Novas estratégias no tratamento de lesões de nervo periférico - Artigo de revisão bibliográfica

1 UNIVERSIDADE DO PORTO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS ABEL SALAZAR Dissertação – Artigo de revisão bibliográfica NOVAS ESTRATÉGIAS NO TRATAMENTO DE LESÕES DE NERVO PERIFÉRICO Isabel Alexandra Fernandes Lemos | Mestrado Integrado em Medicina | Porto, 2015 Dissertação – Artigo de Revisão Bibliográfica 2 Mestrado Integrado em Medicina Artigo de Revisão Bibliográfica Ano Letivo 2014 / 2015 NOVAS ESTRATÉGIAS NO TRATAMENTO DE LESÕES DE NERVO PERIFÉRICO Isabel Alexandra Fernandes Lemos Aluna do 6.º ano profissionalizante do Mestrado Integrado em Medicina Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto Rua de Jorge Viterbo Ferreira nº 228, 4050-313 Porto, Portugal Orientadora: Professora Doutora Ana Colette Pereira de Castro Osório Maurício Professora Associada com Agregação/Vice-Presidente do Conselho Pedagógico Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto Co-orientador: Professor Doutor Manuel Melo Pires Professor de Neurologia/Consultor de Neuropatologia Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto; Centro Hospitalar do Porto – Hospital de Santo António; Tese redigida de acordo com as regras preconizadas pela Comissão de Vancouver. Texto redigido ao abrigo do novo acordo ortográfico em vigor. III Para o Rui que com o seu Brilho sempre me guiou ... I AGRADECIMENTOS À Professora Doutora Ana Colette, agradeço por ter aceitado o desafio de me orientar, pela sua competência científica, profissionalismo, disponibilidade e generosidade. Obrigada pelas valiosas sugestões e por me recordar que “uma vez investigadora, para sempre investigadora”. Ao Professor Doutor Melo Pires agradeço a co-orientação desta tese e o contributo na sua elaboração. À minha Família, as palavras nunca serão suficientes para expressar a minha imensa gratidão; agradeço a confiança inabalável, o apoio incondicional, o carinho inesgotável e todos os sacrifícios feitos. Um bem-haja do tamanho do mundo. II RESUMO O sistema nervoso periférico está sujeito a lesões provenientes de acidentes, de origem externa ou interna, tipicamente lesões por esmagamento ou compressão, isquemia, inflamação e secção, acompanhada ou não de perda de substância. Nos casos particulares de secção do nervo em que não é possível neurorrafia sem tensão, é comum a interposição de um enxerto, que poderá ser um substituto artificial, aloenxerto ou autoenxerto. Contudo, o uso de enxertos tem várias limitações, nomeadamente o espaço entre topos, diâmetro e tipo de fibra, e lesão do local da colheita. Para ultrapassar estas limitações, surgiu a técnica da tubulação e com ela a investigação e desenvolvimento de biomateriais para regeneração do nervo periférico. A tubulação tem como objetivo a orientação do crescimento neuronal, prevenindo a formação de neuromas e o crescimento de tecido fibroso, e promovendo a acumulação de fatores neurotróficos em concentrações fisiológicas, criando um microambiente favorável à regeneração do nervo. Os tubos-guia têm sido a alternativa utilizada pelos cirurgiões, sempre que haja perda significativa de nervo e em que seja impossível a neurorrafia sem tensão excessiva, permitindo o crescimento dos axónios com perturbação mínima do processo de regeneração. Com os tubos-guia, surgiu a possibilidade de manipular o microambiente entre os dois topos do nervo, e com o desenvolvimento da Engenharia de Tecidos, surgem inúmeras combinações possíveis entre biomateriais e agentes celulares, fatores neurotróficos, proteínas ou peptídeos componentes da matriz extracelular. O objetivo deste trabalho é a compilação e sistematização da informação mais recente relativa a novas estratégias de tratamento de lesões de nervo periférico, tendo por base a utilização de tubos-guia, que podem ser implantados vazios ou preenchidos com células. Será dada particular relevância à utilização de sistemas celulares como terapias celulares adjuvantes ao processo de regeneração do nervo após lesões de axonotmese e de neurotmese. A utilização de terapias celulares na regeneração do sistema nervoso periférico tem sido largamente estudada e foi demonstrada grande utilidade clínica promovendo uma melhor regeneração morfológica e funcional. Palavras-chave: Regeneração de nervo periférico; Microcirurgia reconstrutiva; Biomateriais; Engenharia de Tecidos; Sistemas celulares; Células estaminais mesenquimatosas. III ABSTRACT The peripheral nervous system is subjected to injury from accidents, either from external or internal sources, typically injuries from crushing or compression, ischemia, inflammation and section, with or without loss of substance. In particular cases of nerve section where neurorraphy is not possible without tension, graft interposition by an artificial substitute, allograft or autograft is common. However, the use of grafts has several limitations, namely the space between stumps, diameter and type of fiber, and secondary donor site injury. To overcome these limitations, it has emerged the tubulation technique with development of new biomaterials for peripheral nerve regeneration. Tubulation aims the guidance of neuronal growth, preventing neuromas formation and fibrous tissue growth, and promoting neurotrophic factors accumulation in physiological concentrations, creating a microenvironment favorable to nerve regeneration. The guide-tubes have been used by surgeons as an alternative, where there is significant loss of nerve and neurorrhaphy with no excessive stress is impossible, allowing the correct growth of axons with minimal disturbance of the regeneration process and improving the functional recovery outcome of the patients. With the tube-guides, it has become possible to manipulate the microenvironment between the two nerve stumps, and with the development of Tissue Engineering, several possible combinations of biomaterials and cellular agents, neurotrophic factors, proteins, peptides, or extracellular matrix components emerged for improving the regeneration process after peripheral nerve lesions. The objective of this work is the compilation and systematization of the latest information on new strategies for treating peripheral nerve injuries, based on the use of tubeguides and cellular systems, which can be implanted either empty or filled with cells. It will be given particular relevance to the use of cellular systems in Cellular Therapies, since they have been extensively studied and shown great clinical utility in Regenerative Medicine, including peripheral nerve regeneration. Keywords: Peripheral nerve regeneration; Reconstructive microsurgery; Biomaterials; Tissue Engineering; Cellular systems; Mesenchymal stem cells. IV LISTA DE ABREVIATURAS ATMSCs – células estaminais mesenquimatosas derivadas do tecido adiposo AFMSCs – células estaminais derivadas do líquido amniótico BDNF – brain-derived neurotrophic factor BMMSCs – células estaminais mesenquimatosas derivadas da medula óssea DPBS – Dulbecco's phosphate-buffered saline DPSCs – células estaminais mesenquimatosas da polpa dentária ECM – matriz extracelular ePTFE – politetrafluoroetileno ESCs – células estaminais embrionárias EUA – Estados Unidos da América FDA – Food and Drug Administration G-CSF – fator estimulante de colónias de granulócitos GDNF – glial-derived neurotrophic factor HBSS – Hank's balanced salt solution hDPSCs – células estaminais da polpa dentária humanas hMSCs – células estaminais mesenquimatosas derivadas da geleia de Wharton humanas ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar mDPSCs – células estaminais da polpa dentária de ratos MSCs – células estaminais mesenquimatosas NGF – nerve growth factor NP – nervo periférico NSCs – células estaminais neurais NT-3 – neurotrophin 3 OECs – células da mucosa olfativa PGA – ácido poliglicólico PLC – poli-ε-caprolactona PLGA – ácido poli-L-láctico-co-glicólico PLLA – ácido poli-L-láctico SC – célula de Schwann SKPCs – células precursoras derivadas da pele SNC – sistema nervoso central SNP – sistema nervoso periférico UC – cordão umbilical V LISTA DE TABELAS Tabela I. Classificação das lesões do NP. LISTA DE FIGURAS Figura I. Estojo de Microcirurgia. Figura II. Lesão de axonotmese (por esmagamento) (A); Lesão de neurotmese com um gap de 10 mm (B); Lesão de neurotmese reconstruída cirurgicamente com um tubo-guia de quitosano (C). Figura III. Tubos-guia de vários biomateriais: (A) Ácido poli-L-láctico-co-glicólico 90:10 (PLGA 90:10); (B) Poli-ε-caprolactona (PLC, Neurolac®); (C) híbrido de quitosano tipo III; (D) polivinilálcool (PVA) carregado com nanotubos de carbono (CNTs), PVA carregado com polipirrol e apenas de PVA. Figura IV. Cortes transversais de cordão umbilical, com diferentes ampliações onde podemos observar a matriz ou geleia de Wharton a partir da qual são isoladas células estaminais mesenquimatosas (MSCs). Figura V. Células estaminais mesenquimatosas (MSCs) indiferenciadas humanas isoladas da geleia de Wharton (A) e após diferenciação em células tipo neuro-glial (B). A diferenciação ocorreu na presença de meio de cultura neurogénico durante 96 horas (100x). Figura VI. Dentes definitivos (pré-molar e caninos inferiores) extraídos de um dador adulto saudável com 45 anos por razões de correção ortodôntica. Podem observar-se as perfurações realizadas com um drill de 0.12 mm para entrada do meio de cultura na zona da polpa dentária. (A) MSCs isoladas da polpa dentária do dente pré-molar. (B) MSCs isoladas da polpa dentária do dente canino. VI ÍNDICE AGRADECIMENTOS ..................................................................................................................................... I RESUMO ....................................................................................................................................................... II ABSTRACT .................................................................................................................................................. III LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................................ IV LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................... V LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................... V 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................................... 1 2. NERVO PERIFÉRICO ............................................................................................................................... 2 2.1. ANATOMIA DO NERVO PERIFÉRICO ............................................................................................. 2 2.2. LESÃO DO NERVO PERIFÉRICO .................................................................................................... 3 2.2.1. CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES DO NERVO PERIFÉRICO .................................................... 3 2.2.2. DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO DOS NERVOS PERIFÉRICOS ..................................... 3 3. MICROCIRURGIA RECONSTRUTIVA ..................................................................................................... 5 4. AUTOENXERTOS ..................................................................................................................................... 6 5. BIOMATERIAIS E ENGENHARIA DE TECIDOS ..................................................................................... 7 5.1. BIOMATERIAIS NA FABRICAÇÃO DE TUBOS-GUIA ...................................................................... 8 5.1.1. BIOMATERIAIS NATURAIS ........................................................................................................ 8 5.1.1.1. TECIDOS ACELULARES ..................................................................................................... 8 5.1.1.2. BIOPOLÍMEROS NATURAIS ............................................................................................. 10 5.1.2. BIOMATERIAIS SINTÉTICOS .................................................................................................. 12 5.1.2.1. MATERIAIS SINTÉTICOS NÃO DEGRADÁVEIS ............................................................. 13 5.1.2.2. MATERIAIS SINTÉTICOS DEGRADÁVEIS ...................................................................... 13 5.2. SISTEMAS CELULARES ................................................................................................................. 15 5.2.1. CÉLULAS DA MUCOSA OLFATIVA ......................................................................................... 16 5.2.2. CÉLULAS ESTAMINAIS EMBRIONÁRIAS .............................................................................. 17 5.2.3. CÉLULAS ESTAMINAIS NEURAIS .......................................................................................... 17 5.2.4. CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS ..................................................................... 18 5.2.4.1. CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA ..... 18 5.2.4.2. CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS DERIVADAS DO TECIDO ADIPOSO.. 19 5.2.4.3. CÉLULAS PRECURSORAS DERIVADAS DA PELE ........................................................ 20 5.2.4.4. CÉLULAS ESTAMINAIS EXTRA-FETAIS ......................................................................... 20 5.2.4.5. CÉLULAS ESTAMINAIS DERIVADAS DA POLPA DENTÁRIA ........................................ 23 6. CONCLUSÃO .......................................................................................................................................... 25 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................ 27 7 a primeira escolha para reparar lesões de NPs. Tipicamente, o enxerto escolhido é um nervo colhido de outra parte do corpo. O sucesso dos autoenxertos deriva da presença de SCs e da lâmina basal dos tubos endoneurais, que fornecem fatores neurotróficos, e de moléculas de adesão da superfície dos tubos endoneurais para regenerar os axónios. Os nervos mais utilizados são o nervo sural, o nervo grande auricular e o nervo antebraquial medial (40) ou de uma forma geral um nervo sensitivo, visto não haver um grande número de nervos motores disponíveis para colheita, com um mínimo de morbilidade local. No entanto, existem desvantagens inerentes à sua utilização, nomeadamente a oferta limitada de nervos doadores, o sacrifício de um nervo funcional (41), a necessidade de uma segunda cirurgia, a morbidade da área doadora, um desfasamento entre o nervo doador e o local do destinatário e a formação de cicatrizes e neuromas (37, 42). Embora os autoenxertos nervosos sejam amplamente utilizados para a regeneração do NP, apenas 40-50% dos doentes conseguem atingir um grau útil de recuperação funcional (12). Em alternativa aos enxertos de nervo autólogos, têm sido exploradas várias outras fontes autólogas não-nervos como potenciais enxertos nas lesões dos NPs, tais como veias, tendões, músculos e baínhas epineurais, mostrando um sucesso limitado (1, 40, 4347) e disponibilidade inadequada devido à sua origem autóloga. Para superar as desvantagens dos autoenxertos, nervosos ou não-nervosos a utilização de aloenxertos e a técnica da tubulação com biomateriais têm sido amplamente estudada e utilizada. 5. BIOMATERIAIS E ENGENHARIA DE TECIDOS Os Biomateriais e a Engenharia de Tecidos são áreas da ciência em franco desenvolvimento cujas aplicações em Medicina Humana têm vantagens indiscutíveis. O uso de materiais tridimensionais para a regeneração de tecidos é hoje uma técnica cada vez mais usada a que se dá o nome de Regeneração de Tecidos Guiada, sendo a regeneração do NP um forte candidato. Nos últimos 15 anos tem vindo a crescer o interesse do uso da Engenharia de Tecidos na reparação de NP, a par das respetivas técnicas de microcirurgia (48, 49). No âmbito da Engenharia de Tecidos surgem também inúmeras combinações possíveis entre biomateriais e agentes celulares (células de Schwann, células estaminais, células musculares), fatores neurotróficos, proteínas ou peptídeos componentes da matriz extracelular (laminina, fibronectina) e outros substratos (hidrogéis, nano/micro fibras) que parecem ser inesgotáveis, sendo quase impossível abarcar toda a informação fornecida à comunidade científica sobre este tema. 8 5.1. BIOMATERIAIS NA FABRICAÇÃO DE TUBOS-GUIA Os tubos-guias ou scaffolds de enxertos nervosos obtidos por engenharia de tecidos são adequados em lesões de neurotmese para: (a) direcionar os axónios que brotam da extremidade proximal para a distal; (b) manter o adequado suporte mecânico às fibras nervosas em regeneração; (c) proporcionar um canal de conduta para a difusão de fatores neurotróficos e neurotrópicos segregados na regeneração local; (d) fornecer uma parede de conduta para a troca de nutrientes e produtos residuais com o meio envolvente; (e) limitar a infiltração de tecido cicatricial fibroso que impede a regeneração axonal; e (f) criar um microambiente ideal para a regeneração do nervo através da acumulação e libertação de efeitos bioquímicos exógenos e endógenos (49, 50). Para uso clínico, o scaffold neural deverá ser fácil de fabricar e esterilizar, e simples de implantar no NP por meio de técnicas microcirúrgicas. Até ao momento, tem sido usada uma gama muito variada de biomateriais naturais ou sintéticos, em conjunto com técnicas de fabrico bem definidas, para preparar scaffolds neurais com estruturas diferentes, sendo a estrutura básica uma conduta tubular para guia do nervo. O tubo-guia ideal deverá satisfazer algumas necessidades biológicas e físico-químicas, nomeadamente biocompatibilidade, biodegradabilidade, permeabilidade a iões, metabolitos, e para a revascularização do nervo regenerado, propriedades biomecânicas e de superfície que modulam a adesão do sistema celular (51-54). Estas propriedades são determinadas principalmente pelo material e estrutura do tubo-guia, tendo já sido testados muitos biomateriais, quer de origem natural quer sintética. 5.1.1. BIOMATERIAIS NATURAIS Os biomateriais naturais são muito úteis na engenharia de tecido nervoso uma vez que estimulam a adesão, migração, crescimento e proliferação de células, e permitem evitar os prováveis efeitos tóxicos induzidos pelos materiais sintéticos inertes devido à sua boa biocompatibilidade. 5.1.1.1. TECIDOS ACELULARES Os tecidos alogénicos (da mesma espécie) e até xenogénicos (de espécies diferentes) (55) são alternativas possíveis aos autoenxertos, mas embora estejam disponíveis e sejam abundantes, apresentam uma série de fatores de risco, como o desfasamento imunogénico e a possível transmissão de doenças (56). Em tais circunstâncias, é necessária a imunossupressão sistémica 9 de forma a prevenir a rejeição do enxerto, contudo a morbidade associada à terapia imunomoduladora limita a aplicação generalizada do aloenxerto de nervo (57). Por esta razão, tem sido desenvolvida uma estratégia para a remoção dos componentes imunogénicos, que consiste na preparação de tecidos alogénicos ou xenogénicos através de vários métodos de descelularização física, química e enzimática (58). Na prática, os métodos físicos mais usados são a congelação-descongelação, sonificação e agitação, enquanto os tratamentos químicos consistem essencialmente na utilização de detergentes (2, 59-61). Uma vez que a descelularização se centra na remoção ou destruição das células imunogénicas e na preservação dos componentes da matriz extracelular (ECM), os tecidos resultantes livres de células podem ser utilizados como enxertos de nervo em alternativa aos autoenxertos, especialmente na reparação de gaps não-críticos de NP com pequeno comprimento e diâmetro (62, 63). Estes tecidos alogénicos ou xenogénicos acelulares são caracterizados pela sua abundância em ECM e membranas basais, que servem como guias de orientação físicas para o crescimento axonal. Desta forma, os enxertos acelulares, tal como os nervos nativos, mantêm uma estrutura tridimensional à base de colagénio e a laminina, e podem oferecer algumas vantagens relativamente a tubos-guia ocos (64). Além disso, alguns estudos revelaram que a remoção de moléculas inibidoras do crescimento axonal, designadas proteoglicanos de sulfato de condroitína, a partir da lâmina basal, poderia potencialmente aumentar a eficácia de regeneração de enxertos alogénicos ou xenogénicos acelulares (65, 66). Têm sido publicados muitos trabalhos que mostram que os enxertos de nervo acelulares permitem colmatar grandes defeitos nervosos (67-71). Um grande ensaio clínico realizado por Brooks e colaboradores (72) mostrou excelentes resultados funcionais, semelhantes aos dos autoenxertos tradicionais e, embora os elevados custos dos aloenxertos nervosos comerciais disponíveis sejam uma preocupação, esta abordagem apresenta-se muito promissora como alternativa de sucesso para autoenxertos tradicionais. Existe atualmente um enxerto de nervo alogénico acelular disponível comercialmente, o Avance (AxoGen Inc. Alachua, FL), fabricado a partir da descelularização de nervo cadavérico doado. Este produto já foi aplicado em estudos de caso clínico e obteve resultados positivos (73-75). Dada a ausência de componentes bioativos estimulantes do crescimento axonal no interior dos tecidos acelulares, muitos esforços têm sido direcionados para a incorporação de células de suporte ou fatores de crescimento nos scaffolds neurais acelulares. A aplicação da engenharia de tecidos aos enxertos nervosos permitiu uma regeneração nervosa superior aos scaffolds neurais sozinhos, como evidenciado por muitos estudos experimentais com diferentes modelos animais (59, 76-78). 10 5.1.1.2. BIOPOLÍMEROS NATURAIS Moléculas insolúveis da ECM, tais como colagénio, laminina e fibronectina, desempenham um papel importante no desenvolvimento e crescimento dos axónios, e muitos outros proteoglicanos e glicosaminoglicanos podem modular a atividade neuronal e a extensão de neurites, proporcionando efeitos estimuladores ou inibidores (79, 80). Desta forma, os componentes da ECM tornaram-se candidatos muito importantes para scaffolds neurais, e foram processados predominantemente como preenchedores do lúmen de tubos-guia nervosos sob a forma de fibras, canais, esponjas porosas ou hidrogéis, para servir como veículos de administração para as células de suporte, fatores de crescimento ou drogas. O colagénio, componente base da EMC, é a principal proteína estrutural dos tecidos conjuntivos em animais e humanos. Devido à sua natureza intrínseca ou adquirida, o colagénio é frequentemente usado em implantes médicos, tais como peles artificiais e pensos curativos. Desde o início dos anos 90 que os tubos-guia à base de colagénio, processados sob diferentes formas, têm sido aplicados na reparação de lesões de NP com gaps de diferentes comprimentos com resultados clínicos satisfatórios (81-83). Por exemplo, tubos de silicone preenchidos com laminina, fibronectina e colagénio, levaram a melhor regeneração do nervo num gap de 10 mm no nervo ciático do rato em comparação com os controlos de silicone vazios (84). Outros estudos têm mostrado que as fibras de colagénio orientadas no interior de géis, alinhadas utilizando campos magnéticos, proporcionam um molde melhor para a extensão das neurites do que as fibras de colagénio orientadas aleatoriamente (85, 86). Foram alcançadas taxas de regeneração comparáveis àquelas que utilizaram um autoenxerto de nervo usando tubos de colagénio contendo uma matriz porosa de colagénio – glicosaminoglicano (87, 88). Até à data, os tubosguia nervosos disponíveis comercialmente são constituídos por colagénio bovino do tipo I. Os produtos NeuroMatrixTM, NeuroflexTM, NeuraGen, NeuraWrapTM e NeuroMendTM são aprovados pela FDA dos EUA (89) e têm sido colocados em uso clínico (90-94). Recentemente di Summa publicou um estudo que mostrou que os guias NeuraGen® têm alta afinidade para células regenerativas e podem ser usados como veículos eficientes para a entrega de células (95). Um novo tipo de produto, Revolnerv, fabricado a partir dos colagénios I+III altamente purificados derivados de pele de porco, está aprovado pela União Europeia e tem sido utilizado para reparar gaps de 10 mm no nervo peronial de ratos, com regeneração axonal motora e recuperação locomotora bem-sucedidas (96, 97). Está neste momento a decorrer um ensaio clínico para o tratamento de defeitos de NPs com Neuromaix (PeRepair), um tubo-guia nervoso à base de colagénio porcino, tendo por base vários trabalhos publicados pelo grupo de Bozkurt e colaboradores (98-101). 11 O grupo de investigação do ICBAS também desenvolveu algum trabalho relevante com colagénio, tendo testado membranas de colagénio equino tipo III em lesões de axonotmese no nervo ciático do rato, suplementadas com células N1E-115 in vitro diferenciadas em células neuro-gliais, e mostrou que a suplementação celular não tinha benefícios em termos de regeneração axonal, mas as membranas sozinhas poderiam suportar a recuperação da função motora (102, 103). Os resultados negativos observados deveram-se à utilização de um sistema celular diferenciado originado de uma linha celular imortalizada neoplásica, tendo-se optado por começar a utilizar células estaminais mesenquimatosas (MSCs), isoladas de tecidos extra-fetais. Mais recentemente, tem sido dirigida particular atenção ao quitosano, um derivado da quitina. A quitina é o segundo polissacarídeo mais abundante encontrado na natureza ao lado de celulose, e pode ser isolado a partir da casca exterior de crustáceos, exoesqueletos de insetos e paredes celulares dos fungos. É um biopolímero de unidades monoméricas de N-acetil-D-glucosamina e tem sido largamente aplicada numa ampla gama de dispositivos biomédicos. O quitosano é um copolímero de D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina e tem uma estrutura molecular muito semelhante à laminina, fibronectina e colagénio. Além disso, o quitosano tem propriedades antitumorais e antimicrobianas, e tem demonstrado ser promotor da migração e proliferação das SCs (104), logo tem propriedades biológicas favoráveis para a regeneração nervosa. O quitosano tem encontrado cada vez maior aplicação em engenharia de tecido nervoso, servindo como biomaterial candidato para o desenvolvimento de scaffolds neurais, tendo demonstrado uma eficácia notável na promoção da regeneração nervosa em modelos experimentais animais (105-109). Recentemente, um estudo comparou o desempenho de um tubo-guia de quitosano e de um autoenxerto na regeneração da lesão de neurotmese de nervo ciático num modelo de roedor e foram observados resultados semelhantes, indicando que o quitosano tem o potencial inerente de tratar grandes lacunas nervosas e de funcionar como estrutura de suporte para material de enchimento que poderá apoiar a regeneração nervosa (110). A associação do quitosano a componentes celulares também tem sido cada vez mais estudada, com diversos estudos publicados com MSCs (111), SCs(112), células estaminais derivadas de tecido adiposo (ATMSCs) (113), células N1E-115 (114), células estaminais derivadas da medula óssea (BMMSCs) (115). Uma vez que o quitosano é frágil na sua forma seca, tem que ser submetido ligação cruzada química ou pode ser usado conjuntamente com outros materiais antes da fabricação do scaffold. No grupo de investigação do ICBAS, Amado e colaboradores preparam membranas híbridas de quitosano para a tubulização do NP e mostraram que as membranas de quitosano tipo III liofilizadas (com microporos de aproximadamente 100 µm) foram particularmente eficazes na recuperação funcional do NP após axonotmese (Figura II.A) (114). Mais tarde, Simões e 12 colaboradores mostraram que as mesmas membranas também podem ser utilizadas com êxito para melhorar a regeneração axonal e recuperação funcional do NP após neurotmese do nervo ciático de rato (Figura II.B) (108). Mais recentemente, Shirosaki e colaboradores (116) estudaram a regeneração do NP utilizando membranas híbridas quitosano-siloxano porosas e mostraram que estas melhoraram significativamente a regeneração da fibra nervosa e a recuperação funcional em lesões de axonotmese e de neurotmese do nervo ciático em modelos de ratos. Independentemente da suplementação ou não das membranas com MSCs isoladas a partir de geleia de Wharton do cordão umbilical, o número de fibras nervosas mielinizadas regeneradas e a espessura da mielina foram significativamente maiores nos ratos tratados com as membranas híbridas quitosano-siloxano porosas. Figura II. Lesão de axonotmese (por esmagamento) (A); Lesão de neurotmese com um gap de 10 mm (B); Lesão de neurotmese reconstruída cirurgicamente com um tubo-guia de quitosano (C). Imagens gentilmente cedidas por Ana C. Maurício. 5.1.2. BIOMATERIAIS SINTÉTICOS Além dos biopolímeros naturais, os polímeros sintéticos constituem uma outra classe de biomateriais muito promissores para a fabricação de scaffolds neurais devido às suas propriedades físicas e químicas ajustáveis. Contudo, a biocompatibilidade de alguns destes 13 materiais sintéticos representa um desafio, porque eles são incompatíveis com a adesão celular e reparação tecidual; estes materiais sintéticos são muitas vezes modificados de forma a tornarem-se mais “cell friendly”. 5.1.2.1. MATERIAIS SINTÉTICOS NÃO DEGRADÁVEIS Historicamente, os materiais sintéticos não degradáveis foram testados antes dos materiais sintéticos biodegradáveis. O silicone tem sido estudado desde os anos 60 para a reparação de NP e os tubos de silicone representam um dos primeiros e mais frequentemente utilizados tubosguia de nervo preparados com materiais sintéticos, devido às suas propriedades inertes e elásticas. Embora seja não degradável no corpo e impermeável a moléculas grandes, os tubosguia de silicone fornecem um modelo importante para o estudo da regeneração do nervo, e têm sido aplicados em ensaios clínicos para colmatar pequenos gaps no nervo com algum sucesso (117, 118). Scaffolds não degradáveis também têm sido fabricados com plástico, tal como acrílico, polietileno, polivinil, elastómeros, entre outros, mas com resultados muito pobres (119). Materiais não degradáveis à base de silicone ou de politetrafluoroetileno (ePTFE) (Gore-Tex) foram usados para preparar os tubos-guia pioneiros em ensaios com roedores e humanos (117, 118, 120-122). Infelizmente, os materiais não degradáveis são deixados in situ como corpos estranhos após a regeneração do nervo, e, portanto, provocam uma reação de corpo estranho crónica com a formação de tecido cicatricial excessivo, podendo inibir a recuperação funcional do nervo (117). 5.1.2.2. MATERIAIS SINTÉTICOS DEGRADÁVEIS De modo a ultrapassar as desvantagens associadas aos materiais não degradáveis, a investigação para a preparação de scaffolds neurais tem-se centrado em materiais sintéticos biodegradáveis, os quais devem degradar num intervalo de tempo razoável. Os produtos de degradação são absorvidos pelo organismo, pelo que não deverão ser tóxicos ou induzir reações de corpo estranho. Além disso, as propriedades físico-químicas e biológicas dos materiais sintéticos biodegradáveis, podem ser adaptadas para corresponder a diferentes requisitos da aplicação, como reter algumas moléculas ou servir como suporte para um sistema celular. Os poliésteres alifáticos representam uma classe comum de polímeros sintéticos biodegradáveis, entre os quais o ácido poli-L-láctico (PLLA) (123-128), o ácido poliglicólico (PGA) (129-131), policaprolactona (PLC) e os seus copolímeros, incluindo o ácido poli-láctico-ε-caprolactona 14 (Neurolac®) (45, 132-134), ácido poli-L-láctico-co-glicólico (PLGA) (132, 135-139) e poli-1,3trimetilenocarbonato-ε-caprolactona (140), tornaram-se os biomateriais aprovados pela FDA usados no campo dos dispositivos médicos e têm sido amplamente utilizados como biomateriais para scaffolds neurais. Um estudo prospetivo, randomizado, multicêntrico sobre a reconstrução do nervo digital com guias de PGA (141), mostrou que este apresenta resultados superiores, tanto para pequenos gaps (<4 mm), em comparação com reparação topo-a-topo, como para gaps mais longos (até 30 mm), em comparação com autoenxertos nervosos. Um outro estudo mais recente, comparou PGA com condutas de veia autógena para a reconstrução de lacunas nervosas digitais e mostrou que a recuperação sensorial após a reconstrução do nervo digital com veia autógena foi equivalente à conduta utilizando PGA, com um perfil de custo similar e menos complicações pós-operatórias (142). Existem ainda diversos casos clínicos publicados sobre a utilização de condutas PGA-colagénio na reparação de lesões de NP, com resultados muito promissores (143-146), contudo este material ainda não está disponível comercialmente. Fan e colaboradores descreveram a aplicação de um enxerto de PGA-quitosano para reparar um defeito de 35 mm no nervo mediano no cotovelo de um paciente humano e após implantação observaram a evolução da recuperação da função motora e sensitiva do nervo, afirmando que este enxerto poderá ser usado na correção cirúrgica de defeitos extensos em NPs grandes em humanos (147). Mais tarde, Gu e colaboradores utilizaram o mesmo material para reparar um defeito de 30 mm no nervo mediano no antebraço distal de um paciente humano, o qual recuperou a abdução palmar e oposição digital do polegar, sugerindo uma possível estratégia para a reconstrução clínica de defeitos extensos em troncos nervosos periféricos em humanos (148). Um scaffold neural ideal também necessita de condutividade elétrica para promover o crescimento de neurites, porque o componente chave da comunicação neuronal no corpo é o potencial de ação gerado na sinapse. Daí que alguns polímeros eletricamente condutores, incluindo Polipirrola, Polianilina e Politiofeno, tenham sido testados para preparar scaffolds neurais, devido às suas propriedades elétricas e antioxidantes ajustáveis (149, 150). Polifosfoésteres, poliuretanos e polímeros piezoelétricos também têm sido tentados para preparar scaffolds neurais (53). Na Figura III são mostrados alguns exemplos de tubos guia. Apesar das vantagens dos diferentes polímeros sintéticos, um material sintético por si só não é suficiente para satisfazer plenamente todos os requisitos dos scaffolds neurais. Além disso, alterações nas condições de copolimerização afetam frequentemente as características dos copolímeros, pelo que estes podem ser superiores aos homopolímeros em certos aspetos. Atualmente, a utilização de copolímeros ou de misturas de polímeros como materiais para preparação de scaffolds neurais, representa um novo esforço de investigação. Embora vários ensaios clínicos mostrem que a aplicação de tubos-guia sintéticos na reconstrução de NP conduz a recuperação funcional de sucesso (141, 142, 151, 152), parece que os cirurgiões ainda estão 15 à espera de nova geração de guias nervosos que garantam resultados semelhantes (ou até melhores) em comparação com os autoenxertos tradicionais. Figura III. Tubos-guia de vários biomateriais: (A) Ácido poli-L-láctico-co-glicólico 90:10 (PLGA 90:10); (B) Poli-εcaprolactona (PLC, Neurolac®); (C) híbrido de quitosano tipo III; (D) polivinil-álcool (PVA) carregado com nanotubos de carbono (CNTs), PVA carregado com polipirrol e apenas de PVA. Imagens gentilmente cedidas por Ana C. Maurício. 5.2. SISTEMAS CELULARES A utilização de tubos-guia para a reparação de lesões de NPs tem alcançado algum sucesso, contudo apenas demonstraram uma evidente recuperação morfológica e funcional na reparação de lesões com um gap reduzido (102, 103, 108, 137, 153, 154). Quando o gap é muito grande, os tubos-guia permitem fazer a ponte entre os topos do nervo lesado, mas para uma regeneração eficaz, devem ser incorporadas células de suporte ou fatores de crescimento e/ou citocinas (155). Estes sistemas celulares quando implantados no nervo lesado podem produzir fatores de crescimento ou moléculas da ECM, ou podem modular o processo inflamatório, para melhorar a regeneração dos nervos (102, 103, 108, 137, 153). As SCs, as células estaminais neurais, as células estaminais embrionárias (ESCs), MSCs e as células do estroma da medula óssea são as células de suporte mais estudadas (153), embora várias outras tenham sido relatadas. A célula 16 estaminal ideal para aplicação clínica na reparação de NP deve ser facilmente acessível, com capacidade de expansão in vitro, capaz de sobreviver in vivo e integrar-se no tecido do hospedeiro, e deve ser passível de transfeção e expressão estável de genes exógenos (156). No processo de regeneração nervosa deve ser dada ênfase à importância do tipo de células estaminais, diferenciação, tubo-guia e método de aplicação das células, sendo que a influência de cada um destes componentes na regeneração nervosa tem sido extensivamente estudada (157). Embora exista muita investigação no enriquecimento dos tubos-guia com diferentes tipos de células, a abordagem mais razoável parece ser a utilização de células da glia devido ao seu papel fundamental na regeneração axonal (7). Durante o processo de regeneração, as células gliais suportam o recrescimento axonal não só mecanicamente, através da formação das bandas Büngner que orientam os axónios para os alvos de inervação distais, mas também através da secreção de uma série de fatores de crescimento e, juntamente com os macrófagos, da remoção de tecido necrótico e restos de mielina (7, 158, 159). Desta forma, a sua ausência dentro de um tubo-guia poderá ser um fator limitante que pode ser superado através do enriquecimento dos tubos-guia com este tipo de células ou dos seus precursores (119). A utilização de culturas de SCs autólogas é considerada impraticável por todas as dificuldades inerentes não só a recolha do nº de células suficientes, mas também da própria cultura, com consequentes atrasos indesejados na reparação nervosa (160-164). No entanto, alguns autores demonstraram que o transplante de SCs no interior de diferentes tubos-guia melhoraram não só a qualidade mas também a taxa de regeneração axonal (165-167). 5.2.1. CÉLULAS DA MUCOSA OLFATIVA – OECs Como alternativa às SCs vários estudos têm explorado a possibilidade de enriquecer tubos-guia nervosos com OECs. Estas são células com origem periférica, no palódio olfativo, que mantêm a capacidade de se autorrenovar e diferenciar, sendo consideradas células progenitoras de nervo periféricas (168). Os resultados mostraram que estas células gliais fornecem suporte trófico/trópico para os axónios em regeneração (136, 169-171) e que podem integrar-se no nervo reparado do hospedeiro e contribuir para a mielinização dos axónios regenerados (169, 172, 173). 23 5.2.4.5. CÉLULAS ESTAMINAIS DERIVADAS DA POLPA DENTÁRIA - DPSCs As DPSCs residem no nicho perivascular da polpa dentária e pensa-se que terão origem na migração de células da crista neural, as quais, durante o desenvolvimento embrionário, se diferenciam numa ampla variedade de células, incluindo neurónios do sistema nervoso periférico (264). As DPSCs podem ser colhidas a partir de dentes decíduos e, devido à grande quantidade de células presentes e aos métodos de isolamento não-invasivos comparativamente a outras fontes de tecido adultas, representam indiscutivelmente a fonte mais conveniente de células estaminais multipotentes (264-267). As DPSCs humanas foram comparadas com as BMMSCs e demonstraram maior número de células, disponibilidade e proliferação (268), bem como melhores propriedades de células estaminais neurais (269). Embora a experiência com DPSCs ainda seja limitada, os dados mostram que estas células podem ter um papel importante na regeneração do NP. Em modelos de embriões aviários, as DPSCs mostraram quimio-atração dos axónios do gânglio trigeminal (270). Apesar de vários grupos já terem relatado a diferenciação neuronal de DPSCs humanas in vitro (264, 270-276), Martens e colaboradores forneceram a primeira evidência de que as DPSCs são capazes de se diferenciar em SCs e suportar crescimento neural in vitro, assumindo que serão boas candidatas para terapias celulares no tratamento de lesão de NPs (277). As DPSCs foram implantadas numa matriz de gel de colagénio e formaram colunas alinhadas que suportaram e guiaram o crescimento de neurites (277). Embora as DPSCs humanas (hDPSCs) apresentem fortes propriedades imunomoduladoras (278), o xenotransplante é muitas vezes problemático devido à rejeição imunológica, sendo de grande interesse o desenvolvimento de modelos de roedores para o transplante autólogo ou alogénico de DPSCs. Alguns autores relataram que as DPSCs de incisivos de rato (mDPSCs) têm potencial neurogénico através da formação bemsucedida de células tipo-neurónio com morfologia multipolar que expressaram marcadores neuronais in vitro (279, 280), mas Vargas e colaboradores mostraram que a eficiência de mDPSCs na neuro-diferenciação é muito menor do que a de hDPSCs (280). Mais tarde, Ellis e colaboradores relataram que as mDPSCs sofreram neuro-diferenciação in vitro, mas a uma maturação limitada, com propriedades mais consistentes com o desenvolvimento neuronal precoce (272). Recentemente, alguns grupos independentes relataram que as hDPSCs apresentam atividade neuro-regenerativa em modelos de lesão da medula espinhal de roedores, com expressão de níveis mais elevados de fatores tróficos no tecido, melhor organização dos tecidos, e a presença de muitos axónios ou oligodendrócitos e neurónios com sinapses (281, 282). hDPSCs transplantadas em combinação com tubos de PLGA promoveram a reparação de gaps de 7mm do nervo facial em modelos roedores (139, 279, 283). Já em 2015, Yamamoto e colaboradores mostraram que as hDPSCs contribuem para a regeneração do NP, não por 24 diferenciação direta das hDPSCs em fenótipo de SCs, mas por secreção de fatores neurogénicos/angiogénicos na proximidade das recém-migradas SCs, e também regulam a sua apoptose e proliferação (284). O grupo de investigação do ICBAS também está a desenvolver investigação na aplicação das DPSCs na regeneração de NP, contudo, como ainda não existem dados publicados apenas são apresentadas algumas imagens dos trabalhos preliminares na Figura VI. Figura VI. Dentes definitivos (pré-molar e caninos inferiores) extraídos de um dador adulto saudável com 45 anos por razões de correção ortodôntica. Podem observar-se as perfurações realizadas com um drill de 0.12 mm para entrada do meio de cultura na zona da polpa dentária. (A) MSCs isoladas da polpa dentária do dente pré-molar. (B) MSCs isoladas da polpa dentária do dente canino. Imagens gentilmente cedidas por Ana C. Maurício. 25 6. CONCLUSÃO A incidência de lesões traumáticas do NP e a morbilidade a ela associada motivam a grande importância dada à investigação na área da regeneração do NP. Com o objetivo de uma eficiente reparação do nervo, através da regeneração nervosa com recuperação morfológica e funcional, a Engenharia de Tecidos tem abordado a manipulação do microambiente no local de regeneração do nervo focando maioritariamente três áreas: (a) biomateriais a utilizar; (b) componentes a introduzir no local; (c) forma de introdução desses componentes no local de regeneração. Apesar dos avanços e inovações nas técnicas reconstrutivas de NPs ao longo dos últimos 40 anos, a reparação por sutura continua a ser a técnica mais comumente utilizada, com grandes limitações associadas, o que motivou uma extensa pesquisa sobre alternativas para a correção cirúrgica. Embora o conceito de utilização de um tubo-guia para a reparação de NPs seja mais rápida para os cirurgiões e evite a morbidade da colheita, foram entretanto identificados muitos fatores de crescimento que influenciam a regeneração do nervo, e a sua combinação com tubos-guia parece ser a abordagem do futuro. A utilização de alguns sistemas celulares como agentes terapêuticos na regeneração do NP, tanto em lesões de axonotmese como de neurotmese, também se revelou claramente vantajosa pela sua capacidade de produção de fatores neurotróficos melhorando, não só a qualidade de recuperação motora e nociceptiva como também a velocidade de recuperação. Embora nem todos os sistemas celulares apresentem resultados positivos, a investigação destes abre as portas para a sua extrapolação a outros sistemas celulares, nomeadamente células estaminais com as quais o grupo de investigação do ICBAS está a trabalhar. Olhando em retrospetiva para a panóplia de trabalhos apresentados na regeneração de NP, confirma-se a necessidade e a importância do trabalho de uma equipa multidisciplinar no desenvolvimento e estudo clínico de novos biomateriais e sistemas celulares, bem como na avaliação (funcional e morfológica) na recuperação de lesões do NP. Grande parte dos trabalhos referidos ao longo desta revisão são respeitantes a estudos préclínicos, os quais são essenciais para a inovação tecnológica da microcirurgia reconstrutiva. Contudo, o tipo de nervo, a causa da lesão e o tamanho da lacuna, são muito variáveis, tornando a comparação entre resultados muito difícil. Entretanto, embora existam já alguns estudos publicados com materiais testados clinicamente, quase todos consistem em pequenas séries de casos, assumindo-se que a passagem de estudos pré-clínicos para a aplicação clínica é um desafio. Estou convicta que os futuros avanços cirúrgicos na abordagem de lesões de NPs se irão concentrar nos sistemas celulares, contudo, a viabilidade de células estaminais e o custo dos biomateriais mais avançados, dificultam a disponibilidade clínica das novas tecnologias, atrasando ainda mais os estudos em humanos para essas terapias promissoras. 26 Em conclusão, afigura-se claramente que o futuro na Medicina Regenerativa não passará pela melhoria de uma única estratégia, mas sim pela otimização da combinação de diversas abordagens diferentes, associando diferentes competências e conhecimentos e envolvendo equipas multidisciplinares. Esta abordagem, apesar de desafiadora, representa uma excelente oportunidade para os investigadores explorarem novos campos científicos com a esperança de se fazerem avanços clínicos significativos nos próximos anos. 27 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Battiston B, Papalia I, Tos P, Geuna S. 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