Avaliação do espetro de reação de um sistema de diagnóstico por vídeo rastreio de peixes zebra (Danio rerio) expostos a cinco tóxicos distintos

Avaliação do espetro de reação de um sistema de diagnóstico por vídeo rastreio de Peixes Zebra (Danio rerio) expostos a cinco tóxicos distintos. JOÃO ANTÓNIO SILVA AMORIM DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM TOXICOLOGIA E CONTAMINAÇÃO AMBIENTAIS João António Silva Amorim Avaliação do espetro de reação de um sistema de diagnóstico por vídeo rastreio de Peixes Zebra (Danio rerio) expostos a cinco tóxicos distintos. Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Toxicologia e Contaminação Ambientais submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador - Doutor Luis Filipe Pereira de Oliva Teles. Categoria - Professor e Investigador Auxiliar. Afiliação - Faculdade de Ciências da Universidade do Porto e Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental. Agradecimentos A realização deste trabalho não teria sido possível sem a ajuda e o envolvimento de inúmeras pessoas que foram imprescindíveis ao longo de mais de dois anos. Gostaria de começar por agradecer ao meu orientador, Professor Luis Filipe Teles, por todo o conhecimento e empenho que sempre demonstrou. O seu apoio foi um dos pilares que tornou possível a criação desta tese. A sua boa disposição e capacidade de trabalho foram apenas algumas das inúmeras virtudes que demonstrou e que o caraterizam enquanto Investigador e Professor. A ele deixo o meu muito obrigado. A todos os meus colegas de Mestrado, com os quais passei inúmeras horas de estudo e convivência, momentos que nunca esquecerei e que guardarei como dos melhores da minha vida. Por vezes com etapas difíceis, com muito trabalho e cansaço, mas que no fim acabaram por compensar e deixar todos orgulhosos. A eles deixo os meus votos de muitas felicidades e sucesso. Um obrigado muito especial aos meus colegas e grandes amigos Joana Machado, Miguel Fernandes e Tiago Afonso, sem os quais nunca teria conseguido alcançar os meus objetivos. Estiveram sempre presentes e dispostos a ajudar. Demonstraram imensa paciência e humildade do primeiro ao último segundo. A eles deixo estas palavras, que apesar de insuficientes, são verdadeiras. A todos os Professores e Investigadores que ao longo do Mestrado me apoiaram e transmitiram os seus conhecimentos. Com os quais tive o prazer de trabalhar e conviver em três grandes casas, cujos nomes não devem deixar de ser referidos, nomeadamente: a Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, o Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto e o Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental. Ao Professor Doutor Vitor Vasconcelos, gostaria de deixar o meu profundo agradecimento por ter tornado possível a realização desta tese e por ter sempre apoiado o meu trabalho. Aos meus amigos que me acompanharam desde sempre, cuja amizade de longos anos nunca se apagará da minha memória. Um especial muito obrigado para a Filipa Almeida, Frederico Maia, Pedro Leite e Tiago Correia. Por fim, gostaria de agradecer aos meus pais, sem os quais não seria possível escrever estas palavras. Sem os quais não seria a pessoa que sou hoje. Sempre me deram todas as oportunidades e liberdades para seguir o caminho que me trouxe até este momento. Gostaria de lhes dedicar o meu trabalho e de dizer que nada que possa escrever irá algum dia ser capaz de descrever a minha gratidão e amor. Abstract Objectives: The main objective of this work was to create and test an automated alert system of disturbances of the aquatic environment and confront it with five different toxics with distinct chemical nature, in order to confirm the potential broad spectrum of action, using only the analysis of behavior of Zebra Fish (Danio rerio). The study involved the construction of a video tracking system that would confirm the quality of the tested water in an easy and reliable way, without the need of any kind of biochemical test. Methodology: Three identical video tracking systems were built that through the capture of video and the analysis of nine behavioral components of the fish allowed to infer the presence or absence of contamination in the water. Six experimental conditions were tested: one negative control and five toxics of different chemical nature, namely: Bleach, Lindane, Tributyltin, Mercury and Formaldehyde. There were two replicates for experimental condition and the assay was repeated nine times for statistical validation of the results. The exposure time was set at one hour and the concentration used corresponded to 9% of the LC50-96h of the tested compounds, in order to put to the test the capability of the system and get environmental relevant results. An Artificial Neural Network of the type Self-Organizing Map was used in conjunction with a Correspondence Analysis for the construction of a statistical model of diagnostic and obtaining values of accuracy, sensibility, specificity, false positives, false negatives, positive predictive value and negative predictive value. Results: The system had an overall diagnostic capability of 79% in accuracy, 77% in sensitivity and 88% in specificity. The lowest result of the predictive value was 78% (Lindane and Mercury), in the case of the negative predictive value, and 86% (Bleach and Lindane), in the case of the positive predictive value. The best result of the predictive value was 100% (Bleach and TBT), in the case of the negative predictive value, and 89% (TBT), in the case of the positive predictive value. Even though it was not the main objective of the study, it was possible to analyze which behavioral factors were most affected by the presence of the contaminants. Conclusion: The novel video tracking system built was able to produce a great number of diagnoses, in a short period of time and with a high quality, even in the presence of different types of contaminants. Resumo Objetivos: O principal objetivo deste trabalho foi o de criar e testar um sistema automático de alerta de perturbações do meio aquático e confrontá-lo com cinco tóxicos de natureza química distinta, de forma a confirmar o seu potencial espectro de ação, recorrendo apenas à análise do comportamento do Peixe Zebra (Danio rerio). O estudo envolveu a construção de um sistema de vídeo rastreio capaz de comprovar de forma rápida e fiável a qualidade da água, sem utilização de qualquer tipo de testes bioquímicos. Metodologia: Foram construídos três sistemas de vídeo rastreio idênticos que através da captura de vídeo e análise de nove componentes do comportamento dos peixes permitiram inferir sobre a presença ou ausência de contaminação na água. Foram testadas seis condições experimentais: um controlo negativo e cinco tóxicos de natureza química distinta, nomeadamente: Lixívia, Lindano, Tributilestanho, Mercúrio e Formaldeído. Existiram duas réplicas por condição experimental e o ensaio foi repetido nove vezes de forma a permitir validação estatística dos resultados. O tempo de exposição estabelecido foi de uma hora e a concentração utilizada correspondeu a 9% do CL50-96h dos compostos testados, para permitir pôr à prova a capacidade do sistema e obter resultados ecologicamente relevantes. Foi utilizada uma Rede Neuronal Artificial do tipo Self-Organizing Map em conjunto com uma Análise de Correspondência para construção de um modelo estatístico de diagnóstico e obtenção de valores de exatidão, sensibilidade, especificidade, falsos positivos, falsos negativos, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Resultados: O sistema apresentou uma capacidade geral de diagnóstico de 79% de exatidão, 77% de sensibilidade e 88% de especificidade. O menor resultado de capacidade preditiva foi de 78% (Lindano e Mercúrio), no caso do valor preditivo negativo, e 86% (Lindano e Lixívia), no caso do valor preditivo positivo. O melhor resultado da capacidade preditiva foi de 100% (Lixívia e TBE), no caso do valor preditivo negativo, e 89% (TBE), no caso do valor preditivo positivo. Apesar de não constituir o objetivo principal do estudo, foi possível analisar quais os fatores comportamentais mais afetados pela presença dos contaminantes. Conclusão: O sistema de vídeo rastreio construído de raiz mostrou, mesmo na presença de diferentes tipos de contaminantes, ser capaz de produzir um grande número de diagnósticos, num curto espaço de tempo e com uma elevada qualidade. I Índice 1. Introdução ……………………………………………………………………………....... 1 1.1. Ambientes Aquáticos ……………………………………………...……………. 1 1.2. Perigos Toxicológicos ………………………………………………...………… 2 1.3. Avaliação do Risco Ecológico ………………………………………..………... 3 1.4. Ecotoxicologia …………………………………………………………………… 4 1.5. Comportamento como Indicador de Toxicidade ………...…………………… 6 1.6. Redes Neuronais Artificiais na Compreensão do Comportamento Animal .. 7 1.7. Vídeo Rastreio como Sistema Automático de Alerta Precoce de Perturbações do Meio Aquático ……………………………………………...... 9 1.8. Peixe Zebra como Modelo ……………………………………………..……... 10 1.9. Os Tóxicos …………………………..…………………………………..……... 11 1.9.1. Lixívia – NaClO ………………………………………………..………. 11 1.9.2. Lindano - Gama-Hexaclorocicloexano (γ-HCH) ……………………. 12 1.9.3. Tributilestanho (TBE) …………………………………………………. 14 1.9.4. Mercúrio ………………………………………………………………... 16 1.9.5. Formaldeído …………………………………………………………… 18 1.10. Objetivos do Trabalho ………………..……………………………………….. 20 2. Material e Métodos …………………………………………………………………….. 21 2.1. Preparação do Material ……………………………………………………….. 19 2.2. Aquisição dos Animais ………………………………………………………… 23 2.3. Escolha dos Tóxicos …………………………...……………………………… 23 2.4. Ensaio Definitivo ……………………………………………………………….. 25 2.5. Tratamento de Imagem ……………………………………………………...... 27 2.6. Análise Estatística ……………………………………………………………... 30 3. Resultados ……………………………………………………………………………… 32 3.1. ANOVA e Grupos Homogéneos ……………………………………………... 32 3.2. Cluster Analysis ………………………………………………………………... 34 3.3 Análise de Correspondência …………………………………………………. 37 4. Discussão ……………………………………………………………………………….. 43 5. Conclusão ………………………………………………………………………………. 50 6. Referências Bibliográficas ...…………………………………………………………... 51 7. Anexos …………………………………………………………………………………... 60 II Índice de figuras Figura 1 - Disposição esquemática do sistema de filmagem: A - cortiça expandida; B - espuma rígida de poliestireno; C - câmara 540L IR; D - banho-maria; E – vidro transparente; F - iluminação. ………….……………………………………....………………. 22 Figura 2 - Disposição esquemática dos banhos-maria (vista superior): 1 - banho-maria; 2 - bomba de filtragem de água Tetra GmbH D-49304; 3 - resistência elétrica TetraTec HT50; 4 - arenas de filmagem (condições experimentais A, B, C e D). …………………... 22 Figura 3 - Exemplo da aplicação do filtro de fundo claro (light backgorund filter) e ferramenta de Rolling Ball Background no programa ImageJ. ……………………………... 28 Figura 4 - Exemplo da utilização da ferramenta de seleção poligonal no programa ImageJ. …………………………………………………………………………………………………….. 28 Figura 5 - Exemplo da aplicação da ferramenta de alteração de Threshold no programa de ImageJ. …………………………………………………………………………………..………. 29 Figura 6 - Statistica Weights Spreadsheet: Resumo da importância de cada uma das variáveis (coordenada X, coordenada Y, velocidade linear, aceleração linear, ângulo entre os segmentos formados pelas coordenadas do peixe em três frames sucessivos, velocidade angular, aceleração angular, meander absoluto e dispersão) na definição das nove categorias criadas pela Cluster Analysis. ………………………………………………. 36 Figura 7 - Statistica Standardized Deviates: Resumo do desvio da frequência entre os valores observados e valores esperados, em cada uma das condições experimentais, nomeadamente: Controlo (Sem), Lixívia (lix), Lindano (Lin), TBE, Mercúrio (Hg) e Formol (For). ……………………………………………………………………………………………... 37 4 seres a sofrer repercussões após a destabilização da dinâmica do seu habitat (Lazorchak e Josephs, 2003). No entanto, a utilização destes indicadores não se encontra limitada às populações autóctones, sendo que outros organismos não representativos de um ambiente específico podem ser escolhidos, quando por exemplo, é necessário determinar valores dos endpoints típicos usados em Ecotoxicologia como CL50 (concentração letal para 50% dos organismos testados), NOEC (No Observed Effect Concentration - concentração máxima para a qual não existem efeitos observáveis nos organismos testados) ou LOEC (Lowest Observed Effect Concentration - concentração mínima responsável pelo aparecimento de efeitos observáveis nos organismos testados). A escolha destes organismos deve-se ao facto de serem de mais fácil manutenção em laboratório, serem exaustivamente estudados e bem caraterizados, apresentarem maior facilidade de comparação de resultados e maior fiabilidade na determinação de fatores de segurança entre diferentes espécies. Estes são denominados organismos modelo (Ankeny e Leonelli, 2011). 1.4. Ecotoxicologia A Ecotoxicologia é um campo multidisciplinar que integra conhecimentos de duas grandes áreas de estudo: a Toxicologia e a Ecologia. A Toxicologia procura compreender os efeitos adversos que determinados agentes podem ter nos organismos vivos, agentes frequentemente categorizados como tóxicos, mas que podem ser bastante diferentes entre si, incluindo na sua origem. Permite-nos estudar a ação tóxica dos diferentes compostos, percebendo assim os mecanismos de ação dos mesmos, os efeitos negativos e os tratamentos que estes possam ter, bem como ajudar na deteção e mitigação dos problemas deles resultantes. A Ecologia procura compreender as interações que ocorrem entre os organismos e o ambiente que os rodeia, no sentido de perceber a dinâmica entre as componentes bióticas e abióticas de um dado ecossistema. A sua dimensão é gigantesca quando considerados os diferentes níveis organizacionais que podemos encontrar dentro de um único ambiente, desde o nível microscópico até à escala global, toda a biosfera. Atualmente é um campo de estudo cuja principal visão se centra na sustentabilidade do planeta. A Ecotoxicologia procura não só compreender os efeitos adversos de determinados agentes em organismos vivos, como também relacioná-los com os diferentes níveis de organização dentro do mesmo ecossistema. Os seus principais objetivos são a prevenção dos problemas ambientais causados por tóxicos e em segundo lugar a resolução dos mesmos (Forbes e Forbes, 1994). 5 Um dos grandes problemas enfrentados pela Ecotoxicologia é a disparidade entre o ritmo de desenvolvimento e descoberta de novos compostos e a avaliação do seu potencial risco, tanto para o Homem como para o Ambiente (Bushnell et al., 2010). Apesar do esforço conjunto entre vários países e organizações ambientais, de forma a desenvolver ensaios toxicológicos baseados na ecologia e integrando diferentes visões, como a caraterização química dos compostos e o seu reflexo nos fatores biológicos como a diversidade, os endpoints toxicológicos tradicionais (mortalidade, NOEC, LOEC, entre outros) continuam a ser exaustivamente utilizados, muito embora possam avaliar apenas aspetos pontuais (Clotfelter et al., 2004). Tratam-se de valores relativamente simples de obter e comparar entre si, dado que existe uma grande variedade de ensaios padronizados utilizando organismos modelo, mas que podem apresentar enormes disparidades de resultados entre diferentes espécies, ou até dentro de uma mesma espécie, quando comparamos resultados obtidos por autores distintos. Podem ter uma importância ecológica pouco significativa uma vez que, idealmente, as ferramentas de avaliação de risco devem promover a sustentabilidade dos ecossistemas identificando precocemente os sintomas de exposição a tóxicos (Bouvier d'Yvoire et al., 2012). Os resultados de testes toxicológicos pontuais (agudos) podem ser suplementados por ensaios ao longo de um período de tempo mais abrangente, geralmente superior a 90 dias ou relativo a mais do que uma geração, denominados ensaios sub-crónicos ou crónicos. Nestes, podem ser observados efeitos ao nível do indivíduo, como o crescimento, mas ainda efeitos ao nível populacional, como o sucesso de reprodução. São geralmente reservados a estudos sobre a carcinogenicidade, mutagenecidade e toxicocinética de compostos (Barile, 2013). Muitos destes ensaios, quer agudos quer crónicos, utilizam concentrações com baixa relevância ecológica, por não corresponderem a níveis realistas de contaminação ambiental, sendo geralmente muito mais elevadas que as registadas em situações reais (Bouvier d'Yvoire et al., 2012). Mesmo quando fortemente contaminados, os ecossistemas naturais podem apresentar concentrações muito inferiores às letais para a maioria das espécies, capazes de provocar efeitos profundos, mas não a morte de organismos (Cabrera et al., 1998). Estes efeitos, apesar de insuficientes para causar mortalidade relevante, podem levar a perda de funções ecológicas, dado que o comportamento normal das espécies afetadas pode ser alterado (Scott et al., 2003). Estas modificações de comportamento podem afetar a capacidade predatória ou de fuga a predadores, a capacidade sensorial, os comportamentos sociais, os padrões migratórios, alterar ritmos circadianos, entre outros (Little e Finger, 1990). 6 1.5. Comportamento como Indicador de Toxicidade Como ferramenta para a Ecotoxicologia, o comportamento animal tem vindo a ganhar uma importância crescente, muito devido ao facto de apresentar uma sensibilidade até 1.000 vezes superior ao convencional, e exaustivamente utilizado, valor de CL50 (Hellou, 2011). O comportamento é um efeito a nível individual de um dado organismo e é definido pela ação ou reação a um determinado conjunto de circunstâncias, tanto a nível molecular, físico e/ou ecológico (Scott e Sloman, 2004). Resulta das condições a que um organismo está sujeito e representa um efeito agudo e/ou cumulativo. Representa ainda uma interface única entre fatores intrínsecos e extrínsecos, que determinam a sobrevivência de um organismo (Little et al., 1990). Inúmeros parâmetros comportamentais podem ser utilizados como endpoints toxicológicos, por serem facilmente observados e quantificados, tais como: respostas de medo/fuga; aspetos relacionados com a capacidade de locomoção, reprodução ou alimentação; agressividade; memória; entre outros. Alterações comportamentais podem ocorrer a concentrações significativamente inferiores às necessárias para causar efeitos fisiológicos evidentes (Faucher et al., 2008), mas capazes de alterar significativamente o comportamento normal das espécies. Alguns exemplos de compostos com este potencial incluem: etinil estradiol, presente nas pílulas anticoncecionais e comum em águas residuais, com capacidade de diminuir a agressividade em diversos organismos; metais pesados, capazes de provocar o aumento dos custos metabólicos, afetando negativamente o balanço energético e levando a um aumento de comportamentos associados à predação (aumento da voracidade), ou ainda pesticidas, que afetam negativamente a capacidade de orientação e navegação (Montiglio e Royaute, 2014). A alteração dos comportamentos normais dos organismos pode ter implicações ecológicas relevantes, dado que afeta a sua capacidade de sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Atualmente, a ubiquidade de muitos contaminantes antropogénicos pode ser responsável por uma mudança na pressão seletiva sobre as espécies presentes em diversos ambientes, devido aos profundos efeitos diretos e indiretos causados pela contaminação dos ecossistemas (Fleeger et al., 2003). Apesar de inúmeros exemplos poderem ser referidos, um dos mais mediáticos é, possivelmente, o caso do efeito negativo do pesticida DDT na população de Águias-Reais (Haliaeetus leucocephalus) da Flórida. Durante os anos de 1950, foi registada uma redução significativa do número de indivíduos desta espécie, que coincidia com o comportamento anormal que as mesmas apresentavam, principalmente no que diz respeito à sua capacidade reprodutiva, mais especificamente durante a corte e a nidificação. Estes comportamentos alertaram para a capacidade de disrupção endócrina deste composto, que só foi finalmente reconhecida durante as décadas de 1980-1990 (Zala e Penn, 2004). 7 Uma das principais críticas à utilização do comportamento como endpoint em ensaios toxicológicos prende-se com o facto de este nem sempre ser uma variável simples de analisar e principalmente por nem sempre ser fácil de comparar entre diferentes estudos (Clotfelter et al., 2004). No entanto, o recente desenvolvimento tecnológico, nomeadamente nas áreas audiovisuais e da informática, permitiu a emergência de sistemas automáticos que possibilitam a análise comportamental de inúmeros organismos distintos, sem necessidade de recorrer a um observador externo que mesmo treinado pode cometer erros ou influenciar intencionalmente (ou não) os resultados finais. É importante perceber que, uma das principais dificuldades encontradas neste tipo de trabalhos e metodologias é o facto de poder existir uma enorme variação intraespecífica, isto é, variações entre indivíduos da mesma espécie e até de uma mesma população, o que significa que quando sujeitos a condições de stress semelhantes os comportamentos podem ser relativamente distintos de indivíduo para indivíduo (Schrandt et al., 2012). Apesar disso, um número de réplicas suficientemente elevado e a escolha acertada dos parâmetros a estudar, torna possível a validação estatística dos resultados obtidos. A utilização de métodos de deteção automáticos e o uso de fórmulas matemáticas na descrição dos parâmetros a avaliar, abrem portas a uma possível padronização dos métodos. Este aspeto poderá levar a uma maior difusão destas técnicas, podendo inclusive, num futuro bastante próximo, serem utilizadas na criação de mais e melhor legislação ambiental bem como na criação de sistemas de alerta precoce de perturbações do meio aquático. 1.6. Redes Neuronais Artificiais na Compreensão do Comportamento Animal As redes neuronais artificiais são modelos computacionais de inteligência artificial inspirados no sistema nervoso central animal, particularmente no cérebro. São utilizadas para estimar funções matemáticas não-lineares que dependem de um número elevado de inputs (dados de entrada) (Cheng e Titterington, 1994). São geralmente sistemas que apresentam unidades de processamento simples, os “neurónios”, interligados e capazes de relacionar inputs e reconhecer padrões nos dados, através do raciocínio indutivo e natureza adaptativa. Estes “neurónios” são nódulos de informação ligados e relacionados entre si, formando uma rede que tenta imitar a organização biológica do cérebro animal. Esta semelhança deve-se à capacidade destes sistemas funcionarem de forma coletiva e em paralelo, sem uma divisão clara de tarefas entre as diferentes unidades. O desenvolvimento das redes neuronais artificiais levou a uma mudança no paradigma da inteligência artificial, passando de sistemas em que o conhecimento se encontrava 8 presente no seu código, e definido claramente por um conjunto de regras, para um sistema dinâmico, onde a aprendizagem e capacidade de adaptação se destacam. São utilizadas quando existe um conhecimento a priori limitado para o problema em questão, sendo capazes de encontrar relações subtis nos dados, mesmo quando estas mesmas relações são difíceis de prever ou até completamente desconhecidas. Por esse motivo são utilizadas quando as soluções requerem um conhecimento que é difícil de explicar, mas para o qual existe um número suficiente de dados/observações. São geralmente mais flexíveis do que métodos estatísticos tradicionais e capazes de melhorar o seu desempenho de forma gradual com a aprendizagem (Zhang et al., 1997). Esta capacidade deve-se ao facto de os pesos associados aos diferentes “neurónios” ser ajustado durante o processo, o que se pode refletir em importâncias diferentes atribuídas a diferentes dados. A sua utilização como método de previsão de resultados data dos anos de 1960, no entanto o desenvolvimento informático e aumento dos recursos computacionais foi essencial para a sua reintrodução durante a década de 1980 (Rumelhart et al., 1986). A sua utilização no estudo e compreensão do comportamento animal pode tornarse uma poderosa ferramenta na prevenção de certos tipos de poluição, nomeadamente a aquática, uma vez que pode permitir perceber e classificar comportamentos complexos, que de outra forma não seriam valorizados ou compreendidos. A Rede Neuronal Artificial do tipo Self-Organizing Map (SOM) é um algoritmo que permite mapear informação densa e complexa num espaço bidimensional, através de processos de aprendizagem não supervisionados. Este tipo de aprendizagem não exige um agente externo (investigador) a acompanhar o processo, uma vez que apenas é necessário fornecer à rede os inputs. A partir destes dados de entrada a rede deteta as suas semelhanças e tenta estabelecer relações progressivamente mais complexas, que são depois classificadas automaticamente. Neste processo é necessária redundância nos dados de entrada, de forma a ser possível detetar os padrões nos inputs. A SOM diferencia- -se dos restantes algoritmos uma vez que privilegia a preservação topológica dos dados, o que significa que inputs próximos espacialmente são classificados como semelhantes e a importância desta relação é mantida, preservando desta forma as propriedades espaciais do universo de resultados. Esta análise é particularmente eficaz na classificação e deteção de subgrupos relevantes nos dados (Clusters), especialmente quando não existe qualquer conhecimento sobre os mesmos. As relações dentro de um mesmo Cluster deverão ser semelhantes, não o sendo no caso de outros subgrupos (homologia interna e separação externa) (Qiao e Han, 2010; Cabanes e Bennani, 2010). 9 Em suma, a capacidade deste algoritmo em generalizar, aprender com a experiência e preservar a organização topológica dos dados torna-o ideal como ferramenta de diagnóstico, uma vez que não necessita de conhecimento a priori sobre as condições testadas, apresenta capacidade em se adaptar aos inputs formando relações progressivamente mais complexas entre os mesmos e mantém uma organização bidimensional dos dados, que é importante na compreensão das relações criadas. As suas características podem permitir compreender o comportamento dos organismos quando expostos a substâncias tóxicas, condição necessária na sua aplicação em sistemas de vídeo rastreio. 1.7. Vídeo Rastreio como Sistema Automático de Alerta Precoce de Perturbações do Meio Aquático Quando aplicados na prevenção ou avaliação do risco ambiental, os sistemas automatizados de alerta precoce de perturbações do meio aquático devem ser capazes de detetar alterações comportamentais nos organismos testados e produzir um diagnóstico fiável acerca da qualidade do ambiente em que estes se encontram. A tecnologia aplicada neste tipo de estudos tem evoluído de forma acentuada na última década, sendo que os primeiros sistemas utilizavam eletrónica analógica e apenas eram capazes de estudar um único indivíduo e em ambientes extremamente artificiais. Alguns dos exemplos mais engenhosos da aplicação deste tipo de técnicas são a utilização de feixes infravermelhos, ultrassons ou ainda um radar do tipo Doppler (Spink et al., 2001). No entanto, a utilização de sistemas que recorrem ao uso de imagens de vídeo apresenta claras vantagens, nomeadamente a sua maior simplicidade e flexibilidade, o que resulta em menores custos em termos monetários, de tempo e de esforço. Os sistemas de vídeo rastreio são particularmente eficazes na caraterização e estudo de ações rápidas e/ou breves ou ações durante períodos temporais alargados. Estes são ainda essenciais na determinação de variáveis espaciais como a distância percorrida, a velocidade média de deslocação, entre outras, que de outro modo não poderiam ser avaliadas de uma forma consistente (Spink et al., 2001). São extremamente úteis na monitorização do comportamento de animais aquáticos, por apresentarem uma elevada frequência de amostragem (número de fotogramas/frames por segundo) e uma grande resolução espacial (Pittman e Ichikawa, 2013). Os peixes são organismos que despertam um interesse particular neste campo, porque muitos dos seus comportamentos (considerados ecologicamente relevantes) são 10 facilmente observados e quantificados. Para além disso, mesmo quando não são fisicamente afetados por um contaminante, podem exibir alterações significativas no seu comportamento, devido à sua enorme capacidade sensorial, principalmente olfativa (Scott e Sloman, 2004). 1.8. Peixe Zebra como Modelo De entre as inúmeras espécies utilizadas em Ecotoxicologia, o Peixe Zebra (Danio rerio) tem-se tornado cada vez mais importante, sobretudo devido ao facto de oferecer um compromisso entre a simplicidade na sua utilização e a complexidade do seu sistema, homólogo a roedores e humanos (Tran e Gerlai, 2014). Apresenta respostas a tóxicos e fármacos semelhantes às observadas em mamíferos, demonstrando a sua capacidade em identificar agentes que representam um risco para a saúde Humana e Ambiental (Powers et al., 2010). É uma espécie altamente prolífica, resiliente, de tamanho reduzido (4 cm) e propensão natural em formar cardume, o que facilita a sua manutenção em laboratório, com um mínimo de esforço e sem perturbar o seu comportamento natural, mantendo as interações e coesão sociais. Para além disso, a capacidade e facilidade de administração de tóxicos solúveis em água de uma forma não invasiva, torna-os ideais em estudos comportamentais (Pannia et al., 2014). De facto, esta espécie é facilmente exposta a substâncias hidrofílicas presentes na água, principalmente pelas brânquias mas também por toda a superfície corporal (Gerlai et al., 2006). Os seus sistemas sensoriais são altamente desenvolvidos e versáteis, representando uma vantagem no que diz respeito à quantidade de técnicas a que podem ser aplicados. Apresentam uma grande sensibilidade vestibular; excelente visão tetracromática; quimio, mecano e termosensibilidade; excelente audição e presença da linha lateral, importante na deteção de estímulos vibratórios (Moorman, 2001). A utilização do Peixe Zebra não está no entanto limitada à Ecotoxicologia, sendo já a terceira espécie animal melhor caraterizada geneticamente, depois do murganho (Mus musculus) e mosca da fruta (Drosophila melanogaster) (Grunwald e Eisen, 2002). É um poderoso modelo animal em estudos genéticos, de desenvolvimento e até farmacológicos, exibindo ainda uma variedade de comportamentos sociais e de defesa bastante úteis na caraterização do seu comportamento (behavioral phenotyping) (Gerlai, 2003). Diversas variáveis comportamentais podem ser analisadas, como a frequência de paragens na locomoção, duração de movimentos, velocidade linear, distância percorrida, ângulos de viragem, posição na coluna de água, forma e padrão dos movimentos, entre outros (Kane et al., 2004; Blaser e Gerlai, 2006). Mais ainda, uma grande variedade de comportamentos 11 complexos e/ou sociais podem ser analisados, como a habituação, memória, reflexos, escolha, aprendizagem, atração/repulsão, agressividade, coesão em cardume, entre outros (Blaser e Vira, 2014). 1.9. Os Tóxicos De forma a colocar à prova o sistema de vídeo rastreio, foram selecionados cinco tóxicos pertencentes a diferentes grupos químicos, número que foi um compromisso entre a disponibilidade de tempo e recursos e a necessidade de desenvolver um trabalho que representasse um esforço e importância significativos. 1.9.1. Lixívia – NaClO A lixívia, designação comercial do Hipoclorito de Sódio, é atualmente um dos compostos mais utilizados a nível mundial, em diversas atividades como industriais, agrícolas, farmacêuticas, hospitalares e domésticas, principalmente devido às suas capacidades desinfetantes e baixo custo de produção (Magalhães et al., 2007). É utilizado desde o século XVII e é considerado de uso vital na desinfeção e tratamento de água, bem como no controlo de inúmeras doenças infeciosas, especialmente em países com reduzido acesso a água potável (Clasen e Edmondson, 2006). O seu uso indiscriminado e descargas descontroladas no Ambiente representam um problema a nível mundial. São soluções extremamente instáveis e fortemente oxidantes. A sua reação com a água forma Ácido Hipocloroso (HClO), que rapidamente se dissocia em iões Hidrogénio (H+) e iões Hipoclorito (CLO-) (Lopez-Galindo et al., 2010a). Os subprodutos da desinfeção gerados resultam de reações entre os iões formados com a matéria orgânica presente na água, mais precisamente com nucleótidos e/ou proteínas. Podem ser subdivididos em quatro categorias: halogénios livres, haloaminas, trialometanos e organohalogenados. São lipofílicos, estáveis e tóxicos para o Homem e para o Ambiente, por apresentarem capacidade mutagénica, carcinogénica e citotóxica (Monarca et al., 2000). Estudos epidemiológicos demonstraram que o consumo de água tratada com Cloro aumenta o risco de cancro gastrointestinal e do sistema urinário, bem como a incidência de abortos espontâneos e de efeitos no sistema reprodutor e no desenvolvimento (Monarca et al., 2004). O Hipoclorito de Sódio é uma base forte (pH > 11), sendo extremamente corrosivo. Apresenta capacidade de neutralizar aminoácidos livres, atuar como solvente orgânico e 12 degradar ácidos gordos presentes em membranas celulares. Tem ainda capacidade de oxidar proteínas de forma irreversível, nomeadamente os grupos Sulfidril da Cisteína; gerar espécies reativas de oxigénio (EROs); provocar Peroxidação Lipídica e de interferir com o metabolismo, levando à diminuição da síntese de ADN e à disfunção progressiva de mitocôndrias com subsequente morte celular (Hidalgo et al., 2002; Mohammadi, 2008). O uso do Hipoclorito de Sódio como antisséptico encontra-se comprovado em bactérias, micobactérias, esporos, vírus, algas e protozoários (Hidalgo et al., 2002). É ainda considerado o desinfetante mais eficiente para a inativação química do vírus da imunodeficiência humana adquirida (VIH) in vitro (Aranda-Anzaldo et al., 1992). É uma biomolécula essencial para o sistema imunitário de inúmeros organismos, sendo sintetizada a partir do Peróxido de Hidrogénio e iões de Cloro (catalisada pela enzima Mieloperoxidase) e ativada por fagócitos em zonas de inflamação (Lapenna e Cuccurullo, 1996). Reduzidas concentrações (0,2 mg/L) provocam fortes impactos nos ambientes aquáticos, nomeadamente em produtores primários, onde podem interferir com a produtividade fotossintética do fitoplâncton (Poornima et al., 2005). Estes valores podem ser encontrados à saída de efluentes de indústrias (Manduzio et al., 2004; Nebot et al., 2006) e até mesmo estações de tratamento de águas residuais, onde o valor de Cloro residual pode atingir 1 mg/L (Pignata et al., 2012). A exposição de peixes a concentrações subletais deste agente induz alterações comportamentais como letargia e diminuição do ritmo respiratório, que podem estar relacionadas com danos provocados nas brânquias dos animais, apresentando de uma forma dependente da dose de exposição: hipertrofia, hiperplasia, fusão da lamela do epitélio e necrose (Lopez-Galindo et al., 2010b). Estes danos podem comprometer processos fisiológicos ao nível branquial reduzindo as trocas gasosas e diminuindo os níveis de oxigénio. 1.9.2. Lindano - Gama-Hexaclorocicloexano (γ-HCH) Lindano é a designação comercial dada à fórmula isomérica gama (γ) do composto Hexaclorocicloexano (HCH). O seu uso como inseticida ocorreu de forma exaustiva por todo o globo desde a década de 1940 até fortes restrições serem colocadas à sua utilização, devido aos efeitos adversos observados em organismos não-alvo e à sua persistência no Ambiente. Na agricultura foi utilizado no tratamento de sementes e colheitas, na indústria madeireira como preservante e na pecuária no tratamento contra 13 ectoparasitas. Atualmente é ainda utilizado como loção tópica no controlo de certos parasitas (Humphreys et al., 2008). Considerado um Poluente Orgânico Persistente (POP) pertencente à classe dos Organoclorados, o Lindano, possui capacidade de sofrer transporte atmosférico a longas distâncias antes de sofrer deposição, geralmente em zonas mais frias do Planeta (destilação global), tendo já sido detetado no Ártico (Marini et al., 2012). É estável e resistente à degradação química, fotolítica e biológica, apresentando ainda capacidade de bioacumulação e até mesmo biomagnificação, devido à sua elevada lipofilicidade (Bayarri et al., 2001). O seu fator de bioconcentração (FBC), razão entre a concentração no organismo e a concentração no meio, foi calculado para diferentes organismos aquáticos, desde invertebrados a peixes, tendo variado de 43 a 4240 (Geyer et al., 1997). Quando o FBC é superior a 1, considera-se que está a ocorrer acumulação, como tal, os valores obtidos são deveras preocupantes. A 29 de Abril de 2004 o seu uso foi restringido na União Europeia pela Regulamentação nº 850/2004 (Portugal ratificou a regulamentação pelo Decreto nº 15/2004, de 3 de Junho), tendo sido limitado a reações químicas intermediárias para produção de outros compostos. Antes das medidas de controlo definidas, em 2009, pela Convenção de Estocolmo, as concentrações de lindano encontradas nos ambientes aquáticos podiam atingir níveis de 1 µg/L, em zonas próximas a áreas de cultivo, dez vezes superiores às permitidas pela legislação (Marini et al., 2012). Nos Estados Unidos da América, o seu uso continua a ser permitido em loções tópicas para uso humano no controlo de pulgas e sarna, bem como em atividades do foro veterinário. Um único shampoo para eliminação de piolhos tem capacidade de contaminar perto de 23 mil litros de água, sendo que o custo da sua remoção em estações de tratamento de águas residuais ronda o valor de 3 mil euros (Davis, 2002). Em 2006, encontrava-se registado para uso comercial em 17 países, banido em mais de 50 e fortemente restringido em 33 (Humphreys et al., 2008). Estas discrepâncias na sua utilização causam grandes preocupações ambientais, porque revelam que o seu uso pode ainda estar descontrolado, nomeadamente em países subdesenvolvidos como a Índia (Bijoy-Nandan e Nimila, 2012). O Lindano é um neurotóxico que interfere com a ação do Ácido Gama-Aminobutírico (GABA), principal neurotransmissor com ação inibidora no sistema nervoso central e essencial na regulação da excitabilidade neuronal. O Lindano interage com o recetor GABA mediado por ligandos (GABAAR), mais precisamente ao nível do local de ligação da picrotoxina, bloqueando o canal iónico e evitando a ligação do GABA ao seu recetor. Sem esta ligação, não se dá a hiperpolarização do neurónio nem a reversão do potencial de 20 1.10. Objetivos do Trabalho O aumento das pressões exercidas pelo Homem sobre o Ambiente tornam imperativo um estudo e um conhecimento extensivo do efeito que determinados contaminantes podem ter nas comunidades biológicas, como tal, é necessário desenvolver ferramentas que permitam avaliar esses mesmos efeitos de uma forma rápida e fácil. O objetivo deste trabalho foi criar e testar um sistema automático de vídeo rastreio para deteção de perturbações do meio aquático, confrontando-o com cinco tóxicos de natureza química distinta, de forma a verificar o seu potencial espectro de ação. Para tal, foram criadas três unidades de filmagem idênticas que permitiram controlar, de forma igual e simultânea, todas as condições experimentais necessárias. Foi ainda construído um modelo estatístico recorrendo a uma Rede Neuronal Artificial do tipo SOM em conjunto com uma Análise de Correspondência e calculadas várias medidas de qualidade de diagnóstico, nomeadamente os valores de exatidão, sensibilidade, especificidade, falsos positivos, falsos negativos, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) dos diagnósticos por ele obtidos. Estes valores serviram para validar a eficácia do sistema. Desta forma torna-se possível perceber se o modelo é capaz de produzir diagnósticos corretos em relação à presença ou ausência de contaminação, mas também se é capaz de apresentar resultados consistentes quando confrontado com contaminantes de natureza bastante distinta. 21 2. Material e Métodos 2.1. Preparação do Material Procedeu-se à montagem de dois aquários Tetra de 50 litros (64 cm comprimento, 34 cm altura e 29 cm largura), equipados com bombas de filtragem de água Tetra GmbH D-49304 e resistências elétricas TetraTec HT50, bem como à preparação das três unidades de filmagem. De uma forma geral, o sistema de filmagem foi constituído da seguinte forma: 1. Sistema de iluminação: composto por 12 (3x4) lâmpadas LED cilíndricas (50 cm de comprimento, 3 cm de diâmetro e 60 watts de potência). 2. Três banhos-maria (48 cm de comprimento, 36 cm de largura e 17 cm de altura): equipados com resistências elétricas TetraTec HT50 e bombas de filtragem de água Tetra GmbH D-49304 para garantir a manutenção da temperatura da água a 28ºC. 3. Isolamento: composto por placas de cortiça expandida com 2 cm de espessura, formando um único compartimento de 200 cm comprimento, 120 cm altura e 60 cm largura a toda a volta das três unidades, nomeadamente as laterais, a parte de trás e da frente. 4. Sistema de gravação: constituído por três câmaras Flow Electronics 540L IR ligadas a um computador Intel® Pentium® Dual CPU (2:00 [email protected] GHz, 1.87 GB RAM) com sistema operativo Microsoft Windows XP Home Edition version 2002 Service Pack 3, com software de filmagem DSS1000, versão 4.7.0041. A disposição do sistema que apresentou melhores resultados foi: iluminação no plano inferior, banhos-maria e arenas no plano médio e sistema de gravação no plano superior, como esquematizado na Figura 1. A base dos banhos-maria foi composta por uma placa de plástico branco de 3 mm de espessura, para permitir e otimizar a passagem da luz e fornecer um maior contraste entre peixe/arena e facilitar a filmagem. 22 Figura 1 - Disposição esquemática do sistema de filmagem: A - cortiça expandida; B - espuma rígida de poliestireno; C - câmara 540L IR; D - banho-maria; E – vidro transparente; F - iluminação. Foi necessária a construção de doze arenas de filmagem individuais, que consistiu na montagem de três aquários (35 cm comprimento, 15 cm altura e 20 cm largura) com vidros de 2 mm de espessura, divididos internamente em quatro secções iguais e opacas, de maneira a individualizar cada peixe e respetiva condição experimental. Cada secção comportou 1,5 litros, equivalentes a 10 cm de coluna de água, o suficiente para manter o comportamento natural da espécie. Estas arenas eram colocadas no interior dos respetivos banhos-maria, como é possível ver na Figura 2. Figura 2 - Disposição esquemática dos banhos-maria (vista superior): 1 - banho-maria; 2 - bomba de filtragem de água Tetra GmbH D-49304; 3 - resistência elétrica TetraTec HT50; 4 - arenas de filmagem (condições experimentais A, B, C e D) 23 Todos os aquários e arenas foram mantidos a uma temperatura constante de 28ºC±1, ideal para a espécie, temperatura esta controlada pelas resistências e monitorizada com a ajuda de cinco termómetros internos de mercúrio LX-012-A. 2.2. Aquisição dos Animais Os 150 peixes D. rerio de estirpe selvagem, com cerca de cinco meses de idade e 2,5 cm de comprimento, provenientes do mesmo lote, foram adquiridos na empresa Orniex Gaia, e foram acondicionados num dos aquários Tetra 50. Os organismos dispuseram de um período de adaptação de um mês antes de qualquer ensaio. Os organismos foram alimentados uma vez por dia (depois da hora prevista dos ensaios, de forma a não interferir com a consistência dos resultados) com TetraMin Bio Active Formula e mantidos num fotoperíodo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Cada peixe foi utilizado uma única vez e nenhum dos animais sofreu danos permanentes ou morte durante as experiências. Após a sua utilização foram mantidos no segundo aquário Tetra 50. 2.3. Escolha dos Tóxicos De forma a colocar verdadeiramente à prova a capacidade de diagnóstico do sistema de vídeo rastreio e ao mesmo tempo produzir resultados importantes de um ponto de vista ecológico, um dos passos mais importantes do trabalho prendeu-se com a escolha dos tóxicos a utilizar. Existiram alguns critérios que foram essenciais na seleção dos mesmos, nomeadamente: 1. A sua acessibilidade, o que resulta em custos monetários mais reduzidos. 2. A sua facilidade de utilização, nomeadamente a sua solubilidade em água à concentração pretendida e diminuídos riscos durante a sua manipulação. 3. A capacidade de eliminação, principalmente das soluções stock preparadas. 4. A possibilidade de representarem um importante risco ecológico, podendo ser classificados de contaminantes prioritários, emergentes e/ou controversos. 5. As concentrações utilizadas estarem dentro dos valores observados nos ecossistemas, mesmo que de forma pontual. 6. A existência de valores conhecidos de CL50 para Peixe Zebra, de forma a calcular as concentrações a utilizar. 7. O conhecimento dos efeitos e modo de ação dos tóxicos, de forma a ser possível relacioná-los com as (possíveis) variações comportamentais. 24 8. O seu uso prévio em outros trabalhos, de forma a tornar possível a discussão dos resultados. 9. A necessidade de todos os tóxicos escolhidos serem bastante diferentes entre si, pertencendo inclusive a famílias químicas distintas. Todos os tóxicos utilizados foram testados durante uma hora de exposição, a uma concentração equivalente a 9% do CL50-96h, calculado em ensaios toxicológicos convencionais e presentes na literatura. Estes valores foram selecionados por terem apresentado resultados bastante favoráveis em experiências anteriormente realizadas (para publicação). Permitiram colocar à prova a capacidade de diagnóstico do sistema pelo facto de serem concentrações baixas e ecologicamente relevantes. Outro aspeto importante foi o facto de se evitar danos permanentes nos organismos testados, uma das condições consideradas essenciais. O reduzido tempo de exposição é fundamental dado que torna possível obter um maior número de diagnósticos num menor espaço de tempo. A baixa concentração e o reduzido tempo de exposição podem não ser relevantes para causar danos nos organismos testados, mas serem suficientes para revelar alterações comportamentais que possam ser detetadas pelo sistema. As concentrações utilizadas e os valores de CL50-96h para D. rerio que estiveram na sua origem são apresentados na Tabela 1. 25 Tabela 1 - Resumo das concentrações utilizadas e valores de CL50-96h que estiveram na sua origem, para os compostos Hipoclorito de Sódio, Lindano, TBE, Cloreto de Mercúrio e Formol. Composto CL50-96h para Danio rerio Concentração utilizada Hipoclorito de Sódio 5,53 mg/L (Pitanga, 2011) 0,5 mg/L Lindano 0,10 mg/L (Ensenbach e Nagel, 1995) 10 µg/L TBE 2,7 µg/L (Martins et al., 2007) 0,243 µg/L Cloreto de Mercúrio 0,05 mg/L (Martins et al., 2007) 4,5 µg/L Formol 41 mg/L (Liu et al., 2011) 3,69 mg/L Para todos os tóxicos foi preparada uma solução stock com água desionizada e mantida em agitação durante a noite, para garantir a completa dissolução dos reagentes. Seguidamente, foram armazenadas a uma temperatura constante e protegidas da luz de forma a evitar fotodegradação. Um limite de segurança de pelo menos dez vezes foi mantido em relação ao limite de solubilidade a 25ºC. As soluções stock foram preparadas de forma a ter em conta a sua concentração e permitir que todas as condições experimentais fossem contaminadas com o mesmo volume de solução, cerca de 24 mL. O Hipoclorito de Sódio (NaClO – 5%, CAS 7681-52-9) foi adquirido na empresa PanReac AppliChem e o Lindano (γ-BHC – 97%, CAS 58-89-9), TBE (TBTO – 96%, CAS 56-35-9), Mercúrio (HgCl2 ≥ 99.5%, CAS 7487-94-7) e Formol (HCHO – 36.5-38%, CAS 50-00-0 ) na empresa Sigma-Aldrich. 2.4. Ensaio Definitivo Foram realizadas nove repetições do ensaio definitivo para permitir a validação estatística dos resultados. Cada ensaio foi constituído por dois tempos de filmagem de uma 26 hora: “Antes” e “Depois” da contaminação. Foram selecionadas apenas fêmeas para facilitar a gravação (sendo maiores eram mais visíveis e evitou-se introdução de variáveis como diferenças de género, peso, e tamanho). Cada unidade de filmagem possuía um aquário com quatro secções isoladas por vidro opaco (arenas). Cada arena era única e representava apenas uma condição experimental. Existiram seis condições experimentais em cada ensaio (cinco contaminantes e um controlo negativo) e duas réplicas por condição. A distribuição das condições pelas arenas foi sempre aleatória mas as duas réplicas nunca ficaram na mesma unidade de filmagem. Os ensaios foram realizados durante o período de maior atividade dos peixes, entre as 10 e as 16 horas (MacPhail et al., 2009), e seguiram os seguintes passos: Tempo “Antes”:  Confirmação das temperaturas do aquário Tetra 50 que mantinha o lote de peixes e das arenas de filmagem a 28ºC±1, condição necessária à realização dos ensaios.  Seleção de 12 fêmeas do aquário Tetra 50 e transferência das mesmas para as arenas de filmagem.  Tempo de habituação de 15 minutos (Gerlai et al., 2009).  Falsa contaminação das arenas com água desionizada. O volume utilizado, cerca de 24 mL, não afetava significativamente a altura da coluna de água e era pipetado facilmente utilizando uma micro pipeta Gilson Pipetman 100 mL.  Novo tempo de habituação de 15 minutos.  Gravação de uma hora - Pré-exposição, para permitir que cada peixe fosse utilizado como controlo de si próprio. Tempo “Depois”:  Contaminação das diferentes condições experimentais com 24 mL de solução: 1. Água desionizada (controlo negativo); 2. Lixívia; 3. Lindano; 4. TBE; 5. Cloreto de Mercúrio; 6. Formol.  Tempo de habituação de 15 minutos.  Gravação de uma hora - Pós-exposição.  Terminada a hora de gravação, transferência dos peixes para o segundo aquário Tetra 50, utilizado apenas para manter os peixes já utilizados. Os procedimentos do tempo “Antes” e do tempo “Depois” foram equivalentes de forma a sujeitar os peixes ao mesmo tipo de manipulações e evitar a introdução de variáveis. 27 2.5. Tratamento de Imagem No final de cada ensaio resultavam seis gravações, uma de cada unidade de filmagem no tempo “Antes” e no tempo “Depois”. Este tipo de gravação convencional não pôde ser utilizada diretamente, dado que as diferentes condições experimentais não se encontravam individualizadas nem os dados eram compatíveis com os programas de análise estatística utilizados para validação dos resultados, neste caso o programa Statistica versão 10 (StatSoft, 2011). Por esse facto as gravações tiveram de sofrer tratamento. De uma maneira geral, o objetivo do tratamento de imagem consistiu em individualizar cada peixe e transformar a sua localização na arena em coordenadas X e Y que pudessem depois ser analisadas. Em primeiro lugar, converteu-se o formato de vídeo numa sequência de imagens individuais (frames). Para isso foi utilizado o programa VirtualDub, fazendo a conversão do formato AVI para o formato ImageSequence. Em seguida, recorrendo ao programa ImageJ, cada condição experimental foi individualizada; cada peixe transformado num ponto negro com o fundo a branco e, por fim, com recurso à ferramenta MultiTracker, cada ponto negro foi reconhecido como uma coordenada, sendo depois essa informação exportada para uma tabela de Excel. Para esse efeito, cada fotograma importado inicialmente pelo programa ImageJ foi convertido para uma escala de cinzentos a 8-bit (8-bit grayscale). Com recurso à ferramenta Rolling Ball Backgorund com um filtro de fundo claro (light backgorund filter) os frames foram limpos, de forma a eliminar possíveis interferências nas imagens, como sombras, e aumentar o contraste dos animais (Figura 3). 28 Figura 3 - Exemplo da aplicação do filtro de fundo claro (light backgorund filter) e ferramenta de Rolling Ball Background no programa ImageJ. Com a ferramenta de seleção poligonal, cada arena de filmagem individual foi selecionada e o restante eliminado (Figura 4). Como a posição das câmaras e das arenas não se alterou durante os ensaios, esta seleção só foi feita uma vez no início de cada ficheiro de gravação, para cada uma das quatro arenas, sendo o programa capaz de assumir a mesma seleção nos fotogramas seguintes. Esta seleção foi necessária uma vez que a ferramenta de MultiTracker apresenta melhores resultados quando segue a trajetória de apenas um peixe a cada momento. Figura 4 - Exemplo da utilização da ferramenta de seleção poligonal no programa ImageJ. 29 Através da ferramenta de alteração de Threshold foi possível tornar cada peixe num ponto negro com tudo o resto a branco (Figura 5). Cada Threshold foi introduzido individualmente no início das gravações de acordo com os resultados que apresentava, sendo depois o programa capaz de assumir o mesmo valor para os fotogramas seguintes. Figura 5 - Exemplo da aplicação da ferramenta de alteração de Threshold no programa de ImageJ. Depois destes processos foi possível utilizar a ferramenta de MultiTracker, esta ferramenta calculou as coordenadas dos organismos em cada fotograma individual. Esta informação foi exportada para uma tabela de formato Excel com três colunas, nomeadamente as coordenas X e Y e o número do frame correspondente. Aos diferentes ficheiros Excel foram dadas denominações distintas, de forma a se identificar facilmente a que condição experimental se tratava, nomeadamente o número do ensaio (1 a 9), data, hora inicial da gravação, momento da gravação (“Antes” ou “Depois” da contaminação), câmara (esquerda, centro ou direita), arena (A, B, C, ou D) e tóxico (Controlo, Líxivia, Lindano, Tributilestanho, Mercúrio ou Formol). Com a informação da localização do peixe transformada numa tabela de coordenadas X e Y foi possível calcular nove parâmetros descritores do movimento e fazer a análise estatística em programas convencionais. Todos as coordenadas foram centradas para que cada arena tivesse a mesma posição espacial, como se todas elas estivessem sobrepostas. 36 Verificando-se que todas as séries temporais apresentavam uma taxa de erro bastante baixa (Tabela 6), cerca de 8%, aceitou-se que o modelo se adequava aos resultados. O modelo foi ajustado para comportar nove dimensões, ou seja, criou nove categorias de dados e agrupou-os segundo as suas semelhanças. No Anexo 2 pode verse um resumo das categorias criadas, o valor médio e o desvio padrão das nove variáveis que as constituem. Na Figura 1, pode ver-se a importância dada a cada variável na definição das categorias. Por exemplo, a variável coordenada X (mm) foi extremamente importante na definição da categoria (1,2) mas pouco significativa para a categoria (3,2). Figura 6 - Statistica Weights Spreadsheet: Resumo da importância de cada uma das variáveis (coordenada X, coordenada Y, velocidade linear, aceleração linear, ângulo entre os segmentos formados pelas coordenadas do peixe em três frames sucessivos, velocidade angular, aceleração angular, meander absoluto e dispersão) na definição das nove categorias criadas pela Cluster Analysis. 37 3.3. Análise de Correspondência Realizou-se uma Análise de Correspondência que aliada ao teste do X2 permitiu compreender que variáveis ou conjugação de variáveis foram importantes para o diagnóstico, isto é, que categorias de comportamento se constituíram mais informativas em cada condição experimental e quais foram as mais afetadas pela presença ou ausência de contaminante. Através da análise da Figura 2, pode ver-se que alguns tipos de comportamentos puderam ser associados a uma dada condição experimental, por exemplo: um aumento da frequência da categoria (3,1) estava relacionado com a ausência de toxicidade. De forma contrastante, o aumento da frequência da categoria (1,3) estava relacionado com a presença de toxicidade. Isto significa que a condição experimental “Controlo” apresentou uma elevada frequência da categoria (3,1) e reduzida frequência da categoria (1,3). Figura 7 - Statistica Standardized Deviates: Resumo do desvio da frequência entre os valores observados e valores esperados, em cada uma das condições experimentais, nomeadamente: Controlo (Sem), Lixívia (lix), Lindano (Lin), TBE, Mercúrio (Hg) e Formol (For). 38 O Teste do X² (Tabela 7 – Chi Squares) demonstrou a existência diferenças significativas entre as diferentes condições experimentais. Tabela 7 – Statistica Eigenvalues and Inertia for all Dimensions: Valores próprios e estatísticas relacionadas. Number of Dims. Eigenvalues and Inertia for all Dimensions (Predictions spreadsheet (Ensaios João 2014 Statistica 1) in Ensaios João 2014 Statistica 1 SOM 3x3) Input Table (Rows x Columns): 9 x 6 Total Inertia=,14250 Chi²=7151,4 df=40 p≈0,0000 Include condition: Momento="+" and (Sample="Train" or Sample="Test") Singular Values EigenValues Perc. of Inertia Cumulatv Percent Chi Squares 1 0,275196 0,075733 53,14438 53,1444 3800,578 2 0,191097 0,036518 25,62589 78,7703 1832,615 3 0,127466 0,016248 11,40145 90,1717 815,366 4 0,107702 0,011600 8,13994 98,3117 582,122 5 0,049050 0,002406 1,68833 100,0000 120,740 Dado que o valor de significância foi inferior a 0,05% (p ≈ 0,0000), foi possível afirmar que existiram, de facto, diferenças de comportamento estatisticamente significativas entre as condições experimentais. A Análise de Correspondência foi feita sem as frames correspondentes à série de validação previamente definida pela Cluster e sem o momento “Antes”. A primeira exclusão, permitiu ao modelo trabalhar “às cegas”, não utilizando os dados que mais tarde seriam utilizados para a validação do método de diagnóstico. A segunda exclusão, representa uma vantagem na deteção de contaminação em situações reais, dado que não é necessário definir-se previamente um comportamento de referência sem tóxico para cada peixe que se utilize na monitorização, ou seja, não é necessário que cada peixe seja usado como controlo de si próprio. Neste caso, a Análise de Correspondência criou um espaço penta dimensional, dado que o número de dimensões é calculado pela fórmula: nº de condições experimentais - 1. Neste espaço são definidos cinco vetores (1. Vetor Lixívia, 2. Vetor Lindano, 3. Vetor TBE, 4. Vetor Mercúrio, 5. Vetor Formol) que representam o efeito da adição dos tóxicos, 39 e que são calculados pela diferença entre o ponto “Sem Tóxico” e os pontos “Lix”, “Lin”, “TBE, “Mer” e “For”. Estes pontos representam o conjunto das unidades experimentais com o respetivo contaminante. Para realizar o diagnóstico, as amostras do momento “Depois” da série de validação foram projetadas como pontos suplementares no espaço penta dimensional definido pela Análise de Correspondência; e calculada a distância escalar dessas amostras a cada um dos Vetores Tóxico definidos previamente. Cada amostra é um ponto que representa a média das duas réplicas (por condição experimental), presentes nos nove ensaios. As distâncias calculadas medem o grau de alteração verificado em cada amostra, no sentido e direção dos cinco Vetores Tóxico. De forma a cada vetor ter o mesmo peso, os valores foram padronizadas através da média e do desvio-padrão das amostras. Por cada amostra obtiveram-se cinco estimativas diferentes do grau de alteração verificado, que representam a distância escalar aos cinco Vetores Tóxicos. Cada uma serviu para diagnosticar separadamente a presença ou ausência de contaminação na água. O diagnóstico geral e indiferenciado foi dado por estas cinco distâncias escalares, sendo positivo, se for positivo em pelo menos uma medida deste grupo, negativo, se for negativo em todas essas medidas, e incerto, se for incerto em todas elas. O diagnóstico foi efetuado dividindo os Vetores Tóxicos em três segmentos. As amostras projetadas no segmento inferior, foram diagnosticadas como não apresentando tóxico, as amostras projetadas no segmento superior, foram diagnosticadas como apresentando tóxico, e as amostras projetadas no segmento intermédio, foram diagnosticadas como incertas. Estes pontos de corte nos segmentos podem ser afinados, de forma a melhorar os parâmetros de diagnóstico. Todos os diagnósticos foram feitos por par de réplica, de modo a diminuir o grau de incerteza dos mesmos. Foram excluídos dois diagnósticos, uma vez que os peixes saltaram para o exterior da arena de filmagem, numa das unidades dos pares de réplicas. Os resultados dos diagnósticos são apresentados na Tabela 8, em valores absolutos. 40 Tabela 8 – Resultados dos diagnósticos: Número de diagnósticos verdadeiro positivo, verdadeiro negativo, falso positivo, falso negativo e incerto, por condição experimental, nomeadamente: Lixívia, Lindano, TBE, Mercúrio e Formol. Os valores apresentados são valores absolutos. Diagnóstico Lixívia Lindano TBE Mercúrio Formol Geral Verdadeiro Positivo 6 6 8 7 7 34 Verdeiro Negativo 7 7 7 7 7 7 Falso Positivo 1 1 1 1 1 1 Falso Negativo 0 2 0 2 1 5 Incerto 3 0 1 0 1 5 Total 17 16 17 17 17 52 Foram calculados os valores de exatidão, sensibilidade, especificidade, VPP e VPN (Tabela 9), necessários na validação de qualquer instrumento de diagnóstico e importantes para comprovar o sucesso ou fracasso do modelo. É importante referir que, para o cálculo dos valores de qualidade de diagnóstico por contaminante, só foram contabilizados os oito brancos e as condições experimentais do composto correspondente. Procedeu-se como se cada um deles tivesse sido testado independentemente, no entanto os controlos negativos usados como termo de comparação foram os mesmos em todas as análises. 41 Tabela 9 – Resultados da qualidade do diagnóstico: Valores de exatidão, sensibilidade, especificidade, VPP e VPN por condição experimental, nomeadamente: Lixívia, Lindano, TBE, Mercúrio e Formol. Os valores apresentados encontram-se em unidades percentuais. Qualidade de diagnóstico Lixívia Lindano TBE Mercúrio Formol Geral Exatidão 76 81 88 82 82 79 Sensibilidade 66 75 88 77 77 77 Especificidade 88 88 88 88 88 88 Valor Preditivo Positivo 86 86 89 88 88 97 Valor Preditivo Negativo 100 78 100 78 88 58 Nos diagnósticos gerais positivos (certos e errados), e apenas para estes, procurou- -se estimar o contaminante que supostamente estaria a causar a perturbação detetada (Tabela 10). Tabela 10 – Resultados da identificação dada pelas medidas das distâncias escalares, por condição experimental, nomeadamente: Lixívia, Lindano, TBE, Mercúrio e Formol. Os valores apresentados são valores absolutos. Identificação Lixívia Lindano TBE Mercúrio Formol Geral Correta 1 3 4 2 4 14 Incorreta 2 5 5 3 6 21 Total 3 8 8 5 10 35 Esta identificação foi feita por intermédio das medidas das distâncias escalares calculadas anteriormente. A identificação do contaminante foi dada pela medida que entre 42 todas apresentasse o valor mais elevado. Dos cinquenta e dois diagnósticos realizados, trinta e cinco foram diagnosticados pelo modelo como contendo tóxico. Desses diagnósticos gerais positivos, catorze foram corretamente identificados, sendo que os restantes vinte e um foram incorretamente identificados. Por exemplo, a presença de Lixívia foi identificada três vezes pelo método, sendo que uma identificação estava correta e as restantes não. 43 4. Discussão O presente estudo teve como principal objetivo testar a capacidade de diagnóstico de um sistema de vídeo rastreio e confrontá-lo com cinco tóxicos distintos, de forma a garantir a sua fiabilidade. Adicionalmente foi possível obter informações importantes, nomeadamente de que forma o comportamento do Peixe Zebra é alterado quando exposto a estes contaminantes. Esta informação pode revelar-se essencial, não só para este como para outros trabalhos, porque permite ter uma perspetiva sobre os efeitos que estes contaminantes possam ter sobre as comunidades biológicas aquáticas. Apesar de se ter analisado apenas uma imagem bidimensional do espaço, a escolha acertada das variáveis e a relação direta destas com a atividade dos peixes tornou possível identificar os comportamentos típicos das diferentes condições experimentais. De uma forma geral, e salvo algumas exceções, as diferentes condições experimentais com a presença de contaminação apresentaram diferenças estatisticamente significativas nas nove variáveis analisadas, quando comparadas com o controlo. Em primeiro lugar, a análise das coordenadas médias X e Y (Tabela 2) permitiu obter uma imagem geral da posição média do peixe na arena. Uma vez que cada uma delas tinha 175 mm de comprimento e 100 mm de largura, o ponto médio é dado pelas coordenadas x = 88 e y = 50. No caso da coordenada Y, a relação não foi tão evidente, mas quando analisada a coordenada X, foi possível verificar que todas as condições apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre si (Anexos 1, Tabela 1 e 2). O controlo apresentou o valor médio de X (86 mm) mais próximo do centro deste eixo (88 mm), o que significa que em média os peixes nesta condição se encontravam muito perto do centro do eixo. Já nas condições com tóxico, os peixes apresentaram uma posição média menos centrada, mas ainda longe dos limites do eixo (x = 0 e x = 175). Na presença de Formaldeído (x = 80,68 mm) verificou-se a menor diferença em relação ao controlo, enquanto a presença de Lixívia (x = 71,07 mm) apresentou a maior variação. Os resultados parecem indicar que a exposição a estes contaminantes aumenta o comportamento de fuga, dado que os animais apresentaram maior tendência para se afastar do centro da arena e procurar zonas mais periféricas. Este comportamento é considerado uma resposta adaptativa e é utilizado como estratégia para facilitar a procura de abrigo, proteção ou vias de fuga a predadores (Ahmad e Richardson, 2013). É frequentemente observado quando os animais são sujeitos a condições de stress, como no caso de habituação a novos ambientes (Sharma et al., 2009). 44 Em relação à velocidade (mm/s) e aceleração (mm/s2) linear médias (Tabelas 3 e 4), foi possível verificar que todas as condições experimentais com tóxico apresentaram valores mais elevados que o controlo (35,24 mm/s e 101,90 mm/s2, respetivamente), tendo o Formaldeído apresentado os valores mais semelhantes à condição sem tóxico, sendo a diferença estatisticamente significativa no caso da velocidade (36,46 mm/s), mas não no caso da aceleração (103,37 mm/s2). Mais uma vez, a Lixívia (51,63 mm/s e 147,41 mm/s2) apresentou a maior variação em relação ao controlo. Este aumento de velocidade e aceleração (aumento da atividade natatória), quando exposto a contaminantes pode parecer contraditório, no entanto as respostas comportamentais dos organismos podem não apresentar uma relação de proporcionalidade direta com a concentração de tóxico presente. Isto é, baixas concentrações podem ser responsáveis pelo aumento de determinadas caraterísticas, como a velocidade ou aceleração, enquanto concentrações mais elevadas podem ser responsáveis pela diminuição das mesmas (Little et al., 1990; Little e Finger, 1990). Os resultados deste trabalho estiveram de acordo aos obtidos em 2007 por Magalhães et al. que verificaram um aumento da distância percorrida por Danio rerio exposto a Lixívia durante cinco horas, distância esta que foi diminuindo de forma progressiva com o aumento da concentração da contaminação. É importante referir que a concentração mínima utilizada pelos autores acima referidos (4,8 mg/L) foi cerca de dez vezes superior e que o tempo de exposição foi cinco vezes superior ao do presente estudo, o que demonstra a grande sensibilidade por parte do sistema de vídeo rastreio desenvolvido neste trabalho. Para os restantes parâmetros menos clássicos a bibliografia não é extensiva e os termos de comparação foram difíceis de obter. No caso da velocidade angular (graus/s) média (Tabela 3), existiram resultados estatisticamente significativos acima e abaixo dos verificados no controlo. Este parâmetro indica o grau de curvatura por unidade de tempo, ou seja a velocidade de rotação dos animais. A Lixívia (221,74 graus/s) apresentou o valor mais próximo do controlo (220,77 graus/s), não sendo a diferença estatisticamente significativa. O Mercúrio (237,05 graus/s) apresentou o valor mais elevado e as condições Lindano (200,64 graus/s), Formaldeído (201,48 graus/s) e TBE (213,45 graus/s) apresentaram os valores médios mais baixos. No que diz respeito à aceleração angular (graus/s2) média (Tabela 4), o controlo apresentou o valor de 1024,21 graus/s2, sendo que todos os restantes valores foram significativamente superiores, com exceção do Formaldeído (1004,62 graus/s2). Este parâmetro indica a aceleração de rotação dos animais. 45 No caso do valor da dispersão (Tabela 5), dado pela raiz quadrada do produto dos desvios padrão X Y, o Formaldeído (13,80) surgiu mais uma vez como a única exceção, apresentando o único valor inferior ao controlo (15,64). As restantes condições experimentais apresentaram valores superiores, no entanto, apenas no caso do TBE (15,67) as diferenças não foram estatisticamente significativas. Este parâmetro é bastante útil na caracterização do comportamento porque dá uma ideia geral acerca da atividade natatória dos peixes, sendo que valores mais baixos indicam menor atividade e valores mais altos uma maior dispersão pelo aquário. A análise dos valores do ângulo entre os segmentos formados pelas coordenadas do peixe em três frames sucessivas (Tabela 5) revelou-se bastante interessante, por ter permitido perceber a orientação de rotação dos peixes. No caso dos valores negativos, as rotações foram feitas maioritariamente para o lado esquerdo, sendo que no caso de valores positivos verificou-se o oposto. Com exceção do TBE (-1,21º) todos os valores foram significativamente diferentes dos do controlo (-1,28º). Ao contrário de todas as outras condições, no caso do Lindano (0,47º) e do Mercúrio (2,90º) as rotações observadas verificaram-se maioritariamente para a direita. Por fim, no que diz respeito ao valor médio do meander absoluto (Tabela 5), o controlo (30,69 graus/mm) apresentou o valor mais elevado, enquanto as condições experimentais com tóxico obtiveram valores mais reduzidos e estatisticamente significativos. O Lindano (16,08 graus/mm) apresentou a maior variação em relação ao controlo e o Formol a menor variação (22,34 graus/mm). Este valor indica o grau de curvatura por unidade de deslocação (graus/mm), como tal, pode-se inferir que todos os peixes nas condições experimentais sujeitas a contaminação apresentaram um perfil de deslocação com uma trajetória menos acentuada, isto é, com menor curvatura. De uma forma geral, as condições com tóxico apresentaram um aumento de atividade natatória dos peixes em relação ao controlo. Esta observação é corroborada principalmente pela análise dos valores de velocidade linear média, dado que as condições com contaminantes apresentaram sempre valores significativamente superiores aos registados no controlo. Os valores de aceleração linear e angular média e dispersão vão também, de um modo geral, de encontro a esta observação. Este aumento de atividade natatória pode ser explicado pelo instinto de fuga presente nos animais, que tentam desta forma evitar a exposição aos agentes tóxicos (Magalhães et al., 2007). Esta capacidade de resistência pode indicar que os organismos estão perto do limite de exposição tolerável para o agente em questão, mas ainda dentro dos valores de NOAEC (Magalhães et al., 2007). 52 13. Blaser, R., Vira, D. (2014). Experiments on learning in zebrafish (Danio rerio): a promising model of neurocognitive function. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 42, 224-231. 14. 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Anexos Anexo 1 - Grupos Homogéneos Tabela 1 - Grupos Homogéneos formados pelo Turkey Honest Significance Test referentes ao valor médio da variável coordenada X (mm) nas condições experimentais Controlo (Cont), Lixívia (Líx), Lindano (Lin), TBE, Mercúrio (Mer) e Formol (For). O valor de significância (Sig) é apresentado no final. Condição Experimental Coordenada X (mm) 1 2 3 4 5 6 Tukey HSD Líx 71,071256 Lin 72,449234 Mer 73,93915 TBE 75,504401 For 80,683377 Cont 86,003012 Sig 1 1 1 1 1 1 Tabela 2 - Grupos Homogéneos formados pelo Turkey Honest Significance Test referentes ao valor médio da variável coordenada Y (mm) nas condições experimentais Controlo (Cont), Lixívia (Líx), Lindano (Lin), TBE, Mercúrio (Mer) e Formol (For). O valor de significância (Sig) é apresentado no final. Condição Experimental Coordenada Y (mm) 1 2 3 4 Tukey HSD TBE 40,6424128 For 42,9820710 Cont 45,3827108 Mer 45,5377832 Lin 45,6345963 Líx 47,3461981 Sig 1 1 0,772 1