efetuadas por ano (ICMART, 2009; Kashir et al., 2010), com mais de meio milhão de ciclos citados apenas na Europa (Ferraretti et al., 2012). A nível mundial já nasceram mais de 8 milhões de bebés com recurso a TRA (Kashir et al., 2010). A percentagem de nascimentos concebidos por técnicas de reprodução assistida na Europa encontra-se entre os 0,5 e 4,6% (Ferraretti et al., 2012). As técnicas de reprodução assistida na Europa têm exibido uma contínua expansão tanto a nível do número de clínicas, como de países e de ciclos de tratamento (Cohen et al., 2009). Um historial minucioso do casal infértil na primeira consulta é de extrema importância e permite determinar se qualquer um dos membros do casal apresenta, ou apresentou no passado, um problema clínico que possa afetar a conceção. Os pontos a considerar incluem a saúde em termos gerais, a história reprodutiva (maternidade/paternidade anteriores, infertilidade prévia e tratamentos utilizados e duração da infertilidade atual), a sexualidade (frequência das relações sexuais, se estas ocorrem no período fértil e métodos contracetivos utilizados), história cirúrgica e/ou exposição a medicação, drogas e toxinas e, por fim, atividades profissionais e de lazer, tanto no presente como no passado (Silverberg e Turner, 2009; Hurd, 2010). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 24 1.1. Fisiologia do eixo Hipotálamo-Hipófise A glândula pituitária ou hipófise é uma pequena glândula cujas secreções são controladas por sinais hormonais e nervosos provenientes do hipotálamo. A hipófise encontra-se dividida na hipófise anterior e na hipófise posterior (Guyton e Hall, 2006). O hipotálamo sintetiza e segrega hormonas, incitadoras ou inibidoras, que são conduzidas até à glândula pituitária anterior por vasos sanguíneos do sistema porta hipotálamo-hipófise. Na hipófise anterior, estas hormonas estimulam ou inibem, respetivamente, a secreção e/ou síntese de hormonas hipofisárias (Guyton e Hall, 2006). Nos sistemas reprodutores, tanto feminino como masculino, existem três hierarquias de hormonas (Figura 1). A hormona libertadora de gonadotrofinas (GnRH), produzida pelo hipotálamo, estimula a hipófise anterior a produzir duas hormonas gonadotróficas, a hormona foliculoestimulante (FSH) e a hormona luteínizante (LH) (Guyton e Hall, 2006). A LH nos homens tem, também, a designação de hormona estimuladora das células intersticiais (ICSH) (Fox, 2011). Em resposta a estas duas gonadotrofinas, os ovários segregam estrogénios e progesterona e os testículos, por estímulo da LH, segregam testosterona. A FSH estimula, principalmente, a espermatogénese por parte das gónadas masculinas (Guyton e Hall, 2006). Estas hormonas esteroides (progesterona, estrogénio e testosterona) apresentam um papel fundamental no equilíbrio do eixo hipotálamo-hipófise por mecanismos de feedback positivo e negativo (Fox, 2011). A principal diferença entre este mecanismo nos homens e nas mulheres encontra-se na produção de gâmetas e de hormonas esteroides. Nos homens, esta produção trata-se de um processo contínuo após a puberdade e não cíclico como nas mulheres (Elder e Dale, 2011). Gónadas Hipotálamo Hipófise anterior GnRH FSH LH Gâmetas Figura 1 - Interações entre o hipotálamo, a hipófise anterior e as gónadas. Os esteroides produzidos pelas gónadas desempenham um feedback negativo na secreção de GnRH e na secreção de gonadotrofinas, indicado pelo sinal negativo (-). Adaptado de Fox, 2011. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 31 produzir testosterona, que se vai combinar com as ABP nos túbulos seminíferos (Elder e Dale, 2011). As células de Sertoli produzem também inibina, que desempenha um papel importante no equilíbrio do eixo hipotálamo-hipófise, por inibição da secreção de FSH pela hipófise anterior (Seeley et al., 2004a). A testosterona é essencial para o desenvolvimento masculino, estimulando o desenvolvimento da genitália masculina interna, mais especificamente, dos canais deferentes, dos epidídimos e das vesículas seminais. No entanto, para o desenvolvimento da genitália externa e da próstata é necessária a conversão deste esteroide, pela enzima 5-α-redutase, na hormona dihidrotestosterona (DHT), que é mais eficiente. Alterações ou deficiências na DHT levam a um desenvolvimento da genitália externa anormal mesmo que a genitália interna se tenha desenvolvido corretamente (Giwercman e Nordenskjöld, 2006). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 32 1.3. Anatomia e fisiologia do aparelho reprodutor feminino O aparelho reprodutor feminino é constituído pelas gónadas femininas, ou ovários, pelas trompas de Falópio, pelo útero, pela vagina e pela genitália externa ou vulva, que compreende os lábios (menores e maiores) e o clitóris (Junqueira e Carneiro, 2004b). Os ovários são dois órgãos pequenos, com, aproximadamente, 3 cm de comprimento e 1,5 cm de largura, cada (Junqueira e Carneiro, 2004b; Seeley et al., 2004a), que se encontram suspensos na cavidade pélvica por dois filamentos de tecido conjuntivo que os ligam ao útero (Fox, 2011). As trompas de Falópio são tubos musculares com, aproximadamente, 12 cm de comprimento, que apresentam uma grande mobilidade. São constituídas pela porção intramural, que tem ligação para o útero, pelo istmo, pela ampola, pelo infundíbulo e pelas fímbrias, que cobrem uma parte dos ovários para conseguir capturar o ovócito após a ovulação (Junqueira e Carneiro, 2004b). O útero é um órgão com bastante tecido muscular que apresenta a forma de uma pera. A parte superior, e mais dilatada, corresponde ao fundo e a mais estreita, que se abre para a vagina é o cérvix ou colo uterino (Seeley et al., 2004a). O útero contém três camadas. A camada mais externa, ou perimétrio, é constituída por tecido conjuntivo, a camada central, e a mais espessa, constituída por músculo liso é o miométrio e, por último, a camada mais interna é o endométrio. Esta camada é estratificada, sendo constituída por um estrato basal (ao lado do miométrio) e um estrato funcional. Este último cresce ciclicamente e sofre descamação, levando à menstruação, em resposta ao estrogénio e à progesterona (Fox, 2011). A única barreira física entre a vagina e o útero é o muco cervical, que impede a passagem de substâncias e células da vagina para o útero (Seeley et al., 2004a). A abertura da vagina para o exterior está imediatamente abaixo da abertura da uretra e encontram-se ambas cobertas pelos lábios (o menor é o interno e o maior, o externo). O clitóris é uma pequena estrutura composta, maioritariamente, por tecido eréctil e localiza-se na periferia anterior do lábio menor (Fox, 2011). As gónadas femininas, tal como as masculinas, apresentam duas funções, a produção dos gâmetas e das hormonas esteroides, estrogénio e progesterona (Elder e Dale, 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 33 Durante o desenvolvimento embrionário, a superfície do ovário encontra-se revestida pelo epitélio germinativo. À medida que o feto feminino se desenvolve, as oogónias diferenciam-se deste epitélio e migram para o córtex do ovário (Elder e Dale, 2011). Estas células germinativas começam a dividir-se, por um período limitado de tempo, aumentando o seu número de 600 mil para 6-8 milhões, após 20 semanas de gestação. No entanto, na 12ª semana, ou fim do 1º trimestre, as oogónias iniciam a primeira divisão meiótica, parando em profase I, na fase diplóteno, e passam, então, a designar-se ovócitos primários (Elder e Dale, 2011). O núcleo dos ovócitos nesta fase é grande e pálido, designando-se vesícula germinal (VG) (Elder e Dale, 2011). Cada ovócito primário é revestido por uma única camada de células da granulosa que se encontram ligadas ao ovócito por junções. Ao ovócito em profase I e à camada envolvente de células da granulosa dá-se o nome de folículo primordial. Este folículo permanece na periferia do córtex do ovário num estado de quiescência (Elder e Dale, 2011). Os ovócitos que não se encontram dentro de folículos degeneram, levando a uma redução do seu número para, aproximadamente, 2 milhões na altura do nascimento (Elder e Dale, 2011; Seeley et al., 2004a). Desde o nascimento até à puberdade, só existem ovócitos em profase I nos ovários (Elder e Dale, 2011). No entanto, a maioria destes ovócitos vai degenerar por um processo denominado atresia, restando apenas 300 mil ovócitos na altura da puberdade (Junqueira e Carneiro, 2004b). As células da granulosa encontram-se num estado de quiescência e a divisão nuclear só continua após a puberdade. Contudo, o folículo continua o seu crescimento morfológico (Elder e Dale, 2011). O desenvolvimento folicular, estimulado pela FSH, engloba mais três estádios de desenvolvimento, o de folículo primário, o de folículo secundário ou pré-antral e o de folículo maduro ou de Graaf (Seeley et al., 2004a). O folículo primordial passa a primário quando o ovócito aumenta o seu tamanho assim como as células da granulosa, que adquirem, posteriormente, uma forma cuboide. Seguidamente são formadas várias camadas destas células e um invólucro de glicoproteínas que envolve o ovócito, designado zona pelúcida, que o irá proteger durante o transporte e a fertilização (Seeley et al., 2004a). No folículo secundário, as células da granulosa multiplicam-se, aumentando ainda mais o número de camadas a rodear o ovócito, e formam-se várias vesículas de fluido entre elas (Seeley et al., 2004a). Este fluido assemelha-se ao plasma sanguíneo e contém glicoproteínas produzidas pelas células da granulosa. Nesta fase, o folículo secundário passa a estar associado a pequenos vasos sanguíneos, que permitem que o seu desenvolvimento continue por ação de hormonas e de fatores de crescimento FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 34 que circulam na corrente sanguínea. Estes induzem a formação da teca, a proliferação das células da granulosa e a expansão do ovócito (Elder e Dale, 2011). A teca é composta por duas camadas, a interna e a externa, que estão envolvidas na produção de androgénios, que irão ser, posteriormente, convertidos em estrogénios (Junqueira e Carneiro, 2004b). O folículo secundário continua o seu desenvolvimento e passa a folículo de Graaf quando, em resposta à FSH libertada pela hipófise anterior, as células da granulosa se diferenciam em duas populações distintas: as que rodeiam o ovócito e formam uma massa de células denominada cumulus, mitoticamente inativa, e as que rodeiam o folículo e formam uma camada mural que expressa recetores para a hormona luteínizante (Elder e Dale, 2011). As células mais internas do cumulus expandem e apresentam um padrão radiante, tendo, por isso, a designação de corona radiata (Veeck, 1999). Estas células comunicam com o ovócito por junções que as ligam ao oolema (Elder e Dale, 2011). As vesículas de fluido entre as células da granulosa fundem-se e formam a cavidade antral. Esta cavidade expande com o aumento de fluido no seu interior e o ovócito deixa de estar no centro do folículo e toma uma posição mais periférica (Elder e Dale, 2011). O ovócito humano na fase de folículo de Graaf tem 120 μm de diâmetro e encontra-se preparado para continuar a meiose (Elder e Dale, 2011). Por mês, são recrutados 20 folículos secundários, mas, normalmente, apenas um folículo de Graaf é ovulado. Os outros degeneram por atresia (Elder e Dale, 2011). No folículo maduro, mesmo antes da ovulação, o ovócito primário completa a primeira divisão meiótica com a extrusão do primeiro glóbulo polar (1º GP), passando a designar-se ovócito secundário (Seeley et al., 2004a). A divisão do citoplasma nesta primeira divisão meiótica é desequilibrada. O ovócito secundário fica com praticamente todo o citoplasma, para assegurar o seu posterior desenvolvimento, enquanto o glóbulo polar é bastante reduzido e acaba por degenerar (Seeley et al., 2004a). O ovócito secundário inicia a segunda divisão meiótica mas permanece em metafase II (Seeley et al., 2004a; Fox, 2011). Perto da ovulação, o folículo expande muito rapidamente, atingindo os 18,8 mm e as células da granulosa e da teca tornam-se mais finas (Seeley et al., 2004a; Elder e Dale, 2011). A membrana basal do folículo expande, atingindo, aproximadamente, 400 vezes o seu tamanho original (Elder e Dale, 2011). O folículo continua a expandir e acaba por romper. Esta rutura leva à saída do fluido folicular e também do ovócito secundário, que se encontra rodeado pela zona pelúcida e pelo cumulus e é capturado para a trompa de Falópio (Seeley et al., 2004a). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 35 O ovócito secundário só continua a segunda divisão meiótica se houver penetração por um espermatozoide. Caso esta não ocorra, o ovócito degenera e é expulso do organismo (Seeley et al., 2004a). Após a ovulação, o folículo tem, ainda, uma função importante no organismo. As células da granulosa sofrem várias alterações formando o corpo lúteo ou amarelo, devido à coloração amarelada que as suas células adquirem, e começam a segregar progesterona e pequenas quantidades de estrogénio. Se não ocorrer gravidez, o corpo lúteo permanece funcional durante 10 - 12 dias e após este período, degenera e forma o corpo albicans ou branco, devido à coloração branca das células degeneradas (Seeley et al., 2004a). Todos os estádios de desenvolvimento folicular, assim como a sua organização pelo ovário, encontram-se ilustrados na Figura 6. Figura 6 - Ilustração de uma secção do ovário e a sua estrutura interna com os diferentes estádios de desenvolvimento folicular. Adaptado de Seeley et al., 2004a. Todos os meses, a partir da puberdade, ocorrem alterações cíclicas na secreção das hormonas gonadotróficas pela hipófise anterior, que têm influência nos ovários, e induzem, assim, alterações cíclicas na produção de estrogénio e progesterona. Por conseguinte, estes esteroides vão influenciar o endométrio uterino. Deste modo, simultaneamente ao processo de maturação folicular, várias alterações ocorrem no útero (Seeley et al., 2004a). O ciclo menstrual inclui, assim, todas as modificações FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 36 cíclicas que ocorrem a nível da secreção hormonal pela hipófise anterior, no ovário e no útero (Seeley et al., 2004a; Fox, 2011). 1.3.1. Ciclo menstrual O ciclo menstrual tem a duração de, aproximadamente, 28 dias e pode ser dividido em diferentes fases, de acordo com as alterações a nível do ovário e do endométrio (Figura 7): Fase folicular – Tem início no primeiro dia da menstruação e termina com a ovulação, que ocorre por volta do 14º dia. Nesta fase, há o recrutamento de folículos por estímulo da FSH. Estes folículos produzem estrogénios e inibina. O único folículo dominante, por ciclo, continua a produzir estrogénio, que acaba por atingir níveis muito elevados. Simultaneamente, no útero houve a descamação do endométrio durante, aproximadamente, 5 dias, correspondente à menstruação. Os elevados níveis de estrogénio produzidos pelos folículos induzem a proliferação celular e o crescimento de glândulas e de vasos sanguíneos, permitindo a regeneração do endométrio e algum crescimento do mesmo. Esta proliferação do tecido endometrial caracteriza a fase proliferativa do útero, que termina, assim como a fase folicular, com a ovulação (Fox, 2011). Ovulação – Coincide com o pico de LH e termina com a saída do ovócito do ovário. A quantidade elevada de estrogénio produzida pelo folículo de Graaf vai, por feedback positivo, induzir o pico de LH que conduz à ovulação. Este pico induz, também, a produção de progesterona e o início da luteínização das células da granulosa. O pico de LH na presença de progesterona induz a produção de enzimas proteolíticas que rompem a parede do folículo e libertam o ovócito, juntamente com a zona pelúcida e a corona radiata (Seeley et al., 2004a). Há, também, a produção de prostaglandinas, responsáveis pela contração das células musculares envolventes, permitindo a ovulação, ou seja, a saída do ovócito do ovário (Fox, 2011). Fase Lútea – Após a ovulação, o folículo vazio é estimulado pela LH e forma o corpo lúteo, que produz, de forma gradual, progesterona, estradiol e inibina. Por volta do 21º dia, estas hormonas atingem níveis máximos e, por mecanismos de feedback negativo, conduzem ao decréscimo da secreção de FSH e LH, inibindo uma nova ovulação no mesmo ciclo. O corpo amarelo degenera e, consequentemente, há a FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 37 queda de progesterona, de estradiol e de inibina (Fox, 2011). Uma vez que os níveis destes esteroides já não se encontram no seu máximo, há, de novo, um aumento da secreção de FSH e de LH no 26º dia e o recrutamento de folículos para o próximo ciclo (Seeley et al., 2004a). No útero, o elevado nível de progesterona estimula a secreção glandular, a acumulação de secreções nas glândulas e o espessamento e vascularização do endométrio, que se encontra nesta fase - fase secretora - preparado para receber o embrião caso tenha ocorrido a fertilização (Fox, 2011). Com a diminuição da secreção de progesterona no ovário, ocorre a necrose e a descamação do estrato funcional do endométrio e começa a menstruação, que marca o início de um novo ciclo (Fox, 2011). Se houver variação na duração do ciclo menstrual, diferente de 28 dias, é mais provável que esta variação ocorra na fase folicular do que na fase lútea (Seeley et al., 2004a). Figura 7 - Ciclo menstrual e alterações a nível do ovário. As setas indicam o efeito das hormonas, da FSH e LH a nível folicular e do estrogénio e da progesterona a nível do endométrio. Adaptado de Fox, 2011. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 38 1.4. Fertilização A fertilização é um processo progressivo e continuo. Começa com a penetração do ovócito pelo espermatozoide seguindo-se a formação e justaposição dos pronúcleos e termina com a união dos cromossomas maternos e paternos (singamia) (Bavister, 2002). A fertilização ocorre na ampola de uma das trompas de Falópio (Guyton e Hall, 2006). As fases iniciais da fertilização dependem, essencialmente, de duas estruturas: do acrossoma do espermatozoide e da zona pelúcida do ovócito (Elder e Dale, 2011). Embora os espermatozoides sejam considerados maduros quando abandonam o epidídimo, a atividade fertilizante é inibida por fatores inibidores do epitélio genital masculino. Assim, logo após a ejaculação os espermatozoides não são ainda capazes de fecundar o ovócito. À capacidade de ligação e posterior fertilização do ovócito dáse o nome de capacitação. Esta é dependente da temperatura, sendo apenas adquirida no trato feminino, após a passagem pelo cérvix (Elder e Dale, 2011). No aparelho feminino, os espermatozoides entram em contacto com fluidos que conduzem a uma panóplia de alterações que permitem a capacitação (Guyton e Hall, 2006). Estas alterações passam pela remoção dos fatores inibidores dos ductos genitais masculinos e pelo aumento da permeabilidade da membrana do espermatozoide aos iões de cálcio (Guyton e Hall, 2006). Cada espermatozoide contém o acrossoma, uma vesícula com enzimas hidrolíticas, entre as quais a hialuronidase que digere o ácido hialurónico presente na corona radiata, permitindo que o espermatozoide alcance a zona pelúcida do ovócito (Elder e Dale, 2011; Fox, 2011). A ligação espermatozoide-zona pelúcida é mediada por recetores específicos na superfície do espermatozoide e desencadeia a reação acrossómica, que consiste na fusão da membrana do acrossoma com a membrana plasmática do espermatozoide. Esta fusão permite a formação de poros por onde as enzimas do acrossoma são libertadas (Fox, 2011). O ligando primário da zona pelúcida, o ZP3, liga-se especificamente à membrana plasmática do acrossoma do espermatozoide intacto. O segundo ligando, o ZP2, liga-se à membrana interna do acrossoma do espermatozoide. Para a penetração da zona pelúcida, o espermatozoide recorre tanto a mecanismos enzimáticos como mecânicos. As enzimas libertadas na reação acrossómica pelo espermatozoide permitem a invasão da zona pelúcida através da degradação dos seus componentes. A força mecânica exercida pelos batimentos FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 39 vigorosos da cauda do espermatozoide facilita a entrada da sua cabeça na zona pelúcida (Granot e Dekel, 2012). Depois de penetrar a zona pelúcida o espermatozoide atravessa o espaço perivitelino (Granot e Dekel, 2012). O primeiro espermatozoide a alcançar o oolema funde a membrana plasmática da sua cabeça com a do ovócito e atravessa-a até ao citoplasma (Fox, 2011). As mitocôndrias e a cauda do espermatozoide entram, também, no ooplasma mas degeneram posteriormente (Elder e Dale, 2011). A fusão das membranas estimula o retículo endoplasmático do ovócito a libertar os iões de cálcio (Ca2+) armazenados. Este fluxo de cálcio induz diversas alterações estruturais no ovócito que impedem que este seja fertilizado por mais de um espermatozoide, ou seja, evita a polispermia (Fox, 2011). Os grânulos corticais (GC) são pequenos organelos que contêm enzimas. Imediatamente após a penetração do espermatozoide e por ação do fluxo de Ca2+, estes grânulos fundem-se com o oolema e libertam as suas enzimas no espaço perivitelino por exocitose. A este processo dáse o nome de reação cortical. Esta reação provoca o endurecimento da zona pelúcida e, consequentemente, a inativação dos locais de ligação dos espermatozoides (Elder e Dale, 2011; Seeley et al., 2004b). Este fluxo de Ca2+ permite, ainda, que o ovócito continue a divisão nuclear a partir da metafase II, onde tinha estagnado, e a termine (Fox, 2011). No fim da segunda divisão meiótica, há, também, uma distribuição desigual do citoplasma entre as duas células resultantes. O ovócito fica com a maioria do citoplasma, enquanto o segundo glóbulo polar, não herda quase nenhum e é também expulso para o espaço perivitelino, onde acaba por degenerar, tal como o primeiro (Fox, 2011). O núcleo formado após a segunda divisão meiótica designa-se pronúcleo (PN) e migra para o centro do ovócito, assim como o pronúcleo masculino. Após penetrar a zona pelúcida e o oolema, enquanto o ovócito completa a divisão meiótica, a membrana plasmática do núcleo do espermatozoide começa a dissolver-se e a cromatina a descondensar. As protaminas são substituídas por histonas, desenvolvendo-se o pronúcleo masculino. Cada um destes pronúcleos é haploide. Durante a migração para o centro do ovócito ocorre a replicação do ADN em cada um dos PN (Elder e Dale, 2011). Quando justapostos no centro do ovócito, algumas horas antes de se iniciar a primeira divisão, as membranas dos PN desagregam e uma vez alinhados, os cromossomas paternos separam-se, preparando-se para a mitose e a fertilização termina (Elder e Dale, 2011; Papale et al., 2012). O potencial mitótico do zigoto humano é herdado do pai, pelo centríolo do espermatozoide (Papale et al., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 40 1.5. Implantação O zigoto sofre a primeira divisão mitótica, aproximadamente, 30 horas após a fertilização, num processo designado clivagem. O embrião continua a dividir-se por mitoses, formando células sucessivamente mais pequenas, designadas blastómeros. Este decréscimo do tamanho das células deve-se ao facto de todos os blastómeros continuarem rodeados pela zona pelúcida, sem que haja expansão da mesma (Elder e Dale, 2011; Fox, 2011). A segunda clivagem ocorre 40 horas após a fertilização e origina quatro blastómeros. Após 60 horas, ocorre a terceira clivagem, da qual resultam oito células. Ao quarto dia, após a fertilização, o embrião apresenta entre 32 a 64 blastómeros e tem a designação de mórula. Posteriormente, dá-se a formação de uma cavidade central cheia de fluido, designada blastocélio. Nesta fase, o embrião tem a designação de blastocisto e é rodeado por uma camada de células denominada trofoectoderme (TF), que se situa entre o blastocélio e a zona pelúcida (Seeley et al., 2004b) e a partir da qual se irá desenvolver a placenta (Elder e Dale, 2011). O blastocisto é constituído por uma massa mais espessa de células no seu interior, a massa celular interna (MCI), que dará origem ao feto (Seeley et al., 2004b). A formação do blastocélio e a sua expansão são essenciais para o desenvolvimento e posterior diferenciação da massa celular interna (Elder e Dale, 2011). Todos estes eventos, desde a primeira divisão celular até à fase de blastocisto, ocorrem com a migração do embrião pela trompa de Falópio, desde a ampola até ao útero, onde irá ocorrer a implantação, que corresponde à incorporação do blastocisto pela parede uterina (Seeley et al., 2004b). Durante a transição de mórula para blastocisto, o embrião entra no útero, onde é mantido pelo oxigénio e substratos metabólicos provenientes de secreções uterinas. No local de implantação, as células da trofoectoderme produzem enzimas proteolíticas, que digerem uma passagem pela zona pelúcida, permitindo a eclosão do blastocisto da mesma. A trofoectoderme secreta, também, a gonadotrofina coriónica humana (hCG) que vai comunicar com as células epiteliais do endométrio (Elder e Dale, 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 47 2. Análise da amostra seminal 2.1. Colheita A amostra seminal deve ser colhida por masturbação para um frasco de plástico esterilizado (Biosigma®, Itália), numa sala privada no centro onde a sua análise irá ser realizada. Deste modo, é possível minimizar a exposição da amostra a flutuações tanto de temperatura como de tempo entre a hora da colheita e a da análise. Se não puder ser feita no centro, a colheita deve ser feita em casa. Neste caso, o paciente é claramente instruído sobre todos os passos e cuidados/consequências a ter na colheita e no transporte da amostra até ao laboratório, devendo, também, assinar um consentimento. A amostra seminal deve ser entregue dentro de uma hora após a colheita e tem de ser transportada a uma temperatura próxima à temperatura corporal (Jeyendran, 2003; WHO, 2010). Quando não é possível obter uma amostra por masturbação, esta pode ser recolhida para um preservativo isento de espermicidas, próprio para este tipo de situações, não afetando, assim, nem o sémen nem a sua análise. Quando se recorre a este preservativo, a amostra tem, também, de ser transportada à temperatura corporal e ser entregue, no prazo de uma hora, no laboratório que procederá à sua análise (WHO, 2010). O período de abstinência é um dos fatores relacionados com a variação da qualidade espermática mais importantes (Jeyendran, 2003), recomendando-se que este seja de 2 a 7 dias para a colheita da amostra seminal a analisar (WHO, 2010). Um período inferior pode favorecer a motilidade espermática, mas afeta o volume e a concentração da mesma. Por outro lado, um período de abstinência mais longo pode reduzir a motilidade (Silverberg e Turner, 2009). É extremamente importante que a amostra seminal esteja completa. Se a parte inicial do ejaculado, que é a mais rica em espermatozoides, estiver ausente, deve ser realizada uma segunda colheita, após o período de abstinência recomendado (Jeyendran, 2003). Devido à possibilidade de a amostra se encontrar incompleta e/ou contaminada, o coito interrompido não é um método de colheita válido (WHO, 2010). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 48 2.2. Análise Após a colheita, a amostra é incubada a 37 °C e a sua análise deve iniciar-se com uma simples inspeção assim que esta se encontre completamente liquefeita. O período de incubação não deve, no entanto, ultrapassar os sessenta minutos, para prevenir que a desidratação ou alterações na temperatura prejudiquem o ejaculado (WHO, 2010). A análise pode ser dividida em duas partes, o exame macroscópico e o exame microscópico e segue os limites estabelecidos pela OMS (Anexo I). No primeiro, são analisados parâmetros como a liquefação, a viscosidade, o volume, o pH, a cor e o cheiro da amostra seminal. No último, é avaliada a motilidade, a integridade membranar, a concentração e a morfologia dos espermatozoides, assim como a presença de outras células no ejaculado. A Organização Mundial de Saúde estabeleceu limites de referência para todos os parâmetros espermáticos analisados. 2.2.1. Exame macroscópico Liquefação Após a ejaculação, a amostra apresenta-se como um coágulo devido às secreções das vesículas seminais. Comummente, dentro de 30 minutos a 37 °C, este coágulo liquefaz-se por completo por ação de secreções enzimáticas da próstata, ficando no estado líquido. Assim, uma liquefação incompleta uma hora após a ejaculação pode indicar a ausência das enzimas prostáticas. Por outro lado, uma amostra já de consistência líquida imediatamente após a colheita pode revelar anomalias nas secreções seminais, ou ausência das vesículas seminais, especialmente, se o volume do ejaculado for reduzido (Jeyendran, 2003). As amostras colhidas em casa ou nos preservativos especiais já se devem encontrar liquefeitas quando chegam ao laboratório (WHO, 2010). A liquefação pode ser reconhecida tanto a nível macroscópico como microscópico, uma vez que o coágulo não adquire a forma do frasco e na amostra coagulada não há uma distribuição homogénea das células (WHO, 2010). Espermatozoides que se encontravam, inicialmente, imóveis adquirem motilidade à medida que a amostra fica liquefeita. Por este motivo, para uma correta avaliação da FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 49 qualidade espermática, é essencial que a amostra se encontre completamente liquefeita no momento em que esta é realizada (WHO, 2010). Se esta não ocorrer naturalmente, é necessário recorrer a métodos enzimáticos ou mecânicos, com recurso a enzimas, como a α-amilase, ou por aspirações sucessivas com uma pipeta de vidro de pequeno calibre, respetivamente. O uso de enzimas pode, no entanto, prejudicar a amostra, sendo, por isso, recomendado o método mecânico para liquefazer a amostra (Jeyendran, 2003). O ejaculado pode apresentar coágulos semelhantes a um gel, que não se liquefazem. O seu significado não é, ainda, conhecido (Jeyendran, 2003). Viscosidade Ao contrário de uma amostra não completamente liquefeita, um ejaculado viscoso apresenta uma espessura e consistência homogéneas, constantes com o tempo. A viscosidade elevada pode ser reconhecida pelas propriedades elásticas da amostra, que a tornam difícil de pipetar (WHO, 2010). Após a liquefação, a viscosidade pode ser determinada por uma aspiração suave com uma pipeta de plástico (VWR®, EUA), que é difícil se a viscosidade for elevada. Ao rejeitar o pipetado, deve-se observar como a amostra sai da pipeta. Se cair em forma de pequenas gotas, a viscosidade é normal, no entanto, se formar um fluxo contínuo é aumentada. Uma viscosidade considerada anormal pode formar um filamento, ao cair, com mais de 2 cm (WHO, 2010). Uma viscosidade elevada pode interferir com a correta análise da motilidade e da concentração espermática, com a deteção de espermatozoides ligados a anticorpos e com a análise de alguns marcadores bioquímicos (WHO, 2010). Uma viscosidade elevada associada a uma motilidade reduzida pode ter consequências relevantes na capacidade de fertilização, devido à baixa probabilidade dos espermatozoides conseguirem escapar a um ejaculado tão viscoso (Jeyendran, 2003). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 50 Volume O volume do ejaculado resulta em grande parte das secreções das vesículas seminais e da próstata (60 e 30%, respetivamente) (Seeley et al., 2004). As glândulas bulbouretrais e os epidídimos contribuem apenas com uma pequena fração para o volume. A quantificação precisa deste volume é essencial em qualquer avaliação da qualidade espermática para o cálculo do número total de espermatozoides e de células não espermáticas no ejaculado. Esta quantificação faz-se com recurso a uma pipeta graduada (VWR®, EUA) por aspiração direta da amostra (WHO, 2010). O volume tem um efeito mínimo no potencial de fertilização, contudo, se for inferior a 1,0 mL pode não ser suficiente para cobrir o cérvix, não expondo o esperma ao muco cervical (Jeyendran, 2003). Um reduzido volume deve-se, normalmente, a obstruções no ducto ejaculador ou à ausência bilateral congénita dos canais deferentes (WHO, 2010), na qual as vesículas seminais se encontram precariamente desenvolvidas. Um volume reduzido pode, no entanto, também dever-se a uma combinação de problemas, como a perda de uma fração do ejaculado, ejaculação parcialmente retrógrada, deficiência andrógena (Sitzmann et al., 2008; WHO, 2010) ou a um período insuficiente de abstinência (Jeyendran, 2003). Por outro lado, uma amostra muito volumosa pode resultar de exsudação em caso de inflamação dos órgãos acessórios (WHO, 2010). Um volume normal, antes de diluição, segundo os valores de referência da OMS, deve ser superior a 1,5 mL. pH O pH do sémen reflete o equilíbrio entre o pH das diferentes secreções das glândulas acessórias, principalmente da secreção alcalina da vesícula seminal e da secreção ácida prostática (WHO, 2010). Assim, o pH indica a razão entre estas duas secreções (Sitzmann et al., 2008), tendo sido referenciado como normal, pela OMS, um pH de 7,2. O pH deve ser medido até uma hora após a colheita, por ser influenciado pela perda de dióxido de carbono (CO2) que ocorre após a ejaculação (WHO, 2010). O pH é avaliado mergulhando o papel indicador de pH (Merck®, Alemanha) na amostra. Para amostras consideradas normais, o indicador de pH mais utilizado mede na gama 6,0 - 10,0 (WHO, 2010). Antes de medir o pH, é necessário agitar muito bem a amostra seminal para evitar oscilações na medição (WHO, 2010). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 51 Se o pH for inferior a 7,0 e a amostra tiver um volume reduzido e uma concentração de espermatozoides baixa, pode existir obstrução do ducto ejaculador ou ausência bilateral congénita dos canais deferentes (Jeyendran, 2003; WHO, 2010). Um pH superior a 9,4 é indício de patologia prostática severa (Jeyendran, 2003). Cor e cheiro Uma amostra de sémen liquefeita, normal, apresenta uma cor homogénea branca/ acinzentada ou amarelada. Se a concentração de células espermáticas for muito reduzida, a amostra torna-se menos opaca (WHO, 2010). A cor do esperma pode variar devido à presença de glóbulos vermelhos e de certas vitaminas ou drogas, apresentando uma cor vermelha-acastanhada e amarela, respetivamente. Assim, uma cor anormal pode ser indício de alguma patologia a nível das glândulas sexuais acessórias ou de alguma anomalia em geral (Sitzmann et al., 2008). O cheiro de uma amostra seminal é sui generis e inequívoco (Jeyendran, 2003). A presença de urina na amostra seminal pode alterar a cor e o cheiro da mesma (Jeyendran, 2003). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 52 2.2.2. Exame microscópico Motilidade Em edições anteriores, a Organização Mundial de Saúde considerava quatro categorias de motilidade: progressiva rápida (≥ 25 µm/s), progressiva lenta, não progressiva e imobilidade. Era, portanto, recomendada a distinção entre uma progressão lenta e rápida. Contudo, a partir de 2010, devido à dificuldade em distinguir espermatozoides lentos e rápidos, são apenas consideradas três categorias de motilidade: a progressiva (PR), a não progressiva (NP) e a imobilidade (IM), (WHO, 2010). Na motilidade progressiva, os espermatozoides movem-se tanto numa trajetória linear como circular, independentemente da velocidade que apresentam. Na motilidade não progressiva, ou in situ, os espermatozoides movem-se, mas com ausência de progressão, permanecendo no mesmo local. A imobilidade caracteriza espermatozoides sem qualquer tipo de movimento (WHO, 2010). A motilidade dos espermatozoides pode ser afetada por diversos fatores, tais como a idade do paciente e a sua saúde em geral, o período de abstinência, a exposição excessiva ao calor ou toxinas, o método de colheita e as condições a que a amostra é submetida (incluindo o tempo) até à altura da sua análise (Jeyendran, 2003; Silverberg e Turner, 2009). O valor mínimo de referência, segundo a OMS, para a motilidade total (PR e NP) é de 40% e para a motilidade progressiva (apenas PR) é de 32%. A presença de uma percentagem inferior a 32% de espermatozoides progressivos no ejaculado denominase astenozoospermia (Jeyendran, 2003). Esta, quando associada à presença de um elevado número de leucócitos e de detritos seminais é um indício de infeção das glândulas sexuais acessórias, tipicamente da próstata (Jeyendran, 2003). A quantidade de espermatozoides com motilidade progressiva influencia a taxa de gravidez (WHO, 2010), pois aumenta a probabilidade de alcançar o ovócito. Os espermatozoides imóveis são incapazes de migrar pelo muco cervical e mesmo que se encontrem no local de fecundação não conseguem atravessar o cumulus nem a corona radiata, sendo, consequentemente, incapazes de penetrar a zona pelúcida (Jeyendran, 2003). Deste modo, a motilidade permite prever a capacidade dos espermatozoides para atingir o ovócito (Sitzmann et al., 2008). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 53 A motilidade espermática no ejaculado deve ser analisada o mais cedo possível, após a liquefação completa da mesma, para evitar que a desidratação e as alterações de pH e de temperatura a afetem, permitindo uma análise correta (WHO, 2010). A amostra deve ser agitada antes da análise da motilidade, para homogeneização da mesma, de modo a que os resultados sejam fidedignos e reprodutíveis. Uma vez homogeneizada, retira-se uma alíquota da amostra e observa-se a um microscópio ótico (Nikon®, Japão), numa ampliação de 100×, para verificar a presença de alguma aglutinação ou agregação. De seguida, aumenta-se a ampliação para 200× e efetuase a análise da motilidade, pela avaliação da motilidade de 200 espermatozoides. A amostra deve ser, novamente, agitada antes de repetir a contagem. Comparam-se os resultados das duas contagens, para cada categoria de motilidade analisada e confirma-se se os valores são concordantes. Apenas espermatozoides intactos (com cabeça e cauda) numa área a, pelo menos, 5 mm das bordas da lamela devem ser contados. Deste modo, os efeitos da secagem na motilidade são evitados (WHO, 2010). Devem-se, também, evitar as áreas perto de bolhas de ar, pela influência que estas apresentam na motilidade (Jeyendran, 2003). A aglutinação refere-se, especificamente, a espermatozoides móveis aderentes uns aos outros - cabeça com cabeça, cauda com cauda ou até de ambas as formas. A aglutinação limita a motilidade e, por isso, qualquer espermatozoide aglutinado não deve ser considerado na contagem. O grau de aglutinação (desde <10 espermatozoides/aglutinado a todos os espermatozoides aglutinados) e o local de ligação devem ser registados (WHO, 2010), pois a aglutinação pode indicar problemas nos antigénios que se encontram na superfície dos espermatozoides (Sitzmann et al., 2008). É importante distinguir aglutinação, espermatozoides móveis ligados uns aos outros, de agregação, que se refere a espermatozoides imóveis presos uns aos outros e a espermatozoides móveis agregados ao muco, células não espermáticas ou detritos celulares (WHO, 2010). Computer-Aided Sperm Analysis - CASA Existem métodos informáticos, como o CASA (Computer-Aided Sperm Analysis), que foram, inicialmente, desenvolvidos para melhorar a precisão da análise realizada manualmente. Estes visam o estabelecimento de um teste padrão, objetivo e reprodutível, para determinar a concentração, motilidade e morfologia dos FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 54 espermatozoides. Estas técnicas visionam, também, a caracterização do movimento espermático (Silverberg e Turner, 2009). No CASA, os espermatozoides são colocados em câmaras de contagem (Makler ou MicroCell) e observados num microscópio ótico (Silverberg e Turner, 2009). Contudo, a estimativa da percentagem de espermatozoides móveis pode ser falível por ser dependente da quantidade de espermatozoides imóveis, uma vez que estes podem ser confundidos com certos detritos celulares (WHO, 2010). São diversos os fatores que influenciam a performance do CASA e incluem a preparação da amostra, a concentração espermática e a profundidade da câmara de contagem. É, no entanto, possível obter resultados credíveis e reprodutíveis se determinados procedimentos forem seguidos cuidadosamente (WHO, 2010). Vitalidade A vitalidade espermática é avaliada pela integridade da membrana celular e baseia-se no princípio de que uma membrana plasmática danificada permite a entrada de corantes, como a eosina, para dentro da célula, ao contrário de uma membrana integra (WHO, 2010). Esta análise permite, também, confirmar a avaliação da motilidade, uma vez que a percentagem de espermatozoides mortos não pode exceder a percentagem de espermatozoides imóveis. Normalmente, a percentagem de células viáveis excede a de espermatozoides móveis (PR e NP) (WHO, 2010). Desta forma, é possível saber a percentagem de espermatozoides imóveis que se encontram vivos (Silverberg e Turner, 2009). A análise deste parâmetro deve ser uma das primeiras a ser realizada, para evitar a redução do número de espermatozoides vivos (WHO, 2010). O corante mais utilizado para esta análise é a eosina Y, que apresenta uma cor avermelhada. Este é adicionado a uma alíquota da amostra, numa proporção de 1:1 e após a homogeneização desta mistura devem-se aguardar uns minutos para permitir a entrada do corante nos espermatozoides. Agita-se, novamente, a mistura e realiza-se um esfregaço numa lâmina de vidro (VWR®, EUA). Para a preparação do esfregaço, adiciona-se uma gota do preparado na ponta da lâmina e, com o auxílio de outra lâmina (VWR®, EUA), arrasta-se a gota ao longo de toda a superfície laminar (WHO, 2010), como é indicado na Figura 8. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 55 Para a obtenção de um bom esfregaço, sem sobreposição de espermatozoides, devese ter em conta o volume e a concentração da amostra. O ângulo de uma lâmina na outra (α na Figura 8) e a velocidade com que se arrasta a alíquota têm influência na sobreposição da amostra. Assim, quanto menor o ângulo e mais lento o movimento, mais fino é o esfregaço (WHO, 2010). Deixa-se secar a lâmina (VWR®, EUA) antes de se observar ao microscópio ótico (Nikon®, Japão) em campo claro, com uma ampliação de 400× (WHO, 2010). Como a eosina apresenta uma cor avermelhada, os espermatozoides que apresentarem as cabeças vermelhas, permitiram que o corante entrasse, encontramse, portanto, mortos. Por outro lado, os espermatozoides que apresentam uma cabeça verde/esbranquiçada são considerados vivos, uma vez que não houve a entrada de eosina (WHO, 2010). Após a contagem de 200 espermatozoides, calcula-se a percentagem de espermatozoides vivos presentes na amostra. O valor mínimo, estimado pela OMS, para a vitalidade é de 58%. Figura 8 - Preparação do esfregaço para a análise da vitalidade. A alíquota de sémen (S), que se encontra numa das extremidades da lâmina, é arrastada com o auxílio de outra lâmina de vidro no sentido indicado pela seta. α indica o ângulo entre as duas lâminas. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. Concentração A concentração espermática e o número total de espermatozoides são parâmetros distintos. A concentração refere-se ao número de espermatozoides por unidade de volume da amostra seminal, sendo, portanto, influenciada pelo volume das secreções das vesículas seminais e prostáticas (WHO, 2010). Assim, a concentração permite deduzir o sucesso tanto da espermatogénese, como da produção das secreções das glândulas sexuais acessórias (Sitzmann et al., 2008). Por outro lado, o número total de espermatozoides é o número total destas células no ejaculado e é obtido multiplicando α FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 56 a concentração pelo volume da amostra. Este valor é um indício do sucesso geral da espermatogénese, ou de uma possível obstrução dos ductos masculinos (Sitzmann et al., 2008; WHO, 2010). O limite referenciado pela OMS para a concentração ser considerada normal é de 15 × 106 espermatozoides/mL e o número total é de 39 × 106 espermatozoides por ejaculado. A concentração espermática pode ser determinada, com precisão, com recurso a uma câmara de contagem (Elder e Dale, 2011). Existem diferentes câmaras, como a de Neubauer, a Makler e a MicroCell, que apresentam profundidades distintas (100 µm, 10 µm e 20 µm, respetivamente) (Jeyendran, 2003). É, no entanto, recomendado que a câmara de contagem apresente uma profundidade de 100 μm, sendo, por isso, a câmara de Neubauer (Marienfeld®, Alemanha) (Figura 9) a mais comum (WHO, 2010). Este hemocitómetro apresenta duas áreas de contagem, com 3 mm de comprimento por 3 mm de largura cada, que se encontram divididas em nove grelhas de 1mm × 1mm, como se pode observar na Figura 10a. A grelha central contém 25 quadrados, subdividindo-se cada um destes em 16 quadrados (WHO, 2010), que se encontram assinalados na Figura 10a, pelo círculo vermelho e destacados na Figura 10b. Para a contagem de espermatozoides, ambas as áreas de contagem são cobertas por uma lamela que permanece fixa a uma altura de 0,1 mm. Desta forma, é certificado que o volume considerado para a contagem permanece constante (WHO, 2010). Figura 10 – Área de contagem da câmara de Neubauer (Marienfeld®, Alemanha). a) As nove grelhas de uma das áreas de contagem do hemocitómetro de Neubauer (Marienfeld®, Alemanha). Os 25 quadrados são visíveis no centro da câmara. b) Corresponde ao círculo vermelho da Figura 10a e representa os 16 quadrados dentro de cada um dos 25 quadrados da grelha central. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. Figura 9 - Câmara de Neubauer (Marienfeld®, Alemanha) com as duas áreas de contagem visíveis a preto. http://www.exportersindia.com/r_s_scientific/ a b FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 63 espermatozoide anormal (Silverberg e Turner, 2009). A morfologia é, também, um indício do estado de maturação do gâmeta masculino (Sitzmann et al., 2008). A definição da morfologia de um espermatozoide com potencial de fertilização foi obtida pela observação de espermatozoides recuperados do sistema reprodutor feminino, especialmente do muco cervical, após o coito e da superfície da zona pelúcida (WHO, 2010). Assim, este sistema de classificação considera como uma morfologia normal, a morfologia de uma subpopulação de espermatozoides com potencial para fertilização que se encontrava nestas estruturas (WHO, 2010). Segundo este sistema, uma cabeça considerada normal apresenta uma forma oval regular e um acrossoma bem definido e que ocupe 40-70% da sua área. Não deve possuir nenhum vacúolo de grandes dimensões, nem mais de dois pequenos, ou seja, estes não devem ocupar mais de 20% da cabeça (WHO, 2010). Um espermatozoide normal pode ter restos citoplasmáticos desde que estes ocupem menos de um terço do tamanho da cabeça (Elder e Dale, 2011). A peça intermédia deve-se encontrar ligada à zona axial da cabeça, ser estreita, regular e apresentar, aproximadamente, o comprimento da cabeça (WHO, 2010). A peça principal deve ter uma espessura constante em toda a sua extensão e deve ser mais estreita que a peça intermédia. O seu comprimento deve ser de, aproximadamente, 45 μm, ou seja, cerca de 10 vezes o da cabeça (Jeyendran, 2003; WHO, 2010). Esta pode apresentar alguma curvatura, desde que nenhum ângulo agudo, que indique quebra flagelar, seja visível (WHO, 2010). Para que um espermatozoide seja classificado como normal, nenhum defeito evidente pode ser visível na cabeça, no colo/peça intermédia ou na cauda. Um exemplo de um espermatozoide normal encontra-se na Figura 12. Existem, no entanto, diversos tipos de anomalias, que podem ocorrer em cada uma das partes do espermatozoide, sozinhas ou combinadas, devido a erros na espermatogénese ou a patologias nos epidídimos (WHO, 2010). Figura 12 - Espermatozoide humano normal. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 64 Defeitos na cabeça A cabeça pode ser dupla, grande, ou pequena, conferindo ao espermatozoide a designação de bicéfalo, macrocéfalo e microcéfalo, respetivamente. O último aparece intensamente corado devido a uma hipercondensação da cromatina. O acrossoma é dificilmente visualizado, ao contrário do que acontece nos macrocéfalos, em que há uma grande expansão do mesmo (WHO, 2010). A cabeça pode, também, ser amorfa, apresentando um contorno irregular, piriforme, redonda, alongada, pontiaguda ou estreita. A presença de vacúolos que ocupem mais de 20% da sua área é, também, considerada uma anomalia (WHO, 2010). O acrossoma pode ser grande, se ocupar mais de 70% da área da cabeça, pequeno, se ocupar menos de 40%, ou ausente (globozoospermia, ver Anexo II). Diversos exemplos de anomalias na cabeça podem ser observados na Figura 13. Figura 13 - Defeitos na cabeça. a) Cabeça cónica. b) Cabeça amorfa. c) Cabeça redonda. d) Cabeça pequena. e) Cabeça grande. f) Cabeça normal. g) Acrossoma grande, ocupa mais de 70% da cabeça. h) Cabeça pequena com o característico acrossoma pequeno. i) Acrossoma pequeno com mais de dois vacúolos. j) Cabeça piriforme. k) Presença de vacúolos na região pós-acrossomal. l) Presença de mais de dois vacúolos. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 65 Defeitos no colo/peça intermédia As anomalias na peça intermédia estão relacionadas com problemas nas mitocôndrias, nos centríolos e na formação dos microtúbulos. Estas anomalias podem aparecer isoladas ou combinadas, podendo ser de diversos tipos. Pode haver uma inserção assimétrica da peça intermédia, esta pode ser espessa, irregular, fletida (com um ângulo agudo), longa ou demasiado fina (WHO, 2010). A Figura 14 representa algumas anomalias da peça intermédia. Figura 14 - Defeitos no colo/peça intermédia. a) Peça intermédia espessa. b) Peça intermédia irregular e cabeça anormal. c) Inserção assimétrica da peça intermédia na cabeça. A cabeça é anormal. d) Peça intermédia espessa e muito longa. e) Peça intermédia espessa e com um ângulo agudo. f) Peça intermédia e cabeça anormais. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. Defeitos na peça principal A peça principal pode ser curta, múltipla, encontrar-se quebrada ou curvada, com um ângulo acentuado, podendo, também, ter espessura irregular ou apresentar-se enrolada (Figura 15). A última é a anomalia da cauda mais comum. Pensa-se que pode resultar da rutura de fibrilas e da desorganização do axonema (Sutovsky, 2001). Durante a espermiogénese, podem ocorrer erros, levando à separação da cabeça da cauda. Como são, apenas, considerados os espermatozoides intactos na análise espermática, cabeças desprovidas de cauda não são consideradas espermatozoides e, portanto, esta ausência não é considerada uma anomalia (WHO, 2010). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 66 Figura 15 - Defeitos na peça principal. a) Peça principal a formar um loop. A cabeça do espermatozoide é anormal e o acrossoma é grande pois ocupa mais de 70% cabeça. b) Peça principal dupla. c) Peça principal curvada com um ângulo agudo. A peça intermédia é espessa. d) Peça principal enrolada. A cabeça apresenta vacúolos na região pósacrossomal. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. Citoplasma residual Um excesso anormal de citoplasma encontra-se associado a uma espermatogénese deficiente. Os espermatozoides com um terço, ou mais, de citoplasma corado estão muitas vezes associados a defeitos na peça intermédia (Figura 16) (WHO, 2010). Figura 16 - Espermatozoide com citoplasma residual e cabeça anormal. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. Células imaturas e leucócitos As células precursoras espermáticas são todas as células imaturas de origem espermática, que não podem ser classificadas como um espermatozoide maduro. Podem ser espermatócitos I, espermatócitos II ou espermátides (Jeyendran, 2003). A contagem destas células não é considerada como parâmetro na análise da morfologia, mas deve ser registada uma vez que, se forem, pelo menos, 3 por cada 100 espermatozoides (≥ 3%), são um indício de intoxicação, de infeção e de exposição FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 67 a radiação ou drogas. Estas células encontram-se associadas a um reduzido número de espermatozoides e a uma morfologia anormal, refletindo uma redução do potencial de fertilização (Jeyendran, 2003). Após a coloração é possível avaliar a presença de outros elementos celulares não espermáticos, como leucócitos, microrganismos e de detritos celulares (Jeyendran, 2003). Os leucócitos são, provavelmente, provenientes da próstata. Um número igual ou superior a 10 milhões é anormal e pode indicar infeção das glândulas sexuais acessórias, podendo, também, participar em fenómenos de aglutinação. Os leucócitos induzem stress oxidativo pela produção de radicais livres de oxigénio e de secreções de citocinas citotóxicas. Estes produtos interferem com a progressão espermática e com a capacidade de fertilização (Jeyendran, 2003). A distinção entre células imaturas e leucócitos é difícil, sendo necessária a coloração das mesmas. Por este motivo, a análise da presença destas células é realizada na altura da avaliação da morfologia (Jeyendran, 2003). Há características específicas que permitem diferenciar estes dois tipos de células, nomeadamente, o tamanho e a razão núcleo/citoplasma, que são regulares nos leucócitos mas muito variáveis nas células imaturas (Jeyendran, 2003). Na Figura 17 pode ser observado um macrófago e células precursoras de espermatozoides com diferentes níveis de maturidade. A presença de microrganismos, tipicamente bactérias, em elevado número sugere infeção decorrente da próstata (Jeyendran, 2003). Figura 17 - a) Macrófago. b) Citoplasma. c) Espermatócito. d) Espermátide. Adaptado de WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen, 5ª edição. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 68 3. Preparação da amostra seminal O processamento da amostra seminal é crucial para o sucesso dos tratamentos de reprodução assistida, pois permite a seleção morfológica e funcional dos espermatozoides, separando os normais e com motilidade progressiva dos imóveis e com anomalias. O processamento exclui, também, as células não espermáticas e as partículas seminais prejudiciais, tais como prostaglandinas, citoquinas e elementos antigénicos e infeciosos (Bourne et al., 2009; WHO, 2010). É aconselhável um período de abstinência de 2 a 5 dias para a colheita da amostra seminal usada no tratamento. Uma vez colhida, a amostra é incubada a 37 °C, até se encontrar totalmente liquefeita (WHO, 2010). Completa a liquefação, é feita uma breve avaliação da motilidade, morfologia e concentração da amostra, para confirmar se os valores destes parâmetros se encontram semelhantes aos obtidos no espermograma realizado previamente, devido à variabilidade entre colheitas do mesmo indivíduo (WHO, 2010). Inicialmente, a seleção dos espermatozoides é feita por gradientes de densidade. Este método baseia-se na separação dos espermatozoides de boa qualidade das células não espermáticas e dos detritos presentes no plasma seminal, pelas diferentes densidades que apresentam (WHO, 2010). São preparados dois gradientes, constituídos por sílica coloidal e revestidos por silano, com diferentes densidades. Num tubo cónico (Nunc®, Dinamarca), coloca-se o gradiente com a maior densidade por baixo do de menor densidade e a amostra sobre ambos os gradientes. O volume final dos gradientes e a necessidade de um duplicado dependem da qualidade da amostra seminal. O tubo é centrifugado durante 25 minutos a 1200 rpm e a 35 °C. Os espermatozoides móveis migram pelos gradientes e formam um pellet, enquanto o plasma seminal permanece no topo destes gradientes. Os espermatozoides imóveis e os detritos celulares ficam retidos na interface dos dois gradientes. Este método permite, assim, a obtenção de uma amostra altamente purificada (WHO, 2010). Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado com cuidado, de modo a não perturbar o pellet. De seguida, este é recolhido para um novo tubo (Nunc®, Dinamarca), ao qual são adicionados 2,0 mL de meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-aquecido a 37 °C. Em caso de duplicado dos gradientes de densidade, os sedimentos de ambos os tubos (Nunc®, Dinamarca) são adicionados a um terceiro tubo cónico (Nunc®, Dinamarca), ao qual se adicionam, posteriormente, os FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 69 2,0 mL do meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-aquecido. Agita-se o tubo, para homogeneização da amostra antes de o centrifugar, durante 10 minutos a 1200 rpm e a 35 °C. O pellet obtido é submetido a mais uma lavagem, em que se procede do mesmo modo. Descarta-se o sobrenadante, com o cuidado de não perturbar o sedimento, e adicionam-se mais 2,0 mL do meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-aquecido, centrifugando-se, durante 10 minutos a 1200 rpm e a 35 °C, após ressuspender a amostra. Estas duas lavagens permitem a remoção de qualquer partícula nociva que ainda se pudesse encontrar no tubo/amostra, incluindo as partículas de sílica dos gradientes, que podem ser prejudiciais para os gâmetas. Por último, após descartar, cuidadosamente, o sobrenadante adicionam-se, aproximadamente, 0,5 mL de meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-aquecido a 37 °C ao sedimento, muito lentamente e de modo a não o perturbar. O tubo é, posteriormente, colocado num ângulo de 45°, numa estufa (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C, com O2 a 5% e CO2 a 6% e com a tampa parcialmente aberta para permitir trocas gasosas. A inclinação permite uma maior interface entre os espermatozoides e o meio de incubação (Origio®, Dinamarca) (WHO, 2010). O período de incubação deve ser ajustado à qualidade inicial da amostra seminal, variando, comummente, entre os 30 e os 60 minutos, uma vez que a percentagem de formas anormais no meio aumenta com o tempo (Elder e Dale, 2011). A este procedimento dá-se a designação de swim-up, por se basear na capacidade de progressão que os espermatozoides móveis apresentam no meio de cultura (WHO, 2010). Esta técnica permite um excelente isolamento dos espermatozoides móveis e com uma morfologia normal (Gandini et al., 2000; Jakab et al., 2003), sendo indicada para amostras oligozoospérmicas (Bourne et al., 2009). Apresenta, ainda, a vantagem de selecionar uma menor percentagem de espermatozoides com anomalias cromossómicas e com ADN fragmentado (Gandini et al., 2000; Jakab et al., 2003). Nos casos de amostras em que há uma acentuada redução de volume (hipospermia) e/ou de concentração de espermatozoides, o processamento é diferente, iniciando-se com as duas lavagens com meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-aquecido. Contudo, após a 2ª centrifugação, descarta-se o sobrenadante e adicionam-se apenas 0,1 mL do meio de incubação (Origio®, Dinamarca), sem perturbar o sedimento. Coloca-se, de seguida, o tubo com a tampa parcialmente aberta, com uma inclinação de 45°, na estufa (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C, 6% de CO2 e 5% de O2 ou à temperatura ambiente completamente fechado. Nestes casos, como o número de espermatozoides não é suficiente para a realização de swim-up, a amostra seminal é ressuspendida, imediatamente antes de ser utilizada. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 70 4. Métodos de recolha de espermatozoides Nas últimas décadas houve dois grandes desenvolvimentos tecnológicos na área da infertilidade masculina. A primeira foi a introdução da injeção intracitoplasmática de espermatozoides para o tratamento de amostras seminais com parâmetros de qualidade extremamente reduzidos. A segunda foi a extensão da ICSI a casos de azoospermia e a comprovação de que os espermatozoides recolhidos, quer do epidídimo, quer do testículo eram capazes de uma fertilização normal e posterior gestação (Esteves et al., 2011). Diversos métodos de recuperação de espermatozoides têm sido desenvolvidos para colher espermatozoides tanto do epidídimo como do testículo, em homens com azoospermia. A escolha do método de recolha e a sua taxa de sucesso dependem do tipo de azoospermia – obstrutiva ou não obstrutiva (Esteves et al., 2011). A aspiração de espermatozoides do epidídimo (MESA – Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration) foi o primeiro método para a obtenção cirúrgica de espermatozoides em casos de azoospermia obstrutiva (Mansour, 1998). Apesar de terem sido obtidas elevadas taxas de fertilização e de gravidez após a combinação deste método com ICSI (Mansour, 1998), a MESA é muito demorada, dispendiosa, requer anestesia geral e apresenta elevada morbidade. Acabou por ser, por isso, substituída pela aspiração subcutânea de espermatozoides do epidídimo, ou PESA (Percutaneous Epididimal Sperm Aspiration), que é mais simples e realizada sob anestesia local (Mansour, 1998; Elder e Dale, 2011). No entanto, esta técnica apresenta um elevado risco de hematoma e nem sempre é aspirado um número adequado de espermatozoides (Esteves et al., 2011). Em 1993, foi comprovado que o uso de espermatozoides provenientes do testículo, em casos de azoospermia obstrutiva, poderia alcançar fertilização e gestação, após ICSI. Assim, caso não sejam encontrados espermatozoides no epidídimo, pode-se proceder à aspiração de espermatozoides do testículo (TESA – Testicular Sperm Aspiration). Este método, apesar de simples e rápido, nem sempre permite a recuperação de um número suficiente de espermatozoides, podendo, inclusive, danificá-los pela pressão negativa exercida durante a aspiração (Esteves et al., 2011). Recentemente, a extração de espermatozoides do testículo (TESE – Testicular Sperm Extraction), seguida de ICSI, expandiu e passou a incluir casos de azoospermia não obstrutiva (Mansour, 1998). Neste tipo de azoospermia há uma falha na espermatogénese. O epidídimo não contém espermatozoides, mas o testículo pode FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 71 conter algumas áreas específicas em que esta ocorra. A natureza localizada da espermatogénese a pequenos pontos do testículo, diferentes em cada paciente, torna o diagnóstico, baseado numa única biópsia, irrealista, podendo ser necessárias múltiplas biópsias para a identificação das mesmas. No entanto, as amostras de tecido testicular podem ser criopreservadas para utilização futura (Elder e Dale, 2011). A biópsia, ou extração de espermatozoides testiculares, é realizada sob anestesia local (Elder e Dale, 2011). Esta biópsia pode, também, ser realizada a uma ampliação de 6-8×, obtendo a designação de micro-TESE (Esteves et al., 2011). Na sala de tratamento, as amostras recolhidas são colocadas no meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-equilibrado a 37 °C, a 6% de CO2 e 5% de O2, e levadas para o laboratório para pesquisa de espermatozoides e, posterior, processamento das mesmas. É importante que esta pesquisa seja feita de imediato para informar se é necessária a recolha de mais amostra, ou se já foi recuperado um número suficiente de células espermáticas. No caso de biópsia testicular, o fragmento testicular é, inicialmente, lavado para remoção dos coágulos de sangue e, posteriormente, dividido em porções muito reduzidas, com o auxílio de duas lâminas de bisturi, numa placa de Petri (Nunc®, Dinamarca). Esta maceração é realizada no estereomicroscópio (Nikon®, Japão), até que sejam obtidos fragmentos sem túbulos (Palermo et al., 2009a). De seguida, observa-se uma alíquota do macerado ao microscópio invertido (Nikon®, Japão), numa ampliação elevada para confirmar a presença de espermatozoides e centrifuga-se o restante, durante 10 minutos a 1200 rpm. Após remoção do sobrenadante, adiciona-se ao sedimento, o meio de incubação (Origio®, Dinamarca) equilibrado e ressuspendese. A amostra é incubada durante 4 horas na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C, ou durante 24 horas, se a punção for no dia seguinte. Caso não sejam encontrados espermatozoides após a maceração dos fragmentos testiculares, estes são centrifugados nas mesmas condições, e realiza-se nova pesquisa no centrifugado. Se houver um elevado número de espermatozoides, ou o dia da punção ainda não estiver definido, os espermatozoides ou o tecido testicular, podem ser criopreservados (Palermo et al., 2009a). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 72 5. Estimulação ovárica Com a evolução da medicina reprodutiva, foi possível obter maiores taxas de sucesso nos procedimentos de reprodução assistida, através da utilização de fármacos que permitissem a estimulação ovárica, para o desenvolvimento controlado de um maior número de folículos. Inicialmente, esta era induzida pela administração de citrato de clomifeno (CC). O mecanismo de ação do CC consiste na redução do feedback negativo exercido pelo estrogénio na secreção de GnRH, pelo hipotálamo, através da ligação aos recetores do estrogénio, impedindo, desta forma, que estes se liguem e atuem. Assim, há um aumento na produção de GnRH e, consequentemente, das hormonas hipofisárias (FSH e LH). Como a FSH tem um papel essencial no recrutamento folicular, a administração contínua de citrato de clomifeno permite que a quantidade desta gonadotrofina se mantenha acima do limite necessário para a indução do crescimento folicular. Deste modo, o desenvolvimento folicular ocorre de uma forma controlada durante o período pretendido (Hugues e Cédrin-Durnerin, 2009). O citrato de clomifeno é de fácil administração, de custo reduzido, altamente eficaz e seguro. No entanto, quando o tratamento com CC falha recorre-se à própria FSH, que era, inicialmente, proveniente da urina de mulheres grávidas ou na menopausa. Mais recentemente, começou a ser utilizada a FSH recombinante, que apesar de ter um custo mais elevado que a FSH extraída da urina, apresenta mais vantagens: evita contaminações víricas, é ilimitada e apresenta uma elevada pureza e especificidade (Hugues e Cédrin-Durnerin, 2009). A estimulação ovárica visa a superovulação, ou seja, o aumento do número de ovócitos libertados na ovulação (S.P.M.R., 2012) num único ciclo, de uma forma controlada, que possibilita a previsão do melhor dia para a punção folicular (Zhao et al., 2011). A ovulação ocorre 10 horas, com um desvio de mais ou menos 5 horas, após o pico de LH. A administração de agonistas ou de antagonistas de GnRH permite a inibição deste pico e, consequentemente, de uma ovulação prematura, em que a maturação folicular não se encontra, ainda, concluída. Deste modo, é possível minimizar o número de folículos perdidos e de ciclos cancelados por ovulação prematura (Zhao et al., 2011). Os agonistas de GnRH são um análogo desta hormona, mas com uma atividade e especificidade para os recetores superiores. Foram, inicialmente, desenvolvidos para o tratamento de anovulação, mas após a descoberta da sua capacidade paradoxal para FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 79 7. Avaliação da qualidade ovocitária A ICSI e a eventual necessidade de desnudação revelaram um fator subestimado de infertilidade, nomeadamente, a qualidade do ovócito (Mansour, 1998). A remoção das células do cumulus e da corona radiata fornece a oportunidade única de avaliar a morfologia do ovócito antes da fertilização e, em particular, a sua maturidade nuclear (Rienzi et al., 2012). Foi especulado que algumas irregularidades morfológicas, facilmente acessíveis pela observação ao microscópio ótico, podem refletir um potencial de desenvolvimento comprometido, revelando-se, assim, úteis na seleção de ovócitos competentes antes da fertilização (Rienzi et al., 2012). Contudo, não há uma correlação entre os critérios de identificação da qualidade ovocitária e as respetivas consequências a nível da fertilização, do desenvolvimento embrionário e do sucesso da eventual gravidez (S.P.M.R., 2012). Para ultrapassar esta questão foi realizado um workshop em Istambul, Turquia, em 2010, para o estabelecimento de critérios e terminologia comuns para classificar os ovócitos e também zigotos e embriões, que seria aplicado, rotineiramente, em qualquer laboratório de procriação medicamente assistida (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). É de notar que os consensos estabelecidos foram os primeiros para ovócitos e embriões, pelo que devem ser revistos em intervalos regulares de tempo (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Ficou acordado que, idealmente, o ovócito apresentaria uma estrutura esférica, com 110-120 µm de diâmetro, envolvida por uma zona pelúcida uniforme (15-20 µm), com um citoplasma uniforme, translúcido e livre de inclusões e com um espaço perivitelino com o 1º glóbulo polar de tamanho apropriado (Figura 22) (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). O tamanho do ovócito é crucial para que este continue a meiose. No entanto, este pode apresentar variações sem consequências a nível da fertilização ou do desenvolvimento embrionário, à exceção de um diâmetro de, aproximadamente, 200 µm. Neste caso, os ovócitos são considerados gigantes (Figura 23) e são tetraploides, não devendo ser microinjetados (Rienzi et al., 2012) devido ao risco de aneuploidias (S.P.M.R., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 80 7.1. Avaliação do complexo cumulus-ovócito Embora haja pouca evidência que confirme a relação entre o potencial de desenvolvimento embrionário e o complexo cumulus-ovócito (COC), segundo os consensos de Istambul, a sua classificação deve ser realizada pela atribuição do grau 0 ou grau 1. Um bom COC obtém o grau 1 e é definido como tendo o cumulus expandido e uma corona radiante (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Se o COC for denso, com o ovócito imaturo, obtém o grau 0 (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A maioria dos ovócitos aspirados após estimulação ovárica exibe, pelo menos, uma variação relativamente à morfologia descrita como a ideal. Estas anomalias ovocitárias podem ser divididas em extracitoplasmáticas e intracitoplasmáticas (Rienzi et al., 2012). Figura 22 - Ovócito ideal, com estrutura esférica, rodeado por uma zona pelúcida uniforme, com um citoplasma, também, uniforme, translúcido e livre de inclusões e com o espaço perivitelino com o 1º glóbulo polar visível às 5 horas. Ampliação 200×. Adaptado de Rienzi et al., 2012. Figura 23 - Um ovócito gigante (direita) e outro de tamanho normal (esquerda). De notar que não é visível o 1º glóbulo polar no ovócito gigante. Adaptado de Rienzi et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 81 7.2. Anomalias extracitoplasmáticas Dentro das extracitoplasmáticas encontram-se as anomalias da zona pelúcida, do espaço perivitelino e do 1º glóbulo polar (Rienzi et al., 2012). Alterações na zona pelúcida podem dever-se a problemas na padronização desta matriz glicoproteica, podendo esta apresentar-se densa, deformada (Figura 24a), com espessura variável ou até exibir ruturas, que se encontram associadas a baixas taxas de fecundação (S.P.M.R., 2012). A ZP pode, também, encontrar-se invadida por células da granulosa ou estar ausente. No entanto, devido à variabilidade entre pacientes, só são consideradas anómalas, zonas pelúcidas com cor ou espessura excecionais (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A presença de inclusões no espaço perivitelino (Figura 24c e Figura 24d) foi considerada uma anomalia e deve ser registada, apesar de haver poucos dados que comprovem o seu efeito na fecundação. Contudo, não é necessário referir a quantidade das mesmas. A ausência do EPV deve, também, ser anotada (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Um espaço perivitelino excecionalmente grande pode resultar de uma extrusão excessiva de citoplasma durante a formação do 1º glóbulo polar ou ser indício de maturidade avançada, afetando, deste modo, a taxa de fertilização e a qualidade embrionária (Rienzi et al., 2012). A extrusão do 1º glóbulo polar deve ser confirmada nos ovócitos não inseminados, sempre que possível (pode não ser viável para os ovócitos inseminados por FIV). O 1º glóbulo polar pode estar fragmentado (Figura 24c e Figura 24d) ou dividido (S.P. M.R., 2012). O seu tamanho só deve ser anotado, se excecionalmente grande (Figura 24b). Os ovócitos que apresentem o 1º glóbulo polar anormalmente grande, não devem ser inseminados devido ao risco de aneuploidia (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 82 7.3. Anomalias intracitoplasmáticas Embora seja expectável um citoplasma homogéneo, heterogeneidades ligeiras não podem ser consideradas anomalias, pois estão associadas a variabilidade (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). No entanto, dismorfismos severos na textura citoplasmática encontram-se relacionados com falhas no desenvolvimento embrionário e no potencial de implantação (Rienzi et al., 2012). O citoplasma pode-se encontrar dividido dentro da mesma zona pelúcida (Figura 25a) (Rienzi et al., 2012; S.P.M.R., 2012), não tendo sido, ainda, reportada nenhuma gravidez com estes ovócitos (Rienzi et al., 2012). Uma das anomalias intracitoplasmáticas mais importantes é a presença de agregados do retículo endoplasmático liso tubular (sER) (Figura 25e), que compromete, significativamente, o desenvolvimento destes ovócitos (Rienzi et al., 2012). Se estes agregados forem múltiplos, ou superiores a 18 µm encontram-se associados a anomalias fetais (S.P.M.R., 2012). a c b d Figura 24 - Anomalias extracitoplasmáticas. a) Ovócito MII oval com ZP também oval e EPV relativamente normal. Ampliação 200×. b) Ovócito em MII com o 1º glóbulo polar gigante, 5-6 vezes maior que o normal. c) Ovócito em MII com vários fragmentos celulares no espaço perivitelino, praticamente indistinguíveis do 1º glóbulo polar, que se encontra fragmentado. d) Ovócito em MII com o 1º glóbulo polar fragmentado e com granulosidade significativa no espaço perivitelino. Dois corpos de inclusão são claramente visíveis no centro do ovócito. Adaptado de Rienzi et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 83 A granulosidade deve ser distinguida de clusters de organelos, que são detetados em qualquer microscópio, ao contrário da granulosidade que é, apenas, detetada num microscópio de contraste de fase. Os clusters (Figura 25d) estão associados a um menor potencial de implantação, enquanto a granulosidade (Figura 25b), quando acentuada, encontra-se associada a uma reduzida taxa de fecundação e de desenvolvimento embrionário (S. P. M. R., 2012). Os corpos refrateis (CR) são vesículas de lipofuscina (pigmento resultante da eliminação incompleta de detritos celulares). Estes podem ser múltiplos e apresentam tamanhos variáveis (Figura 25c). CR grandes encontram-se associados a baixas taxas de fecundação e de desenvolvimento embrionário (S.P.M.R., 2012). A presença de poucos e pequenos vacúolos (5-10 µm de diâmetro), originados pela absorção de fluido externo, não deve apresentar consequências em termos biológicos. Por outro lado, a presença de vacúolos grandes (com mais de 14 µm de diâmetro) está associada a falhas na fecundação e no desenvolvimento embrionário (Figura 25f). Os vacúolos que permanecem após a singamia podem interferir com os planos de clivagem e, assim, diminuir a taxa de blastocistos (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Uma viscosidade aumentada está associada a menores taxas de fecundação e de desenvolvimento embrionário, possivelmente, devido à dificuldade de movimento dos organelos e dos pronúcleos. Na injeção intracitoplasmática de espermatozoides, se o canal de microinjeção persistir, há uma reduzida probabilidade de implantação (S.P.M.R., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 84 Figura 25 - Anomalias intracitoplasmáticas. a) Dois ovócitos dentro da mesma ZP (citoplasma dividido). Ampliação 400×. b) Ovócito MII com granulosidade citoplasmática e ZP com espessura variável. Ampliação 400×. c) Ovócito MII com CR grande no citoplasma. Ampliação 400×. d) Ovócito MII com cluster de organelos. Notar que é diferente de granulosidade citoplasmática. A zona pelúcida apresenta uma forma irregular. e) Ovócito em MII com agregados de sER no citoplasma. Espaço perivitelino aumentado e 1º glóbulo polar fragmentado. Ampliação a 400×. f) Ovócito com um único vacúolo grande, que ocupa quase metade do ooplasma. Ampliação 200×. Adaptado de Rienzi et al., 2012. a c e b d f FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 85 8. Inseminação artificial A inseminação artificial (IA) envolve a recolha, o tratamento e a inseminação da amostra seminal em diferentes regiões do sistema reprodutor feminino, sendo classificada de acordo com estes locais. A mais comum é a inseminação na cavidade uterina e denomina-se inseminação intrauterina (IIU). Pode, também, ter a designação de intravaginal, intracervical e ainda intratubárica, se a inseminação for na vagina, no canal cervical e nas trompas, respetivamente (Bayer et al., 2002). A inseminação intrauterina teve a sua primeira publicação em 1962 (S.P.M.R., 2012; ESHRE, 2009), e desde então tem sofrido inúmeras inovações tanto a nível da preparação do sémen, como da monitorização do período pré-ovulatório e da indução da ovulação (ESHRE, 2009). Apesar de não ser considerada uma técnica de reprodução assistida, a IIU é aplicada num largo espetro de situações (ESHRE, 2009; ICMART e WHO, 2009). É aconselhada em caso de infertilidade idiopática, na presença de fator cervical (Bayer et al., 2002), de endometriose ligeira, de vaginismo, de fator masculino moderado, (apenas pequenas alterações nos parâmetros seminais) e de disfunções sexuais. É, também, aplicada quando é necessário o recurso a esperma de dador (inseminação heteróloga) (ESHRE, 2009; S.P.M.R., 2012). A IIU pode incluir estimulação ovárica ou ser realizada num ciclo natural (Bayer et al., 2002). A estimulação ovárica permite o desenvolvimento de um maior número de folículos e, consequentemente, o aumento do número de ovócitos libertados na ovulação, de uma forma controlada (S.P.M.R., 2012). Quando os folículos apresentam um desenvolvimento adequado, a ovulação é induzida pela administração de hCG (Bayer et al., 2002; ESHRE, 2009). A IIU pode ser realizada em diferentes alturas do período peri-ovulatório. É, no entanto, recomendado que esta ocorra entre as 32-36 horas após a administração da hCG (S.P.M.R., 2012; ESHRE, 2009). No dia da inseminação, é necessária a colheita da amostra seminal para a preparação da mesma, no centro onde irá ser realizada a IIU (Bayer et al., 2002). O processamento do esperma é crucial para o sucesso da inseminação artificial, uma vez que permite a separação dos espermatozoides morfológica e funcionalmente normais e com motilidade progressiva dos espermatozoides imóveis e com anomalias. Excluem-se, também, as partículas seminais que induzem contrações uterinas, como FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 86 as prostaglandinas. Por outro lado, inseminações com sémen não processado estão associadas a infeções pélvicas (ESHRE, 2009). Após a colheita, a amostra permanece numa estufa a 37 °C até se encontrar totalmente liquefeita. A amostra seminal é, então, analisada para confirmar se a motilidade, concentração e morfologia são adequadas para uma inseminação intrauterina, uma vez que os parâmetros seminais de diferentes amostras de um mesmo indivíduo apresentam uma grande variabilidade (WHO, 2010). Confirmados estes valores, procede-se ao processamento do esperma com recurso a gradientes de densidade e à técnica de swim-up, como descrito na secção “Preparação da amostra seminal” na página 68. Após o swim-up recolhe-se o sobrenadante para uma seringa (B. Braun, Alemanha) e, antes da inseminação, observa-se uma alíquota da amostra a inseminar para uma segunda análise, bastante breve, da motilidade e da concentração dos espermatozoides. A IIU tem uma maior taxa de sucesso quando são utilizados mais de 5 milhões de espermatozoides móveis. No entanto, este número depende da percentagem de espermatozoides com morfologia normal (Badawy et al., 2009). Para a inseminação intrauterina é introduzido um espéculo na paciente para uma prévia análise do canal cervical. A amostra processada, que se encontra na seringa (B. Braun, Alemanha), é então introduzida lentamente num cateter (Gynétics®, Bélgica), que está inserido na cavidade uterina através do canal cervical (Bayer et al., 2002). Como os espermatozoides são depositados na cavidade uterina, não passam pelo muco cervical e evita-se, assim, a sua retenção nesta barreira física. É eliminada, também, a exposição ao ambiente acídico e nocivo vaginal. Deste modo, é possível a obtenção de um maior número de espermatozoides, com boa motilidade próximo do ovócito (Brinsden, 2005). A deteção da implantação é realizada entre o 12º e 14º dia, após a injeção de hCG, pelo doseamento da hormona β-hCG na corrente sanguínea (Esfandiari et al., 2005; Rinehart, 2007). O resultado é positivo se for igual ou superior a 25 mIU/mL (American Pregnancy Association, 2013). A gravidez é confirmada com uma ecografia, pela presença de um saco gestacional, entre a 6ª e 7ª semana de gestação (Bayer et al., 2002; Knopman et al., 2010). A taxa de sucesso da IIU, por ciclo, com estimulação ovárica, encontra-se entre os 520% e depende de vários fatores, como a idade da mulher, a duração e tipo de infertilidade, o número de folículos desenvolvidos e a qualidade da amostra seminal (Bayer et al., 2002; S.P.M.R., 2012). A inseminação intrauterina sem estimulação FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 87 ovárica não apresenta um aumento significativo na taxa de gestação (Bayer et al., 2002; ESHRE, 2009). Contudo, a estimulação ovárica induz, com frequência, a ovulação de mais de um ovócito, aumentando, assim, a probabilidade de gestação múltipla (ESHRE, 2009). A idade da paciente tem muita influência na taxa de sucesso de uma inseminação intrauterina, sendo, em mulheres acima dos 40 anos de idade, cerca de 1/3 da obtida em mulheres até aos 35 anos (S.P.M.R., 2012). A taxa de gravidez, por ciclo, é de 16% em mulheres com idade inferior a 35 anos e de 4,4% em mulheres com idade igual ou superior a 35 anos (Ikechebelu e Okeke, 2007). Devido à diferente qualidade da amostra seminal entre a maioria dos pacientes e dos dadores, existe uma discrepância entre as taxas de nascimentos obtidos a partir de IIU homóloga e heteróloga, nomeadamente, esta é de 9,1% para os primeiros e de 13,7%, para os últimos (Ferraretti et al., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 88 9. Fertilização in vitro A fertilização in vitro (FIV) é uma técnica de reprodução assistida que repete o processo natural do ser humano. Foi introduzida há três décadas e aplica-se quando tratamentos prévios por inseminação artificial falharam, na presença de obstrução ou ausência de trompas, em caso de disfunção ovárica moderada a severa (Galán et al., 2008; Gianaroli et al., 2012) e de fator masculino não grave (Galán et al., 2008). É a técnica mais eficiente no tratamento de infertilidade (ESHRE, 2009). A FIV compreende vários passos, entre os quais, a estimulação ovárica, a punção folicular, a preparação da amostra seminal, a inseminação e a transferência dos embriões (Bayer et al., 2002). Existem, pelo menos, cinco pré-requisitos para que a FIV seja bem-sucedida: o Obtenção de ovócitos maduros; o Obtenção de espermatozoides de qualidade; o Utilização de meios de cultura adequados para ovócitos, espermatozoides, para a fecundação e para os embriões; o Transferência segura dos embriões para a cavidade uterina; o Boa preparação para a implantação e manutenção do embrião pós-implantação (Zhao et al., 2011). A estimulação ovárica é feita pela administração de gonadotrofinas injetáveis para o desenvolvimento folicular, seguindo-se da injeção da gonadotrofina coriónica humana (hCG), para indução da ovulação. Com este procedimento, é possível promover o desenvolvimento folicular e a maturação de um número elevado de ovócitos (muitas vezes superior a 10), num único ciclo, de uma forma controlada, que possibilita a previsão do melhor dia para a punção folicular (Zhao et al., 2011). A taxa de sucesso da FIV encontra-se diretamente relacionada com o número de folículos aspirados (Bayer et al., 2002), ou seja, a punção de vários ovócitos aumenta a probabilidade de gravidez num menor número de ciclos de fertilização (Zhao et al., 2011). Quando o desenvolvimento folicular é adequado, é injetada a hormona coriónica humana que induz a maturação dos ovócitos para que estes possam ser fecundados (Bayer et al., 2002). A punção dos ovócitos é realizada 36 horas após a injeção de hCG, sendo, posteriormente, necessária, a preparação do endométrio para a implantação. Na noite após a punção folicular é administrada progesterona à paciente, para que o FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 95 Figura 27 - Sistema de micromanipulação. Em a) é possível observar o microscópio invertido num suporte anti-vibração, os dois micromanipuladores e microinjetores. As seringas não são, no entanto, nítidas. A micropipeta holding encontra-se do lado esquerdo e a micropipeta ICSI do lado direito. 1h – micropipeta holding; 1I – micropipeta ICSI; 2h – Microinjetor da micropipeta holding; 2I – Microinjetor da micropipeta ICSI; 3h – Micromanipulador da micropipeta holding; 3I – Micromanipulador da micropipeta ICSI; 4 – placa de aquecimento. b) Ampliação das duas micropipetas. http://rmaess.tripod.com/IMAGENS.htm 3h 2I 2h 3I 4 1h 1I a b 1h 1I não se encontre coberto com óleo, uma vez que a evaporação pode diminuir a temperatura e aumentar a osmolaridade da solução (Barnes, 2009). O fuso meiótico dos ovócitos é sensível à temperatura, e, por isso, estes devem ser sempre manipulados a 37 °C para prevenir dissociações cromossómicas e consequente aneuploidia (Barnes, 2009). Deve, portanto, ser utilizado um sistema de aquecimento da platina do microscópio invertido, de modo a manter os ovócitos e, também, os embriões a 37 °C. Sem esta fonte de calor a placa arrefece, precipitadamente, em apenas 5 minutos, para níveis inferiores ao da temperatura do laboratório (Barnes, 2009). É importante que estas condições se mantenham constantes para evitar alterações nos resultados (Barnes, 2009). Estereomicroscópio Os gâmetas são transferidos da placa de cultura para a placa de micromanipulação e, voltam para a placa de cultura, no fim da microinjeção. Deste modo, é importante que o estereomicroscópio esteja numa bancada com superfície aquecida, para manter os gâmetas a 37 °C, e com uma incubadora com humidade e atmosfera controladas (Barnes, 2009). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 96 10.2. Injeção intracitoplasmática de espermatozoides - ICSI A ICSI ultrapassa todas as barreiras naturais e passos preliminares (de penetração e fusão) para a fertilização, provando ser uma técnica de reprodução assistida eficaz e aplicável em diversas situações, que previamente eram um impedimento absoluto de fertilização (Palermo et al., 1992). Pode, assim, ser utilizada em casos de oligoastenozoospermia e criptozoospermia, por necessitar de, apenas, um reduzido número de espermatozoides (Mansour, 1998; Palermo et al., 2012). As taxas de fertilização e de gestação independentes da qualidade espermática fazem da ICSI a técnica mais eficiente na presença de fator masculino de infertilidade (Mansour, 1998; Tournaye e Cohen 2012). A ICSI permite a avaliação da qualidade e maturidade ovocitária, podendo ser utilizada com sucesso, no tratamento de casais cujos tratamentos anteriores por fertilização in vitro convencional falharam (de Vos, 2000). A microinjeção revelou-se, também, mais eficaz quando há um reduzido número de ovócitos, ou estes apresentam reduzida qualidade (Mansour, 1998; Palermo et al., 2012). Durante a criopreservação de ovócitos, ocorre a exocitose prematura dos grânulos corticais, que induzem o endurecimento da zona pelúcida e, consequentemente, impedem a fertilização. Deste modo, os ovócitos criopreservados só podem ser fertilizados com recurso à injeção intracitoplasmática de espermatozoides (Lucena et al., 2006; Palermo et al., 2012). O diagnóstico genético pré-implantação (DGPI) exige que o embrião não apresente espermatozoides ligados à zona pelúcida para evitar o risco de contaminação de ADN. Este pré-requisito é apenas cumprido pela ICSI, por ser a única TRA que só utiliza um espermatozoide por ovócito (Palermo et al., 2009b). Dos indivíduos infetados com o vírus de imunodeficiência humana (HIV), 75% encontra-se na idade reprodutiva. Com o desenvolvimento de novas terapias, a SIDA passou de uma síndrome fatal a uma doença crónica e, assim, muitos pacientes infetados têm interesse em iniciar uma família. Há, no entanto, a preocupação de transmissão tanto vertical como horizontal do vírus (Palermo et al., 2009b). A inseminação intrauterina com espermatozoides processados por centrifugação com gradientes de densidade e, posterior swim-up, foi utilizada no tratamento de casais em que o parceiro masculino se encontrava infetado pelo HIV-1. Contudo, a ICSI é mais adequada por evitar, virtualmente, a interação dos ovócitos com o sémen, reduzindo o risco de exposição viral. Existe, também, um aumento considerável na taxa de FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 97 sucesso de ICSI relativamente à IIU, sendo, deste modo, necessário um menor número de tentativas para alcançar a gravidez (Palermo et al., 2009b). A injeção intracitoplasmática de espermatozoides pode, também, ser utilizada em caso de infertilidade masculina por fatores imunológicos, ou seja, quando anticorpos antiespermatozoides se encontram presentes (Mansour, 1998; Palermo et al., 2012). Homens com azoospermia, que previamente não podiam ter filhos biológicos, podem recorrer à microinjeção de espermatozoides maduros extraídos (Palermo et al., 2009b) do testículo ou do epidídimo (Tournaye e Cohlen, 2012). Em caso de azoospermia não obstrutiva (NOA), em que a ausência de espermatozoides se deve a falhas no mecanismo de produção dos mesmos, há uma taxa de recuperação de espermatozoides média de 50% (Tournaye e Cohlen, 2012) por biópsia testicular (Palermo et al., 2009b). Assim, pacientes com NOA podem ser tratados com sucesso com recurso a TESE, desde que espermatozoides maduros sejam obtidos (Palermo et al., 2009b). A ICSI pode, também, ser recomendada em caso de obstrução do ducto ejaculador por recuperação de espermatozoides quer do epidídimo quer dos testículos (de Vos, 2000). No caso de azoospermia obstrutiva, a etiologia da obstrução dos canais deferentes (congénita ou adquirida) e o método de recolha dos espermatozoides não afetam a fertilização (Palermo et al., 2009b). Assim, as taxas de fertilização e de gestação obtidas com ICSI são independentes do método de recolha dos espermatozoides (Palermo et al., 2012), sendo possível a conceção e paternidade em casais com todas as formas do fator masculino de infertilidade (Palermo et al., 2009a). A seleção dos espermatozoides para ICSI baseia-se, principalmente, na motilidade e na morfologia que estes apresentam. No entanto, estas características não excluem espermatozoides com danos no ADN. Verificou-se que a percentagem de espermatozoides com morfologia normal e com danos no ADN era maior em indivíduos inférteis, do que nos controlos férteis (Nasr-Esfahani et al., 2011). Como os espermatozoides contribuem com, aproximadamente, metade do genoma para o embrião, a seleção de um espermatozoide com a cromatina intacta para ICSI deveria ser obrigatória, de modo a prevenir falhas na fertilização ou no desenvolvimento embrionário, abortos ou doenças na descendência (Nasr-Esfahani et al., 2011). Foi proposto por Bartoov em 2002, um novo método de avaliação, em tempo real, da morfologia dos organelos de espermatozoides móveis (MSOME), pela observação num microscópio invertido, a uma ampliação superior a 6000× (Silva et al., 2012). É, deste modo, possível avaliar o núcleo do espermatozoide (forma e cromatina), o tamanho do acrossoma, a presença ou ausência de vacúolos, a região pósacrossomal, o colo, as mitocôndrias e a cauda, de uma forma detalhada e em tempo FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 98 real (Nasr-Esfahani et al., 2011). O MSOME permite, assim, correlacionar a morfologia dos espermatozoides com danos no ADN (Silva et al., 2012). A presença de vacúolos na cabeça do espermatozoide revelou ser o fator preditivo mais relevante. Os vacúolos estão relacionados com erros na compactação da cromatina ou com a desnaturação e fragmentação do ADN, afetando, deste modo, o desenvolvimento embrionário (Silva et al., 2012). O MSOME conduziu ao desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozoides de elevada ampliação (IMSI) (Silva et al., 2012). A IMSI permite a seleção de espermatozoides com um núcleo morfologicamente normal antes da injeção, podendo melhorar as taxas de fertilização, a qualidade embrionária, a taxa de desenvolvimento até à fase de blastocisto, as taxas de implantação e de gestação e a probabilidade de descendência normal. A injeção intracitoplasmática de elevada ampliação parece, também, diminuir de forma significativa a taxa de abortamento (Silva et al., 2012), tendo demonstrado melhores resultados que a ICSI. Contudo, a IMSI é bastante demorada e para prevenir danos adicionais no ADN, provavelmente devido a um aumento do número de vacúolos, deve ser realizada à temperatura ambiente, para que um número adequado de espermatozoides seja selecionado antes da inseminação a 37 °C (Nasr-Esfahani et al., 2011). 10.3 Procedimento de microinjeção Tal como na FIV convencional, na ICSI é também necessária a estimulação ovárica da mulher, que se processa de forma idêntica em ambas as técnicas. No entanto, enquanto na FIV tradicional os ovócitos são inseminados com as células do cumulus ao seu redor, na ICSI é necessária a desnudação dos ovócitos para remoção da maior quantidade das células do complexo cumulus-corona antes da fertilização. Este processo permite determinar a maturidade nuclear e a morfologia citoplasmática com maior rigor e precisão, facilitando, também, o manuseamento dos gâmetas femininos durante a microinjeção (de Vos, 2000). A desnudação é realizada 3 horas após a punção folicular, durante o período de pré-incubação até ICSI. Este período permite que os ovócitos atinjam a maturidade citoplasmática, devido à não sincronização entre esta e a maturidade nuclear (Rienzi e Ubaldi, 2009), conduzindo ao aumento da taxa de fertilização. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 99 A desnudação é feita pela combinação da ação enzimática da hialuronidase (Origio®, Dinamarca) e da força mecânica exercida pela aspiração com a pipeta de desnudação (Vitrolife®, Suécia), como descrito na “Desnudação de ovócitos”, na página 76. Os ovócitos desnudados são observados para a avaliação do seu grau de maturidade no microscópio invertido (Nikon®, Japão). A maturação remete para a ausência da vesícula germinal e extrusão do primeiro glóbulo polar, indicando que o ovócito se encontra em metafase II e, portanto, preparado para a fertilização. Posteriormente, os ovócitos são, novamente, incubados na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha), a 37 °C, O2 a 5% e CO2 a 6%, até à microinjeção. Só os ovócitos maduros são selecionados para a microinjeção (de Vos, 2000; Mansour, 1998), sendo os imaturos submetidos a maturação in vitro na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C. Durante o período de pré-incubação, é realizada a colheita da amostra seminal, que é processada de forma semelhante à utilizada na técnica de fertilização in vitro convencional, descrita em “Preparação da amostra seminal”, na página 68. Antes da microinjeção observa-se uma alíquota da amostra processada para confirmar a concentração, motilidade e morfologia dos espermatozoides da mesma. Parâmetros como a concentração e morfologia dos espermatozoides e a presença de anticorpos anti-espermatozoides não afetam a taxa de sucesso da ICSI (de VOS, 2000), contudo a microinjeção com espermatozoides imóveis apresenta uma reduzida taxa de fertilização (Mansour, 1998). Assim, se nenhum espermatozoide móvel for encontrado após o processamento da amostra seminal, ressuspende-se o pellet sobre si mesmo e adiciona-se uma alíquota desta suspensão à placa de microinjeção (Figura 19) (Mansour, 1998). Estes gâmetas devem ser submetidos ao HOS (teste de hiposmolaridade) (de Vos, 2000), antes da microinjeção, para selecionar os espermatozoides viáveis (Sitzmann et al., 2008). O teste de hiposmolaridade avalia a integridade membranar dos espermatozoides sem qualquer dano para os mesmos, permitindo, assim, microinjetar os espermatozoides viáveis sem comprometer o sucesso da fertilização (Jeyendran, 2003). Se não forem encontrados espermatozoides viáveis no ejaculado, estes devem ser colhidos dos testículos por TESE, de acordo com o procedimento descrito em “Métodos de recolha de espermatozoides”, na página 70. No entanto, se estes também forem imóveis são, igualmente submetidos ao teste de hiposmolaridade, numa gota de meio hipotónico na placa de microinjeção. A ICSI com espermatozoides selecionados com HOS apresenta elevadas taxas de fertilização, de implantação e de gestação (Nars-Esfahani et al., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 100 Preparação da placa de microinjeção Cerca de 15 minutos antes da microinjeção deve-se preparar a placa para a mesma. São colocadas pequenas gotas com 5-10 µL de meio com tampão (Vitrolife®, Suécia) equilibrado a 37 °C na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha), à direita da placa de Petri (Nunc®, Dinamarca), mas afastado das bordas. O número de microgotas depende do número de ovócitos a injetar, devendo haver sempre mais microgotas que ovócitos, para permitir a lavagem das micropipetas. O número de ovócitos, em simultâneo, na placa de microinjeção deve ser, no máximo, 5. À esquerda da placa, preparam-se duas gotas de PVP (polivinilpirrolidona, ou abreviadamente povidona) (Origio®, Dinamarca), que são espalhadas com uma micropipeta (Gilson®, EUA), de modo a ficarem bastante alongadas e onde irão ser adicionados, posteriormente, os espermatozoides (Figura 28). Por fim, adiciona-se um volume suficiente de óleo (Vitrolife®, Suécia) para cobrir completamente todas as gotas, de modo a manter um ambiente ótimo para os gâmetas durante a micromanipulação. A placa (Nunc®, Dinamarca) é, posteriormente, incubada a 37 °C na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) durante, no máximo, 1 hora, para evitar alterações na osmolaridade. Microinjeção Antes de se iniciar a microinjeção, deve-se confirmar que a temperatura da platina do microscópio é a adequada e que todo o sistema de micromanipulação se encontra preparado. As micropipetas devem-se encontrar posicionadas e focadas corretamente, a b Figura 28 - Representação esquemática da placa de microinjeção preparada rotineiramente (a) e quando não se encontram espermatozoides móveis (b). A azul, encontram-se as gotas com PVP (Origio®, Dinamarca), a rosa as microgotas com meio tamponado (Vitrolife®, Suécia), a laranja a gota com os espermatozoides imóveis ou com a polpa testicular após TESE e a cinzento, o meio hipotónico. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 101 Figura 29 - Imobilização do espermatozoide. http://biogenecs.com.br/infert_icsi.htm mas não com muita antecedência, para evitar a exposição prolongada das mesmas ao ar, uma vez que o óleo pode ficar demasiado viscoso (Barnes, 2009). Na altura da microinjeção, coloca-se uma alíquota da amostra seminal processada na gota de povidona (Origio®, Dinamarca) mais à periferia. Como o PVP é uma solução muito viscosa, os espermatozoides desaceleram o seu movimento, permitindo uma observação mais cuidada, dos mesmos e dos seus padrões cinéticos, em três dimensões (Palermo et al., 2012). Consequentemente, é possível a seleção mais precisa e eficaz dos espermatozoides para a fertilização. O uso de povidona permite, também, um bom controlo do espermatozoide na micropipeta ICSI e previne, ainda, que este adira à mesma (Mansour, 1998). De seguida, colocam-se os ovócitos desnudados maduros nas microgotas, um por microgota, no estereomicroscópio (Nikon®, Japão). A placa de microinjeção (Nunc®, Dinamarca), já com os ovócitos, é colocada na platina aquecida do microscópio invertido (Nikon®, Japão) e baixam-se as pipetas, previamente focadas. Foca-se a gota mais periférica de PVP (Origio®, Dinamarca), onde se encontram os espermatozoides, e seleciona-se um espermatozoide móvel com base na sua morfologia. Aspira-se um bocado de povidona (Origio®, Dinamarca) antes de aspirar o espermatozoide selecionado (Mansour, 1998), que é, então, descartado na 2ª gota de PVP (Origio®, Dinamarca). Nesta, procede-se à imobilização do mesmo, ou seja, a cauda é quebrada com a micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia), cessando por completo o seu movimento. A imobilização causa, também, a rutura da membrana citoplasmática do espermatozoide, sendo este fenómeno importante para a ativação do ovócito, por permitir que os componentes citosólicos espermáticos envolvidos na ativação do ovócito sejam libertados (Mansour, 1998). Há um aumento significativo nas taxas de fertilização após ICSI, quando a membrana citoplasmática da cauda é danificada (Mansour, 1998). Para a imobilização, baixa-se a micropipeta de microinjeção (Vitrolife®, Suécia) de modo a comprimir a cauda (na zona imediatamente a seguir à peça intermédia) contra o fundo da placa de microinjeção (Nunc®, Dinamarca) (Figura 29) e move-se a micropipeta para o lado, até se fazer um golpe na cauda, que imobilize o espermatozoide. Depois de imobilizado, este é aspirado, lentamente, pela cauda com a micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia), sendo, assim, transportado para a microgota onde se encontra o ovócito. Com recurso à micropipeta holding (Vitrolife®, Suécia), o ovócito é rodado suavemente, até ter o 1º glóbulo polar às 6 h ou 12 h. Esta posição tem sido utilizada FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 102 desde o primeiro trabalho de Palermo com ICSI (1992), por evitar danos no fuso meiótico (Mansour, 1998). Uma vez posicionado, o ovócito é submetido a uma ligeira sucção com a micropipeta holding (Vitrolife®, Suécia), para que permaneça fixo e não altere a sua posição durante a microinjeção. É fundamental que, antes de se microinjetar, se confirme que o plano equatorial do ovócito, a micropipeta holding (Vitrolife®, Suécia) e a ponta da micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia) se encontrem todos no mesmo plano de focagem, de modo a evitar erros na microinjeção e danos nas células. Com o espermatozoide posicionado na ponta da micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia), esta é direcionada para a zona pelúcida, de modo a perfurá-la na posição correspondente à das 3 h no relógio, sendo, então, introduzida no ovócito após a penetração da zona pelúcida (Figura 30). Verifica-se resistência por parte do oolema, que se estica conforme a micropipeta avança (Mansour, 1998). Contudo, quando a micropipeta (Vitrolife®, Suécia) atinge, aproximadamente, o centro do ovócito, a membrana citoplasmática deve romper-se, verificando-se, nesta altura, um fluxo repentino de citoplasma para dentro da micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia) (Palermo et al., 2009a). Aspira-se uma pequena quantidade de citoplasma ao longo da micropipeta de microinjeção (Vitrolife®, Suécia), rejeitando-se, posteriormente, tudo muito lentamente, incluindo o espermatozoide, no ooplasma. Esta aspiração do citoplasma promove a ativação do ovócito (Mansour, 1998) e permite que o espermatozoide se encontre intimamente posicionado entre os organelos do ooplasma, o que ajuda a mantê-lo dentro do ovócito enquanto se remove a micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia) (Palermo et al., 2009a). Durante a microinjeção, deve-se ter o cuidado para não avançar demasiado no ooplasma e tocar no oolema do lado oposto ao da microinjeção (Mansour, 1998). O procedimento termina com a remoção da micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia) e posterior libertação do ovócito da micropipeta holding (Vitrolife®, Suécia), de forma lenta e controlada, de modo a evitar a fuga do espermatozoide pelo sulco feito com a micropipeta ICSI (Vitrolife®, Suécia) (Mansour, 1998). Há diferentes padrões de resposta do oolema à micropipeta de microinjeção: a rutura normal, quando é criada uma invaginação que rompe no centro do ovócito, a rutura repentina, caracterizada pela rutura membranar sem qualquer resistência à micropipeta e, por último, a rutura difícil quando a membrana não rompe, ou então, rompe apenas após muitas tentativas. O padrão de rutura é um indício da capacidade de sobrevivência e de fertilização do ovócito microinjetado, assim como da incidência FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 103 Figura 30 - Principais passos da injeção intracitoplasmática de espermatozoides. a) Posicionamento do espermatozoide na ponta da micropipeta ICSI e penetração da zona pelúcida às 3 h. b) Injeção do espermatozoide. A invaginação demonstra a resistência oferecida pelo oolema ao avanço da micropipeta. c) Deposição do espermatozoide no ooplasma. O espermatozoide encontra-se assinalado pela seta. a b c de digamia, que resulta de erros na divisão nuclear, não havendo a extrusão do segundo glóbulo polar (Mansour, 1998). Terminada a microinjeção, sobem-se as micropipetas (Origio®, Dinamarca) e coloca-se a placa de microinjeção (Nunc®, Dinamarca) na bancada aquecida onde se encontra o estereomicroscópio (Nikon®, Japão). Os ovócitos são então lavados num meio adequado pré-equilibrado e, posteriormente, transferidos para uma placa de 4 poços (Nunc®, Dinamarca) preparada na véspera, com o meio de incubação (Origio®, Dinamarca) pré-equilibrado e coberto com óleo (Vitrolife®, Suécia). A placa é incubada a 37 °C, a 6% de CO2 e 5% de O2 até à avaliação da fertilização. Esta pode ser avaliada 16-18 horas após a microinjeção pela presença de 2 PN e de dois glóbulos polares intactos ou fragmentados (de Vos, 2000). A observação de dois pronúcleos é de extrema importância, porque uma fertilização anormal pode resultar em pré-zigotos com apenas 1 PN (2,7% dos ovócitos inseminados), ou com 3 PN (3,2% dos ovócitos inseminados) (Palermo et al., 2009b). Como estes (tanto 1 PN como 3 PN) apresentam um potencial semelhante aos prézigotos com 2 PN para o desenvolvimento embrionário e aparentam ter boa qualidade, é necessária a confirmação da existência de 2 PN para se poder selecionar o embrião com a certeza de que não houve nenhum erro durante a fertilização (de Vos, 2000). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 104 11. FIV versus ICSI As taxas de sucesso globais de FIV e ICSI variam significativamente e raramente excedem os 30 e 23%, respetivamente (Kashir et al., 2012). Contudo, em 2008, a nível europeu, a taxa de gravidez com FIV, por aspiração e por transferência foi de 28,5% e 32,5%, respetivamente e para ICSI, as mesmas, foram de 28,7% e 31,9%, respetivamente (Ferraretti et al., 2012). Verifica-se, no entanto, uma variação significativa dos resultados clínicos com o país em que os tratamentos se processam (Ferraretti et al., 2012). Embora a principal indicação para ICSI tenha sido, originalmente, o tratamento do fator masculino de infertilidade, o seu uso tornou-se comum (Elder e Dale, 2011), sendo utilizada na presença de fator masculino ligeiro, em casos de infertilidade idiopática (Ferraretti et al., 2012) e em ciclos com dador de esperma ou de ovócitos (Elder e Dale, 2011). Verificou-se, assim, uma tendência a nível mundial para ICSI, tendo correspondido a 69% dos ciclos a fresco, em 2008, na Europa (Ferraretti et al., 2012). Em Portugal, em 2010, 70% dos ciclos iniciados recorreram à injeção intracitoplasmática de espermatozoides, tendo-se verificado com esta técnica, uma taxa de gestação, por aspiração de 24,1% e por transferência, de 27,8%. No mesmo ano, após FIV convencional, as taxas de gestação, por aspiração e por transferência foram de 26,6% e de 29,7%, respetivamente. Os dados referentes a 2011 ainda não se encontram disponíveis, mas espera-se, contudo, uma inversão desta tendência para ICSI com os novos critérios de referência estabelecidos pela OMS em 2010 (Murray et al., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 111 a b c Figura 32 - Pré-zigotos observados 17 ± 1 h após a inseminação. a) Pré-zigoto observado 18 h após ICSI, a uma ampliação de 400×. Os 2 PN estão centrados e justapostos no citoplasma e apresentam, aproximadamente, o mesmo tamanho. Existe discrepância no número e no tamanho dos CPN entre os dois pronúcleos, o PN à direita demonstra menos CPN e maiores que o da esquerda. Verificam-se alguns detritos no EPV, que é ligeiramente aumentado. b) Pré-zigoto observado 16 h após FIV, a uma ampliação de 400×. Os PN são mais pequenos que o normal e não se encontram exatamente no centro do citoplasma. Os CPN são, também, pequenos e encontram-se alinhados na região de justaposição dos pronúcleos. Este zigoto foi transferido e implantou-se com sucesso. c) Prézigoto com os dois glóbulos polares e os dois pronúcleos justapostos, no entanto de tamanhos diferentes. Estes apresentam CPN pequenos, que diferem tanto em número como no alinhamento entre os dois PN. Ampliação de 200×. Adaptado de Papale et al., 2012. entre si, podendo, no entanto, o PN feminino ser ligeiramente menor (Papale et al., 2012). A presença de pronúcleos com um diâmetro inferior ao normal, 17 horas após a inseminação pode ser um indício de imaturidade ovocitária, ou de anomalias nos gâmetas, que induzem um atraso na fertilização. Pode, no entanto, ocorrer a implantação após a transferência destes zigotos (Papale et al., 2012). Diferenças significativas entre o tamanho dos dois pronúcleos (> 4 µm) e a presença de micronúcleos, ou de PN fragmentados, são consideradas anomalias e estão associadas a aberrações cromossómicas e à perda do potencial de desenvolvimento embrionário (Papale et al., 2012). A Figura 32 apresenta alguns exemplos da variabilidade do tamanho dos pronúcleos. Distância entre os pronúcleos Nos pré-zigotos humanos, o áster dos centrossomas espermáticos organiza os microtúbulos que controlam a aposição dos PN e definem o plano da primeira divisão celular durante a singamia. Movimentos e rotações subsequentes dos pronúcleos facilitam a distribuição das mitocôndrias e o alinhamento da cromatina, que são essenciais para o correto desenvolvimento (Papale et al., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 112 Em 80% dos pré-zigotos que apresentam os PN afastados, 17 horas após a inseminação, há um atraso ou a paragem do desenvolvimento embrionário (Papale et al., 2012). Localização dos pronúcleos no citoplasma O plano da primeira divisão celular é influenciado pela posição dos PN no citoplasma, pois atravessa o eixo por eles definido (Scott, 2003). Na maioria dos pré-zigotos em que os PN se localizam no centro, a primeira divisão ocorre regularmente, levando a um desenvolvimento embrionário normal. Contudo, se estes se encontrarem na periferia do citoplasma, ocorre, frequentemente, uma clivagem anormal e a interrupção do desenvolvimento (Papale et al., 2012). Como a formação e a rotação dos PN são processos dinâmicos, a posição destes no citoplasma varia significativamente com o tempo (Figura 33), sendo a sua posição final, a determinante do plano de clivagem (Papale et al., 2012). Figura 33 - Pré-zigoto com alterações na distribuição dos PN pelo citoplasma e dos CPN, com o tempo, nomeadamente, 11,7 h (a), 15,4 h (b), 18,3 h (c) e 28,3 h (d) após ICSI. Ampliação de 400×. Adaptado de Papale et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 113 Alinhamento dos pronúcleos relativamente aos glóbulos polares Com a extrusão do 2º glóbulo polar, o PN masculino desloca-se, de forma a ficar frente a frente com o feminino e com o centrossoma no meio. Assim, o eixo por eles definido é paralelo ao eixo dos glóbulos polares (Figura 34). Como referido anteriormente, os PN podem sofrer rotações adicionais, podendo passar a definir um eixo perpendicular ao definido pelos GP (Figura 35). Todos estes movimentos e rotações podem causar a formação de uma translucidez periférica no citoplasma dos ovócitos fertilizados, designada halo. Não existem, contudo, dados conclusivos sobre a relevância desta no sucesso da fertilização in vitro (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011; Papale et al., 2012). Se os pronúcleos não se encontrarem justapostos, no centro do citoplasma, nem alinhados, relativamente aos glóbulos polares na altura da avaliação da fertilização, pode ocorrer uma clivagem anormal do embrião, com consequências no seu desenvolvimento (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011; Papale et al., 2012). Glóbulos polares afastados são indício de um desenvolvimento embrionário precário, possivelmente, devido a uma orientação incorreta dos PN, que conduz a uma clivagem irregular, ou à presença de fragmentação, que pode provocar uma elevada turbulência no citoplasma (Papale et al., 2012). Figura 34 - Diagrama de um pré-zigoto, à esquerda, a evidenciar o eixo definido pelos pronúcleos paralelo ao eixo definido pelos glóbulos polares e à direita, um pré-zigoto com os PN justapostos e centrados. O eixo definido pelos pronúcleos é paralelo ao eixo definido pelos glóbulos polares. Cada PN tem um número diferente de CPN, que diferem, também, no alinhamento entre eles. Num dos PN, estão alinhados na região de justaposição e no outro encontram-se dispersos. É visível um halo com algumas inclusões. Adaptado de Papale et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 114 Figura 35 - Diagrama de um pré-zigoto a evidenciar um eixo definido pelos pronúcleos perpendicular ao eixo definido pelos glóbulos polares, à esquerda. À direita, encontra-se um pré-zigoto com os PN justapostos e centrados a definirem um eixo perpendicular ao definido pelos glóbulos polares. Os CPN apresentam tamanho aumentado e encontram-se alinhados na junção entre os PN. Ampliação de 200×. Adaptado de Papale et al., 2012. Alinhamento dos corpos precursores do nucléolo Como os CPN estão alinhados com a cromatina, um alinhamento correto destes reflete uma cromatina alinhada (Papale et al., 2012). Por time-lapse imaging verificou-se que os CPN são muito dinâmicos e que o seu padrão altera num curto período de tempo. Assim, durante o ciclo celular, os CPN alteram o seu número, tamanho e distribuição nos pronúcleos, desaparecendo antes da singamia e do início da primeira divisão celular (Papale et al., 2012). Esta variação no tamanho e no número está relacionada com a fusão dos CPN para a formação do nucléolo (Scott, 2003), havendo, deste modo, um aumento progressivo do seu tamanho e, simultaneamente, a redução do seu número com o tempo. Assim, a presença de CPN pequenos e de tamanhos variáveis, pode ser indício de um nucléolo não funcional, com a consequente diminuição, ou então ineficaz, síntese de rRNA (Papale et al., 2012). Deste modo, a observação do padrão dos CPN, em ambos os pronúcleos, na avaliação do potencial de desenvolvimento embrionário, deve englobar o seu tamanho, número e simetria. Esta pode, também, ter alguma influência no prognóstico do tratamento de reprodução humana assistida, uma vez que a assimetria, neste padrão, entre os 2 PN, encontra-se associada a ciclos celulares anormais. Contudo, se os CPN não estiverem alinhados em ambos os PN, não há consequências no desenvolvimento (Papale et al., 2012). A morfologia dos CPN é influenciada pela idade da paciente, existindo, também, alterações temporais dependentes da TRA utilizada, nomeadamente FIV ou ICSI. Assim, a classificação do padrão PN/CPN deve ser realizada atendendo à técnica utilizada, à hora a que esta ocorreu e às características da paciente (Papale et al., 2012). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 115 Citoplasma O citoplasma dos pré-zigotos deve ser homogéneo, apesar do seu impacto no desenvolvimento embrionário ser, ainda, desconhecido. Embora alguns estudos tenham verificado que anomalias citoplasmáticas severas prejudicavam o potencial de desenvolvimento e de implantação do embrião, não, existem, ainda, dados conclusivos que comprovem a sua veracidade (Papale et al., 2012). Dismorfismos menores, como detritos no espaço perivitelino ou a presença de corpos refrateis no citoplasma, não foram, também, correlacionados como um mau prognóstico. Contudo, é importante que estas observações sejam registadas de modo a conseguir obter mais dados para posteriormente confirmar se existe, de facto, uma relação com o potencial de desenvolvimento e de implantação (Papale et al., 2012). Por outro lado, os pré-zigotos que apresentem discos sER (agregados de retículo endoplasmático liso tubular) não devem ser transferidos, por estarem associados a erros de imprinting e a morte fetal ou de recém-nascidos (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Uma desorganização citoplasmática, como clusters de organelos, está associada a um pH citoplasmático baixo e a um aumento de ATP. Este dismorfismo citoplasmático é hereditário no zigoto e encontra-se associado a baixas taxas de gestação e de implantação, apesar da qualidade de clivagem embrionária não ser afetada (Papale et al., 2012). Presença de vacúolos A presença de poucos e pequenos vacúolos não se encontra associada a consequências em termos biológicos. Contudo, vacúolos com mais de 14 µm de diâmetro podem interferir com os planos de clivagem dos ovócitos fertilizados, reduzindo a taxa de desenvolvimento até à fase de blastocisto, não devendo, por isso, ser transferidos (Papale et al., 2012). . FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 116 13.2. Avaliação do embrião em fase de clivagem Como o desenvolvimento embrionário respeita uma sequência de eventos ordenados e temporalmente específicos, a taxa a que este ocorre e as características morfológicas que os embriões apresentam todos os dias, determinadas horas após a inseminação conferem as duas principais medidas da avaliação do desenvolvimento embrionário (Machtinger e Racowsky, 2013). Contudo, é importante conseguir correlacionar estas caraterísticas observadas ao microscópio com o potencial de implantação do embrião (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Com este intuito, o workshop realizado em Istambul, em 2010, definiu os critérios de classificação de embriões (Tabela 5), com base no número e na simetria dos blastómeros, no grau de fragmentação e na presença de multinucleação (Prados et al., 2012). Número de blastómeros Em 1981, Edwards demonstrou que os embriões humanos normais progridem de uma forma previsível ao longo do tempo, desde a fase de 1 célula até à de 16 células, sendo possível o estabelecimento de padrões específicos relativamente ao número de blastómeros que os embriões devem apresentar a cada dia (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Os embriões que clivem mais lentamente que o previsto apresentam um potencial de implantação menor, assim como os embriões com uma taxa de clivagem muito rápida que são, provavelmente, também, anormais (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A tabela 4 apresenta as horas, após a inseminação, a que os embriões devem ser observados, o tipo de observação que deve ser realizado e o desenvolvimento embrionário esperado, segundo os consensos de Istambul (2011). De todas as características morfológicas tipicamente avaliadas nos embriões em fase de clivagem, o número de células parece ser o indicador mais importante da viabilidade embrionária (Machtinger e Racowsky, 2013). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 117 Tabela 4 – Horas de observação dos ovócitos fertilizados e dos embriões e respetivo desenvolvimento expectável. Adaptado de Machtinger e Racowsky, 2013. Tipo de observação Horas após inseminação (h) Desenvolvimento expectável Fertilização 17 ± 1 Fase pronuclear Singamia 23 ± 1 50% em singamia (até 20% com 2 células) Divisão precoce 26 ± 1 ICSI 28 ± 1 FIV 2 células Embrião em D2 44 ± 1 4 células Embrião em D3 68 ± 1 8 células Embrião em D4 92 ± 2 Mórula Embrião em D5 116 ± 2 Blastocisto Simetria A simetria define o tamanho e forma dos blastómeros de um embrião em fase de clivagem (Machtinger e Racowsky, 2013). Uma elevada regularidade no tamanho dos blastómeros de um embrião no 2º dia de desenvolvimento encontra-se associada a um aumento da taxa de gestação após os tratamentos de reprodução assistida. Por outro lado, nas fases iniciais do desenvolvimento embrionário, associa-se a discrepância na simetria entre os blastómeros a uma redução do potencial de implantação e à presença de multinucleação (Hardarson et al., 2012). Se as primeiras divisões mitóticas do embrião ocorrerem de forma síncrona e simétrica, são formadas sucessivamente, 2, 4, 8 e 16 células, de tamanho semelhante. Contudo, se as clivagens não forem síncronas, o embrião apresenta células com 2 ciclos celulares distintos, sendo expectável blastómeros com tamanhos diferentes, sem consequências a nível do desenvolvimento embrionário (Hardarson et al., 2012). A Figura 36 indica os padrões de clivagem específicos (a assimetria entre os blastómeros não é um indício de fraca qualidade embrionária) e os não específicos para cada número de células. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 118 Fragmentação Um fragmento é definido como uma estrutura citoplasmática extracelular anucleada, rodeada por uma membrana, com um diâmetro inferior a 45 µm, num embrião com dois dias e inferior a 40 µm, num embrião com três dias (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A presença de fragmentos pode resultar de anomalias no metabolismo ou na divisão celular (Machtinger e Racowsky, 2013), não estando, contudo relacionada com uma redução do potencial de implantação, se representar menos de 10% do volume total do embrião (fragmentação suave) (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). O grau de fragmentação é definido como moderado, se ocupar entre 10-25% do volume do embrião e severo, se esta percentagem for superior a 25%, por apresentar consequências na taxa de implantação e de gestação (Prados et al., 2012). Deste modo, a fragmentação é considerada um parâmetro essencial na avaliação do desenvolvimento embrionário (Prados et al., 2012), não sendo, contudo, necessário Embriões com 3 células Embriões com 4 células Embriões com 5 células Embriões com 6 células Embriões com 7 células Embriões com 8 células Blastómeros de tamanho semelhante Blastómeros de tamanho diferente Figura 36 - Ilustração dos padrões de clivagem específicos e não específicos. O verde-escuro indica os padrões de clivagem específicos da fase de desenvolvimento do embrião e o verde-claro indica os padrões não específicos dos embriões em fase de clivagem. Adaptado de Hardarson et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 119 precisar a localização da mesma, uma vez que os fragmentos se podem deslocar no embrião (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A Figura 37 apresenta embriões com os três tipos de fragmentação (suave, moderada e severa). Multinucleação A multinucleação foi definida como a presença de mais de um núcleo, incluindo micronúcleos, nos blastómeros (Figura 38). É suficiente que esta se verifique em apenas um blastómero, para que todo o embrião seja considerado multinucleado (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). A presença de multinucleação deve ser confirmada 44 ± 1 horas após a inseminação (S.P.M.R., 2012) e os embriões multinucleados devem ser rejeitados, pois apresentam mais anomalias cromossómicas e, consequentemente, um maior risco de abortamento espontâneo, comparativamente com os embriões mononucleados (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Verifica-se uma predominância da mesma em embriões com blastómeros assimétricos, relativamente a embriões com um padrão específico de clivagem (Prados et al., 2012). . Figura 37 - Embriões com diferentes níveis de fragmentação. a) Embrião com dois dias, constituído por 4 blastómeros de tamanho semelhante, com menos de 10% de fragmentação. b) Embrião com 4 blastómeros de tamanho diferente e com 15-20% de fragmentação. c) Embrião com 4 blastómeros de tamanho diferente, com cerca de 40% de fragmentação. Adaptado de Prados et al., 2012. a b c Figura 38 - Embrião com 2 blastómeros assimétricos, em que o maior apresenta 4 núcleos e o menor 2. Adaptado de Hardarson et al., 2012. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 120 A Tabela 5 representa o sistema de classificação de embriões em fase de clivagem, acordado no workshop, em Istambul (2011). No entanto, as características referidas representam apenas um padrão mínimo, não restringindo os laboratórios a avaliações adicionais (Embryology A.S.i.R.M. a. E.S.I.G.o., 2011). Deste modo, aspetos morfológicos sem impacto conclusivo no desenvolvimento embrionário, como a granulosidade citoplasmática, a aparência dos blastómeros e a presença de vacúolos, podem ser registados para estudos futuros (Machtinger e Racowsky, 2013). Tabela 5 – Sistema de classificação de embriões em fase de clivagem definido pelos Consensos de Istambul, 2011. Adaptado de Machtinger e Racowsky, 2013. Grau atribuído Classificação Descrição 1 Bom 10% fragmentação Tamanho celular específico da fase Sem multinucleação 2 Razoável 10-25% fragmentação Maioria das células com o tamanho específico Sem multinucleação 3 Mau Fragmentação severa (>25%) Tamanho celular não específico Multinucleação FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 127 15. Diagnóstico Genético Pré-implantação O diagnóstico genético pré-implantação (DGPI) foi executado pela primeira vez, com sucesso, em 1990, por Handyside, sendo utilizado como prática clínica para a prevenção da transmissão de doenças genéticas graves à descendência. O DGPI é, assim, recomendado a casais portadores, ou com descendência ou familiares afetados por anomalias num único gene, ou cromossómicas (Hens et al., 2013). Devido à ausência de alguns dos elementos responsáveis pelo controlo do ciclo celular nas primeiras divisões mitóticas dos embriões humanos (Dekel-Naftali et al., 2013), as aberrações cromossómicas numéricas são comuns nesta fase inicial de desenvolvimento, sendo responsáveis pela reduzida taxa de sucesso dos ciclos de fertilização in vitro. Na tentativa de superar esta questão, foi desenvolvida uma variante do DGPI, o screening genético pré-implantação, de modo a confirmar a presença de aneuploidias nos embriões antes da sua transferência (Iwarsson et al., 2011). Ao contrário do DGPI, o screening é apenas indicado quando existe uma grande probabilidade do embrião apresentar anomalias cromossómicas, nomeadamente, quando a paciente tem mais de 35 anos de idade e em caso de sucessivos insucessos de ciclos de FIV ou de abortamento recorrente (Iwarsson et al., 2011; Hens et al., 2013). Uma vez que após o teste genético, apenas os embriões normais são transferidos para o útero, o DGPI é uma boa alternativa ao diagnóstico pré-natal, que envolve a interrupção da gravidez, ou o nascimento de uma criança afetada pela doença em causa, caso este teste confirme a presença da anomalia genética no feto (Elder e Dale, 2011; Jiang et al., 2012). Antes de requerer o DGPI, os casais devem receber um aconselhamento genético adequado, para avaliar o risco de descendência afetada e serem bem informados sobre a anomalia genética e as respetivas consequências (Jiang et al., 2012; Iwarsson et al., 2011). O ciclo de fertilização in vitro é iniciado normalmente, com a estimulação ovárica e posterior punção folicular, seguindo-se a fertilização in vitro e, por fim, a cultura embrionária, como descrito previamente. É, no entanto, recomendada a microinjeção intracitoplasmática de espermatozoides em detrimento da fertilização in vitro convencional para evitar a contaminação com ADN de espermatozoides supranumerários e de células da granulosa, quando se recorre à reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) (Iwarsson et al., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 128 O DGPI envolve a biópsia e o posterior diagnóstico celular, devendo, a primeira ser realizada por um embriologista e a última por um geneticista (Elder e Dale, 2011). A biópsia celular pode ser de diferentes tipos de células:  primeiro ou ambos os glóbulos polares;  um ou dois blastómeros de embriões em fase de clivagem (que apresentem entre 6 e 8 células);  células da trofoectoderme de blastocistos (Elder e Dale, 2011; Hens et al., 2013). A análise de cada um dos tipos de células apresenta vantagens e desvantagens, tendo em consideração a informação fornecida, a qualidade das células analisadas e o dano causado às restantes células e posterior desenvolvimento das mesmas (Munné, 2009). Para a biópsia, é necessária a abertura da zona pelúcida e posterior aspiração celular (Iwarsson et al., 2011). A abertura da zona pelúcida pode ser realizada por meios químicos, com a solução ácida de Tyrode (pH 2), mecânicos (disseção parcial) ou por laser (Iwarsson et al., 2011), como realizada para a eclosão assistida. A biópsia dos glóbulos polares é feita após a extrusão dos mesmos para o espaço perivitelino (Jiang et al., 2011) e pode ser realizada sequencialmente, ou em simultâneo (Iwarsson et al., 2011). É o tipo de biópsia menos invasivo, não apresentando consequências para o desenvolvimento embrionário (Hens et al., 2013), e permite ultrapassar as objeções éticas relacionadas com a biópsia de embriões (Elder e Dale, 2011). É, também, muito vantajosa quando se recorre ao screening genético, uma vez que a maioria das aneuploidias ocorre na meiose dos ovócitos (Hens et al., 2013). Por outro lado, a biópsia dos glóbulos polares fornece apenas informação sobre o material genético de origem materna, não sendo possível o diagnóstico de anomalias genéticas após a fase de zigoto, que afetam 30% dos embriões (Munné, 2009). Como, geralmente há mais ovócitos que embriões por ciclo, este procedimento fica mais caro do que a biópsia embrionária (Hens et al., 2013). A biópsia unicamente do 1º GP deve ser realizada após a ICSI, uma vez que este indica a posição do fuso meiótico (Munné, 2009). Devido ao risco de crossing-over durante a meiose I nos ovócitos, é recomendada a biópsia de ambos os glóbulos polares (Elder e Dale, 2011). O método de biópsia mais utilizado é a de um ou de dois blastómeros de embriões em fase de clivagem. Os blastómeros contêm material genético de ambos os progenitores, permitindo, assim, a deteção de anomalias, tanto de origem materna, como paterna (Iwarsson et al., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 129 Contudo, um único embrião pode apresentar simultaneamente blastómeros cromossomicamente normais e anormais (Li et al., 2005). A este fenómeno dá-se a designação de mosaicismo, e encontra-se presente em 25-30% dos embriões em fase de clivagem (Munné, 2009). Assim, a análise de um único blastómero nesta fase do desenvolvimento embrionário pode não ser representativa dos restantes, conduzindo a erros de interpretação dos resultados (Hens et al., 2013). Por outro lado, a remoção de dois blastómeros numa fase em que o embrião apresenta apenas entre 6 a 8 células é muito prejudicial para o seu futuro desenvolvimento e, consequentemente, para o sucesso dos tratamentos de fertilização in vitro (Iwarsson et al., 2011). Deste modo, apesar de ser a mais comum, a biópsia de blastómeros permanece ainda um desafio, precisando de ser otimizada (Jiang et al., 2012). Por último, pode ser realizada a biópsia de células da trofoectoderme de blastocistos, que a despeito de ainda não ser muito aplicada clinicamente, estudos recentes obtiveram boas taxas de gestação (Hens et al., 2013). Na fase de blastocisto é possível remover entre 5 a 10 células da trofoectoderme. Assim, apesar de ainda haver algum mosaicismo nesta fase, o maior número de células analisado permite uma identificação mais precisa dos embriões portadores de aneuploidias (Hens et al., 2013). Uma vez que a massa celular interna não é perturbada (Jiang et al., 2012), este tipo de biópsia tem um reduzido impacto na viabilidade do embrião, permitindo uma maior taxa de implantação (Jiang et al., 2012). Contudo, a percentagem de embriões a atingir a fase de blastocisto encontra-se por volta dos 60% (Jiang et al., 2012) e muitos dos embriões que não conseguem alcançar esta fase in vitro, poderiam consegui-lo se já tivessem sido transferidos para o útero (Hens et al., 2013). Uma das principais limitações da biópsia de blastocistos era o tempo. A transferência tem de ocorrer até seis dias após a fertilização para não prejudicar o embrião. Assim, o tempo para a análise é muito curto, sendo necessária a congelação dos blastocistos, que reduz, significativamente, a viabilidade dos mesmos. Contudo, com os novos métodos de criopreservação, nomeadamente, a vitrificação, esta questão está a ser ultrapassada. A vitrificação proporciona o tempo necessário para a análise das células da trofoectoderme e para uma discussão ponderada dos resultados com os casais, sem prejudicar a taxa de sucesso do tratamento (Jiang et al., 2012; Hens et al., 2013). Após a biópsia procede-se à análise genética, que pode ser realizada por hibridização fluorescente in situ (FISH – Fluorescence in situ Hybridization) ou pela reação em cadeia da polimerase (Iwarsson et al., 2011). A análise por FISH é realizada para anomalias cromossómicas, enquanto o PCR é utilizado para o diagnóstico de anomalias num único gene (Iwarsson et al., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 130 Para a análise por FISH, as células biopsadas são lisadas para a extração do ADN e posterior hibridização com as sondas de ADN, que são específicas para cada casal. Para a determinação do sexo do embrião, são utilizadas sondas específicas para os cromossomas X e Y e para anomalias cromossómicas estruturais, são utilizadas sondas específicas para os cromossomas envolvidos. No screening de aneuploidias as sondas utilizadas são específicas para os cromossomas 13, 18, 21, X, Y, 16 e 22, que se encontram mais frequentemente envolvidos neste tipo de anomalias (Iwarsson et al., 2011). Para o PCR, a célula biopsada é também lisada para extração do ADN e, posteriormente, submetida à reação em cadeia da polimerase, onde partes específicas do genoma são amplificadas em milhões de cópias, permitindo a sua análise. Há, contudo, o risco de contaminação, de falha aleatória da amplificação de um dos alelos (allele dropout), ou simplesmente a falha completa de amplificação. Estes riscos são acrescidos na análise de uma única célula, como por exemplo, de apenas um blastómero (Iwarsson et al., 2011). Como a análise com FISH só permite a análise de alguns cromossomas, tem sido desenvolvida a cariotipagem dos 23 pares de cromossomas por hibridização genómica comparativa (CGH – Comparative Genomic Hybridization) e arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism), que permitem a deteção de mutações génicas e de aneuploidias num único passo. Contudo, a informação obtida por esta técnica permite detetar predisposições para doenças comuns e características físicas, podendo levantar questões éticas (Jiang et al., 2012). Após o DGPI para a deteção de anomalias cromossómicas, e o screening de aneuploidias, a taxa de nascimentos, por punção, encontra-se próxima dos 16%. No caso de DGPI para doenças num único gene, esta taxa sobe para os 21% (Iwarsson et al., 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 131 16. Transferência de embriões A transferência dos embriões pode ser realizada a partir do segundo dia do desenvolvimento embrionário. Contudo, o dia mais adequado é dependente de fatores como o número de tentativas anteriores, a idade da paciente, a resposta ovárica e o número e qualidade dos ovócitos. Assim, em pacientes com um bom prognóstico, há um aumento na taxa de nados-vivos após transferência na fase de blastocisto (dias 5 e 6), comparativamente com a fase de clivagem (dias 2 e 3). Nestes casos, deve ser apenas transferido um único blastocisto, uma vez que a transferência de um número superior aumenta consideravelmente a taxa de gestação múltipla (A.S.R.M. e S.A.R.T., 2013). Por outro lado, numa amostra aleatória, ou em pacientes que apresentem um mau prognóstico, os embriões podem ser transferidos, tanto em fase de blastocisto, como de clivagem, não apresentando, as respetivas taxas de gestação e de nados-vivos diferenças significativas. No entanto, a probabilidade dos embriões não se desenvolverem até à fase de blastocisto nestas pacientes é elevada, apresentando, assim, um elevado risco de não haver nenhum embrião ao 5º dia para transferir (A.S.R.M. e S.A.R.T., 2013). Para que sejam obtidas boas taxas de sucesso nos ciclos de fertilização in vitro, não é suficiente a obtenção de ovócitos e de embriões de boa qualidade. É, também, necessária uma transferência eficiente, suave e não traumática dos embriões (Bongso, 1999). Os cateteres de transferência são constituídos por duas partes, a interior e a exterior. É muito importante que a interior, a que transporta o embrião, seja suave e arredondada, de modo a não ferir o endométrio e que apresente um diâmetro suficientemente grande, para a aspiração de blastocistos expandidos sem os danificar. Esta deve ser, também, precisa, para que a quantidade de meio aspirada juntamente com o embrião, seja a adequada (Bongso, 1999). A placa para a transferência dos embriões deve ser preparada com, pelo menos, 5 horas de antecedência, de modo a permitir que os meios estejam equilibrados. Num dos poços de uma placa de 4 poços (Nunc®, Dinamarca) é adicionado o meio (Vitrolife®, Suécia) para o carregamento do cateter de transferência e num segundo poço, o meio de cultura (Vitrolife®, Suécia), para a lavagem do cateter. Este meio depende da fase de desenvolvimento do embrião no dia da transferência. Assim, se a transferência for de embriões com 3 dias de desenvolvimento, de manhã, a placa é preparada de véspera com o meio de cultura mais complexo. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 132 Os embriões selecionados são transferidos para o meio de carregamento do cateter (Vitrolife®, Suécia) pré-equilibrado, 15 minutos antes da transferência. Os restantes, de acordo com o consentimento do casal, são criopreservados ou descartados. A placa de transferência (Nunc®, Dinamarca) é incubada a 37 °C, com O2 a 5% e CO2 a 6 %. O cateter de transferência (Wallace®, EUA) e uma seringa esterilizada de 1,0 mL (B. Braun, Alemanha) são colocados numa superfície aquecida na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha), a 37 °C até serem utilizados. Lavagem do cateter Antes de carregar o cateter (Wallace®, EUA), colocam-se os embriões (no máximo 3) próximos uns dos outros no meio de carregamento do cateter (Vitrolife®, Suécia), para facilitar a aspiração em simultâneo de todos os embriões, e confirma-se que o cateter interno (Wallace®, EUA) entra livremente no cateter exterior (Wallace®, EUA). De seguida, lava-se o cateter interior com o meio de cultura equilibrado (Vitrolife®, Suécia). Para a lavagem, carrega-se a seringa (B. Braun, Alemanha) aquecida com este meio de cultura (Vitrolife®, Suécia), que é depois incorporada no cateter de transferência (Wallace®, EUA), descartando-se o meio através deste. Posteriormente retira-se a seringa (B. Braun, Alemanha) e enche-se com ar. Volta-se a incorporá-la no cateter (Wallace®, EUA) e pressiona-se o pistão para remover qualquer vestígio de meio que possa ter permanecido no cateter. Entretanto, a paciente é encaminhada para a sala de transferência com a bexiga cheia, para permitir uma melhor visualização do útero na monitorização ecográfica. Quando a senhora se encontrar preparada, o laboratório é avisado e procede-se ao carregamento do cateter. Carregamento do cateter Para carregar o cateter (Wallace®, EUA), coloca-se a ponta deste no interior do poço onde estão os embriões, sem lhes tocar, e aspira-se uma pequena quantidade do meio (Vitrolife®, Suécia) para quebrar a tensão superficial que pode surgir na extremidade do cateter. De seguida, aspiram-se os embriões, com cuidado, para evitar o aparecimento de bolhas e de modo a que o volume de meio a envolver os embriões seja de, aproximadamente, 15 µL (Elder e Dale, 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 133 Transferência O cateter de transferência completo (interior e exterior) (Wallace®, EUA) é transportado para a sala de transferência, ainda, com a seringa (B. Braun, Alemanha) incorporada e protegido da luz. A saída do meio com os embriões do cateter é visível pelo aparecimento de uma mancha esbranquiçada brilhante no monitor ecográfico. Após a transferência e antes da remoção do cateter (Wallace®, EUA), pressiona-se o pistão da seringa (B. Braun, Alemanha) durante 30 a 60 segundos, para evitar que os embriões voltem para o cateter (Bongso, 1999). O cateter (Wallace®, EUA) é, então, levado para o laboratório, para confirmar que todos os embriões foram transferidos. Para isso, retira-se a seringa do cateter e deixase cair todo o seu conteúdo numa placa de Petri (Nunc®, Dinamarca), enquanto se verifica, ao estereomicroscópio (Nikon®, Japão), se nenhum embrião ficou retido. Carrega-se, novamente, a seringa (B. Braun, Alemanha) com o meio de cultura (Vitrolife®, Suécia) e descarta-se através do cateter, de modo semelhante à lavagem do mesmo, confirmando, sempre, se há algum embrião presente. Se houver, avisa-se na sala de transferência e procede-se a um novo carregamento do cateter (Wallace®, EUA), seguindo o mesmo procedimento. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 134 17. Criopreservação 17.1. Criopreservação de ovócitos A criopreservação de ovócitos apresenta inúmeras vantagens na área da medicina reprodutiva, principalmente, quando a perda da fertilidade pode ser prevista pela submissão a tratamentos de quimioterapia, ou em pacientes com falência ovárica prematura. Por outro lado, esta técnica evita a necessidade da sincronização entre o ciclo da dadora e o da recetora, sendo extremamente prática e conveniente nos programas de doação de ovócitos (Fuller e Paynter, 2009; Edgar e Gook, 2012). Na sociedade atual, o desejo e/ou a estabilidade de um casal para ter um filho surgem cada vez mais tarde, numa idade em que a fertilidade feminina e a qualidade ovocitária entraram, já, em declínio. A criopreservação de ovócitos permite o adiamento da maternidade, demonstrando, assim, um grande impacto na preservação da fertilidade (Fuller e Paynter, 2009). A criopreservação de gâmetas femininos apresenta, também, uma utilidade notável nos países onde a doação de gâmetas é ilegal ou existe um limite máximo de ovócitos a inseminar por ciclo (Rienzi et al., 2010). Por último, apesar da criopreservação de embriões (Fuller e Paynter, 2009; Singh e Mital, 2009) ultrapassar o problema dos embriões supranumerários, é ilegal em alguns países (Mukaida e Oka, 2012) e não permite que mulheres sem parceiro usufruem desta técnica. As pacientes com objeções éticas, pessoais ou religiosas à criopreservação de embriões, não podem, também, recorrer a esta técnica (Cao et al., 2009; Chian et al., 2009). Assim, a criopreservação de ovócitos revelou-se de extrema importância como alternativa à criopreservação de embriões, fornecendo uma solução para estes casos (Cao et al., 2009). O ovócito é uma das maiores células dos humanos (Fuller e Paynter, 2009; RodriguezWallberg. e Oktay, 2012) e devido ao seu grande volume, apresenta uma reduzida permeabilidade à água e aos agentes crioprotetores (CPA) (Rienzi et al., 2010). Deste modo, quando a temperatura começa a diminuir, a água fica retida no seu interior, ocorrendo a formação de gelo. A formação de cristais de gelo dentro do ovócito é prejudicial para o mesmo (Fuller e Paynter, 2009; Songsasen e Comizzoli, 2009), na medida em que provoca o endurecimento da zona pelúcida e danifica o citoesqueleto (Singh e Mital, 2009; Rodriguez-Wallberg e Oktay, 2012), o fuso meiótico e os FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 135 cromossomas (Singh e Mital, 2009; Rodriguez-Wallberg e Oktay, 2012; Rienzi, et al., 2004). Durante a descongelação, a temperatura relativamente elevada, também induz danos irreversíveis no ovócito. O choque osmótico que ocorre durante a rehidratação pode induzir a rutura da membrana levando à morte celular. Estas consequências podem resultar da despolimerização dos microtúbulos e do desalinhamento dos cromossomas, com o consequente risco de aneuploidia (Mukaida e Oka, 2012). Assim, os ovócitos são severamente afetados pelo processo de criopreservação, tanto na fase de congelação como na fase de descongelação (Songsasen, N. e Comizzoli, 2009). Contudo, com recurso a métodos de congelação lenta e controlada e de vitrificação têm sido obtidos bons resultados (Cao et al., 2009). A congelação lenta necessita de uma máquina de criopreservação, demora algumas horas e é difícil a eliminação de todos os danos causados pela formação intracelular de gelo (Mukaida e Oka, 2012). A vitrificação produz uma solidificação amorfa das células sem que ocorra a formação de gelo, tanto a nível intracelular como extracelular (A.S.R.M. e S.A.R.T., 2006), pela combinação de elevadas concentrações de crioprotetores com uma velocidade elevada de arrefecimento (Mukaida e Oka, 2012). Vitrificação Após a punção folicular, os ovócitos são desnudados com recurso a métodos enzimáticos (pela ação da enzima hialuronidase (Origio®, Dinamarca)) e mecânicos (por aspirações sucessivas com a pipeta de desnudação (Vitrolife®, Suécia)), como descrito na secção “Desnudação de ovócitos” na página 76. Posteriormente visualizam-se os ovócitos para confirmar o seu grau de maturidade. Os ovócitos que apresentem o 1º glóbulo polar extrudido, ou seja, que se encontrem maduros, são selecionados para vitrificar, ao contrário dos imaturos, que são incubados na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C, durante 24 horas, para maturação in vitro. A vitrificação deve ser realizada imediatamente após a desnudação e sempre entre 37 a 40 horas após a administração de hCG, uma vez que o tempo é um fator crucial na manipulação de ovócitos antes da inseminação (Parmegiani et al., 2008). Ao contrário dos zigotos e dos embriões, em fase de clivagem ou de blastocisto, os ovócitos estão parados em metafase II, sendo, por isso, muito mais sensíveis à cultura in vitro que estes. Deste modo, longos períodos de incubação antes da criopreservação podem, provavelmente, afetar a competência ovocitária. Adicionalmente, após a desnudação, os ovócitos encontram-se particularmente vulneráveis a condições subótimas in vitro (Rienzi et al., 2010). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 136 O método de vitrificação consiste, resumidamente, na imersão das células na solução de vitrificação e subsequente submersão em azoto líquido (LN2). Quando necessários, os ovócitos são removidos do LN2, descongelados e colocados numa solução de sacarose (Keskintepe et al., 2009). A exposição das células à solução de vitrificação é o passo mais importante deste método (Keskintepe et al., 2009). O arrefecimento diminui os processos químicos celulares, no entanto, a temperaturas muito inferiores a 0 °C, os efeitos que ocorrem na célula são dominados pela formação intracelular de cristais de gelo. Para evitar que estes se formem, é necessário um período de exposição aos CPA relativamente longo. Contudo, se este for demasiado longo, as células são afetadas pela toxicidade dos crioprotetores. Deste modo, o período de exposição ótimo tem de permitir uma vitrificação bem-sucedida, prevenindo a formação intracelular de gelo sem comprometer a viabilidade das células pela toxicidade dos CPA. As soluções de vitrificação mais comuns contêm como CPA permeável o etilenoglicol, o 1,2-propanediol (PROH), ou o dimetilsulfóxido (DMSO). Este último, apesar de eficiente, apresenta uma toxicidade muito elevada. Como CPA impermeável é utilizada sacarose (Mukaida e Oka, 2012). Todo o procedimento de vitrificação deve ser realizado entre os 25 e os 27 °C, exceto a descongelação, em que os meios utilizados se devem encontrar a 37 °C. Para evitar a formação de cristais de gelo, os ovócitos são, inicialmente, equilibrados numa solução diluída dos agentes crioprotetores permeáveis (Vitrolife®, Suécia), durante 5-15 minutos, numa estufa (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C. Após este período, estes são transferidos para a solução de vitrificação (Vitrolife®, Suécia), que contém sacarose a 0,5 M e os mesmos CPA que a solução diluída, mas com o dobro da concentração. Após 1 minuto nesta solução, os ovócitos são transferidos, com uma micropipeta (Cook®, EUA), com a menor quantidade possível desta solução, para a palheta de vitrificação (Vitrolife®, Suécia), que é selada e submergida rapidamente em azoto líquido (Lucena et al., 2006). Existem kits comerciais de vitrificação que utilizam sistemas abertos ou fechados. Nos primeiros há um contacto direto entre as células e o azoto líquido, o que não se verifica para os últimos, uma vez que a palheta, com as células, é selada antes de entrar em contacto com o LN2. Embora os sistemas abertos permitam uma taxa de arrefecimento superior, estes apresentam um risco de contaminação pelo azoto líquido, o que nos sistemas fechados é muito pouco provável (Rodriguez-Wallberg e Oktay, 2012; Cutting et al., 2009). A prevenção da contaminação nos sistemas abertos pode ser possível pela utilização de azoto líquido altamente purificado, ou esterilizado FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 143 um período de 30-60 minutos a 37 °C, na estufa de CO2, ao fim do qual a amostra pode ser utilizada. 17.3. Doação de gâmetas O programa de doação de gâmetas só é possível graças ao altruísmo dos dadores, que em benefício de casais estéreis, doam os seus gâmetas passando pelos processos de seleção e por algum desconforto, principalmente, no caso das dadoras, que são sujeitas a estimulação ovárica e posterior punção folicular. As técnicas eficientes de criopreservação contribuem, também, para o sucesso, com um melhor rendimento, dos programas de doação de gâmetas. Gâmetas masculinos A doação de espermatozoides foi introduzida no CPMA em 2012 e é a única possibilidade de procriação para pacientes com azoospermia, quando não são encontrados espermatozoides, ou espermátides após biópsia testicular, ou com anomalias genéticas graves. Gâmetas femininos A doação de ovócitos foi introduzida no CPMA em 2008 e é a única possibilidade de procriação para pacientes com falência ovárica prematura, ou ausência de ovário, devido a tratamento de cancro, com idade avançada ou com anomalias genéticas graves. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 144 17.4. Criopreservação de embriões A criopreservação de embriões permite a transferência de um reduzido número de embriões para a cavidade uterina e o armazenamento dos restantes. Deste modo, maximiza-se a eficácia dos ciclos de fertilização in vitro e resolve-se a questão do destino dos embriões excedentários (Loutradi et al., 2008). A criopreservação de embriões possibilita, também, o adiamento da transferência embrionária para ciclos posteriores, em pacientes com elevado risco de síndrome de hiperestimulação ovárica, sem reduzir a taxa de gestação (Loutradi et al., 2008). Os embriões podem ser criopreservados em fase de clivagem ou em fase de blastocisto por dois métodos principais, a congelação lenta e a vitrificação (Loutradi et al., 2008). Vitrificação A vitrificação de embriões é muito semelhante à de ovócitos. Utiliza os mesmos agentes crioprotetores, sempre a 37 °C (Desai et al., 2013), podendo apenas variar na concentração e nos tempos de exposição aos mesmos (Rienzi et al., 2010). Os embriões são, inicialmente equilibrados numa solução diluída de etilenoglicol e DMSO, durante 5-15 minutos. Após uma pequena contração, os embriões voltam ao seu volume normal e são transferidos para pequenas gotas da solução de vitrificação (Vitrolife®, Suécia), que é mais concentrada em etilenoglicol e em DMSO e contém sacarose a 0,5 M (Kuwayama, 2005). Após 1 minuto na solução de vitrificação (Vitrolife®, Suécia), os embriões são transferidos com uma micropipeta (Cook®, EUA) para cada palheta de vitrificação (Vitrolife®, Suécia), com o menor volume possível desta solução (Desai et al., 2013). A palheta de vitrificação com os embriões é selada e submersa em azoto líquido, sendo, posteriormente, transferida para a respetiva localização no contentor de azoto (Desai et al., 2013). Se a vitrificação for de blastocistos é necessário promover o colapso artificial do mesmo, para aumentar a sua sobrevivência, antes da exposição às soluções de vitrificação. Os blastocistos expandidos, que apresentam um blastocélio superior a mais de metade do volume do embrião, são colapsados com um laser díodo, de 1,48 μm. É importante que o local desta pequena abertura seja do lado oposto ao da massa FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 145 celular interna, para não a danificar (Desai et al., 2013). Na maioria dos blastocistos, o colapso é imediato, e, por isso, estes podem ser incubados logo de seguida, a 37 °C na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha), durante 5 minutos. Este período de incubação permite que estes se encontrem completamente colapsados no momento da vitrificação (Desai et al., 2013). Descongelação Todos os passos da descongelação devem ser realizados a 37 °C, sendo fundamental, que todos os meios e soluções utilizadas se encontrem equilibrados a esta temperatura, no momento em que entram em contacto com os embriões (Desai et al., 2013). Deste modo, na véspera da transferência, prepara-se uma placa de 4 poços (Nunc®, Dinamarca), onde se adiciona ao primeiro poço a solução de descongelação com sacarose a 0,25 M para minimizar o choque osmótico, e ao segundo poço, uma solução de descongelação mais diluída, com sacarose apenas a 0,125 M. Nos dois poços restantes, adiciona-se o meio de incubação (Origio®, Dinamarca) adequado à fase de desenvolvimento do embrião vitrificado, servindo o primeiro para a lavagem após as diluições e o último para incubação. A placa é incubada na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C, até à descongelação dos embriões (Desai et al., 2013). Inicialmente retira-se a palheta (Vitrolife®, Suécia) do contentor de armazenamento e esta é transportada para o laboratório, num recipiente com azoto líquido. A primeira etapa da descongelação consiste na remoção dos agentes crioprotetores através de duas lavagens nas soluções de descongelação. Assim, a palheta é colocada no 1º poço da placa (Nunc®, Dinamarca), havendo a saída imediata dos embriões para a solução com sacarose a 0,25 M. No entanto, antes de se descartar a palheta, deve ser confirmada a presença dos embriões no primeiro poço, ao estereomicroscópio (Nikon®, Japão). Os embriões permanecem nesta solução durante 2 minutos, sendo, posteriormente, transferidos para a solução de descongelação mais diluída (sacarose a 0,125 M), onde permanecem durante 3 minutos. Por fim, os embriões são lavados no meio de incubação (Vitrolife®, Suécia) que se encontra no 3º poço e incubados, durante 5 minutos, no 4º poço (Desai et al., 2013). No fim deste período são observados ao microscópio invertido (Nikon®, Japão), a uma ampliação de 400×, para verificar se houve algum dano devido à criopreservação. Considera-se que um embrião em fase de clivagem sobreviveu ao processo de criopreservação, se, pelo menos, metade dos blastómeros permanecer inalterada. Por FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 146 outro lado, a sobrevivência dos blastocistos é determinada pela sua morfologia, imediatamente, após a descongelação. Os blastocistos que apresentem uma cor escura, granulosidade e grandes áreas degeneradas, não são considerados viáveis (Desai et al., 2013). Após a descongelação, os embriões em fase de clivagem podem ser transferidos, ou permanecer em cultura in vitro até à fase de blastocisto, sendo transferidos, apenas, nesta fase. Os blastocistos são incubados durante 2 horas a 37 °C, com O2 a 5% e CO2 a 6%. Após este período, estes são novamente observados para avaliação da expansão do blastocélio, da organização da trofoectoderme e da presença de uma massa celular interna coesa (Desai et al., 2013). Os embriões devem ser fotografados logo a seguir à descongelação e antes da transferência, para confirmar a sua morfologia (Desai et al., 2013). Congelação lenta Antes da transferência, os embriões são observados e selecionam-se os que irão ser transferidos e os que irão ser criopreservados. Antes da congelação, regista-se a localização futura dos embriões no contentor de azoto, identificam-se as palhetas de congelação (CBS, Itália) com o respetivo código, adiciona-se azoto líquido na máquina de congelação (CryoLogic, Austrália) e confirmase que esta se encontra no programa adequado. Os meios utilizados na criopreservação devem encontrar-se equilibrados à temperatura ambiente, caso contrário tornam-se tóxicos para os embriões. Para a congelação lenta de embriões, estes devem ser equilibrados, inicialmente, em 1,2-propanediol a 1,5 M à temperatura ambiente e, posteriormente, numa solução com sacarose a 0,1 M. Os embriões equilibrados são transferidos para as palhetas de congelação (CBS, Itália) (Elder e Dale, 2011). As palhetas (CBS, Itália) são arrefecidas a uma taxa de -2 °C/min até atingirem os -6 °C, temperatura à qual permanecem durante 10 minutos. Entretanto, induz-se a formação dos primeiros cristais de gelo, apertando as extremidades do meio, que contém os embriões, com uma pinça arrefecida em azoto líquido. Após o seeding, o arrefecimento continua, mas a uma taxa de -0,3 °C/min, até se atingir -35 °C (Kuwayama, 2005). A esta temperatura a amostra já pode ser rapidamente arrefecida até os -196 °C sendo, posteriormente, transferida para o contentor de azoto líquido, onde permanecerá armazenada (Elder e Dale, 2011). FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 147 Descongelação Todos os passos da descongelação são realizados à temperatura ambiente. Assim, é fundamental, que todos os meios e soluções utilizados se encontrem equilibrados a esta temperatura no momento da sua utilização (Elder e Dale, 2011). A descongelação dos embriões consiste em duas fases. Inicialmente, e após a remoção das palhetas (CBS, Itália) do contentor de azoto líquido, estas são expostas à temperatura ambiente durante 40 segundos, para evitar que o plástico das palhetas quebre, sendo transferidas, de seguida, para um banho a 30 °C, durante 1 minuto (Elder e Dale, 2011). A segunda fase da descongelação consiste na remoção dos crioprotetores por diluição dos embriões em soluções de sacarose a 0,2 M e posteriores lavagens no meio de incubação, pré-equilibrado à temperatura ambiente (Elder e Dale, 2011). Antes de serem incubados a 37 °C, com O2 a 5% e CO2 a 6%, os embriões são observados ao microscópio invertido (Nikon®, Japão). Procede-se à classificação dos mesmos, comparando a morfologia que apresentam com a que apresentavam, antes do processo de congelação. Consideram-se viáveis, os embriões em fase de clivagem que possuam pelo menos metade dos blastómeros inalterados e os blastocistos com pouca degeneração e sem granulosidades e alterações de cor (Desai et al., 2013). Os embriões permanecem na estufa de CO2 (Heraeus®, Alemanha) a 37 °C até à transferência, que pode ser no próprio dia ou apenas quando o embrião se encontrar no 5º dia de desenvolvimento, no caso de terem sido criopreservados em fase de clivagem. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 148 18. Conclusão A infertilidade afeta um número cada vez maior de casais em todo o mundo. Como tentativa para contrariar este aumento, tem-se investido nas áreas da medicina e da biologia reprodutiva, o que permitiu que as técnicas de reprodução humana assistida sofressem uma rápida evolução ao longo dos anos, com o aumento das suas taxas de sucesso. A taxa de sucesso obtida após a inseminação intrauterina é muito dependente da idade da paciente, encontrando-se próxima dos 16%, em idades inferiores a 35 anos e dos 4,4%, se a idade for superior a 35 anos. A injeção intracitoplasmática de espermatozoides apresenta uma taxa de gestação, por transferência, de 31,9%, e a fertilização in vitro convencional de 32,5%. A ICSI é a técnica de eleição na presença de fator masculino de infertilidade severo. Contudo, tem-se verificado uma tendência para esta TRA (aproximadamente 70% dos ciclos iniciados na Europa), relativamente à FIV convencional, mesmo para o tratamento de fatores de infertilidade masculinos moderados. Espera-se, no entanto, uma inversão nesta tendência com a redução dos valores mínimos de referência da qualidade espermática determinados pela OMS, em 2010. A gestação múltipla é um dos principais problemas nas técnicas de reprodução humana assistida, afetando, tanto a saúde da descendência, como a vida de toda a família. Para minimizar a taxa de gestação múltipla, foram impostas leis que limitam o número de embriões que podem ser transferidos, por ciclo. Em 2008, a transferência de dois embriões foi a mais comum, representando 53,2% de todas as transferências na Europa e, aproximadamente, 70% em Portugal. A taxa de transferência de quatro embriões foi de apenas 2,1%, a nível europeu, não tendo sido transferidos mais de três embriões, por ciclo, em Portugal. Em 2010, em Portugal, a percentagem de transferências de dois embriões aumentou para os 73,5%, assim como a de apenas um embrião, que passou de 19%, em 2008, para 19,7%. O limite de embriões a transferir por ciclo afeta a taxa de gestação global. Para ultrapassar esta questão, ou seja, para tornar possível a transferência de um número muito reduzido de embriões sem afetar a taxa de gestação, tem-se investido numa avaliação eficiente da qualidade embrionária, com base nas suas características morfológicas. Esta avaliação segue os consensos determinados no workshop em Istambul, em 2010, cujo principal objetivo era a seleção do embrião com o maior FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 149 potencial de implantação, defendendo que uma avaliação eficiente deve iniciar-se nos gâmetas, passar pelo ovócito fertilizado e terminar, apenas, antes da transferência, quando os embriões se encontram em fase de clivagem ou de blastocisto. A transferência de um menor número de embriões conduz ao aumento do número de embriões excedentários, que podem ser criopreservados até à transferência em ciclos futuros. No entanto, muitos acabam por não ser transferidos, ficando armazenados por períodos indefinidos de tempo. Em alternativa a este problema, foram propostos outros destinos para estes embriões, nomeadamente, a possibilidade de rejeição, ou de doação para investigação ou para outros casais. Contudo, qualquer um destes destinos levantou questões éticas, havendo diferentes leis sobre os mesmos, de acordo com o país onde se procedeu a fertilização in vitro. A criopreservação de gâmetas proporciona inúmeros benefícios na medicina e biologia reprodutiva, sendo os principais a flexibilidade na preservação do potencial de fertilidade e nos programas de doação de gâmetas. O recurso a dadores de gâmetas, tanto de espermatozoides como de ovócitos, é bastante comum nos tratamentos de RHA, sendo a única possibilidade de procriação para pacientes com anomalias genéticas graves ou com azoospermia, no caso dos homens e falência ovárica prematura ou ausência de ovários, no caso da mulher. A reprodução humana assistida visa o bem-estar e a concretização pessoal dos pacientes, relativamente à capacidade de constituir uma família, procurando, para isso, recorrer a técnicas eficientes e, por vezes, inovadoras, que permitam a obtenção de descendência na presença de qualquer fator de infertilidade, ou até a prevenção do mesmo. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 150 19. Considerações finais O presente ano letivo consistiu num estágio curricular no centro de procriação medicamente assistida CEIE – Centro de Estudos de Infertilidade e Esterilidade, no Porto. Os principais objetivos do mesmo abrangiam o contacto e a familiarização com as diversas técnicas de reprodução humana assistida e também com todos os procedimentos de rotina envolventes, incluindo, o convívio com os pacientes e suporte e apoio dos mesmos, sempre que necessário. Assim, durante o presente ano letivo realizei diversas das práticas de rotina de um CPMA de forma autónoma, nomeadamente, a análise dos diversos parâmetros seminais determinados pela OMS, em diferentes tipos de amostras, o processamento da amostra seminal para todas as técnicas de RHA, incluindo, a criopreservação e descongelação de espermatozoides, a preparação dos meios para as diversas técnicas de reprodução humana assistida e, também, a pesquisa de espermatozoides em amostras de tecido testicular após TESE. Durante o estágio, tive, ainda, a oportunidade de auxiliar nas punções foliculares e, sob supervisão, detetar os ovócitos no fluido folicular e posteriormente lavá-los e, em caso de ICSI, desnudá-los e avaliar a sua maturidade. Acompanhei o desenvolvimento embrionário com a classificação diária dos mesmos, desde a avaliação da fertilização. Com ovócitos e embriões (tanto em fase de clivagem, como de blastocisto) não viáveis, pude praticar a técnica de vitrificação, para cada um destes, e o carregamento do cateter de transferência com embriões em diferentes fases de desenvolvimento. Com espermatozoides excedentários e ovócitos não viáveis pude treinar, também, a injeção intracitoplasmática de espermatozoides, incluindo a preparação do microscópio invertido, com a colocação das respetivas micropipetas, a seleção dos melhores espermatozoides e posterior quebra do seu flagelo, o posicionamento correto do ovócito e a própria injeção intracitoplasmática, com os devidos cuidados. Penso ter sido um ano com grande aproveitamento, uma vez ter permitido não só a familiarização, como também, a aquisição de experiência nas diversas técnicas de reprodução humana assistida num contexto real, com todas as variantes envolvidas, que num contexto apenas laboratorial não seria possível. FCUP Relatório de Estágio em Procriação Medicamente Assistida 151 20. Referências Abdelhafez, F., Bedaiwy, M., El-Nashar, S.A., Sabanegh, E. e Desai, N. (2009). Techniques for cryopreservation of individual or small numbers of human spermatozoa: a systematic review. Human Reproduction Update. 15: 153-164. Aksglaede, L., Link, K., Giwercman, A., Jorgensen, N., Skakkebaek, N.E. e Juul, A. (2013). 47, XXY Klinefelter syndrome: Clinical characteristics and age-specific recommendations for medical management. American Journal of Medical Genetics Part C-Seminars in Medical Genetics. 163C: 55-63. Alpha Scientists in Reproductive Medicine (A.S.i.R.M.) and ESHRE Special Interest Group of (E.S.I.G.o.) Embryology. (2011). The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26: 1270-1283. American Pregnancy Association. (2013, Janeiro). Human Chorionic Gonadotropin (hCG); The Pregnancy Hormone. 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