Estudo da prevalência de mosaicismo de baixo grau e sua implicação clínica na infertilidade feminina

Dissertação para a candidatura ao grau de Mestre em Medicina e Oncologia Molecular Submetida à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto. O presente trabalho foi desenvolvido sob a orientação científica da Professora Doutora Sofia Dória Príncipe dos Santos Cerveira foi realizado no Departamento de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Dedico esta tese à minha famíla e ao meu namorado porque nunca deixaram de acreditar em mim. Sem eles, sem o apoio incondicional de todos não teria chegado onde hoje cheguei. Muito Obrigada! Agradecimentos Porque este trabalho não se resume apenas ao meu esforço, dedicação e trabalho, quero agradecer... Ao Professor Henrique Almeida, regente do mestrado por todo o esforço demonstrado para que esta etapa fosse concluida. Ao Professor Doutor Alberto Barros, Director do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto por me ter dado a oportunidade de desenvolver este trabalho. Foi um projeto bastante motivador na área pela qual lutei e tentarei ser sempre melhor. À Professora Doutora Sofia Dória, minha orientadora da tese, que desde o início me apoiou neste projecto, pela dedicação, profissionalismo e disponibilidade na orientação desde o primeiro dia. À Mestre Vânia Ventura, um agradecimento muito especial pela sua incansável paciência, dedicação, encorajamento, disponibilidade e principalmente pelo carinho e por não ter deixado de acreditar em mim. Todos os momentos passados juntas ficaram sempre guardados. À Doutora Sandra Soares do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Centro Hospitalar do São João pela ajuda e disponibilidade que demonstrou quando precisei. À Professora Doutora Filipa Carvalho e à Doutora Susana Fernandes pelo carinho e disponibilidade que demonstraram sempre que precisei. Ao Professor Doutor João Paulo Oliveira e à Doutora Susana Ferreira pela ajuda que me prestaram. Foi sem dúvida muito importante. Às Doutoras Carolina Almeida e Maria João Pinho pela amizade, dedicação, carinho e ajuda que demonstraram sempre, ao longo do trabalho. À Mestre Ana Paula Neto que esteve sempre ponta a ajudar quando precisei. Aos restantes colaboradores do Departamento de Genética pela boa disposição e carinho que demonstraram e a todos os participantes que disponibilizaram o seu tempo, garantindo assim a viabilidade deste estudo. À minha tia Armandina que foi uma grande amiga, que me motivou e apoiou nesta caminhada! Por último quero agradecer aos meus pais que sempre me apoiaram, pelo amor,pela motivação, pelos ensinamentos, principios e valores que me transmitiram e pelos sacrificios que fizeram para que eu chegasse até aqui! À minha irmã, à minha sobrinha e ao meu cunhado pela força, incentivo, amizade e apoio incondicional prestado desde sempre. Ao Nuno por toda a força, pelo incentivo e ajuda nesta etapa difícil da minha vida, e acima de tudo pelo amor e dedicação prestado ao longo destes anos. Muito Obrigada a todos! Resumo A infertilidade é considerada pela Organização Mundial de Saúde um problema de saúde pública que afeta cerca de 10 a 15% dos casais em todo o mundo. A investigação na área da infertilidade feminina tem demostrado variadísssimas causas associadas. A idade da mulher tem sido um dos fatores mais estudados, verificando-se que com o avançar da idade existe uma maior predisposição para a perda de um cromossoma X ao nivel celular, podendo levar ao aparecimento de linhas celulares anormais mesmo que em pequenas percentagens. A relevância do mosaicismo de baixo grau envolvendo um cromossoma X não está totalmente estabelecida quanto à sua implicação clínica na reprodução humana. Assim, este estudo teve como principal objetivo contribuir para o aumento do conhecimento relativo à importância do mosaicismo de baixo grau, envolvendo linhas celulares 45,X e/ou 47,XXX na infertilidade feminina. Usando a técnica de FISH foram analizadas 106 amostras de sangue periférico de mulheres com mosaicismo de baixo grau do cromossoma X determinado por cariótipo (grupo teste) e 95 amostras do grupo controlo (mulheres com cariótipo normal e sem diagnóstico de infertilidade). Foram também analizadas pela mesma técnica 34 amostras de esfregaço bucal (19 do grupo teste e 15 do grupo controlo). A idade das mulheres variou entre 26 e 43 anos. Com os resultados obtidos verificou-se que a média percentagem de mosaicismo encontrada no grupo teste (6,9%) foi significativamente diferente da média da percentagem de mosaicismo do grupo controlo (4,4%)(p<0,0001). Verificouse também que a presença de linhas celulares aneuploides aumentou com a idade. A análise das células do esfregaço bucal revelou a presença de células aneuploides em ambos os grupos e em percentagens semelhantes. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho permitem sugerir que o mosaicismo de baixo grau (<10%) não deverá ter implicações clínicas relevantes que comprometam a fertilidade. Palavras-chave: Infertilidade feminina, idade avançada, perda do cromossoma X, mosaicismo de baixo grau, aneuploidia, FISH. Abstrat According to recent studies by World Health Organization (WHO), infertility has been recognized as a public health issue around the world and afect approximately 1015% of couples. Female infertility may be caused by many factors but advanced age is the most studied one. Population studies have consistently noted that with advancing age there is an increased predisposition to the loss of the X chromosome and may lead to the appearance of abnormal cell lines if even in small percentages. The relevance and clinical implication of low level mosaicism involving X chromosome is not well established as to its clinical implication in human reproduction. The aim of this study was to contribute to increased knowledge on the importance of low level mosaicism involving cells lines 45,X and / or 47,XXX in female infertility. By FISH tecnique, 106 peripheral blood samples of women with low level mosaicism of chromosome X were analyzed (test group) and 95 samples from the control group (women with normal karyotype and without infertility diagnosis). Thirty four buccal swab samples were also analyzed by the same technique (19 patients and 15 controls). The age various between 26 and 43 years. Our results showed that the mean rates mosaicism found in the test group (6.9%) was significantly different from the mean rates of mosaicism in the control group (4.4%) (p <0.0001). It was also observed that the presence of aneuploid cell lines increased with age. The analysis of cells from buccal swab revealed the presence of aneuploid cells in both groups and at similar rates. In conclusion, the results obtained in this study allow to suggest that low level mosaicism (<10%) should not have relevant clinical implications that compromise fertility. Keywords: Female Infertility, advanced age, X chromosome loss, low level mosaicism, aneuploidy, FISH. Índice de figuras Figura 1: Fertilidade natural feminina em função da idade19. ....................................... 10 Figura 2: Fertilidade e percentagem de abortamentos espontâneos em função da idade20. ........................................................................................................................... 11 Figura 3: Segregação cromossómica durante a meiose. ................................................ 12 Figura 4: Técnica de FISH (adaptado de www.abnova.com) .......................................... 15 Figura 5: Sinal fluorescente vermelho emitido quando a sonda se liga a uma sequência específica do DNA.46 ....................................................................................................... 16 Figura 6: Aplicação do m-FISH em células humanas normais. É possivel visualizar uma célula em metafase e outra em interfase.46 ................................................................... 17 Figura 7: Cariótipo com trissomia do cromossoma X ..................................................... 38 Figura 8: Cariótipo com monossomia do cromossoma X ............................................... 38 Figura 9: Cariótipo com tetrassomia do cromossoma X. ............................................... 38 Figura 10: Imagens de microscopia de fluorescência: Os sinais verdes correspondem a sondas controméricas do cromossoma X e os sinais vermelhos correspondem a sondas centroméricas do cromossoma 18, utilizado como controlo. A: amostra de sedimento de linfócitos do grupo controlo onde se observam duas células (uma em metafase e outra em interfase) com marcação normal para os cromossomas em estudo. B: amostra de sedimento de linfócitos do grupo teste onde se observam 3 células em interfase, duas delas com marcação normal para os cromossomas X e 18 e uma com apenas uma marcação do cromossoma X. ..................................................................... 40 Figura 11: Imagem de microscopia de fluorescência correspondente a uma amostra de esfregaço bucal do grupo controlo. Os sinais verdes corresponde a sondas centroméricas do cromossoma X e os sinais vermelhos correspondem a sondas centromérivas do cromossoma 18. Observam-se 3 células, 2 com marcação normal para os dois cromossomas e uma com apenas um sinal do cromossoma X. ................. 48 Índice de gráficos Gráfico 1: Percentagem de mosaicismo detetada em função da idade no grupo teste.44 Gráfico 2: Percentagem de mosaicismo detetada em função da idade no grupo controlo. ......................................................................................................................... 44 Gráfico 3: Capacidade reprodutiva da mulher em função da idade. ............................. 46 Gráfico 4: Percentagem de aneupoidias detetada no esfregaço bucal em comparação com a percentagem detetada no sangue periférico do grupo teste. ............................ 51 Gráfico 5: Percentagem de aneupoidias detetada no esfregaço bucal em comparação com a percentagem detetada no sangue periférico do grupo controlo. ....................... 51 I. INTRODUÇÃO Introdução Página | 3 I. Introdução A fertilidade e a educação dos filhos são eventos extremamente importantes na vida de cada ser humano e estão fortemente associados com o estado de plenitude, felicidade e integração familiar1. Ao longo da história, a fertilidade sempre foi fundamental para a sobrevivência das populações e por este motivo sempre foi motivada e socialmente aceite. Ao contrário da fertilidade, a infertilidade sempre foi vista como uma doença vergonhosa ou até mesmo uma maldição dos deuses desde os primórdios da História2. A infertilidade tem sido considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como um problema de saúde pública global que afecta cerca de 10 a 15% dos casais inférteis, na população mundial. É um problema multidimensional com implicações sociais, económicas e culturais1,3. É influênciada por diversos fatores, tais como, a idade da mulher, tipo e frequência das relações sexuais, consumo de tabaco, álcool ou drogas ilícitas, utilização de medicamentos, hábitos alimentares e estilo de vida, certos tipos de trabalho e/ou lazer e ainda alterações significativas do peso (IMC <19 e >29)3. Perspectiva histórica Ao longo da história e em todas as civilizações, a mulher sempre foi considerada o símbolo da fertilidade. Quando a mulher não conseguia ter filhos, as responsabilidades recaíam penosamente sobre ela sendo muitas vezes desprezada, odiada e maltratada4,5. Nas civilizações mais antigas, como a Hebraica e a Helénica, em que era impensável a existência de infertilidade masculina, a mulher quase não tinha direitos nem liberdade e por este motivo a infertilidade era sempre de causa feminina e considerada um castigo dos deuses4,5. De todas as civilizações antigas, a Egípcia foi exceção pois a mulher ocupava um lugar de destaque, era merecedora de respeito e o seu estatuto era equivalente ao do Introdução Página | 4 homem. A infertilidade era reconhecida como um problema grave mas não relacionada com castigos divinos4,5. Na idade média não se verificou um grande evolução na área da medicina reprodutiva e a mulher continuou a ser a responsável pela infertilidade4,5. Na época medieval, a procriação era considerada uma necessidade e decorria dos benefícios do matrimónio. Nesta altura, a ausência de fertilidade relacionava-se com castigos divinos e diversos pecados como a infidelidade4,5. Durante muitos anos a medicina foi evoluindo e vários autores foram descrevendo o corpo humano em gravuras. No século XVIII, à metodologia de observação foi adicionada a estruturação do conhecimento em moldes de raciocínio científico. Van Leeuwhenhock descobriu o espermatozóide, Naboth identificou a obstrução tubária, Hunter relatou a primeira inseminação com êxito e Smellin descreveu o processo de fertilização. A mulher começou a ser objecto de estudo mas continua a ser responsável pela falta de fecundação4,5. O século XIX e o início do século XX ficaram marcados por grandes progressos na Medicina, nomeadamente na área da Reprodução Humana. A evolução tecnológica e a Genética Molecular permitiram o estudo dos genes, a sua localização e interrelação nos cromossomas, os mecanismos e fatores que estabelecem a sua expressão ou silenciamento e que determinam a existência de doença4,5. Atualmente, devido aos progressos das técnicas de diagnóstico, a discussão da infertilidade passou a considerar também a existência de causas masculinas. Estas passaram a ser estudadas de forma mais completa e cuidadosa sendo cada vez mais comuns nos dias de hoje4,5. Introdução Página | 5 Incidência e Prevalência De acordo com estudos recentes da OMS, cerca de 10 a 15% dos casais em todo mundo enfrentam problemas relacionados com a infertilidade1-8. Segundo estes estudos, a incidência da infertilidade está fortemente associada com as diferenças geográficas. Países menos desenvolvidos apresentam taxas de infertilidade mais elevadas (cerca de 50%) relacionadas especialmente com doenças sexualmente transmissíveis, enquanto que países mais desenvolvidos, como por exemplo a Europa Ocidental, apresentam taxas de infertilidade mais baixas (cerca de 15%) tendo como fator de risco principal a idade1,5-8. Nos EUA, segundo um estudo recente a prevalência da infertilidade ronda os 7,4% enquanto que na Europa a incidência estimada é de cerca de 14% (Tabela 1). Em Portugal, um estudo realizado por Silva Carvalho em 2009, concluiu que a prevalência da infertilidade ao longo da vida varia entre 8 e 10%, não se verificando diferenças regionais. Assim, estima-se que em Portugal entre 266.088 e 292.996 das mulheres apresentem diagnóstico de infertilidade e que destas, somente 43 a 48% recorram a consulta médica, com procura equivalente do setor público e privado5. Tabela 1: Prevalência da Infertilidade na Europa e EUA5. Autores/ ano Ano do estudo/lo cal Desenho do estudo Amostra do estudo Outcome Resultados SilvaCarvalho 2009 Portugal 2009 Estudo nacional retrospetivo com amostra aleatória estratificada. 2632 indivíduos (1909 mulheres; 723 homens) Prevalência da infertilidade ao longo da vida e em idade reprodutora. 9,8%; 8,2% Bhattach arya 2009 Grampian , Escócia 2007 Estudo retrospetivo de base populacional com amostra randomizada. Taxa de resposta=50,2 % 4466 mulheres 31-50 anos Prevalência da infertilidade ao longo da vida. (12 meses) Reportado pelo próprio. 17.5% 95% IC [16.318.6%] Terävä 2008 Finlândia 19922004 Estudo retrospetivo de base populacional Taxa de resposta=75,8 % 4729 mulheres Prevalência da subfertilidade ao longo da vida. (12 meses)Reportado 16% Introdução Página | 12 Mosaicismo de baixo grau envolvendo o cromossoma X O termo mosaicismo é definido pela presença de duas ou mais linhas celulares diferentes no mesmo organismo24-41. Aneuploidia define-se pela presença ou ausência de um ou mais cromossomas (diferente de 46). As células aneuploides surgem quando ocorrem falhas na segregação cromossómica durante a meiose ou a mitose. Por exemplo, se ocorrerem erros de segregação do cromossoma X, em mosaico, além das células com constituição normal (dois cromossomas), poderão existir também celulas com um ou três cromossomas X35,46 (Figura 3). O tipo de aneuploidias é variável (monossomia ou trissomia) e o grau depende do número de células anormais. Existe alguma dificuldade em definir o que é o mosaicismo de baixo grau. Existem autores que consideram mosaicismo de baixo grau, a presença de 10% de células anormais, outros a presença de menos de 6% de células anormais e até outros que consideram a existência de mosaicismo de baixo grau verdadeiro quando encontram duas células com a mesma anomalia no mesmo individuo24-27,38,39. Assim, Figura 3: Segregação cromossómica durante a meiose. Introdução Página | 13 não existindo uniformidade de critérios torna-se difícil a comparação entre os diferentes estudos. O diagnóstico da monossomia do cromossoma X e as suas implicações já estão bem definidas na literatura31,37,40,41, contudo, a relevância do mosaicismo de baixo grau envolvendo o cromossoma X não está totalmente estabelecida, principalmente no que diz respeito à sua implicação clínica na reprodução humana24-27,38,39. O primeiro estudo desenvolvido envolvendo a presença do cromossoma X em mosaico foi publicado em 1960 por Jacobs et al. que demonstrou que a percentagem de aneuploidias aumentava quando aumentava a idade da mulher26. Desde então foram vários os investigadores que realizaram estudos e confirmaram os resultados obtidos por Jacobs. Além disso, verificaram que era mais comum a presença de cópias com monossomia do cromossoma X (apenas um cromossoma X em vez de dois) do que com trissomia do mesmo cromossoma (presença de 3 cromossomas X em vez de dois)26. O mosaicismo de baixo grau de um cromossoma sexual pode ser verdadeiro, pode estar relacionado com a idade ou pode corresponder a artefactos de cultura, quando são analisadas células cultivadas por citogenética convencional. A citogenética convencional permite a análise do cariótipo através de linfócitos do sangue periférico cultivados. O número de células que são analisadas depende da informação clínica, mas sendo habitualmente analisadas entre 15 a 60 metafases (por norma 30 metafases). Quando surgem células aneuploides na análise do cariótipo, o resultado é reportado sugerindo-se a análise através de outra técnica, nomeadamente a FISH (Fluorescence In Situ Hibridization), uma vez que esta permite uma análise rápida de um número muito superior de células (entre 200 a 1000 células). A FISH permite fazer a análise de núcleos em interfase de diferentes tecidos, verificando se as percentagens de mosaicismo são ou não idênticas em diferentes tecidos de um mesmo individuo e ainda verificar se o mosaicismo é verdadeiro ou se corresponde a artefactos de cultura25-41. As guidelines referem que a presença de células aneuploides em percentagem inferior a 5% podem ser resultado do processo de cultura, falhas de hibridação ou Introdução Página | 14 erros do observador e por este motivo, a mosaicismos inferiores a 5% não são atribuidos significado clínico. O mosaicismo verdadeiro não é fácil de distinguir do mosaicismo relacionado com a idade pelo que as interpretações dos resultados são por vezes difíceis. Por este motivo, torna-se muito importante a determinação e a avaliação do mosaicismo de baixo grau, sendo necessários mais estudos de modo a compreender se este fator terá implicação clinica ou não na reprodução. Introdução Página | 15 Metodologia de análise – FISH A técnica Hibridação In Situ foi desenvolvida nos anos 70 de modo a complementar a citogenética convencional, permitindo a deteção rápida de anomalias cromossomicas. Inicialmente, esta técnica utilizava sondas de ácidos nucleicos marcadas com radioisótopos que, após hibridação, eram detetadas por autoradiografia. Contudo, esta técnica requeria longos periodos de exposição para produzir sinais nos filmes radiográficos tornando este processo lento. Além disso, as sondas eram dispendiosas e a técnica apresentava limitações em relação à resolução da imagem. No final de 1970, foram desenvolvidos outros métodos que produziam sondas de ácidos nucleicos sem utilizar moléculas radioativas42. Em 1990, as moléculas radioativas foram substituidas por moléculas fluorescentes, surgindo assim a técnica de FISH – Fluorescence In Situ Hibridization. As melhorias constantes na deteção de moléculas utilizando imunocitoquimica e imunofluorescência, juntamente com os avanços da microscopia de fluorescência e análise de imagem, permitiram que esta técnica se tornasse mais segura, rápida e fiável42. Na técnica de FISH o DNA humano é inserido em diferentes vetores, como plasmídeos, cosmídeos, bacterial artificial chromosomes (BAC’s), Pl-derived artificial chromosomes (PAC’s) e yeast artifical chromosomes (YAC’s), marcados com uma molécula fluorescente e usados como sonda para hibridar com regiões específicas dos diferentes cromossomas 43 (Figura 4). Sonda Marcação com sonda fluorescente Desnaturação e hibridação Figura 4: Técnica de FISH (adaptado de www.abnova.com) Introdução Página | 16 O método de marcação das sondas de DNA pode ser direto ou indireto. A marcação direta é a mais utilizada, por ser mais rápida e de fácil execução e pressupõe a ligação de um ou mais fluorocromos à sonda de DNA nas regiões 5’ ou 3’ que, imediatamente após a sua ligação à sequência de DNA complementar da amostra, permite a visualização do sinal fluorescente44 (Figura 5). A marcação indireta requer a modificação da sonda pela adição de anticorpos, sendo os mais comuns a biotinaavidina e a digoxina. Os fluorocromos permitem a identificação das sequências complementares pela emissão de sinais fluorescentes, visualizados através de um microscópio de fluorescência45. Na técnica de FISH podem ser usadas diferentes sondas: sequência única, αsatélite, sub-teloméricas e sondas de pintura cromossómica. A combinação de fluorocromos origina multiplas cores que permite a identificação de todos os cromossomas humanos, numa só hibridação, constituindo o Multicolor FISH (m-FISH) (Figura 6). Assim, a m-FISH passou a ser utilizada na caracterização de determinados rearranjos cromossómicos e cromossomas marcadores mas por ser muito dispendiosa teve sobretudo aplicação na investigação de de tumores sólidos46. Figura 5: Sinal fluorescente vermelho emitido quando a sonda se liga a uma sequência específica do DNA.46 Introdução Página | 17 A capacidade de resolução da técnica de FISH é limitada a cerca de 4-10 Mb em cromossomas metafásicos e 50Kb para cromossomas interfásicos. A aplicação da técnica de FISH, dada a sua rapidez, sensibilidade e especificidade, tem-se revelado um método complementar à citogenética convensional, sendo por vezes indispensável em casos em que a resolução do cariótipo não permite detetar pequenas alterações, quando não é possivel obter metafases para analisar ou ainda em DGPI (Diagnóstico Genético Pré-Implantação) citogenético. Figura 6: Aplicação do m-FISH em células humanas normais. É possivel visualizar uma célula em metafase e outra em interfase.46 Introdução Página | 18 II. OBJETIVOS Objetivos Página | 21 II. Objetivos Nas mulheres, a presença de mosaicismo de baixo grau envolvendo uma linha celular 45,X ou 47,XXX tem sido indicada, por alguns autores, como possível causa de infertilidade, abortamentos de repetição e insucesso na procriação medicamente assistida (PMA)29-43. Outros autores, sugerem que a presença de uma linha celular 45,X com baixa representatividade não causará impacto na fertilidade de casais submetidos a um processo de PMA. Com o intuito de compreender se este fator terá implicações clínicas ou não na reprodução pretende-se realizar:  Análise da prevalência de mosaicismo de baixo grau detetado no cariótipo da população em estudo e em cada grupo estratificado por idade.  Avaliação da percentagem de mosaicismo pela técnica de Hibridação In Situ de Fluorescência (FISH) na população em estudo. Avaliação da percentagem numa população controlo utilizando a mesma metodologia (FISH).  Observação da correlação dos resultados obtidos entre as duas populações.  Estudo por FISH nas duas populações (casos e controlos) em células obtidas a partir de esfregaço bucal.  Comparação das percentagens de mosaicismo obtidas nas diferentes amostras tecidulares.  Elaboração de uma base de dados com a história clínica e reprodutiva das mulheres portadoras de mosaicismo de baixo grau envolvendo uma linha celular 45,X para avaliação do prognóstico reprodutivo.  Determinação do grau de mosaicismo a partir do qual poderá haver implicações clínicas ou reprodutivas para as suas portadoras. Material e Métodos Página | 28  Homogeneizou-se o conteúdo do tubo e adicionou-se a solução de Ibraimov até ¾ do tubo.  Centrifugou-se durante 6min a 1600 rpm, à temperatura ambiente. Rejeitou-se o SN e ressuspendeu-se o sedimento em metanol até ¾ do tubo.  Centrifugou-se durante 6min a 1600 rpm, à temperatura ambiente. Rejeitou-se o SN e ressuspendeu-se o sedimento em 5ml de fixador frio, gota a gota, concluindo-se assim a fixação do material biológico. Homogeneizou-se.  Centrifugou-se durante 6min a 1600 rpm, à temperatura ambiente. Rejeitou-se o SN e ressuspendeu-se o sedimento em fixador. Centrifugou-se e repetiu-se este passo 2 a 3 vezes. Extensão de lâminas – procedimento  Lavaram-se as lâminas com detergente e de seguida passaram-se em etanol absoluto.  No aparelho próprio para a extensão, criaram-se as condições ótimas necessárias: temperatura entre 22-23ºC e humidade entre 42-43%.  Deixou-se cair uma gota de suspensão celular sobre a lâmina, colocouse a lâmina na vertical para escorrer o excesso de fixador e deixou-se secar na horizontal sobre a bancada.  Esperou-se cerca de 5min e procedeu-se ao envelhecimento das lâminas (colocar na estufa a 90ºC durante 1h05min). Material e Métodos Página | 29 Bandeamento GTL (coloração de Leishman) – método automático (Aparelho Mirastainer) – procedimento  As lâminas depois de envelhecidas e arrefecidas foram colocadas no braço do aparelho com a identificação colocada na parte superior.  Colocaram-se as soluções nos respetivos recipientes (Peridrol - Metanol) -programa 5.  Retiraram-se as lâminas do braço e colocaram-se sobre a bancada na horizontal de forma a secarem.  Após secarem, voltaram a colocar-se as lâminas no braço do aparelho, tal como no 1º ponto.  Retiraram-se do aparelho as soluções anteriores e colocaram-se as restantes soluções nos recipientes (Tripsina – Sorensen – Corante - Gurr) – programa 1.  Terminado o tempo, retiraram-se as lâminas do aparelho.  Posteriormente, as lâminas foram observadas e analisadas através de um microscópio Nikon (Eclipse, E-400; Tóquio, Japão) com uma câmara CCD (Sony, Tóquio, Japão) e Software apropriado (Cytovision Ultra. Applied Imaging International, Sunderland, UK). Nota: Programa 5: Peridrol - 3m30s e Metanol – 10s com agitação; Programa 1:Tripsina – 4s + Sorensen – 12s + Leishman – 7m + Gurr – 3s + H20 – 3s + secar – 2m a 45ºC. Material e Métodos Página | 30 FISH - Hibridação in situ de Fluorescência A técnica de FISH foi efetuada em sedimento de linfócitos obtidos a partir de culturas de sangue periférico e em amostras de esfregaço bucal. Nos sedimentos de linfócitos foram analizados 1000 núcleos por caso (em interfase ou metafase), tendo em conta os procedimentos convencionais do Departamento de Genetica. Nas amostras de esfregaço bucal foram analisados 500 núcleos por caso. Obtenção de células do esfegaço bucal – procedimento  Colheram-se as células bucais utilizando o Kit BIO-AMIES + charcol, Swabs for collecting.  Adicionou-se 600µl de solução 0,01M Tris-HCL buffer, pH 7.0 previamente preparada, homogeneizou-se cuidadosamente com a ajuda do vórtex durante alguns segundos e retirou-se a zaragatoa.  Centrifugou-se a 1500 rpm durante 3min.  Removeu-se o SN a adicionou-se 600µl de PBS estéril. Centrifugou-se a 1500 rpm durante 3min e repetiram-se os dois últimos passos.  Removeu-se o SN e adicionou-se 3ml de soluto hipotónico previamente aquecido a 37ºC.  Manteve-se 30min na estufa a 37ºC e durante o período de incubação inverteu-se os tubos 2 vezes.  Adicionou-se 2ml de fixador sobre o soluto vortexando cuidadosamente.  Centrifugou-se durante 6 min a 1600 rpm, aspirou-se o SN e ressuspendeu-se em fixador novo. Repetiu-se este passo 2 vezes.  Após a última centrifugação e sem homogeneizar o sedimento, colocaram-se algumas gotas de células sobre a lâmina previamente aquecida a 37ºC e deixou-se secar.  Colocaram-se as lâminas a 63ºC durante 30min e de seguida foram colocadas em pepsina durante 20min a 37ºC.  Lavaram-se as lâminas com água destilada e PBS.  Fixaram-se em Paraformaldeído 4% durante 20min a 63ºC. Material e Métodos Página | 31  Após a última fixação foi utilizado o protocolo do FISH para sedimento de linfócitos. Técnica de FISH – Procedimento  Lavaram-se os sedimentos com fixador e concentraram-se.  Com o auxílio de uma micropipeta, deixou-se cair uma gota de suspensão celular sobre a lâmina previamente identificada. Deixou-se secar.  Verificou-se ao microscópio se a concentração de células era ideal e na zona da lâmina mais concentrada marcou-se um círculo com a ajuda de uma caneta de diamante.  De seguida desidratou-se a lâmina respeitando os seguintes tempos: o 4 minutos em PBS; o 4 minutos em H2O destilada.  1 minuto em EtOH 70% + 96% + 100%. Deixou-se secar as lâminas à temperatura ambiente.  Preparou-se a mix de sondas: uma sonda para a região centromérica do cromossoma X + uma sonda para a região centromérica do cromossoma 18 (controlo) com fluorocromos de cores diferentes. Para cada 10µl de mix utilizou-se: o 7µl de tampão CEP o 1µl de sonda CEPX (Green) o 1µl de sonda CEP18 (Orange) o 1µl de água destilada  Sobre a lamela aplicou-se 2,5µl da mix de sondas e sobrepôs-se as lâminas às lamelas.  Colocou-se as lâminas na placa térmica a 75ºC durante 3 minutos (desnaturação).  A hibridação ocorreu a 37º na estufa em câmara húmida por um período de 2 a 3 horas. Material e Métodos Página | 32  Terminado o tempo de hibridação, lavaram-se as lâminas nas seguintes soluções para remoção de ligações inespecíficas durante a hibridação: o 3 minutos em solução 60% FM/2xSSC em banho-maria a 42ºC; o 3 minutos em solução de 2xSSC em banho-maria a 42ºC; o 3 minutos em solução de 4xSSC/0,05% Tween20 à temperatura ambiente com agitação;  Posteriormente lavaram-se as lâminas novamente nas soluções iniciais: o 15 segundos em PBS o 15 segundos em H2O destilada o 1 minuto em EtOH 70% + 96% + 100%  Deixou-se secar as lâminas à temperatura ambiente mas sempre protegidas da luz.  Colocou-se um pouco de DAPI (contrasta os núcleos de azul).  Visualizaram-se e analisaram-se as lâminas no microscópio de fluorescência (Axio Imager Z1, Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY, USA) equipado com uma câmara CCD (AxioCam MRm, Zeiss) e software de imagem automático (FISH Imaging System, version 5.1, MetaSystems GmbH, Altlussheim, Germany). Material e Métodos Página | 33 O modo de preparação de todas as soluções necessárias para a execução dos protocolos está descrito na Tabela 4. Tabela 4: Soluções necessárias à execução dos protocolos e respetivos modos de preparação. Solução Modo de preparação Soluto hipotónico 2.25g de KCL+500ml de água destilada Ibraimov 100ml 92ml de água destilada + 5ml de ácido acético + 3ml de metanol Fixador 100ml 75 ml de metanol absoluto + 25ml de ácido acético Peridrol 225ml de àgua destilada + 75ml de peróxido de hidrogénio Tripsina 360mg de tripsina + 300ml de tampão Sorensen Corante Leishman 80ml de corante + 240ml de tampão Gurr Gurr 1 pastilha de Gurr’s Buffer + 1L de água destilada. Sorensen 9,47g de Na2HPO4 + 9,073 KH2PO4 + 1L de água destilada Pepsina 98ml H2O + 1ml HCl (1N) + 1 ml pepsina Paraformaldeído 4% 5,4ml PF + 48ml PBS PBS 1 pastilha de tampão fosfato-salino + 200ml água destilada EtOH 70% 70ml de etanol absoluto + 30ml água destilada EtOH 96% 96ml de etanol absoluto + 4 ml água destilada 60% FM/2xSSC 21ml de água destilada + 7ml de 20xSSC + 42ml de Formamida 2xSSC 7ml de 20xSSC + 63ml de água destilada 4xSSC/0,05% Tween20 80ml de água destilada + 20ml de 20xSSC + 250µl de Tween20 Material e Métodos Página | 34 Análise estatística Foram efetuadas cinco comparações principais: 1. Comparação entre a percentagem de mosaicismo detetada e a idade; 2. Comparação da média da percentagem de mosaicismo entre o grupo teste e o grupo controlo em amostras de sangue periférico; 3. Comparação da média da percentagem de mosaicismo entre o grupo teste e o grupo controlo em amostras de esfregaço bucal; 4. Comparação dos resultados obtidos entre amostras de sangue periférico e esfregaço bucal de cada paciente de ambos os grupos; 5. Comparação dos dados recolhidos no questionário individual. A análise estatística foi realizada através de três testes: 1. Regressão Linear no software IBM SPSS Statistics 22; 2. Fisher’s test no Software GraphPad QuickCalcs; 3. Qui-squared test for trend no site http://epitools.ausvet.com.au. Para todos os testes foi considerado o intervalo de confiança a 95%. IV. Resultados Resultados Página | 37 IV. Resultados Amostras de sangue periférico – Bandas GTL No presente estudo foram analisadas 106 amostras de sangue periférico, de pacientes do sexo feminino, que apresentaram mosaicismo de baixo grau do cromossoma X, no cariótipo. A linha celular com monossomia do cromossoma X (Figura 8) esteve presente em 94 das 106 amostras analisadas, tendo sido encontradas também linhas celulares com trissomia (Figura 7) e tetrassomia (Figura 9) do cromossoma X. Em 96 pacientes estudadas verificou-se mosaicismo do cromossoma X em percentagens iguais ou inferiores a 10%. Apenas 10 amostras apresentaram cariótipo com percentagens de mosaicismo entre os 10 e os 20% (Tabela 5). No grupo controlo foram incluídas 95 amostras de mulheres em que todas apresentavam resultado normal na análise do cariótipo. Tabela 5: Resultado do cariótipo e respetiva percentagem de mosaicismo de todas as amostras do grupo teste. Nº de casos Cariótipo % de mosaicismo 14 45,X[3]/46,XX[27] 10 13 45,X[3]/46,XX[55] 5,2 7 45,X[4]/46,XX[54] 6,9 4 45,X[5]/46,XX[53] 8,6 2 45,X[6]/46,XX[52] 10 1 45,X[10]/46,XX[48] 17,2 4 45,X[1]/47,XXX[2]/46, XX[27] 10 9 45,X[1]/47,XXX[2]/46, XX[55] 5,2 2 45,X[1]/47,XXX[2]/48,XXXX[1]/46,XX[54] 6,9 8 45,X[2]/47,XXX[1]/46, XX[27] 10 7 45,X[2]/47,XXX[1]/46,XX[55] 5,2 3 45,X[2]/47,XXX[2]/46,XX[26] 13,3 3 45,X[2]/47,XXX[2]/46,XX[54] 6,9 1 45,X[2]/47,XXX[4]/46,XX[52] 10 1 45,X[2]/48,XXXX[1]/46,XX[55] 5,2 3 45,X[3]/47,XXX[1]/46,XX[26] 13,3 1 45,X[3]/47,XXX[1]/46,XX[27] 12,9 1 45,X[3]/47,XXX[1]/46,XX[52] 7,1 3 45,X[3]/47,XXX[1]/46,XX[54] 6,9 1 45,X[3]/47,XXX[2]/46,XX[53] 8,6 2 45,X[4]/47,XXX[1]/46,XX[53] 8,6 Resultados Página | 44 A análise dos resultados obtidos permitiu verificar uma correlação entre o aumento da idade e o aumento da percentagem de mosaicismo. No grupo teste obteve-se um coeficiente de correlação igual a 0,179 (Gráfico 1) e no grupo controlo igual a 0,140 (Gráfico 2). Gráfico 1: Percentagem de mosaicismo detetada em função da idade no grupo teste. Gráfico 2: Percentagem de mosaicismo detetada em função da idade no grupo controlo. Resultados Página | 45 Comparação de resultados entre grupo teste e grupo controlo – técnica de FISH no sangue periférico Após análise pela técnica de FISH, elaborou-se uma tabela onde foram indicados para cada grupo, o número de casos para os quais se obtiveram percentagens de aneuploidias inferiores a 5% e iguais ou superior a 5% (Tabela 12). Verificou-se que em 63 das 95 amostras estudas (66,3%) do grupo controlo a percentagem de aneuploidias encontrada foi inferior a 5%. No grupo teste em 84 das 106 amostras estudadas (79,2%) a percentagem de aneuplodias observada foi igual ou superior a 5%. (p<0,0001) Tabela 12: Comparação dos resultados obtidos nos dois grupos relativamente à percentagem de aneuploidias detetada. Aneuploidias ≥ 5% Aneuploidias < 5% Total Grupo controlo 32 (33,7%) 63 (66,3%) 95 Grupo teste 84 (79,2%) 22 (20,8%) 106 Total 116 85 201 Perante os resultados obtidos anteriormente (Tabela 9) é possível verificar que a maioria dos casos analisados se encontra no grupo II e III com idades compreendidas entre os 30-34 anos e 35-39 anos, respetivamente. Também é possível verificar a existência de uma tendência, da mulher se tornar infértil com o aumento da idade (Gráfico 3). Resultados Página | 46 Gráfico 3: Capacidade reprodutiva da mulher em função da idade. Resultados Página | 47 Amostras de esfregaço bucal – análise pela técnica de FISH Neste estudo também foram analizadas 34 amostras de esfregaço bucal (19 do grupo teste e 15 do grupo controlo). Todas as amostras foram organizadas e agrupadas por idades (Tabela 13). Tabela 13: Amostras de esfregaço bucal agrupadas por idades e respetivo número de casos no grupo teste e no grupo controlo. Grupo teste Grupo controlo Idade Nº de casos Idade Nº de casos 26 2 27 1 30 1 29 1 32 3 31 1 33 2 32 3 34 2 35 3 35 1 36 1 36 1 37 1 37 2 39 1 38 1 40 1 39 1 41 1 40 2 42 1 43 1 Total 19 15 Resultados Página | 48 Em cada amostra foi avaliada a percentagem de mosaismo pela técnica de FISH. Foram analisadas 500 células por caso (Figura 11). Das 34 amostras de esfregaço bucal não obtivemos resultados em 9 amostras do grupo teste e 1 amostra do grupo controlo. Este facto deveu-se principalmente à falta de quantidade e qualidade de células obtidas. Tendo em conta os resultados obtidos, é possível verificar que a percentagem de mosaicismo no esfregaço bucal do grupo teste variou entre os 3,0% e os 6,7%. No grupo controlo, esta variou entre 1,6% e os 5,4%. Os resultados obtidos estão indicados na Tabela 14. Figura 11: Imagem de microscopia de fluorescência correspondente a uma amostra de esfregaço bucal do grupo controlo. Os sinais verdes corresponde a sondas centroméricas do cromossoma X e os sinais vermelhos correspondem a sondas centromérivas do cromossoma 18. Observam-se 3 células, 2 com marcação normal para os dois cromossomas e uma com apenas um sinal do cromossoma X. Resultados Página | 49 Tabela 14: Percentagem de aneuploidias encontrada no esfregaço bucal de amostras do grupo teste e do grupo controlo. Grupo teste Grupo controlo Idade % de aneuploidias Idade % de aneuploidias 26 4,7 27 3,8 32 3,4 29 4,4 32 6,7 31 2,4 33 4,2 32 3,4 33 5,6 32 1,6 34 4,4 32 4,4 35 5,4 35 5,4 36 5,8 35 3,4 38 3,0 35 2,4 40 5,2 37 4,0 39 5,4 40 5,0 41 3,8 42 5,4 Resultados Página | 50 Resultados Obtidos: esfregaço bucal vs sangue periférico Na tabela 15 resumiu-se os resultados obtidos pela técnica de FISH para os casos em que foi possivel obter um resultado em ambas as amostras (sangue periférico e esfregaço bucal). Tabela 15: Resultados obtidos pela técnica de FISH em ambas as amostras (esfregaço bucal e sangue periférico) do grupo teste e do grupo controlo. Grupo teste Grupo controlo Idade % aneuploidias Esfregaço bucal % aneuploidias Sangue Idade % aneuploidias Esfregaço bucal % aneuploidias Sangue 26 4,7 2,5 27 3,8 4,6 32 3,4 8,4 29 4,4 3,2 32 6,7 1,5 31 2,4 3,3 33 4,2 6,9 32 3,4 4,0 33 5,6 18,4 32 1,6 3,8 34 4,4 6,5 32 4,4 3,0 35 5,4 9,0 35 5,4 3,6 36 5,8 9,2 35 3,4 4,3 38 3,0 5,3 35 2,4 4,2 40 5,2 9,6 37 4,0 4,0 39 5,4 5,2 40 5,0 5,3 41 3,8 4,5 42 5,4 4,0 Após uma análise detalhada dos resultados obtidos nos dois grupos casos e controlos, é possível verificar que para ambos não se encontrou uma correlação entre a percentagem de aneuploidias encontrada no esfregaço bucal e a percentagem de aneuploidias encontrada no sangue periférico (p=0,198). No grupo teste obteve-se um coeficiente de correlação igual a 0,0092 (Gráfico 4) e no grupo controlo igual a 0,0618 (Gráfico 5). No entanto, em todas as amostras de ambos os grupos foi detetada a presença de células aneuploides. Resultados Página | 51 Gráfico 4: Percentagem de aneupoidias detetada no esfregaço bucal em comparação com a percentagem detetada no sangue periférico do grupo teste. Gráfico 5: Percentagem de aneupoidias detetada no esfregaço bucal em comparação com a percentagem detetada no sangue periférico do grupo controlo. y = 0,3958x + 5,8139 R² = 0,0092 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 % de aneuploidias no sangue periférico % aneuploidias no esfregaço bucal Grupo teste y = 0,142x + 3,5157 R² = 0,0618 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 % aneuploidias no sangue periférico % aneuploidias no esfregaço bucal Grupo controlo Resultados Página | 52 Resultados obtidos no questionário individual Foi elaborado um questionário às 34 mulheres (19 do grupo teste e 15 do grupo controlo) que aceitaram participar no estudo onde se colocaram questões tais como o peso, altura, idade da menarca, se era fumadora, grau de escolaridade e história gestacional. Os dados obtidos estão organizados nas tabelas 16 e 17 que se seguem. Tabela 16: Resultados obtidos no questionário das mulheres do grupo teste. Idade Peso (Kg) Altura (cm) Idade Menarca Fumadora Escolaridade História gestacional 32 61 166 11 Sim Licenciatura 1 filho após tratamento 43 57 158 11 Não 12º ano Gravidez ectópica após tratamento 32 48 160 12 Não Licenciatura Gravidez após tratamento 40 61 168 14 Não Licenciatura Sem gestação 33 50 164 12 Não Licenciatura Gravidez após tratamento 34 54 162 12 Não Licenciatura Gravidez após tratamento 32 75 168 13 Não Licenciatura Gravidez ectópica 35 60 159 12 Não Licenciatura Sem gestação 26 79 174 13 Não Licenciatura Gravidez gemelar após tratamento 37 57 155 10 Não 9º ano Sem gestação 39 54 160 14 Não Mestrado 1 filho após tratamento 34 90 175 11 Não 12º ano Gravidez após tratamento 40 53 155 13 Não Licenciatura Gravidez ectópica 38 58 153 13 Não Licenciatura Sem gestação 26 53 162 16 Não 12º ano Sem gestação 37 76 160 14 Não Bacharelato Sem gestação 30 72 160 11 Sim Bacharelato Sem gestação 36 69 170 11 Não Licenciatura Gravidez ectópica 33 56 165 12 Não Licenciatura Gravidez após tratamento Resultados Página | 53 Tabela 17: Resultados obtidos no questionário das mulheres do grupo controlo. Idade Peso (Kg) Altura (cm) Idade Menarca Fumadora Escolaridade História gestacional 31 58 162 13 Não Licenciatura Sem filhos 37 54 164 12 Não Licenciatura 1 filho 35 60 154 13 Não Licenciatura 1 filho 39 65 154 13 Sim 12º ano 1 filho 42 61 162 13 Não Licenciatura 1 filho 40 69 156 14 Não 12º ano 1 filho 41 59 167 14 Não Douturamento 1 filho 32 52 174 14 Não Licenciatura 1 filho 36 60 160 9 Sim Licenciatura 1 filho 35 55 167 14 Não Mestrado 1 filho 32 70 172 12 Não Licenciatura 2 filhos 27 60 157 12 Não 12º ano 1 filho 35 60 166 14 Não Douturamento 1 filho 31 54 166 13 Não Mestrado 1 filho 29 67 170 13 Não Mestrado 1 filho A obervação dos dados recolhidos permitiu verificar que não existe uma diferença significativa entre os dois grupos em relação à idade, ao peso, à altura e à idade da menarca. Verificou-se também que o nivel de escolaridade é elevado uma vez que a maior parte das mulheres, tanto do grupo teste como do grupo controlo, são licenciadas (63,2% grupo teste e 46,7% grupo controlo). Quanto à história gestacional, 36,9% das mulheres do grupo teste não conseguiram ter filhos e 31,6% engravidaram recorrendo a tratamento. Todas as mulheres do grupo controlo engravidaram de forma natural (Tabela 18). Discussão Página | 60 corroboraram o trabalho de Nowinski et al.(1990) mas entra em desacordo com muitos outros trabalhos publicados na literatura25,50. Diversas abordagens têm sido utilizadas para estudar o mosaicismo de baixo grau envolvendo o cromossoma X. Um estudo realizado nos elementos femininos de casais submetidos a tratamento por ICSI (Intracytoplasmatic Sperm Injection) mostrou que o mosaicismo de baixo grau encontrado nessas mulheres (3,3%) não tinha influência sobre o tratamento quando comparado com controlos normais (Sonntag et al., 2001)29. Em 2004, Voigt et al. estudaram também mulheres submetidas a tratamento por ICSI, que apresentavam mosaicismo de baixo grau envolvendo o cromossoma X com uma incidência de 3,8% de células aneuploides. Compararam os resultados com um grupo controlo, também submetido a tratamento mas sem alterações cromossómicas e não encontraram diferenças significativas nos resultados obtidos51. Outro estudo mais recente concluiu que a presença de mosaicismo entre 6 e 28% não tem efeito adverso no resultado do tratamento por ICSI ou IVF (In Vitro Fertilization) (Hommer et al., 2012)33 No nosso estudo verificou-se que das 19 mulheres com diagnóstico de mosaicismo de baixo grau do cromossoma X que responderam ao questionário, 9 engravidaram recorrendo a tratamento (1ª tentativa) e apenas uma paciente não levou a gestação a termo, resultando numa gravidez ectópica (43 anos). É de referir que uma das pacientes que levou a gravidez a termo apresentou 18,4% de mosaicismo envolvendo o cromossoma X e tinha 33 anos no diagnóstico. Estes resultados estão de acordo com o obervado por Hommer e seus colaboradores33. Adicionalmente, Voigt et al. (2004) verificaram que a frequência de mosaicismo do cromossoma X num grupo de mulheres submetidas a tratamento por ICSI era significativamente inferior à frequência presente num grupo de mulheres com história de abortamentos espontâneos (3,8% vs 8,5%, p <0,01)51. Estes resultados confirmaram o que já tinha sido descrito por Holzgreve et al. em 1984, que referia que mulheres com abortamentos de repetição apresentavam alterações númericas do cromossoma X numa maior percentagem52. Na presente investigação foram incluídas cinco amostras de sangue periférico de pacientes com diagnóstico de abortamentos de repetição. A média das idades foi de 35 anos e a média da percentagem de mosaicismo foi 5,6%. Os Discussão Página | 61 nossos resultados não sugeriram uma percentagem mais elevada de mosaicismo nas mulheres com história de abortamentos de repetição mas tendo em conta o número reduzido de casos (apenas 5) comparações com significado estatístico não foram realizadas. Uma das questões levantadas por alguns autores foi se o mosaicimo de baixo envolvendo o cromossoma X poderia ter impacto sobre as caracteristicas fenotípicas sem afetar as funções endócrinas e exócrinas do ovário. Esta situação poderia ser explicada pelo fato do mosaicismo ser confinado ao tecido estudado, habitualmente sangue periférico33. Na verdade, podem existir diferenças nos níveis de mosaicismo e mesmo nos tipos de aneuploidias (aparecimento de linhas celulares adicionais) em diferentes tecidos. Um estudo realizado em mulheres com suspeita clínica de TS revelou diferenças na percentagem de células aneuploides encontrada em linfócitos de sangue periférico e em células epiteliais da mucosa oral quando analisadas pela técnica de FISH (Nazarenko et al.)37. Freriks et al. também estudaram a percentagem de mosaicismo dos cromossomas sexuais em amostras de sangue periférico e esfregaço bucal e os resultados obtidos corroboraram os de Nazarenko e colaboradores53. Para 24 casos (10 do grupo teste e 14 do grupo controlo) foi possível fazer uma análise conjunta dos resultados obtidos em linfócitos de sangue periférico e células epiteliais do esfregaço bucal. As percentagens de mosaisismo encontradas foram diferentes na maioria dos casos nos dois tecidos, no entanto, em todos os casos a presença do mosaicismo foi confirmada nas células da mucosa bucal o que sugere tratar-se de mosaicismos verdadeiros. Em estudos de pacientes com TS ou com fenótipo sugestivo de TS, vários autores sugerem a pesquisa de fragmentos do cromossoma Y. No nosso estudo, todas as mulheres tinham diagnóstico de infertilidade e mosaicismo de baixo grau no cariótipo mas não apresentavam qualquer outro indicador clínico de TS e por este motivo não foi incluida a pesquisa de fragmentos do cromossoma Y. Esta decisão foi baseada no estudo de Van Dyke and Viktor (2006) que concluiram que a identificação Discussão Página | 62 de células com um segundo cromossoma X seria suficiente para excluir, com um elevado grau de confiança, a presença de células com fragmentos do cromossoma Y54. VI. CONCLUSÃO Conclusão Página | 65 VI. Conclusão Com o estudo desenvolvido e os resultados obtidos, concluiu-se que a prevalência de mosaicismo de baixo grau foi mais elevada no grupo teste do que no grupo controlo. Contudo, é de salientar que o grupo teste representava uma população selecionada (presença de mosaicismo de baixo grau no cariótipo) e por este motivo poderia ser esperado, logo à partida, percentagens superiores de aneuploidias pela técnica de FISH quando comparados com uma população com cariótipo normal. A presença de linhas celulares aneuplóides em ambos os grupos, nomeadamente no grupo com cariótipo normal, sugere que este fenómeno poderá ser frequente, que a idade da mulher aumenta a predisposição para a perda do cromossoma X (em ambos os grupos) e que portanto a presença de linhas celulares aneuplóides de baixo grau não deverá ser sobrevalorizada como causa explicativa da infertilidade presente no casal. Adicionalmente, a análise das células do esfregaço bucal revelou a presença de células aneuploides tanto no grupo teste como no grupo controlo em percentagem semelhantes. Assim, os resultados obtidos neste trabalho permitem sugerir que a presença de mosaicismo de baixo grau (<10%) não deverá ter implicações clínicas relevantes que comprometam a fertilidade. No futuro, será importante fazer o seguimento clínico destes casais, submetidos ao não a um tratamento de fertilidade, de forma a poder ser avaliado mais precisamente o sucesso na obtenção de uma gravidez. Conclusão Página | 66 VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Referências Bibliográficas Página | 69 VII. Referências Bibliográficas 1. Roupa Z, et al. Causes of infertility in women at reproductive age. Health Science Journal. 2009; 3(2): 80-87. 2. Barros, Alberto. Guias de Saúde: Infertilidade. Porto: QuidNovi, 2011. ISBN 978989-554-777-7. 3. Direcção Geral de Saúde. Saúde Reprodutiva: Infertilidade. Lisboa: DGS, 2008. ISBN 978-972-675-186-1. 4. Morice P, et al. History of Infertility. Hum Reprod Update. 1995; 1(5):497-504. 5. Silva Carvalho, JL. Manual de Ginecologia: Infertilidade. Permanyer Portugal, 2011; 28:3-73. ISBN 978-972-773-260-1. 6. Macaluzo M, et al. A public health focus on infertility prevention, detection, and management. Fertility and Sterility. 2008. 7. Gnoth C, et al. Definition and prevalence of subfertility and infertility. Hum Reprod. 2005; 20(5):1144–1147. 8. Boivin J, et al. International estimates of infertility prevalence and treatmentseeking: potential need and demand for infertility medical care. Hum Reprod. 2007; 22(6):1506–1512. 9. Ferraz L. Infertilidade conjugal. Avaliação do factor masculino. Acta Urológica. 2006; 23(4): Separata. 10. Olooto, et al. A review of Female Infertility; important etiological factors and management. J. Microbiol. Biotech. Res. 2012; 2(3):379-385. 11. ASRM Practice Commitee. Aging and infertility in women. Fertility and Sterility. 2006 Nov; 86(4). 12. Azziz R, et al. The Prevalence and Features of the Polycystic Ovary Syndrome in an Unselected Population. J Clin Endocrinol Metab. June 2004; 89(6):2745– 2749. 13. Katsikis I, et al. Anovulation and ovulation induction. Hippokratia. 2006; 10(3): 120-127. 14. Kruska KS, et al. Environmental factors in infertility. Clin Obstet Gynecol. 2000 Dec; 43(4):821-829. Anexos Página | 76 Anexos Página | 77 Anexo II: Declaração de Consentimento Informado Doação de células da mucosa bucal Este texto destina-se a fornecer-lhe toda a informação relativa ao projeto de investigação: “Estudo da prevalência de mosaicismo de baixo grau e sua implicação clínica na infertilidade feminina.”. Pelo facto de serem elegíveis para fazerem parte deste estudo, é necessário que leiam toda a informação contida neste documento e caso surjam dúvidas podem solicitar o respetivo esclarecimento. Se decidirem colaborar com este projeto, terão que o declarar assinando este documento no local devidamente assinalado. 1Informação geral sobre o estudo e os investigadores 1.1Título do estudo: Estudo da prevalência de mosaicismo de baixo grau e sua implicação clínica na infertilidade feminina. 1.2Entidade responsável pelo estudo: Departamento de Genética da Faculdade de Medicina do Porto 1.3Nomes e afiliações dos principais investigadores deste estudo: Departamento de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto  Prof. Doutor Alberto Barros  Prof. Doutora Sofia Dória  Dra. Ana Isabel Barbosa  Dra. Vânia Ventura Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Centro Hospitalar São João  Dra. Sandra Soares 2-Objectivo e descrição do estudo Nas mulheres, a presença de mosaicismo de baixo grau envolvendo uma linha celular 45,X tem sido indicada, por alguns autores, como possível causa de infertilidade, abortamentos de repetição e insucesso na reprodução medicamente assistida. Outros autores, sugerem que a presença de uma linha celular 45,X com baixa representatividade não causará impacto na fertilidade de casais submetidos a um processo de procriação medicamente assistida. Por este motivo, torna-se muito importante a determinação e a avaliação do mosaicismo de baixo grau. Contudo, são necessários mais estudos de modo a compreender se este fator terá implicação clinica ou não na reprodução. Neste trabalho, após a análise do cariótipo e da Anexos Página | 78 percentagem de células 45,X realizados em linfócitos, será realizado o estudo pela técnica de Hibridação in situ de Fluorescência (FISH) em células da mucosa bucal permitindo uma análise da percentagem de células com a linha aneuplóide (45,X) num outro tecido, adicionalmente ao realizado em linfócitos. 3-Riscos e Benefícios do Estudo Este estudo não acarreta qualquer tipo de custo nem risco para os intervenientes, uma vez que apenas implica a doação de células da mucosa bucal. Os benefícios deste estudo traduzir-se-ão na possibilidade de determinar qual o grau de mosaicismo envolvendo uma linha celular 45,X a partir do qual poderá haver implicações clínicas ou reprodutivas para as suas portadoras. 3-Contactos relevantes Em caso de dúvida poderá contactar o Departamento de Genética (telefone: 22-5513647) 4Declaração do consentimento informado Eu, abaixo assinado (nome completo),__________________________________________ _______________________________________________________________________, Portadora do bilhete de identidade nº_____________________________________________, compreendi a explicação que me foi fornecida acerca do estudo para o qual será necessária a utilização das minhas células, tendo-me sido dada a oportunidade de esclarecer todas as dúvidas que me surgiram. Declaro que fui informada de que haverá total garantia de anonimato e sigilo conforme determina a legislação portuguesa sobre a proteção de dados individuais e, por isso, consinto que estudo proposto seja realizado. Porto,___________de_____________________de___________ Assinatura_____________________________________________________________________