Porquê Citologia? A experiência de um clínico em autoformação - Mastocitomas caninos: mais além no diagnóstico citológico.

Relatório Final de Estágio Mestrado Integrado em Medicina Veterinária PORQUÊ CITOLOGIA? A EXPERIÊNCIA DE UM CLÍNICO EM AUTOFORMAÇÃO MASTOCITOMAS CANINOS: MAIS ALÉM NO DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO Paula Cristina de Jesus Vilaça Macieira Orientador Prof. Doutor Ricardo Jorge Pereira Córdova Marcos Co-Orientadora Mestre Marta Susana Amaro dos Santos Porto 2014 II III Relatório Final de Estágio Mestrado Integrado em Medicina Veterinária PORQUÊ CITOLOGIA? A EXPERIÊNCIA DE UM CLÍNICO EM AUTOFORMAÇÃO MASTOCITOMAS CANINOS: MAIS ALÉM NO DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO Paula Cristina de Jesus Vilaça Macieira Orientador Prof. Doutor Ricardo Jorge Pereira Córdova Marcos Co-Orientadora Mestre Marta Susana Amaro dos Santos Porto 2014 IV V “A grandeza de uma nação pode ser julgada pelo modo que seus animais são tratados.” Mahatma Gandhi (1869 – 1948) VI VII RESUMO Nos últimos sete anos, enquanto Médica Veterinária numa clínica de pequenos animais, muitos foram os desafios a que fui exposta. Este foi mais um em que me propus arriscar. Terminei a minha Licenciatura, no ICBAS em Dezembro de 2008 e depois de procurar trabalho, em diversas Clínicas Veterinárias, acabei por ser aceite na Clínica Veterinária das Oliveiras, onde trabalho desde Fevereiro de 2009. Ao longo destes anos, muito tenho aprendido e crescido com as minhas colegas de trabalho. Depois de também ter realizado algumas pequenas formações na área laboratorial e de medicina interna, achei que estaria na altura de pedir esta equivalência ao Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, por uma questão de desafio pessoal, mas ao mesmo tempo como uma forma de crescimento dentro desta área. O presente trabalho tem como objetivo, realizar uma pequena retrospetiva no meu percurso enquanto Médica Veterinária de animais de companhia, com um gosto especial pela citologia. Enquanto em fase de formação, desenvolvi um gosto especial por esta área, na qual realizei parte do meu estágio curricular. Depois de terminado o estágio, continuei a desenvolver este gosto pelo laboratório na clínica onde exerço. Aqui, neste trabalho, fiz uma pequena revisão do que tenho vindo a realizar. Não estão descritos todos os casos que encontrei, mas alguns dos mais importantes. Obviamente, seria impossível colocar um pouco de todos. Consciente que muito faltará descrever, fica aqui apenas um pequeno resumo do que tenho feito e do quão importante foi para mim este percurso. Numa segunda parte deste documento, e porque é importante crescer, está descrito uma introdução e os resultados preliminares de um trabalho que continuará a ser desenvolvido, com o meu Orientador e Co-orientadora, num futuro próximo. Consiste numa abordagem diferente aos mastocitomas caninos. Tratam-se dos “grandes imitadores” em veterinária, e dos mais importantes que podemos diagnosticar citologicamente, daí o desafio de ir mais além no seu diagnóstico citológico, no sentido de tentar dar mais respostas. Com um diferente método de coloração, que permite uma melhor avaliação dos núcleos e nucléolos, e com uma ferramenta quantitativa estereológica (nucleator) procurámos obter mais informação que poderá ajudar a estabelecer o prognóstico do animal e a escolher o tratamento mais adequado. VIII IX AGRADECIMENTOS Todos os que nos acompanham têm um papel importante neste período, contribuindo para a nossa formação. Cada um saberá como a sua ajuda foi essencial para ultrapassar momentos menos positivos, ou como contribuiu para a pessoa e profissional que sou. Não posso deixar de salientar... Os meus orientadores, Prof. Dr. Ricardo Marcos e Mestre Marta Santos, pelos conselhos, sabedoria, acompanhamento, disponibilidade e empenho infindável e sobretudo pelo apoio e por acreditarem em mim e tornarem possível a realização deste trabalho, que sem eles não se teria realizado. Muito Obrigada! O Prof. Dr. Pablo Payo, pois desde cedo foi dos grandes contribuidores da minha formação e sempre acreditou em mim, o meu sincero Obrigada! As minhas colegas de trabalho, Dra. Raquel Vieira Fernandes e Dra. Cátia Mota e Sá, por me darem asas para continuar a minha formação e acreditarem no meu trabalho, Obrigada! A minha amiga e colega de trabalho Paula Oliveira, pelo companheirismo constante, pelo apoio, por me ouvir nos momentos mais difíceis, e me incentivar a continuar e não desanimar, o meu sincero Obrigada! As Dra. Lucília Freitas e Dra. Juliana Rego, pela amizade e companheirismo, Obrigada! Aos estagiários, que por cá passaram, Fernanda, Carlos, Mário, Patrícia, Julieta, Rui, Ricardo, pelas brincadeiras que animaram os dias de trabalho. Obrigada! Os mais importantes de todos, meus queridos pais, por serem inigualáveis, quem mais admiro e a quem devo tudo o que sou. Sem eles nada disto teria sido possível. Não existem palavras para vos agradecer. À minha filhota Maria, que apesar de pequenina compreendeu que a mãe não lhe conseguia dar tanta atenção nesta fase e por ser o que mais amo e me dá força para continuar. 4 reconhecer que assim aconteceu. Adquiri, horas após horas, sozinha, frente ao microscópio, confiança, segurança e destreza. Os orientadores estavam só para resolver as minhas dúvidas. Tendo tudo isto em consideração, o meu relatório de estágio mostrou pura e simplesmente os resultados obtidos durante a minha aprendizagem. Em cada semana este peculiar método de estágio era fortemente posto a prova. Em cada semana os meus orientadores dedicavam uma sessão à minha avaliação simulando em todo momento as futuras condições de trabalho 2 de um citologista. Era-me apresentada uma história clínica dum animal com a sua correspondente preparação citológica. Eu, desde a primeira semana, não deveria fazer unicamente o diagnóstico mas deveria elaborar, de modo totalmente autónomo um relatório citológico com as minhas conclusões. Enviaria depois à minha orientadora, exatamente do mesmo modo que faria no futuro, caso trabalhasse como uma citologista veterinária. Na sessão seguinte a minha orientadora, Dra. Carmo Topa, indicar-me-ia os pontos fortes e fracos do meu trabalho para poder corrigi-los em futuras avaliações. No princípio os relatórios e os problemas apresentados eram mais simples, no entanto o tempo que demorava em elaborá-los era considerável. Aprender sozinha, de forma autónoma como elaborar as minhas dúvidas, como “fotografar” as minhas questões, como focalizar os pontos da citologia que me apresentavam, foi um desafio. Aos meus orientadores, que faziam o papel de futuros “expert” por mim consultados, não poderia apresentar-lhes a questão como “não sei o que é esta citologia”. Deveria, pelo contrário, apresentar problemas concretos, documentados digitalmente, especificando por escrito quais eram as minhas dúvidas, problemas e obstáculos diagnósticos. O intuito era identificar os pontos críticos durante a minha aprendizagem para resolver as dúvidas com uma metodologia “cirúrgica” adaptada às necessidades específicas deste processo educativo. Se não tinha dúvidas concretas, os meus orientadores não resolveriam problemas de tipo “genérico”. Aprender a isolar as minhas inseguranças perante uma citologia específica, delimitar as questões problemáticas e conseguir “fotografá-las”, expressando-as por escrito de modo conciso e breve foi uma prioridade. Sem dúvida, no início foi um trabalho árduo. Comecei insegura e com dúvidas se conseguiria fazê-lo. No fim, a minha segurança era maior e à medida que avançava no meu estágio, a minha capacidade de realizar diagnósticos mais complexos foi aumentando e o tempo dispensado para cada citologia era mais razoável. Com este modelo de estágio tentou-se desenvolver principalmente as seguintes competências (Quadro 1), de acordo com a Classificação de objetivos de formação e segundo as recomendações da normativa europeia -Projecto TunningConcepts and Proposals such as 2 Princípio de contextualização: teoria educativa que assume que quanto mais próxima está a situação de aprendizagem de uma situação real, mais fácil será a aquisição e posterior aplicação dos conhecimentos e das capacidades adquiridas. 5 the expected profile of a 21 st century veterinary surgeon. Practically-based Veterinary Knowledge and General Veterinary Knowledge. Quadro 1: Competências na área de citologia. COMPETÊNCIAS GENÉRICAS (CG) OU TRANSVERSAIS (área de citologia) Em negrito as competências mais destacadas e potenciadas neste modelo de estágio. CG 1.- Capacidade d e aplicar os conhecimentos na prática . CG 2.- Planificação e gestão do tempo. CG 3.- Conhecimentos gerais e básicos sobre a área de trabalho. CG 4.- Capacidade de investigação. CG 5.- Capacidade de aprender. CG 6.- Capacidade de gestão de informação (habilidade para procurar e analisar a informação proveniente de diversas fontes) CG 7.- Capacidade crítica e autocrítica. CG 8.- Capacidade de adaptação a novas situações. CG 9.- Capacidade para gerar novas ideias. CG 10.- Resolução de problemas. CG 11.- Tomada de decisões. CG 12.- Trabalho em equipa. Esta era composta pelos clínicos que me forneciam as amostras, os meus orientadores, Dra. Carmo Topa e Prof. Dr. Pablo Payo, os Técnicos Carlos Frias e Verónica Santos e eu mesma, como elemento que aprendia e fornecia os diagnósticos. Esta equipa constituía um ecossistema fundamental para desenvolver estas competências. CG 13.- Capacidade de se relacionar com outras pessoas. CG 14.- Capacidade para trabalhar de forma autónoma. CG 15.- Preocupação pela qualidade. CG 16.- Desejo de superação. COMPETÊNCIAS ESPECÍFICAS (CE) DISCIPLINARES e PROFISSIONAIS (saber e saber fazer): CE 1.- Conhecer os método s para recolher amostras citológicas e a sua interpretação com o seu correspondente relatório. CE 2. - Saber avaliar, em primeiro lugar a qualidade de uma amostra citológica, reconhecendo as potenciais causas de má qualidade das amostras. CE 3. - Saber reconhecer os processos citológicos mais importantes. CE 4. - Saber reconhecer os processos citológicos mais frequentes. CE 4.1.- Saber reconhecer/diferenciar processos neoplásicos / inflamatórios. 6 Este estágio dentro desta metodologia acabou por ser uma rampa de lançamento para o trabalho que tenho vindo a desenvolver. Não só por ter acrescentado conhecimento a nível de citologia, mas também por me preparar para trabalhar sozinha. Penso que a citologia veio trazer mais-valias ao meu trabalho enquanto clínica de pequenos animais. Embora ainda com pouca experiência, tem sido um ponto a favor desde o inicio do meu trabalho enquanto profissional. Inicialmente, comecei por fazer apenas citologias de canal auditivo, sedimentos urinários e raspagens de pele. Aos poucos as minhas colegas da clínica acabaram por ganhar confiança no meu trabalho e no presente momento, só são enviadas para um laboratório exterior as citologias de medula óssea, líquido cefalorraquidiano e uma ou outra citologia em que eu tenha dúvidas. Continuo a usar o mesmo método com que aprendi citologia, e ainda hoje os meus relatórios contêm imagens (em anexo). Na minha opinião acaba por ser importante para o dono do animal (por mais que a linguagem seja técnica) perceber o porquê do tratamento e ficam curiosos com as imagens, alguns chegam mesmo a pedir as imagens para si. No inicio o microscópio que usava era mais limitado, com uma capacidade de campo mais estreito (UTA ® technic) e a imagem obtida não apresentava tanta definição como o que agora uso, mas com o qual consegui trabalhar bem (Figura 1). Figura 1: Microscópio utilizado pelo autor durante o início da prática clínica. 7 Com o passar do tempo, e havendo cada vez mais o serviço de citologia na clínica, achou-se oportuno e rentável comprar um novo microscópio (Figura 2). Tenho conseguido fazer um pequeno arquivo das lâminas que vou vendo. Estas não só servem para a aprendizagem, mas também consigo usá-las para obter segundas opiniões dos casos que vou tendo algumas dúvidas. A minha maior experiência é, sem dúvida, em nódulos cutâneos, em que consigo dar uma resposta célere ao clínico (muitas vezes sou eu própria clínica e citologista), ao dono e também ao cirurgião, se for esse o caso. Tem sido gratificante a experiência que vou tendo: as minhas colegas estão contentes e reconhecem o meu trabalho, que apesar de ser algo recente, já começa a dar frutos e até mesmo vantagens económicas para a clínica. Para enriquecer os meus conhecimentos, e no fundo ter mais experiência de visualização ao microscópio, uso muitas vezes as peças de exérese cirúrgica para realizar citologia. Deste modo treino, para assim fazer cada vez mais e melhores diagnósticos, podendo depois confrontar o meu relatório com a resposta da histopatologia. Assim consigo perceber a minha acuidade em termos de diagnóstico citológico. A experiência tem demonstrado que a citologia tem a sua maior vantagem quando realizada na clínica, obtendo-se aí um maior proveito em termos de diagnóstico. O facto de não termos que recorrer a um laboratório exterior (exceto em casos pontuais), foi sem dúvida mais rentável, quer para a clínica, quer para o dono, que assim usufrui de um serviço mais eficaz e económico. O facto de ter aprendido de um modo e-learning, veio também transformar o meu método de trabalho ainda hoje, pela forma como me foi ensinado a realizar o meu trabalho sozinha. Já as fotografias dos casos, facilitam o esclarecimento de dúvidas que possa ter (pedir uma segunda opinião) e são uma mais-valia para o dono (cada vez mais preocupado e atento, Figura 2: Vista geral do laboratório na Clínica Veterinária das Oliveiras e arquivo de lâminas mais importantes, montadas com Entellan ® . 8 acaba por se sentir “agraciado” e gosta de entender o que se passa com o seu animal de estimação). Quando falamos a nível de sedimento urinário, raspagens de pele (Figuras 3 e 4), então é que seria impensável ter que recorrer ao exterior para a sua avaliação. Assim, consegue-se dar a resposta quase no momento e tomar decisões clínicas de um modo mais eficaz. Podemos ver alguns exemplos de diagnósticos realizados por mim. A nível dermatológico a citologia também consegue ajudar a saber se o animal apresenta prurido, mesmo quando o proprietário nos diz que tal não acontece. A título de exemplo, fica o fato de que quando se encontram Simonsiellas (Figura 5), que são bactérias características da cavidade oral e orofaringe, em lesões de pele consegue-se perceber que o animal tem andado a lamber a lesão, apresentando por isso prurido. Figura 3: Ácaros Sarcoptes scabiei (Objetiva 10x). Figura 4 : Ácaros Demodex canis (Objetiva 10x). 9 Nos últimos 6 anos tenho observado uma média de 187 casos de citologia por ano. Esta casuística não é homogénea durante os anos. Será importante referenciar que no primeiro ano (2009) apenas comecei a realizar citologias a partir de Abril, e que em 2014 estão incluídos os casos até Julho. É importante mencionar que a casuística foi crescendo ao longo dos anos, isto é, enquanto que em 2009 foram visualizados cerca de 40 casos, já em 2013 foram cerca de 110 casos vistos. Entre os tipos de amostras citológicas que vão surgindo na minha prática clínica, tanto a raspagem de pele como o sedimento urinário são dos exames mais realizados (Gráfico 1). Também em destaque estão a citologia aspirativa de agulha fina (CAAF) de nódulos cutâneos e a citologia do canal auditivo. Não posso deixar de dar ênfase, ao fato de também realizar coprologias na clínica. Um dos parasitas mais encontrados é o Tricuris (Figura 6). Figura 5: Simonsiella spp numa citologia aposicional interdigital (seta) Diff-Quik (Objetiva 100x). Gráfico 1: Casuística observada pelo autor na Clínica Veterinária das Oliveiras. 10 O sedimento urinário tem grande relevância na prática clínica, tal como é demonstrado na casuística de citolgias. Este sedimento deve ser observado a fresco e de imediato (Figuras 7 e 8), sob pena dos cilindros e cristais se poderem dissolver. Como se pode observar pelos dados anteriores, a observação ao microscópio tem feito parte da minha prática de pequenos animais, tendo-me ajudado a conseguir fazer diagnósticos clínicos de uma forma mais célere e eficaz. Esta realidade deixou de ser válida não só para mim, uma vez que se tem estendido aos restantes elementos da Clinica Veterinária das Oliveiras, local onde trabalho desde que terminei o curso. Posso dizer que no ínicio, apenas visualizava sozinha citologias de canal auditivo, raspagens de pele e raras citologias de pele. As citologias de massas, esfregaços de sangue e restantes, embora guardasse uma lâmina para mim, também eram enviadas para um laboratório externo à Clínica (ou seja, recurso ao exterior quase numa proporção de 1:1). Ao longo dos anos e com a minha experiência enquanto “citologista” a aumentar, não enviamos nenhum material para o exterior, a não ser que sejam dúvidas pontuais (citologias de orgãos) e em casos que não me sinta confortável a visualizar ou emitir um diagnóstico (medula óssea e liquido cefalorraquidiano). Figura 6: Ovo de Trichuris canis (Objetiva 10x). Figura s 7 e 8: Eritrócitos (seta preta), leucócitos (seta vermelha), cristais de estruvite (seta azul) e cristais de oxalato (seta verde), em dois sedimentos urinários (Objetiva de 40x e de 100x, respetivamente na imagem da esquerda e direita). 11 É consensual que a citologia tem particular utilidade na dermatologia de pequenos animais. Num total de 473 casos, entre os quadros dermatológicos e nódulos cutâneos de cães e gatos, o diagnóstico mais frequente foi de etiologia inflamatória (piodermas/dermatites), mas muito próximo das neoplasias cutâneas diagnosticadas (Gráfico 2). Pode notar-se uma predominância das piodermas como o diagnóstico mais realizado, bem como infeções, normalmente não como causa primária, por Malassezia spp. No gráfico 2, encontram-se também incluídos casos em que não obtive um diagnóstico conclusivo, este deve-se a vários factores, entre os mais comuns, posso incluir: amostras pouco representativas e contaminação sanguínea. Estes gráficos, têm como objectivo fazer uma retrospetiva do trabalho que tenho vindo a desenvolver, de uma forma autónoma após ter terminado o curso. Foram vários os diagnósticos citológicos de neoplasias cutâneas de cães e gatos que proferi nos últimos 6 anos (Gráfico 3; Figuras 9, 10 e 11). Gráfico 2: Casos de dermatológicos diagnosticados por citologia, pelo autor ao longo destes 6 anos. 12 Num total de 90 casos, pela análise do gráfico, pode-se afirmar que os lipomas são o diagnóstico mais comum, bem como os quistos epidérmicos e os carcinomas de células escamosas (Figuras 9 e 10). Esta predominância de lipomas vai de encontro à bibliografia existente: em 218 lesões analisadas por citologia que tiveram diagnóstico definitivo, 48% correspondiam a lipomas (Skeldon & Dewhurst, 2009). A mesma concordância não acontece, quando olhamos para o segundo lugar, pois nos meus casos surge o carcinoma das células escamosas; tal acontece devido ao elevado número de gatos incluidos na amostra. Gráfico 3: diferentes diagnósticos citológicos, em cães e gatos, realizados ao longo destes últimos 6 anos. Figura 9 e 10: Carcinoma de Células Escamosas, da cavidade oral num gato, colhida realizada por CAAF. Diff-Quik Objetiva de 4x (Imagem da esquerda); Objetiva de 100x (imagem da direita). 13 3. INDICAÇÕES DA CITOLOGIA NA PRÁTICA CLÍNICA VETERINÁRIA Dada a acessibilidade direta das lesões para colheita de amostras, a citologia constitui um exame complementar facilmente aplicável em dermatologia (Carlotti, 1992; Fournel-Fleury et al., 1994). Esta técnica é utilizável em todo o tipo de lesões cutâneas que permitam a recolha de material celular. Entre as lesões primárias, escolhidas preferencialmente em relação às secundárias, o exame citológico está especialmente adaptado à avaliação de pápulas, pústulas, vesículas, bolhas, nódulos e tumores; nas lesões secundárias, poderão ser incluídas as erosões, úlceras e fístulas (Marshall, 1992). Embora as informações obtidas não possuam carácter tão específico como o que é conseguido por outros métodos de diagnóstico (cultura fúngica, bacteriana e/ou antibiograma e biópsia), o exame citológico constitui, segundo Scott et al. (1995), o método de diagnóstico de consultório mais satisfatório em dermatologia. Deste modo, o exame citológico pode ser definido como um método complementar de diagnóstico com lugar entre o exame clínico e outros métodos de diagnóstico de maior especificidade, nos quais se inclui a histopatologia, esta com carácter de obrigatoriedade em lesões neoplásicas (Fournel-Fleury et al., 1994). Figura 11 : Histiocitoma canino (DiffQuik, Objetiva de 100x). Figura 12: Citologia de canal auditivo. Otite de origem bacteriana (Diff-Quik , Objetiva de 40x). 20 mastocitomas mais indiferenciados (Figura 17) (Legrand et al., 1987; Zinkl, 1987; Clinkenbeard, 1993; Tvedten, 1994). Na maioria das amostras citológicas de mastocitomas identifica-se, em pano de fundo, grânulos de cor violeta/púrpura resultantes da rotura de células aquando da realização do esfregaço. Esta observação é tão característica que a sua deteção em preparações pouco celulares poderá levantar a suspeita de mastocitoma; já a presença de um infiltrado de eosinófilos, atraídos por fatores quimiotáticos libertados pelos mastócitos, é outro dos achados citológicos característicos de mastocitomas (Barton, 1993; Baker & Lumsden, 2000; Thrall, 2000). Não parece existir uma correlação direta entre o grau de granularidade das células neoplásicas e a presença de eosinófilos (Pulley & Stannard, 1990; Barton, 1993). Ocasionalmente, podem observar-se fragmentos de bandas de colagénio hiperacidófilas em preparações citológicas de mastocitomas. Estas estão relacionadas com a atividade colagenolítica de algumas substâncias libertadas aquando da desgranulação dos mastócitos (Clinkenbeard, 1993). Pelas razões atrás referidas, os mastocitomas são considerados tumores de fácil diagnóstico citológico (Zinkl, 1987; Bostock & Philo, 1991; Clinkenbeard, 1993; Tvedten, 1994; Baker & Lumsden, 2000). Excetuam-se desta generalização os mastocitomas completamente indiferenciados, que revelam ausência ou marcada escassez de granulação no citoplasma, e situações esporádicas de não evidenciação dos grânulos dos mastócitos usando a coloração de Diff-Quik. Esta última questão poderá ser pertinente, uma vez que os mastócitos podem ser confundidos com macrófagos ou plasmócitos, quando não se obtem uma reação metacromática dos grânulos,. Alguns autores referem que tempos prolongados de fixação, de pelo menos 30 segundos, evitam este problema. Na nossa experiência, com a “técnica 1+2+3”, não temos encontrado problemas na identificação dos mastócitos (Marcos & Santos, 2011). No entanto, perante a suspeita de uma má coloração dos mastócitos (por exemplo, num tumor de células redondas em que se suspeite de mastocitoma pouco diferenciado), deve usar-se uma Figura 17: Diminuição das granulações citoplasmáticas e maior evidência dos núcleos num mastocitoma pouco diferenciado (Diff-Quik, Objetiva 100x) . 21 coloração tipo Romanowsky mais elaborada e sensível para estas células (por exemplo, MayGrünwald Giemsa ou apenas o Giemsa) (Marcos & Santos, 2011). Ainda assim, um exame citológico exaustivo permite quase sempre a identificação de alguns grânulos e o diagnóstico desta neoplasia (Cowell & Tyler, 1989; Tyler et al., 1999; Baker & Lumsden, 2000, Marcos & Santos, 2011). A terapêutica deverá ser cirúrgica, com ampla margem de segurança, e eventualmente complementada com quimioterapia (Marcos & Santos, 2011). 2. COLORAÇÃO DE AZUL DE TOLUIDINA E SUA APLICAÇÃO EM MASTOCITOMAS 2.1 Introdução e objetivo A utilização de colorações especiais em citologia veterinária poderá ser importante quando se pretende confirmar a natureza de determinado pigmento (melanina, hemossiderina), substância extracelular (como a amilóide ou matriz mucinosa) ou ainda secreção presente em lesões epiteliais  aumentado assim a informação gerada pelo exame citológico. Foi demonstrado previamente que a maioria das colorações especiais poderá ser aplicada em preparações citológicas previamente coradas com Diff-Quik após descoloração com solução de álcool-ácido ou, em alguns casos, diretamente sobre a lâmina (Marcos et al., 2009). O Azul de Toluidina é bastante usado em histopatologia para corar mastócitos e mucopolissacarídeos. Em citologia, o Azul de Toluidina tem sido proposto como uma forma de triagem para esfregaços de efusões pericárdicas e pleurais, mas o seu uso mais amplo é na coloração de mastócitos (Leclere et al., 2006; Marcos & Santos, 2011). Com esta coloração, os grânulos dos mastócitos ficam corados de vermelho púrpura, tanto mais intenso quanto mais próximos e maiores forem os grânulos. Em contraste com o Diff-Quik, esta coloração realça a metacromasia dos grânulos deste tipo de células, apesar de globalmente demonstrar menor afinidade para os grânulos. No entanto, esta menor afinidade (aparentemente uma desvantagem) permite uma melhor avaliação do detalhe nuclear e nucleolar, mesmo em mastocitomas muito granulares (Marcos, comunicação pessoal). O objetivo deste trabalho é aplicar a coloração de Azul de Toluidina a preparações citológicas de mastocitomas e fazer uma avaliação das características nucleares dos mastócitos neoplásicos. Pretende-se avaliar, de forma preliminar (usando para isso um pequeno número de casos, Tabela 1) se a morfologia nuclear e nucleolar varia consoante o grau de diferenciação dos mastocitomas avaliados na coloração de Diff-Quik. Com o presente trabalho pretende-se acrescentar informação à avaliação citológica dos mastocitomas, acreditando que a informação recolhida poderá vir a revelar-se importante para a classificação citológica e idealmente para a definição do prognóstico da neoplasia. 22 A relação entre o grau de diferenciação citológico dos mastocitomas e a avaliação dos parâmetros nucleares tem sido alvo de estudo por diversos autores (Vico, 2002; Strefezzi et al., 2003, 2009). No trabalho de Vico (2002), os parâmetros nucleares foram avaliados por morfometria em esfregaços citológicos e histológicos e revelaram-se equivalentes. De modo semelhante, Strefezzi et al. (2003) tentou estabelecer uma relação entre a morfometria nuclear dos mastócitos e a sua gradação histológica. Num artigo dos mesmos autores, em 2009, é afirmado que a morfometria nuclear em preparações citológicas, pode prever o comportamento biológico de mastocitomas cutâneos em cães, ajudando assim a produzir um diagnóstico mais útil em termos de prognóstico. 2.2 Material e Métodos Foram selecionados retrospetivamente 8 casos citológicos diagnosticados como mastocitoma e cujo diagnóstico foi confirmado por histopatologia. Foram incluídos na amostra neoplasias de diferentes graus de diferenciação em termos citológicos. As preparações citológicas coradas por Diff-Quik foram observadas no sentido de rever o diagnóstico e o grau de diferenciação, fotografar e selecionar a lâmina para depois realizar a coloração com Azul de Toluidina. Foi realizada uma pré-avaliação e seleção das lâminas, que se encontra resumida na Tabela 1. Identificaçã o do c aso Número de registo Grau diferenciação citológico Grau histológico 1 475/13 Moderadamente diferenciado II 2 164/13 Pouco diferenciado III 3 89/13 Moderadamente diferenciado II 4 291/13 Moderadamente diferenciado III 5 216/12 Bem diferenciado II 6 273/13 Moderadamente diferenciado II 7 103/13 Moderadamente diferencido II 8 92/14 Bem diferenciado II Tabela 1 – Casos selecionados em que se fez a recoloração com Azul de Toluidina. 23 Em seguida, as lâminas foram colocadas em Xilol para remoção da lamela e posteriormente recoradas com o Azul de Toluidina, segundo a técnica que se descreve de seguida. Técnica de coloração de Azul de Toluidina em preparações citológicas • Água corrente • Azul de Toluidina 1:1000 – 30 segundos • Álcool a 95º - 6 mergulhos rápidos • Escorrer • Álcool 100º - 2 mergulhos rápidos • Montar em Aquatex. Depois de recoradas, estas lâminas foram novamente visualizadas ao microscópio e fotografados vários campos representativos da preparação citológica. Após este procedimento, foi realizada uma avaliação morfológica qualitativa dos núcleos e nucléolos dos mastócitos, que se encontram sintetizadas na Tabela 2. Relativamente aos nucléolos a avaliação foi feita segundo os padrões: 1) pequeno, redondo e único; 2) múltiplos e redondos; 3) macronucléolo; 4) nucléolos atípicos (forma irregular). Em dois casos (2 e 8) procedeu-se ainda a uma avaliação quantitativa do volume nuclear. 2.3 Resultados Em geral, esta coloração funcionou bem em todas as lâminas. Ainda assim notaram-se diferentes graus de intensidade, o que não inviabilizou a avaliação nucleolar (o nucléolo ficou bastante visível e fácil de avaliar nas lâminas recoradas). A Tabela 2 resume a avaliação quantitativa das lâminas recoradas com o Azul de Toluidina. Figura 18 e 19 : Coloração Diff-Quik (direita) e recoloração com azul de toluidina (esquerda). Nas fotografias do mesmo campo consegue ver-se a melhoria do detalhe nuclear; Objetiva 100x. 24 Tabela 2Avaliação qualitativa nuclear após coloração com Azul de Toluidina; padrão 1, 2, 3 e 4 de nucléolos correspondem, respetivamente, a nucléolo único e redondo, múltiplo e redondo, macronucléolo e nucléolos atípicos. 2.4 Avaliação quantitativa segundo a técnica do nucleator Segundo foi referido atrás, esta técnica foi usada apenas em dois casos (2 e 8). O nucleator é uma técnica estereológica que estima o volume nuclear médio através de perfis de núcleos, em que seja visível o nucléolo. A técnica, originalmente definida para utilização em cortes histológicos (Gundersen, 1988) foi aqui adaptada para o contexto de amostras citológicas (recoradas com Azul de Toluidina), usando um sistema de análise esterológica (Cast-Grid, Olympus®). No nucleator, o nucléolo é identificado pelo operador (Figura 20), sendo que o sistema de análise gera automaticamente 2 linhas que passam pelo nucléolo e o operador tem de marcar a interseção das linhas com o bordo nuclear. O volume médio pesado pelo número N é calculado pela fórmula (Gundersen, 1988; Marcos et al., 2012): 3 )3/4( nN lv x π = em que o l representa a média dos segmentos de reta (entre as cruzes verde e amarelas). Em situações oncológicas, mais do que o volume médio do núcleo é importante a sua variabilidade (que no fundo traduz a anisocariose). Este pode ser estimado pelo volume nuclear médio pesado pelo volume, V . Este pode ser determinado de uma forma indireta a partir do N , segundo uma outra fórmula: ( ) )1( 2 VCVvv nNV += x em que CV 2 (V) corresponde ao Descrição qualitativa Identificação do caso Núcleo Padrão de nucléolos Outras características 1 Anisocariose moderada Cromatina granular fina Padrão 2 Sem eosinófilos ou fibras de colagénio 2 Anisocariose elevada Cromatina granular grosseira Padrão 3 e 4 Células binucleadas 3 Anisocariose moderada Cromatina granular fina Padrão 2 Células binucleadas 4 Cromatina densa Padrão 2 5 Cromatina densa Padrão 2 Presença de fibroblastos e eosinófilos 6 Cromatina granular fina Padrão 2 Coloração fraca 7 Cromatina granular, grosseiramente distribuída Padrão 2 e 3 8 Cromatina granular fina Padrão 1 25 coeficiente de variação dos volumes determinados pelo nucleator. De uma forma simplista pode dizer-se que se a população tiver baixa anisocariose o V ≅ N e se a anisocariose for marcada o V > N (isto é, o V nuclear será muito maior do que o N ). Nos casos de mastocitomas bem e pouco diferenciados foram medidos 115 e 170 mastócitos, respetivamente. O N foi, respetivamente, 245 µm 3 e 521 µm 3 (ou seja, núcleos parecem ser significativamente maiores nos tumores pouco diferenciados). Já nestes dois casos, o V foi, respetivamente, 326 µm 3 e 859 µm 3 (isto é, parece haver maior anisocariose nos tumores pouco diferenciados). 2.5 Discussão e perspetivas futuras A coloração de Azul de Toluidina foi de extrema importância para se conseguir uma melhor avaliação dos núcleos e nucléolos dos mastocitomas que foram selecionados para este estudo. Desta forma, conseguimos fazer uma primeira avaliação qualitativa o que permitiu classificar os mastocitomas segundo o padrão nuclear e nucleolar. Nos tumores deste estudo, alguns dos casos de mastocitomas bem diferenciados em termos citológicos foram diagnosticados em histopatologia como mastocitomas de grau II. Esta discrepância tem a ver com o fato do grau incluir aspetos (como a extensão das células Figura 20 : Medições realizadas com o nucleator. Cruz verde: nucléolo, identificado pelo operador; as cruzes amarelas demarcam os quatro pontos de interseção das linhas que passam pelo nucléolo e bordo nuclear. Azul de toluidina, Objetiva 100x. 26 neoplásicas para a derma profunda e hipoderme) que são apenas observáveis em histopatologia e que entram na classificação em graus de Patnaik et al. (1984) (que é a mais usada na histopatologia). A avaliação qualitativa em citologia estará sempre sujeita a subjetividade difícil de controlar, pois depende do observador e a viés associada à amostragem de um menor número de células. Ainda assim, observação do padrão nucleolar poderá ajudar na discriminação dos mastocitomas mais invasivos e de pior prognóstico. É importante destacar a utilidade do nucleator em comparação com técnicas de análise de imagem, em que o núcleo é delineado manualmente (Strefezzi et al., 2003; Barbosa et al., 2014). Ao usar 4 intersecções, o workload é menor no nucleator, obtendo-se com relativa rapidez dois parâmetros ( N e V ) que poderão ser úteis na discriminação dos mastocitomas. Recorde-se que os trabalhos anteriores de análise de imagem determinaram a área nuclear e o perímetro (Strefezzi et al., 2003; Barbosa et al., 2014), assim como o diâmetro médio, coeficiente de regularidade e coeficiente de elipticidade (Strefezzi et al., 2003). Estes trabalhos registaram diferenças entre mastocitomas de grau I e III, apenas no que respeita à área, perímetro e diâmetro médio. Os dados aqui referidos não são diretamente comparáveis; no entanto, assumindo os núcleos dos mastocitomas como parcialmente esféricos (e como tal com um volume de π.r 3 ), o diâmetro médio calculado nos dois casos deste trabalho corresponderá a 8,5 µm e a 9,9 µm nos mastocitomas bem e pouco diferenciados, respetivamente. Estes valores estão em razoável concordância com os reportados por Strefezzi et al (2003) (8,8 µm em mastocitomas de grau I e 9,5 µm nos de grau III). Globalmente, os resultados deste trabalho reforçam a importância da continuação do estudo dos mastocitomas caninos com novas abordagens no que respeita à coloração e quantificação. Embora tenham sido já realizados vários trabalhos, por múltiplos autores, existindo diversas metodologias de avaliação da morfometria nuclear, o nucleator parece conseguir uma razoável precisão associada a uma rapidez de execução. Uma incontornável limitação do presente estudo preliminar prende-se com a dimensão reduzida da amostra. Assim, será importante aumentar o número de casos a analisar com recoloração e estereologia, alargando o estudo a casos recolhidos fora do ICBAS. Eventualmente, poder-seão incluir também casos vistos por outros colegas. Será também interessante avaliar as características clinico-patológicas dos tumores (por exemplo, o tamanho e localização do tumor ou a idade do animal) correlacionando-as com os parâmetros estereológicos determinados. Será expectável que o resultado deste trabalho preliminar (eventualmente incluindo mais alguns casos adicionais) seja alvo de uma apresentação científica em congresso de veterinária e/ou artigo científico. 27 Bibliografia Aceña MC, Gascón MY, Palacio J (1997). Principios generales y utilidade de la citologia en clinica veterinária. Pequeños Animales 9: 4-18. Allen SW, Prasse KW (1993). Cytologic diagnosis of neoplasia and perioperative implementation. In: Veterinary Laboratory Medicine in Practice. 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