Caracterização histopalógica e diagnóstico molecular das mutações no gene KRAS em pacientes com carcinoma coloretal metastático: importância para a definição da sensibilidade e especificidade de diferentes técnicas moleculares

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Dissertação de Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular Caracterização histopatológica e diagnóstico molecular das mutações no gene KRAS em pacientes com carcinoma coloretal metastático: Importância para a definição da sensibilidade e especificidade de diferentes técnicas moleculares Maria João Fernandes de Pina Instituição de acolhimento: Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto (IPATIMUP) Orientador: Professor Doutor José Carlos Machado Co-orientador: Mestre Luís Cirnes Porto, 2013 ii iii DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE EM MEDICINA E ONCOLOGIA MOLECULAR APRESENTADA À FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO iv v Agradecimentos Ao longo deste percurso foram muitas as pessoas sem as quais seria impensável tornar possível este trabalho. Em primeiro lugar queria agradecer a oportunidade de realização do Mestrado. À comissão organizadora e à Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, o meu obrigado pela oportunidade e formação de excelência. Agradeço ao meu orientador, Professor Doutor José Carlos Machado, pela possibilidade de desenvolver este projeto, mas também pelo estímulo, conhecimento, disponibilidade, ajuda e apoio científico em todos os momentos que necessitei. Estou manifestamente grata! Expresso a minha gratidão ao meu co-orientador, Mestre Luís Cirnes. Um obrigado muito especial por toda a ajuda e disponibilidade. Não só pelas partilhas de experiências e conhecimentos, como pelo otimismo, motivação e espírito crítico concedidos. Pela confiança depositada, por seres um amigo, um grande obrigado! Agradeço à Doutora Fátima Carneiro e Hospital de São João, pela disponibilidade e acessibilidade às amostras, por todo o contributo que permitiu executar o presente trabalho. Ao Doutor Renê Gerhard, agradeço toda a disponibilidade e contributo indispensáveis para a realização do presente trabalho. Agradeço também à Doutora Catarina Eloy pela disponibilidade e ajuda. A todos os elementos do laboratório de anatomia patológica do IPATIMUP, pela disponibilidade, apoio e contribuição sempre que necessário, um grande obrigado. Um agradecimento há A.Menarini Diagnostics Portugal e à Transgenómica. Em especial agradeço à Daria Franceschi, pela transmissão de conhecimentos, por toda a ajuda e disponibilidade em esclarecer as minhas dúvidas sempre que precisei. Ao Carlos Resende, pela disponibilidade para comigo, pela ajuda e conhecimentos transmitidos. Pela contribuição que também deste a este trabalho, um grande obrigado. A todos os elementos do laboratório de diagnóstico genético do IPATIMUP agradeço a boa amizade, partilha de conhecimentos e boa disposição constantes. Em especial, agradeço à Cheila Ribeiro. Guardarei sempre com carinho a amizade partilhada. Por seres “o meu braço direito”, pelo auxílio, companhia, e disponibilidade sempre presentes, um grande obrigado! Agradeço ainda ao José Luís Costa e à Ana Justino em especial pela ajuda com o Ion Torrent. Não esquecendo todos aqueles que vi passam e passaram pelo laboratório, agradeço a boa disposição e momentos partilhados. Um grande agradecimento à Sara Meireles por toda a disponibilidade e ajuda a qualquer momento, e à Rute Fernandes, por estar sempre disponível, amizade e incentivo. Aos meus colegas de Mestrado com quem partilhei momentos inesquecíveis, pelo companheirismo, amizade e ajuda em todas as etapas deste percurso. Ao Bruno Escudeiro, faltam-me as palavras para descrever o quão grata estou. Pela pessoa magnífica que és. Pelo constante apoio, compreensão, paciência, carinho e bondade. Por acreditares em mim e me dares força para continuar nos momentos mais difíceis. Por me acompanhares. Um grande obrigado por tudo! Por fim, e não menos importante, mas antes pelo contrário, expresso a minha gratidão eterna à minha família, em especial aos meus pais e às minhas irmãs. Por acreditarem em mim e me acompanharem em mais uma etapa da minha vida. Por me apoiarem em tudo. Por todo o carinho e confiança que depositam em mim. A vós deixo o meu profundo agradecimento de uma forma muito especial. A todas as pessoas que contribuíram para a realização deste trabalho deixo aqui um especial agradecimento. vii Índice Geral Agradecimentos ................................................................................................................. v Abreviaturas ..................................................................................................................... xi Resumo ............................................................................................................................ 1 Abstract ............................................................................................................................ 2 1. Introdução .................................................................................................................. 3 1.1. Carcinoma Coloretal ........................................................................................... 3 1.1.1. Carcinogénese do CCR ................................................................................... 4 1.1.2. Tratamento do Carcinoma Coloretal metastático ............................................. 5 1.2. O KRAS e suas vias de sinalização .................................................................... 7 1.3. Mutações no gene KRAS e o CCRm .................................................................. 9 1.4. Análise Mutacional do gene KRAS ....................................................................10 1.4.1. Seleção e avaliação do material para análise molecular: o papel do patologista ................................................................................................................11 1.4.2. Metodologias para deteção de mutações no gene KRAS ...........................13 2. Objetivos...................................................................................................................18 2.1. Objetivos gerais .................................................................................................18 2.2. Objetivos específicos .........................................................................................18 3. Material e Métodos ...................................................................................................19 3.1. Amostragem do estudo ......................................................................................19 3.2. Caracterização Histopatológica .........................................................................19 3.3. Caracterização Molecular ..................................................................................20 3.3.1. Material Biológico para análise molecular ...................................................20 3.3.2. Análise Molecular .......................................................................................20 3.3.2. Sequenciação paralela massiva no PGMTM ................................................23 3.4. Correlação do controlo morfológico com o diagnóstico molecular ......................25 3.5. Análise Estatística dos resultados .....................................................................25 4. Resultados ................................................................................................................26 viii 4.1. Determinação do limite de sensibilidade analítica dos métodos em estudo ....... 26 4.2. Caracterização molecular dos casos em estudo ............................................... 28 4.2.1. Frequência e distribuição mutacional do gene KRAS ................................. 28 4.2.2. Comparação dos resultados da análise molecular entre as metodologias em estudo ................................................................................................................... 29 4.2.3. Correlação das metodologias em estudo com NGS: Classificação de casos não concordantes ..................................................................................................... 31 4.3. Correlação do controlo morfológico com a análise molecular ............................ 33 5. Discussão ................................................................................................................ 36 6. Conclusão ................................................................................................................ 43 7. Referências bibliográficas ........................................................................................ 45 ix Índice de Figuras Figura 1 - Incidência e Mortalidade do cancro a nível mundial por sexo no ano de 2008. . 3 Figura 2Sequência adenoma-carcinoma. ....................................................................... 5 Figura 3 – Papel das mutações no gene KRAS na ativação oncogénica das vias de sinalização intracelulares. ................................................................................................. 8 Figura 4 - Esquema representativo das principais etapas do processo de genotipagem do KRAS utilizando o Surveyor Scan K-RAS Mutation Detection Kit (à esquerda) e respetivo pormenor do modo de atuação da Surveyor Nuclease (à direita).....................................15 Figura 5 – Representação esquemática do workflow de MPS no PGMTM; a. Principais etapas do fluxo de trabalho para MPS no Ion TorrentTM. ..................................................17 Figura 6 – Determinação do limite de deteção (sensibilidade analítica) do método de sequenciação direta de Sanger. ......................................................................................27 Figura 7 – Exemplos de resultados obtidos na análise dos codões 12 e 13 do gene KRAS por sequenciação direta e pelo método Surveyor Scan kit. ..............................................28 Figura 8 – Imagens de cortes histológicos corados por H&E e respetiva avaliação morfológica do conteúdo em células tumorais. ................................................................33 4 pacientes), e no pulmão (em 10% a 20% dos pacientes) (5). Os avanços ao nível do diagnóstico e tratamento têm vindo a aumentar o número de pacientes com cura da doença em fase precoce, através de cirurgia. Contrariamente, o prognóstico para formas avançadas da doença é baixo, com tratamento paliativo para a maioria dos pacientes (6). A elevada incidência deste cancro, em conjunto com a alta taxa de mortalidade, se diagnosticado numa fase tardia da doença, demonstra a necessidade de desenvolvimento de novas formas de diagnóstico, prognóstico e de predição mais eficazes. O maior conhecimento ao nível molecular permitiram conhecer algumas das causas para a iniciação e progressão deste tipo de tumores, revelando também, a complexidade e heterogeneidade desta doença (7). 1.1.1. Carcinogénese do CCR O CCR constitui uma doença cuja progressão neoplásica está associada com a acumulação de alterações, desde, anomalias cromossómicas, modificações epigenéticas e mutações genéticas, que envolvem genes que regulam por exemplo a proliferação, diferenciação, apoptose e angiogénese. A carcinogénese coloretal resulta da ativação de vias neoplásicas distintas e independentes, com características moleculares específicas, nomeadamente, as que conduzem à instabilidade cromossómica (CIN), instabilidade de microssatélites (MSI) ou a metilação aberrante de promotores de genes (especificamente das ilhas CpG1), designados como fenótipos de ilhas CpG metiladas (CIMP) (8, 9). Vogelstein and Fearon, no ano de 1990, propuseram o modelo da carcinogénese coloretal que correlaciona eventos genéticos específicos com a evolução patológica da morfologia do tecido. Em termos histológicos, ao nível das células epiteliais do intestino, as alterações genéticas conduzem, primeiramente, a uma hiperplasia da mucosa que acaba por progredir para adenoma, inicialmente, com baixo grau de displasia. A partir destes adenomas de menores dimensões, uma proporção pode avançar para adenomas com displasia de alto grau, a partir do qual um clone maligno é capaz de evoluir e iniciar a invasão da parede do intestino, como carcinoma (sequência adenoma-carcinoma) (8, 1012). Estas alterações genéticas, necessárias para a iniciação e progressão do tumor no CCR, envolvem inúmeros genes, incluindo a inativação de genes supressores tumorais, como o gene APC (Adenomatous Polyposis Coli) e TP53 (Tumor Protein p53), e a ativação de oncogenes como o KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homologue) (8, 9, 12, 13). 1 Regiões ricas em dinucleótidos de Guanina-Citosina; 5 Mutações no gene APC são um evento precoce da tumorigénese coloretal e são observadas em cerca de 60 a 80% dos adenomas e carcinomas, em oposição ao gene TP53, mutado em aproximadamente 40 a 60% dos tumores, e que aparenta surgir numa fase mais tardia, aquando da transição para carcinoma. As mutações no gene KRAS são observadas em 40 a 50% dos adenomas e carcinomas, ocorrendo maioritariamente, durante os estadios iniciais de crescimento e progressão dos adenomas. Muitas outras alterações genéticas e epigenéticas podem ocorrer durante esta sequência, nomeadamente, ao nível dos genes de reparação do ADN, especificamente nos mismatch repair (MMR) genes, como a aquisição de hipermetilação do promotor do gene MLH1 em 15% dos casos de CCR esporádico, e mutações hereditárias em 2 a 4% nos genes MLH1 e MSH2 no Síndrome de Lynch. A perda cromossómica (18q) contendo os genes SMAD2 e SMAD4, é observada em cerca de 60% dos CCRs (Figura 2) (8). Figura 2Sequência adenoma-carcinoma. A tumorigénese coloretal inicia-se com uma transformação do epitélio normal do intestino em adenomas, progredindo para displasias e subsequente evolução para carcinoma. No decorrer desta sequencia há um acumular de alterações em inúmeros genes, desde mutações génicas (gene APC – 60-80%, TP53 – 40-60% e KRAS – 40-50%), perdas cromossómicas (perda do cromossoma 18q contendo os genes SMAD) e alterações epigenéticas (como a hipermetilação do promotor do MLH1); (adaptado de Brahim, A. et al (2012) (8)). 1.1.2. Tratamento do Carcinoma Coloretal metastático O prognóstico para pacientes com CCR metastático (CCRm) que não realizam tratamento é desfavorável, com um tempo médio de sobrevivência de aproximadamente 6 meses (14). A resseção cirúrgica das metástases pode prolongar o tempo médio de sobrevivência destes pacientes, ou até mesmo curar alguns deles. Apesar dos benefícios da cirurgia, apenas 10 a 20% dos pacientes possuem metástases passíveis de resseção quando diagnosticadas (5, 14). As opções de tratamento para pacientes com CCRm têm sofrido alterações ao longo dos últimos anos. Por várias décadas o tratamento quimioterápico com 5fluorouracilo + leucovorin (5-FU/LV), constituía o tratamento de eleição destes pacientes, com uma taxa de resposta de 20% a 30% e uma sobrevivência global média de 11 a 12 meses. Posteriormente, desde os anos 90, pela introdução de novos agentes citostáticos, 6 tem ocorrido uma melhoria das opções terapêuticas para estes pacientes. Estes novos regimes de combinação do 5-FU com o oxaliplatino (FOLFOX) e irinotecano (FOLFIRI) demonstraram uma melhoria das taxas globais de resposta e do tempo de sobrevivência. Em regimes de primeira linha de quimioterapia incluindo o oxaliplatino ou o irinotecano é observada uma taxa de resposta superior, de 33% a 62% (2, 5, 14). Mais recentemente, o melhor conhecimento e compreensão dos eventos genéticos que estão na base do desenvolvimento, progressão e metástase dos tumores, resultou num impacto significativo ao nível da investigação direcionada para o tratamento de pacientes com cancro. Em particular, o foco no desenvolvimento de terapias dirigidas e na utilização de técnicas moleculares para a identificação dos pacientes com maior probabilidade de resposta a essas mesmas terapias (15). Novos agentes terapêuticos, direcionados para o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e recetor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), demonstraram melhorar o prognóstico dos pacientes com CCRm (14). A terapia com anticorpos monoclonais anti-EGFR, cetuximab (Erbitux®) e panitumumab (Vectibix®), foram aprovados pela European Medicines Agency (EMA) na Europa e pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos, para o tratamento de doentes com CCRm. Contudo, como a grande maioria dos tratamentos para cancro, a terapia com estes agentes está associada com a toxicidade grave, onde apenas uma pequena percentagem (de 10% a 20%) dos pacientes vai beneficiar do tratamento (16-21). A via de sinalização do EGFR encontra-se frequentemente ativada no CCR, e por esse motivo, é extensivamente, investigada como alvo terapêutico em cancro. A sobreexpressão do EGFR, determinada por imunohistoquímica, constituiu inicialmente o critério de seleção para a terapia com inibidores do EGFR, pressupondo que a sensibilidade a estes agentes estava associada a um aumento da expressão da proteína. Contudo, evidências de pacientes com CCRm tratados com anticorpos monoclonais indicaram que este biomarcador pouco se associava com a resposta aos anticorpos antiEGFR. Rapidamente observaram que pacientes com elevada, baixa ou sem a expressão do recetor, possuíam um benefício similar perante a terapia monoclonal, e que por isso, não se verificava correlação entre a expressão aumentada do EGFR no tumor e a resposta à terapia. Tal fato realçou a necessidade e a importância em identificar fatores específicos que permitissem clarificar a determinação dos pacientes que irão beneficiar da terapia (22). Tendo em conta a via de sinalização do EGFR, moléculas efetoras a jusante deste recetor, começaram a ser estudadas como potenciais biomarcadores para a terapia com anticorpos monoclonais. A associação entre mutações específicas e resposta à terapia parece fornece uma clara oportunidade para melhorar as taxas de resposta e redução do 7 tratamento de pacientes com pouca probabilidade de resposta a determinadas drogas (1). O gene KRAS foi dos primeiros a ser estudado. Ensaios clínicos onde a análise ao gene KRAS foi efetuada em amostras de tumor de pacientes com CCRm, tratados com cetuximab ou panitumumab, demonstraram que a eficácia da terapia anti-EGFR estava dependente do estado mutacional deste gene. Em pacientes com o KRAS wild-type (não mutado), verificaram que a adição da terapia monoclonal à quimioterapia com o 5-FU resultava numa melhoria significativa da sobrevivência global e tempo de progressão livre da doença, em comparação com a quimioterapia em isolado. Em contraste, a combinação da quimioterapia e a terapia monoclonal em pacientes com o KRAS mutado não demonstrou benefícios. Estudos posteriores demonstraram, independentemente da terapia, uma sobrevivência global menor em pacientes com o KRAS mutado, comparativamente, a pacientes com KRAS wild-type (13, 23). A análise genética demonstrou assim que a presença de mutações no gene KRAS constitui um marcador preditivo negativo, da não resposta ao panitumumab ou cetuximab, em pacientes com CCRm. O estado mutacional do gene KRAS possui um impacto considerável em decisões terapêuticas em pacientes com CCRm, onde a presença de mutações neste gene, identificam pacientes que não irão beneficiar da terapia monoclonal anti-EGFR (2, 15, 17, 24). 1.2. O KRAS e suas vias de sinalização O gene KRAS localizado no braço curto do cromossoma 12 (locus 12p12.1) codifica para o KRAS. Primeiramente, identificado como um homólogo celular de um gene de transformação do vírus de sarcoma de ratinho (Kristen Rat Sarcoma Viral Oncogene Homologue), constitui um dos membros da família RAS (incluindo KRAS, HRAS e NRAS) de pequenas proteínas de ligação guanosina difosfato/guanosina trifosfato (GDP/GTP) que atuam como transdutores de sinal. O KRAS constitui um componente chave na regulação de vias de sinalização intracelulares através de uma variedade de recetores, incluindo o EGFR. A sua atividade, e consequentemente, a sinalização a jusante, é regulada através de fatores de troca do nucleotídeo guanina (GEFs) e por proteínas ativadoras da guanosina trifosfatase (GAPs) (15, 17). Todas as proteínas RAS são ativadas por ligação à GTP através de GEFs, cuja produção é estimulada pela ativação de recetores de fatores de crescimento, 8 nomeadamente, do EGFR. Quando ocorre a ligação, ou seja, ativação, as proteínas RAS possuem maior afinidade para moléculas efetoras específicas, a maioria das quais iniciam várias cascadas de vias de sinalização intracelular incluindo, a via do Rat sarcoma vírus/Mitogen-activated protein kinase (RAS/MAPK) e a via do Phosphoinositide3-kinase (PI3K/AKT), vias de sinalização importantes na regulação da transcrição génica, proliferação celular, apoptose, angiogénese, invasão e migração. A inativação ocorre quando o RAS-GTP (forma ativa) é hidrolisado a RAS-GDP (forma inativa) por ação da GTPase intrínseca, cuja atividade encontra-se marcadamente aumentada pelas GAPs (15, 17). Em condições fisiológicas normais, os níveis de RAS-GTP são mantidos constantes (pelo equilíbrio entre a atividade das GEFs e das GAPs), fundamental na sinalização do tecido normal no que se relaciona com a proliferação, diferenciação e senescência. A ocorrência de mutações ativantes no KRAS altera esse equilíbrio, o que resulta numa redução marcada da atividade intrínseca da GTPase, tornando-a resistente às GAPs. A ativação constitutiva da proteína conduz à permanente ativação das vias de sinalização a jusante, independentemente dos recetores a montante, como o EGFR, e assim induzir à transformação oncogénica (Figura 3) (15, 17). Figura 3 – Papel das mutações no gene KRAS na ativação oncogénica das vias de sinalização intracelulares. O gene humano KRAS, um dos membros da família RAS, codifica para proteínas de ligação guanosina difosfato/guanosina trifosfato (GDP/GTP) que atuam como transdutores de sinal de vias de sinalização importantes no desenvolvimento e função celular. A ocorrência de mutações somáticas missense, por exemplo, no codão 12 do gene KRAS, resulta em proteínas RAS constitutivamente ativas (RAS-GTP). Em consequência ocorre a ativação oncogénica das vias de sinalização a jusante e resultando num crescimento, proliferação e diferenciação celular anormal; (adaptado de Wang, H. et al. (2010) (15)). 9 1.3. Mutações no gene KRAS e o CCRm De todas a neoplasias humanas, cerca de 15 a 20% contêm mutações nos genes da subfamília RAS. Mutações ativantes do gene KRAS têm sido observadas com uma frequência relativamente elevada numa variedade de tumores humanos, incluindo: o carcinoma coloretal (30-60%), pancreático (60%), do trato biliar (33%), do pulmão (18%), do ovário (17%) e endometrial (15%) (13, 15). Das mutações ativantes no gene KRAS, mais de 90% são detetadas nos codões 12 (82-87%) e 13 (13-18%) do exão 2. Estas mutações são, geralmente, do tipo pontual e observadas como mutações somáticas. Os padrões mais comuns encontram-se descritos na Tabela 1. Também documentadas, mas com uma menor frequência (em menos de 5% dos casos), mutações nos codões 61 (exão 3) e 146 (exão 4) podem ser observadas (1, 17, 19, 25-27) Constituindo um dos genes mais frequentemente mutado na via de sinalização RAS/MAPK, as mutações no gene KRAS são, na maioria dos casos, um evento precoce do desenvolvimento e progressão dos carcinomas coloretais. Aproximadamente 35% a 45% dos pacientes com CCRm apresentam mutações neste gene, comparativamente à frequência de mutações nos genes NRAS e HRAS, muito menor neste tipo de tumores (1% a 3%) (1, 15, 28). As mutações no gene KRAS mais frequentemente observadas no CCR incluem as transições de guanina para adenina e transversões guanina para timidina (1, 19). No codão 12, as mutações p.Gly12Asp e p.Gly12Val, são as mais comuns, e, no codão 13 a substituição de uma glicina por um aspartato (p.Gly13Asp) constitui a mutação mais frequentemente observada (27, 29). Os codões 12 e 13 codificam para dois resíduos de glicina adjacentes localizados na proximidade do local catalítico da proteína RAS. Diferentes mutações resultam numa substituição de diferentes aminoácidos nesses locais catalíticos, e desta forma, resultam em diferentes níveis de redução da atividade intrínseca da GTPase. Como consequência, mutações diferentes no gene KRAS, podem ser responsáveis por diferentes alterações biológicas. Mutações no codão 12 estão frequentemente associadas a um fenótipo mucinoso do CCR, em contraste com as mutações no codão 13, geralmente, relacionadas com carcinoma não mucinoso, mas de maior agressividade e potencial metastático (1). 10 Tabela 1 - Tipo de mutações mais frequentemente observadas nos codões 12 e 13 do exão 2 do gene KRAS. * Adaptado de Vaughn, C. P., et al. (2011) (29); O estado mutacional do gene KRAS possui um impacto considerável na decisão terapêutica de pacientes com CCRm. Desde o ano de 2009 que a Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO – American Society of Clinical Oncology) recomenda que todos os pacientes com CCRm candidatos a terapia monoclonal anti-EGFR devem ser testados para a pesquisa de mutações nos codões 12 e 13 do gene KRAS. Como mencionado anteriormente, a presença de mutações neste gene, identifica pacientes que não irão beneficiar da terapia (21, 24, 30). 1.4. Análise Mutacional do gene KRAS A análise do estado mutacional do gene KRAS constitui um importante fator no encaminhamento terapêutico de pacientes com CCRm. Por outro lado, mutações neste gene podem ser detetadas por inúmeras metodologias, mas todas comportam limitações e que devem ser consideradas. Até à data, não existe uma metodologia standard para a análise molecular do KRAS. É, por isso, urgente a necessidade de serem estabelecidas e implementadas guidelines tanto na prática clínica, como na validação de métodos e definição de procedimentos estandardizados para a deteção de mutações neste gene (17, 18, 25, 31). A Sociedade Europeia de Patologia (ESP - European Society of Pathology) e o Colégio Americano de Patologistas (CAP - College of American Pathologists) propuseram guidelines técnicas para a análise mutacional do gene KRAS. Estas enfatizam o papel do Codão Nucleótido variante Aminoácido variante Frequência (em %) * Cosmic ID 12 c.35G>A p.Gly12Asp 31,4 521 c.35G>T p.Gly12Val 25,3 520 c.34G>T p.Gly12Cys 8,2 516 c.34G>A p.Gly12Ser 6,0 517 c.35G>C p.Gly12Ala 4,7 522 c.34G>C p.Gly12Arg 1,4 518 13 c.38G>A p.Gly13Asp 21,2 532 c.37G>T p.Gly13Cys 0,6 527 11 patologista na seleção das amostras para a análise molecular, seleção da metodologia a utilizar e padronização do relatório de resultados (32). Por outro lado, fatores como a percentagem de células tumorais presentes na amostra e a qualidade geral do tecido colhido e respetivo ADN extraído incluem importantes implicações na precisão e sensibilidade do método utilizado para genotipagem do KRAS e que também devem ser considerados (20, 25). A avaliação através de esquemas externos de avaliação da qualidade (External Quality Assessment - EQA) é um passo fundamental para a validação de testes para uso clínico. Laboratórios que realizem testes para estudo do gene KRAS (bem como outros testes moleculares preditivos com significado clínico) devem ser validados pelos programas de controlo de qualidade. O European Quality Assessment Program para teste do KRAS (KRAS EQA), suportado pela ESP, tem como objetivo avaliar o desempenho do teste molecular, incluindo, a correta identificação da mutação no gene KRAS, a percentagem de células tumorais e a forma de apresentação dos resultados no relatório. Este programa efetua uma avaliação global da qualidade do teste, com o intuito de desenvolver estratégias e procedimentos estandardizados que ajudem a garantir a proficiência e assegurar um ótimo desempenho, interpretação e descrição da análise mutacional do KRAS (17, 25, 33-35). Os testes disponíveis pelo CAP permitem a avaliação periódica do desempenho do laboratório e a promoção da proficiência dos exames efetuados. Testes de proficiência para o estudo mutacional do KRAS encontram-se disponíveis desde o ano de 2009 (36). A subscrição e participação nestes testes de proficiência são uma forma de controlo de qualidade e definição e monitorização de critérios para garantia da qualidade, relacionados com, o turn-around time dos exames, documentação das falhas em testes, tendências no volume de exames e seus resultados (37). 1.4.1. Seleção e avaliação do material para análise molecular: o papel do patologista Os testes de diagnóstico para o estudo do estado mutacional do gene KRAS são realizados na rotina diagnóstica em material tumoral, geralmente, de tecidos fixados em formalina neutra tamponada e incluídos em parafina. A análise molecular pode ser também realizada em ADN extraído de tecidos a fresco em solução preservante (por exemplo RNAlater [Qiagen,California]) ou de tecidos criopreservados. Contudo, tendo em conta um ponto de vista mais prático, pela facilidade de obtenção e preservação por 12 longos períodos de tempo, os blocos de tecido incluídos em parafina constituem as amostras clínicas mais frequentemente utilizadas (20, 24, 25, 27, 38-40). Conforme as guidelines estabelecidas pela National Comprehensive Cancer Network (NCCN) para carcinoma do cólon, a análise mutacional do KRAS pode ser realizada em amostras de tecido tumoral primário ou metastático. Nos casos de doença metastática em pacientes com recorrência, o consenso geral é de que a amostra inicial do tumor primário, obtida no momento da cirurgia de resseção, é apropriada para fornecer resultados informativos e conclusivos. No caso de pacientes com diagnóstico inicial de doença metastática, a análise molecular pode ser efectuada em amostras de tecido metastático. Estas recomendações têm por base o facto de as mutações no gene KRAS ocorrerem numa fase precoce da tumorigénese coloretal, e portanto, ser expectável a sua estabilidade ao longo do desenvolvimento da doença e a concordância entre os tumores primários e metastáticos ser quase total (20, 25, 41, 42). O principal requisito para uma genotipagem conclusiva do KRAS é a capacidade, da metodologia utilizada, em descriminar entre os diferentes alelos mutantes e wild-type. Dependendo do tecido em análise, a quantidade de células tumorais versus células não tumoral é variável e heterogénea. Como consequência a quantidade de ADN mutante relativamente ao ADN wild-type pode variar grandemente. O tecido alvo possuirá sempre células normais presentes no microambiente tumoral (como, linfócitos, macrófagos, células endoteliais e fibroblastos) (25, 43, 44). Por outro lado, o tumor por si só é, uma mistura heterogénea de células tumorais onde é possível que nem todas contenham a mesma mutação. Esta distribuição, não uniforme pode gerar, na análise mutacional de diferentes regiões do tumor, resultados distintos. Dado que a fonte de material é, usualmente, tecido tumoral processado na rotina anatomopatológica, e muitas vezes, sujeito a macrodisseção para aumentar o número de células tumorais em relação ao número de células normais, as principais limitações destes métodos relacionam-se com o reduzido volume de células tumorais e o baixo rácio de células tumorais para células normais das amostras em teste (8, 44, 45). O mínimo de quantidade de células tumorais requeridas, em relação às não tumorais, depende do método utilizado, sendo por isso importante a avaliação pelo patologista, da proporção de tumor no bloco de tecido e em assegurar que esse valor esteja de acordo com os critérios mínimos da técnica selecionada (limite de deteção da metodologia) (17, 25, 37, 45). O patologista possui um papel central na seleção do bloco de tecido mais adequado para o teste molecular. Este é responsável por verificar a presença de tumor no bloco selecionado para extração de ADN, bem como, assegurar que o mesmo possui quantidade suficiente de células tumorais para a análise molecular. A avaliação do conteúdo tumoral deve ser realizada num corte histológico do bloco selecionado corado 13 com hematoxilina – eosina (H&E) (17, 25). Segundo as recomendações do CAP, as amostras devem ser especificamente selecionadas por um patologista, de forma a incluir, predominantemente, células tumorais, excluindo a presença significativa de inflamação e/ou necrose (20, 24). Um importante aspeto observado é a elevada variabilidade na determinação da percentagem de células tumorais em cortes histológicos. A avaliação do conteúdo tumoral constitui um procedimento subjetivo, dependente, da região da amostra selecionada para a análise, bem como, da determinação do rácio entre células tumorais e as células normais. Um estudo EQA envolvendo 13 laboratórios demonstrou existir diferenças com os valores estimados de percentagem de células tumorais entre os diferentes laboratórios. Por exemplo, para várias amostras, observaram-se laboratórios que estimaram 10% a 20% de células tumorais, enquanto outros estimavam para as mesmas amostras, 90% a 100% (uma diferença de 80%) (33). Excluindo a variabilidade na percentagem de células tumorais, em relação ao nível da secção do corte histológico, estas diferenças sugerem que a variabilidade na avaliação entre patologistas constitui o principal fator para estas discrepâncias. Este facto pode ser justificado quando a avaliação do conteúdo tumoral é realizada tendo por base, o cálculo da percentagem da área da amostra que é tumor, em vez, da percentagem de núcleos que estão no tumor, cuja avaliação microscópica é de maior dificuldade, mas esta sim, considerada a forma mais correta para determinação da percentagem de células tumorais (25, 33, 46). 1.4.2. Metodologias para deteção de mutações no gene KRAS Uma grande variedade de métodos estão disponíveis para a deteção de mutações no gene KRAS. Contudo, ainda não é claro, que técnica fornece um melhor desempenho em termos de sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade para a genotipagem do KRAS (16, 17, 33, 47, 48). Hoje em dia, a análise por sequenciação direta de ADN e metodologias com base em Polimerase chain reaction (PCR) constituem os métodos mais frequentemente utilizados para determinar o estado mutacional deste gene (15, 17). A sequenciação direta pelo método de Sanger é descrita como o método goldstandard para a deteção de mutações somáticas em amostras tumorais. Capaz de identificar todas as mutações possíveis num exão (desde substituições de base, pequenas inserções e deleções) esta metodologia possui, no entanto, uma sensibilidade limitada perante um baixo número de células tumorais, particularmente, em amostras de tecido processadas na rotina anatomopatológica (15, 25, 49-51). Uma percentagem de 20 3.3. Caracterização Molecular 3.3.1. Material Biológico para análise molecular O estudo molecular foi realizado em amostras de ADN genómico, extraído a partir de cortes de 10μm de tecidos fixados em formalina tamponada e impregnados em parafina. Após secagem das lâminas em estufa, a 60ºC e durante 30 minutos, realizou-se a sua desparafinação por passagem das lâminas em dois banhos sucessivos de xileno, seguida de duas passagens em etanol absoluto (15 minutos em cada um dos banhos). Posteriormente, foi efectuada a raspagem do material biológico contido na lâmina para um tubo eppendorf estéril com ajuda de um bisturi (estéril). Seguiu-se a purificação e isolamento do ADN através do Invisorb® Spin Tissue Mini kit (Invitek, Berlin), segundo as normas do fabricante. A concentração e grau de pureza do ADN foi avaliada por espectrofotometria de absorção no NanoDrop 2000c Spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington). Até ao momento de análise as amostras de ADN genómico foram armazenadas a -20ºC. Para 5 casos foi necessária uma nova extração de ADN a partir do bloco de tecido de origem. Para estes casos foi também realizado controlo morfológico. Para nenhuma das amostras de todo o estudo foi efectuada macrodisseção no processo de extração. 3.3.2. Análise Molecular A caracterização molecular dos codões 12 e 13 do gene KRAS das amostras em estudo foi efetuada segundo duas diferentes metodologias. Para todos os casos foi realizada a análise molecular por Sequenciação direta pelo método de Sanger e pelo método do SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit, (Transgenomic. Inc., Omaha). 3.3.2.1. Determinação da sensibilidade analítica dos métodos em estudo A determinação do limite de deteção (sensibilidade analítica) da sequenciação direta pelo método de Sanger foi realizada por análise de amostras celulares contendo percentagens distintas de células com o KRAS wild-type (linha celular GP202) e células 21 com o KRAS mutado (linha celular AGS), contendo a mutação c.35 G>A (p.Gly12Asp) em heterozigotia. As linhas celulares GP202 e AGS foram mantidas em cultura em meio RPMI (Life Technologies, Carlsbad), suplementado com soro fetal bovino a 10% (PAA, Austria), 100 IU/mL de penicilina e 100 µg/Ml de streptomicina (Life Technologies, Carlsbad), numa estufa com atmosfera controlada (5% de CO2 e a 37ºC). As células cresceram até um grau de confluência de 80 – 90%, e após tratamento com tripsina foi efectuada contagem de células em câmara de Neubauer para cada uma das linhas. De acordo com o número total de células de ambas as linhas celulares, foi efetuada a mistura de células tendo em conta um número final de um milhão de células. Foram feitas diferentes misturas, de forma a obter suspensões celulares contendo a mutação no gene KRAS (células da linha celular AGS) nas seguintes percentagens: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 50% e 100%. Das suspensões celulares obtidas foram realizados cell-blocks utilizando HistoGel™ (Richard Allan Scientific, Kalamazoo), e posterior processamento histológico na rotina anatomopatológica. A partir deste momento, estas amostras foram processadas exatamente da mesma forma, que as amostras de rotina para análise de mutações no gene KRAS. Após a sequenciação direta, a análise das sequências obtidas, foi efectuada através do software de análise Mutation Surveyor 3.24 (Softgenetics, Pennsylvania) e o limite de deteção determinado. Para o método SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit, foi utilizado como limite de sensibilidade analítica o referido pelo próprio fabricante. 3.3.2.2. Sequenciação direta pelo método de Sanger A sequenciação automática pelo método de Sanger foi efetuada após reação de amplificação utilizando a Qiagen® Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden). A amplificação dos codões 12 e 13 (exão 2) do gene KRAS foi efectuada utilizando o seguinte par de primers: primer foward 5’ -GGTACTGGTGGAGTATTTGATAGTG -3’ e primer reverse 5’ - TGGATCATATTCGTCCACAAAA-3’, resultando num produto final de 197 pares de base (pb). Os primers foram desenhados com auxílio do programa informático Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). A reação decorreu no termociclador MyCyclerTM Thermal Cycler (BIO-RAD, Hercules) e segundo as seguintes condições (Tabela 2): 22 Tabela 2 – Condições para a reação de PCR *Touchdown – descida a cada ciclo de 1ºC na temperatura de annealing Todas as reações de amplificação incluíram um controlo negativo para controlo de contaminação por ADN exógeno. Após electroforese horizontal em gel de agarose das reações de PCR, para confirmação de amplificação, os produtos foram purificados utilizando uma mistura de enzimas, FastAP™ Thermosensitive Alkaline Phosphatase e Exonuclease I (Thermo Scientific, Wilmington), seguindo as indicações do fabricante. Para a reação de sequenciação, foi utilizado BigDye® Terminator Cycle v3.1 (Applied Biosystems, Foster City). Para a reação de sequenciação utilizou-se Bigdye a 2,5x, tampão para uma concentração final a 1x e primer (foward) a 10 mM, para um volume final de 5µl. A reação decorreu segundo as condições descritas na seguinte tabela 3. Tabela 3 – Condições para a reação de sequenciação. Reagentes Volume (µl) Bigdye 2,5X 0,4 Distilled H2O DNAse/RNAse free 2,2 Buffer Bigdye 1X 0,5 10X Primer Forward (10 µM) 0,4 Produto amplificado digerido 1,5 Volume final 5 Sucedeu-se a purificação por Filtração em gel com Sephadex® G-50 Fine (GE Healthcare, Uppsala) e desnaturação em formamida dos produtos de sequenciação. A sequenciação direta foi realizada no ABI PRISM® 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City) de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante, e os eletroferogramas obtidos foram analisados através do software de análise Mutation Surveyor 3.24 (Softgenetics, Pennsylvania). Para os casos em que houve necessidade de repetição, por falha na sequenciação ou por dificuldade na interpretação, foi realizada sequenciação bidirecional. Reagentes Volume (µl) 2X Qiagen Multiplex PCR Master Mix 7,5 Distilled H2O DNAse/RNAse free 3,5 5X Q-Solution 1 10X Primer Forward (10 µM) 1 10X Primer Reverse (10 µM) 1 ADN (50-100 ng/µl) 1 Volume final 15 Etapa Temperatura Tempo Nº de ciclos Desnaturação Inicial 95º C 15’ 1 Desnaturação 95º C 30’’ Annealing 65-60º C* 45’’ 8 Extensão 72º C 1’ Desnaturação 95º C 30’’ Annealing 56º C 45’’ 35 Extensão 72º C 1’ Extensão Final 72º C 10’ 1 Etapa Temperatura Tempo Nº de ciclos Desnaturação Inicial 95º C 2’ 1 Desnaturação 95º C 15’’ Annealing 55º C 20’’ 35 Extensão 60º C 2’ Extensão Final 60º C 10’ 1 23 3.3.2.3. Surveyor® Scan Kras Mutation Detection Kit O SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit, (Transgenomic. Inc., Omaha) foi efetuado de acordo com as condições descritas pelo fabricante (57, 61). A análise mutacional do exão 2 do gene KRAS incluiu 3 passos principais: 1. Reação de amplificação do ADN mutante e ADN wild-type, e hibridização e formação de homoduplexos e heteroduplexos. Para cada reação são incluídos controlos positivos, de ADN de plasmídeo (controlo wild-type para exão 2, controlo mutado positivo para codão 12 e controlo mutado positivo para codão 13), de forma a assegurar que os reagentes se encontram nas condições adequadas para utilização. É também incluído, por cada reação um controlo negativo para exclusão de contaminação com ADN exógeno. Após a reação de amplificação, é avaliada a eficácia por electroforese horizontal em gel de agarose a 2% dos produtos amplificados. 2. Digestão enzimática da mistura de homoduplexos/heteroduplexos (produtos amplificados) com a SURVEYOR Nuclease. Os heteroduplexos sofrem digestão pela endonuclease, que reconhece os locais de mismatch, formando fragmentos de ADN. 3. Análise dos fragmentos de ADN no WAVE MCE System através do WAVE MCE Control Software. Por separação eletroforética capilar em microchip, os fragmentos de ADN formados por digestão, vão possuir diferentes tempos de migração, que correspondem ao tamanho desses fragmentos e, desta forma, à localização do(s) local(ais) de mismatch. A análise dos resultados obtidos, incluindo o eletroferograma e “gel virtual”, foi realizada através do WAVE MCE Viewer Software. 3.3.2. Sequenciação paralela massiva no PGMTM Para os casos discrepantes entre as duas metodologias anteriores, foi realizada MPS no PGM™. Foram incluídos 29 casos no total: 5 correspondentes a casos não concordantes entre as metodogias em comparação, 4 casos contendo a mutação e 20 casos com genótipo wild-type para o KRAS também por ambas as metodologias em estudo. O fluxo de trabalho para MPS no PGM™ foi realizado segundo as condições descritas pelo fabricante, incluindo, de forma sucinta, as seguintes etapas: 24 Preparação da biblioteca de fragmentos: A preparação da biblioteca iniciou-se com a amplificação do codão 12 e 13 do gene KRAS por PCR, segundo as mesmas condições descritas anteriormente para a realização de sequenciação direta pelo método de Sanger (ver tópico “3.3.2.1 – Sequenciação Direta pelo método de Sanger”). Posteriormente, foi realizado de acordo com o protocolo Preparing Short Amplicon (<350bp) Libraries Using the Ion Plus Fragment Library Kit, PN MAN0006846, Rev.3.0 (Life Technologies, Carlsbad). Os produtos amplificados foram purificados utilizando Agencourt® AMPure® XP Reagent (Beckman Coulter IZASA, Carnaxide) e após quantificação e normalização das suas concentrações para um valor equimolar foram sujeitas a uma digestão enzimática com enzimas de end-repair, utilizando o Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit, PN 4471252 (Life Technologies, Carlsbad). De seguida, e para ser possível a junção de diferentes amostras num mesmo chip de sequenciação, a estratégia de DNA Barcoding foi utilizada (Xpress™ Barcode Adapters 1–16, PN 4471250 e Xpress™ Barcode Adapters 17–32, PN 4474009 [Life Technologies, Carlsbad]). Esta estratégia consiste na ligação de adaptadores específicos (pequenas sequências específicas de oligonucleótidos) aos fragmentos de cada amostra em análise. Após nova purificação e quantificação utilizando o Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad), efetuou-se a junção das diferentes amostras em proporções equimolares numa mesma pool. Seguiu-se a amplificação da biblioteca e cálculo da molaridade da mesma para determinação do fator de diluição da biblioteca necessário para a preparação do template. Preparação da template: De acordo com o fator de diluição determinado foi efetuada a diluição da biblioteca, e seguido o protocolo do Ion PGM ™ Template OT2 400 Kit, PN MAN0007218, Rev. 2.0 (Life Technologies, Carlsbad). Realização de uma amplificação clonal dos fragmentos de ADN através de PCR de emulsão (emPCR), no Ion OneTouch 2, do qual resultam micro-esferas (Ion Sphere™ Particles – ISPs) revestidas por fragmentos de ADN. Após emPCR efetuou-se o enriquecimento das ISPs positivas4 no Ion OneTouch™ES utilizando Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1 (Life Technologies, Carlsbad). MPS no PGM™ e análise bioinformática dos resultados: A sequenciação das enrichedISP foi realizada no PGM™ System, utilizando um Ion 314™ Chip v2 e segundo o protocolo Ion PGM ™ Sequencing 400 Kit PN MAN0007242, Rev. 2.0 (Life Technologies, 4 ISPs positivas correspondem às ISPs que resultam de uma reação de emPCR bem sucedida, ou seja, as micro-esferas que após amplificação clonal ficam revestidas por cadeias de ADN template; 25 Carlsbad). Os resultados obtidos são transmitidos a partir do PGM™ System para o Torrent Server e a análise bioinformática dos dados efetuada utilizando os plug-ins: Variant Caller (para identificação das variantes presentes) e o Amplicon Coverage (quantificar o nível de cobertura dos amplicons). Os settings de análise utilizados foram os pré-definidos para a análise de alterações somáticas. Para a interpretação dos resultados só foram consideradas variantes para uma percentagem alélica superior a 1%. 3.4. Correlação do controlo morfológico com o diagnóstico molecular A correlação entre a análise histopatológica efetuada pelo patologista e o resultado obtido na análise molecular foi realizada por comparação das percentagens do conteúdo de células tumorais estimadas pelo avaliador e o resultado molecular pelas diferentes metodologias. Inicialmente, foi efetuado o cálculo das sensibilidades e especificidades dos métodos em estudo sem ter em conta o controlo morfológico. Numa segunda fase, tendo em consideração os limites de sensibilidade analítica das metodologias em estudo e a avaliação microscópica do conteúdo tumoral, foi realizado um novo cálculo das sensibilidades e especificidades dos métodos em estudo e analisadas as diferenças obtidas em relação aos cálculos realizados previamente. 3.5. Análise Estatística dos resultados A análise estatística dos resultados das diferenças nas frequências mutacionais e discrepâncias observadas entre as diferentes metodologias foi realizada através do software de análise Statview 5.0 (SAS Institute Inc., USA). Para cálculo de sensibilidades e especificidades foi utilizada a folha de cálculo Diagnostic Test Calculator (http://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php). 26 4. Resultados 4.1. Determinação do limite de sensibilidade analítica dos métodos em estudo A determinação da sensibilidade analítica (limite de deteção) foi apenas realizado para o método de sequenciação direta de Sanger. Para o método de SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit o limite de deteção utilizado foi o determinado pelo próprio fabricante (limite de deteção de 5% de células tumorais, o que corresponderá a cerca de 2,5% de alelos mutados em heterozigota). A determinação do limite de deteção da sequenciação direta foi efetuado utilizando ADN extraído a partir de citoblocos contendo uma mistura de células da linhagem AGS, contendo a mutação c.35 G>A (p.Gly12Asp) em heterozigotia, e células wild-type da linha celular GP202, em percentagens celulares que variaram dos 5% aos 100%. Com o método de sequenciação direta, a mutação no gene KRAS foi detetada a partir de uma percentagem de ADN mutado de 15% de células tumorais, onde um pequeno pico de fluorescência de baixa intensidade para a mutação é já visível. Abaixo deste valor (de 15% células tumorais) a mutação não é identificada. Por sua vez, para percentagens progressivamente superiores de células AGS mutadas, a mutação é também, conjuntamente, mais nítida (Figura 6). De acordo com os eletroferogramas obtidos, foi definido como limite de deteção da metodologia a presença de pelo menos 20% de células tumorais, de forma a garantir, uma deteção reprodutível dos alelos mutados no background de alelos wild-type (corresponderá a uma capacidade de deteção de cerca de 10% de alelos mutados se mutação em heterozigotia). 27 GP2O2 (KRAS WT) AGS (KRAS MUT) Eletroferograma 100% 0% 95% 5% 90% 10% 85% 15% 80% 20% 75% 25% 70% 30% 50% 50% 0% 100% WT – wild-type; MUT – mutado; Figura 6 – Determinação do limite de deteção (sensibilidade analítica) do método de sequenciação direta de Sanger. Segundo os resultados obtidos da sequenciação das suspensões celulares contendo diferentes percentagens de células tumorais com a mutação no gene KRAS (p.Gly12Asp) é possível observar que a partir de uma percentagem de 15% de células tumorais a presença de um pico de fluorescência correspondente à mutação (seta). Para percentagens superiores de células AGS a mutação é progressivamente mais nítida. Para valores inferiores (0%, 5% e 10%), a mutação no gene KRAS não é detetada; 28 4.2. Caracterização molecular dos casos em estudo A análise mutacional dos codões 12 e 13 do gene KRAS foi possível nas 111 amostras de tumor em estudo pelo método de sequenciação direta segundo Sanger. Em 8 casos não foi possível efetuar a análise molecular pelo método do SURVEYOR Scan KRAS Mutation Detection Kit (103 casos no total). Exemplos dos resultados obtidos para ambas as metodologias em estudo estão apresentados na Figura 7. Figura 7 – Exemplos de resultados obtidos na análise dos codões 12 e 13 do gene KRAS por sequenciação direta e pelo método Surveyor Scan kit. À esquerda, eletroferogramas obtidos por sequenciação direta: (a.) sequência wild-type (sem mutação); (b.) sequência com a mutação p.Gly12Val no codão 12; (c.) sequência com a mutação p.Gly13Asp no codão 13. Locais de mutação indicados com seta preta; À direita, resultados da análise de fragmentos pelo Surveyor Scan kit: (d.) resultado negativo para mutação; (e.) resultado positivo para mutação. Setas azuis indicam fragmentos wild-type que não sofreram digestão e setas verdes correspondem ao produto de digestão dos fragmentos contendo mutação para o gene KRAS. 4.2.1. Frequência e distribuição mutacional do gene KRAS Das 111 amostras analisadas por sequenciação direta, 59 casos (53,2%) foram consideradas wild-type e 52 (46,8%) mutados (Tabela 4). Através do SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit, foram identificados 51 casos wild-type (49,5%) e 52 (50,5%) reportados como positivos para a mutação neste gene (Tabela 5). Para o método de sequenciação direta, do total das mutações observadas no exão 2 no gene KRAS foram mais frequentes a mutações no codão 12 que as mutações ao nível do codão 13 (80,8% versus 19,2%, respetivamente). As mutações p.Gly12Val e p.Gly12Asp foram as mais frequentes no codão 12 com 17,1% e 15,3%, respetivamente, a. d. b. c. e. 29 seguidas das mutações p.Gly12Ser (2,7%) e p.Gly12Cys (1,8%). No total de amostras analisadas, apenas um caso envolvendo o codão 12 com a mutação p.Gly12Ala (0,9%) foi reportado. A mutação p.Gly12Arg não foi encontrada em nenhum caso neste estudo por sequenciação direta. No codão 13, predominou a substituição p.Gly13Asp, observada em 9 casos (8,1%), com apenas um caso contendo a mutação p.Gly13Cys (Tabela 4). Tabela 4 – Frequência mutacional do gene KRAS segundo o método de sequenciação direta segundo Sanger para as 111 amostras em estudo; Estado mutacional do KRAS Nº de Casos % Wild-type 59 53,2 Mutado 52 46,8 Mutação no codão 12 p.Gly12Val 19 17,1 p.Gly12Asp 17 15,3 p.Gly12Ser 3 2,7 p.Gly12Cys 2 1,8 p.Gly12Ala 1 0,9 p.Gly12Arg 0 - Mutação no codão 13 p.Gly13Asp 9 8,1 p.Gly13Cys 1 0,9 Tabela 5 - Frequência mutacional do gene KRAS segundo o método SURVEYOR Scan K-RAS Mutation Detection Kit para as 103 amostras em estudo; Estado mutacional do KRAS Nº de Casos % Wild-type 51 49,5 Mutado 52 50,5 4.2.2. Comparação dos resultados da análise molecular entre as metodologias em estudo Avaliando os resultados obtidos pelo método de sequenciação direta segundo Sanger e pelo kit comercial Surveyor Scan, foi obtida uma concordância de 95,1% (98/103) entre as metodologias e foram identificados 5 casos (4,9%) com resultados discrepantes (Tabela 6). 36 5. Discussão A deteção de mutações somáticas no gene KRAS tem atualmente um importante impacto a nível clínico pelo seu valor preditivo na terapia com anticorpos monoclonais anti-EGFR (Cetuximab e Panitumumab) em pacientes com CCRm. As mutações no KRAS podem ser detetadas por muitas metodologias, não existindo uma técnica goldstandard para a análise mutacional deste gene que se utilize como referência. É importante a realização de estudos de comparação sistemática da sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade de diferentes técnicas moleculares para a genotipagem do KRAS, bem como, conhecer e compreender o impacto que a amostra em estudo pode possuir na análise, nomeadamente, no que se relaciona com o seu conteúdo tumoral. O presente estudo teve como objetivo avaliar a importância da caraterização histopatológica na definição da sensibilidade e especificidade de diferentes técnicas moleculares no diagnósico molecular das mutações no gene KRAS em pacientes com CCRm. O estudo incluiu a análise molecular de 111 amostras de tumores coloretais metastáticos, para as quais foi efetuada a caracterização molecular por sequenciação direta pelo método de Sanger e através do método Surveyor Scan KRAS Mutation detection kit. Do total de amostras em estudo, não foi possível efetuar a análise molecular em 8 amostras pelo Surveyor Scan kit. Este fato pode ser justificado pelas amostras em questão possuírem ADN de menor qualidade. A possível fragmentação do ADN por fixação em formalina e/ou degradação desde o momento da extração (ano 2009 e 2010) pode reduzir as taxas de sucesso da reação de PCR. Por outro lado, segundo este kit comercial, é necessária uma concentração do produto amplificado igual ou superior a 20 ng/µl para gerar resultados possíveis de análise. Neste sentido, apesar de ser possível a amplificação na maioria das amostras, os produtos de amplificação apresentando concentrações inferiores aos 20 ng/µl, não são passíveis de análise pelo Surveyor Scan kit. Em contrapartida, para o método de sequenciação direta, a obtenção de produtos amplificados com concentrações menores são, em princípio, suficientes para a análise molecular por esta metodologia, sugerindo, por isso, ser um método menos dependente da qualidade geral do ADN extraído. Do total de amostras analisadas no presente trabalho, as frequências mutacionais obtidas para o exão 2 do gene KRAS demonstraram encontrar-se um pouco acima dos valores descritos na literatura. Foi obtida uma percentagem de casos positivos de 46,8% pelo método de sequenciação direta segundo Sanger e de 50,5% pelo método Surveyor 37 Scan kit. Estudos envolvendo uma amostragem superior seriam necessários para uma aproximação aos valores descritos na literatura. Por outro lado, segundo o método de sequenciação direta, a presença de mutações no codão 12 (80,8%) demonstrou ser superior, que no codão 13 (19,2%) o que está em consonância com a literatura. As mutações p.Gly12Val, p.Gly12Asp e p.Gly13Asp foram, por sua vez, as mais frequentemente observadas, o que também está em concordância com o já descrito (1, 19). No presente trabalho foi avaliada a sensibilidade analítica do método de sequenciação direta de Sanger, comparando o desempenho deste método com o kit comercial Surveyor Scan. A análise comparativa dos resultados entre as duas metodologias demonstrou uma concordância de 95,1% (98/103) com 4,9% de casos discrepantes (5/103). Em termos de sensibilidade, a sequenciação direta surge como o método menos sensível (sensibilidade de 89,66%) em comparação com o Surveyor Scan kit (sensibilidade de 94,55%), que demonstrou um desempenho relativamente superior à sequenciação direta (uma exatidão de 97,10% versus 94,60%, respetivamente). Ambas as metodologias apresentaram uma especificidade de 100%. Tendo em conta as discrepâncias obtidas, de forma a classificar os casos com resultado não concordante, foi realizada MPS no PGM™. Os resultados obtidos confirmaram a mutação em 4 casos classificados como falsos negativos por sequenciação direta e um falso negativo por Surveyor Scan kit. A presença de dois falsos negativos (caso 2 e 3) por sequenciação direta relaciona-se com a percentagem de células tumorais, abaixo do limite de deteção da metodologia (valores de 5% e 10% de células tumorais). Na verdade, a sequenciação direta pelo método de Sanger permanece como a metodologia gold-standard para a análise de mutações somáticas em amostras tumorais, mas que se caracteriza por uma sensibilidade inferior, especialmente, para amostras com baixo conteúdo tumoral. Um dos objetivos do presente estudo, incluiu a definição dos limites de sensibilidade analítica. Como apresentado na Figura 6 estabeleceu-se um limite de 20% de células tumorais como nível de sensibilidade analítica para a sequenciação direta de Sanger, capaz de detetar cerca de 10% de alelos mutados com mutação em heterozigotia, e cujo valor é corroborado pela literatura (1, 23, 26, 31, 52, 53). Em oposição, os restantes dois casos classificados como falsos negativos por sequenciação direta segundo Sanger (caso 4 e 5), apresentaram uma percentagem de células tumorais elevada (50% e 60%, respetivamente), e por isso, dentro do limite de sensibilidade analítica do método. Os resultados obtidos por NGS demonstraram porém, que a mutação identificada encontra-se numa percentagem alélica baixa, de aproximadamente 7% para ambos os casos, um valor que está abaixo do limite de 38 deteção do método de sequenciação direta, mas dentro dos valores de sensibilidade analítica estabelecidos para o Surveyor Scan kit. É de realçar que a análise molecular de uma amostra tumoral é limitada não só pela heterogeneidade celular, mas também pela heterogeneidade molecular, ou seja, a existência de subclones contendo diferentes genótipos. A heterogeneidade entre as células tumorais (com e sem mutação), aliada ao fato de todas as amostras em estudo possuírem alguma percentagem de células do estroma normal, pode resultar numa relativamente baixa percentagem de alelos mutados em algumas das amostras em estudo, mascarando a deteção das mutações. A avaliação histopatológica é uma estimativa do conteúdo de células tumorais, mas não preditiva da frequência de alelos mutados (43). E o que pode justificar a diferença observada entre a percentagem de células tumorais estimada na avaliação microscópica e a percentagem alélica obtida por NGS, particularmente, evidenciada no caso 1, 4 e 5. Existem dois desafios importantes para uma análise concludente do gene KRAS em tecido coloretal: a heterogeneidade da amostra em estudo e as diferenças nos limites de deteção para mutações distintas (17, 54). O método de Surveyor Scan kit apresentou, do total de 5 casos com resultado discrepante entre as duas metodologias em estudo, apenas um caso discordante com os resultados de NGS (caso 1). O único caso classificado como falso negativo por esta metodologia, positivo por sequenciação direta, e avaliado com 50% de células tumorais, confirmou por NGS a presença da mutação em causa com 5,3% de alelos mutados. Um fator importante, e já mencionado, é a importância da qualidade geral do ADN extraído, ao nível da precisão e sensibilidade do método utilizado para genotipagem do KRAS (20, 25). A qualidade do ADN da amostra em causa não era ótima. A sensibilidade de uma metodologia com base em PCR é dependente das condições físico-químicas da reação, da concentração e natureza do ADN alvo e dos primers selecionados. Uma justificação para a obtenção deste resultado falso negativo, inclui as diferenças na eficiência das reações de amplificação, que podem conduzir a um enviesamento, onde uma cadeia wild-type, que é copiada nos primeiros ciclos da reação de PCR, conduz a que a mesma seja, preferencialmente, amplificada, e consequentemente, “disfarçando” a mutação. Por outro lado, a análise microscópica avaliou este caso com uma percentagem de células tumorais, acima do limite de deteção de ambos os métodos. A necessidade de repetição e confirmação deste resultado pelo método comercial é um passo a seguir. Contudo, ainda não foi possível esclarecer até ao momento este resultado. A análise por NGS demonstrou ainda a presença de dois casos com resultado wild-type por ambas as metodologias em estudo, e por isso dados como falsos negativos (caso 6 e 7). Segundo o controlo morfológico da percentagem de células tumorais, estes casos apresentam valores diminutos, de menos de 5% (caso 6) e 10% (caso 7) de 39 células tumorais. O caso 6 está abaixo do limite de deteção de ambas as metodologias, e o caso 7 encontra-se dentro do limite de deteção apenas para o método comercial Surveyor Scan kit. Por NGS as mutações foram observadas com uma percentagem alélica de 2,5% para ambos os casos. Neste sentido, é possível verificar que a presença destes dois falsos negativos ocorreu devido aos alelos mutados se encontrarem numa percentagem abaixo do nível de deteção do método de sequenciação direta e, por sua vez, no limite mínimo de deteção do método de Surveyor Scan kit, que falhou na sua deteção. Este ponto reforça que mesmo seguindo os critérios de seleção tendo em conta o controlo morfológico, e conciliando com a técnica molecular e o seu limite de sensibilidade analítica, existem casos que mesmo assim podem passar como falsos negativos. A utilização de NGS é um exemplo de uma metodologia capaz de detetar mutações em percentagens alélicas ínfimas e que quantifica os alelos mutantes presentes num background de alelos wild-type. Contudo, a sua aplicabilidade a nível diagnóstico na deteção de mutações somáticas carece de validação, crucial em laboratórios acreditados. Inúmeros desafios, particularmente, no que se relaciona com a análise e interpretação dos dados, têm que ser ultrapassados (58). Por outro lado, as mutações identificadas por NGS e cujas frequências são muito baixas não podem ser confirmadas com sequenciação direta segundo Sanger devido às limitações de sensibilidade (62). A presença de frequências tão baixas de alelos mutados no gene KRAS em tumores classificados como KRAS wild-type pelas técnicas de rotina, pode condicionar a resposta à terapia anti-EGFR. De fato, o tratamento pode favorecer a que um subclone contendo mutação no gene KRAS em reduzida percentagem alélica, possa ser selecionado positivamente, determinando a posterior resistência à terapia observada nestes pacientes (45, 53). Apesar da elevada sensibilidade das novas técnicas de sequenciação em detetar esses subclones latentes pode, por sua vez, haver a exclusão de pacientes que até iriam beneficiar da terapia. Seria por isso, importante avaliar a resposta destes pacientes, negativos por sequenciação direta, à terapia monoclonal antiEGFR. Por outro lado, numa rotina de diagnósticos, deve ser tido em conta, que para a deteção de mutações no gene KRAS, as amostras são, na maioria dos casos, tecidos processados na rotina anatomopatológica, e por isso, a quantidade de células normais mascara a componente tumoral do tecido em análise. O papel do patologista, na seleção da amostra tumoral e na avaliação da percentagem de células tumorais, é fundamental, para garantir que existem células tumorais suficientes para a análise molecular (dentro do limite de sensibilidade analítica da metodologia selecionada). Uma forma de promover um aumento da sensibilidade é através da macrodisseção, ou seja, aumentando o número de células tumorais em relação ao número de células circundantes do estroma normais no 40 ADN genómico extraído. O patologista surge mais uma vez, como um elemento fulcral na identificação das amostras que necessitam de macrodisseção, e assim, garantir que se encontram dentro do limite de deteção da técnica selecionada. A realização de macrodisseção para casos contendo uma baixa percentagem de células tumorais é hoje em dia um procedimento de rotina, promovendo um aumento do conteúdo tumoral no material em análise, e assim aumentar a capacidade de deteção da mutação se presente. Um dos objetivos do presente trabalho, englobou a análise microscópica do conteúdo em células tumorais das amostras em estudo, e possível em 61 casos. Em nenhuma das amostras estudadas foi realizada macrodisseção aquando da extração. No exemplo apresentado na Figura 8A, de um caso avaliado com 10% de células tumorais (caso 2), as zonas de tumor surgem em focos isolados, de pequenas dimensões, rodeados de estroma com células normais. A macrodisseção manual neste caso teria promovido um aumento do ADN tumoral no total de ADN genómico extraído, podendo ter aumentado a capacidade de deteção da mutação pelo método de sequenciação direta (metodologia onde falhou a deteção). Contudo, a não realização deste procedimento conduziu a que no total de ADN genómico extraído, o ADN tumoral ficasse diluído no ADN normal das células do estroma envolvente, e que competem entre si na reação de amplificação (63, 64). A macrodisseção surge como um procedimento importante para diminuir esse efeito. Tal facto também se reproduz para o caso 5 (Figura 8B) mesmo tendo em conta a maior proporção de células tumorais versus células normais do estroma circundante, que segundo o controlo morfológico se encontram em proporções quase equivalentes. É de referir ainda, apesar de incluir um ponto não aprofundado no presente trabalho, mas cuja importância é conhecida, a variabilidade que pode ocorrer na forma de avaliação entre diferentes patologistas, e o que revela as deficiências persistentes na padronização das avaliações anatomopatológicas. Apenas o CAP, estabeleceu recomendações gerais que comtemplam que as amostras tumorais para análise molecular devem ser especificamente selecionadas por um patologista, incluindo, predominantemente, células tumorais, e excluindo a presença significativa de inflamação e/ou necrose (20, 24). Fatores estes que podem diminuir a sensibilidade da técnica molecular, mesmo quando metodologias com uma sensibilidade analítica superior são utilizadas. Por exemplo, na Figura 8B, é evidente a presença de um algum infiltrado inflamatório a rodear as zonas contendo tumor e alguma necrose. Para este caso específico (caso 5), e como já discutido, os resultados moleculares obtidos foram discordantes entre as metodologias em estudo, falhando a deteção da mutação por sequenciação direta. Angulo, B., et al. demonstraram que parâmetros morfológicos como a presença de infiltrado inflamatório e conteúdo mucinoso, afetam a deteção das 41 mutações por diferentes metodologias, com diferentes limites de sensibilidade analítica (incluindo a sequenciação direta segundo Sanger) (65). Neste sentido, a realização de estudos posteriores, avaliando o real impacto destes parâmetros histológicos ao nível dos resultados moleculares é importante, especialmente, no sentido de padronizar a forma de avaliação e seleção da amostra para estudo molecular. Uma segunda fase do trabalho teve como objetivo a correlação dos resultados do controlo morfológico e os resultados moleculares obtidos. Tendo em conta os resultados da análise molecular e limites de sensibilidade analítica das metodologias em estudo, e correlacionando com os valores das percentagens do conteúdo de células tumorais estimadas pelo patologista, verifica-se que a mutação apenas é detetada de forma reprodutível caso a percentagem de células tumorais da amostra em análise esteja dentro dos limites de sensibilidade analítica do método molecular selecionado. Neste sentido, a realização de um controlo morfológico, numa fase inicial, poderia ter evitado a obtenção de alguns falsos negativos, nomeadamente, por sequenciação direta (método com menor sensibilidade) uma vez que foram consideradas amostras que não eram adequadas para a análise. Estes resultados foram evidentes quando se recalcularam as sensibilidades e especificidades das metodologias em estudo, excluindo todos os casos que não cumpriam os critérios morfológicos (percentagem de células tumorais abaixo do limite de sensibilidade da metodologia). Da reanálise as metodologias demonstraram um desempenho semelhante. Foi obtido um aumento da sensibilidade, para ambos os métodos que apresentaram um valor idêntico, de aproximadamente 96%, e mantendo a especificidade de 100% em ambos. Consequentemente, ambas as metodologias surgem com um exatidão também aumentada, de cerca de 98%. Estes resultados demonstram que a sensibilidade do método de sequenciação direta, bem como, para o método do Surveyor Scan Kit, pode ser aumentada, desde que associado a uma caracterização histopatológica do conteúdo de células tumorais da amostra em análise. Na verdade, estes resultados realçam a importância da seleção e avaliação da amostra para o estudo molecular. É fundamental a sua adequação tendo em conta a metodologia utilizada e assim garantir que os resultados sejam corretamente interpretados e o diagnóstico molecular efetuado com o rigor exigido. Cada laboratório deve por isso garantir o desempenho dos seus exames com a maior qualidade possível, validando os seus procedimentos e participando nos programas de controlo de qualidade, subscrevendo-se, por exemplo, em testes de proficiência fornecidos pelo CAP (20). A participação nestes testes de proficiência, por exemplo para o KRAS, permitem uma melhoria na validação dos procedimentos técnicos, minimizando, a ocorrência de erros que possam surgir numa qualquer fase do procedimento, e garantir assim, a qualidade dos seus serviços. 42 Foi verificado adicionalmente que, para o método de sequenciação direta, uma sequenciação bidirecional dos produtos de amplificação (sentido foward e reverse) demonstra resultados mais fidedignos, minimizando, enviesamentos por má interpretação das sequências devido à presença de ruído de fundo e atuando como uma dupla confirmação do resultado, especialmente se a mutação se encontra no limiar do limite de deteção. Por sua vez, o método comercial Surveyor Scan kit, demonstrou possuir a principal desvantagem de não fornecer informação acerca da mutação específica quando detetada. Existindo a necessidade de recorrer à sequenciação automática para genotipar a mutação. 43 6. Conclusão Uma deteção precisa de mutações no gene KRAS é crucial no diagnóstico molecular pela importância na seleção do tratamento adequado de pacientes com CCRm. São diversas as metodologias que podem ser utilizadas para a genotipagem do KRAS, mas que carecem de estudos que validem o seu desempenho. A necessidade de validação de métodos e estabelecimento e implementação de guidelines na prática clínica para a deteção de mutações neste gene é visível. No presente estudo, numa primeira fase, a metodologia Surveyor Scan demonstrou uma maior sensibilidade na deteção das mutações no gene KRAS, quando comparada com o método de sequenciação direta, e o que seria expectável. Numa segunda fase, tendo em conta os resultados obtidos de análise molecular, e aliando agora os limites de sensibilidade analítica das metodologias em estudo, e correlacionando com os valores das percentagens do conteúdo de células tumorais estimadas pelo patologista, houve a confirmação que existe uma correlação com a capacidade de deteção da mutação com uma percentagem de células tumorais da amostra em análise, e que se deve encontrar acima do limite de sensibilidade analítica do método molecular selecionado. A escolha por que método usar, na medida em que não existe, até ao momento, nenhuma metodologia standard para o estudo mutacional do gene KRAS, deve incluir uma avaliação de inúmeros fatores, abrangendo, o limite de deteção da metodologia, a sensibilidade (falsos negativos) e especificidade (falsos positivos), reprodutibilidade, turnaround time e custos, tendo sempre por base, a experiência do laboratório, equipamentos disponíveis e facilidade na obtenção dos resultados. Diferentes métodos podem ser utilizados para teste molecular do gene KRAS em amostras tumorais numa rotina de diagnósticos, cada um deles englobando vantagens e desvantagens. A maior experiência existe nos laboratórios utilizando a sequenciação direta após PCR, que sendo relativamente acessível em termos de custos, quando comparada aos kits comerciais, se associada a uma caracterização anatomopatológica da amostra em análise, demonstra ser tão sensível e fidedigna, na produção de resultados credíveis e em tempo útil, quando comparada com as restantes metodologias para estudo mutacional do gene KRAS. Num teste de genotipagem do KRAS, é importante garantir a qualidade do processo na fase analítica e pós-analítica, mas não esquecer a fase pré-analítica, onde a necessidade de padronização é evidente. A qualidade do exame está dependente de 44 vários fatores, desde o momento de colheita do material, da preparação da amostra (sua fixação e processamento), bem como, da seleção e adequação para análise molecular em termos de conteúdo tumoral. O patologista possui por isso um importante papel em várias etapas do processo. Em conclusão, os resultados da avaliação do estado mutacional do gene KRAS não devem estar dependentes apenas do método molecular a utilizar para genotipagem, uma vez que todos eles fornecem resultados válidos. O estudo permitiu demonstrar a real importância em aliar à metodologia selecionada para análise molecular, uma avaliação histopatológica das amostras em análise, devidamente selecionadas e avaliados por um patologista, fator crucial a se ter em conta aquando a análise dos resultados para a realização um diagnóstico preciso. 45 7. Referências bibliográficas 1. Custodio A, Feliu J. 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