Atividade osteoclástica na superfície de hidroxiapatite nano e microestruturada modulada pela presença de inibidores da bomba de protões

ATIVIDADE OSTEOCLÁSTICA NA SUPERFÍCIE DE HIDROXIAPATITE NANO E MICROESTRUTURADA MODULADA PELA PRESENÇA DE INIBIDORES DA BOMBA DE PROTÕES HÉLDER TIAGO GOMES SILVA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA À FACULDADE DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA M 2014 Orientadores científicos: Professor Doutor João Miguel Rodrigues Professora Doutora Maria Helena Fernandes I Resumo No corpo humano, o osso possui várias funções físicas, como proteção, suporte e auxílio no movimento, assim como funções metabólicas, importantes na regulação da homeostasia do organismo. De modo a recuperar de uma fratura, ou a adaptar-se a forças de tensão, é necessário que o osso seja constantemente remodelado, um processo extremamente controlado, mediado por células específicas, os osteoblastos e osteoclastos. Os osteoblastos são responsáveis pela formação de novo tecido ósseo. Quando ativos, produzem e mineralizam uma matriz proteica, denominada osteoide. Os osteoclastos estão envolvidos no processo de remodelação óssea, que acontece durante os períodos de formação e reparação do osso, através da sua função de degradação do tecido ósseo. A formação destas células começa com a proliferação de precursores osteoclásticos imaturos, e com a associação dos mesmos ao fenótipo osteoclástico. Uma vez iniciado o processo de reabsorção, os osteoclastos desenvolvem uma membrana rugosa, na qual se encontram bombas de protões, e por onde é segregado ácido, assim como enzimas líticas, o que permite a degradação do tecido ósseo. Este processo começa com a adesão das células osteoclásticas à matriz óssea, ao que se segue a génese de um meio extracelular entre ambos, circundado por uma zona de vedação. Para além dos osteoblastos e osteoclastos, existem ainda outros dois tipos de células ósseas, os osteócitos e as células ósseas de revestimento. O primeiro tipo formase à medida que o osteoide é produzido pelos osteoblastos, quando algumas destas células são aprisionadas e incorporadas na matriz, e está encarregue da manutenção do tecido ósseo. As células ósseas de revestimento recobrem as superfícies ósseas que não se encontram em remodelação, representando uma fonte de precursores osteogénicos. Para além disso, possuem uma importante função na preservação da homeostasia mineral. A remodelação óssea é regulada por forças mecânicas, hormonas e fatores locais. A ação coordenada entre osteoblastos e osteoclastos acontece no interior de um compartimento de remodelação óssea, cuja forma é dada por um invólucro de células ósseas de revestimento, e se localiza na área do tecido ósseo a ser remodelada. A taxa a que este processo decorre é variável de acordo com o tipo de osso, permanecendo, no entanto, estável em indivíduos saudáveis. De outro modo, podem surgir doenças ósseas, como a osteoporose e a artrite reumatoide, entre outras. No conjunto, as células ósseas são responsáveis pela produção, mineralização, manutenção e reabsorção de tecido ósseo, desempenhando também um papel na sua fisiologia. No entanto, estas células constituem apenas uma pequena parte da composição óssea. A maior parte é representada por uma fase orgânica, composta principalmente por colagénio tipo I, e por uma fase inorgânica, composta, essencialmente, por um mineral, a hidroxiapatite (HA). Estas duas componentes, orgânica e inorgânica, são indissociáveis e interagem entre si, conferindo propriedades mecânicas ao tecido ósseo, nomeadamente resistência e elasticidade. A composição da HA é similar à componente inorgânica do osso, representando cerca de 70% da massa óssea. Por essa razão, existe um elevado potencial de utilização II de HA sintética como substituto ósseo em aplicações biomédicas. As principais vantagens deste mineral são a biocompatibilidade, osteocondução, e o facto de não apresentar toxicidade nem desencadear uma resposta inflamatória por parte do organismo. Atualmente, as suas principais aplicações consistem no preenchimento de defeitos ósseos e no revestimento de implantes metálicos. Além disso, os materiais anteriormente utilizados para esta finalidade apresentavam várias limitações, pelo que houve a necessidade de criar biomateriais que as ultrapassassem, e que possuíssem capacidades osteocondutoras e de regeneração, assim como de libertação de fármacos, de forma a produzirem um efeito terapêutico mais rápido e eficaz. A interação entre o tecido ósseo e a superfície do biomaterial implantado é um fator importante a ser considerado, sendo desejável a formação óssea na área de contacto entre ambos. Assim, a HA nanoestruturada promove a formação de uma camada de apatite antes de interagir diretamente com o tecido ósseo a nível atómico, o que confere uma maior estabilidade. À escala nanométrica, a estrutura da HA apresenta uma elevada osteocondução, ao contrário da HA convencional, sendo a taxa de formação de novo tecido ósseo superior. Além disso, os cristais de apatite presentes no corpo humano são materiais nanoestruturados, pelo que existe uma maior pertinência na sintetização deste mineral nessa escala. Atualmente, os inibidores da bomba de protões (IBP) são principalmente utilizados de modo a diminuir a segregação de ácido gástrico, que ocorre através de uma bomba de protões, uma enzima que transporta ácido das células parietais para o lúmen gastrointestinal. Estes inibidores bloqueiam a bomba de protões, tornando possível o tratamento de doenças decorrentes de acidificação gástrica excessiva, como o refluxo ou úlceras. Por esta razão, a utilização de IBP no contexto da regeneração/metabolismo ósseo apresenta um elevado potencial de aplicação, pois a acidificação óssea promovida pelos osteoclastos, à semelhança da segregação ácida que acontece na envolvente gástrica, requer o envolvimento de bombas de protões transmembranares. III Abstract In the human body, bone tissue is responsible for several physical functions, like protection, support and motion aid, as well as metabolic functions, important to the organism homeostasis regulation. In order to recover from a fracture, or to adapt to stress forces, it is necessary that the bone undergoes constant remodeling, an extremely controlled process, guided by specific cells, osteoblasts and osteoclasts. Osteoblasts are in charge of the synthesis of new bone tissue. When active, these cells produce and mineralize a protein matrix, known as osteoid. Osteoclasts are involved in the bone remodeling process, which takes place during the bone growth and repair periods, through their bone tissue-degrading function. The shaping of these cells begins with the proliferation of immature osteoclastic precursors, and their association to the osteoclastic phenotype. Once the resorption process is initiated, osteoclasts develop a ruffled border membrane, which presents proton pumps, and through which acid and lytic enzymes are secreted, allowing bone tissue dissolution. This process begins with osteoclastic attachment to the bone matrix, followed by the genesis of an extracellular environment between them, surrounded by a sealing zone. Besides osteoblasts and osteoclasts, there are two other types of bone cells, osteocytes and bone lining cells. The first type evolves as osteoid is produced by osteoblasts, when some of these cells are trapped and incorporated in the matrix, and is responsible for bone tissue maintenance. Bone lining cells overlay surfaces that are not undergoing remodeling, being a source of osteogenic precursors. Besides, these cells have an important role on the mineral homeostasis preservation. Bone remodeling is regulated by mechanical forces, hormones and local factors. The coordinated action between osteoblasts and osteoclasts takes place inside a bone remodeling compartment, shaped by a bone lining cells coverture, and located over the bone tissue area to be remodeled. The rate at which this process takes place varies according to the bone type, remaining, however, stable in healthy individuals. Otherwise, bone diseases, such as osteoporosis and arthritis, among others, may occur. As a whole, bone cells produce, mineralize, maintain and reabsorb bone tissue, playing also a role in its physiology. However, these cells constitute only a minor part of bone composition. The main part consists of an organic phase, mostly composed of type I collagen, and an inorganic phase, essentially composed of a mineral, hydroxyapatite. The two components, organic and inorganic, are indissociable and interact with each other, bestowing mechanical properties to the bone tissue, namely resistance and elasticity. Hydroxyapatite composition is similar to the inorganic component of the bone, representing approximately 70% of bone mass. For this reason, there is a high utilization potential of synthetic hydroxyapatite as a bone replacement in biomedical applications. The main advantages of this mineral consist on biocompatibility, osteoconduction, and the fact that it does not present toxicity nor causes an inflammatory response by the organism. Currently, it is mainly applied to fill bone defects, and to coat metallic implants. Besides, the materials previously utilized for this purpose presented several limitations, thus making it necessary to create biomaterials IV that could overcome them, and that displayed osteoconductive and regenerative capacities, as well as drug releasing properties, in order to produce a faster and more efficient therapeutic effect. It is important to consider the interaction between bone and the implanted biomaterial surface, being desirable the formation of new bone tissue in the contact area between both. Thus, nanostructured hydroxyapatite promotes the generation of an apatite layer before directly interacting with bone at an atomic level, granting a better stability. At nanometric scale, hydroxyapatite structure presents high osteoconduction, as opposed to conventional hydroxyapatite, causing new bone tissue formation rate to be much higher. Besides, apatite crystals found in the human body are nanostructured materials, for which the synthesis of this mineral in the same scale appears to be more pertinent. Currently, proton pump inhibitors are mostly used to decrease gastric acid secretion, which occurs through a proton pump, an enzyme that carries acid from the parietal cells to the gastrointestinal lumen. These inhibitors block the proton pump, allowing the treatment of diseases related with excessive gastric acidification, like reflux or ulcers. Due to this fact, the use of proton pump inhibitors in the bone regeneration/metabolism context reveals a high application potential, for the osteoclastpromoted bone acidification, similarly to the gastric acid secretion, requires the involvement of transmembranar proton pumps. V Lista de Abreviaturas α-MEM - Alpha modified minimum essential medium ATPase H+/K+ - adenosina trifosfatase hidrogénio-potássio BLC – células ósseas de revestimento BMP – proteínas ósseas morfogenéticas BMU – unidade multicelular básica BRC – compartimento de remodelação óssea ClC-7 - chloride channel 7 Cmax – concentração máxima CTR – recetor de calcitonina DRX - difração de raios-X FTIR - Fourier transform infrared spectroscopy GH - hormona do crescimento HA - Hidroxiapatite IBP - inibidores da bomba de protões IL-1 - interleucina-1 IVS – inibidores das vias de sinalização JNK – c-Jun N-terminal kinase MAPK - mitogen-activated protein kinase M-CSF - macrophage colony-stimulating factor MEV - microscopia eletrónica de varrimento MEK – MAPK/ERK kinases mHA – hidroxiapatite microestruturada MMP – metaloproteinases da matriz MSC – células estaminais mesenquimais NF-ĸB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells VI nHA – hidroxiapatite nanoestruturada OPG – osteoprotegerina PBMC – células mononucleadas de sangue periférico humano PGE2 - prostaglandina E2 PTH - hormona da paratiroide RANK - receptor activator of nuclear factor kappa-B RANKL - receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand TNF - tumor necrosis factor TRAP - tartrate-resistant acid phosphatase VNR – recetor de vitronectina VII Lista de Figuras Figura 1 ......................................................................................................................................... 2 Figura 2 ......................................................................................................................................... 3 Figura 3 ......................................................................................................................................... 4 Figura 4 ......................................................................................................................................... 5 Figura 5 ......................................................................................................................................... 8 Figura 6 ....................................................................................................................................... 11 Figura 7 ....................................................................................................................................... 13 Figura 8 ....................................................................................................................................... 14 Figura 9 ....................................................................................................................................... 17 Figura 10 ..................................................................................................................................... 21 Figura 11 ..................................................................................................................................... 22 Figura 12 ..................................................................................................................................... 24 Figura 13 ..................................................................................................................................... 27 Figura 14 ..................................................................................................................................... 29 Figura 15 ..................................................................................................................................... 31 Figura 16 ..................................................................................................................................... 33 Figura 17. .................................................................................................................................... 38 Figura 18. .................................................................................................................................... 38 Figura 19 ..................................................................................................................................... 39 Figura 20. .................................................................................................................................... 41 Figura 21. .................................................................................................................................... 44 Figura 22. .................................................................................................................................... 45 Figura 23. .................................................................................................................................... 46 Figura 24. .................................................................................................................................... 47 Figura 25 ..................................................................................................................................... 48 Figura 26 ..................................................................................................................................... 49 Figura 27 ..................................................................................................................................... 50 Figura 28. .................................................................................................................................... 51 Figura 29. .................................................................................................................................... 53 Figura 30. .................................................................................................................................... 54 Figura 31. .................................................................................................................................... 55 Figura 32. .................................................................................................................................... 56 Figura 33. .................................................................................................................................... 57 4 3).[1] Nos ossos longos, esta cavidade consiste num canal, onde se encontra a medula óssea, sendo possível observar osso esponjoso (cancellous) junto às suas extremidades. Do mesmo modo, os ossos chatos apresentam uma estrutura composta pelo córtex e osso esponjoso, mas o seu interior está completamente preenchido, ou seja, não exibe cavidade medular. Em idades avançadas, o osso esponjoso pode mesmo desaparecer, devido ao colapso das superfícies corticais.[2] Figura 3 – Esquema da secção sagital de um osso longo: 1 – epífise; 2 – placa epifiseal; 3 – metáfise; 4 – diáfise. O osso cortical é encontrado principalmente na zona da diáfise, enquanto o osso esponjoso se localiza junto à epífise.[2] Para além das superfícies articulares, protegidas por cartilagem[2], todos os ossos se encontram envolvidos, quer na superfície interna, quer externa, por uma membrana de tecido conjuntivo. Externamente, esta membrana é denominada por periósteo[2], o qual é constituído por duas camadas fibrosas, apresentando a camada mais interior um potencial osteogénico que leva à formação de novo tecido ósseo, um processo designado por aposição periosteal.[1] A superfície interna, presente nas cavidades medulares, é revestida pelo endósteo[2], onde se inicia a reabsorção óssea, por oposição ao periósteo. Ambas as membranas possuem células que participam no metabolismo ósseo, os osteoblastos e osteoclastos, que desempenham a função de formação e reabsorção óssea, respetivamente, de modo a executar a remodelação, crescimento e reparação óssea (Figura 4).[1] A cavidade medular e os espaços intertrabeculares no osso esponjoso contêm medula óssea, responsável pela produção de células sanguíneas. Esta cavidade pode ainda ter a função de armazenamento de gordura, sendo nesse caso denominada por medula amarela.[2] 5 Figura 4 - A reabsorção óssea é efetuada pelos osteoclastos na superfície interna do osso (endósteo), sendo a formação realizada na superfície externa (periósteo), o que permite a remodelação, crescimento e reparação óssea.[163] 6 Fisiologia do osso Encontram-se, no osso, minerais essenciais para diversas funções metabólicas. O cálcio tem um papel fundamental na coagulação sanguínea, na contração do músculo cardíaco e do músculo esquelético e, ainda, na função nervosa. Por sua vez, o fósforo é importante na composição dos ácidos nucleicos e fosfolípidos.[2] A parte mineral do tecido ósseo é maioritariamente constituída por HA[3], podendo ainda ser encontradas pequenas quantidades de sódio, magnésio, fluoreto, carbonatos e silício. A concentração de sais permanece em equilíbrio, ou seja, a quantidade de cálcio absorvida pelo organismo é, aproximadamente, a mesma libertada pelo tecido ósseo, permitindo a substituição constante dos minerais ósseos. Este mineral é absorvido no trato intestinal, através de transporte ativo por ação da vitamina D, podendo níveis baixos desta vitamina provocar problemas ósseos, como mineralização insuficiente, raquitismo e osteomalácia.[2] A concentração de cálcio no organismo é, também, controlada pela hormona da paratiroide (PTH)[3], que atua diretamente no osso, diminuindo a concentração de fosfatos no plasma, através da excreção urinária. O funcionamento reduzido da glândula da paratiroide causa uma diminuição da atividade osteoclástica e um decréscimo dos níveis de cálcio. Pelo contrário, se esta glândula se encontrar demasiadamente ativa, a reabsorção óssea atinge valores exagerados, enfraquecendo o osso, e podendo originar fraturas, descalcificação e tumores ósseos.[2] Também a calcitonina desempenha funções na regulação da atividade osteoclástica, reduzindo a ação dos osteoclastos e promovendo a diminuição dos níveis de cálcio e fosfato no sangue.[3] Assim, a regulação dos níveis de cálcio é de extrema importância. Um decréscimo de 30% nos seus valores normais induz contrações tetânicas, devido à descarga elétrica que sucede no sistema nervoso central e periférico, o que pode ser fatal. Pelo contrário, se os níveis de cálcio apresentarem valores demasiadamente elevados, dá-se uma diminuição dos reflexos e da atividade geral do sistema nervoso central. Mesmo uma elevação moderada destes níveis pode conduzir à formação de cálculos renais, cuja constituição assenta em fosfato de cálcio e, consequentemente, a uma falha renal.[2] 7 Estrutura molecular A estrutura molecular do osso desempenha um papel crucial nas suas funções estruturais e biológicas[4][5]. As células ósseas constituem aproximadamente 20% desta estrutura, sendo o resto do tecido ósseo um material compósito, formado por uma fase orgânica reforçada com uma fase mineral inorgânica.[6] A primeira é constituída maioritariamente por colagénio tipo I, com fibrilas orientadas predominantemente em paralelo relativamente umas às outras, e que suportam a matriz onde os cristais minerais se podem formar (Figura 5).[4] O colagénio constitui uma parte importante da estrutura óssea, pois a orientação das suas fibrilas resulta na formação do osso lamelar (arranjo concêntrico no osso cortical, e paralelas entre si no osso trabecular). No caso do osso não remodelado (woven bone), formado durante a maturação do esqueleto e em algumas patologias, as fibrilas de colagénio estão dispostas aleatoriamente.[1] Fazem ainda parte da fase orgânica, proteoglicanos e glicoproteínas adesivas.[7] A matriz inorgânica possui iões fosfato, cálcio e, em menor quantidade, bicarbonato, magnésio, potássio, sódio e citrato. A junção do fosfato e do cálcio dá origem a cristais de HA, que se situam entre as ligações cruzadas das fibrilas de colagénio e nas terminações dessas mesmas fibrilas.[4] Tanto os componentes orgânicos como inorgânicos da matriz óssea, assim como as interações entre si, contribuem para as propriedades mecânicas do osso, tais como a sua resistência e elasticidade.[4][7] 8 Figura 5 – Estrutura multiescalar hierárquica do osso, onde se encontram inseridas as fibrilas de colagénio da fase orgânica da matriz óssea.[164] Fazem também parte da matriz óssea proteínas não colagénicas, distribuídas aleatoriamente, como a osteocalcina e a sialoproteína óssea, e a osteonectina e osteopontina, assim como proteínas derivadas do sangue, que se ligam ao osso devido à sua afinidade com os cristais minerais, como a albumina e imunoglobulinas.[8] As proteínas ósseas morfogenéticas (bone morphogenetic proteins - BMP) são um tipo de glicoproteínas responsável pela indução óssea[9][10], podendo encontrar-se, não só no tecido ósseo, como em outros tecidos corporais.[11] Estas proteínas possuem a função de modular o desenvolvimento esquelético durante a embriogénese[10], devido à sua grande capacidade de indução da diferenciação osteoblástica, a partir de células mesenquimais progenitoras. Na fase embrionária, estão envolvidas na regulação de alguns processos de desenvolvimento da cartilagem e osso[11] e, na fase adulta, dirigem a proliferação, diferenciação e apoptose de células mesenquimais e células ósseas, entre outras.[10] 9 Células ósseas As células ósseas são classificadas de acordo com a sua forma, função e localização, existindo quatro tipos celulares: osteoblastos, osteoclastos, osteócitos e células ósseas de revestimento (bone lining cells – BLC) (Figura 6). Em conjunto, estas células executam cinco tarefas gerais: produção de proteínas ósseas; estimulação da mineralização da matriz óssea; manutenção do tecido ósseo; reabsorção óssea; e desempenho de funções na fisiologia mineral.[12] Os osteoblastos são responsáveis pela formação de tecido ósseo. Estas células mononucleadas podem ser encontradas no osso, intimamente associadas ao periósteo e endósteo. Quando ativos, os osteoblastos produzem uma matriz proteica, denominada osteoide, encontrando-se envolvidos na mineralização da mesma.[2] À medida que o osteoide é produzido pelos osteoblastos, algumas destas células são aprisionadas e incorporadas na matriz óssea, tornando-se osteócitos. Estes têm a função de manutenção do tecido ósseo, sendo acondicionados dentro de lacunas e canalículos localizados no osso lamelar.[2] Nos estágios primários do seu ciclo de vida, os osteócitos podem estar ativos no processo de mineralização do osso. Porém, na fase madura, deixam de apresentar essa capacidade.[12] Os osteoclastos são células grandes e multinucleadas, responsáveis pela degradação do tecido ósseo. Estão envolvidos na remodelação óssea durante a fase de crescimento e reparação, bem como nos processos destrutivos levados a cabo para a remoção de tecido ósseo.[2] As células ósseas de revestimento recobrem as superfícies inativas do osso, ou seja, as superfícies que não se encontram em remodelação. No entanto, estas células também podem ser induzidas a proliferar e a diferenciarem-se em células osteogénicas diferentes, podendo representar uma fonte de precursores osteogénicos.[10] Devido ao facto de a ativação da remodelação óssea ocorrer em superfícies ósseas inativas, as BLC podem estar envolvidas na propagação dos sinais que iniciam a reabsorção e remodelação óssea. Também é reconhecida a sua importância na homeostasia mineral, através da manutenção dos fluidos ósseos e do fluxo iónico existente entre o osso e o espaço intersticial.[11] 10 Ciclo de Remodelação Óssea A remodelação óssea é executada pela unidade multicelular básica (basic multicellular unit - BMU) do osso, constituída por osteócitos, osteoclastos e osteoblastos, sendo a sua atividade regulada por forças mecânicas, hormonas, tais como a hormona da paratiroide e hormona do crescimento (growth hormone - GH), citocinas e fatores locais.[1] A ação coordenada dos osteoclastos e osteoblastos acontece dentro de um compartimento de remodelação óssea (bone remodeling compartment – BRC), que se forma quando os osteócitos respondem a um estímulo fisiológico (e.g. hormonas), ou físico (e.g. danos estruturais), levando à formação de uma cobertura de células de revestimento sobre o osso a ser remodelado. Os capilares da medula óssea penetram nesta cobertura, fornecendo um canal para que células e nutrientes possam entrar neste meio (Figura 6).[12] Após o estímulo biomecânico inicial, e consequente ativação da remodelação por ação dos osteócitos, dá-se a retração das células de revestimento da superfície endosteal, assim como a digestão da membrana do endósteo, através de metaloproteinases da matriz (matrix metalloproteinases - MMP). Em seguida, são recrutados e ativados precursores osteoclásticos, os quais se fundem, tornando-se multinucleados, e atuam como mediadores da reabsorção óssea. Após este processo, os osteoblastos reúnem-se na cavidade de reabsorção, segregando osteoide, o que origina novo tecido ósseo após mineralização.[1] A taxa de remodelação é variável de acordo com o tipo de osso, sendo maior em zonas de osso trabecular, e menor em zonas onde predomina o osso cortical. Após a degradação óssea, os osteoclastos são substituídos por osteoblastos que, em indivíduos saudáveis, restauram completamente o osso previamente degradado.[13] A ação dos osteoclastos e osteoblastos está estreitamente relacionada, pelo que a massa óssea de um adulto são permanece estável. Se tal não acontecer, e a atividade osteoclástica for excessiva, podem ocorrer doenças como a osteoporose, doença de Paget, metástases osteolíticas e artrite.[1] No caso do processo de envelhecimento, a quantidade de tecido ósseo depositada na lacuna de reabsorção, através da ação osteoblástica, é inferior à removida pelos osteoclastos. Este balanço negativo é o principal responsável pela perda óssea que se verifica com a idade. Ainda assim, os fatores responsáveis pelo aparecimento sequencial dos osteoclastos e osteoblastos nos locais de remodelação óssea, o seu papel individual no processo, e os mecanismos subjacentes à sua produção, permanecem por elucidar.[13] 11 Figura 6 –Diagrama da unidade multicelular básica (basic multicellular unit - BMU) no interior do compartimento de remodelação óssea (bone remodeling compartment - BRC).[165] 12 Osteoclastos Os osteoclastos são células multinucleadas de grandes dimensões, formadas a partir da fusão de progenitores mononucleares da família dos monócitos/macrófagos. São responsáveis pela reabsorção óssea, desempenhando um papel fundamental na formação e manutenção do esqueleto.[13] A estabilidade mecânica e homeostasia fisiológica dependem da remodelação efetuada por estas células, capazes de degradar, tanto a parte mineral, como a parte orgânica da matriz óssea. A sua característica funcional mais distinta é a capacidade de dissolverem a matriz mineralizada, através da segregação de ácido por uma bomba de protões.[14] Reabsorção osteoclástica A reabsorção óssea começa com a proliferação de precursores osteoclásticos imaturos, e com a sua subsequente fusão, terminando com a degradação das fases orgânica e inorgânica do osso, através de osteoclastos maduros.[15] Uma vez iniciado este processo, ocorre a formação de uma membrana rugosa nos osteoclastos, através da qual se efetuam a degradação e reabsorção do tecido ósseo, e cuja forma se deve ao transporte de vesículas ácidas, desde o interior das células osteoclásticas, até à sua membrana plasmática, onde são projetadas, num processo semelhante à exocitose.[15][16] A degradação do osso começa com a ligação dos osteoclastos à matriz óssea (Figura 7), ao que se segue a formação de um meio extracelular entre ambos[17], delimitado por uma zona de vedação (sealing zone), rica em filamentos de actina e desprovida de organelos. Esta estrutura possui a forma de anel e rodeia a membrana rugosa[18], contendo podossomas da membrana plasmática osteoclástica[21], onde se encontram proteínas como a vinculina, talina e α-actinina, responsáveis pela ligação ao citosqueleto das células ósseas.[22] Tal como a membrana rugosa, o anel de podossomas aparece juntamente com o início da reabsorção óssea, e desaparece após o osteoclasto ser destacado da matriz óssea.[18] O reconhecimento ósseo por parte dos osteoclastos é mediado por integrinas, principalmente a integrina αvβ3. Este facto foi demonstrado em estudos, nos quais a expressão da mesma foi bloqueada, o que originou, por parte das respetivas células osteoclásticas, a não formação de anéis de actina, membranas rugosas anormais, e deficiente reabsorção óssea.[19] Desconhece-se, no entanto, se existe um reconhecimento de locais predeterminados no osso, ou se essa ação é estocástica.[20] 13 Figura 7 – Diagrama esquemático de um osteoclasto polarizado no osso. A membrana rugosa encontra-se rodeada pela zona de vedação, sendo a ligação à matriz óssea regulada pela integrina αvβ3.[166] A degradação da fase orgânica do osso é antecedida pela dissolução da sua fase inorgânica.[23] Os osteoclastos dissolvem a componente mineral óssea na lacuna de reabsorção, através de segregação ácida, realizada por intermédio de, pelo menos, duas entidades moleculares diferentes (Figura 8).[24][25] A primeira consiste numa bomba de protões H+, presente na membrana rugosa das células osteoclásticas[26][27][28], e alimentada por ATP, sendo denominada ATPase vacuolar[26][29]; a segunda baseia-se no transporte de aniões Cl-, através de canais iónicos específicos de cloreto (chloride channel 7 - ClC-7).[30] Da ação combinada destas duas moléculas, resulta a segregação de ácido clorídrico (HCl) no meio de reabsorção, o que causa uma diminuição do valor do pH para aproximadamente 4,5[17], permitindo a solubilização dos sais alcalinos da hidroxiapatite. A dissolução dos cristais de HA liberta grandes quantidades de cálcio e fosfato, que necessitam de ser transportadas para o exterior da lacuna de reabsorção, de modo a dar continuidade ao processo reabsortivo. É também gerado um grande volume de bicarbonato que, se não for removido, neutraliza o baixo pH existente, bloqueando a subsequente desmineralização. Este processo ainda não se encontra, no entanto, totalmente explicado[31], existindo teorias que envolvem o transporte de moléculas em vesículas, o transporte de iões através de proteínas de ligação e, ainda, canais iónicos ou bombas na membrana plasmática.[14] A dissolução dos minerais ósseos torna possível a atuação de enzimas proteolíticas, que degradam a matriz orgânica. Existem dois grupos de enzimas envolvidos neste processo: as metaloproteinases da matriz e as proteases lisossomais. Entre as últimas, destaca-se a catepsina K, expressa pelos osteoclastos e segregada na lacuna de reabsorção.[32][33] A função desta protease, quando em pH ácido, é clivar o colagénio tipo I.[34][35] Os produtos de degradação resultantes são endocitados pelas células osteoclásticas sendo, em seguida, transportados e libertados através da superfície oposta ao local de reabsorção.[36] 20 semelhante, a hidroxiapatite. Além disso, este material estimula a formação, precipitação e deposição de cálcio, resultando numa maior resistência matricial. As cerâmicas possuem, também, um grande potencial como veículos de libertação de fármacos, devido à sua grande afinidade com proteínas.[65][66] Metálicos Os biomateriais metálicos são, essencialmente, compostos por metais porosos, como o titânio, cuja estrutura consiste em poros interconectados, à semelhança do osso trabecular. O titânio é um metal biocompatível, resistente à corrosão, não biodegradável e possui um módulo de elasticidade variável, podendo ser fabricado em várias formas e texturas. Estes biomateriais são principalmente usados para revestir a superfície de implantes, promover o crescimento ósseo e conferir estabilidade.[67] No entanto, tendem a formar uma superfície oxidada bioinerte, que não interage de forma perfeita com os tecidos envolventes, além de possuírem uma rigidez característica, que pode causar problemas no interface biomaterial-tecido.[68] Compósitos Os materiais compósitos são uma combinação de materiais com diferentes características, exibindo, por essa razão, propriedades otimizadas. Um exemplo é a combinação de titânio com HA, que permite reduzir o caráter inerte do metal e aumentar a sua osteointegração.[50] Também a combinação de cerâmicas bioativas (fosfato de cálcio) com polímeros favorece as características mecânicas do compósito final, pois a adição de polímeros a cerâmicas reduz a fragilidade das mesmas, ou seja, a sua tendência para quebrar. Por outro lado, aumenta a sua bioatividade e capacidade de libertação de agentes terapêuticos. 21 Figura 10 – Classificação e tipos de biomateriais.[84] 22 Osteointegração A osteointegração foi, originalmente, definida como uma ligação estrutural e funcional entre o tecido ósseo e a superfície do implante (Figura 11).[69] Histologicamente, define-se como “a fixação direta de um implante, pela formação de tecido ósseo em seu redor, sem que haja o crescimento de tecido fibroso na interface implante-osso”.[70] Devido às limitações da definição histológica, nomeadamente a falta de aplicabilidade clínica, foi proposta uma definição mais orientada no contexto biomecânico, segundo a qual a osteointegração “é um processo no qual é conseguida e mantida a fixação, clinicamente assintomática, do implante, podendo este ser, previsivelmente, incorporado com segurança no tecido ósseo, persistindo a fixação sob condições normais de carga”.[71][72] A osteointegração não acontece isoladamente, dependendo da existência dos processos de osteoindução e osteocondução. Além disso, o seu sucesso implica que a fixação ao osso se mantenha ao longo do tempo.[73] Os implantes osteointegrados e funcionais demonstram uma interface com densidade óssea semelhante à do osso implantado.[74] No entanto, a obtenção desta condição é, geralmente, demorada, podendo ser acelerada através do revestimento do implante com HA.[75][76][77] Em geral, o sucesso da osteointegração depende, maioritariamente, da otimização do biomaterial, e não tanto de um aumento da taxa de resposta óssea.[73] Figura 11 – a) Parafuso de titânio osteointegrado; b) parafuso vertebral revestido com HA[73]; c) Osteointegração de um implante da anca.[167] 23 Hidroxiapatite A hidroxiapatite - Ca10(OH)2(PO4)6 - é um fosfato de cálcio com uma composição química semelhante à componente inorgânica da matriz óssea. Por essa razão, existe, atualmente, um grande interesse em sintetizar HA como substituto ósseo em aplicações biomédicas.[78][79] Os materiais à base de fosfato de cálcio possuem várias aplicações clínicas, nomeadamente do foro ortopédico, sendo principalmente utilizados na substituição de enxertos autólogos e em implantes metálicos.[80] Neste contexto, a HA apresenta as vantagens de ser biocompatível, devido à semelhança estrutural com o tecido ósseo[81], bioativa, osteoindutiva e osteocondutora[82][83], biodegradável, sendo lentamente substituída por tecido ósseo normal e, ainda, um material não carcinogénico nem alergénico. Também não apresenta toxicidade, nem induz uma resposta inflamatória/imunológica ou formação fibrosa.[84] Além disso, devido ao facto de constituir cerca de 70% da massa óssea[87], a HA apresenta uma grande capacidade de absorção e adsorção de moléculas[88] (Figura 12). As suas principais aplicações são o preenchimento de defeitos ósseos e o revestimento de implantes metálicos.[85][86] Apesar destas vantagens, possui fracas propriedades mecânicas, nomeadamente a resistência à fratura, o que restringe a sua aplicabilidade.[89] Por esta razão, a HA é usada como revestimento de próteses metálicas, combinando assim as características físicas dos metais com a sua biocompatibilidade e bioatividade.[84] Outra desvantagem é o facto de a sua semelhança com a componente mineral óssea resultar numa baixa taxa de biodegradação no interior do organismo[90][91]. Apesar de esta taxa aumentar com a porosidade[91], a HA possui uma reduzida reatividade, sendo a substituição por tecido ósseo efetuada lentamente, o que faz com que permaneça no corpo por largos períodos de tempo[92][93], uma situação normalmente indesejada.[94][95] A hidroxiapatite pode ser sintetizada a altas temperaturas, exibindo uma elevada cristalinidade (cristais grandes), ou a baixas temperaturas, com cristalinidade reduzida (cristais pequenos), sendo possível, com esta segunda opção, sintetizar HA com propriedades semelhantes às do osso humano.[96] Existe também a possibilidade de modelar a estrutura da HA, através da substituição do cálcio por metais[97], permitindo alterar a sua cristalinidade, textura e solubilidade.[88] Nos últimos anos, houveram ainda várias tentativas de recombinar HA com outras cerâmicas[98], polímeros[99] e, principalmente, vidros bioativos, que são muito mais reativos, de modo a obter materiais compósitos com propriedades biológicas melhoradas, na procura do desenvolvimento de uma nova geração de materiais com propriedades biológicas e mecânicas mais adaptadas.[100] 24 Figura 12 – Diagrama esquemático representativo dos fenómenos que ocorrem na superfície da HA após implantação. (1 e 2) Solubilização da superfície da HA. (3) Equilíbrio entre a solução fisiológica e a superfície da HA. (4) Adsorção de proteínas e material orgânico. (5 e 6) Adesão e proliferação celular. (7) Início de formação óssea. (8) Novo tecido ósseo formado.[168] Obtenção e caracterização da Hidroxiapatite É possível obter HA pela técnica de precipitação, que acontece através da reação, a baixa temperatura, entre precursores de cálcio e fósforo. Daqui resulta um pó, que é calcinado, de modo a obter uma estrutura de apatite homogénea. A solução inicial é bastante diluída, sendo a precipitação e titulação executadas lentamente, o que leva a uma maior uniformidade da HA resultante. Além disso, o pH e a temperatura são cuidadosamente controlados.[101] Após a obtenção da HA sintética, procede-se à sua caracterização, através de técnicas que permitem verificar a respetiva homogeneidade, presença e tamanho de poros favoráveis à osteointegração, e qualidade geral. Estas incluem a difração de raiosX (DRX), a espetroscopia por infravermelhos com transformada de Fourier (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), e a microscopia eletrónica de varrimento (MEV).[102] 25 Aplicações Existem, atualmente, várias aplicações biomédicas para a HA (Tabela 1) como, por exemplo, a sua utilização enquanto revestimento de próteses metálicas, de modo a estabilizar a interface entre o implante e os tecidos.[96][103] A sua capacidade de libertação prolongada de fármacos permite o tratamento de doenças ósseas, nomeadamente do foro oncológico[96], o que constitui uma enorme vantagem pois, deste modo, torna-se possível combinar o tratamento de tumores no tecido ósseo com a formação do mesmo.[104] No campo odontológico, utiliza-se HA na prevenção de perda óssea após extração de um ou mais elementos dentários[88], em correções maxilo-faciais, implantes dentários, e no preenchimento de cavidades císticas, entre outras.[105] As características da HA podem ser melhoradas, recorrendo à mistura com elastina[107], quitosano[108], e colagénio[109], entre outros. Isto deve-se ao facto de estas moléculas promoverem a biocompatibilidade e incorporação do implante nos tecidos. Além disso, melhoram as suas propriedades mecânicas, pois aumentam a resistência e elasticidade.[110][111] Tabela 1 – Aplicações da hidroxiapatite.[106] Aplicações Formas Matriz ou suporte para crescimento ósseo Grãos, porosa Osso artificial Grãos, densa, porosa Cimento ósseo Pó Articulações artificias Metal revestido com HA Próteses vasculares Densa Próteses traqueais Porosa/Densa Terminais percutâneos Densa Sistema de libertação Densa/Pó 26 Hidroxiapatite Nanoestruturada É importante, na fase de desenvolvimento de implantes ósseos, ter em conta a interação dos mesmos com o osso, sendo desejável a utilização de biomateriais que formem tecido ósseo à sua superfície. As biocerâmicas compostas por hidroxiapatite microestruturada dissolvem-se lentamente, formando uma camada de apatite antes de interagirem com o tecido ósseo a nível atómico, o que não confere a estabilidade desejada. Além disso, não permitem um aporte sanguíneo totalmente adequado às necessidades de reparação dos tecidos, nem uma resposta completamente ajustada a variações de fatores externos, tais como a tensão mecânica.[112] A estrutura porosa da HA, a uma escala nanométrica, constitui um ótimo substituto ósseo, devido à sua biocompatibilidade, bioafinidade e osteocondução (Figura 13).[121] Estas características não são obtidas com a mesma eficácia na HA microestruturada, pois a taxa de substituição do implante por tecido ósseo é muito inferior.[113] Além disso, a microHA apresenta uma distribuição não uniforme dos poros, e baixa ligação entre os mesmos, o que dificulta o seu preenchimento.[114] Por outro lado, as cerâmicas baseadas em nanoHA exibem estruturas altamente interligadas, permitindo uma osteocondução mais eficaz[113], sendo o tamanho e densidade dos poros, assim como as interligações entre si, fatores importantes neste processo.[115][116] Os cristais de apatite presentes no corpo humano (esmalte, dentina e cemento) são materiais nanoestruturados.[117] Por conseguinte, a nanoHA representa a forma com maior potencial de estudo e aplicação biomédica.[118] Além disso, as interações moleculares são efetuadas à escala nanométrica, pelo que a utilização de um material na mesma proporção as torna mais rápidas e eficazes. Estudos efetuados em defeitos ósseos, implantados com HA micro e nanoestruturada, revelaram um crescimento bastante mais significativo nas áreas implantadas com nanoHA, o que revela o potencial da mesma neste tipo de aplicações.[122] As características estruturais dos biomateriais, como a área de superfície, o volume dos poros, ou o tamanho das partículas, podem influenciar a sua resposta no meio fisiológico. Assim, a nanoHA possui propriedades que permitem um melhor controlo das interações proteicas (adsorção, conformação e bioatividade), sendo possível dirigir as respostas celulares (adesão e proliferação), ou a síntese e deposição de minerais.[119] A HA nanocristalina possui, ainda, uma melhor sinterabilidade e densificação, resultantes da sua maior área de superfície, sendo os materiais sintetizados mais resistentes a fraturas.[120] Os métodos utilizados para a sua preparação incluem a precipitação química[123][124], o tratamento hidrotérmico[124][125], pectização (solgel)[126][127], microemulsão[128][129], síntese mecânico-química[130][131] e eletrodeposição.[132] 27 Figura 13 – Imagem de alta resolução de HA nanoestruturada.[118] 28 Inibidores da bomba de protões O ácido gástrico é segregado pelas células parietais do estômago, em resposta a estímulos provocados pela presença de alimentos. Este processo inicia-se com a ativação de recetores localizados nas células parietais, que enviam sinais à adenosina trifosfatase hidrogénio-potássio (ATPase H+/K+), ou bomba de protões, resultando na segregação ácida.[156] Quando ativada, a bomba de protões gástrica bombeia iões H+ em troca de iões K+.[135][136] Deste modo, a forma mais eficaz de travar este processo é através do bloqueio do seu principal responsável, a ATPase H+/K+. Para tal, são utilizados antagonistas desta bomba, que a bloqueiam através da ligação competitiva ao K+ (Figura 14).[137] Atualmente, os inibidores da bomba de protões (IBP) são principalmente utilizados na diminuição da referida segregação de ácido gástrico, pois a sua ação bloqueia a bomba responsável pela mesma.[134] Assim, são aplicados no tratamento do refluxo gástrico e gastrite, bem como de úlceras estomacais e duodenais.[133] O efeito produzido por estes fármacos é independente do estímulo inicial, contrariamente à inibição provocada por outro tipo de moléculas, como os antagonistas de recetores de histamina, por exemplo.[156] Os IBP são bases fracas, pelo que são capazes de atravessar as membranas das células parietais, cujo interior consiste num meio extremamente ácido, acumulando-se nos canalículos secretores das mesmas.[134] Aqui, sofrem um rearranjo químico, transformando-se na sua forma ativa, a qual inibe a atividade da bomba de protões.[138][139] Pensa-se que as terapias baseadas em IBP estejam, a longo prazo, relacionadas com um risco aumentado de fratura óssea. A solubilidade do cálcio é um fator importante para a sua absorção[140], e um meio ácido facilita a assimilação deste mineral.[141] Por conseguinte, a má absorção de cálcio, decorrente da inibição de ácido no lúmen gastrointestinal, pode explicar esta situação. Verificou-se, em estudos com ratos, que tratamentos com IBP originaram uma má absorção de fosfato de cálcio, assim como uma diminuição da densidade mineral óssea. Após uma redução do pH gastrointestinal, ambas foram novamente normalizadas[142][143], o que sugere que o ácido gástrico desempenha um papel importante na absorção de cálcio.[144] Alguns estudos, ainda, examinaram o efeito de terapias com base em IBP na absorção de cálcio em humanos: entre indivíduos jovens e saudáveis, não foi causada uma redução significativa[145]; no entanto, com uma população acima dos 65 anos, foi verificado um impacto considerável.[146] Esta situação pode ter que ver com o facto de a população mais envelhecida apresentar uma grande taxa de gastrite que, em conjunto com terapias de inibição da segregação ácida, faz decrescer, de uma forma muito mais expressiva, a assimilação deste mineral.[144] 29 Figura 14 – Inibição da bomba de protões gástrica através da ligação competitiva ao potássio.[156] 36 Parte 2 37 Introdução A reabsorção óssea é efetuada pelos osteoclastos, pelo que estas células desempenham um papel decisivo no desenvolvimento de patologias ósseas, assim como no processo de implantação e integração de biomateriais para regeneração óssea. Por conseguinte, torna-se necessário aprofundar o conhecimento acerca do seu funcionamento. Os biomateriais compostos por HA são facilmente osteointegrados, possuindo propriedades ideais para a utilização em contexto ósseo. Quando implantados no osso, funcionam como suporte estrutural, sendo absorvidos à medida que são substituídos por novo tecido ósseo, a uma taxa que pode ser controlada de acordo com as características da HA escolhida. Além disso, podem também ser utilizados como veículos de libertação prolongada de fármacos, o que representa uma enorme vantagem no tratamento de doenças ósseas. A ação dos IBP bloqueia a segregação de ácido por parte dos osteoclastos, através da inibição da bomba de protões vacuolar. Considerando este facto, levanta-se a possibilidade da utilização destes fármacos de modo a modular a atividade osteoclástica. Assim, o presente trabalho pretende aprofundar o conhecimento sobre o potencial de aplicação dos IBP neste contexto, pois pensa-se que estes fármacos exerçam influência sobre a osteoclastogénese. Foi utilizada HA como substrato dos meios de cultura celulares, onde se avaliou a ação dos IBP sobre a atividade das células osteoclásticas, pois esta conjunção demonstra ser extremamente relevante na pesquisa de futuras aplicações no campo da regeneração óssea. Deste modo, avaliou-se, na superfície nano e microestruturada da HA, a modulação da osteoclastogénese pelos IBP, usando precursores osteoclásticos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico humano. Estas células foram mantidas na presença dos fatores osteoclastogénicos M-CSF e RANKL, diferenciandose em osteoclastos. Posteriormente, foram administrados três IBP, o omeprazol, esomeprazol, e lansoprazol. A resposta celular foi caracterizada através da quantificação de ADN total, atividade da TRAP, e capacidade de reabsorção de Ca2+. As culturas celulares foram ainda visualizadas por microscopia eletrónica de varrimento, e foi observada, por microscopia ótica confocal, a existência de células com anéis de actina e com a expressão de VNR e CTR. Foi ainda analisado, na presença e ausência de IBP, o envolvimento das vias de sinalização MEK, NF-kB, JNK e p38 MAPK. 38 Materiais e métodos Preparação das pastilhas de HA micro e nanoestruturadas A preparação das pastilhas de HA microestruturada (Plasma BiotalLimited) e nanoestruturada (Fluidinova S.A. - Portugal, nanoXIM.HAp202) envolveu a utilização de um molde (Figura 17), no qual foram depositados 75 mg de pó de HA por pastilha, sendo esta compactada através de uma prensa uniaxial (Mestra snow P3) (Figura 18), a uma pressão de sensivelmente 20 Bar. Foi utilizada, para a pesagem do pó, uma balança analítica (Mettler Toledo AB204-S), sendo o diâmetro e espessura dos discos preparados medidos através de um paquímetro digital Mitutoyo. Figura 17 - Molde usado para a preparação de pastilhas de HA (desmontado e montado). Figura 18 - Prensa uniaxial utilizada na compactação do pó de HA. 39 Após a compactação do pó na forma de pastilha, procedeu-se à sua sinterização, utilizando temperaturas diferentes de acordo com a cristalinidade. Assim, utilizou-se, para as pastilhas de HA microestruturada, uma temperatura de sinterização de 1300°C, com um patamar de 1 hora, e uma taxa de aquecimento de 4°C/min. Por sua vez, as pastilhas de HA nanoestruturada foram sinterizadas a uma temperatura de 830°C, com um patamar de 15 minutos e uma taxa de aquecimento de 20°C/min. O arrefecimento de ambos os tipos de pastilhas (Figura 19) realizou-se no interior do forno desligado, até ser atingida a temperatura ambiente. Figura 19 - Pastilhas sinterizadas de HA nanoestruturada (esquerda) e microestruturada (direita). 40 Culturas de precursores osteoclásticos Isolamento de células mononucleadas de sangue periférico humano Foram utilizadas, como precursores osteoclásticos, células mononucleadas de sangue periférico humano (peripheral blood mononuclear cells - PBMC), isoladas a partir de sangue proveniente de dadores do sexo masculino, com idades compreendidas entre os 25 e os 35 anos. Primeiramente, diluiu-se o sangue na proporção de 1:2 em PBS suplementado com 2 mM de EDTA, sendo este transferido para tubos com FicollPaqueTM PREMIUM (GE Healthcare Bio-Sciences). Em seguida, procedeu-se à sua centrifugação a 400g, por um período de 30 minutos, após o qual se recolheram e transferiram as PBMC para um novo tubo (Figura 20), tendo sido, mais uma vez, adicionado PBS + 2 mM de EDTA, assim como realizada nova centrifugação a 400g, por um período de 10 minutos. Após descartar o sobrenadante, os dois últimos passos foram repetidos. Para concluir, foi novamente adicionado PBS e efetuou-se a contagem das PBMC num hematocitómetro (Celltac MEK-5103). Culturas celulares As PBMC foram semeadas sobre as pastilhas de HA micro e nanoestruturada, a uma densidade de 1,5x106 células/cm2, em placas com 48 poços. As culturas celulares foram mantidas em α-MEM (Alpha modified minimum essential medium), suplementado com 30% (V/V) de soro humano dos mesmos dadores das PBMC, 100 IU/mL de penicilina, 2,5 μg/mL de estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina e 2 mM de L-glutamina. O meio de cultura foi suplementado com dois fatores osteoclastogénicos, M-CSF (25ng/mL) e RANKL (40ng/mL) (M+R), e mantido na ausência (controlo) ou presença de diferentes concentrações (10-7M a 10-4M) de três IBP (omeprazol, esomeprazol e lansoprazol) (Figura 20). Adicionalmente, as culturas celulares foram tratadas com a menor concentração de cada IBP que promoveu um efeito significativo no comportamento osteoclástico (10-6M), e suplementadas com diferentes inibidores de vias de sinalização (IVS) importantes para a osteoclastogénese[184], os quais se encontram indicados na Tabela 2. Tabela 2 - Inibidores das vias de sinalização utilizados. Inibidor Concentração (µM) Via de sinalização inibida U0126 1 MAPK/ERK kinases (MEK) PDTC 10 Nuclear Factor-kappa B (NF-kB) SP600125 10 c-Jun N-terminal Kinase (JNK) SB202190 5 p38 mitogen-activated protein kinase 41 As culturas celulares foram mantidas numa atmosfera húmida com 5% de CO2, a 37˚C, por um período de 21 dias, sendo o meio de cultura substituído uma vez por semana (Figura 20). Retiraram-se amostras ao 14º e 21º dia, de modo a quantificar a atividade da TRAP, o ADN celular, a atividade de reabsorção de HA, e a apoptose, assim como para observar a morfologia celular, através de microscopia ótica confocal e microscopia eletrónica de varrimento (scanning electron microscopy - SEM). Figura 20 - Culturas de precursores osteoclásticos. a) Isolamento de células mononucleadas de sangue periférico humano (PBMC): as PBMC (precursores osteoclásticos) foram isoladas a partir de sangue humano, o qual foi diluído em PBS e suplementado com EDTA, sendo então transferido para tubos com Ficoll-PaqueTM PREMIUM. Centrifugou-se o sangue, tendo-se então recolhido e transferido as PBMC para um novo tubo. Após descartar o sobrenadante, foi novamente adicionado PBS e efetuou-se a contagem das PBMC num hematocitómetro. b) Culturas celulares: semearam-se então as PBMC sobre pastilhas de HA micro e nanoestruturadas, sendo as culturas mantidas em α-MEM suplementado com soro humano, antibióticos, antifúngicos e aminoácidos. O meio de cultura foi ainda suplementado com MCSF e RANKL, e as culturas foram mantidas na ausência (controlo) ou presença de diferentes concentrações omeprazol, esomeprazol e lansoprazol, por um período de 21 dias. Imagem adaptada de [185]. 42 Quantificação da atividade da TRAP A TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) é uma enzima segregada pelos osteoclastos durante a sua atividade. Por essa razão, é utilizada como marcador do processo reabsortivo, sendo a quantidade libertada proporcional à taxa de reabsorção. A atividade da TRAP foi quantificada através do método colorimétrico de hidrólise de pNPP, um substrato cromogénico que, quando hidrolisado por uma fosfatase, origina para-nitrofenol. Este composto, num meio alcalino, exibe uma cor amarela, permitindo a leitura da absorvância, que se relaciona com a quantidade de TRAP presente. Assim, as culturas celulares foram lavadas 2 vezes com PBS, tendo sido solubilizadas com 0,1% Triton X-100 (V/V) e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. Foi acrescentada uma solução de 22,5mM pNPP, preparada em 0,225M de acetato de sódio, 0,3375M de KCl, 0,1% Tx-100, 22,5mM de tartarato de sódio, e 0,225mM de cloreto de ferro, a um pH de 5,8. Incubou-se 1 hora a 37⁰C, tendose bloqueado a reação através da adição de NaOH 5M. Em seguida, determinou-se a absorvância a 400nm num leitor de ELISA (Synergy HT, Biotek). A atividade da TRAP foi normalizada tendo em consideração a concentração de ADN celular total para cada condição experimental, sendo os resultados apresentados em nmol/min.µg-1ADN. Quantificação do ADN A quantificação do ADN foi efetuada com o Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, segundo as instruções do fabricante. As células foram incubadas com o corante PicoGreen, e a fluorescência transmitida foi quantificada num fluorímetro (Synergy HT, Biotek), com um comprimento de onda de excitação a 485nm, e de emissão a 528nm. Microscopia Ótica Confocal As culturas celulares foram lavadas duas vezes com PBS, tendo sido fixadas com 3,7% (v/v) de para-formaldeído à temperatura ambiente, por um período de 15 minutos. Em seguida, foram novamente lavadas com PBS por duas vezes, e marcadas para a actina com 5U/mL Alexa Fluor® 647-Faloidina (Invitrogen), e para os recetores da vitronectina e da calcitonina (VNR e CTR, respetivamente) com 50μg/mLIgGs de rato anti-VNR e anti-CTR (R&D Systems). A deteção das IgGs anti-VNR e anti-CTR foi efetuada com 2µg/mL IgGs anti-rato marcados com Alexa Fluor® 488 (Invitrogen). No final, as culturas celulares foram visualizadas por microscopia ótica confocal. 43 Microscopia Eletrónica de Varrimento Lavaram-se as culturas celulares duas vezes com PBS, sendo as células fixadas com 1,5% glutaraldeído (preparado em 0,14M cacodilato de sódio) durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, as culturas foram lavadas duas vezes com água destilada, e procedeu-se à desidratação das amostras, utilizando séries de diferentes soluções de etanol, até se atingir o ponto crítico. Posteriormente, foram revestidas com paládio-ouro e observadas através de microscopia eletrónica de varrimento, num microscópio equipado com um espetroscópio de dispersão de energias de raios-X FEI Quanta 400FEG/EDAX Pegasus X4M sob condições de vácuo. Quantificação do Ca2+ extracelular Ao sétimo dia de incubação, o meio de cultura foi substituído por um meio sem cálcio. Ao 14º e 21º dia determinou-se a concentração de cálcio existente, através do kit de quantificação CalcifluorTM. A fluorescência transmitida foi determinada num fluorímetro (Synergy HT, Biotek). 44 Resultados Caracterização da diferenciação osteoclástica das culturas de PBMC na presença de IBP Quantidade total de ADN As culturas de PBMC, efetuadas na superfície das pastilhas de HA micro e nanoestruturada, foram mantidas na presença de fatores osteoclastogénicos (RANKL e M-CSF), e na ausência (controlo) ou presença de três diferentes IBP (omeprazol, esomeprazol e lansoprazol), tendo sido caracterizadas ao 14º e 21º dia, relativamente à quantidade total de ADN (Figuras 21 e 22). Figura 21 - Efeito das diferentes concentrações dos IBP utilizados na quantidade total de ADN das culturas de PBMC na superfície de pastilhas de nHA. * Significativamente diferente do controlo. A quantificação de ADN permite uma informação aproximada sobre a densidade celular de cada condição experimental. Assim, verificou-se que os IBP utilizados promoveram um padrão de resultados semelhantes, de acordo com as diferentes concentrações administradas. Globalmente, a resposta celular diminuiu com o aumento da concentração dos IBP. 45 Comparativamente com o controlo, ao 21º dia, a maior concentração de IBP utilizada (10-4 M) causou a diminuição mais significativa na densidade celular. A inibição mais expressiva deu-se com o esomeprazol (~56%), seguida pelo omeprazol (~44%) e, por fim, o lansoprazol (~43%) (Figura 21). Figura 22 - Efeito das diferentes concentrações dos IBP utilizados na quantidade total de ADN das culturas de PBMS na superfície de pastilhas de mHA. * Significativamente diferente do controlo. As diferentes concentrações de IBP causaram, nas pastilhas de mHA, um efeito na densidade celular semelhante ao causado nas pastilhas nHA, ou seja, comparativamente ao controlo, a concentração de 10-4 M foi, ao 21º dia, aquela que originou uma maior diminuição da densidade celular. O omeprazol gerou a maior inibição (~80%), seguido pelo esomeprazol (~47%), e pelo lansoprazol (~47%) (Figura 22). 52 significativo quando administrado o esomeprazol (~56%), e total com o omeprazol (~100%). Pelo contrário, na presença de lansoprazol, o efeito inibitório do U0126 foi inferior ao controlo (~23%). O PDTC causou uma inibição completa na ausência de IBP. No entanto, esta inibição foi apenas parcial quando administrado omeprazol (~76%), esomeprazol (~31%) e lansoprazol (~45%). Na ausência de IBP, o SP600125 promoveu um efeito inibitório pouco significativo relativamente ao controlo (~9%). Quando utilizados o esomeprazol e o lansoprazol, a inibição foi mais significativa (~68% e ~38%, respetivamente). Na presença de omeprazol, não foi observado nenhum efeito relevante. A inibição fomentada pelo SB202190, sem a presença de IBP, obteve um valor de ~58%. Na presença do omeprazol e esomeprazol, este efeito não foi tão acentuado (~27% e ~37%, respetivamente), não se tendo verificado qualquer efeito de relevância na presença de lansoprazol (Figura 28). 53 Atividade da TRAP Avaliou-se, ao 14º e 21º dia, a atividade da TRAP nas culturas de PBMC efetuadas na superfície de pastilhas de nHA e mHA. Estas foram mantidas na presença da menor concentração de IBP que causou um efeito relevante na ação osteoclástica (106 M), e suplementadas com diferentes inibidores das vias de sinalização relacionados com a osteoclastogénese: U0126 (1 µM), PDTC (10 µM), SP600125 (10 µM) e SB202190 (5 µM). Os resultados recolhidos foram normalizados com a quantificação de ADN correspondente (Figuras 29 e 30). Figura 29 - Quantificação da atividade da TRAP nas culturas de PBMC na superfície de pastilhas nHA, tratadas com diferentes IBP na concentração de 10-6 M, na presença ou ausência de diferentes inibidores das vias de sinalização. * Significativamente diferente do controlo. Verificou-se que a atividade da TRAP foi negativamente afetada pelos IVS administrados. Comparativamente ao controlo, na ausência de IBP, o U0126 causou uma diminuição significativa na atividade da TRAP (~63%). A administração de IBP contrariou este efeito, sendo a inibição causada menor (lansoprazol com ~60%, e esomeprazol com ~20%), ou irrisória (omeprazol). O PDTC originou uma inibição total (~100%) na ausência de IBP, assim como na presença de omeprazol. Esta inibição foi apenas parcial quando administrado esomeprazol (~52%) e lansoprazol (~88%). O 54 SP600125 promoveu uma redução expressiva da atividade da TRAP na ausência de IBP (~85%). O efeito foi menor com a administração destes fármacos (~25%, ~42% e ~24% para o omeprazol, esomeprazol e lansoprazol, respetivamente). Nas culturas sem IBP, o SB202190 causou um decréscimo relevante na atividade da TRAP (~53%). A inibição obteve valores inferiores na presença de lansoprazol (~20%), e insignificantes com a utilização de omeprazol, tendo, no entanto, sido superior com o esomeprazol (~56%). Todos os resultados descritos correspondem ao 21º dia (Figura 29). Figura 30 - Quantificação da atividade da TRAP nas culturas de PBMC na superfície de pastilhas mHA, tratadas com diferentes IBP na concentração de 10-6 M, na presença ou ausência de diferentes inibidores das vias de sinalização. * Significativamente diferente do controlo. Ao 21º dia, nas culturas de controlo em mHA, o U0126 promoveu um efeito inibitório de ~20%. Esta inibição foi mais expressiva com esomeprazol (~39%), e total quando administrado omeprazol (~100%). No entanto, na presença de lansoprazol, a atividade da TRAP não foi significativamente alterada. O PDTC originou um efeito inibitório completo (~100%) na ausência de IBP. Esta inibição foi apenas parcial na presença de omeprazol (~54%), esomeprazol (~75%) e lansoprazol (~57%). O SP600125 não afetou a atividade da TRAP de um modo significativo na ausência de IBP, nem na presença de omeprazol e lansoprazol, mantendo-se a inibição moderada após suplementação com esomeprazol (~29%). Nas culturas de controlo, o SB202190 causou uma inibição de ~48%, sendo o efeito menor com a utilização de omeprazol (~25%) e lansoprazol (~35%), e maior com a utilização de esomeprazol (~56%) (Figura 30). 55 Caracterização da capacidade de reabsorção de HA De modo a determinar a atividade de reabsorção de HA nas diferentes condições experimentais testadas, foi quantificada a libertação de Ca2+ no meio de cultura. As PBMC foram mantidas na ausência e presença de omeprazol, esomeprazol e lansoprazol, sendo utilizada a menor concentração de cada IBP que causou um efeito significativo no comportamento osteoclástico (10-6 M). Os resultados apresentados correspondem aos valores obtidos para cada condição experimental, normalizados com o valor de Ca2+ libertado no meio de cultura pelas pastilhas de HA na ausência de células (Figura 31). Figura 31 - Quantificação do Ca2+ extracelular em µM nas pastilhas de nHA (a) e mHA (b). * Significativamente diferente do controlo. A presença de IBP provocou, em ambos os tipos de HA, uma redução da quantidade de Ca2+ extracelular. Na nHA, a inibição causada pelos três IBP foi semelhante, sendo, no entanto, o maior efeito provocado pelo esomeprazol (~33%), seguido pelo lansoprazol (~29%) e, finalmente, pelo omeprazol (~25%) (Figura 31a). Na superfície microestruturada, os IBP produziram um efeito ligeiramente mais acentuado, com a maior inibição originada pelo lansoprazol (~47%), seguido pelo esomeprazol (~43%) e omeprazol (~35%) (Figura 31b). 56 Visualização das culturas celulares por Microscopia Eletrónica de Varrimento Ao 21º dia, as culturas celulares foram observadas através de microscopia eletrónica de varrimento. Os respetivos resultados encontram-se na Figura 32. Figura 32 - Análise por Microscopia Eletrónica de Varrimento das culturas celulares tratadas com omeprazol. É possível observar os osteoclastos na superfície das pastilhas de HA nano (A, B) e microestruturadas (C, D), e a respetivas lacunas na nHA (C) e mHA (D). As culturas celulares demonstraram, na presença e ausência de IBP, uma distribuição de osteoclastos homogénea nas superfícies de nHA e mHA. Verificou-se que a morfologia celular foi afetada pelas características da superfície de HA, tendo-se observado uma conformação celular mais esférica sobre a área microestruturada. 57 Visualização das culturas celulares por Microscopia Ótica Confocal Visualização de células com anéis de actina e expressão de VNR e CTR Após marcação, as células foram observadas por microscopia ótica confocal, ao 21º dia, de modo a verificar a existência de características osteoclásticas, em particular, anéis de actina e expressão de VNR e CTR (Figura 33). Figura 33 - Observação, ao 21º dia, através de microscopia ótica confocal, das culturas de PBMC efetuadas na superfície de HA na presença de M-CSF e RANKL, e na ausência (controlo) ou presença de diferentes IBP. São demonstrados os osteoclastos com uma coloração azul para a actina, e uma coloração verde para os recetores da vitronectina (VNR) ou recetores da calcitonina (CTR). As barras brancas representam 120 μm. Na ausência de IBP, as culturas de PBMC realizadas em ambas as superfícies de HA, demonstraram um número elevado de células com marcação positiva para a actina e para o VNR e CTR. Por outro lado, verificou-se que, na presença destes fármacos, o número de células osteoclásticas diminuiu significativamente. 58 Discussão O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de aprofundar o estudo do perfil osteoclastogénico dos IBP em superfícies de HA micro e nanoestruturadas, nomeadamente o omeprazol, esomeprazol e lansoprazol. Para tal, foram isolados, e semeados nas referidas superfícies, precursores osteoclásticos provenientes de sangue periférico humano, os quais foram mantidos na presença dos fatores osteoclastogénicos M-CSF e RANKL e, posteriormente, suplementados com IBP. O estudo da interação entre as células osteoclásticas e a superfície de implantes ósseos possui uma grande relevância, pois a maioria dos materiais utilizados na substituição/regeneração óssea requer que ocorra o processo de reabsorção osteoclástica na área de contacto com os tecidos, de modo a desempenhar corretamente as suas funções. Existe, também, um enorme potencial de aplicação de IBP neste contexto. No entanto, atualmente, a informação relativa aos efeitos destes fármacos sobre os processos osteoclastogénicos é contraditória, pelo que existe a necessidade de investigar com maior detalhe este tema. Os IBP encontram-se entre os fármacos mais prescritos do mundo, sendo principalmente usados na terapia de problemas relacionados com o excesso de ácido gástrico.[187] Por serem bases fracas, possuem a capacidade de atravessar a membrana das células parietais, cujo interior consiste num meio extremamente ácido.[134] Aqui, convertem-se na sua forma ativa, inibindo a atividade da bomba de protões gástrica, responsável pela segregação ácida[154][139], e possibilitando o tratamento de doenças como a esofagite e úlceras, entre outras.[133] Uma vez que o mecanismo de atuação dos osteoclastos requer, do mesmo modo, o envolvimento de uma bomba de protões (vacuolar), que promove a acidificação e degradação do tecido ósseo, os IBP surgem como potenciais moduladores da atividade osteoclástica. Os estudos mais recentes apontam, porém, no sentido de existirem consequências adversas decorrentes da terapêutica com base nestes fármacos, incluindo um risco aumentado de fraturas ósseas.[144][186][189][190] Assim, foi demonstrado que os tratamentos com IBP podem, quando realizados por períodos prolongados, causar uma absorção deficiente de cálcio.[196–199] A absorção deste mineral depende da existência de um meio ácido, pelo que este tipo de terapia causa um desequilíbrio na sua assimilação, resultando numa maior taxa de perda óssea.[188][146] O uso prolongado destes fármacos conduz também a um decréscimo da reabsorção de vitamina B12, o que pode originar um baixa densidade mineral e, consequentemente, fraturas.[191] Outros estudos apontam, contudo, no sentido contrário, não relacionando o uso de IBP com uma redução significativa da densidade mineral[200], nem associando estas moléculas a uma absorção de cálcio deficiente.[201][202] Alguns destes, efetuados in vitro e in vivo, sugerem mesmo que os IBP podem causar um aumento da densidade óssea, devido ao seu efeito de diminuição da reabsorção óssea, pelo bloqueio da bomba de protões osteoclástica.[186][192-194] Pensa-se ainda que o aumento do pH gástrico, decorrente da administração oral destes fármacos, pode originar hipergastrinemia, seguindo-se um estado de hiperparatiroidismo, que conduz a um maior turnover ósseo.[203] 59 A utilização de biomateriais permitiu a substituição dos enxertos autólogos e alogénicos, cuja utilização provocava várias complicações[52][53], e tornou possível a mimetização da estrutura tridimensional do tecido ósseo, apresentando um meio de proliferação celular mais eficiente.[54] Deste modo, existe atualmente uma perspetiva mais favorável de regeneração óssea, associada a tratamentos mais efetivos, através da libertação local de fármacos.[50] A osteointegração acontece com a ligação dos biomateriais ao osso, através da síntese de tecido ósseo na interface entre ambos.[70] Este processo depende das propriedades de osteoindução e osteocondução do biomaterial utilizado[73], e pode ser acelerado através do revestimento do implante com HA.[75] O sucesso da regeneração óssea está dependente, no entanto, não só da existência de osteointegração e osteossíntese, como também do processo de vascularização e reabsorção óssea.[51] A HA não só revela propriedades osteoindutivas e osteocondutoras[82][83], como é completamente biocompatível[84], devido à sua semelhança estrutural com a componente inorgânica da matriz óssea, pelo que a síntese deste mineral manifesta uma grande relevância no que concerne a regeneração óssea.[78][79] Contudo, apresenta uma reduzida resistência à fratura, o que causa restrições na sua aplicação.[89] Além disso, devido à similaridade com o osso, possui uma baixa taxa de biodegradação[90][91], que leva à sua permanência no organismo por períodos de tempo demasiadamente longos, o que geralmente não é pretendido.[94][95] Para o sucesso dos processos relacionados com a regeneração óssea, é aconselhável a utilização de biomateriais que permitam uma rápida e eficiente formação de tecido ósseo na sua superfície e, se necessário, no seu interior. A HA nanoestruturada apresenta uma constituição porosa que fornece uma maior biocompatibilidade e osteocondução que a microHA, devido à sua estrutura altamente interligada.[113] Considerando também o facto de as moléculas orgânicas interagirem a uma escala nanométrica, a nHA demonstra um maior potencial de aplicabilidade[118], pois permite reações moleculares mais céleres, e um maior controlo sobre as interações proteicas e respostas celulares.[119] Além disso, da sua maior área de superfície, advém uma resistência a fraturas superior.[120] Por conseguinte, a conceção de uma superfície de HA que permita o controlo da taxa de degradação óssea pelos osteoclastos, possibilitará também a regulação da resposta celular na sua superfície, bem como a administração de agentes terapêuticos. Este cenário é possível através do controlo da rugosidade e complexidade da superfície de HA, amplificando o seu potencial osteogénico, de modo a produzir implantes mais eficientes.[195] No presente trabalho, foi utilizada a técnica de Microscopia Eletrónica de Varrimento, de modo a efetuar a observação da topografia das pastilhas de hidroxiapatite micro e nanoestruturada. Através da avaliação do diâmetro médio dos grãos de HA, foram observadas diferenças significativas entre ambas as superfícies testadas (ØnHA = 70nm e ØmHA = 3,9µm). As culturas celulares foram mantidas na presença dos fatores osteoclastogénicos M-CSF e RANKL, que desempenham um papel fundamental na proliferação e diferenciação dos progenitores osteoclastogénicos.[1][14] Pensa-se que este processo seja 60 mais evidente na superfície de pastilhas de HA microestruturada, tendo sido referida uma proporcionalidade entre a dimensão do grão de HA e a taxa de osteoclastogénese.[204] Os resultados obtidos neste estudo, relativamente à quantificação de ADN, atividade da TRAP, e capacidade de reabsorção de HA, em diferentes condições experimentais, na superfície de mHA e nHA, vão ao encontro desta ideia, ou seja, verificou-se que as culturas de PBMC, efetuadas em mHA, exibiram uma taxa superior de adesão celular e diferenciação osteoclástica, relativamente à nHA. Recentemente, foi demonstrado que a atividade da TRAP atingiu valores superiores em superfícies nanoestruturadas, em comparação com as microestruturadas, tendo, inclusivamente, a observação por MEV revelado a presença de lacunas de reabsorção apenas nesse tipo de superfície.[195] O referido estudo usou, porém, osteoclastos diretamente isolados de ossos longos de coelhos recém-nascidos, e a área utilizada baseava-se em dentina isolada a partir de marfim de elefante, sendo por isso diferentes dos elementos utilizados no presente estudo. Outros autores referem a obtenção de uma maior taxa de reabsorção em nHA, e um grande estímulo da diferenciação de células osteoclásticas nessa superfície, mas esta condição só foi obtida após uma profunda redução do seu conteúdo de carbonato.[205] Assim, existe uma relação direta entre as características físico-químicas de um biomaterial e o comportamento celular, em particular, o comportamento osteoclástico. Consequentemente, surge a possibilidade de projeção de superfícies de HA capazes de induzir taxas ótimas de formação e degradação óssea, especificamente desenhadas para diferentes aplicações no contexto ósseo. O efeito causado, no presente estudo, pelos IBP nas células osteoclásticas aparentou ser dependente da dose administrada.[206] Foram utilizadas, de modo a abranger uma grande gama, as concentrações de 10-7 M e 10-4 M, nas quais se incluem as máximas concentrações plasmáticas obtidas durante uma terapia com IBP. É de realçar que estes valores fornecem apenas informação sobre a concentração da forma inalterada dos IBP na corrente sanguínea, não sendo conhecidas as concentrações das suas formas modificadas pelo baixo pH, principalmente, no tecido ósseo. Além disso, o processo de difusão dos IBP no tecido ósseo é ainda apenas parcialmente conhecido, não sendo possível determinar se ocorreu a conversão do fármaco na sua forma ativa, ou se esta teve lugar em localizações específicas.[182][207] Existem também vários estudos in vitro, realizados a um pH neutro, nos quais não foi demonstrada a formação do composto ativo dos IBP, o que levanta a hipótese de estes afetarem as células ósseas na sua forma original.[208-210] Observou-se que, conforme esperado[203], as PBMC se diferenciaram em osteoclastos, após exposição aos fatores osteoclastogénicos M-CSF e RANKL, estando estes resultados em concordância com estudos realizados através do mesmo sistema de cultura.[211] A presença de células osteoclásticas funcionais foi confirmada pela expressão de diversos genes osteoclásticos, pela atividade da TRAP e pela capacidade de reabsorção de HA. Foi verificado um decréscimo na densidade e diferenciação celular, provocado pelos IBP, de acordo com a dose administrada, principalmente com concentrações iguais ou superiores a 10-6 M, um valor aproximado da máxima concentração 61 plasmática (Cmax) descrita para os IBP.[212][213] A diminuição na densidade osteoclástica foi ratificada pelo aumento da taxa de apoptose, atingindo os 15% para as nHA e os 25% para as mHA. Relativamente à diferenciação celular, foi registada uma redução até 25% para as nHA e até 30% para as mHA. Quantificou-se, também, a concentração de Ca2+ extracelular nas culturas, com o objetivo de avaliar a taxa de reabsorção nas diferentes condições experimentais, concluindo-se que os resultados foram ainda mais expressivos, ou seja, a concentração de 10-6 M causou uma inibição da reabsorção osteoclástica compreendida entre 25 e 33% em nanoHA, e entre 35 e 47% em microHA. Em ambas as superfícies, os valores de inibição obtidos para cada um dos três fármacos administrados foram aproximados entre si. Porém, na mHA, principalmente na presença de lansoprazol, a percentagem de inibição da reabsorção foi superior relativamente ao controlo. Assim, verificou-se que o comportamento osteoclástico foi diretamente influenciado pela superfície de HA utilizada, registando-se uma taxa de diferenciação superior na superfície das pastilhas de HA microestruturada. Foi também demonstrado, em ambas as superfícies, que a osteoclastogénese é amplamente afetada pelos IBP, tendo o omeprazol causado o efeito mais evidente a este nível, tanto na presença de mHA, como nHA. Estes dados demonstram que os IBP bloqueiam, de facto, a reabsorção osteoclástica, sendo mais efetivos na superfície microestruturada. A razão mais plausível para este acontecimento tem que ver com a sua capacidade de inibição da bomba de protões osteoclástica.[181][214] Foi estudada, in vivo, a influência dos IBP na atividade osteoclástica, sendo observada, em humanos, uma alteração dos marcadores de reabsorção óssea na urina[194] e, em animais, uma inibição da reabsorção osteoclástica de implantes à base de fosfato de cálcio.[182] Deste modo, conclui-se que os IBP afetam, de forma mais acentuada, a função celular do que a proliferação. Este facto relaciona-se com uma possível indução, por parte destes fármacos, de uma citotoxicidade direta não específica, que é posteriormente amplificada pelos efeitos inibitórios específicos em determinados parâmetros funcionais, tais como a reabsorção osteoclástica.[206][210] A diferenciação e a atividade osteoclástica envolvem várias vias de sinalização intracelulares, que utilizam diferentes mediadores, bem como complexos mecanismos de modulação simples e cruzada, permitindo aos osteoclastos o desempenho preciso das suas funções.[215] No presente estudo, procedeu-se à avaliação, em ambas as superfícies de HA, do impacto dos IBP nas vias de sinalização referidas, através da quantificação da atividade da TRAP, e da quantidade total de ADN. De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que estes fármacos provocaram, de facto, alterações no envolvimento de algumas das vias testadas. Apesar da existência de estudos que referem uma redução da osteoclastogénese após o bloqueio da via MEK[216], foi demonstrado que o U0126, o inibidor da mesma via de sinalização utilizado neste estudo, induziu um aumento da diferenciação osteoclástica, ou seja, esta via aparentou regular negativamente a osteoclastogénese, tal como proposto por outros autores.[217][218] 68 [41] Udagawa N et al. 1990. Origin of osteoclasts: Mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells. [42] Kong YY et al. 1999. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerina ligand. [43] Lacey DL et al. 1998. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. [44] Hofbauer LC et al. 1999. 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