Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas

Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Marlene Sofia Oliveira Mendes Biologia e Gestão da Qualidade da Água Departamento de Biologia 2012 Orientador Professora Doutora Sandra Quinteira, Professor Coordenador do IPSNCESPU Coorientador Professor Doutor Nuno Monteiro, Investigador auxiliar, CIBIO, FCUP e Professor auxiliar, UFP Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Universidade do Porto / Santander Totta “Projetos Pluridisciplinares 2010” (PP-199/2010) e pela Cooperativa de Ensino Superior, Politécnico e Universitário - CESPU (05-2011/CITS). 2 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Agradecimentos Em primeiro lugar quero agradecer aos meus pais e à minha irmã, todo o apoio, amor e compreensão que me têm dado ao longo de toda a minha vida. À minha orientadora, Prof. Doutora Sandra Quinteira, quero agradecer a orientação, empenho, dedicação e disponibilidade que sempre demonstrou ao longo da realização desta tese e também pela oportunidade que me deu de trabalhar numa área desconhecida para mim. Ao Prof. Doutor Nuno Monteiro, pela disponibilidade e por toda a ajuda que me deu ao longo da realização da tese. A todas as pessoas no CIBIO que de alguma forma contribuíram para a realização desta tese. Às minhas amigas e companheiras que sempre me deram apoio e incentivo para continuar mesmo nas horas em que duvidei de mim mesma e achei que já não tinha forças para continuar. À CESPU, à Universidade do Porto e ao Santander Totta pelo financiamento do trabalho. A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desta tese, um muito obrigado. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 3 Resumo O fenómeno de resistência aos antibióticos é reconhecido globalmente como um sério risco para a saúde pública que continuamente preocupa e desafia a comunidade científica. Embora os mecanismos subjacentes a este fenómeno sejam bem conhecidos em ambiente hospitalar, não existe ainda informação suficiente sobre o papel exercido, na disseminação e aquisição de determinantes de resistência, por outros nichos ecológicos, nomeadamente das comunidades bacterianas que habitam a fauna selvagem, parte da qual em risco de extinção. Assim, constituiu um dos principais objetivos deste trabalho a caracterização fenotípica e genotípica do microbioma associado a várias espécies animais icónicas que habitam um dos últimos entrepostos selvagens do mundo, a região da Rota da Seda e a região do Planalto Tibetano (Teto do mundo), com a pesquisa de determinantes genéticos de resistência a antibióticos associados aos fenótipos de suscetibilidade observados. Foi possível utilizar, para além de amostras de fezes de várias espécies animais em risco de extinção, ou ameaçadas, amostras de fezes de Equus kiang, o burro selvagem tibetano. As amostras de fezes foram recolhidas no decurso de uma expedição à região de Xinjiang, na China e de uma colaboração com investigadores no Tibete que recolheram as amostras relativas ao kiang. As bactérias, associadas aos diferentes animais, foram obtidas após um processo de seleção em meios de cultura, suplementados e não suplementados com diferentes classes de antibióticos e foram identificadas por provas bioquímicas clássicas, sistemas automáticos de identificação e, em algumas situações, por PCR. A determinação da suscetibilidade aos diferentes agentes antimicrobianos, de cada isolado obtido, foi efetuada pelo método de difusão com discos, de acordo com as normas e critérios definidos pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). A pesquisa de genes codificadores de resistência (por exemplo, tetM, tetL, tetO, ermA, ermB, ermC, bla TEM , bla CTX-M , bla SHV ) e a deteção da presença de integrões de classe 1 foi realizada por PCR. Em geral, foi possível isolar bactérias que apresentaram fenótipos de resistência a partir das amostras de todos os animais da região de Xinjiang. Foram detetados elevados níveis de resistência à tetraciclina e à vancomicina em Enterococcus e também elevadas resistências ao imipenemo e à cefotaxima em bactérias de Gram negativo. Em relação à pesquisa de genes codificadores de resistência foi possível detetar a presença de tetM, ermB e também de bla CTX-M . A presença de integrões de classe 1 também foi detetada. 4 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Com estes resultados foi possível verificar que a resistência se estende além do ambiente hospitalar encontrando-se também presente em ambientes remotos pouco povoados. Palavras-chave: antibióticos, animais selvagens, resistências, locais remotos FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 5 Summary Antibiotic resistance is globally recognized as a serious risk to public health concerning and continually challenging the scientific community. Although the mechanisms underlying this phenomenon are well known in the hospital setting, there is not enough information about the role played in the dissemination and acquisition of resistance determinants for other ecological niches, including bacterial communities inhabiting wildlife, some of which endangered. So one of the main objectives of this study was the phenotypic and genotypic characterization of the microbiome associated with several iconic animal species that inhabit one of the world's last wild depot, the region of the Silk Road and the Tibetan Plateau (Roof of the World), with the research of genetic determinants of antibiotic resistance associated with the phenotypes of susceptibility observed. It was possible to use, in addition to fecal samples of various animal species at risk of extinction or endangered, fecal samples of Equus kiang, the Tibetan wild ass. Stool samples were collected during an expedition to the Xinjiang region in China and in collaboration with researchers of Tibet who collected the samples related to kiang. Bacteria associated with the different animals were obtained after a process of selection in culture media supplemented and non-supplemented with various classes of antibiotics, and were identified by classical biochemical tests, automatic identification, and in some instances, by PCR. The determination of susceptibility to several antimicrobial agents obtained from each isolate was performed by disk-diffusion method, according to the standards and criteria established by the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). The search for genes encoding resistance (for example, tetM, tetL, tetO, ermA, ermB, ermC, bla TEM , bla CTX-M , bla SHV ) and detection of the presence of class 1 integrons was performed by PCR. In general, it was possible to isolate bacteria that showed phenotypes of resistance from the samples of all animals of the Xinjiang region. High levels of resistance to vancomycin and tetracycline in Enterococcus were detected and also high resistance to cefotaxime and imipenem in Gram negative bacteria. Regarding the study of genes encoding resistance it was possible to detect the presence of tetM, ermB and also bla CTX-M . The presence of class 1 integrons was also detected. With these results it was possible to verify that resistance extends beyond the hospital environment and it is also present in remote environments sparsely populated. 6 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Key Words: antibiotics, wild animals, resistance, remote locations. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 7 Índice Lista de Figuras ............................................................................................................ 9 Lista da Tabelas ......................................................................................................... 10 1. Introdução ............................................................................................................ 13 1.1 Antibióticos e resistência .............................................................................. 13 1.2 Principais grupos de antibióticos ................................................................... 16 2. Objetivos.............................................................................................................. 20 3. Material e Métodos .............................................................................................. 21 3.1 Caracterização do local de amostragem e origem das amostras .................. 21 3.2 Obtenção dos isolados ................................................................................. 23 3.3 Identificação dos isolados obtidos ................................................................ 24 3.4 Avaliação da suscetibilidade a agentes antimicrobianos ............................... 25 3.5 Caracterização de genes de resistência a antibióticos .................................. 26 3.5.1 Condições gerais das reações de amplificação de DNA por PCR ......... 26 3.5.1.1 Preparação do DNA bacteriano ...................................................... 26 3.5.1.2 Condições de amplificação ................................................................ 26 3.5.1.3 Eletroforese em gel de agarose ......................................................... 27 4. Resultados e Discussão ...................................................................................... 30 4.1 Isolados obtidos ............................................................................................ 30 4.2 Identificação dos Isolados obtidos ................................................................ 31 4.3 Avaliação da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos dos isolados obtidos .................................................................................................................... 32 4.3.1 Avaliação da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos em isolados provenientes das amostras da região de Xinjiang ................................................ 32 4.3.2 Avaliação da suscetibilidade em isolados provenientes das amostras de Equus kiang ......................................................................................................... 34 4.4 Caracterização dos genes de resistência ..................................................... 37 4.4.1 Caracterização da resistência à tetraciclina ........................................... 37 8 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 4.4.1.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang ........................................ 37 4.4.1.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano .......................... 38 4.4.2 Caracterização da resistência aos macrólidos ....................................... 39 4.4.2.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang ........................................ 39 4.4.2.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano .......................... 40 4.4.3 Pesquisa de bla CTX-M , bla TEM e bla SHV ..................................................... 41 4.4.3.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang ........................................ 41 4.4.3.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano .......................... 41 4.5 Pesquisa da presença de Integrões .............................................................. 41 4.5.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang ............................................ 42 4.5.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano ............................. 43 5. Conclusão Geral .................................................................................................. 44 6. Referências bibliográficas .................................................................................... 46 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 15 inserção das cassetes de genes, attI, localizado a seguir ao intI e um promotor que se encontra localizado no interior do intI e que dirige a transcrição para o local de inserção onde os genes localizados nas cassetes são expressos. Estas características encontram-se todas na região conservada 5’. A região conservada 3’ codifica para a resistência às sulfonamidas, mediada pelo gene sul1, qacE∆1 que determina resistência a brometo de etídio e compostos quaternários de amónio e duas Open Reading Frames (ORF), orf5 e orf6 que codificam para proteínas de funções desconhecidas. Novos integrões são gerados a partir da inserção de novas cassetes de genes no attI, ou deleção de uma mais cassetes de um integrão existente (Figura 1). Deleções, duplicações e rearranjo das cassetes já foram observados. O movimento das cassetes para dentro e fora dos integrões é um processo feito ao acaso, assim como a maioria dos arranjos genéticos em bactérias. [17] [18] [19] Quatro classes de integrões foram identificadas até ao momento. Cada classe tem um específico gene intI e local attI. A maioria dos integrões descritos pertence à classe 1. Embora os integrões possam mobilizar várias cassetes de genes, por si só eles não são móveis. Integrões de classe 1 são muitas vezes encontrados em transposões. Estes transposões encontram-se normalmente localizados em Região conservada 3’ Região conservada 5’ Região conservada 3’ Figura 1 - Estrutura do integrão. Adaptada de Bennet, 1999. [19] Região conservada 5’ 16 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas plasmídeos móveis o que aumenta a disseminação dos genes de resistência aos antibióticos a bactérias da mesma espécie ou mesmo espécies diferentes. [17] [18] 1.2 Principais grupos de antibióticos Cada grupo de antibióticos tem um alvo ou alvos específicos na célula bacteriana. Existem vários grupos de antibióticos, que atuam em diferentes locais da célula bacteriana, nomeadamente antiparietais, antimembranares, inibidores da síntese proteica, inibidores da síntese dos ácidos nucleicos, antimetabolitos, nitrofuranos, antituberculosos e antilepra. [20] Dentro dos antibióticos antiparietais encontram-se os glicopéptidos como a teicoplanina e a vancomicina inibidores da formação do peptidoglicano. São de origem natural, com ação bacteriolítica e são inibidores da formação do peptidoglicano na fase membranar. Estes antibióticos têm fraca atividade contra bacilos de Gram negativo devido ao seu elevado peso molecular o que impede a sua passagem através dos canais de porina existentes na membrana exterior deste tipo de bactérias. Atuam contra um grande número de bactérias de Gram positivo, incluindo bactérias pertencentes ao género Enterococcus. Estes antibióticos atuam através da alteração do local alvo, formam complexos com o dipeptideo D-alanil-D-alanina da cadeia peptídica dos percursores do peptidoglicano, impedindo a transferência de unidades recém sintetizadas para a matriz parietal em crescimento, provocando a lise da célula bacteriana em crescimento. Tanto a vancomicina como a teicoplanina são de uso exclusivo hospitalar em Portugal. [1] [20] A resistência adquirida aos glicopéptidos em Enterococcus spp. pode dever-se a seis diferentes genótipos de resistência: vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG. Os genes van A e vanB são bastante frequentes, sendo que vanA ocorre em E. faecalis, E. faecium e ocasionalmente em E. avium, E. durans, E. hirae e E. raffinosum, é indutivel e confere resistência à vancomicina e à teicoplanina. Já o gene vanB ocorre quase exclusivamente em E. faecalis e em E. faecium conferindo resistência indutivel à vancomicina mas não à teicoplanina. O gene vanC é característico da espécie Enterococcus e é intrínseco das espécies E. gallinarum, E. casseliflavus e E. flavescens. Os genes vanD, vanE e vanG foram observados num número reduzido de espécies. [1] [20] Ainda dentro dos antiparietas encontram-se os beta-lactâmicos, também eles inibidores da síntese do peptidoglicano. São uma coleção de substâncias não homogéneas na sua química, tendo apenas em comum um anel β-lactâmico. Têm o FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 17 inconveniente de poderem ser inativados por enzimas hidrolíticas bacterianas (βlactamases). Dentro dos beta-lactâmicos incluem-se as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactamos e os carbapenemos. As bactérias escapam à ação destes antibióticos por 4 mecanismos: hidrólise por β-lactamases, modificação dos alvos (alteração da PBP’s – Penicillin Binding Proteins), impermeabilização da membrana externa e bombas de efluxo. As β-lactamases são os principais determinantes da resistência bacteriana aos antibióticos. São enzimas, cujos genes podem apresentar localização plasmídica ou cromossómica que catalizam a hidrolise do anel β-lactâmico. Alguns genes codificam para β-lactamases com um espetro de atividade reduzido, outras apresentam atividade para β-lactâmicos de largo espetro como as cefalosporinas de 3ª geração, levando ao aparecimento de β-lactamases de espetro alargado (ESBL – Extended Spectrum βLactamases). Dentro destas últimas incluem-se, por exemplo, as do tipo TEM, SHV e CTX-M. Dependendo da sua atividade, as β-lactamases podem ser designadas de penicilases, cefalosporinases ou carbapenemases. Muitas vezes os genes codificadores de β-lactamases encontram-se em integrões: elementos genéticos mobilizáveis em plasmídeos e transposões, com capacidade de adquirirem múltiplas cassetes de genes de resistência a antibióticos. [1] [21] No que diz respeito aos antibióticos inibidores da síntese proteica temos os aminoglicosídeos como é o caso da tobramicina e a gentamicina. São muito utilizados para o tratamento de infeções provocadas por bactérias de Gram positivo (Enterococcus) e de Gram negativo (Pseudomonas, Enterobacteriaceae), são normalmente usado juntamente com antibióticos antiparietais ou glicopéptidos. Após atingir o citoplasma bacteriano, o antibiótico liga-se à subunidade 30S ribossomal, causando alterações na síntese proteica. A modificação enzimática das moléculas destes antibióticos constitui o mecanismo mais frequente de resistência observada em estirpes clinicas embora também existam outros mecanismos de resistência, como alteração dos ribossomas por mutação (alteração do local alvo) e impermeabilização da membrana citoplasmática (reduzida capacidade de atravessar os invólucros bacterianos para atingir o citoplasma). [20] [21] [22] As tetraciclinas são antibióticos de largo espetro, ativas contra bactérias de Gram positivo e de Gram negativo. O seu baixo custo e fácil aplicação fazem com que as tetraciclinas sejam largamente consumidas quer na medicina quer na veterinária. As tetraciclinas inibem primariamente a síntese proteica, atuando ao nível da 18 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas subunidade 30S dos ribossomas. Classificam-se como bacteriostáticos uma vez que apenas inibem o crescimento bacteriano. Os determinantes genéticos podem ser de origem cromossómica, sendo mais frequentes em plasmídeos ou em transposões o que facilita a sua disseminação. Os mecanismos de resistência às tetraciclinas descritos para Enterococcus são: bombas de efluxo que são codificadas pelos genes tetK e tetL. Estas bombas expulsam o antibiótico para o exterior não permitindo que ele se acumule no citoplasma. O outro mecanismo é um sistema de proteção ribossomal constituídos por proteínas que ao interagir com o ribossoma o deixam insensível à inibição das tetraciclina. Este mecanismo é codificado pelos genes tetM, tetO e tetS. [1] [20] [22] Os macrólidos inibem a síntese proteica ao ligar-se à subunidade 50S do ribossoma. Tal como as tetraciclinas têm uma atividade bacterisotática e uma grande atividade face a bactérias de Gram positivo. A resistência aos macrólidos pode ser mediada por vários mecanismos e genes. Um dos mecanismos mais disseminados é a alteração do local alvo, mediada pelos genes erm. De facto a diminuição de suscetibilidade a macrólidos em Enterococcus spp. devido à presença de ermB é das mais disseminadas nos vários nichos onde se estudam estas bactérias, tendo sido detetado em isolados clínicos, frangos e suínos. Outros mecanismos de resistência incluem a inativação enzimática e bombas de efluxo, codificadas pelos genes ere e mef respetivamente. [1] [20] [21] [22] [23] As quinolonas, como é o caso da ciprofloxacina (quinolona de segunda geração), são ativas contra bactérias de Gram negativo tendo pouca atividade contra bactérias de Gram positivo. Elas inibem as enzimas responsáveis pelo enrolamento do DNA processo fundamental na replicação deste. As bactérias podem resistir à ação destes antibióticos através de impermeabilização da membrana exterior, alterações no local alvo e através de bombas de efluxo. [20] [22] A quinopristina/dalfopristina usam-se na terapêutica associadas, inibem a síntese proteica com uma ligação à subunidade 50S do ribossoma. No que diz respeito à resistência à quinopristina, pensa-se que possa ser similar à dos macrólidos e no caso da dalfopristina que se deve à degradação enzimática. [20] [22] Alguns estudos já foram realizados em locais remotos como na Bolívia, onde foram encontradas altos níveis de resistência a antibióticos em isolados comensais de Escherichia coli. [11] Também na região da Beringia em amostras fecais de pássaros foram detetados níveis de resistência a vários antibióticos. [24] Ainda outros estudos FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 19 feitos em diferentes animais demonstraram elevados níveis de resistência a antibióticos. [2] [6] [25] [26] Na presente tese as amostras utilizadas foram uma oportunidade única de estudo, uma vez que pertencem a animais endémicos da região de Xinjiang e do Planalto Tibetano nunca antes estudadas. 20 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 2. Objetivos Atualmente, a emergência e evolução da resistência a agentes antimicrobianos constituem um dos fenómenos mais preocupantes de Saúde Pública, tendo vindo, nos últimos anos, a representar um desafio constante à escala mundial. O hospital é sem dúvida um dos nichos ecológicos mais importantes na promoção do aparecimento de elevados níveis de resistências. Contudo, permanece, pouco esclarecida a origem de alguns dos mecanismos de resistência adquiridos com maior relevância clínica, bem como a sua associação a bactérias de nichos ecológicos extra-hospitalares. Tendo em conta que o papel dos animais selvagens neste complexo processo de disseminação da resistência não está claramente estabelecido, o estudo da fauna selvagem endémica que habita regiões remotas e muitas vezes exóticas, com a caracterização da flora microbiana associada, torna-se uma das abordagens mais lógicas e importantes para a deteção e/ou identificação de novos mecanismos de resistência. Assim, constituíram objetivos do presente trabalho: • Caracterizar a flora microbiana associada a diferentes espécies animais selvagens da região de Xinjiang e do burro selvagem tibetano (Equus kiang) que habita o Planalto Tibetano. • Estudar a suscetibilidade das bactérias isoladas, das diferentes amostras de fezes animais, a vários grupos de antibióticos, identificando a presença de bactérias resistentes. • Caracterizar os determinantes genéticos associados aos vários fenótipos de resistência identificados. • Investigar e identificar a associação dos determinantes genéticos de resistência aos antibióticos a elementos de captura genética móveis, facilitadores e promotores da disseminação horizontal da resistência. • Contribuir para o conhecimento do papel dos animais selvagens, alguns em vias de extinção, como potencial reservatório e fonte de bactérias resistentes a antibióticos fora do ambiente hospitalar. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 21 3. Material e Métodos 3.1 Caracterização do local de amostragem e origem das amostras No presente trabalho, foram utilizadas amostras de fezes de várias espécies animais selvagens icónicas, algumas consideradas ameaçadas ou em vias de extinção, que habitam uma das regiões mais remotas do globo, a região de Xinjiang na China e do Planalto Tibetano, a região mais alta do mundo (Figura 2). Figura 2 - Região de Xinjiang e Planalto Tibetano. Parte das amostras de fezes (n=32), de vários animais selvagens (Tabela 1; Figura 3), foi recolhida no decurso de uma recente expedição, a “Silk Road 2010 Expedition”, levada a cabo por uma equipa de investigadores do CIBIO (Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos) juntamente com a Chinese Academy of Sciences, à Região Autónoma de Xinjiang Uyghur, localizada na China. As restantes 32 amostras (Tabela 1) foram obtidas no contexto de uma colaboração entre um grupo de investigação do CIBIO e investigadores locais no Tibete, que procederam à recolha de fezes de Equus kiang, o burro selvagem tibetano. Este equídeo, o maior dos burros selvagens, é uma espécie endémica do Tibete, considerado um dos últimos territórios de vida selvagem do Oriente. Estas amostras foram recolhidas em diferentes reservas naturais do Planalto Tibetano, onde o kiang 22 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas habita: Tingri (n=14), Nyalam (n=4), Gyirong (n=6) e Nagqu (n=8), localizações caracterizadas por população humana inexistente ou extremamente baixa. Tabela 1 - Espécies animais amostradas e respetiva classificação do estado de conservação Espécie animal Estado de Conservação a Nº de amostras Marmota cinzenta (Marmota baibacina) Camelo bactriano (Camelus bactrianus) Burro selvagem da Mongólia (Equus hemionus) Lobo tibetano (Canis lupus) Cão selvagem asiático (Cuon alpinus) Urso castanho (Ursus arctos) Cavalo Przewalski (Equus ferus przewalskii) Gazela (Procapra gutturosa) Cabra selvagem (Capra aegagrus aegagrus) Burro selvagem tibetano (Equus kiang) De menor preocupação Criticamente ameaçado Ameaçado De menor preocupação Ameaçado De menor preocupação Ameaçado De menor preocupação Vulnerável De menor preocupação 7 8 4 3 1 1 6 1 1 32 a de acordo com a classificação do “The IUCN Red List of Threatened species” [27] Figura 3 - Alguns exemplares dos animais selvagens amostrados (A - Marmota cinzenta; B - Camelo bactriano; C - Burro selvagem da Mongólia; D - Lobo tibetano; E - Cão selvagem asiático; F - Cavalo Przewalski). FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 23 A região de Xinjiang, uma área pouco povoada e que se estende por mais de 1,6 milhões de km 2 , é habitada por diferentes grupos étnicos, tendo sido, no passado, atravessada pelo norte da Rota da Seda, que cruzava o deserto icónico de Taklamakan (Figura 4). É uma vasta região isolada, caracterizada por ambientes distintos, habitats incluindo deserto, semi-deserto e tundra. Algumas destas áreas são consideradas, à parte das regiões polares, das menos povoadas do mundo e, durante a expedição, não foram vislumbrados sinais de presença humana. O acesso a esta região remota é extremamente difícil e limitado, tendo sido necessárias autorizações oficiais especiais para entrar em determinadas áreas. Figura 4 - Diferentes áreas percorridas, durante mais de 5000 Km, no decurso da expedição "Silk Road 2010 Expedition", onde foram recolhidas as diversas amostras de fezes de animais selvagens. As amostras de fezes dos animais foram recolhidas com material estéril, colocadas em meio de cultura liquido (TSB - Tryptic Soy Broth) e transportadas à temperatura ambiente, transporte esse que demorou cerca de 1 semana. Uma vez no laboratório as amostras foram conservadas a -80ºC. 3.2 Obtenção dos isolados As amostras de fezes foram pré-enriquecidas em Buffered Peptone Water de acordo com procedimentos standard (ISO 6579) [28] e alíquotas destas suspensões (0,1 ml) foram semeadas à superfície de placas de Petri contendo diferentes meios de 24 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas cultura seletivos (Slannetz-Bartley Agar para Enterococcus spp., MacConkey Agar para Enterobacteriaceae e outros bacilos de Gram negativo) suplementados e não suplementados com diferentes antibióticos. A descrição dos meios de cultura, dos agentes antimicrobianos e respetivas concentrações, utilizados no processo de seleção de bactérias, encontra-se na Tabela 2. As placas foram incubadas a 37ºC/24h, tendo-se repicado e guardado uma colónia de cada morfologia. Tabela 2 - Agentes antimicrobianos utilizados na suplementação das placas e as suas respetivas concentrações Meio de Cultura Agentes antimicrobianos Concentrações (µg/ml) MacConkey Agar Cefotaxima Ceftazidima Imipenemo Tetraciclina Ciprofloxacina 2 2 1 8 0,125 Slanetz-Bartley Agar Tetraciclina Vancomicina Gentamicina Amoxicilina Ciprofloxacina 8 4 125 16 4 Paralelamente, foi também realizada a pesquisa de Salmonella de acordo com os procedimentos descritos na norma ISO 6579. [28] Após o isolamento, as bactérias foram conservadas em TSB com 20% de glicerol a -80ºC para posterior caracterização. 3.3 Identificação dos isolados obtidos A identificação das colónias foi realizada através de provas bioquímicas clássicas (por ex. coloração de Gram, oxidase, fermentação de açucares, etc.), sistemas de identificação miniaturizados API 32GN e, no caso das bactérias presuntivamente identificadas como Enterococcus, por reações de PCR. Os primers utilizados para identificação de género e espécie, assim como as concentrações dos reagentes e as condições de amplificação estão descritas nas Tabelas 3 e 4. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 31 Tabela 7 – Isolados obtidos a partir das amostras de animais provenientes da região de Xinjiang Animal Amostras (nº) Isolados (nº) Gram positivos (nº) Gram negativos Fermentadores da Lactose (nº) Não fermentadores da Lactose (nº) Burro selvagem da Mongólia 4 59 14 12 33 Cão selvagem asiático 1 7 6 1 0 Urso castanho 1 5 4 1 0 Gazela 1 11 3 2 6 Lobo tibetano 3 30 18 8 4 Cavalo Przewalski 6 67 22 27 18 Marmota cinzenta 7 89 33 25 31 Camelo bactriano 8 100 36 34 30 Cabra selvagem 1 10 5 4 1 Total 32 378 141 114 123 Tabela 8 – Isolados obtidos das amostras do kiang provenientes da região do Planalto Tibetano Zona Amostras (nº) Isolados (nº) Gram positivos (nº) Gram negativos Fermentadores da Lactose (nº) Não fermentadores da Lactose (nº) Tingri 14 136 62 40 34 Nyalam 4 42 20 11 11 Gyirong 6 61 23 21 17 Nagqu 8 79 36 27 16 Total 32 318 141 99 78 4.2 Identificação dos Isolados obtidos Das 64 amostras de fezes, utilizadas no presente estudo, foi possível isolar 696 estirpes bacterianas, que inicialmente foram distinguidas de acordo com o seu comportamento face à coloração de Gram, tendo-se obtido um total de 282 bactérias de Gram positivo e 414 bacilos de Gram negativo, pertencentes a diferentes espécies, como descrito na Tabela 9. 32 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Tabela 9 -Identificação dos isolados provenientes da região de Xinjiang e do Planalto Tibetano Espécie Nº de isolados Isolados obtidos das amostras d a r egião d e Xinjiang Enterococcus sp. 23 Enterococcus faecium 42 Enterococcus faecalis 14 Escherichia coli 15 Klebsiella pneumoniae 3 Enterobacter sakazakii 2 Acinetobacter baumannii 3 Stenotrophomonas maltophilia 3 Delftia acidovorans 2 Rhizobium radiobacter 1 Proteus mirabilis 1 Brevundimonas vesicularis 1 Burkholderia cepacia 1 Outros isolados de Gram positivo não identificados 62 Outros isolados de Gram negativo não identificados (fermentadores da lactose 94 Outros isolados de Gram negativo não identificados (não fermentadores da lactose) 111 Isolad os obtidos das amostras do Planalto Tibetano Enterococcus sp. 22 Enterococcus faecium 8 Escherichia coli 1 Pantoea spp. 1 Achromobacter denitrificans 4 Pseudomonas alcaligenes 1 Outros isolados de Gram positivo não identificados 111 Outros isolados de Gram negativo não identificados (fermentadores da lactose) 97 Outros isolados de Gram negativo não identificados (não fermentadores da lactose) 73 A pesquisa seletiva de bactérias do género Salmonella segundo a norma internacional ISO [28] realizada para as diferentes amostras de fezes anteriormente mencionadas revelou-se negativa. 4.3 Avaliação da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos dos isolados obtidos 4.3.1 Avaliação da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos em isolados provenientes das amostras da região de Xinjiang Das 378 bactérias isoladas a partir das amostras de fezes de animais endémicos da região de Xinjiang, foi possível verificar que 235 delas (62,2%) apresentam fenótipos de resistência aos antibióticos. Curiosamente, enquanto algumas dessas bactérias - 21,4% (81) - apresenta resistência a um só antibiótico, a FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 33 maioria - 40,7% (154) - manifesta um fenótipo de resistência múltipla (variando entre 2 a 5 agentes antimicrobianos). No caso das bactérias de Gram positivo, foram obtidos 141 isolados, sendo que 103 apresentaram uma diminuição da suscetibilidade a um ou vários antibióticos. Foram detetadas taxas variáveis de resistência aos diferentes antibióticos testados para estirpes de Enterococcus spp: tetraciclina - 76% (60/79), eritromicina – 57% (45/79), amoxicilina – 18% (14/79), vancomicina – 10% (8/79), quinopristina/dalfopristina – 34% (27/79), gentamicina – 22% (17/79). Dos 237 bacilos de Gram negativo isolados a partir das amostras de fezes dos animais provenientes da região de Xinjiang, foi possível identificar a presença de 114 isolados com capacidade de fermentar a lactose (vários identificados como E. coli) e 123 bacilos não fermentadores da lactose. Uma elevada percentagem de bacilos de Gram negativo fermentadores da lactose (46,5%) apresentaram diminuição de suscetibilidade a um ou vários agentes antimicrobianos e, em algumas situações, os perfis de suscetibilidade eram idênticos aos exibidos por estirpes tipicamente hospitalares. Detetaram-se taxas de resistência variáveis aos diferentes antibióticos testados: amoxiciclina - 40,4% (46/114), amoxicilina/ácido clavulânico – 13,6% (14/103), cefotaxima – 8,7% (9/103), gentamicina – 6,25% (1/16), ciprofloxacina - 15% (17/114), tetraciclina – 43,75% (7/16), tobramicina – 12,2% (12/98). Dos 114 isolados, 15 deles, a maioria com resistência a beta-lactâmicos e aminoglicosídeos foram identificados como E. coli. Um estudo efetuado em animais selvagens no México e na Austrália demonstrou uma maior frequência de resistência a antibióticos nos isolados provenientes do México. [5] Sugeriu-se que essa diferença se deva à ampla ocupação humana e uso de antibióticos no México, assim como, possíveis pressões seletivas nos animais hospedeiros. As aves selvagens são um reservatório de bactérias resistentes com potencial para disseminação de longa distância. Proximidade à atividade humana aumenta o número de bactérias resistentes associadas com aves selvagens. Por exemplo gaivotas e gansos que fazem ninhos perto de águas residuais albergam mais E. coli resistente do que aves associadas a águas não poluídas. [5] Através da migração, as aves podem disseminar a resistência a outros ambientes aparentemente sem contacto com antibióticos. No que diz respeito aos bacilos de Gram negativo não fermentadores da lactose, 80 (65%) isolados apresentaram diminuição de suscetibilidade a um ou vários 34 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas antibióticos. Foram observadas diferentes taxas de resistência aos antibióticos testados: amoxicilina (63%), ceftazidima (7,4%), gentamicina (24,8%) e tobramicina (22,5%). Dos 80 isolados, 2 apresentaram um fenótipo de resistência ao imipenemo. Um Proteus mirabilis obtido de uma marmota cinzenta e uma Brevundimonas vesicularis proveniente de um camelo bactriano. Entre 2006 e 2009 foram detetados 22 casos de infeções por B. vesicularis num hospital no sul de Taiwan. Após avaliação da sua suscetibilidade aos antibióticos verificou-se que 90,9% dos isolados eram suscetíveis ao imipenemo, cefpirome e piperacilina/tazobactam, 86,4% eram suscetíveis à gentamicina, amicacina e ciprofloxacina, 63,6% suscetíveis à ceftazidima e 59,1% suscetível ao trimetoprim-sulfametoxazole. [38] Os isolados clínicos de P. mirabilis, não produzem β-lactamases sobre condições de crescimento usuais. No entanto, já foi identificada resistência aos carbapenemos em Proteus spp. mediada por OXA-23 e VIM-1. Em 2009 foi isolado um P. mirabilis num hospital da China, após avaliação da suscetibilidade verificou-se que este era resistente a todos os agentes testados, tendo sido confirmada a presença de bla KPC (K. pneumoniae carbapenemase, que confere resistência aos carbapenemos). [39] Também na Grécia, em isolados de um hospital foi encontrado um P. mirabilis contendo uma β-lactamase do tipo bla TEM . [40] Alguns isolados identificados como Delftia acidovorans apresentaram fenótipo de resistência aos aminoglicosídeos, assim como já foi reportado para isolados clínicos. [41] Sendo o imipenemo um antibiótico de utilização restrita ao ambiente hospitalar, o facto de se terem encontrado bactérias com resistência a essa molécula em animais provenientes de ambientes tão remotos, com influência humana extremamente reduzida, reveste-se de grande importância e sugere que a resistência aos antibióticos está longe de estar confinada aos hospitais e poderá estar disseminada nas mais remotas áreas do globo. 4.3.2 Avaliação da suscetibilidade em isolados provenientes das amostras de Equus kiang A partir das amostras de fezes de Equus kiang, foi possível obter 318 isolados, 144 deles com fenótipo de resistência aos antibióticos testados (45,3%), variando entre resistência a um só antibiótico (34%) e a múltiplos agentes antimicrobianos (11,3%). Relativamente, às bactérias de Gram positivo, foram obtidos 141 isolados, sendo que 46 apresentaram uma diminuição da suscetibilidade a um ou vários antibióticos. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 35 Detetaram-se taxas variáveis de resistência aos diferentes antibióticos testados para estirpes de Enterococcus spp: tetraciclina - 10% (3/30), eritromicina – 10% (3/30), amoxicilina – 3,3% (1/30), vancomicina – 37% (11/30), quinopristina/dalfopristina – 77% (23/30). Vários estudos demonstram uma elevada taxa de Enterococcus resistentes à vancomicina e à tetraciclina em vários ambientes distintos, entre eles encontram-se o ambiente hospitalar, águas residuais provenientes de hospitais e em locais de criação de suínos. [42] [43] [44] Estes resultados permitem verificar que existe uma elevada disseminação de estirpes resistentes em locais onde o uso dos antibióticos é intensivo, pelo que a existência de níveis de resistência em locais remotos revela-se de grande importância para caracterizar os determinantes genéticos associados aos vários fenótipos de resistência observados. Relativamente aos 177 bacilos de Gram negativo isolados a partir das amostras de fezes do kiang, foi possível identificar 99 isolados com a capacidade de fermentar a lactose e 78 bacilos não fermentadores da lactose (alguns identificados como Achromobacter denitrificans). Dos isolados com capacidade para fermentar a lactose 35,4% apresentaram diminuição de suscetibilidade a um ou vários agentes antimicrobianos. Taxas de resistência variáveis foram detetadas para os diferentes antibióticos testados: amoxiciclina – 33,3% (33/99), amoxicilina/ácido clavulânico – 2,02% (2/99), cefotaxima – 1,01% (1/99), ciprofloxacina – 1,01% (1/99). No que diz respeito aos bacilos de Gram negativo não fermentadores da lactose, 81% (63/78) dos isolados apresentaram diminuição de suscetibilidade a um ou vários antibióticos. Foi possível observar taxas de resistência variáveis aos diferentes antibióticos: ceftazidima – 6,4% (5/78), tobramicina – 5,1% (4/78), ciprofloxacina – 21,8% (17/78), meropenemo – 1,3% (1/78), aztreonamo – 78,2% (61/78), gentamicina – 3,8% (3/78). Foram detetados 3 isolados resistentes à tobramicina, ciprofloxacina, gentamicina, aztreonamo e um isolado resistente à ceftazidima e ao aztreonamo, todos eles identificados como Achromobacter denitrificans. Tanto quanto se sabe apenas um caso de infeção por esta bactéria foi reportado. [45] Embora níveis de resistência a cefalosporinas, aminoglicosídeos e quinolonas tenham sido já reportados para o género Achromobacter, este é usualmente sensível a antibióticos comuns como o meropenemo e a ceftazidima. [45] Assim a presença destas bactérias em animais endémicos destas zonas remotas e com pressões humanas extremamente reduzidas vem mais uma vez reforçar a ideia de que a resistência não se encontra apenas 36 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas confinada aos hospitais e que o estudo destas bactérias pode ajudar a entender o complicado processo de emergência e disseminação de estirpes resistentes. Ao comparar as duas áreas de amostragem, foi possível verificar que as bactérias obtidas a partir das amostras de fezes do burro selvagem tibetano apresentam, de forma genérica perfis de suscetibilidade aos antibióticos testados muito superiores aos observados para as bactérias provenientes dos animais da região de Xinjiang (Tabela 10). Tabela 10 – Comparação entre as percentagens de resistência aos antibióticos dos isolados provenientes dos animais da região de Xinjiang e do Planalto Tibetano Antibióticos Resistências Xinjiang Planalto Tibetano Gram positivos Amoxicilina 18% (14/79) 3,3% (1/30) Gentamicina 22% (17/79) 0%(0/30) Vancomicina 10% (8/79) 37% (11/30) Tetraciclina 76% (60/79) 10% (3/30) Quinopristina/dalfopristina 34% (27/79) 77% (23/30) Eritromicina 57% (45/79) 10% (3/30) Gram negativos fermentadores da lactose Tetraciclina 43,75% (7/16) 0% (0/0) Amoxicilina 40,4% (46/114) 33,3% (33/99) Amoxicilina/Ácido clavulânico 13,6% (14/103) 2,02% (2/99) Cefotaxima 8,7% (9/103) 1,01% (1/99) Tobramicina 12,2% (12/98) 0% (0/99) Ciprofloxacina 15% (17/114) 1,01% (1/99) Gentamicina 6,25% (1/16) 0% (0/0) Gram negativos não fer mentadores da lactose Amoxicilina/Ácido clavulânico 23,9% (16/67) 0% (0/0) Ceftazidima 7,4% (5/68) 6,4% (5/78) Imipenemo 5,7% (6/106) 0% (0/78) Tobramicina 22,5% (20/89) 5,1% (4/78) Ciprofloxacina 10,6% (13/123) 21,8% (17/78) Amoxicilina 63% (53/84) 0% (0/0) Aztreonamo 22,5% (9/40) 78,2% (61/78) Gentamicina 24,8% (28/113) 3,8% (3/78) Tetraciclina 37,1% (13/35) 0% (0/0) Meropenemo 0% (0/79) 1,3% (1/78) No caso do burro selvagem da Mongólia (Equus hemionus) e do burro selvagem tibetano (Equus kiang) existe a dúvida se estes dois animais pertenceram à mesma espécie ou a espécies diferentes. Estudos, no sentido de resolver essa dúvida estão inclusive a ser realizados por investigadores do CIBIO. Independentemente desta situação, eles encontram-se separados por quilómetros de distância e encontram-se a altitudes bastante diferentes. Enquanto E. hemionus se encontra na FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 37 zona do semi-deserto do Gobi, E. kiang encontra-se no Planalto Tibetano entre os 2000 e os 5000 metros de altitude. Esta diferença pode influenciar o facto das bactérias provenientes do kiang apresentarem perfis de suscetibilidade mais elevados e a um maior número de antibióticos. 4.4 Caracterização dos genes de resistência 4.4.1 Caracterização da resistência à tetraciclina 4.4.1.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang Relativamente à resistência à tetraciclina foram pesquisados 3 genes que possivelmente conferem resistência a este antibiótico para todos os isolados previamente identificados como Enterococcus. Os genes tetM e tetO associados a um mecanismo de proteção ribossomal e tetL que codifica para uma bomba de efluxo. Dos 60 isolados resistentes à tetraciclina, 12% possuem o gene tetM, 70% possuem os genes tetM e tetL, 10% possuem o gene tetL e 8% dos isolados é resistente à tetraciclina mas não apresenta nenhum dos genes testados. Os isolados que apresentaram elevada ou intermédia suscetibilidade à tetraciclina, não apresentaram nenhum dos genes testados. Já o gene tetO não foi detetado em nenhum dos isolados testados. Os resultados encontram-se na Tabela 11 e a Figura 5 representa um dos géis obtidos do PCR de pesquisa para genes de resistência à tetraciclina. Tabela 11 - Resultados da pesquisa dos genes de resistência à tetraciclina para as amostras da região de Xinjiang Gene Suscetibilidade ( %) Baixa Intermédia Elevada tetM 12 tetM e tetL 70 tetL 10 tetO --------------- 8 100 100 38 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas Figura 5 - Gel resultante do PCR de pesquisa de genes de resistência à tetraciclina. a – FCH5-2, b – FCH5-3, cFCH19-5, dmarcador 100bp DNA Ladder, e – FCH19-7, f – FCH19-8, g – FCH19-11, h – branco. A partir dos resultados obtidos é possível concluir que a maioria dos isolados possui dois mecanismos de resistência, produzem genes para a produção de proteínas como parte de um mecanismo de proteção ribossomal (tetM) e genes que codificam para bombas de efluxo (tetL). Existem 22% dos isolados que apenas possuem um mecanismo de resistência, os restantes 8% dos isolados resistentes à tetraciclina não apresentam nenhum dos genes testados, podendo apresentar outro mecanismo de resistência como por exemplo a inativação química da tetraciclina codificada pelo gene tetX. 4.4.1.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano Dos isolados resistentes à tetraciclina, 67% possuem o gene tetM e 33% possuem os genes tetM e tetL. Os isolados com elevada ou intermédia suscetibilidade, não apresentaram nenhum dos genes testados. Tal como nos isolados obtidos das amostras de Xinjiang também nos isolados obtidos das amostras de kiang o gene tetO não foi detetado. Os resultados encontram-se na Tabela 12. Tabela 12 - Resultados da pesquisa dos genes de resistência à tetraciclina para as amostras do Planalto Tibetano Gene Suscetibilidade (%) Baixa Intermédia Elevada tetM 67 tetM e tetL 33 tetL tetO --------------- 100 100 tetM – 657pb tet L – 475pb FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 39 No caso das amostras do Planalto Tibetano, a maioria dos isolados apresentam genes de resistência para a produção de proteínas (67%) e os restantes possuem dois mecanismos, produção de proteínas e bombas de efluxo. O gene que mais predomina nos isolados obtidos de ambas as regiões foi o tetM, este resultado vai de encontro aos resultados obtidos em bactérias entéricas dos pinguins da Antártida [25] onde este gene também foi detetado. 4.4.2 Caracterização da resistência aos macrólidos 4.4.2.1 Isolados obtidos das amostras de Xinjiang Todos os isolados identificados como Enterococcus foram testados para a presença de ermA, ermB e ermC. Dos resistentes à eritromicina, 91,1% possuem o gene ermB, 8,9% é resistente mas não apresenta nenhum dos genes testados. No que diz respeito aos isolados com elevada suscetibilidade, 25% apresenta o gene ermB e os restantes 75% não apresentou nenhum dos genes testados. Relativamente aos isolados com suscetibilidade intermédia, 27,3% possuem o gene ermB e os restantes 72,7% não apresenta nenhum dos genes. Os genes ermA e ermC não foram detetados em nenhum dos isolados. Os resultados encontram-se na Tabela 13. Tabela 13 - Resultados da pesquisa de genes de resistência aos macrólidos para as amostras da região de Xinjiang Os resultados obtidos permitem afirmar que dos isolados testados apenas um mecanismo de resistência foi detetado, associado ao gene ermB (alteração do local alvo devido à produção de enzimas), que se verificou fundamentalmente em bactérias resistentes (91,1%), tendo sido também detetado em bactérias com suscetibilidade intermédia (27,3%) e elevada (25%). Alguns dos isolados não apresentaram nenhum dos genes testados podendo apresentar outros genes que não os testados ou outro mecanismo de resistência, como por exemplo, codificar genes para a produção de bombas de efluxo. Gene Suscetibilidade (%) Baixa Intermédia Elevada ermA ermB 91,1 27,3 25 ermC ------------ 8,9 72,7 75 40 FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 4.4.2.2 Isolados obtidos das amostras do Planalto Tibetano Dos 30 isolados identificados como Enterococcus, dos que apresentaram diminuição da suscetibilidade em 33% foi detetado o gene ermB nos restantes 67% não foi detetado nenhum dos genes testados. Relativamente aos isolados com elevada suscetibilidade estes não apresentaram nenhum dos genes. No que diz respeito aos isolados com suscetibilidade intermédia, 12% apresentou o gene ermB e os restantes 88% não apresentaram nenhum dos genes testados. Assim como aconteceu com os isolados provenientes das amostras de Xinjiang também os isolados provenientes das amostras de kiang não foram detetados os genes ermA e ermC em nenhum dos isolados testados. Os resultados encontramse na Tabela 14 e a Figura 6 representa um dos géis obtidos do PCR de pesquisa para genes de resistência à eritromicina. Tabela 14 - Resultados da pesquisa de genes de resistência aos macrólidos para as amostras do Planalto Tibetano Ao contrário do que aconteceu com as amostras de Xinjiang a maioria dos isolados não apresenta nenhum dos genes testados, podendo apresentar outros genes ou mecanismos de resistência. Para os Enterococcus em que foram pesquisados genes de resistência aos macrólidos, quer para isolados provenientes das amostras da região de Xinjiang quer Gene Suscetibilidade (%) Baixa Intermédia Elevada ermA ermB 33 12 ermC --------------- 67 88 100 ermB – 424pb Figura 6 - Gel resultante do PCR de pesquisa de genes de resistência aos macrólidos. a – FCH20-11, b – FCH2012, c – FCH25-9, d – FCH25-12, e – FCH2-13, f – FCH4-1, g – marcador 1kb DNA Ladder, h – FCH4-14, i – FCH4-15, j – FCH6-1, k – FCH6-4, l – FCH6-5, m – branco. FCUP Resistência a antibióticos em bactérias isoladas de animais selvagens de regiões remotas 47 minimal antibiotic exposure. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51:11791184. 12. D’Costa, VM., King, CE., Kalan, L., Morar, M., Sung, WL., Schwarz, C., Froese, D., Zezula, G., Calmels, F., Debruyne R., Golding, GB., Poinar, HN., Wright, GD. 2011. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477:457-460. 13. 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