Identificação de péptidos produzidos pela fermentação láctica de subprodutos das indústrias de lacticínios com capacidade inibidora das gelatinases, MMP-9 e MMP-2

Identificação de péptidos produzidos pela fermentação láctica de subprodutos das indústrias de laticínios com capacidade inibidora das gelatinases da matriz, MMP-2 e MMP-9. Sara Martins Sanches Porto, 2015 ii Identificação de péptidos produzidos pela fermentação láctica de subprodutos das indústrias de laticínios com capacidade inibidora das gelatinases da matriz, MMP-9 e MMP-2. Identification of peptides produced by lactic fermentation of dairy industry byproducts with the ability to inhibit the matrix metalloproteinases, MMP-9 and MMP-2. Sara Martins Sanches Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação, Universidade do Porto Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Professor Doutor Ricardo Manuel de Seixas Boavida Ferreira, Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Doutora Ana Isabel Gusmão Lima, Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa Prof. Doutor José Alejandro Ribeiro dos Santos, Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto Dissertação de candidatura ao grau de Mestre em Nutrição Clínica apresentada à Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto 2015 iii Agradecimentos Ao Instituto Superior de Agronomia pela possibilidade de fazer a investigação necessária a este trabalho nas suas instalações. Ao meu Orientador Professor Doutor Ricardo Boavida por me ter aceite no seu grupo, permitindo-me assim a realização deste trabalho, pelos conhecimentos, experiência e disponibilidade. À minha co-orientadora, a Doutora Ana Lima, pelos ensinamentos e ajuda dada durante este percurso. Ao meu co-orientador Prof. Doutor José Alejandro Santos, pelos conselhos e disponibilidade prestados. À Profª Adélia e Isabel Santos por me terem permitido trabalhar com o soro de leite, incluindo-me assim no seu trabalho. A todos os meus colegas de laboratório pela companhia, apoio e paciência em todos os momentos deste período, em especial ao Phill, Inês, Eduarda, Ana Cristina, Regina, Sofia, Filipe, Margarida, Catarina, Raimundo, António e Maria João. Ao Miguel por toda a ajuda e explicações dadas durante este trabalho. E em especial à Sabrina por todo o apoio, paciência, preocupação, ajuda interminável, motivação e amizade! Um agradecimento especial à Jenni por toda a companhia, ajuda, motivação e paciência contínua, por me aturar em mais este percurso e, em especial, pela amizade! Agradeço ainda à Margarida pela amizade e apoio constante e, às duas pelas infindáveis viagens de comboio. Sem elas este mestrado não teria sido o mesmo. À Carla pela sua amizade e por estar sempre presente. iv Finalmente, quero agradecer à minha família por estarem sempre presente, por todo o apoio e motivação que me dão e por me terem sempre dado a oportunidade de prosseguir com os meus estudos. Aos meus Pais pela dedicação, paciência, empenho e apoio incondicional! Aos meus Irmãos por fazerem parte da minha vida, tornando-a melhor! À minha Avó, Madrinha e Avó pelo carinho, presença e apoio constante! A todos os amigos que, de algum modo, me ajudaram e contribuíram para mais um período da minha vida. v Resumo A principal causa de morte dos doentes com cancro colo-retal reside nas metástases e não no tumor primário. A invasão e a proliferação celular são fatores chave no desenvolvimento das metástases tumorais. Vários estudos têm demonstrado que as metaloproteinases de matriz (MMPs), mais especificamente as gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estão envolvidas no desenvolvimento tumoral uma vez que são responsáveis pela degradação da matriz extracelular. Deste modo, a sua inibição torna-se um mecanismo em estudo muito importante para a terapêutica e prevenção da doença oncológica e o estudo dos seus inibidores, essencial. Vários estudos sugerem que a dieta pode ser preventiva para o cancro do cólon. O leite é constituído por um sistema proteico constituído por duas grandes famílias de proteínas: as caseínas (80%) e as proteínas do soro (20%). As proteínas do soro possuem diversas propriedades nutricionais e biológicas importantes, principalmente na prevenção de doenças, tendo apresentado efeitos anti-tumorais. Além disso, a fermentação do soro de leite com bactérias produtoras de ácido láctico leva à hidrólise das principais proteínas. Isto resulta na formação de péptidos bioativos que têm vindo a ser estudados devido às suas atividades benéficas para a saúde, como o seu efeito anti-tumoral. Assim, este trabalho pretendeu estudar o potencial anti-tumoral das proteínas e péptidos do soro de leite em células do cancro do cólon, o seu efeito na invasão e proliferação celular, se este efeito está relacionado com a inibição das MMPs e, ainda, determinar qual a fração do soro responsável pela atividade anti-tumoral. vi Foi então avaliada a capacidade do soro de leite fermentado e não fermentado na inibição da atividade das gelatinases, MMP-2 e MMP-9, através de ensaios fluorimétricos e, ainda, através de zimografias reversas. Também foram realizados ensaios na linha celular de cancro do cólon HT-29 de modo a estudar o efeito do soro e da sua fermentação na invasão e proliferação celular. Os resultados destes ensaios demonstraram que o soro de leite fermentado tem um potencial bioativo no cancro do cólon. Além de constatar que os péptidos bioativos libertados durante o processo fermentativo têm atividade inibitória das MMPs in vitro, também demonstrou ter efeito na inibição da invasão e proliferação celular. No entanto, este efeito não pareceu dever-se à inibição das MMPs presentes no meio extracelular. Os resultados deste trabalho apontam para a necessidade de futuros estudos sobre o potencial anti-tumoral do soro do leite e do soro do leite fermentado. Palavras-Chave Soro de leite, fermentação, bactérias produtoras de ácido láctico, MMP-2, MMP-9, cancro do cólon, células HT-29, invasão celular, proliferação celular. vii Abstract The primary cause of death by colorectal cancer derives from metastization and not from the primary tumor itself. Cancer cell invasion and proliferation are the key factors in the development of cancer metastasis. Many studies have demonstrated that matrix metalloproteinases (MMPs), more specifically a group called gelatinases (MMP-2 and MMP-9), are involved in tumor development because of their ability to degrade extracellular matrices. Thus, the mechanism of their inhibition becomes an important topic to study for the prevention and therapeutics of cancer and the identification of potential inhibitors is essential. Many studies suggest that diet can be a way of colon cancer prevention. Bovine milk comprises two major families of proteins: caseins (80%) and whey proteins (20%). Whey proteins possess an important variety of nutritional properties and bioactivities, especially those involved in the prevention of diseases, namely anti-cancer effects. Furthermore, whey fermentation by acid lactic bacteria hydrolyzes the major proteins in whey, which results in the formation of bioactive peptides that have been studied for their health-related bioactivities, such as their anti-tumor effect. Therefore, this work aimed to study the anti-tumor potential of whey proteins and peptides on colon cancer cells, their effect in cellular invasion and proliferation, if this effect was related to MMPs inhibition, and to ascertain the main whey fraction responsible for the anti-tumor activity. The capacity of whey and fermented whey to inhibit gelatinase (MMP-2 and MMP-9) activities, was assessed by fluorimetric assays and reverse zymographys. Also, cellular assays with the colon cancer cell line HT-29 were performed, in viii order to study the effect of whey and fermented whey samples in the mechanisms of cellular invasion and proliferation. Our results showed that fermented whey has a bioactive potential on colon cancer. The performed assays showed that the bioactive peptides released during fermentation exhibit an inhibitory activity upon MMPs in vitro, particularly MMP-2, as well as on cellular invasion and proliferation. However, in the cells this effect didn’t seem to be due to extracellular MMPs inhibition, but rather other mechanisms involved with cell proliferation. As a whole, the results obtained show the need for future work on the antitumor potential of whey and fermented whey. Keywords Whey, lactic acid bacteria, MMP-2, MMP-9, colon cancer, HT-29 cells, invasion, proliferation. ix Índice Agradecimentos ..................................................................................................... iii Resumo ................................................................................................................... v Lista de Abreviaturas ............................................................................................. xii Lista de Figuras .................................................................................................... xiv Lista de Tabelas .................................................................................................. xviii 1. Introdução ........................................................................................................ 1 1.1. Metaloproteinases de matriz ..................................................................... 2 1.2. O papel oncológico das gelatinases, MMP-2 e MMP-9 ............................. 4 1.3. Leite, produtos lácteos e a saúde ............................................................. 7 1.4. O soro de leite ......................................................................................... 10 1.4.1. β-Lactoglobulina ............................................................................... 12 1.4.2. α-Lactalbumina ................................................................................. 13 1.4.3. Lactoferrina ....................................................................................... 14 1.4.4. Albumina sérica bovina ..................................................................... 15 1.5. Processos fermentativos e saúde ........................................................... 15 1.6. Atividade anti-tumoral das proteínas e péptidos do soro de leite ............ 17 2. Objetivos ........................................................................................................ 20 3. Material e Métodos ......................................................................................... 21 3.1. Reagentes ................................................................................................. 21 3.2. Materiais biológicos ................................................................................. 21 3.2.1. Soro de leite ..................................................................................... 21 xvi Figura 15 – Percentagem de proliferação celular das células HT-29 em relação ao controlo após adição da fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite colhida ao longo da fermentação; Figura 16 – Taxa de invasão celular, em relação ao controlo, após o corte da monocamada de células HT-29 na presença da amostra total do soro de leite ao longo da fermentação, após 48 h; Figura 17 – Taxa de invasão celular, em relação ao controlo, após o corte da monocamada de células HT-29 na presença da fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite ao longo da fermentação, após 48 h; Figura 18 – Exemplos de migração celular, na presença da amostra total do soro de leite de mistura ao longo dos seis dias de fermentação, após o corte da monocamada de células HT-29, após 48 h; Figura 19 - Exemplos de migração celular, na presença da fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo dos seis dias de fermentação, após o corte da monocamada de células HT-29, após 48 h; Figura 20 – Imagem representativa da zimografia gelatinolítica obtida por SDSPAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v de gelatina). Meio extracelular das células HT-29 recolhido após ensaio da invasão celular com adição de inibidor: amostra total do soro de leite de mistura ao longo da fermentação; Figura 21 - Imagem representativa da zimografia gelatinolítica obtida por SDSPAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v de gelatina). Meio extracelular das células HT-29 recolhido após ensaio da invasão celular com adição de inibidor: fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo da fermentação; xvii Figura 22 – Atividade gelatinolítica (% em relação ao controlo) do meio extracelular, das células HT-29, com amostra total do soro de leite de mistura ao longo da fermentação; Figura 23 – Atividade gelatinolítica (% em relação ao controlo) do meio extracelular, das células HT-29, com fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo da fermentação. xviii Lista de Tabelas Tabela 1 - Quantificação de lactose e do ácido láctico no soro de leite de mistura fermentado; Tabela 2 - Concentração proteica da amostra total e da fração entre 3 e 10 kDa, de soro de leite de mistura fermentado. 1 1. Introdução Em 2012 existiam, a nível mundial, 14,1 milhões de novos casos de cancro, 8,2 milhões de mortes por cancro e 32,6 milhões de pessoas que viviam com esta doença (diagnosticado há pelo menos 5 anos). O cancro colo-retal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais comum nos homens e o segundo nas mulheres a nível mundial, com 746 mil e 614 mil casos em 2012, respetivamente(1). A incidência do CCR em países desenvolvidos é 18% mais elevada quando comparada com regiões menos desenvolvidas(2). Esta variabilidade demonstra a importância que os fatores ambientais têm na etiologia deste cancro(2, 3). Estudos epidemiológicos sugerem que a dieta é um fator determinante, sendo que, em relação ao cancro do cólon os principais fatores de risco são: o fenótipo, a dieta ocidental (pobre em fibra e rica em gordura saturada e carnes vermelhas), as técnicas utilizadas na preparação dos alimentos e o sedentarismo(4-6). Estima-se que os fatores alimentares sejam responsáveis por cerca de 70 a 90% dos casos, sendo que a otimização da dieta poderá levar a uma diminuição da incidência desta doença maligna(7-10). Segundo o relatório elaborado pelo World Cancer Research Fund o consumo de carnes vermelhas e processadas, alimentos contendo ferro, queijo, alimentos ricos em gordura animal, alimentos açucarados e o consumo de bebidas alcoólicas está associado ao aumento do risco de CCR, tendo esta associação sido demonstrada com uma evidência convincente. Foi ainda demonstrado, no entanto, com evidência provável, que o ganho de peso na idade adulta, gordura corporal e gordura abdominal também se encontram associados 2 com o aumento do risco de CCR. Por outro lado, a atividade física demonstrou, com evidência convincente, uma associação com a diminuição do risco do CCR. Alimentos contendo fibra dietética, o leite e o cálcio também demonstraram possuir uma associação provável com a diminuição do risco de CCR(6). Estes dados mostram a necessidade de estudar novos agentes e estratégias que possam ser utilizados na prevenção e terapêutica desta doença tão prevalente. 1.1. Metaloproteinases de matriz As metástases tumorais definem a agressividade do tumor e são a principal causa de morte no cancro(11, 12). Nem todas as células tumorais primárias têm potencial para formar metástases. Para que isto aconteça, as células tumorais têm de possuir certas propriedades de modo a destacar-se da massa tumoral primária, migrar até os vasos linfáticos ou sanguíneos, atravessar a membrana vascular basal, penetrar no lúmen vascular, escapar à vigilância do sistema imunitário, aderir ao endotélio vascular dos órgãos (diferentes do local primário), realizar extravasão, sobreviver e crescer no ambiente invadido(11, 13). Outro fator importante para que ocorra metastização tumoral é a angiogénese, uma vez que esta é necessária tanto para o crescimento da massa tumoral primária, como para o crescimento das metástases(14). Além disso, os novos vasos sanguíneos que penetram no tumor são usados como via de entrada pelas células tumorais para a circulação(13). Quando a formação das metástases ocorre, o prognóstico torna-se desfavorável uma vez que os novos tumores, além de inoperáveis, não respondem aos tratamentos convencionais (quimioterapia e radioterapia) aos quais o tumor primário é sensível(11). Deste modo, é de extrema importância o 3 estudo de novos agentes e estratégias que possam ser usados na prevenção e controlo da formação de metástases tumorais. As metaloproteinases de matriz (MMPs) constituem uma família de endopeptidases responsáveis pela clivagem de diversos substratos proteicos através de um mecanismo que envolve a ativação de um local de ligação de uma molécula de água, através de um ião de zinco(11, 15). Estas enzimas encontram-se envolvidas tanto em processos fisiológicos, como no desenvolvimento de diversas condições patológicas nomeadamente metástases tumorais, inflamação crónica, e consequente dano tecidular, e distúrbios neurológicos. O principal efeito fisiológico descrito sobre estas enzimas é a modelação e regulação do turnover da matriz extracelular (MEC), através da degradação direta dos seus componentes proteicos - colagénio, proteoglicanos e fibronectina(11, 15). As MMPs são secretadas em grande quantidade sob a forma de próproteína. Nesta forma, o domínio catalítico da enzima encontra-se protegido pelo pro-domínio, sendo que estes interagem através de um resíduo de cisteína e um ião de zinco, o chamado cysteine switch. A sua ativação pode ocorrer através de diversos mecanismos sendo, provavelmente o mais importante, a remoção proteolítica do pró-domínio por outras endopeptidases(11, 15). As MMPs secretadas são classificadas de acordo com o seu substrato específico sendo, deste modo, divididas em colagenases, estromelisinas e gelatinases(11, 15) (Figura 1). Vários trabalhos que estudam os mecanismos subjacentes à invasão tumoral e ao desenvolvimento de metástases identificaram as MMPs como fatores chave nos processos que envolvem a disseminação tumoral(11). 4 Figura 1 – Estrutura modular do domínio modelador das MMPs. Adaptado de Wee Yong V, 1998(16). 1.2. O papel oncológico das gelatinases, MMP-2 e MMP-9 As gelatinases são as MMPs responsáveis pela degradação do colagénio desnaturado - a gelatina – e incluem a MMP-2 e a MMP-9(11). A MMP-2 (gelatinase A) tem uma massa molecular de 72 kDa. É sintetizada sob a forma de pró-enzima e a sua ativação depende da ligação com o inibidor endógeno das MMPs, o inibidor tecidular das metaloproteinases 2 (TIMP2). Este complexo é um substrato para a metaloproteinase de membrana MMP14, que remove o pró-domínio da pro-MMP-2 através da clivagem proteolítica dando origem à enzima ativa com 64 kDa(17). A MMP-2 é capaz de degradar a gelatina, os colagénios dos tipos I, IV e V, a elastina e a vibronectina(15). A MMP-2 é amplamente expressa nas células do tecido conjuntivo(11). Devido à sua capacidade de degradar o colagénio na membrana vascular basal, a MMP-2 encontra-se envolvida na neovascularização, tanto em condições fisiológicas como patológicas, como ocorre na metastização tumoral(18). No 5 entanto, o estado de maturação da enzima parece influenciar a sua função na angiogénese. Enquanto a enzima na forma ativa induz apoptose nas células endoteliais e inibe a neovascularização, a sua forma de ativação intermédia (quando complexada com a MMP-14) melhora a sobrevivência celular e promove a angiogénese(15). A MMP-2 também atua na migração celular, uma vez que é responsável pela degradação direta da membrana basal(15). A MMP-9 (gelatinase B) tem uma massa molecular de 92 kDa na sua forma inativa, sendo que, ao ser ativada, se transforma numa enzima com 83 kDa. A sua ativação pode ocorrer através da remoção do pró-domínio por ação de protéases, incluindo outras MMPs. A expressão da MMP-9 ocorre em situações que necessitam da remodelação de tecidos, como no desenvolvimento, na cicatrização de feridas e na invasão tumoral(11, 15). A MMP-9 é responsável pela libertação da forma biologicamente ativa do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), o qual tem um papel crucial na angiogénese. Este processo, juntamente com a capacidade da enzima em realizar a degradação proteolítica da membrana basal, indica que a MMP-9 tem um papel importante na formação de novos vasos sanguíneos(15, 19). As MMPs têm vindo a ser identificadas como fatores-chave na angiogénese, no crescimento e na metastização tumoral, tornando o seu estudo importante para a prevenção e tratamento da doença oncológica(11, 13, 15, 20). A angiogénese é um processo essencial para o crescimento tumoral uma vez que, sem vasos sanguíneos, o tumor não pode aumentar o seu tamanho nem metastizar. Deste modo, uma vez que o tumor depende da angiogénese, o bloqueio desta é uma estratégia para impedir o crescimento tumoral, podendo ser 6 usada na sua prevenção e terapêutica(14). Por outro lado, a proliferação e a invasão celular também são fatores essenciais na metastização, necessitando, por isso, da atividade das MMPs para que ocorram (Figura 2)(21-23). Figura 2 – Ação das MMPs no desenvolvimento tumoral. Adaptado de Rao JS, 2003(24) A maioria dos estudos que procuram desenvolver novos medicamentos anti-tumorais foca-se sobretudo no reconhecimento da célula tumoral, e subsequente indução de apoptose, ou direcionam-se na atividade das MMPs, desenvolvendo inibidores específicos destas enzimas, que atuam preferencialmente in loco(25, 26). A inibição das MMPs poderá ser um método interessante para a prevenção e tratamento da doença oncológica. Esta inibição ocorre, fisiologicamente, através 7 de pequenas proteínas denominadas de TIMPs (21 a 28 kDa), as quais bloqueiam a atividade proteolítica das MMPs ativas ao ligarem-se ao centro de ligação do zinco, fortemente conservado ao longo da evolução. Conhecem-se, atualmente, quatro TIMPs, produzidos por várias células como queratinócitos, fibroblastos, osteoblastos e células endoteliais(11). Ensaios que usaram TIMPs e inibidores sintéticos das MMPs comprovaram a relação entre as MMPs e as metástases tumorais(11). Estas evidências levaram ao desenvolvimento e produção de inibidores sintéticos das MMPs(25, 27). No entanto, os vários ensaios clínicos realizados com estes agentes provaram a sua ineficácia, além de terem apresentado efeitos secundários adversos graves, falhando assim o seu objetivo(28). Estes resultados foram associados, principalmente, a uma inibição não seletiva das MMPs por parte dos inibidores sintéticos das MMPs utilizados(25, 27). Assim, a investigação tem-se virado cada vez mais para a procura de inibidores naturais das MMPs e o seu estudo revela-se de grande importância, uma vez que estes podem ser usados como terapêutica adjuvante da doença oncológica(29). Este aspeto assume ainda maior impacto a nível da procura de inibidores que façam parte de alimentos, uma vez que a dieta tem sido cada vez mais apontada como uma forma eficaz e importante na prevenção tumoral. 1.3. Leite, produtos lácteos e a saúde Desde que se iniciou a prática da domesticação dos animais que o Homem começou a beber leite e, deste modo, a tirar benefício do elevado valor nutricional deste produto. O seu consumo tem vindo a ser relacionado com a saúde, uma vez que é uma boa fonte de proteína, gordura, vitaminas e minerais(3). Estudos epidemiológicos têm vindo a demonstrar que o consumo de produtos lácteos é um 14 o crescimento celular durante 3 a 4 dias, havendo uma diminuição drástica ao fim deste período, o que sugere uma apoptose retardada(33, 36, 49). 1.4.3. Lactoferrina A lactoferrina (LF) é uma glicoproteína que se encontra presente no leite, numa concentração inferior às restantes proteínas. É uma glicoproteína de ligação ao ferro, com uma massa molecular de 80 kDa. Têm-lhe sido atribuídos diversos papéis fisiológicos, nomeadamente a regulação da homeostasia do ferro, atividade antimicrobiana, atividade anti-inflamatória, imuno-modeladora, ativação da transcrição celular e proteção contra o cancro(45). Com a degradação da LF, o principal péptido produzido é a lactoferricina, que é responsável pela maioria dos seus efeitos imunomodelatórios(45), sendo considerada como o domínio ativo responsável pela atividade antimicrobiana da lactoferrina bovina(36). É um péptido constituído por 25 resíduos de aminoácidos, sendo dois deles resíduos de cisteína. A LF tem demonstrado possuir uma atividade citotóxica in vitro para diferentes tipos de linhas celulares, incluindo células de leucemia, fibrossarcoma, vários carcinomas e neuroblastomas. Esta atividade citotóxica tem uma seletividade de ação devido à natureza catiónica da lactoferricina, que permite a este péptido atingir apenas as células tumorais negativamente carregadas, poupando as células saudáveis devido à sua carga neutra. No entanto, esta seletividade é a responsável pela lactoferricina não exercer a sua atividade nas células tumorais da próstata PC3, bem como noutros tipos de células cancerígenas que, devido à sua fraca carga negativa, são refratárias ao tratamento com a LF(36). 15 1.4.4. Albumina sérica bovina A albumina sérica bovina (BSA) é constituída por 582 resíduos de aminoácidos e, apesar de não ser sintetizada na glândula mamária, aparece no leite através de uma passagem passiva da corrente sanguínea. Laursen e colegas (1990) demonstraram que a BSA inibe o crescimento da linha celular MCF-7 de células do cancro da mama, uma vez que esta parece inibir a proliferação celular através da modelação da atividade de fatores de crescimento autócrinos(50). 1.5. Processos fermentativos e saúde As bactérias produtoras de ácido láctico (BAL) têm sido utilizadas na indústria alimentar como culturas primárias na manufatura de carnes fermentadas e produtos lácteos. O principal metabolito produzido durante estas reações de fermentação é o ácido láctico, sendo que, durante este processo, há uma aumento da acidez do leite, tornando o crescimento de outros microrganismos, que não as bactérias lácticas, inviável. Além do ácido láctico, estas bactérias também produzem compostos bacteriostáticos. (51) O leite fermentado é uma parte importante na nossa alimentação. Desde os tempos antigos que o Homem se apercebeu do processo fermentativo sem, contudo, o compreender. Inicialmente, o leite fermentava espontaneamente e a reutilização dos vasos onde era armazenado e das ferramentas utilizadas conferiam uma certa repetibilidade e estabilidade ao processo fermentativo. Isto levou à utilização de microrganismos específicos para a produção de alimentos mais ou menos refinados sendo que, cada país acabou por desenvolver os seus 16 próprios leites fermentados como o iogurte, soro de leite coalhado e bebidas lácteas fermentadas, entre outros(51). O uso destas bactérias na fermentação de produtos lácteos tem demonstrado grandes benefícios, tanto a nível da produção como para o consumidor. Além da sua importância na preservação do alimento, têm uma importância nutricional e terapêutica. As BAL têm vindo a ser usadas, com muito sucesso, no tratamento da diarreia, alergias alimentares e na doença inflamatória intestinal. Também demonstraram possuir propriedades na prevenção do cancro colo-retal ao inibirem o seu desenvolvimento e progressão através de múltiplas vias(52). Além do benefício inerente às próprias bactérias, vários estudos têm sugerido que os produtos lácteos fermentados exibem propriedades antihipertensivas, antibacterianas, anti-tumorais e anti-mutagénicas(53-56). Matar e colegas (1997) concluíram que, após fermentação de leite com bactérias lácticas com atividade proteolítica, são produzidos compostos anti-mutagénicos, tendo sugerido a libertação de péptidos bioativos como principal mecanismo(53). Ao estudarem os efeitos biológicos do leite fermentado com a espécie proteolítica Lactobacillus helveticus, que tem a capacidade de induzir a libertação de elevadas quantidades de péptidos durante o processo fermentativo do leite, Rachid e colegas (2006) observaram que este diminuía significativamente o crescimento de tumores mamários induzidos quimicamente em ratos(54). Este resultado veio ao encontro do estudo realizado por Biffi e colegas (1997), que tinham demonstrado um efeito anti-proliferativo no leite fermentado por várias bactérias lácticas, numa linha celular humana de cancro da mama. Apesar de não terem conseguido determinar qual o componente responsável por 17 este efeito, concluíram que seria um composto solúvel produzido pelas bactérias lácticas durante o processo fermentativo(57). Estes estudos revelaram a importância do processo de fermentação e do consumo de leites fermentados na prevenção da doença oncológica, sem no entanto explicarem o mecanismo subjacente. 1.6. Atividade anti-tumoral das proteínas e péptidos do soro de leite Estudos conduzidos em populações humanas e experiências realizadas em animais têm sugerido que, quer o leite quer outros produtos lácteos, exibem um efeito protetor contra o desenvolvimento do cancro colo-retal(58). Têm vindo a ser publicados, nas últimas décadas, vários estudos epidemiológicos que sugerem que os produtos lácticos exercem um efeito inibitório no crescimento de vários tipos de tumores(59). Um estudo realizado na Suécia demonstrou uma associação positiva entre o consumo de laticínios e uma baixa incidência do cancro do cólon, tendo sido considerada a proteína, o cálcio, a riboflavina e a gordura(60). Diversas experiências efetuadas em roedores atribuíram esta atividade anti-tumoral à fração proteica do leite, em especial, às proteínas do soro de leite(59). McIntosh e colegas (1995) demonstraram que a incidência de tumores do cólon, num grupo de ratos alimentados com proteínas do soro, era 30% menor quando comparado com a incidência de um grupo alimentado com soja e 25% menor quando comparado com um grupo alimentado com carne vermelha. Apesar da diferença não possuir significado estatístico, concluíram que a proteína do soro conferia uma maior proteção contra o desenvolvimento de tumores intestinais, quimicamente induzidos, quando comparada com a proteína da soja e 18 da carne vermelha. No entanto, não possuíam dados suficientes para avaliar o impacto da dieta na massa tumoral (58). Por sua vez, Hakkak e colegas (2001), ao compararem dietas à base de proteína do soro de leite e de caseína, concluíram que o grupo de ratos alimentado com proteínas do soro apresentava níveis médios de incidência de tumores no cólon 40% inferiores, quando comparado com os animais alimentados à base de caseína. No entanto, neste estudo não encontraram diferenças significativas na massa tumoral e na multiplicidade (número de tumores por rato) entre os dois grupos (61). A superioridade do efeito anti-cancerígeno das proteínas do soro de leite sobre a caseína também já tinha sido estudada por Bounous e colegas(59, 62, 63). Um mecanismo explicativo proposto para este efeito anti-tumoral das proteínas do soro resulta da sua capacidade em aumentar a concentração de glutationa nos tecidos, devido ao seu elevado conteúdo em cisteína e γglutamilcisteína, que são substratos precursores para a síntese da GSH. A GSH é um tripéptido antioxidante que tem um efeito protetor muito importante sobre os efeitos secundários do stresse oxidativo e que participa na desintoxicação celular de agentes carcinogéneos(36, 59, 61). No entanto, não foram observadas diferenças nos níveis hepáticos de GSH detetados entre o grupo de ratos alimentado com proteína de soro e o grupo alimentado com caseína(61). Attaallah e colegas (2012) compararam o efeito protetor da proteína do soro com o do seu hidrolisado proteico (mistura de péptidos e aminoácidos livres, derivada de uma hidrólise enzimática), uma vez que este último também demonstrava possuir propriedades antioxidantes. Após alimentarem dois grupos, um com proteína de soro e outro com hidrolisado de proteína do soro, concluíram 19 que o segundo, após indução química de tumores, apresentava uma menor incidência de tumores no cólon em comparação com o grupo alimentado com proteínas do soro. Sendo que o grupo alimentado com o hidrolisado das proteínas de soro apresentou uma incidência de apenas 33%, em comparação com o grupo alimentado com proteínas de soro, em que aquela proporção subiu para 91,9% de tumores, concluíram com significado estatístico que o hidrolisado proteico provou ser mais eficaz na prevenção do desenvolvimento de tumores no cólon, quando comparado com as proteínas do soro(64). No entanto, e como, uma vez mais, não houve diferenças estatísticas nos níveis de GSH entre grupos, nenhum mecanismo foi sugerido para este efeito anti-tumoral. Partindo dos estudos acima mencionados, parece evidente que a atividade anti-tumoral dos produtos lácteos se deve essencialmente à sua fração proteica, mais especificamente, às proteínas do soro de leite e aos péptidos libertados durante a sua hidrólise. No entanto, o mecanismo através do qual atuam não está ainda estudado e esclarecido. Por este motivo, assume relevância verificar se a inibição das MMPs poderá estar relacionada com esta atividade anti-tumoral das proteínas e péptidos do soro de leite. 20 2. Objetivos Como referido na Introdução, os péptidos presentes no soro do leite exibem um efeito anti-tumoral. Contudo o mecanismo subjacente não se encontra ainda esclarecido. Uma vez que a fermentação do soro do leite, além de libertar péptidos contidos nas suas proteínas, também apresenta efeitos benéficos para a saúde (e.g. metabolização da lactose), o objetivo deste trabalho foi o de fermentar o soro de leite e estudar os seguintes parâmetros: - Avaliar o potencial anti-tumoral do soro de leite, fermentado e não fermentado, e o seu efeito na proliferação e na invasão celular; - Verificar se este efeito está relacionado com a inibição das metaloproteinases de matriz, MMP-2 e MMP-9; - Determinar qual a fração peptídica do soro mais importante a nível da atividade anti-tumoral: as proteínas nativas ou os péptidos bioativos, obtidos pela degradação parcial das proteínas principais durante a fermentação. Como objetivo final procurar-se-á aferir como é que a ingestão do soro, ou o uso das suas frações com maior atividade, poderá ser usada como terapêutica adjuvante no tratamento da doença oncológica. 21 3. Material e Métodos 3.1. Reagentes Todos os reagentes utilizados neste trabalho apresentavam um grau de pureza pró-análise e eram provenientes da Sigma (St Louis, EUA), da Bio Rad (Richmond, EUA), da Merck S. A. (Darmstadt, Alemanha), da VWR Chemical (Radnor, EUA), da Millipore (Canadá), da RPE ACS (Milão, Itália), da Chem-lda NV (Bélgica) e da PanReac AppliChem (Barcelona, Espanha). Todas as soluções foram preparadas com água desionizada, obtida num sistema Mili-Q plus, da “Milipore” (Bedford, EUA). 3.2. Materiais biológicos 3.2.1. Soro de leite O material biológico utilizado para a realização deste trabalho foi soro de queijo (doravante denominado soro do leite), proveniente da fábrica de produção do Queijo Saloio (Torres Vedras, Portugal), sendo este obtido de uma mistura de leite de diferentes ruminantes (vaca, cabra e ovelha). O soro foi adquirido diretamente na fábrica, aquando da produção do queijo. Durante o processo de fabrico deste, foi utilizado um fermento industrial composto por um determinado consórcio de espécies de bactérias lácticas constituído por Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Lactococcus lactis lactis biovar. diacetylactis, Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Para a 22 realização deste trabalho foi utilizado o soro não fermentado (Dia 0) e soro fermentado ao longo de seis dias (Dia 1, 2, 3, 4, 5 e 6). 3.2.2. Células HT-29 Foi utilizada, durante este estudo, uma linha celular humana de um adenocarcinoma do cólon, HT-29 (ECACC 85061109), obtida de um adenocarcinoma de uma mulher caucasiana de 44 anos. 3.3. Ensaios fermentativos 3.3.1. Soro de leite (Queijo Saloio, Torres Vedra, Portugal) O soro de leite foi fornecido pela fábrica de produção do Queijo Saloio já com um consórcio específico de bactérias lácticas, um fermento industrial (Danisco, Dinamarca) adicionado durante a produção do queijo a partir de leite de mistura. O ensaio fermentativo foi realizado num balão de Erlenmeyer de 2 L, utilizando o fermento industrial, durante 6 dias, a uma temperatura controlada de 37 °C, sem agitação. Ao longo da fermentação foram recolhidas alíquotas diárias de 150 mL, sendo imediatamente conservadas a -20 °C para posterior análise. 3.4. Isolamento da fração polipeptídica de baixa massa molecular O soro do leite apresenta diversos componentes proteicos com diferentes massas moleculares. De forma a separar estes vários componentes, as amostras de soro recolhidas ao longo da fermentação passaram por dois processos de ultrafiltração. O primeiro processo realizou-se num ultrafiltrador “Vivaspin” (Pall Corporation, EUA) com um Molecular Weight Cut-Off (MWCO) de 10 kDa. De seguida, o permeado foi submetido a um novo processo de ultrafiltração, 23 utilizando um filtro MWCO de 3 kDa, no qual se conservou o retido, obtendo-se assim uma fração proteica concentrada, desprovida de ácido láctico e dessalinizada, supostamente compreendida entre os 3 e os 10 kDa. As ultrafiltrações foram realizadas numa centrífuga Beckman Coulter AllegraTM 25R a uma força constante de 2800 g e a 4 °C para evitar degradação proteica. A fração acima dos 10 kDa e o concentrado contendo a fração peptídica de baixa massa molecular, após serem recolhidos, foram guardados a uma temperatura de -20 °C até serem utilizados. 3.5. Quantificação da lactose e do ácido láctico De modo a determinar o teor de lactose e de ácido láctico no soro de leite ao longo da fermentação recorreu-se à técnica de HPLC, que permite uma separação dos compostos com base em várias técnicas cromatográficas. Assim, para cada um dos compostos em estudo foi elaborada uma reta padrão, com a qual é possível relacionar a concentração de cada substância com a área do pico respetivo. Os compostos utilizados para cada reta padrão foram: lactose (SigmaAldrich, EUA) e ácido láctico (Sigma-Aldrich, EUA). As amostras, depois de diluídas de 1:2 (v/v) com uma solução de 5 mM de ácido sulfúrico, foram sujeitas a uma centrifugação de 9300 g (centrífuga Eppendorf, modelo 5451 D, Alemanha), durante 10 min, após a qual se procedeu à filtração do sobrenadante em filtros Millipore (∅ = 0,22 μm). Foram efetuadas três réplicas de cada amostra, sendo injetados 10 μL em cada corrida, recorrendo a um injetor automático 717plus Autosampler (Waters Corporation, EUA), numa coluna SUGAR SH1011 (Showa Denko America, Inc., EUA). Cada corrida teve a duração de 30 min, a uma temperatura de 50 °C, tendo sido utilizado como 30 3.11. Ensaios celulares com células HT-29 3.11.1. Manutenção das células HT-29 A linha celular HT-29 foi mantida em meio RPMI (Meio Roswel Park Memorial Institute) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal (SBF), 200 mM de glutamina, 2x104 UI.mL-1 de penicilina e 20 mg.mL-1 de estreptomicina, em condições de 37 °C e atmosfera humidificada com 5% (v/v) de CO2. A viabilidade celular era rotineiramente verificada com observação diária num microscópio invertido. Após 48 h e no caso de as células apresentarem uma confluência compreendida entre 85 e 90%, era realizada a tripsinização da monocamada celular. Retirou-se o meio RPMI e foi realizada uma lavagem com tampão fosfato salino (PBS), esterilizado em autoclave a 121 °C, durante 20 min. Após se retirar o PBS, foi adicionada tripsina-EDTA (ATV: 8 g.L-1 NaCl, 1 g.L-1 KCl, 1,1 g.L-1 glucose hidratada, 0,58 g.L-1 NaHCO3, 0,2 g.L-1 EDTA hidratado e 2 g.L-1 tripsina) e a mistura foi incubada durante 15 min. Esta solução permite recolher a monocamada de células uma vez que estas se desagregam do frasco. Posteriormente, as células foram distribuídas em frascos e incubadas novamente a 37 °C até se obter novamente uma confluência entre os 85 e 90%. No caso de esta confluência não existir ao fim de 48 h, apenas se trocou o meio RPMI. 3.11.2. Ensaio de proliferação celular A proliferação celular foi avaliada pelo método padrão com brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-lil)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)(70). As células HT-29 foram colocadas, com uma densidade de ca. 2x104 células por poço, em placas de 96 poços e incubadas com 100 µg.mL-1 do potencial inibidor. Após 24 h de 31 tratamento, o meio extracelular foi cuidadosamente removido e as células foram lavadas com PBS. Posteriormente, foram adicionados 25 µL de uma solução de MTT dissolvido em meio de cultura com uma concentração final de 0,5 mM em cada poço. As placas foram novamente incubadas durante 4 h a 37 °C. O PBS foi removido. De seguida, foram adicionados 200 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) de forma a solubilizar os cristais de MTT. Finalmente, e após agitação das placas, foi determinada a densidade ótica a 570 nm (OD570), num espectrofotómetro (Syenery HT, Bio-TEK). 3.11.3. Ensaio de invasão celular As células HT-29 foram colocadas a crescer em placas com 24 poços (5x105 células/poço) até atingirem, no mínimo, um valor de confluência de 80%. Foi realizado um risco na monocamada de células com uma ponta de pipeta de 100 µL de modo a criar uma abertura, simulando uma ferida. Posteriormente, o meio foi retirado e as células foram lavadas com PBS, de forma a retirar os detritos resultantes. Cada poço foi preenchido com 1 mL de meio previamente descrito, com ou sem a presença de amostra com o potencial inibidor com uma concentração proteica de 100 µg.mL-1, tendo permanecido as células a crescer durante 48 h. Após este período de crescimento, as células foram fotografadas e a área coberta pelas células migradas foi contabilizada em 3 locais diferentes de cada triplicado da amostra. Estes valores foram expressos em percentagem em relação ao controlo (sem potencial inibidor). 3.11.4. Zimografia A zimografia é uma técnica eletroforética que permite avaliar a atividade das gelatinases, MMP-2 e MMP-9, presentes no meio extracelular das células HT- 32 29 após ensaio com adição do inibidor. A zimografia foi realizada num gel de poliacrilamida (12,5% (m/v) acrilamida) copolimerizada com gelatina: - Gel de separação: 12,5% (m/v) acrilamida, 1% (m/v) bisacrilamida, 750 mM Tris-HCl pH 8,8, 10% (m/v) gelatina, 0,028% (m/v) PSA e 0,14% (v/v) TEMED. - Gel de concentração: 5% (m/v) acrilamida, 1% (m/v) bisacrilamida, 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,03% (m/v) PSA e 0,24% (v/v) TEMED. As amostras, após recolhidas, foram tratadas com tampão de amostra (62,6 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% (m/v) SDS, 10% (v/v) glicerol). Após a eletroforese, o gel foi lavado numa solução de 2,5% (v/v) Triton X100, com três lavagens consecutivas de 30 min e incubado durante a noite numa solução com tampão de desenvolvimento (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2 e 0,01% (m/v) de azida de sódio). A coloração do gel ocorreu com 0,5% (m/v) Coomassie G-250 em 30% (v/v) etanol e 10% (v/v) ácido acético. Para a descoloração utilizou-se uma solução com 30% (v/v) etanol e 10% (v/v) ácido acético até se observarem bandas brancas no gel azul. 3.11.5. Quantificação da atividade gelatinolítica do meio extracelular O meio extracelular das células HT-29 foi colhido, após a realização do ensaio de invasão celular, para se quantificar a atividade gelatinolítica após exposição a diferentes inibidores. Esta atividade é devida à presença das duas enzimas, a MMP-2 e a MMP-9. O ensaio decorreu da forma descrita no ponto 3.10.1. No entanto, foram usadas concentrações diferentes, uma vez que foi adicionado a cada poço 100 µL 33 do meio retirado das células HT-29 (onde estão presentes as enzimas MMP-9 e MMP-2) e 100 µL da gelatina DQ. 3.12. Análise estatística A análise estatística foi efetuada com o programa PASW Statistics 18®. Todos os resultados são expressos pelas médias de pelo menos três amostras ± desvio padrão. Para comparar o efeito dos potenciais inibidores e a comparação entre eles foi realizada a ANOVA, sendo p ≤0,05 aceite como significativo. 34 4. Resultados e Discussão 4.1. Caracterização do soro do leite As proteínas alimentares podem possuir, inscritas na sua estrutura primária, sequências que durante a digestão no trato gastrointestinal, originam péptidos bioativos através de degradação enzimática, ou mesmo durante o processamento dos alimentos, por hidrólise enzimática ou fermentação. Durante o processo fermentativo, as BAL hidrolisam as proteínas do soro em péptidos e aminoácidos que são posteriormente utilizados como fontes de azoto, necessário ao seu crescimento(71). A fermentação do soro por estas bactérias conduz também à diminuição do conteúdo de lactose, com consequente formação de ácido láctico e de outros metabolitos, como compostos aromáticos, o que contribui para o sabor, textura e aumento da solubilidade dos hidratos de carbono no produto final(72, 73). Após os processos fermentativos, realizados neste trabalho, com as estirpes Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis cremoris, Lactococcus lactis lactis biovar. diacetylactis, Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii bulgaricus o soro de leite de mistura foi caracterizado em relação a diferentes parâmetros físico-químicos, nomeadamente o teor proteico total e os teores de lactose e de ácido láctico. 4.1.1. Teor em ácido láctico, lactose e concentração proteica Durante a fermentação do soro observou-se que, em termos de produção de ácido láctico, houve um aumento acentuado até às 72 h tendo-se, 35 posteriormente, mantido relativamente estável até ao final da fermentação, com uma concentração de, aproximadamente, 20 g.L-1. Como seria de esperar, este aumento foi acompanhado pela diminuição do teor em lactose (Tabela 1). Tabela 1 – Evolução dos teores de lactose e de ácido láctico ao longo da fermentação do soro de leite. Os valores são a média de pelo menos três réplicas biológicas ± desvio padrão. Dias de fermentação Lactose (g.mL-1) Ácido láctico (g.mL-1) Dia 0 58,9 3,3 ± 0,02 Dia 1 42,7 8,8 ± 0,06 Dia 2 35,8 18,1 ± 0,07 Dia 3 32,1 20,3 ± 0,03 Dia 4 30,6 19,6 ± 0,15 Dia 5 30,5 20,4 ± 0,04 Dia 6 29,1 20,9 ± 0,12 Em relação à quantificação proteica, a amostra total do soro de leite demonstrou algumas variações ao longo dos dias, como se pode observar na Tabela 2. No entanto, a variação da concentração proteica é mais notória na fração entre os 3 e 10 kDa, uma vez que se observa o seu aumento ao longo dos dias de fermentação, que poderá ser coincidente com a libertação de péptidos obtidos pela degradação proteica parcial realizada por protéases das BAL. Estudos realizados sobre o sistema proteolítico de diversas estirpes de bactérias comprovaram que existe libertação de péptidos bioativos antihipertensivos após hidrólise das proteínas do leite. As espécies Lactococcus lactis ssp. cremoris e a Streptococcus salivarius ssp. thermophylus foram duas das estirpes estudadas(71, 74). 36 Tabela 2 – Evolução da concentração proteica na amostra total e na fração entre 3 e 10 kDa, ao longo da fermentação do soro de leite. Os valores foram obtidos pelo método de Lowry modificado e são a média de pelo menos três réplicas biológicas ± desvio padrão. Dias de fermentação Proteína total (mg.mL-1) Fração peptídica entre 3 e 10 kDa (mg.mL-1) Dia 0 8,76 ± 0,69 0,86 ± 0,11 Dia 1 9,21 ± 1,02 1,46 ± 0,17 Dia 2 5,72 ± 0,33 1,72 ± 0,20 Dia 3 6,99 ± 0,71 1,84 ± 0,16 Dia 4 5,84 ± 0,88 1,58 ± 0,06 Dia 5 8,35 ± 0,35 2,04 ± 0,15 Dia 6 5,60 ± 0,54 1,37 ± 0,06 4.1.2. Análise do perfil proteico A hidrólise das proteínas do soro pelas BAL foi também analisada por SDSPAGE, em gel de poliacrilamida, como representado nas Figuras 3 e 4. Figura 3 – Imagem representativa do perfil polipeptídico das frações proteicas da amostra total do soro de leite de mistura obtido por SDS-PAGE, em gel de poliacrilamida (17,5% m/v acrilamida), suplementado com 10% (v/v) glicerol. Soro de leite de mistura não fermentado (Dia 0) e fermentado durante 1, 2, 3, 4, 5 e 6 dias. Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. Baseado na informação disponível na literatura e na massa molecular, as bandas numeradas são tentativamente identificadas como: 1 e 2 – BSA e LF; 3 – β-LG; 4 – α-LA. 1 e 2 3 4 37 Ao observar a Figura 3 é possível determinar que, em termos de perfil proteico, existe uma diminuição da intensidade das bandas ao longo dos dias de fermentação, especialmente os polipéptidos de maior massa molecular e o polipéptido de 14 kDa, o que se poderá traduzir num ataque proteolítico às várias frações proteicas do soro do leite pelas BAL. A banda correspondente à massa molecular de, aproximadamente, 14 kDa é a banda representativa da α-LA(36, 75). Esta sofre uma diminuição na intensidade da banda, tornando-se aparentemente inexistente a partir do segundo dia de fermentação. É também neste dia que se pode observar a formação de fragmentos de menores dimensões (<10 kDa), que podem corresponder à formação de péptidos com propriedades bioativas. No entanto, a β-LG, banda correspondente à massa molecular de 18 kDa(36, 76), já não apresenta uma diminuição da intensidade ao longo da fermentação, o que pode indicar que esta não terá sido hidrolisada pelas BAL(77). É ainda possível observar, na amostra não fermentada (Dia 0), polipéptidos com massas moleculares compreendidas entre os 66 e os 80 kDa, correspondentes à BSA e à LF(36). Estas bandas também apresentam uma diminuição na sua intensidade, desaparecendo quase completamente durante o primeiro dia da fermentação. A partir deste dia observa-se a formação de fragmentos com menor massa molecular, o que poderá também corresponder à formação de péptidos. Deste modo, é possível constatar que, no que diz respeito às principais proteínas do soro, o consórcio bacteriano utilizado para a fermentação demonstrou possuir uma grande capacidade de hidrólise da α-LA. Porém, no que diz respeito à β-LG, esta foi hidrolisada numa extensão muito menor, se é que houve hidrólise. Por outro lado, em relação às proteínas de elevada massa 38 molecular, como a BSA, a LF e ainda as imunoglobulinas, que são mais suscetíveis à atividade proteolítica das BAL, observou-se que sofreram hidrólise completa durante os primeiros dias de fermentação. A Figura 4 mostra a evolução, durante a fermentação do soro de leite, do perfil peptídico da fração com massas moleculares compreendidas entre os 3 e os 10 kDa. Este gel permite visualizar claramente as bandas de fragmentos proteicos de menores dimensões, que poderão corresponder aos péptidos formados durante a fermentação ao longo dos dias. Figura 4 – SDS-PAGE, (17,5% m/v acrilamida; suplementado com 10% v/v glicerol) ilustrativo da evolução do perfil polipeptídico das frações proteicas com massas moleculares compreendidas entre os 3 e os 10 kDa durante a fermentação do soro de leite. Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. Este perfil proteico mostra que, com o consórcio bacteriano utilizado para a fermentação do soro de leite de mistura, se obtém a formação e acumulação de péptidos derivados da degradação parcial das proteínas de maiores dimensões, incluindo provavelmente a α-LA. Estes resultados são coincidentes com os resultados obtidos por Pescuma e colegas em termos de degradação proteolítica, que referiram que a proteína que obteve um maior grau de hidrólise foi a α-LA(72). 39 4.2. High Performance Liquid Chromatography – HPLC A análise feita por HPLC à hidrólise das proteínas do soro do leite pelas BAL está representada na Figura 5(a-g). Durante a cromatografia de fase reversa (do Inglês RP = reverse phase), as proteínas e os péptidos são eluídos de acordo com a sua hidrofobicidade, sendo os hidrófilicos libertados primeiro e os mais hidrofóbicos por último. Dia 1 α-LA β-LG Dia 0 α-LA BSA β-LG 214 nm 280 nm 214 nm 280 nm LF 46 Figura 7 – Inibição da atividade gelatinolítica da MMP-9 na presença da fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite ao longo da fermentação em relação ao controlo. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p≤0,05 vs. controlo. Ao realizar o ensaio com a fração do soro de leite contendo as moléculas com uma massa molecular compreendida entre 3 e 10 kDa, não se observou nenhum grau de inibição significativo após adição do soro de leite, não havendo diferença em nenhum dos dias de fermentação em comparação com o controlo (Figura 7). 0 20 40 60 80 100 120 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Atividade gelatinolítica da MMP-9 (% em relação ao controlo) Dias de Fermentação 47 4.3.2. MMP-2 O efeito do soro de leite ao longo da fermentação na atividade da MMP-2 também foi determinado através do ensaio da atividade gelatinolítica com a enzima de origem comercial. Tanto a amostra total como a fração molecular com massas compreendidas entre 3 e 10 kDa foram estudadas, sendo adicionado o volume correspondente a 50 µg de proteína. Os resultados são apresentados nas Figuras 8 e 9, respetivamente. Figura 8 – Inibição da atividade gelatinolítica da MMP-2 na presença da amostra total do soro de leite ao longo da fermentação em relação ao controlo. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p≤0,05 vs. controlo. Ao realizar o ensaio com a amostra total do soro e observando a Figura 8, verifica-se que houve um grau de inibição da atividade da enzima MMP-2 em todos os dias da fermentação, quando comparado com o controlo. No entanto, os dias que se destacaram com um maior grau de inibição foram os dias 0, 2, 5 e 6, tendo apresentado significado estatístico (p≤0,05), com valores de inibição de 23, 22, 18 e 29% respetivamente. 0 20 40 60 80 100 120 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Atividade gelatinolítica da MMP-2 (% em relação ao controlo) Dias de Fermentação 48 Figura 9 – Inibição da atividade gelatinolítica da MMP-2 na presença da fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite ao longo da fermentação em relação ao controlo. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p≤0,05 vs. controlo. Relativamente ao ensaio realizado com a fração molecular com massas compreendidas entre 3 e 10 kDa, é observável através da Figura 9, que houve um grau significativo de inibição da atividade da MMP-2, quando comparado com o controlo. Esta inibição ocorreu em todos os dias da fermentação, com significado estatístico (p≤0,05), exceto no dia 3. Assim, houve uma inibição da atividade da MMP-2 de cerca de 43% no Dia 0, 34% no Dia 1, 40% no Dia 2, 44% no Dia 4, 34% no Dia 5 e 35% no Dia 6. Comparando os resultados entre as duas frações, é possível constatar que a inibição desta enzima pela fração de baixa massa molecular do soro é maior do que a inibição que ocorre com a amostra proteica total. Analisando os resultados da inibição da atividade de ambas as gelatinases com o soro de leite ao longo da fermentação, avaliado pelo ensaio da atividade gelatinolítica, podemos concluir que parece existir uma maior inibição da MMP-2 0 20 40 60 80 100 120 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Atividade gelatinolítica da MMP-2 (% em relação ao controlo) Dias de Fermentação 49 em comparação com a inibição da MMP-9. Tendo em consideração que a atividade gelatinolítica representa a degradação da gelatina pela enzima, estes resultados parecem indicar que o soro de leite, colhido ao longo da fermentação, não apresenta um efeito inibitório significativo da atividade da MMP-9. No entanto, quando as mesmas amostras são adicionadas à enzima MMP-2, parecem inibir a sua atividade. Além disso, é ainda possível constatar que a fração de baixa massa molecular do soro parece ter maior efeito na inibição da MMP-2 quando comparada com a amostra total, o que poderá sugerir a presença de péptidos bioativos formados durante a fermentação. Estes resultados são coincidentes com os resultados obtidos por Antiopi Varelias e colegas. Estes estudaram o efeito de um extrato de soro bovino enriquecido com fatores de crescimento na modulação da expressão e atividade das enzimas MMP-9 e MMP-2 presentes em úlceras crónicas, bem como no inibidor tecidual da MMP-2 (TIMP-2). Após uma aplicação tópica do extrato proteico, enriquecido com fatores de crescimento, em úlceras durante quatro semanas, observou-se uma diminuição na MMP-2 ativa. O mesmo não se verificou na MMP-9 nem no TIMP-2(79). Estes resultados sugerem, portanto, que o soro do leite, particularmente a fração de baixa massa molecular, tem capacidade de inibição da MMP-2 e não da MMP-9. 4.4. Zimografia reversa A zimografia reversa permite determinar se alguma fração da amostra em estudo é inibidora da ou resistente à ação da enzima presente no meio. Deste modo, realizaram-se zimografias reversas para cada gelatinase, para a MMP-2 e para a MMP-9, com a amostra total (Figura 10) e com a fração contendo as 50 moléculas com massas compreendidas entre 3 e 10 kDa (Figura 11) do soro do leite, colhido ao longo dos vários dias de fermentação. 4.4.1. Zimografia reversa com MMP-9 Após a realização da zimografia reversa com a enzima de origem comercial MMP-9, podemos observar através da Figura 10 que existem 2 frações na amostra total do soro de leite que são resistentes à ação ou inibidoras da atividade da MMP-9. Estas têm uma massa molecular entre 50 e 75 kDa e ocorrem no soro não fermentado (Dia 0) e no soro com 1 dia de fermentação (Dia 1). Figura 10 - Imagem representativa de uma zimografia reversa obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v gelatina e 10 µmol.mL-1 de MMP-9). Em cada coluna do gel foi adicionada amostra total do soro de leite colhida ao longo dos seis dias de fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. No entanto, observando este ensaio zimográfico, não se observou nenhuma fração de baixa massa molecular que se apresentasse como resistente à ação da ou inibidora da atividade desta enzima. Deste modo, realizou-se uma 51 nova zimografia reversa com a fração do soro também colhida ao longo da fermentação, mas contendo apenas as moléculas de baixa massa molecular (3 a 10 kDa), uma vez que esta fração se encontra mais concentrada. Os resultados obtidos encontram-se representados na Figura 11. Figura 11 - Imagem representativa de uma zimografia reversa obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v gelatina e 1 µmol.mL-1 de MMP-9). Em cada coluna do gel foi adicionada a fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite colhida ao longo dos seis dias de fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. Como se pode observar pela Figura11, denota-se uma zona que parece ser resistente à ação da MMP-9 ou inibitória da sua atividade, com uma massa molecular de 15 kDa e que se mantem ao longo de todos os dias de fermentação sendo, no entanto, mais marcada do dia 0 ao dia 3. Podemos, então, constatar que, de acordo com as zimografias reversas realizadas com a enzima comercial MMP-9, existem frações no soro de leite de mistura que parecem ser resistentes à ação da MMP-9 ou inibitórias da sua atividade. No entanto, comparando estes resultados com os resultados do ensaio 52 da atividade gelatinolítica (Figuras 6 e 7), uma vez que o soro de mistura não parecia inibir a atividade desta enzima, podemos inferir que estas frações poderão ser apenas resistentes à MMP-9. No entanto, e apesar de não ter significado estatístico, observou-se um ligeiro grau de inibição no Dia 0 da amostra total no ensaio da atividade gelatinolítica (Figura 6) o que poderá indicar que a banda observada no Dia 0 na zimografia reversa da amostra total (Figura 10) poderá ser inibidora da MMP-9. 4.4.2. Zimografia reversa com MMP-2 Posteriormente também se realizou a zimografia reversa com a enzima de origem comercial MMP-2 tanto para a amostra total como para a fração de baixa massa molecular do soro de leite de mistura, representadas respetivamente na Figura 12 e na Figura 13. Figura 12 - Imagem representativa de uma Zimografia reversa obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v gelatina e 1 µmol.mL-1 de MMP-2). Em cada coluna do gel foi adicionada amostra total do soro de leite colhida ao longo dos seis dias de fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. 53 Como é observável na Figura 12, existe uma fração na amostra total que parece ser resistente à ação da ou inibidora da atividade da MMP-2. Esta apresenta uma massa molecular de 150 kDa e apenas está presente no soro não fermentado (Dia 0). Não apresentando mais nenhuma fração, também com esta gelatinase se repetiu a zimografia reversa com a fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo da fermentação, uma vez que esta apresenta uma maior concentração das frações de baixa massa molecular quando comparada com a amostra total do soro. Figura 13 - Imagem representativa de uma zimografia reversa obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v gelatina e 1 µmol.mL-1 de MMP-2). Em cada coluna do gel foi adicionada a fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite ao longo da fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). Os polipéptidos do gel foram corados com Coomassie G. Ao observar a Figura 13 podemos constatar que a mesma fração com massa molecular de 15 kDa, que aparece na zimografia reversa realizada com a 54 MMP-9, está presente e parece ser resistente à ação da MMP-2 ou inibidora da sua atividade. Estes resultados também parecem ser coincidentes com os resultados obtidos no ensaio da atividade gelatinolítica (Figuras 8 e 9) uma vez que nestes se observava uma inibição na atividade da MMP-2, principalmente na fração compreendida entre 3 e 10 kDa. Deste modo, podemos inferir que a fração que se observa na zimografia reversa poderá ser inibidora da atividade da MMP-2. 4.5. Ensaios celulares Ao longo dos anos tem-se verificado que as MMPs desempenham um papel crucial na remodelação dos tecidos e no desenvolvimento dos órgãos devido à sua função no rearranjo da matriz extracelular. No entanto, apesar desta função essencial, as MMPs também se encontram associadas a processos patológicos uma vez que estas contribuem para a progressão tumoral, quando a sua função ou expressão se encontra alterada(80). Após constatar que o soro do leite de mistura parece ter um efeito inibidor da atividade das gelatinases, principalmente da MMP-2, passou-se para os ensaios celulares de invasão e proliferação celular. Estes foram realizados utilizando a linha celular HT-29. 4.5.1. Proliferação celular A proliferação celular das células estaminais é um fator muito importante nas fases ativas do desenvolvimento e durante a regeneração dos tecidos. No entanto, a proliferação celular desregulada é uma característica das células tumorais. As MMPs têm a capacidade de influenciar a proliferação celular tanto nos processos fisiológicos, como no microambiente tumoral, uma vez que estas 55 podem alterar a biodisponibilidade e a funcionalidade de vários fatores de crescimento reguladores(15, 80, 81). Um exemplo é a ativação proteolítica do TGFβ pelas gelatinases que, numa situação cancerígena, vai ter um efeito de indução tumoral(80). Outro caso é a libertação do fator de crescimento VEGF, pela enzima MMP-9, que estimula a angiogénese tanto em condições fisiológicas como durante o desenvolvimento tumoral(15). Deste modo, para estudar o efeito do soro de leite como potencial inibidor das gelatinases e, consequentemente da proliferação celular, realizou-se o ensaio com MTT. Este permite avaliar a viabilidade celular das células HT-29 após a adição do soro de leite. Os resultados encontram-se ilustrados nas Figuras 14 e 15. Figura 14 – Percentagem de proliferação celular das células HT-29 em relação ao controlo após adição da amostra total do soro de leite de mistura colhida durante a fermentação. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p≤0,05 vs. controlo. Ao realizar o ensaio com a amostra total do soro foi adicionado o volume correspondente a 100 µg de proteína às células HT-29. Como se pode observar na Figura 14, a amostra total apresentou uma inibição da proliferação celular, com significado estatístico (p≤0,05), exceto no soro com 1 dia de fermentação (Dia 1). 0 20 40 60 80 100 120 140 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Proliferação celular % em relação ao controlo Dias fermentação 62 Para poder responder a esta questão foi-se estudar a atividade gelatinolítica do meio das células HT-29 com a presença do inibidor e, para isso, realizaram-se os seguintes ensaios: zimografia gelatinolítica e ensaio da atividade gelatinolítica do meio. 4.5.3. Zimografia gelatinolítica As gelatinases presentes no meio extracelular recolhido do ensaio da invasão celular foram avaliadas através de uma zimografia gelatinolítica. Deste modo, foram realizadas duas zimografias, uma com a amostra total do soro de leite e outra com a fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa (Figuras 20 e 21). Com este ensaio pretendia-se ver se as gelatinases presentes no meio extracelular se encontravam inativas na presença da amostra. Neste caso, ao realizar a eletroforese, as MMPs não conseguiriam degradar a gelatina presente no gel. Figura 20 – Imagem representativa da zimografia gelatinolítica obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v de gelatina). Meio extracelular das células HT-29 recolhido após ensaio da invasão celular com adição de inibidor: amostra total do soro de leite de mistura ao longo da fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). O gel foi corado com Coomassie G. 63 Figura 21 - Imagem representativa da zimografia gelatinolítica obtida por SDS-PAGE (12,5% m/v acrilamida, suplementado com 10% m/v de gelatina). Meio extracelular das células HT-29 recolhido após ensaio da invasão celular com adição de inibidor: fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo da fermentação. Coluna M: marcadores de massa molecular (kDa). O gel foi corado com Coomassie G. As zimografias representadas pelas Figuras 20 e 21 demonstram que o meio extracelular das células HT-29, recolhido após o ensaio da invasão celular, contém várias espécies gelatinolíticas que correspondem à MMP-2 ativa (64 kDa), à pro-MMP-2 (72 kDa), à MMP-9 (83 kDa) e à pro-MMP-9 (92 kDa)(15, 79). Ao comparar o controlo com as amostras onde foi adicionado soro de leite, podemos observar que não houve uma diminuição da atividade destas enzimas, exceto no soro não fermentado (Dia 0). O soro não fermentado apresentou uma diminuição de 10% na amostra total e de 13 % na fração molecular compreendida entre 3 e os 10 kDa, quando comparado com o respetivo controlo. A intensidade das bandas da MMP-2 ativa, da pro-MMP-2, da MMP-9 ativa e da pro-MMP-9 do meio contendo a amostra foram medidas por densitometria e os valores normalizados em relação ao controlo (meio extracelular sem presença da amostra). Estes resultados indicam que as gelatinases presentes no meio extracelular degradaram a gelatina presente no gel, ou seja, que as gelatinases se encontravam ativas. Porém, apesar destes resultados demonstrarem que as gelatinases se encontravam ativas na presença da amostra, o soro do leite demonstrou uma 64 inibição na invasão e proliferação celular. Para tentar perceber melhor o mecanismo subjacente a esta inibição, realizou-se ainda outro ensaio para avaliar a atividade gelatinolítica do meio extracelular. 4.5.4. Atividade gelatinolítica com meio extracelular das células HT-29 Realizou-se então o ensaio de avaliação da atividade gelatinolítica com o meio extracelular extraído das células HT-29. Para isso foram adicionados 100 µL do meio extracelular e 100 µL do substrato gelatina DQ, de modo a observar novamente se as gelatinases presentes no meio iriam ou não degradar o substrato, ou seja, se estavam ou não ativas. Os resultados encontram-se ilustrados nas Figuras 22 e 23. Figura 22 – Atividade gelatinolítica (% em relação ao controlo) do meio extracelular, das células HT-29, com amostra total do soro de leite de mistura ao longo da fermentação. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p ≤0,05 vs. Controlo. Ao juntar o meio extracelular que continha, como inibidor, a amostra total do soro do leite, podemos observar pela Figura 22 que houve um ligeiro grau de inibição da degradação da gelatina pelas gelatinases existentes no meio. No 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Atividade Gelatinolítica % em relação ao controlo Dias de Fermentação 65 entanto, além de ter sido uma ligeira inibição também não teve uma diferença significativa quando comparada com o controlo. Figura 23 – Atividade gelatinolítica (% em relação ao controlo) do meio extracelular, das células HT-29, com fração molecular compreendida entre 3 e 10 kDa do soro de leite de mistura ao longo da fermentação. Os valores são apresentados em média ± desvio padrão; * p≤0,05 vs. controlo. Ao realizar o mesmo ensaio com a fração de baixa massa molecular do soro de leite (3 a 10 kDa) é possível observar, através da Figura 23, que esta fração não apresenta inibição da atividade gelatinolítica. Deste modo, é possível constatar que, uma vez que houve degradação do substrato gelatina DQ, as gelatinases presentes no meio extracelular, retirado do ensaio da invasão celular, se encontravam ativas na presença das amostras estudadas. Assim, analisando os resultados de ambos os ensaios, da zimografia gelatinolítica e da atividade gelatinolítica com o meio extracelular, podemos constatar que as gelatinases presentes no meio se encontravam ativas na presença do soro de leite. No entanto, quando adicionado nos ensaios da 0 20 40 60 80 100 120 Controlo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Atividade gelatinolítica % em relação ao controlo Dias de Fermentação 66 proliferação e invasão celular, o soro do leite apresentou realmente uma inibição destas atividades. Esta situação poderá ter duas explicações. Por um lado, a inibição apresentada nos ensaios da invasão e proliferação celular poderá ser devido à inibição das MMPs. No entanto, a ligação entre o inibidor e a enzima (MMP) poderá não ser uma ligação covalente e, deste modo, ser reversível. Neste caso, ao realizar a zimografia gelatinolítica, o complexo inibidor-enzima, em contacto com o SDS presente no gel, poderá ter-se separado ficando assim a enzima disponível para degradar o substrato. Neste caso, a inibição que ocorreu nos ensaios da invasão e proliferação celular poder-se-á dever realmente à inibição das gelatinases. Por outro lado, a inibição que ocorreu na invasão e proliferação celular com a adição do soro do leite poderá não estar relacionada com a inibição das MMPs. Apesar dos ensaios realizados sugerirem que, in vitro, o soro do leite tem inibição nas gelatinases, principalmente na MMP-2, a concentração adicionada nos ensaios da invasão e proliferação celular, 100 µg de proteína por 100 µL, pode não ter sido suficiente para ter efeito ou, em ensaios celulares não ocorrer o mesmo efeito inibitório que se verifica nos kits com as enzimas com origem comercial. A inibição da invasão e proliferação celular pode ocorrer devido a outros mecanismos que não a inibição das metaloproteinases de matriz. A atividade das lectinas, por exemplo, que podem reconhecer o glicoma alterado na superfície das células tumorais malignas e levar eventualmente à morte celular programada por apoptose e autofagia, pode ser reconhecida como terapia antineoplásica(82). Estudos realizados por outros trabalhos no nosso laboratório (dados não mostrados) com o soro de leite (do Dia 0 ao Dia 3) constataram que as suas proteínas e polipéptidos têm a capacidade de se ligarem às membranas 67 das células HT-29. Esta poderá ser então outra possível explicação para os resultados obtidos, o que poderá até explicar porque é que a inibição é maior na proliferação celular quando comparada com a invasão. 4.6. Avaliação do potencial bioativo do soro de leite no cancro coloretal – Considerações finais Como acima descrito, a fermentação do soro de leite resulta na hidrólise das parcial ou total das suas principais proteínas, podendo provocar a libertação e consequente acumulação de sequências peptídicas específicas com efeitos benéficos para a saúde. Como descrito por vários autores, as proteínas do soro e do seu hidrolisado têm um efeito redutor na incidência de tumores intestinais em animais(58, 59, 61-64), no entanto, o mecanismo subjacente ainda se encontra por esclarecer. Como se pode constatar pelos resultados apresentados neste trabalho, o soro de leite, fermentado e não fermentado, pareceu de facto ter um efeito na inibição das gelatinases, principalmente na MMP-2. Começando por analisar os resultados do soro de leite não fermentado (Dia 0), podemos constatar que este apresentou uma inibição da atividade da MMP-2, não tendo acontecido o mesmo com a MMP-9. O soro não fermentado também apresentou uma inibição da invasão celular; contudo, esta apenas ocorreu com a amostra total e não com a fração de baixa massa molecular. Relativamente à proliferação celular, esta também sofreu uma inibição, mais marcada na amostra total quando comparada com a fração de 3 a 10 kDa. Isto indica que esta atividade inibitória poderá ser devida às proteínas de elevada massa molecular existentes apenas no Dia 0: a LF, a BSA ou, ainda, as imunoglobulinas. Após 68 análise dos cromatogramas obtidos por HPLC, é possível comprovar que tanto a BSA como a LF desaparecem logo durante o primeiro dia de fermentação. Isto sugere que a atividade inibitória da invasão e proliferação celular poderá estar relacionada com estas proteínas, uma vez que apenas estão presentes no Dia 0. Estes resultados são coincidentes com estudos já realizados com a LF e a BSA, anteriormente descritos, tendo a LF, bem como o péptido resultante da sua hidrólise parcial, a lactoferricina, demonstrado uma atividade citotóxica para diferentes tipos de linhas celulares(83-86) e a BSA apresentado um efeito de inibição da proliferação celular ao inibir o crescimento de uma linha celular do cancro da mama(50). Relativamente ao soro de leite fermentado constatou-se que este não teve efeito na inibição da atividade da MMP-9. No entanto, relativamente à MMP-2, a amostra total demonstrou uma ligeira inibição da atividade desta enzima e a amostra entre os 3-10 kDa demonstrou uma inibição ainda mais elevada em comparação à primeira. Estes resultados sugerem que os polipéptidos libertados durante a fermentação poderão ter um efeito inibitório da enzima MMP-2 e, deste modo, o processo fermentativo realizado durante 6 dias demonstra trazer benefícios no efeito anti-tumoral do soro do leite. Ao estudar o seu efeito na invasão celular constatou-se que apenas a fração de baixa massa molecular, e nos últimos dias de fermentação, é que demonstrava uma ligeira inibição nesta atividade contudo, sem significado estatístico. Por outro lado, a inibição da proliferação celular aumentou ao longo dos dias da fermentação do soro e foi consistente tanto para a amostra total como para a fração entre os 3 e 10 kDa, tendo sido maior na última. Estes dados sugerem que os polipéptidos libertados pela fermentação do soro do leite têm um 69 efeito na inibição da proliferação celular e na invasão celular. Estes resultados vão ao encontro da ação já conhecida da α-LA, que demonstrou possuir um efeito anti-proliferativo em linhas celulares de adenocarcinomas do cólon (HT-29)(49). Estes resultados parecem então sugerir que os péptidos libertados durante a sua hidrólise poderão exercer o mesmo efeito. Estes resultados são coincidentes com os resultados obtidos por Kimora e colegas (2014) que, ao estudarem o efeito das proteínas do soro de leite nas mudanças cutâneas induzidas por radiação ultravioleta B (UVB), observaram que havia uma redução significativa da MMP-2 ativa após a administração oral das proteínas do soro. Também observaram que existia inibição da pro-MMP-9. Concluíram então que as proteínas do soro do leite preveniam a degradação do colagénio tipo IV, a angiogénese, proliferação e o dano no ADN causados pela radiação UVB(87). Deste modo, a fermentação do soro de leite pelas BAL e consequente uso pode ser uma forma interessante e alternativa à eliminação do soro do leite, que tem vindo a levantar tantos problemas. Como podemos constatar pelos resultados deste estudo e de outros já realizados, o processo fermentativo realizado durante 6 dias parece levar à libertação de vários péptidos bioativos – como podemos observar no perfil proteico do soro e nos cromatogramas obtidos por HPLC, que têm diferentes sensibilidades. Este aumento da libertação de péptidos bioativos é coincidente com a inibição da MMP-2, com a inibição da invasão celular e, principalmente, com a inibição da proliferação celular. Estes resultados são coincidentes com os resultados obtidos por Rachid e colegas (2006) que constataram que leite fermentado com L. helveticus diminuia o crescimento de tumores mamários em ratos(54) ou, ainda, os resultados obtidos por Biffi e colegas 70 (1997) que demonstraram um efeito anti-proliferativo do leite fermentado por BAL numa linha celular do cancro da mama, tendo associado este efeito a um composto solúvel produzido pelas bactérias lácticas durante o processo fermentativo(57). Além disso, a fermentação do soro leva a um maior valor nutricional. Além da capacidade anticancerígena das suas proteínas e péptidos, a degradação das principais proteínas faz com que estas não tenham o seu potencial alergénico, tenham uma maior digestibilidade e haja um aumento no conteúdo de aminoácidos livres. Além disso, as BAL têm a capacidade de diminuir a concentração de lactose presente no meio (72). No entanto, os benefícios do soro do leite fermentado não se devem apenas à formação dos péptidos bioativos. Devido ao seu importante papel na prevenção do CCR, as BAL têm vindo a ser estudadas como potencial método terapêutico, uma vez que estas inibem a iniciação e progressão da carcinogénese por diversos mecanismos. Alguns estudos demonstram que as BAL têm um papel na regulação da apoptose celular por vias intrínsecas e extrínsecas, um mecanismo potencialmente crítico na prevenção do CCR. Além disso, encontramse envolvidas em mais mecanismos celulares e moleculares que estão envolvidos na prevenção do CCR como efeitos anti-oxidantes, respostas imunes ou, ainda, através da epigenética(52). Assim, é possível constatar com este trabalho, que o processo fermentativo é benéfico quando realizado no soro do leite de mistura e quando este ocorre durante 6 dias. 71 No entanto, é preciso ter em consideração determinados fatores que poderão ser importantes no uso das proteínas e polipéptidos do soro de leite na prevenção ou terapêutica da doença oncológica. Em primeiro lugar é importante estudar a sua digestibilidade e biodisponibilidade. Os péptidos bioativos são péptidos que têm uma atividade de tipo hormonal ou medicamentosa e que têm a capacidade de modular funções fisiológicas através da sua ligação a recetores específicos nas células alvo(74). No entanto não é possível estabelecer uma relação direta entre a atividade obtida em ensaios in vitro e os mecanismos destes péptidos in vivo. A digestão, que desempenha um papel chave na formação, mas também, na degradação dos péptidos bioativos, e a sua absorção no trato gastrointestinal são essenciais e determinantes para que ocorra o seu efeito no organismo. Esta questão tem sido bastante estudada em relação aos péptidos bioativos com atividade antihipertensiva tendo já vários estudos demonstrado que estes são absorvidos, exercendo assim a sua função no organismo(88-91). Esta questão é de extrema importância uma vez que o grande impedimento para que as proteínas e os péptidos possam modular os processos de carcinogénese é a sua suscetibilidade relativamente à digestão gastrointestinal, o que resulta na redução dos seus efeitos bioativos(92). Outro fator importante a ter em consideração reside na própria inibição das MMPs. Como já descrito os primeiros ensaios clínicos a serem realizados com os primeiros inibidores sintéticos das MMPs (MMPIs) não tiveram sucesso uma vez que os resultados foram ineficazes e apresentaram efeitos secundários prejudiciais(93, 94). Uma vez que vários estudos tinham demonstrado a importância das MMPs como alvo para o desenvolvimento de novas terapêuticas anti- 78 28. Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science. 2002; 295(5564):2387-92. 29. Cragg GM, Newman DJ. Plants as a source of anti-cancer agents. J Ethnopharmacol. 2005; 100(1-2):72-9. 30. Cho E, Smith-Warner SA, Spiegelman D, Beeson WL, van den Brandt PA, Colditz GA, et al. Dairy foods, calcium, and colorectal cancer: a pooled analysis of 10 cohort studies. J Natl Cancer Inst. 2004; 96(13):1015-22. 31. Huncharek M, Muscat J, Kupelnick B. 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