Síntese e Avaliação Biológica de Prolinomiméticos do PLG com Potencial Atividade Neuroprotetora

Síntese e Avaliação Biológica de Prolinomiméticos do PLG com Potencial Atividade Neuroprotetora Ivo Emanuel Sampaio Dias Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto 2013 Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ____/____/______ Síntese e Avaliação Biológica de Prolinomiméticos do PLG com Potencial Atividade Neuroprotetora Ivo Emanuel Sampaio Dias Mestrado em Bioquímica Departamento de Química e Bioquímica 2013 Orientador José Enrique Rodríguez Borges, Professor Auxiliar com Agregação, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Coorientador Xerardo García Mera, Professor Titular, Faculdade de Farmácia da Universidade de Santiago de Compostela O conhecido é finito, o desconhecido infinito; intelectualmente estamos numa ilha no meio dum oceano ilimitado de inexplicabilidade. O nosso dever em cada geração é recuperar um pouco mais de terra. T. H. Huxley, 1887 Agradecimentos Índice Geral IV 1.5. PLG COMO MODULADOR ALOSTÉRICO DE RECETORES DOPAMINÉRGICOS D2 E POTENCIAL FÁRMACO NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS NEURODEGENERATIVAS DO SNC .................................................................................. 47 1.5.1. Neuropéptido PLG .................................................................................................... 47 1.5.2. PLG como ligando alostérico .................................................................................... 49 1.5.3. Prolinomiméticos do PLG ......................................................................................... 51 1.6. ÂMBITO DO PROJETO E OBJETIVOS........................................................................ 54 1.6.1. Âmbito do Projeto ..................................................................................................... 54 1.6.2. Objetivos ................................................................................................................... 54 1.6.2.1. Síntese de prolinomiméticos .................................................................................. 55 1.6.2.2. Síntese dos tripéptidos prolinomiméticos do PLG ................................................. 55 1.6.2.3. Avaliação Biológica dos Prolinomiméticos ........................................................... 56 1.7. PLANO DE TRABALHOS ............................................................................................. 57 1.7.1. Plano de Síntese das Pseudoprolinas ......................................................................... 58 1.7.2. Plano de Síntese dos Prolinomiméticos do PLG ....................................................... 59 CAPÍTULO 2 - Parte Teórica e Discussão de Resultados ..................................................... 61 2.1. DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS PROLINOMIMÉTICOS ............................... 63 2.1.1. Planeamento Sintético ............................................................................................... 63 2.1.2. Aminoácidos não naturais: Síntese do ácidos carboxílicos 7-exo e 8-exo ................ 64 2.2. SÍNTESE DE AZABICICLOS COMO PRECURSORES PROLINOMIMÉTICOS ...... 65 2.2.1. Reação de Diels-Alder .............................................................................................. 65 2.2.2. Reação de aza-Diels-Alder: Síntese dos adutos 4-exo/5-endo .................................. 71 2.2.2.1. Síntese do 2-hidroxi-2-metoxietanoato de metilo (2): precursor do glioxilato de metilo ................................................................................................................................... 75 2.2.2.2. Síntese dos adutos 4-exo/5-endo ............................................................................ 78 2.2.3. Síntese de cis-dióis vicinais ....................................................................................... 81 2.2.3.1. Síntese de ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carboxilato de metilo (6-exo) .............................................................................................. 83 2.2.4. Síntese dos ácidos carboxílicos 7-exo e 8-exo .......................................................... 87 2.2.4.1. Hidrólise de ésteres ................................................................................................ 87 2.2.4.2. Hidrólise por catálise ácida .................................................................................... 87 2.2.4.3. Hidrólise por catálise alcalina ................................................................................ 88 2.2.4.4. Síntese do ácido ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carboxílico (7-exo) e do ácido ( )-exo-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxílico (8-exo) ................................................................................................................................. 89 2.3. SÍNTESE DE PÉPTIDOS ................................................................................................ 94 2.3.1. Fundamentos da Síntese Péptidica ............................................................................ 94 Índice Geral V 2.3.2. Natureza química e estereoquímica dos aminoácidos ............................................... 94 2.3.3. Abordagem Genérica de Proteção e Formação da ligação peptídica ........................ 95 2.3.4. Metodologia genérica para a formação de ligações peptídicas ................................. 96 2.3.5. Grupos Protetores ...................................................................................................... 98 2.3.5.1. Proteção do grupo amina ........................................................................................ 98 2.3.5.2. Proteção do grupo carboxílico .............................................................................. 101 2.3.6. Agentes acilantes e reagentes de acoplamento ........................................................ 102 2.3.6.1. Agentes acilantes .................................................................................................. 103 2.3.6.2. Acoplamento usando carbodiimidas .................................................................... 107 2.3.6.3. Ésteres Ativos ....................................................................................................... 109 2.3.6.4. Sais de fosfónio e amidínio/urónio ....................................................................... 110 2.3.7. Importância da Quiralidade ..................................................................................... 113 2.3.7.1. Mecanismos de racemização ................................................................................ 114 2.3.8. Síntese dos dipéptidos 11a-c ................................................................................... 115 2.3.9. Desproteção dos dipéptidos 11a-c: síntese dos dipéptidos 12a-c............................ 120 2.3.10. Síntese dos tripéptidos prolinomiméticos 13a-c/13a'-c' ....................................... 124 2.3.11. Hidrogenação ........................................................................................................ 129 2.3.11.1. Hidrogenação Catalítica ..................................................................................... 129 2.3.11.2. Processo de hidrogenação catalítica ................................................................... 132 2.3.12. Hidrogenólise catalítica ......................................................................................... 133 2.3.13. Hidrogenação e N-desbenzilação catalítica dos tripéptidos 13a-c/13a'-c': síntese dos tripéptidos desprotegidos 14a-c/14a'-c' ...................................................................... 134 2.3.14. Hidrólise dos ésteres 14a-c/14a'-c': síntese dos tripéptidos 15a-c/15a'-c' ........... 138 2.4. VIA DE SÍNTESE COMPLEMENTAR PARA A SÉRIE P*LG ................................. 143 2.4.1. Reação de aza-Diel-Alder: síntese dos adutos 17-exo e 18-endo ........................... 145 2.4.2. Síntese de ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxilato de etilo (19-exo) ................................................................................................................ 149 2.4.3. Síntese do ácido ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carboxílico (20-exo) .......................................................................................................... 152 2.4.4. Via de síntese alternativa para o tripéptido 15a/15a' .............................................. 155 2.4.4.1. Síntese dos tripéptidos 21a/21a'........................................................................... 155 2.4.4.2. Síntese dos tripéptidos 22a/22a'........................................................................... 158 2.4.4.3. Síntese dos tripéptidos 15a/15a'........................................................................... 162 2.5. CONSIDERAÇÕES NA SÍNTESE PEPTÍDICA .......................................................... 163 CAPÍTULO 3 - Parte Experimental ...................................................................................... 169 3.1. Aspetos Gerais ............................................................................................................... 171 Índice Geral VI 3.2. SÍNTESE DOS PRECURSORES PROLINOMIMÉTICOS ......................................... 174 3.2.1. Síntese de 2-hidroxi-2-metoxiacetato de metilo (2) ................................................ 174 3.2.2. Síntese de ( )-endo-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxilato de metilo (4-exo) e ( )-exo-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxilato de metilo (5-endo) ........................................................................................................................................... 177 3.2.3. Síntese de ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxilato de metilo (6-exo) ............................................................................................................... 183 3.2.4. Síntese do ácido ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carboxílico (7-exo) ............................................................................................................ 186 3.2.5. Síntese do ácido ( )-exo-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxílico (8exo) .................................................................................................................................... 189 3.2.6. ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxilato de etilo (17-exo) e ( )-endo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxilato de etilo (18-endo) .............................................................................................................. 192 3.2.7. Síntese de ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxilato de etilo (19-exo) ................................................................................................................ 200 3.2.8. Síntese do ácido ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carboxílico (20-exo) .......................................................................................................... 204 3.3. SÉRIE P*LG .................................................................................................................. 207 3.3.1. Síntese de (terc-butoxicarbonil)-L-leucilglicinato de metilo (11a) ......................... 207 3.3.2. Síntese do trifluoracetato de L-leucilglicinato de metilo amónio (12a) .................. 211 3.3.3. Síntese do {(1R,3S,4R)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carbonil}-Lleucilglicinato de metilo (13a) e do {(1S,3R,4S)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (13a') ...................................................................... 214 3.3.4. Síntese do {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (14a) e do {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (14a') ...................................................................................................................... 219 3.3.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil)}-L-leucilglicina (15a) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (15a').............. 224 3.3.6. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (21a) e de {(1R,3S,4S)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (21a') .......................... 229 3.3.7. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3carbonil}-L-leucilglicina (22a) e de {(1R,3S,4S)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (22a') ............................................. 234 3.3.8. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil)}-L-leucilglicina (15a) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (15a').............. 239 3.4. SÉRIE P*GL .................................................................................................................. 240 3.4.1. Síntese de (terc-butoxicarbonil)glicil-L-leucinato de metilo (11b) ......................... 240 3.4.2. Síntese do trifluoracetato de glicil-L-leucinato de metilo amónio (12b) ................. 244 Índice Geral VII 3.4.3. Síntese de {(1R,3S,4R)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carbonil}-glicil-Lleucinato de metilo (13b) e de {(1S,3R,4S)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3carbonil}glicil-L-leucinato de metilo (13b') ..................................................................... 247 3.4.4. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucinato de metilo (14b) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucinato de metilo (14b') ...................................................................................................................... 251 3.4.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucina (15b) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucina (15b') ............. 255 3.5. SÉRIE P*VA .................................................................................................................. 259 3.5.1. Síntese do (terc-butoxicarbonil)-L-valil-L-alaninato de metilo (11c)...................... 259 3.5.2. Síntese do trifluoracetato de L-valil-L-alaninato de metilo amónio (12c) ............... 263 3.5.3. Síntese de {(1R,3R,4S)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carbonil}-L-valil-Lalaninato de metilo (13c) e de {(1S,3S,4R)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (13c') .................................................................. 266 3.5.4. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (14c) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (14c') ................................................................................................................. 270 3.5.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alanina (15c) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alanina (15c') . 274 CAPÍTULO 4 - Ensaios Farmacológicos .............................................................................. 279 4.1 ENSAIOS DE COMPETIÇÃO AGONISTA/ANTAGONISTA DO RECETOR D2 DE DOPAMINA ......................................................................................................................... 281 4.1.1. Material e Métodos .................................................................................................. 281 4.1.1.1. Preparação de membranas .................................................................................... 282 4.1.1.2. Ensaios de união ao recetor D2 humano ............................................................... 282 4.1.2. Resultados ............................................................................................................... 282 CAPÍTULO 5 - Considerações Finais ................................................................................... 285 6. Anexos .................................................................................................................................. 289 II. Índice de Figuras Índice de Figuras XI ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.1: Os principais circuitos dopaminérgicos: via nigroestriada (a vermelho); via mesolímbica (a preto); via mesocortical (a azul); via tuberoinfundibular (a roxo) ............................ 33 Figura 1.2: Representação esquemática de um recetor de dopamina acoplado a proteínas G ... 34 Figura 1.3: Representação esquemática de um recetor de dopamina evidenciando a sua organização em sete domínios ............................................................................................................... 36 Figura 1.4: Representação dos ângulos diedros phi, ϕ, referente à rotação em torno da ligação N-Cα e psi, ψ, referente à rotação em torno da ligação Cα-C ...................................................... 41 Figura 1.5: Níveis de hierarquização estrutural das cadeias peptídicas, desde a sua sequência primária até à estrutura quaternária ............................................................................................. 42 Figura 1.6: Representação de um gráfico de Ramachandran contendo os valores de ϕ e ψ para várias estruturas. Apesar de ser possível a formação de hélices-α sinistrorsas, estas não surgem em proteínas ................................................................................................................................ 43 Figura 1.7: Representação de uma hélice-α (dextrorsa) ............................................................. 44 Figura 1.8: Representação de uma folha-β (antiparalela) e de uma folha-β pregueada (paralela). As setas indicam o a direção e o sentido das porções das cadeias apresentadas (N-terminal Cterminal) ...................................................................................................................................... 44 Figura 1.9: Representação de uma volta-β (à esquerda) e de uma volta-γ (à direita) ................ 45 Figura 1.10: Representação esquemática relativa aos modos de ação do efeito alostérico ........ 49 Figura 1.11: Conformação em volta-β do PLG, incluindo as ligações hidrogénio intramoleculares ................................................................................................................................................ 51 Figura 2.1: Interação entre as orbitais LUMO de um dienófilo com as HOMO de um dieno no processo de cicloadição ............................................................................................................... 69 Figura 2.2: Isomeria endo/exo em sistemas de norbornano ....................................................... 69 Figura 2.3: Interações orbitais primárias e secundárias no estado de transição exo e endo. ...... 70 Figura 2.4: Principais interações (primárias e secundárias) na definição estereoquímica (exo/endo) dos adutos resultantes de reação de aza-Diels-Alder na obtenção de sistemas 2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-enos ............................................................................................................ 71 Figura 2.5: Natureza estereoquímica dos α-aminoácidos .......................................................... 95 Figura 2.6: Abordagem geral de proteção e desproteção na formação de ligações peptídicas num sistema ortogonal. R: cadeia lateral; GP: Grupo protetor ................................................... 97 Figura 2.7: Formas mais comuns de ácidos carboxílicos ativados, por ordem de aumento de complexidade, também correspondendo, à exceção dos anidridos mistos, à ordem na qual os métodos se tornaram disponíveis .............................................................................................. 102 Figura 2.8: Espectro de 1H-RMN do racemato 17-exo evidenciando duplicação de sinais ..... 147 Figura 2.9: Espectro de massa (ESI-MS) do cicloaduto 19-exo .............................................. 151 Figura 2.10: Estudo de fragmentação de 19-exo por ESI-MSn: (A) MS2; (B) MS3 ................. 152 Figura 2.11: Espectro de massa (ESI-MS) do cicloaduto 20-exo ............................................ 154 Índice de Figuras XII Figura 2.12: Estudo de fragmentação de 20-exo por ESI-MSn: (A) MS2; (B) MS3 ................. 154 Figura 2.13: Espectro de massa (ESI-MS) dos tripéptidos 21a/21a' ....................................... 157 Figura 2.14: Estudo de fragmentação de 21a/21a' por ESI-MS2 ............................................. 158 Figura 2.15: Espectro de massa (ESI-MS) dos tripéptidos 22a/22a' ....................................... 161 Figura 2.16: Estudo de fragmentação de 22a/22a' por ESI-MS2 ............................................. 161 Figura 2.17: Espectro de 1H-RMN da mistura dos diastereoisómeros 13a/13a', com expansão dos singletos relativos aos ésteres metílicos utilizados para estabelecer a proporção diastereoisomérica (1:1.4) ......................................................................................................................... 163 Figura 2.18: Espectro de 13C-RMN da mistura dos diastereoisómeros 13a/13a', com expansão a campos altos, evidenciando a duplicação de sinais ................................................................... 164 Figura 2.19: Espectro de 1H-RMN da mistura dos diastereoisómeros 14c/14c', com expansão dos sinais relativos às amidas, com ênfase para a presença dos diastereoisómeros (a vermelho) e respetivos rotâmeros (a azul) ..................................................................................................... 164 Figura 2.20: Espectro de 13C-RMN da mistura dos diastereoisómeros 14c/14c', com expansão dos sinais a campos altos, com ênfase para a presença de rotâmeros (a azul) .......................... 165 Figura 2.21: Espectro de 1H-RMN da mistura dos diastereoisómeros 21a/21a', com expansão dos singletos relativos aos ésteres metílicos utilizados para estabelecer a proporção diastereoisomérica (1:1.4) ......................................................................................................................... 166 Figura 2.22: Espectro de 13C-RMN da mistura dos diastereoisómeros 21a/21a', com destaque para os sinais a campos mais altos onde se verifica um elevado número de rotâmeros ............ 166 Figura 2.23: Espectro de IV do dipéptido 11a, com destaque para a duplicação das bandas relativas ao estiramento C=O .......................................................................................................... 167 Figura 3.1: Dipéptido (terc-butoxicarbonil)-L-leucilglicinato de metilo. Exemplo de numeração adotada na atribuição dos protões (ou grupo de protões) e dos carbonos nas estruturas peptídicas. A numeração para cada resíduo de α-aminoácido constituinte da cadeia peptídica inicia-se no carbono do seu grupo carbonilo ............................................................................. 173 III. Índice de Esquemas Índice de Tabelas XX Tabela 2.25: Picos mais característicos de ESI-MS para os tripéptidos desprotegidos 14ac/14a'-c'..................................................................................................................................... 138 Tabela 2.26: Resultados obtidos na síntese dos tripéptidos 15a-c/15a'-c' ............................... 139 Tabela 2.27: Bandas de IV mais características para os tripéptidos 15a-c/15a'-c' .................. 140 Tabela 2.28: Desvios químicos de 1H-RMN mais característicos para os tripéptidos 15a-c/15a'- c' ................................................................................................................................................ 140 Tabela 2.29: Desvios químicos de 13C-RMN mais característicos para os tripéptidos 15a-c/15a'- c' ................................................................................................................................................ 141 Tabela 2.30: Picos mais característicos de ESI-MS para os tripéptidos 15a-c/15a'-c' ............ 142 Tabela 2.31: Bandas de IV mais características para os cicloadutos 17-exo e 18-endo .......... 146 Tabela 2.32: Desvios químicos de 1H-RMN mais característicos para os cicloadutos 17-exo e 18-endo ..................................................................................................................................... 146 Tabela 2.33: Desvios químicos de 13C-RMN mais característicos para os cicloadutos 17-exo e 18-endo ..................................................................................................................................... 148 Tabela 2.34: Picos mais característicos de ESI-MS para os cicloadutos 17-exo e 18-endo .... 149 Tabela 4.1: Compostos prolinomiméticos utilizados nos ensaios biológicos de competição agonista/antagonista utilizando a técnica de fixação de ligandos para determinação do efeito modulador alostérico de recetores D2 de dopamina ........................................................................... 283 V. Glossário Glossário XXIII GLOSSÁRIO A Ala L-alanina AAC2 Hidrólise de ésteres catalisada por ácido AC Adenilato ciclase ACh Acetilcolina AcOEt Acetato de etilo AcOH Ácido acético ADN Ácido 2-desoxirribonucleico ADTN 2-amino-6,7-di-hidroxi-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno AII Angiotensina II Alloc Aliloxicarbonilo AMP Monofosfato de Adenosina ATA TFA Ácido trifluoroacético ATP Trifosfato de Adenosina ATR Reflexão Atenuada Total, do inglês Attenuated Total Reflection BAC2 Hidrólise de ésteres catalisada por base BDDC 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida BHE Barreira hematoencefálica Bn Grupo benzilo Boc terc-butoxicarbonilo Boc2O Anidrido de terc-butoxicarbonilo BOP Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfónio BOP-Cl Cloreto do ácido bis(2-oxo-3-oxazolidino)fosfínico cAMP AMP cíclico CC Cromatografia de adsorção em coluna CDI Carbonildiimidazol CF Cloroformiato de alquilo COMT Catecol-O-metiltransferase COSY Correlation Spectroscopy CPD Ciclopentadieno Cq Carbono quaternário D Dupleto DA Dopamina DATATOP Deprenyl and Tocophenol Antioxidative Therapy of Parkinsonism DCC Diciclo-hexilcarbodiimida Glossário XXIV DCU Diciclo-hexilureia dd Duplo dupleto DDC Levodopa descarboxilase DEPT Distortionless Enhnancement by Polarization Transfer DFT Teoria do Funcional de Densidade DHB Di-hidrobiopterina dH2O Água desionizada DIC Diisopropilcarbodiimida DIEA N-etil-N,N-diisopropilamina DMAD Azodicarboxilato de dimetilo DMF Dimetilformamida DMSO-d6 Dimetilsulfóxido hexa-deuterado DOPAC Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético dq Duplo quarteto dt Duplo tripleto DT Discinesia Tardia EC Enzyme Commission ECP Estimulação Cerebral Profunda EDC 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida EDTA Ácido etilenodiaminotetracético EI+-MS Espectrometria de Massa com ionização por Impacto Eletrónico EMAR Espectroscopia de Massa de Alta Resolução EMEMF12 Dulbeco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 eq. Equivalentes estequiométricos ESI-MS Espectrometria de Massa com ionização por Electrospray Et3N Trietilamina EtOH Etanol FBS Soro Fetal Bovino FDA Food and Drug Administration Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc-OSu N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida G Gly Glicina GDP Guanosina difosfato Glu Glutamato GPE Ácido glicil-L-prolil-L-glutâmico Gpp[NH]p Guanilimido difosfato Glossário XXV GTP Guanosina trifosfato HATU Hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio hERG Human Ether-à-go-go-Related Gene Hex Hexano HBTU Hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametilurónio HMPA Hexametilfosforotriamida HOBt 1-hidroxi-1H-benzotriazole HOMO Highest Occupied Molecular Orbital HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HVA Ácido homovanílico IGF-1 Fator de crescimento insulínico tipo 1 IQ+-MS Espectrometria de Massa por Ionização Química IV Espectroscopia de Infravermelho L Leu L-leucina L-dopa Levodopa LRRK2 PARK-8 Leucine-rich repeat kinase 2 LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital JPNG Joint Programme – Neurodegenerative Disease Research m Multipleto M+ Ião parental (espectrometria de massa) mACh Recetor muscarínico de acetilcolina mGluR Recetor muscarínico de glutamato MAO Monoamina oxidase MAO-B Monoamina oxidase B mc Multipleto complexo md Multipleto desdobrado MeOH Metanol MIF-1 Fator de inibição da libertação da hormona estimuladora de melanócitos m/z Relação massa/carga (espectrometria de massa) NADH Dinucleótido de nicotinamida e adenina NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina Nav Canal de Na+ dependente de voltagem NET Transportador de norepinefrina NMDA N-metil-D-aspartato NOMM N-óxido de N-metilmorfolina NPA N-propilnorapomorfina Glossário XXVI Nps 2-nitrofenilsulfonilo NpsCl Cloreto de 2-nitrofenilsulfonilo OBn Éster benzílico OEt Éster etílico OMe Éster metílico OtBu Éster terc-butílico PAOPA Pirrolidinilcarbonilamino-2-oxopirrolidinacetamida P.f. Ponto de fusão Ph Fenilo PINK1 Phosphatase and tensin homolog induced putative kinase 1 PLG L-prolil-L-leucilglicinamida PNP Fosforilases de nucleósidos de purina PPII Hélice II de poliprolina PRKN Gene da parkina p Penteto P Pro L-prolina PyBOP Hexafluorofosfato de (benzatriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfónio P* 2-azabiciclo[2.2.1]heptano P*GL 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonilglicil-L-leucina P*LG 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil-L-leucilglicina P*VA 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonilglicil-L-valil-L-alanina q Quarteto RD Recetores dopaminérgicos Rf Fator de retenção RMN Ressonância Magnética Nuclear t.a. Temperatura ambiente Tris-HCl Cloridrato de tris(hidroximetil)aminometano s Singleto SA Síndrome de Alzheimer SH Síndrome de Huntington sl Singleto largo SNC Sistema Nervoso Central SNCA Gene da α-sinucleína SNP Sistema Nervoso Periférico SP Síndrome de Parkinson str Estiramento, do inglês stretching Glossário XXVII t Tripleto THB Tetra-hidrobiopterina tBu terc-butilo tBuOH terc-butanol TBTU Tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio TFA ATA Ácido trifluoracético TFBE Eterato de trifluoreto de boro THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografia em camada fina, do inglês Thin-Layer Cromatography TMS Tetrametilsilano TMU N,N,N',N'-tetrametilureia Tri Trifenilmetilo Troc 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo UCH-L1 Hidrolase C-terminal de Ubiquitina V Val L-valina WFT Teoria do Funcional de Onda Z Benziloxicarbonilo δ Desvio químico ψPro Pseudoprolina 2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4,5-T Ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético 3-MT 3-metoxitiramina VI. Relação de Compostos Descritos Resumo XXXVII RESUMO A importância biológica dos péptidos está associada à ampla variedade de funções que estes desempenham nos organismos vivos. Neste contexto, a utilização de péptidos como potenciais fármacos constitui um importante campo de investigação. Nas últimas décadas, muitos investigadores procuram sintetizar péptidos estruturalmente modificados de forma a melhorar a estabilidade e a atividade biológica deste tipo de compostos. Um exemplo paradigmático recai no tripéptido natural PLG (L-prolil-L-leucil-glicinamida) o qual é encontrado no soro humano por clivagem proteolítica da hormona oxitocina. Este tripéptido desempenha importantes funções no sistema nervoso central revelando conferir neuroproteção in vitro e in vivo em patologias neurológicas como a Síndrome de Parkinson. Estudos apontam que o resíduo de α-aminoácido L-prolina possui um papel importante em péptidos bioativos contendo este resíduo, devido às suas propriedades conformacionais únicas. Neste sentido torna-se atrativo e imperativo desenvolver análogos prolinomiméticos destes neuropéptidos de modo a estudar de que forma alterações neste resíduo poderão contribuir para o desenvolvimento de fármacos que confiram maior atividade neuroprotetora. Neste sentido, o presente trabalho tem por objetivo desenvolver vias de síntese exploratórias conducentes à preparação de análogos do PLG substituindo o resíduo de L-prolina por uma unidade prolinomimética baseada no sistema 2-azabiciclo[2.2.1]heptano, P*. Desta forma, propõe-se a construção de três séries distintas de análogos, incluindo as séries P*LG, P*GL e P*VA, como potenciais análogos do PLG. Este trabalho inicia-se com a criação de um pool de estruturas prolinomiméticas abarcando nove percursores na sua forma racémica, elegendo-se uma dessas estruturas de forma a iniciar a síntese dos derivados do PLG. Numa segunda parte está descrita a síntese dos fragmentos C-terminais, para cada um das séries propostas, contabilizando a preparação de seis dipéptidos. Em seguida, procedeu-se ao acoplamento da unidade prolinomimética com os dipéptidos correspondentes às séries anteriormente consideradas de forma a obter-se os tripéptidos almejados. Desta forma, foram sintetizados onze tripéptidos sob a forma de misturas de diastereoisómeros cujas tentativas de separação revelaram-se infrutíferas. As vias sintéticas encontram-se bem descritas, tendo sido efetuado um estudo complementar de otimização da via conducente à preparação do P*LG. Finalmente, nove desses tripéptidos foram sujeitos a avaliação biológica frente a recetores D2 dopaminérgicos de forma a averiguar o seu potencial efeito como moduladores positivos destes recetores. Os resultados obtidos revelaram-se inconclusivos, sendo necessária mais investigação neste campo. Abstract XXXIX ABSTRACT The biological relevance of peptides is associated with the wide variety of roles they play in living organisms. In this context, the use of peptides as potential drugs is an important field of research. In recent decades, many researchers are seeking to synthesize peptides structurally modified to improve the stability and biological activity of such compounds. A paradigmatic example lies on PLG (L-prolyl-L-leucyl-glycinamide) a natural tripeptide which is found in human serum by proteolytic cleavage of the oxytocin hormone. This tripeptide plays important roles in the central nervous system revealing confer neuroprotection in vitro and in vivo in neurological diseases such as Parkinson's Syndrome. Studies indicate that the amino acid residue L-proline plays an important role in bioactive peptides containing this residue due to its unique conformational properties. Having this in mind it becomes imperative and attractive to develop prolinemimetic analogues of these neuropeptides in order to study how changes in this residue may contribute to the development of pharmaceuticals that confer greater neuroprotective activity . Therefore, the present work aims to develop exploratory synthetic routes leading to the preparation of PLG analogues replacing the residue of L-proline by a prolinemimetic unit system based on 2-azabicyclo[2.2.1]heptane, P*. It is also proposed to build three distinct series of analogs, including P*LG, P*GL and P*VA series as potential analogs of PLG. This work begins creating a pool of prolinemimetic structures containing nine precursors in its racemic forms, electing up one of these structures in order to initiate the synthesis of the PLG derivatives. In the second part the synthesis of C-terminus fragments is described for each of the series proposed, accounting with the preparation of six dipeptides. Afterward, we proceeded to the coupling between the prolinemimetic unit with the corresponding dipeptide to the previously considered series in order to obtain the desired tripeptides. Thereby, eleven tripeptides were synthesized in the form of mixtures of diastereoisomers whose separation attempts have proved unsuccessful. The synthetic routes are well described, having been made a complementary study of optimization in respect to the pathway leading to the preparation of P*LG . Finally, nine of these tripeptides were subjected to biological evaluation against dopamine D2 receptors in order to ascertain its potential effect as positive modulators of these receptors. The results proved to be inconclusive, requiring further research in this field. Resumen XLI RESUMEN La importancia biológica de los péptidos se asocia con la amplia variedad de funciones que desempeñan en los organismos vivos. En este contexto, el uso de péptidos como potenciales fármacos es un importante campo de investigación. En las últimas décadas, muchos investigadores buscan sintetizar péptidos estructuralmente modificados para mejorar su estabilidad y actividad biológica. Un ejemplo paradigmático es el caso del PLG (L-prolil-L-leucil-glicinamida) un tripéptido natural que se encuentra en el suero humano por ruptura proteolítica de la hormona oxitocina. Este tripéptido desempeña papeles importantes en el sistema nervioso central revelando conferir neuroprotección in vitro y in vivo en enfermedades neurológicas tales como el Síndrome de Parkinson. Estudios realizados indican que el residuo del aminoácido L-prolina juega un papel importante en la actividad biológica de péptidos que contienen este aminoácido debido a sus propiedades conformacionales únicas. Con esto en mente, se vuelve imperativo y atractivo el desarrollo de análogos miméticos de prolina de estos neuropéptidos con el fin de estudiar cómo los cambios estructurales en las unidades de aminoácidos pueden contribuir al desarrollo de nuevos productos farmacéuticos que confieran mayor actividad neuroprotectora. Por lo tanto, el presente trabajo tiene como objetivo el desarrollo exploratorio de rutas sintéticas que conduzcan a la preparación de análogos de PLG remplazando el residuo de Lprolina por una unidad prolinomimética sobre la base del sistema 2-azabiciclo[2.2.1]heptano, P*. También se propone la construcción de tres series distintas de análogos, incluyendo las series P*LG, P*GL y P*VA, estudiándolos como potenciales análogos del PLG. Este trabajo comienza creando un pool de estructuras prolinomiméticas conteniendo nueve precursores en sus formas racémicas, eligiendo una de estas estructuras con el fin de iniciar la síntesis de los derivados del PLG. En la segunda parte del trabajo se describe la síntesis de los fragmentos C-terminales de cada una de las series propuestas, lo que representa la preparación de seis dipéptidos. A continuación, se relata como se procedió para el acoplamiento entre la unidad prolinomimética y los correspondientes dipéptidos para las series consideradas con el fin de obtener los tripéptidos deseados. De este modo, once tripéptidos se sintetizaron en forma de mezclas de diastereoisómeros. Las vías de síntesis están bien descritas, habiendo sido hecho un estudio complementario de optimización con respecto a la vía que conduce a la preparación de la serie P*LG. Por último, nueve de estos tripéptidos se sometieron a evaluación biológica contra los receptores D2 de la dopamina con el fin de determinar su potencial efecto como modulador positivo de estos receptores. Hasta el presente los resultados demostraron ser no concluyentes, lo que requiere más investigación en este campo. CAPÍTULO 1 Introdução Teórica Introdução 3 1.1. PROLINOMIMÉTICOS 1.1.1. Antecedentes O α-aminoácido L-prolina (Pro ou P) é um dos vinte codificados pelo ácido 2-desoxirribonucleico (ADN). Faz parte dos α-aminoácidos não essenciais, uma vez que é sintetizado pelo organismo. A forma mais comum, L, possui estereoquímica S, a par dos restantes α-aminoácido naturais, com exceção da cisteína e seus derivados. O α-aminoácido L-prolina é o único que apresenta uma cadeia lateral cíclica, que pode ser vista como sendo o resultado da sua ligação covalente ao azoto do grupo α-amina,1 apresentando-se como uma α-amina secundária em detrimento dos restantes. Esta propriedade torna este α-aminoácido um bloco de síntese único, revestido de uma enorme importância na síntese de péptidos e proteínas. L-Prolina Com efeito, as regiões polipeptídicas contendo L-prolinas são menos flexíveis provocando kinks na estrutura das proteínas obrigando, na maioria dos casos, a ligação peptídica que antecede estes resíduos de α-aminoácidos, a adotar uma conformação cis, ao contrário dos restantes α-aminoácidos naturais que formam, preferencialmente, ligações peptídicas trans. Isto deve-se, em parte, à baixa barreira energética entre o equilíbrio (cis-trans) das ligações peptídicas do resíduo de prolina sendo que a conformação trans está apenas ligeiramente favorecida sobre a cis. Desta forma, uma característica das moléculas contendo o resíduo L-prolina, é a capacidade de formação de ligações peptídicas cis e a possibilidade de isomerização (cis-trans) muito facilmente devido à diminuta diferença na barreira energética.2 Por outro lado, a inexistência de um hidrogénio ligado ao azoto aquando de uma ligação amida, diminui a estabilização por pontes de hidrogénio das ligações peptídicas que antecedem os resíduos de L-prolina. trans Estado de Transição cis 1Freire, A. P.; Quintas, A. Estrutura e Propriedades dos Aminoácidos e Péptidos, in Bioquímica Organização Molecular da Vida, 1 ed., Lidel, 2008, 10, p. 142. 2Breznik, M.; Kikelj, D. Farm. Vestn. 2000, 51, 553. Introdução 10 1.2. ATIVIDADE NEUROPROTETORA DO TRIPÉPTIDO L-PROLIL-L-LEUCILGLICINAMIDA (PLG) 1.2.1. Antecedentes Os vinte α-aminoácidos codificados pelo ADN são importantes blocos na construção de diversas biomoléculas, os quais se encontram unidos através de ligações peptídicas para formarem cadeias mais ou menos longas, às quais se dá a designação de cadeias polipeptídicas. É comum designar-se por péptido, quaisquer cadeias polipeptídicas contendo menos do que cem resíduos de α-aminoácidos, para as restantes cadeias contendo cem ou mais resíduos de α-aminoácidos na sua constituição atribui-se, genericamente, a designação de proteína. Grande parte das ligações covalentes das cadeias polipeptídicas possui livre rotação, à exceção das ligações peptídicas, o que lhes permite adotar um vasto leque de conformações, possibilitando assumir diferentes níveis de organização estrutural tridimensional.34,35 Os péptidos, juntamente com as proteínas, são as moléculas mais abundantes nos sistemas biológicos. Esta classe de biomoléculas são essenciais para a maioria dos processos bioquímicos que estão na base da vida, uma vez que se encontram envolvidas praticamente em todas as propriedades estruturais e funcionais dos seres vivos. Existem vários milhões de proteínas nos sistemas biológicos apresentando assim, um lato espectro de formas, dimensões e funções biológicas. Dentre as múltiplas funções desempenhadas pelos péptidos e proteínas, pode-se nomear a catálise enzimática – os enzimas são biocatalisadores de milhares de reações bioquímicas, aumentando a velocidade da reação que catalisam; a defesa – esta é assegurada por um conjunto de péptidos e proteínas com efeito sinérgico na defesa dos organismos, desde a queratina que protege os vertebrados contra agressões mecânicas, até às imunoglobulinas do sistema imunitário, que auxiliam os seres vivos contra a invasão de organismos patogénicos; função estrutural – uma grande parte destas biomoléculas está implicada no suporte e proteção dos seres vivos, como as proteínas que compõem o citoesqueleto até ao colagénio, uma proteína que está envolvida na elasticidade da pele; o movimento – a actina e a miosina são essenciais no processo de contração e relaxamento muscular que está na base do movimento de seres vivos vertebrados; armazenamento – com efeito, a ceroplasmina é uma proteína muito importante no sequestro de cobre; regulação – a ligação de pequenos péptidos, como o neuropéptido PLG, aos recetores dopaminérgicos D2, resulta na modulação destes últimos, regulando a sua atividade.36 34Quintas, A.; Ascenso, C. Introdução às Proteínas, in Bioquímica Organização Molecular da Vida, 1 ed., Lidel, 2008, 11, pp. 161-163. 35Ben-Shev, A.; Frolow, F.; Nelson, N. Nature 2003, 426: 630-635. 36Creigliton, T. E. Proteins: Strutures and Molecular Properties, 2 Ed., 1993, W. H. Freeman and Company, New York. Introdução 11 1.2.2. Síndromes Neurodegenerativas 1.2.2.1. Aspetos Gerais37 O tecido nervoso encontra-se imbuído no organismo, interligando-se e formando uma rede de comunicações, constituindo desta forma o sistema nervoso. Anatomicamente, este é vulgarmente dividido em: Sistema Nervoso Central (SNC), formado pelo encéfalo, constituintes neuronais do sistema fotorrecetor e medula espinhal, e pelo Sistema Nervoso Periférico (SNP), formado pelos nervos e por pequenos agregados de células nervosas denominados gânglios nervosos. Os nervos são constituídos principalmente por prolongamentos dos neurónios situados no SNC ou nos gânglios nervosos. Os dois componentes principais do tecido nervoso são os neurónios e vários tipos de células da glia (ou neuroglia), que sustentam os neurónios e participam de outras funções importantes. No SNC, há uma segregação entre os corpos celulares dos neurónios e os seus prolongamentos. Este facto é responsável pelo reconhecimento de duas porções distintas no encéfalo e na medula espinhal, denominadas substância branca e substância cinzenta. A substância cinzenta recebe essa designação porque revela essa coloração quando observada macroscopicamente, sendo formada em geral por corpos celulares dos neurónios e células da glia, contendo também prolongamento de outros neurónios. A substância branca, por seu turno, não contém corpos celulares de neurónios, sendo constituída por prolongamentos de neurónios e por células da glia. Esta designação resulta da presença de grande quantidade de mielina, uma substância que envolve certos prolongamentos dos neurónios (axónios). Os neurónios têm a propriedade de responder a alterações do meio em que se encontram (estímulos) com modificações da diferença de potencial elétrico que existe entre as superfícies interna e externa da membrana celular. As células que exibem essa propriedade (neurónios, células musculares e algumas glândulas) são ditas "excitáveis". Os neurónios reagem, prontamente, aos estímulos e a modificação de potencial elétrico pode restringir-se ao local do estímulo ou propagarse pela célula, através da sua membrana. Esta propagação constitui o que se denomina por impulso nervoso, cuja função é transmitir informações a outros neurónios, a músculos, glândulas ou outras células efetoras. Os neurónios, através dos seus prolongamentos geralmente longos e numerosos, formam circuitos neuronais, de diversos tamanhos e graus de complexidade. Um circuito neuronal pode ser simples porém, na maioria das vezes, trata-se da combinação de dois ou mais circuitos que interagem para executar uma dada função. 37Junqueira, L. C.; Carneiro, J. Histologia Básica, 11 ed., 2008, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan. Introdução 12 As funções basilares do sistema nervoso são: detetar, transmitir, analisar e utilizar as informações geradas pelos estímulos sensoriais representados pelo calor, luz, energia mecânica e modificações químicas do ambiente externo e interno. Além disso, o sistema nervoso colmata atividades atinentes à organização e coordenação, direta ou indiretamente, do funcionamento de quase todas as funções do organismo, entre as quais, as funções motoras, viscerais, endócrinas e psíquicas. Os neurónios comunicam entre si através de um processo designado por sinapse. Existem dois tipos de sinapses: as elétricas e as químicas. As últimas afiguram-se enquanto mais frequentes. Nas sinapses químicas um determinado impulso nervoso gerado num dado neurónio por ação de um estímulo é conduzido através do axónio por sucessivas despolarizações e repolarizações da membrana. No término do axónio, a despolarização da membrana ativa canais de Ca2+ dependentes de voltagem havendo influxo de Ca2+ que culmina na exocitose de neurotransmissores (moléculas que servem de transmissores da informação) por fusão das membranas das vesículas que contêm os neurotransmissores com a membrana do término do axónio (célula pré-sinática), libertando desta forma os neurotransmissores para a fenda sináptica. Esses neurotransmissores ligam-se a recetores específicos da célula pós-sináptica (que pode ser um neurónio ou uma célula-efetora), havendo passagem da informação por indução de uma nova despolarização da célula pós-sináptica.38 Os neurotransmissores podem ser categorizados, essencialmente, em três grupos, dependendo da sua natureza química: aminas biogénicas, aminoácidos e péptidos. Estes funcionam como mensageiros químicos possibilitando a comunicação interneuronal, bem como com as restantes células-alvo. Para que a esta troca de informação ocorra de forma precisa é necessário que haja homeostasia dos níveis destes neurotransmissores ao longo do sistema nervoso. Destarte, torna-se inteligível que alterações nos níveis de determinados neurotransmissores poderá por em causa a comunicação interneuronal, alterando os circuitos neuronais, com implicações nefastas mais ou menos acentuadas decorrentes do grau de perturbação, as populações neuronais implicadas e a extensão do dano, que poderá conduzir, em último caso, à indução de mecanismos apoptóticos e processos neurodegenerativos. Com efeito, verifica-se em várias síndromes neurodegenerativas uma alteração dos níveis de alguns neurotransmissores; desta forma na Síndrome de Alzheimer (SA), os níveis de acetilcolina (ACh) encontram-se diminuídos;39 na Síndrome de Parkinson os níveis de dopamina (DA) encontram-se diminuídos;40 já no que se refere à Esclerose Amiotrófica Lateral, os níveis de glutamato (Glu) estão aumentados.41 38Waites, C. L.; Garner, C. C. Trends Neurosci. 2011, 34, 326. 39Geula, C.; Mesulam, M. M. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1995, 9 (2), 23-28. 40Obeso, J. A.; Rodríguez-Oroz, M. C.; Benitez-Temino, B. et al. Mov. Disord. 2008, 23 (3), 548-559. 41Al-Chalabi, A.; Leigh, P. N. Current Opinion in Neurology 2000, 13 (4), 397-405. Introdução 13 Acetilcolina Dopamina Glutamato Estas síndromes caracterizam-se pela apoptose de populações específicas de neurónios, que culmina nas manifestações clínicas próprias de cada processo neurodegenerativo.42,43 De acordo com o EU Joint Programme – Neurodegenerative Disease Research (JPND), as doenças neurodegenerativas são condições debilitantes e incuráveis, que resultam na degeneração progressiva e/ou na morte das células nervosas. Esta neurodegeneração causa problemas no movimento, as ataxias, ou no próprio funcionamento cerebral, originando a demência. A demência é um declínio progressivo ou crónico da função cognitiva, que afeta a memória, o pensamento, o comportamento, a linguagem, a capacidade de cálculo, a aprendizagem e a emoção, não devendo nunca ser associada a um processo normal de envelhecimento. Estima-se que 153 000 cidadãos portugueses e 9.9 milhões de cidadãos europeus sofram de algum tipo de demência.44 De acordo com o relatório DEMENTIA – A Public Health Priority,45 no mundo inteiro, em 2010, o número ascendia a 35.6 milhões. Anualmente, calcula-se que o número de novos casos de pessoas com demência seja cerca de 7.7 milhões, ou seja, um novo caso a cada 4 segundos. As previsões são para que, em 2050, o número de pessoas que sofrem de demência no mundo inteiro triplique, situando-se nos 115.4 mil milhões de pessoas. Num estudo efetuado no Reino Unido, foi demonstrado que os custos associados à demência equivalem a cerca do dobro dos custos associados ao cancro, a cerca do triplo dos associados a doença cardíaca e a cerca de quatro vezes os associados a ataques cardíacos.46 Prevê-se que o impacto socioeconómico da demência seja um dos maiores desafios do futuro da Sociedade Europeia, dado o envelhecimento da população, o aumento da esperança de vida e o facto da incidência da demência aumentar exponencialmente com a idade. Neste contexto, o rastreio e o diagnóstico precoce são passos essenciais para que as demências sejam atempadamente diagnosticadas, contribuindo para o abrandamento da evolução da doença e o adiamento dos sintomas mais severos nos doentes.43 42Kovacs, G. G.; Budka, H. Focus Struct. Biol. 2009, 7, 251. 43Gibrat, C.; Cicchetti, F. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 2011, 35, 380. 44Parlamento Europeu. Relatório sobre a iniciativa europeia em matéria da doença de Alzheimer e outras formas de demência. Bruxelas: Parlamento Europeu, 2010. 45World Health Organization. Dementia: A Public Health Priority. Reino Unido: [s.e.], 2012. 46Luengo-Fernandez, R.; Leal, J.; Gray, A. Dementia 2010 - The economic burden of Dementia and associated research funding in the United Kingdom. Cambridge: Alzheimer’s Research Trust, 2010. Introdução 14 1.2.2.2. Síndrome de Parkinson Etiologia A Síndrome de Parkinson, descrita em 1817 pelo médico Inglês James Parkinson (1755 – 1824),47 é a segunda doença neurodegenerativa mais comum. De acordo com a European Parkinson's Disease Association, em 2011,48 na Europa estima-se que existam mais de 1.2 milhões de pessoas com a SP e espera-se que, em 2030, esse número duplique. Em Portugal, segundo a Associação Portuguesa de Doentes de Parkinson, dados epidemiológicos de 2011 apontam para cerca de 20 000 pessoas, sendo expectável que existam 6 milhões em todo o mundo.49 Esta é uma síndrome idiopática, i.e., de causa indefinida e multifacetada, caracterizada como sendo uma desordem neurodegenerativa – uma α-sinucleinopatia – com prevalência de 160 casos por cada 100 000 habitantes na Europa aumentando até 4% da população cima dos 80 anos.50 Sob o ponto de vista patológico, a SP manifesta-se pela perda de neurónios na substância negra, componente ventral da pars compacta. Estima-se que até ao falecimento, os doentes apresentem uma redução neuronal de 50-70% nesta zona em comparação com indivíduos não afetados. As alterações patológicas mais precocemente descritas na SP foram observadas no bolbo radiquiano/pontine tegmentum e no bolbo olfatório.51 Nesses estágios iniciais os pacientes são présintomáticos. À medida que a síndrome progride a substância negra, áreas do mesencéfalo e do prosencéfalo basal tornam-se envolvidas. Por fim, as alterações patológicas manifestam-se no neocórtex. Esta progressão das alterações patológicas deve-se à distribuição dos corpos de lewy, estes são inclusões imunorreativas à α-sinucleína contendo um número de proteínas neurofilamentosas adstritas com proteínas responsáveis pela proteólise. Estas incluem a ubiquitina, as proteínas heat shock, as quais possuem um papel crucial na sinalização de moléculas para proteólise. Mutações no gene que codifica a α-sinucleína são responsáveis por algumas das formas de SP familiares nas quais verifica-se a presença de corpos de lewy. Mutações no gene que codifica para a parkina é responsável por uma forma de SP em que não se verificam os corpos de lewy em casos juvenis, sugerindo que esta proteína possui um papel importante no desenvolvimento dos corpos de lewy. Tem sido demonstrado que a parkina facilita a ligação de outras proteínas à ubiquitina (ubiquitinação), tais como a sinfilina-1 (proteína de interação com a α-sinucleína), levando à formação de corpos de lewy.52 47Dauer, W.; Przedborski, S. Neuron 2003, 39, 889-909. 48European Parkinson's Disease Association. The European Parkinson's Disease Standards of care consensus Statement. United Kingdom, 2011. 49Associação Portuguesa de Doentes de Parkinson, Revista Parkinson, nº30, 2011. 50Mutch, W. J.; Dingwall-Fordyce, I.; Downie, A. W. et al. BMJ 1986, 292, 534-536. 51Braak, H.; Bohl, J. R.; Müller, C. M. et al. Mov. Disord. 2006, 21, 2042-2051. 52Chung, K. K.; Zhang, Y.; Lim, K. L. et al. Nat. Med. 2001, 7, 1144-1150. Introdução 15 O sistema ubiquitina-proteossoma é importante para proteólise intracelular e é responsável por um vasto número de processos que mantém a viabilidade das células. Atua através da remoção de proteínas ubiquitinadas, isto é, selecionadas através da ligação à ubiquitina para serem eliminadas. Uma falha no sistema ubiquitina-proteossoma conduzirá a uma anormal agregação intracelular de proteínas, incluindo a α-sinucleína que é o maior componente dos corpos de lewy. Um dos principais locais onde há depósito de corpos de lewy é o bolbo olfatório, não sendo por isso de estranhar que nos casos de clínicos precoces se detetem alterações no cheiro e paladar,53 endossando a noção de que a formação de corpos de lewy possam ser importantes na ativação de vias que conduzam à disfunção e morte neuronal. Fatores Genéticos54,55 Apesar da SP ser usualmente uma síndrome esporádica, existe um crescente número de mutações num único gene que têm sido identificados. Até ao presente onze genes foram mapeados por ligação genética com seis identificados: α-sinucleína (SNCA), hidrolase C-terminal de ubiquitina L1 (UCH-L1), parkina (PRKN), LRRK2, PINK1 e DJ-1. Estas mutações num único gene, com a notável exceção da LRRK2, estão presentes apenas num diminuto número de pacientes com SP, embora a sua identificação e as proteínas por estes genes codificadas, sejam relevantes para descortinar os mecanismos responsáveis pela SP e de outras patologias neurodegenerativas. Uma única mutação no gene SNCA é responsável pelo surgimento de SP em idades precoces, com um padrão de herança autossómico dominante. Contudo, é de salientar que a duplicação ou triplicação do gene SNCA em pacientes com SP leva ao desenvolvimento da sintomatologia característica da SP em idades mais avançadas, por volta da quarta e quinta décadas, reforçando a ideia de que a sobrexpressão do SNCA poderá ser um fator preponderante na SP esporádica. O gene LRRK2 (PARK8) está implicado, até à data, na SP familiar, também designada de SP "esporádica".56 A frequência de mutações no gene LRRK2 em pacientes com histórico de casos de SP na família é de 5-7%. O gene LRRK2 codifica para uma proteína designada dardarina (derivada da palavra basca para tremor). Os corpos de lewy têm sido identificados em alguns casos em que existe mutação no gene LRRK2. Muitos dos pacientes portadores desta mutação apresentam sintomatologia da SP com idade de manifestação mediana ou mais avançada. Um número de mutações associadas a um único gene, e.g. DJ-q e parkina, com padrões de herança autossómica recessiva, apresentam-se, em recorrência, numa idade mais precoce, de forma menos agressiva com boa resposta à levodopa e com a presença de distonia. 53Hawkes, C.M. BMJ 1995, 311, 129. 54Warner, T. T.; Schapira, A. H. Ann Neurol 2003, 53 (Suppl 3), S16-S23; discussion S23-S25. Review. 55Cookson, M. R.; Xiromerisiou, G.; Singleton, A. Curr Opin Neurol 2005, 18, 706-711. 56Gilks, W. P.; Abou-Sleiman, P. M.; Gandhi, S. et al. Lancet 2005, 365, 415-416. Introdução 16 Tem sido também implicadas alterações mitocondriais com o desenvolvimento de SP. Anomalias no Complexo 1 da via do enzima de fosforilação oxidativa foram detetadas nos cérebros de pacientes com SP, nas plaquetas sanguíneas e no músculo esquelético. Este é o dado mais consistente implicando alterações mitocondriais na SP, embora alterações noutros complexos também tenham sido referidos na literatura.57 Os neurónios da pars compacta parecem ser particularmente suscetíveis ao stress oxidativo. Estudos envolvendo ADN mitocondrial falharam na busca de um gene indubitavelmente envolvido no stress oxidativo que explicasse os defeitos de fosforilação oxidativa na SP. Contudo, parece consistente que anomalias mitocondriais possam ter um papel importante nas vias que conduzem à disfunção e morte neuronal. O gene PINK1 codifica para um complexo mitocondrial e tem sido implicado numa forma autossómica recessiva de SP, porém existem indícios que apontam não ser um dos fatores de risco mais preponderantes na SP esporádica. Fatores Ambientais Alguns fatores ambientais provaram estar implicados, em certo grau, com a SP. É o caso do fumo de cigarro onde se constata uma forte correlação com o desenvolvimento desta síndrome. É também possível que disfunções mitocondriais despoletadas por uma ou mais toxinas ambientais propiciem o desenvolvimento de SP. Além disso, viver num ambiente rural parece conferir um risco acrescido, na medida em que, estudos revelam uma correlação entre SP e a exposição a pesticidas e conservantes de madeira.58 Alguns desses pesticidas incluem inseticidas como a rotenona e herbicidas como Agent Orange,59 que na verdade se apresenta como mistura de herbicidas, o 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e o 2,4,5-T (ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético). A exposição a metais pesados também parece ser um fator de risco, com consequente acumulação na substância negra; contudo, estudos efetuados mostraram-se inconclusivos nesta pendência.60 57Schapira, A. H. Lancet Neurol 2008, 7, 97-109. 58Dick, F. D. Br Med Bull 2006, 79-80, 219-231. 59Tanner, C. M.; Kamel, F.; Ross, G. W. et al. Environ Health Perspect 2011, 119 (6), 866-872. 60de Lau, L. M.; Breteler, M. M. Lancet Neurol. 2006, 5 (6), 525-535. Introdução 17 Rotenona 2,4-D 2,4,5-T Diagnóstico Clínico61 Os sintomas cardinais na SP são: bradicinesia (dificuldade na iniciação do movimento), rigidez muscular (dificuldade no relaxamento dos músculos), instabilidade postural (dificuldades de manter o equilíbrio) e tremor de repouso (essencialmente nas mãos e nos pés). Estes sintomas podem não se manifestar concomitantemente. Alterações mais subtis, como é o caso de modificações na caligrafia (e.g. micrografia) ou redução da expressão facial, são geralmente características precoces da manifestação da sintomatologia. À medida que a neurodegeneração progride verificase também hipofonia (voz fraca devido à incoordenação dos músculos vocais), redução dos movimentos de deglutição e alterações dos reflexos. Complicações não motoras associadas à SP tornamse mais graves à medida que a neurodegeneração recrudesce, havendo desenvolvimento de quadros depressivos em cerca de 40% dos pacientes. O tremor de cabeça e na voz poderão também estar presentes. Tratamento É necessário ter em conta que existem duas vias antagónicas de controlo, uma via dopaminérgica que é responsável por "inibir a inibição", i.e., que desbloqueia os movimentos voluntários e, uma via colinérgica, contrária à anterior, capaz de "excitar a inibição", i.e., que bloqueia o controlo dos movimentos voluntários. Por conseguinte, a perda de neurónios dopaminérgicos que está na base desta síndrome neurodegenerativa, provoca a perda do bloqueio dopaminérgico, conduzindo a um desequilíbrio entre as duas vias opostas supracitadas, resvalando nas manifestações motoras típicas na SP. 61Davie, C. A. British Medical Bulletin 2008, 86, 109-127. Introdução 18 Com base nisto, as estratégias terapêuticas farmacológicas fundamentam-se em duas abordagens possíveis ao nível do SNC: potenciação da atividade dopaminérgica, a qual pode ser conseguida através da indução do aumento da libertação de dopamina endógena, por administração de dopamina exógena, redução da taxa de degradação de dopamina e através de estimulação dos recetores dopaminérgicos do SNC. Outra abordagem passa pela inibição da atividade colinérgica de forma a compensar a diminuição da atividade dopaminérgica que se vai instalando com a progressão desta síndrome. Para entender a estratégia terapêutica utilizada na SP é necessário conhecer-se o ciclo metabólico da dopamina (Esquema 1.3). A biossíntese da dopamina no organismo humano faz-se a partir da L-tirosina, sobre a qual atua o tirosina hidroxilase (EC 1.14.16.2) na presença de oxigénio molecular e de tetra-hidrobiopterina (THB), originando L-dopa, uma molécula de água e di-hidrobiopterina (DHB). A L-dopa, por sua vez, através do L-dopa descarboxilase (EC 4.1.1.28) dá origem ao neurotransmissor dopamina com libertação de uma molécula de CO2. L-tirosina Di-hidroxifenilalanina Dopamina L-DOPA Esquema 1.3 Representação esquemática da biossíntese de dopamina a partir da L-tirosina. No interior das células dopaminérgicas, a dopamina citosólica é metabolizada principalmente por duas reações sucessivas. Primeiro, o monoamina oxidase, MAO (EC 1.4.3.4) converte a dopamina no correspondente aldeído que, por sua vez serve de substrato ao aldeído desidrogenase (EC 1.2.1.3) produzindo-se o ácido 3,4-di-hidroxifenilacético (DOPAC). O DOPAC, em seguida, difunde para o meio extracelular e pode ser tanto conjugado com glucorónidos ou convertido a ácido homovanílico (HVA) pelo catecol-O-metiltransferase, COMT (EC 2.1.1.6).62 O MAO-B encontra-se localizado fora dos neurónios dopaminérgicos, i.e., nas células gliais, enquanto o COMT encontra-se apenas no exterior dos neurónios dopaminérgicos. Uma fração da dopamina libertada, é primeiro O-metilada pelo COMT a 3-metoxitiramina (3-MT) e depois oxidada pelo MAO-B para formar HVA.61 61Davie, C. A. British Medical Bulletin 2008, 86, 109-127. 62Männistö, P. T.; Ulmanen, I.; Lundström, K.; Taskinen, J.; Tenhunen, J.; Tilgmann, C.; Kaakkola, S. Prog Drug Res 1992, 39, 291-350. Introdução 19 Dopamina 3-metoxitiramina Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético Ácido homovanílico Esquema 1.4 Representação esquemática simplificada do metabolismo da dopamina. COMT: catecol-O-metilltransferase, MAO-B: monoamina oxidase B. A farmacologia vigente na SP visa então atenuar a sintomatologia através da reposição do equílibrio DA/ACh. Para o efeito, podem ser empregues diferentes estratégias que visam a potenciação da atividade dopaminérgica: utilizando fármacos que estimulem a produção e libertação de dopamina; indiretamente através do uso de fármacos inibidores do metabolismo da dopamina ou a combinação de ambas as estratégias num esforço sinérgico. Em certos estádios da SP pode-se recorrer ao bloqueio da atividade colinérgica mediante a utilização de fármacos antimuscarínicos. Uma das abordagens no tratamento farmacológico da SP consiste em realizar um aporte exógeno de dopamina, contudo, seria leviana a administração exclusiva de dopamina exógena para a reposição dos níveis deste neurotransmissor. Neste sentido, é necessário ter em conta o metabolismo da dopamina e as suas características bioquímicas e fisiológicas. Em primeiro lugar, a dopamina é uma molécula muito polar e, portanto, incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). Introdução 26 Anticolinérgicos e Amantadina Os agentes anticolinérgicos constituíram, durante muitos anos, o foco central no tratamento da SP. Atuam, principalmente, através da redução da atividade colinérgica produzida pela perda do controlo inibitório dopaminérgico mas, a maior parte destes fármacos, pode também inibir a recaptação pré-sináptica e o armazenamento de dopamina, o que conduz a um aumento da concentração de dopamina na fenda sináptica. Estes fármacos possuem uma eficácia limitada nas formas pouco severas de parkinsonismo e a sua ação mais interessante centra-se no combate à rigidez e, em menor extensão, os tremores e a hipocinesia (redução do movimento). Do ponto de vista químico, os agentes anticolinérgicos utilizados no tratamento da SP exibem uma elevada lipofilia, consequência da presença de um ou mais anéis aromáticos e do elevado efeito estérico devido à tripla substituição do átomo de azoto da amina terciária que apresentam, o que provoca ocultação do par eletrónico não compartilhado. Desta maneira é possível distinguir características transversais nesta classe de fármacos: 1. Um grupo amino terciário, cujos substituintes não devem ser grupos muito volumosos, e.g., metilo, etilo ou formando parte de um anel alifático. 2. Um átomo eletronegativo separado do N amínico terciário por uma cadeia de dois ou três átomos de carbono. Normalmente, é um átomo de oxigénio, ainda que possa ser um átomo de azoto ou mesmo um átomo de carbono com hibridacão sp2. 3. Um dos anéis aromáticos próximos ao átomo eletronegativo, sendo estes que atuam como inibidores dos recetores muscarínicos da acetilcolina no SNC. Eventualmente estes anéis aromáticos podem ser substituídos por sistemas anulares alifáticos complexos, como o bornano ou outras estruturas similares. Bornano Introdução 27 Derivados de benzidriléteres Esta classe de compostos é derivada do álcool benzidrílico, entre os quais destacam-se a orfenadrina e a etanautina. A primeira possui um efeito anticolinérgico, atuando como antagonista dos recetores mACh,92 possui ainda uma ação anti-histamínica atuando nos recetores H1,93 antagoniza os recetores NMDA (N-metil-D-aspartato),94 inibe o reuptake de noripinefrina (bloqueador NET),95 e bloqueia ainda os canais de sódio Nav1.7, Nav1.8 e Nav1.9,96 assim como o canal de potássio hERG.97 No que tange à etanautina esta é utilizada genericamente sob a forma de um sal de monoacefilinato, de modo a contrabalançar a ação estimulante da acefilina através do efeito sedativo da etanautina, resultando num melhor perfil terapêutico. Orfenadrina Etanautina Acefilina Derivados de fenil-álcoois terciários Estes derivados são os mais importantes no grupo dos anticolinérgicos eficazes no tratamento da SP. Um deles é o tri-hexilfenidilo, um agente antiparkinsoniano da classe dos antimuscarínicos. Este fármaco liga-se aos recetores muscarínicos M198 e, possivelmente, a recetores de dopamina.99 Estima-se que 50-75% dos pacientes com SP reajam positivamente e experienciem uma melhoria entre 20-30% da sintomatologia. Para aumentar a atividade terapêutica o tri-hexilfenidilo é, geralmente, prescrito concomitantemente com a levodopa, outro antimuscarínico ou anti-histamínico. A combinação de agonistas dopaminérgicos como a cabergolina também é possível, sendo resultado de uma abordagem multidimensional. 92Syvälahti, E. K.; Kunelius, R.; Laurén, L. Pharmacology & Toxicology 1988, 62 (2), 90-94. 93Rumore, M. M.; Schlichting, D. A. Life Sciences 1985, 36 (5), 403-416. 94Kornhuber, J.; Parsons, C. G.; Hartmann, S. et al. Journal of Neural Transmission 1995, 102 (3), 237-246. 95Pubill, D.; Canudas, A. M.; Pallàs, M. et al. The Journal of Pharmacy and Pharmacology 1999, 51 (3), 307-312. 96Desaphy, J. F.; Dipalma, A.; De Bellis, M. et al. Pain 2009, 142 (3), 225-235. 97Scholz, E. P.; Konrad, F. M.; Weiss, D. L. et al. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 2007, 376 (4), 275284. 98Giachetti, A.; Giraldo, E.; Ladinsky, H.; Montagna, E. British Journal of Pharmacology 1986, 89 (1), 83-90. 99Berke, J. D.; Hyman, S. E. Neuron 2000, 25 (3), 515-532. Introdução 28 Outro derivado anticolinérgico que faz parte da segunda linha de fármacos no tratamento da SP é a procilina100. O seu uso é limitado, uma vez que se sabe que este fármaco é capaz de melhorar o tremor, mas não a bradicinesia. Tri-hexilfenidilo Prociclina Derivados da fenotiazina Os anéis aromáticos estão rigidamente unidos, formando parte de um anel fenotiazínico. Estes compostos são etilenodiaminas que, apesar da sua ação anticolinérgica, exercem marcados efeitos sobre os recetores H1 de histamina. A dietazina e a etopropazina são derivados da fenotiazina e são usados como agentes antiparkinsonianos, possuindo ações anticolinérgicas, anti-histamínicas e antiadrenérgicas. São também usados no alívio da síndrome extrapiramidal induzido por fármacos como outras fenotiazinas, mas à semelhança de outros compostos, com propriedades antimuscarínicas. Fenotiazina Dietazina Etopropazina 100Adamson, D. W.; Barrett, P. A.; Wilkinson, S. Journal of the Chemical Society 1951, 11 (0), 52-60. Introdução 29 Amantadina A amantadina é um fármaco aprovado para o uso como antiparkinsoniano, mas também é sobejamente utilizado como antivírico. Apesar disso, a sua efetividade como antiparkinsoniano é inconclusiva. Um estudo revela que existe pouca evidência para suportar a sua eficácia e segurança, contudo continua a ser prescrita.101 A amantadina é um antagonista fraco dos recetores de glutamato do tipo NMDA,102,103 aumenta a libertação de dopamina e bloqueia o seu reuptake. Pode ser usada como monoterapia ou juntamente com a levodopa. Um possível efeito secundário do uso da amantadina é o livedo reticularis (padrão vascular reticulado de coloração arroxeada causada pelo inchaço das vênulas devido à obstrução de capilares por trombos) quando usada no tratamento da SP.104 Amantadina Abordagem cirúrgica - Estimulação Cerebral Profunda (ECP) Em 2012, o órgão regulador norte-americano, Food and Drug Administration (FDA), aprovou a ECP como tratamento na SP.105 Este tratamento baseia-se num procedimento invasivo que envolve a implantação de um dispositivo médico (pacemaker cerebral) que envia impulsos elétricos para áreas cerebrais específicas. A ECP não cura a SP, mas pode ser de extrema importância na redução de alguns dos sintomas associados a esta síndrome, melhorando a qualidade de vida dos pacientes que recorrem a este procedimento.106 Esta cirurgia é realizada apenas em pacientes cuja sintomatologia não pode ser adequadamente controlada com a terapia farmacológica disponível, ou cuja medicação possua efeitos colaterais severos que justifique este procedimento. 101Crosby, N. J.; Deane, K.; Clarke, C. E. Amantadine in Parkinson's disease. In Clarke, C. E. Cochrane Database of Systematic Reviews 2003, John Wiley & Sons, Ltd. 102Kornhuber, J.; Bormann, J.; Hübers, M.; Rusche, K.; Riederer, P. Eur. J. Pharmacol. Mol. Pharmacol. Sect. 1991, 206, 297-300. 103Blanpied, T. A.; Clarke, R. J.; Johnson, J. W. Journal of Neuroscience 2005, 25 (13), 3312-3322. 104Vollum, D. I.; Parkes, J. D.; Doyle, D. Br Med J 1971, 2, (5762), 627-8. 105Kringelbach, M. L.; Jenkinson, N.; Owen, S. L. F.; Aziz, T. Z. Nature Reviews Neuroscience 2007, 8, 623-635. 106Kleiner-Fisman, G.; Herzog, J.; Fisman, D. N.; Tamma, F.; Lyons, K. E.; Pahwa, R.; Lang, A. E.; Deuschl, G. Mov. Disord. 2006, 21 (14), 290-304. Introdução 30 Os efeitos decorrentes da estimulação elétrica através de impulsos de alta frequência na fisiologia das células nervosas e dos neurotransmissores encontra-se em debate, porém através do envio destes impulsos elétricos em regiões específicas do cérebro consegue mitigar107 e/ou diminuir os efeitos secundários induzidos pela terapêutica farmacológica,108 permitindo reduzir o esquema terapêutico e/ou tornando-o mais tolerável. Não obstante, a ECP revelou ser de grande valia na redução sintomatológica em alguns pacientes com SP, existe um potencial risco de complicações graves associado a este procedimento,109 que dizem respeito a riscos comuns a quaisquer procedimentos invasivos, e.g. infeções (3-5%) e hemorragias (1-2%).110 Os mecanismos por detrás do alívio sintomático da SP com recurso à ECP são, até à data, desconhecidos. 107Moro, E.; Lang, A. E. Expert Review of Neurotherapeutics 2006, 6 (11), 1695-1705. 108Apetauerova, D.; Ryan, R. K.; Ro, S. I.; Arle, J.; Shils, J.; Papavassiliou, E.; Tarsy, D. Movement Disorders 2006, 21 (8), 1277-1279. 109Gildenberg, P. L. Stereotact Funct Neurosurg 2005, 83 (2-3), 71-79. 110Doshi, P. K. Stereotact Funct Neurosurg 2011, 89 (2), 89-95. Introdução 31 1.3. CIRCUITOS E RECETORES DOPAMINÉRGICOS 1.3.1. Antecedentes Em 1958, no laboratório de Farmacologia Química do Instituto Nacional do Coração na Suécia, Arvid Carlsson e Nils-Åke Hillarp detetaram a presença de dopamina no cérebro e pouco depois, em 1959, Bertler e Rosengren detetaram uma elevada concentração da mesma no corpo estriado, na qual se encontra uma baixa concentração de noradrenalina. Estes feitos levaram a descartar a ideia existente nessa época de que a dopamina era um simples precursor de outras catecolaminas. A dopamina é, com efeito, um dos neurotransmissores catecolaminérgicos mais importantes do SNC. É um neurotransmissor versátil, que participa na regulação de diversas funções fisiológicas que vão desde o controlo do movimento até ao desenvolvimento de condutas de base emocional. 1.3.2. Circuitos dopaminérgicos Os circuitos dopaminérgicos são vias de transmissão do neurotransmissor dopamina entre diferentes regiões cerebrais. Assim, no caso da transmissão de dopamina são conhecidas quatro vias principais, a saber: a via nigroestriada, a mesolímbica, a mesocortical e a via tuberoinfundibular (Figura 1.1).111 Via nigroestriada: é a via de controlo do movimento. A dopamina oriunda de uma zona cerebral denominada substância negra, que por sua vez está conectada com o corpo estriado, que desempenha um papel importante no controlo do sistema músculo-esquelético. A perda de neurónios dopaminérgicos na substância negra é um dos principais marcos patológicos que está na base da sintomatologia da SP,112 levando a uma redução expressiva da função dopaminérgica nesta via. Note-se que, os sintomas associados a esta síndrome surgem, tipicamente, após a perda de 80-90% da função dopaminérgica. Esta via também está envolvida em outras síndromes que afetam o movimento, como a discinesia tardia, um dos efeitos colaterais das drogas ansiolíticas. Estes fármacos bloqueiam os recetores D2 em várias vias cerebrais. A utilização de fármacos que visam reduzir os sintomas psicóticos têm como objetivo a redução da função dopaminérgica na via mesolímbica, contudo, como muitos desses fármacos não são muito seletivos, eles podem bloquear a função dopaminérgica em todas as vias. Quando a via nigroestriada é afetada pelo seu uso, pode-se manifestar desordens de movimento similares às encontradas na SP. 111Anden, N. E.; Carlsson, A.; Dahlstroem, A.; Fuxe, K.; Hillarp, N. A.; Larsson, K. Life Sci 1964, 3, 523-530. 112Diaz, J. How Drugs Influence Behavior, Englewood Cliffs: Prentice Hall, 1996. Introdução 32 Via mesolímbica: é a segunda via cerebral em que intervém ativamente a dopamina. Esta tem início a partir dos neurónios da região tegmental ventral do cérebro e está conetada ao sistema limbico (responsável, por sua vez, pela regulação das emoções, da motivação, da conduta e o sentido do olfato e diversas funções involuntárias, como o batimento cardíaco ou os ciclos ventilatórios), à via núcleos accumbens, à amígdala e ao hipocampo, assim como ao cortéx pré-frontal mediano. O sistema dopaminérgico do mesolímbico é amplamente apontado como a via da recompensa, porém essa hipótese não é unânime.113 Uma vez que esta via está associada com os sentimentos de recompensa e desejo, torna-se implicada em teorias neurobiológicas de adição, esquizofrenia e depressão.114 A adição, perda de controlo face ao uso de uma droga ou a procura compulsiva e abuso de drogas apesar das consequências adversas são devido a um aumento de transmissão dopaminérgica no sistema límbico, cujo mecanismo depende do princípio ativo em causa (psicoestimulantes, opiatos, etanol e nicotina).115,116 Tal como os efeitos da adição a drogas, a esquizofrenia e a depressão possuem alterações estruturais e funcionais semelhantes da transmissão dopaminérgica.117 Via mesocortical: transmite dopamina desde a região tegmental ventral até ao lóbulo frontal do córtex pré-frontal. É uma das vias essenciais à normal função cógnitiva do cótex préfrontal dorsolateral (parte do lóbulo frontal), e pensa-se estar implicada nas respostas emocionais cognitivas e na motivação. Alterações nesta via parecem estar relacionadas com psicoses tal como a esquizofrenia. Esta via está intimamente associada à via mesolímbica, que também é conhecida como via mesolímbica da recompensa. Via tuberoinfundibular: refere-se a uma população de neurónios no núcleo arqueado do hipotálamo médio basal (região tuberal) que se projetam na eminência mediana (região infundibular). A libertação de dopamina neste local regula a função neuroendocrinal através da estimulação da secreção de prolactina na glândula anterior da pituitária. Alguns fármacos antipsicóticos bloqueiam a transmissão dopaminérgica na via tuberoinfundibular, o que causa o aumento dos níveis plasmáticos de prolactina (hiperprolactinemia) que se reflete no surgimento de galactorreia, ginecomastia, disrupção do ciclo menstrual na mulher, problemas visuais, dor de cabeça, infertilidade, entre outros sintomas. 113Berridge, K. C. Psychopharmacology 2007, 191,391-431. 114Laviolette, S. R. Schizoprenia Bulletin 2007, 33, 971-981. 115Pierce, R. C.; Kumaresan, V. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 2006, 30, 215-238. 116Janhunen, S.; Ahtee, L. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 2007, 31, 287-314. 117Van den Heuval, D. M. A.; Pasterkamp, R. J. Progress in Neurobiology 2008, 85, 75-93. Introdução 33 Figura 1.1 Os principais circuitos dopaminérgicos: via nigroestriada (a vermelho); via mesolímbica (a preto); via mesocortical (a azul); via tuberoinfundibular (a roxo). Introdução 34 1.3.3. Recetores dopaminérgicos 1.3.3.1. Famílias e estrutura básica dos recetores dopaminérgicos Os recetores definem-se como moléculas (ou arranjos moleculares) capazes de reconhecer com elevada seletividade um ligando específico e ser ativado por ele com eficácia intrínseca de forma a iniciar um evento celular.118 As proteínas G, são proteínas envolvidas na ativação de cascatas de sinalização intracelular e recebem esta designação pela sua interação com nucleótidos de guanina (GTP/GDP). Muitos recetores encontram-se associados a este tipo de proteínas G, sendo designados por recetores acoplados a proteínas G. Estas últimas revestem-se de extrema importância na transdução de sinais, já que através destas se estimula (Gs) ou se inibe (Gi) o adenilato ciclase (EC 4.6.1.1), ou se estimula (Gq) o fosfolipase C (EC 3.1.4.11), regulando-se assim, os níveis intracelulares de segundos mensageiros como o AMP cíclico (cAMP) e o fosfatidil inositol, respetivamente. Quando os recetores estão acoplados a proteínas G, revelam menos afinidade para os ligandos agonistas (estado de baixa afinidade), ao passo que, aqueles recetores acoplados, i.e., funcionalmente ativos, mostram uma maior afinidade (estado de alta afinidade). Assim, o estado de alta afinidade do recetor corresponde à formação do complexo ternário agonista-recetor-proteína G. Figura 1.2 Representação esquemática de um recetor de dopamina acoplado a proteínas G. Desde a descoberta das funções fisiológicas da dopamina, em 1957,119 este transmissor catecolaminérgico tem atraído muita atenção. As ações fisiológicas decorrentes da dopamina são mediadas por cinco proteínas G distintas acopladas a recetores, porém altamente relacionadas. Estas cinco proteínas G encontram-se divididas em dois grandes grupos: as classes D1 e D2 de recetores dopaminérgicos.120,121 118Humphrey, P. P. A. Ann. New York Acad. Sci. 1997, 812, 1. 119Carlsson, A.; Lindqvist, M.; Magnusson, T. Nature 1957, 180, 1200. 120Andersen, P. H.; Gingrich, J. A.; Bates, M. D.; Dearry, A.; Falardeau, P.; Senogles, S. E.; Caron, M. G. Trends Pharmacol Sci 1990, 11, 231-236. 121Vallone, D.; Picetti, R.; Borrelli, E. Neurosci Biobehav Rev 2000, 24, 125-132. Introdução 35 Esta classificação é feita tendo por base as observações bioquímicas que revelam o efeito modulatório da atividade do adenilato ciclase (AC) por parte da dopamina. Foi mostrado em 1978 que os recetores de dopamina poderiam existir em duas populações distintas, em que apenas um subgrupo estaria positivamente acoplado com o AC.122 Esta observação conduziu subsequentemente à separação dos subtipos D1 e D2 dos recetores dopaminérgicos, baseado em grande parte, na capacidade de modulação da produção de cAMP e nas diferenças das suas propriedades farmacológicas.123 Mais tarde, com o surgimento da tecnologia de ADN recombinante e com a clonagem molecular de recetores em 1990, verificou-se uma heterogeneidade colossal em termos bioquímicos, farmacológicos e fisiológicos nos mesmos.124,125,126 Com base nesses novos dados, estes recetores foram classificados em recetores da classe D1 (que inclui os subtipos D1 e D5 - originalmente identificado como D1B)127 aos quais se associam funções estimuladoras e recetores de dopamina da classe D2 (inclui os subtipos D2L, D2S, D3 e D4).128 Os recetores D1 são os mais abundantes no SNC, localizando-se em todas as áreas do cérebro que recebem inervação dopaminérgica (corpo estriado, núcleo accumbens e córtex); já os recetores D2 localizam-se nos neurónios que sintetizam dopamina (terminações dopaminérgicas do corpo estriado e do núcleo accumbens, no corpo celular destes neurónios na substância negra e na área tegmental ventral). Todos os recetores dopaminérgicos possuem, na sua constituição, sete domínios transmembranares contituidos cada um por 20-25 resíduos de α-aminoácidos hidrofóbicos, estando os domínios conetados de forma a possuirem, alternadamente, porções extracelulares e intracelulares, estas últimas acopladas a sistemas de transdução intracelulares mediante proteínas G.129 A região N-terminal corresponde a um domínio extracelular glicosilado. Os efeitos da ativação destes recetores devem-se à interação que a última ansa citoplasmática e a região C-terminal (ambas intracelulares), estabelecem com as proteínas G. O terceiro domínio citoplasmático é responsável por conferir seletividade a cada subtipo de recetor, na medida que este exibe diferenças de subtipo para subtipo de recetores. 122Spano, P. F.; Govoni, S.; Trabucchi, M. Adv Biochem Psychopharmacol 1978, 19,155-165. 123Kebabian, J. W.; Calne, D. B. Nature 1979, 277, 93-96. 124Bunzow, J. R.; Van Tol, H. H.; Grandy, D. K.; Albert, P.; Salon, J.; Christie, M.; Machida, C. A.; Neve, K. A.; Civelli, O. Nature 1988, 336, 783-787. 125Van Tol, H. H.; Bunzow, J. R.; Guan, H. C.; Sunahara, R. K.; Seeman, P.; Niznik, H. B.; Civelli, O. Nature 1991, 350, 610-614. 126Sunahara, R. K.; Guan, H. C.; O’Dowd, B. F.; Seeman, P.; Laurier, L. G.; Ng, G.; George, S. R.; Torchia, J.; Van Tol, H. H.; Niznik, H. B. Nature 1991, 350, 614-619. 127Tiberi, M.; Jarvie, K. R.; Silvia, C.; Falardeau, P.; Gingrich, J. A.; Godinot, N.; Bertrand, L.; Yang-Feng, T. L.; Fremeau, R. T. Jr.; Caron, M. G. Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88, 7491-7495. 128Sokoloff, P.; Andrieux, M.; Besanc, R.; Pilon, C.; Martres, M. P.; Giros, B.; Schwartz, J. C. Eur J Pharmacol 1992, 225, 331-337. 129Schwartz, J.-C.; Giros, B., Martres, M.-P.; Sokoloff, P. Curr. Trends Treat. Parkinson's Dis., Proc. Symp. 1992, 59. Introdução 42 O empacotamento de um ou mais elementos da estrutura secundária, origina unidades com um nível de organização superior, estamos assim perante a estrutura terciária. Um quarto termo, estrutura quaternária, emergiu quando se reconheceu que uma entidade distinta pode ser formada pela associação de duas ou mais cadeias polipeptídicas, como é o caso da hemoglobina. Note-se, contudo, que muitos autores utilizam a expressão sequência primária em detrimento de estrutura primária, apresentando a primeira menor ambiguidade, uma vez que esta designa a sequência de resíduos de α-aminoácidos na cadeia peptídica e não a "estrutura de α-aminoácidos". Aconselha-se, destarte, o abandono da expressão "estrutura primária".143 Figura 1.5 Níveis de hierarquização estrutural das cadeias peptídicas, desde a sua sequência primária até à estrutura quaternária. Adaptado de Nelson et al..144 1.4.2.2.1. Estrutura secundária dos péptidos144 Na estrutura de um péptido ou de uma proteína, cada α-aminoácido apresenta valores determinados para ϕ e ψ. Como estes são os únicos graus de liberdade que a estrutura apresenta, a conformação da cadeia peptídica fica completamente determinada quando se conhecem os valores de ϕ e ψ para cada α-aminoácido. Se representarmos os valores de ϕ e ψ para todos os α-aminoácidos de um péptido ou proteína, obtém-se o denominado diagrama de Ramachandran (Figura 1.6). 143Benoiton, N. L. Chemistry of Peptide Synthesis, 1st ed., CRC Press. Taylor & Francis Group: New York, 2006, p. 283. 144Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed., W. H. Freeman and Company: New York, 2008, 116-156. Introdução 43 Figura 1.6 Representação de um gráfico de Ramachandran contendo os valores de ϕ e ψ para várias estruturas. Apesar de ser possível a formação de hélices-α sinistrorsas, estas não surgem em proteínas. Adaptado de Nelson et al..144 Este diagrama é importante para distinguir três regiões com valores "permitidos" para os ângulos de torção, ou seja, aqueles valores que não dão lugar a impedimentos estéricos na estrutura. Estas regiões correspondem aos elementos de estrutura secundária das proteínas. Note-se que certos valores de ϕ e ψ podem não existir devido a impedimentos estéricos limitando o ângulos de torção. Os graus de liberdade e outros parâmetros como o número de α-aminoácidos e natureza dos mesmos e as interações intramoleculares são determinantes para definir uma conformação,13 que está na base da sua estrutura secundária. De maneira geral, podem-se classificar estes tipos de conformações, baseado na disposição espacial dos resíduos de α-aminoácidos que constituem a cadeia peptídica. Hélice-α: Nesta estrutura o esqueleto polipeptídico está estreitamente enrolado ao longo do maior eixo da molécula e as cadeias laterais dos resíduos de α-aminoácido projetam-se para fora do esqueleto helicoidal. A estabilização dá-se pela presença das ligações de hidrogénio entre o grupo CON-H de um resíduo de α-aminoácido (i) e o grupo carbonilo do resíduo de α-aminoácido que dista quatro resíduos de α-aminoácido na sequência linear (i + 4). O sentido de giro de uma αhélice pode ser para a direita (hélice dextrorsa) ou para a esquerda (hélice sinistrorsa). As α-hélices encontradas em proteínas são dextrorsas. 13Khan, M.; Eguchi, M. Synthesis of Peptides Incorporating β-Turn Inducers and Mimetics. In Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry, Murray, G.; Felix, A.; Moroder, L.; Toniolo, C. Eds., 2003, vol. E, 22c, p. 695. 144Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed., W. H. Freeman and Company: New York, 2008, 116-156. Introdução 44 Figura 1.7 Representação de uma hélice-α (dextrorsa). Adaptado de Nelson et al..144 Folha-β: é um padrão estrutural encontrado em várias cadeias peptídicas, nas quais regiões vizinhas da cadeia polipeptídica associam-se por meio de ligações de hidrogénio, resultando numa estrutura achatada e rígida. A folha-β pregueada, ou configuração β, é uma estrutura também mantida por pontes de hidrogénio entre as unidades peptídicas. Neste caso, entretanto, as ligações são estabelecidas entre cadeias polipeptídicas diferentes, distendidas e paralelas, ou entre segmentos distantes e distendidos de uma mesma cadeia. As pontes de hidrogénio são perpendiculares ao eixo das cadeias, e os grupos laterais dos α-aminoácidos projetam-se para cima e para baixo do plano da folha pregueada. Quando o número de cadeias associadas é grande, resulta numa estrutura flexível, mas não elástica. Folha-β Folha-β pregueada Figura 1.8 Representação de uma folha-β (antiparalela) e de uma folha-β pregueada (paralela). As setas indicam o a direção e o sentido das porções das cadeias apresentadas (N-terminal C-terminal). 144Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed., W. H. Freeman and Company: New York, 2008, 116-156. Introdução 45 Voltas: são motivos de estrutura secundária constituídos por uma sequência de 3-5 resíduos de α-aminoácido, que induzem uma alteração da direção da cadeia peptídica.145 Esses resíduos não formam estruturas secundárias regulares tais como hélices-α ou folhas-β. Em oposição às hélices-α, os ângulos diedros do esqueleto não são, geralmente, constantes em todos os resíduos envolvidos na volta. As voltas são classificadas de acordo com a distância entre os dois resíduos finais. Assim, tendo em conta o número de resíduos envolvidos, que estabelecem ligações de hidrogénio, podemse formar voltas específicas em que os resíduos finais (i) encontram-se separados por ligações peptídicas (i ). Tendo em conta este critério, é possível distinguir-se, essencialmente, cinco tipos de voltas, a saber: voltas-α (i 4); voltas-β (i 3), sendo este arranjo o mais comum; voltas-γ (i 2); voltas-δ (i 1) e, finalmente, voltas-π (i 5). Figura 1.9 Representação de uma volta-β (à esquerda) e de uma volta-γ (à direita). As voltas-γ estabelecem-se entre três resíduos de α-aminoácido formando um pseudociclo de sete átomos. A ligação de hidrogénio estabelece-se entre o carbonilo do primeiro resíduo (i) e o grupo amida do último resíduo (i + 2).146,147 Existem dois tipos de voltas, denominadas voltas-γ e voltas-γ inversas que são definidas pelos ângulos diedros do resíduo (i + 1). As voltas-β, ou conformação β-girada, foram reveladas pela primeira vez em 1968 por Venkatachalam,147 a sua formação é muito frequente em cadeias peptídicas devido, em grande extensão, à estabilidade que provocam e além disso, são as melhores conhecidas até ao momento. 145Venkatachalam, C. M. Biopolymers 1968, 6 (10), 1425-1436. 146Chon, K. C. Anal. Biochem. 2000, 286, 1. 147Rosenstroem, U.; Skoeld, C.; Plouffe, B.; Beandry, H.; Lindeberg, G.; Botros, M.; Nyberg, F.; Wolf, G.;Karlem, A.; Gallo-Payet, N.; Hallberg, A. J. Med. Chem. 2005, 48, 4009. Introdução 46 Para a formação desta conformação, é necessária a participação de quatro resíduos de αaminoácido: (i), (i + 1), (i + 2) e (i + 3), ordenados desde o extremo N-terminal do resíduo (i) até ao extremo C-terminal do resíduo (i + 3), formando um pseudociclo de dez átomos, em que o grupo amida do resíduo (i + 3) participa como dador numa ligação hidrogénio com o grupo carbonilo do resíduo (i). Destarte, este tipo de conformação obriga a que distância entre os Cα dos resíduos (i) e (i + 3) seja menor que 7Å, sendo que os resíduos (i + 1) e (i + 2) não descrevem uma estrutura helicoidal. Uma volta-β pode adotar diferentes arranjos espaciais dependendo dos ângulos diedros dos resíduos (i + 1) e (i + 2) que, em regra, apresentam uma abundância variável. A atividade biológica de um número significativo de péptidos de baixo peso molecular são associados às conformações β-giradas. Este é o caso de uma centena de ligandos reconhecidos por recetores de membrana associados a proteínas G. Introdução 47 1.5. PLG COMO MODULADOR ALOSTÉRICO DE RECETORES DOPAMINÉRGICOS D2 E POTENCIAL FÁRMACO NO TRATAMENTO DE PATOLOGIAS NEURODEGENERATIVAS DO SNC 1.5.1. Neuropéptido PLG O tripéptido L-prolil-L-leucilglicinamida (PLG), também conhecido como fator de inibição da libertação da hormona estimuladora de melanócitos (MIF-1),90,148 é um tripéptido hipotalâmico endógeno derivado da clivagem da hormona oxitocina.149,150 O PLG é um neuropéptido endógeno encontrado no sistema nervoso central,151,152,153 onde estudos farmacológicos mostraram exercer as suas funções biológicas na modulação da transmissão neuronal dopaminérgica na via nigrostriatal.91,148,154,155 Estudos demonstraram que este neuropéptido modula a neurotransmissão dopaminérgica através de processos que não contemplam a síntese, captação, ou metabolismo da dopamina.156 Mais precisamente exerce um potencial efeito sobre a L-dopa,157 além de aumentar o efeito dos agonistas dopaminérgicos nos recetores D2 tais como N-propilnorapomorfina (NPA), apomorfina e 2-amino-6,7-di-hidroxi-1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno (ADTN),90,91 através da modulação dos receptores D2 de dopamina, de um modo bifásico dependente da dose para dar uma curva doseresposta em forma de sino.151,158 Contudo, o PLG não possui nenhum efeito na ligação de antagonistas tal como o espiroperidol a estes recetores de dopamina.90,91 Estudos mostram que o PLG potencia a ligação do [3H]-NPA e do [3H]-quinpirrole de um modo dependente da dose relativamente aos subtipos dos receptores dopaminérgicos D2L, D2S e D4, sem potenciar a ligação aos recetores de dopamina D1 e D3.90,91 Estes resultados revelam que o PLG atua promovendo a conversão dos recetores dopaminérgicos (RD) do seu estado de baixa afinidade para o estado de alta afinidade, tornando-os mais sensíveis aos agonistas. 20,91,153,154 20Costa, J. F.; Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X.; Midón, P.; Rodríguez-Borges, J. E., Tetrahedron 2010, 66, 6797-6805. 90Verma, V.; Mann, A.; Costain, W.; Pontoriero, G.; Castellano, J., M.; Skoblenick, K.; Gupta, S. K.; Pristupa, Z.; Niznik, H. B.; Johnson, R. L.; Nair, V. D.; Mishra, R. K., J. Pharmacol. Exp.Ther. 2005, 315, 1228-1236. 91Srivastava, L. K.; Bajwa, S. B.; Johnson, R. L.; Mishra, R. K. J. Neurochem. 1988, 50, 960-968. 148Mann, Amandeep; Verma, V.; Basu, D.; Skoblenick, K, J.; Beyaert, M. G. R.; Fischer, A.; Thomas, N.; Johnson, R. L.; Mishra, R. K., European Jornal of Pharmacology 2010, 641, 96-101. 149Celis, M. E.; Taleisnik, S.; Walter, R., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1971, 68 (7): 1428-33. 150Petersson, M.; Uvnäs-Moberg, Physiology & Behavior 2004, 83 (3): 475-81. 151Mishra, R. K.; Chiu, S.; Chiu, P.; Mishra, C. P., Meth.Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1983, 5, 203-233. 152Saitton, S.; Tredici, A. L.; Saxtin, M.; Stenström, T.; Kihilberg, J.; Luthman, K., Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 16471654. 153Saitton, S.; Tredici, A. L.; Mohell, N.; Vollinga, R. C.; Boström, D.; Kihilberg, J.; Luthman, K., J. Med. Chem. 2004, 47, 6595-6602. 154Reed, G. W.; Olson, G. A.; Olson, R. D., Neurosci. Biobehav Rev. 1994, 18, 519-525. 155Fischer, A.; Mann, A.; Verma, V.; Thomas, N.; Mishra, R. K.; Johnson, R. L., J. Med. Chem. 2006, 49, 307-317. 156Bhargava, H. N., Gen. Pharmacol. 1983, 14, 609-614. 157Huidobro-Toro, J. P.; De Carolis, A. S.; Longo, V. G., Pharmacol. Biochem. Be. 1974, 2, 105. 158Chiu, S.; Paulose, C. S.; Mishra, R. K., Peptides 1981, 2, 105. Introdução 48 Um estudo envolvendo membranas de sinaptossomas bovinos mostrou que o PLG exibe o seu efeito modulatório máximo nos subtipos D2L dos recetores de dopamina.90,91,148 O PLG possui variadas atividades farmacológicas ao nível do sistema nervoso,148 porém o mecanismo de ação preciso na modulação dos recetores dopaminérgicos permanece pouco inteligível.148,158 Estudos preliminares sugerem a evidência de um local de ligação do PLG nos RD.148,158,159 Conjetura-se, portanto, a existência de um local de ligação no próprio RD ou numa outra macromolécula independente que, de alguma forma, liga-se ao recetor para formar um complexo com o RD.148 Uma série de estudos demonstraram que este tripéptido possui atividade terapêutica substancial no tratamento da SP,160 e ainda, capacidade para interagir com outros fármacos modificando os seus efeitos. Assim, por exemplo, antagoniza a catalepsia induzida por morfina,161 bem como discinesia induzida por fármacos antipsicóticos162,163 Tendo em conta estes resultados, outros estudos sobre o PLG centraram-se na potencial atividade deste tripéptido para aliviar as alterações de conduta provocadas pela SP em modelos animais.164,165 Os primeiros passos no sentido de deslindar o mecanismo de ação associado ao PLG surgiram com a descoberta da sua afinidade com o tecido estriado humano, assim como a sua capacidade para reduzir a sensibilidade induzida pelo haloperidol (antagonista do recetor de dopamina D2)166 sobre os recetores dopaminérgicos. A posterior demonstração que o PLG atua como um modulador alostérico positivo dos recetores de dopamina assim como a sua capacidade de incrementar o efeito inibitório dos recetores D2 de dopamina sobre o adenilato ciclase,167 serviram para dar algumas pistas acerca do seu possível mecanismo de ação. Haloperidol 90Verma, V.; Mann, A.; Costain, W.; Pontoriero, G.; Castellano, J., M.; Skoblenick, K.; Gupta, S. K.; Pristupa, Z.; Niznik, H. B.; Johnson, R. L.; Nair, V. D.; Mishra, R. K., J. Pharmacol. Exp.Ther. 2005, 315, 1228-1236. 91Srivastava, L. K.; Bajwa, S. B.; Johnson, R. L.; Mishra, R. K. J. Neurochem. 1988, 50, 960-968. 148Mann, Amandeep; Verma, V.; Basu, D.; Skoblenick, K, J.; Beyaert, M. G. R.; Fischer, A.; Thomas, N.; Johnson, R. L.; Mishra, R. K., European Jornal of Pharmacology 2010, 641, 96-101. 158Chiu, S.; Paulose, C. S.; Mishra, R. K., Peptides 1981, 2, 105 159Chiu, S; Wong, Y. W.; Wan, Y. P; Chiu, P.; Mishra, R. K., Prog. Neuro-Psychopharmocol. Biol. Psychiat. 1983, 7, 739-742. 160Barbeau, A.; Roy, M.; Kastin, A. J. Can. Med. Assoc. J. 1976, 114, 120. 161Chiu, S.; Mishra, R. K. Eur. J. Pharmacol. 1979, 53, 119. 162(a) Sharma, S.; Paladino, P.; Gabriele, J.; Saeedi, H.; Henry, P.; Chang, M.; Mishra, R. K.; Johnson, R. L. Peptides 2003, 24, 313. (b) Mycroft, F. J.; Bhargava, H. N.; Wei, E. T. Peptides 1987, 8, 1051. 163Chiu, P.; Rajakumar, G.; Chiu, S.; Johnson, R. L.; Mishra, R. K. Peptides 1985, 6, 179. 164Smith, J. R.; Morgan, M. Gen. Pharmacol. 1982, 13, 203. 165Marcotte, E. R.; Chugh, A.; Mishra, R. K.; Joshnson, R. L. Peptides 1998, 19, 403. 166Kjaera, J. B.; Hjarvarda, B. M.; Jensena, K. H.; Hansen-Møllerb, Naesbye Larsenc, J. O. Applied Animal Behaviour Science 2004, 86 (1-2), 77-91. 167Mishra, R. K.; Makman, M. H.; Costain, W. J.; Nair, V. D.; Johnson, R. L. Neurosci. Lett. 1999, 269, 21. Introdução 49 Mais recentemente, em 2010, o PLG demonstrou a capacidade de induzir um aumento da expressão de c-Fos (um proto-oncogene, i.e., um gene que codifica para proteínas que ajudam a regular o crescimento celular e a diferenciação) em regiões com inervação dopaminérgica,168 ainda que também esteja envolvida na redução da expressão do transcrito da c-Fos induzida por haloperidol.169 Estes resultados, delineiam a possibilidade de que a modulação de recetores D2 através deste tripéptido possa incitar a funcionalização seletiva do recetor D2 através de vias não clássicas, dependendo do meio celular. 1.5.2. PLG como ligando alostérico Diferentes mutações ou polimorfismos nos recetores acoplados a proteínas G estão associados a uma miríade de patologias. Este facto faz destes recetores alvos importantes para o desenvolvimento de novos fármacos. Contudo, devido à elevada homologia presente nos centros ortostéricos (de ligação do agonista) e ao vasto número de modos de ligação a esses centros (uma vez que reconhecem uma enorme diversidade de ligandos endógenos)170 presentes nos diferentes subtipos de recetores pertencentes a uma mesma família, torna-se uma tarefa hercúlea encontrar ligandos seletivos (agonistas ou antagonistas) de recetores associados a proteínas G. Uma abordagem utilizada para colmatar esta dificuldade passa pelo uso de moduladores de pequeno tamanho que atuem noutra zona destes recetores que não nos seus locais ortostéricos de forma a provocar um efeito, quer seja ativante ou inibitório, da resposta induzida pela ligação agonista-recetor, i.e., com efeito alostérico.164 Figura 1.10 Representação esquemática relativa aos modos de ação do efeito alostérico. 164Smith, J. R.; Morgan, M. Gen. Pharmacol. 1982, 13, 203. 168Kahn, R. S.; Yu, C.; Kastin, A. J.; He, Y.; Ehrensing, R. H.; Hsuchou, H.; Stone, K. P.; Pan, W. Int. J. Pept. 2010, ID 537639. 169Ott, M. C.; Costain, W. J.; Mishra, R. K. ; Johnson, R. L. Peptides 2000, 21, 301. 170Conn, P. J.; Christopoulos, A.; Lindsley, C. W. Nature Rev. Drug Discov. 2009, 8, 41. Introdução 50 Regra geral, a ligação modulador-recetor altera a resposta biológica (sinal induzido) devido a alterações conformacionais no centro ortostérico, através da interação de ligandos alostéricos nestes recetores por meio de um, ou mesmo, pela combinação de vários mecanismos de ação. Desta forma, a interação de ligandos alostéricos induz no centro ortostérico (Figura 1.10) uma maior ou menor afinidade para o ligando endógeno (seta vermelha), quer respostas intracelulares (seta azul), além de poderem exibir um agonismo intrínseco, mesmo na ausência de ligando ortostérico (seta verde). No que diz respeito ao mecanismo modulador por detrás da estabilização do estado de alta afinidade dos recetores dopaminérgicos despoletado pelo PLG, ainda não está definido até ao momento, um mecanismo indubitável e consistente. Porém, são propostas duas possíveis vias que tentam dar resposta a esta questão: especula-se que o PLG possua interação direta com um domínio do recetor diferente do seu local ortostérico, ou até mesmo através de um mecanismo indireto associado ao aumento da taxa de hidrólise de GTP por parte da proteína G;167 contudo esta hipótese parece menos provável, na medida que, o efeito modulador não se observa noutros recetores acoplados a proteínas G, como é o caso dos recetores adrenérgicos α2, nem com recetores acoplados a proteínas Gs, como a dos recetores dopaminérgicos da família D1,90 evidenciando especificidade para os recetores D2. Além de se desconhecer o mecanismo exato da modulação alostérica conferida por este tripéptido, também não é clara qual a conformação bioativa do mesmo, ainda que se tenham realizados estudos de conformação do tripéptido livre en solução mediante técnicas espectroscópicas de RMN em DMSO-d6171 e de dicroísmo circular.172 Adicionalmente, estudos teóricos efetuados no mesmo solvente, indicam que a conformação em volta-β é uma das mais estáveis, i.e., menos energéticas, supondo-se que este tripéptido apresente elevada flexibilidade.173 Também se sabe que no estado sólido (difractometria de raiosX)174 a molécula apresenta uma ligação de hidrogénio intramolecular entre o átomo de oxigénio carbonílico do resíduo de L-prolina e o protão amídico trans do resíduo de glicinamida (Figura 1.11). A confluência destas informações sugere que, tanto em solução como no estado sólido, o PLG adota uma conformação em volta-β na ausência de ligação ao recetor. A existência entre uma ligação de hidrogénio adicional entre o átomo de azoto do grupo amina do resíduo de L-prolina e o protão amídico do resíduo de L-leucina faz diminuir o ângulo diédrico ψi (Figura 1.11). 90Verma, V.; Mann, A.; Costain, W.; Pontoriero, G.; Castellano, J., M.; Skoblenick, K.; Gupta, S. K.; Pristupa, Z.; Niznik, H. B.; Johnson, R. L.; Nair, V. D.; Mishra, R. K., J. Pharmacol. Exp.Ther. 2005, 315, 1228-1236. 167Mishra, R. K.; Makman, M. H.; Costain, W. J.; Nair, V. D.; Johnson, R. L. Neurosci. Lett. 1999, 269, 21. 171Higashijima, T.; Tasumi, M.; Miyazawa, T.; Miyoshi, M. Eur. J. Biochem. 1978, 89, 543. 172Schwartz, R.; Mattice, W. L.; Spirtes, M. A. Biopolymers 1979, 18, 1835. 173Zimmerman, S. S.; Baum, R.; Scheraga, H. A. Int. J. Peptide Protein Res. 1982, 19, 143. 174Reed, L. L.; Johnson, P. L. J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 7523. Introdução 51 Figura 1.11 Conformação em volta-β do PLG, incluindo as ligações hidrogénio intramoleculares. Mais recentemente, em 2004, Strohmeier et al.175 compararam valores teóricos e experimentais de tensores de desvios químicos de 13C e 15N no PLG, alcançando dados concordantes com os obtidos por difração de raios-X, corroborando a disposição do esqueleto do PLG e os dos seus análogos. Posteriormente, em 2010, Wood et al.176 desenvolveram protocolos no intuito de obterem modelos computacionais que permitessem determinar o funcional de densidade (DFT), o funcional de onda (WFT) e cálculos de mecânica molecular para o PLG e outras pequenas moléculas relacionadas. Através da análise conformacional de um grupo de novos modelos de prolinomiméticos do PLG contendo uma β-lactâma em detrimento do resíduo de L-leucina (resíduo central) em soluções de CDCl3 e de DMSO-d6, mediante técnicas de espectroscopia de RMN mono e bidimensionais,177 revelam que se estabelece um equilíbrio entre as conformações em volta-βII e volta-. 1.5.3. Prolinomiméticos do PLG O pirrolidinilcarbonilamino-2-oxopirrolidinacetamida, PAOPA, foi um dos primeiros prolinomiméticos do PLG pertencendo a um grupo de análogos deste tripéptido que incluíam elementos de restrição em diferentes posições do tripéptido (1-8). No caso do PAOPA, este possui uma anel de γ-lactâma, com configuração R na posição α do mesmo. Estes análogos foram sujeitos a ensaios biológicos in vitro para estudar o seu efeito sobre a [3H]-ADTN, comprovando-se que tanto o PAOPA como o composto 4 incrementavam a fixação do agonista a recetores D2 de membranas do núcleo caudado bovino (núcleo localizado nos núcleos da base do cérebro de muitas espécies de animais que possui um papel importante no sistema de aprendizagem e memória), sendo o maior efeito verificado relativo ao PAOPA. 175Strohmeier, M.; Grant, D. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 966. 176Wood, R. L.; Young-Dixon, B. J.; Roy, A.; Gay, B. C.; Johnson, R. L.; Amin, E. A.; J. Mol. Struct. 2010, 944, 76. 177Aizpurua, J. M,: Palomo, C.; Balentova, E.; Jimenez, A.; Andreie, E.; Sagartzazu-Aizpurua, M.; Miranda, J. I.; Linde, A. J. Org. Chem. 2013, 78, 224. Introdução 58 1.7.1. Plano de Síntese das Pseudoprolinas No sentido de concretizar o primeiro objetivo, delineou-se um plano de síntese de precursores do sistema 2-azabiciclo[2.2.1]heptano N-protegido. Tendo em conta a análise retrossintética (Esquema 1.6) é possível verificar-se que este tipo de precursores pode ser obtido através da reação de aza-Diels-Alder partindo de um glioxilato, uma amina primária e do ciclopentadieno. O nosso grupo possui uma vasta experiência na síntese deste tipo de precursores, quer sob a forma racémica,181 quer sob a forma enantiomericamente pura.182 Na síntese das pseudoprolinas optou-se pela síntese dos cicloadutos precursores sob a forma racémica, uma vez que esta é menos dispendiosa e mais direta, não envolvendo o uso de auxiliares quirais. Outra justificação para o uso de racematos baseia-se no facto de que, no decurso das reações envolvendo o acoplamento com compostos enantiomericamente puros possa, eventualmente, ser possível a separação dos diasteroisómeros socorrida por técnicas cromatográficas. Assim, pela análise do Esquema 1.7, partiu-se do ácido glioxílico (1) para obtenção do glioxilato de metilo (2) por esterificação com metanol, em refluxo. A reação entre o hemiacetal 2 com a benzilamina (3) gera, in situ, mediante utilização de ácidos de Lewis, a imina do glioxilato de metilo que, por adição do ciclopentadieno a baixas temperaturas, originou os cicloadutos derivados do 2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hep-5-eno-3-carboxilato de metilo, 4-exo e 5-endo. A di-hidroxilação dos cicloadutos 4-exo com OsO4 resultou nos cis-dióis 6-exo. A hidrólise em meio básico dos ésteres 4-exo e 6-exo, deu origem aos respetivos ácidos carboxílicos, 8-exo e 7-exo. Esquema 1.7 Via de síntese proposta para a preparação dos prolinomiméticos 7-exo e 8-exo. 181Rodríguez-Borges, J. E.; García-Mera, X.; Fernández, F; Lopes, V. H. C.; Magalhães, A. L.; Cordeiro, M. N. D. S. Tetrahedron 2005, 61, 10951-10957. 182Vale, M. L. C.; Rodríguez-Borges, J. E.; Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X. Tetrahedron 2006, 62, 94759482. Introdução 59 1.7.2. Plano de Síntese dos Prolinomiméticos do PLG De forma cumprir o segundo objetivo, para cada série de tripéptidos prolinomiméticos propostos (Esquema 1.8), procedeu-se à síntese, num primeiro passo, dos correspondentes dipéptidos 11a-c, de forma a manter a sequência C-terminal pretendida, a partir dos aminoácidos comerciais protegidos 9a-c e 10a-c, utilizando o TBTU como agente de acoplamento. Mediante desproteção acidolítica do grupo terc-butoxicarbonilo (Boc) com ácido trifuoracético obtiveram-se os correspondentes sais de trifluoracetato de amónio, 12a-c. O acoplamento destes últimos, com o racemato 8-exo, mediante as mesmas condições de condensação supracitadas, resultou na síntese dos tripéptidos 13a-c/13a'-c'. Através da hidrogenação catalítica destes precursores prolinomiméticos, procedeu-se à saturação da olefina e, por prolongamento das condições reacionais, à N-desproteção (N-desbenzilação), alcançando-se os tripéptidos 14a-c/14a'-c'. A hidrólise em meio básico dos ésteres metílicos presentes nos tripéptidos 14a-c/14a'-c' conduziu à obtenção dos tripéptidos prolinomiméticos almejados, 15a-c/15a'-c'. Esquema 1.8 Via de síntese proposta para a preparação dos tripétidos prolinomiméticos respetiva às série P*LG, P*GL e P*VA. CAPÍTULO 2 Parte Teórica e Discussão de Resultados Parte Teórica e Discussão de Resultados 63 2.1. DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS PROLINOMIMÉTICOS 2.1.1. Planeamento Sintético Relativamente ao desenvolvimento de estruturas prolinomiméticas constringidas, poder-seiam apresentar diferentes abordagens sintéticas. O nosso grupo de investigação possui uma vasta experiência na preparação do sistema bicíclico do tipo 4-exo e 5-endo, tanto na forma racémica como dos quatro estereoisómeros enantiomericamente puros a partir de precursores e/ou auxiliares quirais comerciais ou previamente preparados,183 tendo trabalhado no seu aproveitamento sintético dirigido a outros campos, nomeadamente aza-açúcares e azanucleósidos.184 Desta forma elegeu-se a forma racémica 4-exo para o desenvolvimento de uma metodologia exploratória em detrimento ao uso da forma enantiomericamente pura destes compostos bicíclicos. 4-exo 5-endo Esta abordagem justifica-se na medida em que é consideravelmente menos dispendiosa tanto do ponto de vista metodológico (uma vez que não envolve o uso de auxiliares quirais) como do ponto de vista economicista (uma vez que estes auxiliares são bastante caros). Assim, é possível conhecer a química inerente à síntese desta classe de tripéptidos análogos do PLG de forma exploratória. Partimos do racemato exo para a obtenção dos prolinomiméticos almejados uma vez que o enantiómero (1S,3S,4R)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno3-carboxilato de metilo é o sistema bicíclico precursor que estruturalmente se assemelha mais à S-prolina natural, podendo ser vista como um análogo de prolina trans-3,5-dissubstituído,185 e ainda, porque tem a vantagem de se conseguir excesso diastereoisomérico deste par de enantiómeros, exo. 183(a) Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4123. (b) Fernández, F.; García-Mera, X.; López, C.; Rodríguez, G.; Rodríguez-Borges, J. E. Tetrahedron-Asymm. 2000, 11, 4805.(c) Fernández, F.; García-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E.; Blanco, J. M. Tetrahedron 2001, 42, 5239. 184(a) Blanco, J. M.; Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X.; López, C.; Rodríguez, G.; Rodríguez-Borges, J. E.; Rodríguez-Hergueta, A. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 5663-5666. (b) Fernández, F.; García-Mera, X.; Vale, M. L. C.; Rodríguez-Borges, J. E. Synlett 2005, 319-321. (c) García-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E.; Vale, M. L. C.; Alves, M. J. Tetrahedron 2011, 67 (37), 7162-7172. 185Venkatraman, S.; Njoroge, F. G.; Wu, W.; Girijavallabhan, V.; Prongay, A. J.; Butkiewicz, N.; Pichardo, J. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2006, 16, 1628-1632. Parte Teórica e Discussão de Resultados 64 2.1.2. Aminoácidos não naturais: Síntese do ácidos carboxílicos 7-exo e 8-exo Neste contexto, para a síntese dos correspondentes prolinomiméticos propostos (7-exo e 8exo), a primeira tarefa a realizar consistirá na obtenção de quantidades suficientes do aduto 4-exo. Para o efeito, seguindo os antecedentes bibliográficos do nosso grupo de trabalho, a abordagem sintética mais conveniente resulta da reação de aza-Diels-Alder entre o ciclopentadieno (CPD) e a imina protonada do glioxilato de metilo formada in situ pelo glioxilato de metilo e a benzilamina na presença de ácidos de Lewis,183 precursores acessíveis tanto pela disponibilidade comercial e acessibilidade de preço (Esquema 2.1). Esquema 2.1 Reação de aza-Diels-Alder entre a imina do glioxilato de metilo e o CPD. No que respeita à preparação do ácido 7-exo, este pode ser obtido a partir da di-hidroxilação do aduto 4-exo originando o correspondente cis-diol, 6-exo. Este último, através de hidrólise alcalina (saponificação), resultará no respetivo ácido carboxílico pretendido. Para a síntese do ácido 8-exo, levar-se-á a cabo a hidrólise alcalina do amino-éster correspondente, 4-exo (Esquema 2.2). Esquema 2.2 Via de síntese proposta para a preparação dos prolinomiméticos 7-exo e 8-exo. 183(a) Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4123. (b) Fernández, F.; García-Mera, X.; López, C.; Rodríguez, G.; Rodríguez-Borges, J. E. Tetrahedron-Asymm. 2000, 11, 4805.(c) Fernández, F.; García-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E.; Blanco, J. M. Tetrahedron 2001, 42, 5239. Parte Teórica e Discussão de Resultados 65 2.2. SÍNTESE DE AZABICICLOS COMO PRECURSORES PROLINOMIMÉTICOS 2.2.1. Reação de Diels-Alder A reação de Diels-Alder186 foi descoberta por Diels e Alder, em 1928. Por este trabalho estes investigadores ganharam o Premio Nobel em Química, em 1950. Esta reação é uma adição de um dieno conjugado com um alceno, resultando na formação de um ciclo-hexeno.187 A reação de Diels-Alder é uma das ferramentas mais versáteis em síntese orgânica,188,189,190,191 que devido ao facto de se poder gerar vários estereocentros novos simultaneamente, deu lugar a vastas aplicações na síntese de moléculas altamente complexas, como é o caso da síntese total de produtos naturais.192,193,194 Este tipo de reação é definida como uma reação pericíclica concertada em que duas ou mais moléculas insaturadas (ou mesmo partes da mesma molécula) combinam-se para formar um aduto cíclico no qual verifica-se uma redução da multiplicidade da ligação (cicloadição). É, portanto uma reação de cicloadição concertada [4+2] entre um (hetero)dieno conjugado contendo um sistema eletrónico 4 e um alceno (ou alcino) substituído, também designado por (hetero)dienófilo, contendo um sistema eletrónico 2 .195 Este tipo de reação resulta na formação de duas novas ligações σ a partir dos dois eletrões de uma ligação π do dieno e de dois eletrões da ligação π do dienófilo que visa a formação de um sistema ciclo-hexénico substituído. O exemplo mais simples da reação de Diels-Alder entre sistemas π é a adição do buta-1,3-dieno ao eteno, em fase gasosa, para dar origem ao respetivo cicloaduto, o ciclo-hexeno (Esquema 2.3). Esquema 2.3 Reação de Diels-Alder entre sistemas demonstrando o rearranjo dos eletrões e a formação de novas ligações . 186Diels, O.; Alder, K. Justus Liebigs Ann. Chem. 1928, 98, 460 187Diels, O.; Alder, K. Ber. 1929, 62, 2081-2087. 188Kloetzel, M. C. Org. React. 1948, 4, 1-59. 189Holmes, H. L. Org. React. 1948, 4, 60-173. 190Kagan, H. B.; Riant, O. Chemical Reviews 1992, 92 (5), 1007-1019. 191Nicolaou, K. C.; Snyder, S. A.; Montagnon , T.; Vassilikogiannakis, G. Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1668-1698. 192Carruthers, W. Cycloaddition Reactions in Organic Synthesis, Pergamon, Oxford, 1990. 193Oppolzer, W. Comprehensive Organic Synthesis, Paquette, L. Ed., Pergamon, Oxford, 1991. 194Coxon, J. M.; Foese, R. D. J.; Ganguly, B.; Marchand, A. P.; Morukuma, K. Synlett 1999, 11, 1681. 195Vollhardt, K.; Peter, C. Organic Chemistry: Structure and Function, 6th ed., W. H. Freeman and Company: New York, 2011, p 628. Parte Teórica e Discussão de Resultados 66 Esta reação ocorre através de um único estado de transição, de forma concertada, i.e., todas ligações quebram-se e formam-se num único passo. Tal como o benzeno é estabilizado devido à sobreposição cíclica de seis electrões, o processo de Diels-Alder também beneficia da presença deste arranjo no estado de transição. Uma representação das orbitais pode mostrar claramente a formação das ligações por sobreposição das orbitais p do dienófilo com as orbitais p terminais do dieno. Enquanto estes quatro carbonos re-hibridizam para originar orbitais sp3, as restantes orbitais p do dieno dão origem à nova ligação π (Esquema 2.4). Esquema 2.4 Representação das orbitais da reação de Diels-Alder entre o buta-1,3-dieno e o eteno. O rendimento da reação entre o eteno e o buta-1,3-dieno é baixo e requer temperaturas elevadas, contudo consegue-se obter rendimentos elevados em reações de Diels-Alder, tendo em conta a estrutura eletrónica do dienófilo e do dieno envolvido na reação. O conhecimento das propriedades físico-químicas tanto dos dienos conjugados como dos dienófilos reveste-se de grande importância para o sucesso deste tipo de reações de cicloadição. Dieno conjugado A reação de Diels-Alder é favorecida quando os dienos conjugados são ricos em eletrões, i.e., dienos substituídos com grupos dadores de eletrões. O dieno conjugado pode ser uma cadeia aberta ou fechada e pode possuir diferentes tipos de substituintes. Apenas possui uma limitação: deve existir na conformação s-cis. Os dienos de cadeia aberta estão em equilíbrio entre a conformação s-cis e s-trans, sendo o equilíbrio deslocado para a conformação s-cis, uma vez que a reatividade do dieno na conformação s-cis é elevada, reagindo prontamente com o dienófilo. Dienos strans que reagem com dienófilos originam anéis de seis membros contendo uma ligação dupla trans altamente constringida. Parte Teórica e Discussão de Resultados 67 Dienos que estão permanentemente na conformação s-cis são extremamente reativos em cicloadições, sendo o ciclopentadieno (CPD) um exemplo paradigmático, apresentando tal reatividade que, à temperatura ambiente, dimeriza espontaneamente – originando o diciclopentadieno (Esquema 2.5). Pode-se reverter este processo de forma a obter-se o CPD na sua forma monomérica através de uma destilação simples via retro-Diels-Alder. CPD Diciclopentadieno Esquema 2.5 Formação do diciclopentadieno por dimerização do ciclopentadieno através da reação de Diels-Alder. Os dienos cíclicos que estão permanentemente numa conformação s-trans e estão impedidos de adotar a conformação s-cis não participam em reações de cicloadição de Diel-Alder, pelo menos não como dienos conjugados. Existem, contudo, algumas exceções a este tipo de cicloadições, como é o caso da reação entre o quadriciclano e o azodicarboxilato de dimetilo (DMAD) para originar a respetiva 1,2diazetidina.196,197 Em vez de ocorrer por ligações , operam por anéis de ciclopropano com elevada tensão, na medida em que estes apresentam um significativo carácter (Esquema 2.6). Quadriciclano DMAD 1,2-diazetidina Esquema 2.6 Cicloadição atípica entre o quadriciclano e o DMAD operando por um anel de ciclopropano para originar a respetiva 1,2dizetidina. 196Jones, G. A.; Shephard, M. J.; Paddon-Row, M. N.; Beno, B. R.; Houk, K. N.; Redmond, K.; Carpenter, B. K. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 4334-4339. 197Jaap, E. K.; Jan, B. F. N. Engberts Nature 2005, 435, 746-747. Parte Teórica e Discussão de Resultados 74 A adição do dieno (ciclopentadieno) ao dienófilo VI (imina estabilizada do glioxilato de metilo) pode ocorrer de quatro maneiras distintas, originando quatro isómeros. Tendo como referência a função éster, o dieno pode aproximar-se de forma a originar dois diasteroisómeros (exo e endo) e, para cada um desses diasteroisómeros, o ataque pode ser feito indistintamente pela face si ou re do dienófilo, resultando assim num par de enantiómeros exo e um par de enantiómeros endo, como obviado no Esquema 2.10. Como resultado, obtêm-se duas famílias de diasteroisómeros (exo e endo), apresentando-se cada uma, sob a forma de mistura racémica. Esquema 2.10 Formação de cicloadutos por reação de aza-Diels-Alder com indicação das possíveis aproximações (exo e endo) e faces de ataque (re e si) entre o ciclopentadieno e a imina protonada do glioxilato de metilo. A reação é altamente estereosselectiva, quanto mais baixa é a temperatura maior a estereosseletividade no que diz respeito à formação dos adutos exo. Parte Teórica e Discussão de Resultados 75 O nosso grupo de investigação tem vindo a estudar há alguns anos este tipo de reações de aza-Diels-Alder entre iminas de glioxilatos quirais e o ciclopentadieno, para a obtenção estereoespecífica dos correspondentes adutos bicíclicos.20,181,184b,184c,208 O uso de racematos, como precursores, é prático em termos sintéticos uma vez que permite a investigação de novas reações sem a necessidade da exaustiva de resolução dos enantiómeros ou a utilização de metodologias de síntese assimétrica, servindo como medida exploratória, o que de outra forma implicaria elevados custos. Apenas justificar-se-ia a utilização de compostos enantiomericamente puros uma vez comprovada a viabilidade da síntese dos compostos prolinomiméticos almejados, assim como na preparação dos peptidomiméticos do PLG e a posterior avaliação da sua eventual atividade biológica. Além do mais, uma vez partindo de prolinomiméticos sob a forma racémica, o acoplamento delineado com os dipéptidos enantiomericamente puros poderá possibilitar a separação dos diastereoisómeros nas etapas conducentes à síntese dos tripéptidos propostos. 2.2.2.1. Síntese de 2-hidroxi-2-metoxietanoato de metilo (2): precursor do glioxilato de metilo. Este hemiacetal pode ser preparado por esterificação direta do ácido glioxílico com metanol em refluxo,209 como evidenciado pela seguinte equação química: O glioxilato de metilo forma-se também in situ a partir do 2-hidroxi-2-metoxietanoato de metilo (2) (Esquema 2.11). 2 Glioxilato de metilo Esquema 2.11 Equilíbrio entre o 2-hidroxi-2-metoxietanoato de metilo e o respetivo glioxilato. 20Costa, J. F.; Caamaño, O.; Fernández, F.; García-Mera, X.; Midón, P.; Rodríguez-Borges, J. E. Tetrahedron 2010, 66, 6797-6805. 181Rodríguez-Borges, J.; García-Mera, X.; Fernández, F.; Lopes, C.; Hugo, V.; Magalhães, A. L.; Morales, M.; Cordeiro, M. N. D. S. Tetrahedron 2005, 61, 10951-10957. 184bFernández, F.; García-Mera, X.; Vale, M. L. C.; Rodríguez-Borges, J. E., Synlett 2005, 2, 319-321. 184cGarcía-Mera, X.; Rodríguez-Borges, J. E.; Vale M. L. C. do; Alves, M. J., Tetrahedron 2011, 67 (37), 7162-7172. 208Rodríguez-Borges, J. E.; Vale, M. L. C.; Aguiar, F. R.; Alves, M. J.; García-Mera, X. Synthesis 2008, 6, 971-977. 209Dewar, M. J. S.; Olivella, S.; Stewart, J. J. P. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 5771. Parte Teórica e Discussão de Resultados 76 A síntese deste hemiacetal (2) a partir do ácido glioxílico em condições de refluxo em metanol, conduz ao ataque deste último ao grupo formilo e, ainda, à esterificação pelo ataque ao ácido carboxílico. O mecanismo para a formação do éter encontra-se representado no Esquema 2.12: Esquema 2.12 Síntese do hemiacetal 2 com formação do éter metílico a partir da reação entre o glioxilato de metilo e metanol. O protão envolvido na reação é gerado pelo próprio ácido glioxílico. O outro grupo hidroxilo formado não segue a reação uma vez que o hemiacetal é mais estável que o respetivo acetal. No outro local da molécula ocorre o processo de esterificação de Fischer-Speier210. O mecanismo de esterificação encontra-se a seguir evidenciado (Esquema 2.13). Esquema 2.13 Síntese do hemiacetal 2 com formação do éster metílico a partir da reação entre o glioxilato de metilo e metanol. 210Fischer, E.; Speier, A. Chemische Berichte 1895, 28, 3252-3258. Parte Teórica e Discussão de Resultados 77 Resultados Próprios Partiu-se de uma solução de ácido glioxálico mono-hidratado em MeOH anidro e deixou-se em refluxo, com agitação contínua, durante 18h. Arrefeceu-se a mistura reacional, adicionou-se KHCO3 sólido e evaporou-se o solvente com recurso a pressão reduzida. O resíduo obtido foi dissolvido em CH2Cl2, secou-se com Na2SO4 anidro e filtrou-se a suspensão lavando-se abundantemente com CH2Cl2. Purificou-se o composto com recurso à cromatografia de adsorção em coluna de gel de SiO2, obtendo-se 2 como um óleo incolor. Rendimento de 90%. A análise estrutural do hemiacetal 2 foi realizada mediante espectroscopia de 1H-RMN, 13C-RMN, DEPT e IV e, por espectrometria de massa, IQ+-MS (secção 3.2.1.). Os resultados obtidos permitiram confirmar a estrutura esperada para o composto, estando concordantes com os apresentados na literatura.181,209 Em seguida, apresentam-se os resultados espectroscópicos e espectrométricos para o hemiacetal 2. 2-hidroxi-2-metoxiacetato de metilo (2) IV: É possível verificar-se uma banda a 3424.96 cm-1 relativa ao estiramento O-H, duas bandas relativas ao estiramento Csp3-H a 2957.30 e 2841.60 cm-1 e outra banda forte a 1742.37 cm-1, relativa ao estiramento C=O do éster metílico. Estes dados estão de acordo com a estrutura esperada para o hemiacetal. 1H-RMN: Pela análise deste espectro é possível identificar-se inequivocamente os protões da estrutura esperada. Verifica-se um singleto correspondente ao protão H-2 a δ = 4.86 ppm; um singleto largo que permuta com D2O, compatível com o protão do grupo hidroxilo a δ = 3.87 ppm, e ainda, dois singletos correspondentes a 1-OCH3 e 2-OCH3, a δ = 3.81 e 3.47 ppm, respetivamente. 13C-RMN e DEPT: A co-análise dos espectros obtidos evidenciaram um pico respeitante a um carbono quaternário a campo baixo (δ = 169.72 ppm), compatível com o carbono C-1; verifica-se um pico a δ = 93.22 ppm relativo ao carbono C-2 e, ainda, os picos respeitantes aos carbonos dos grupos 1-OCH3 e 2-OCH3, a δ = 55.36 e 52.89 ppm, respetivamente. EM: Detetou-se a presença de um pico a m/z = 121 u.m.a., compatível com o ião quasi-molecular, MH+, da molécula-alvo (m/z esperado = 121 u.m.a.) e um pico a m/z = 120 u.m.a coincidente com o ião molecular, M+ (m/z esperado = 120 u.m.a.). Pode-se ainda constatar um pico a m/z = 103 u.m.a, [M-17]+, concordante com eliminação do grupo -OH e um pico a m/z = 90 u.m.a, [M-30]+, concordante com eliminação de um grupo -OCH3. 181Rodríguez-Borges, J. E.; García-Mera, X.; Fernández, F.; Lopes, V. H. C.; Magalhães, A. L.; Cordeiro, M. N. D. S. Tetrahedron 2005, 61, 10951. 209Dewar, M. J. S.; Olivella, S.; Stewart, J. J. P. J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 5771. Parte Teórica e Discussão de Resultados 78 2.2.2.2. Síntese dos adutos 4-exo e 5-endo A síntese dos cicloadutos, 4-exo e 5-endo, pode ser descrita pela seguinte equação: A preparação dos cicloadutos 4-exo e 5-endo foi efetuada como descrito previamente,181 mediante ativação do hemiacetal do glioxilato de metilo por reação de quantidades equimolares de benzilamina para gerar in situ a respetiva imina protonada do glioxilato de metilo através da adição de ATA e TFBE em CH2Cl2 seco e adição, por último, de CPD recentemente bidestilado e colocado em banho de gelo, a 0ºC. Tal justifica-se na medida em que, como referido na secção 2.2.1. (Esquema 2.5), o CPD dimeriza espontaneamente à temperatura ambiente, para obviar essa situação recorre-se à destilação de forma a obter-se o ciclopentadieno na sua forma monomérica (retroDiels-Alder). Este pode ser guardado durante alguns dias na sua forma monomérica se mantido a 0ºC, uma vez que à t.a. o processo de dimerização é rápido.211 A reação decorreu num sistema previamente arrefecido a 78ºC mediante banho criostático de acetona/azoto líquido de forma a assegurar o controlo termodinâmico, conduzindo a um maior rendimento do racemato exo em detrimento ao racemato endo. Desta forma obtiveram-se os racematos 4-exo e 5-endo, os quais foram purifica-dos mediante cromatografia líquida de adsorção em coluna de gel de SiO2 usando-se como eluente Hex/AcOEt (4:1), recolhendo-se um primeiro grupo de frações correspondente aos adutos maioritários, 4-exo (75%), um segundo grupo de frações de uma mistura 4-exo/5-endo enriquecida em 5-endo e, por último, um grupo de frações do aduto minoritário, 5-endo (19%). A análise estrutural dos racematos 4-exo e 5-endo foi realizada mediante espectroscopia de 1H-RMN, 13C-RMN, DEPT e IV e, por espectrometria de massa, IE+-MS (secção 3.2.2.). Os resultados obtidos permitiram confirmar as estruturas esperadas para os compostos, estando concordantes com os apresentados na literatura.181 181Rodríguez-Borges, J. E.; García-Mera, X.; Fernández, F.; Lopes, V. H. C.; Magalhães, A. L.; Cordeiro, M. N. D. S. Tetrahedron 2005, 61, 10951. 211Hönicke, D.; Födisch, R.; Claus, P.; Olson, M. Cyclopentadiene and Cyclopentene in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. Parte Teórica e Discussão de Resultados 79 IV: Os espectros obtidos para os cicloadutos 4-exo e 5-endo, revelam a presença de bandas de estiramento Csp2-H, concordantes a presença do anel aromático (grupo benzilo), bem como da olefina entre os carbonos C-5 e C-6. Verificam-se, ainda, bandas de estiramento Csp3-H e, uma banda de estiramento C=O, como esperado, respeitante ao éster metílico. Em seguida, apresentam-se os dados relativos às bandas mais características sumariados na Tabela 2.1. Tabela 2.1 Bandas de IV mais características para os cicloadutos 4-exo e 5-endo. Entrada IV / cm-1 Csp2-H (str) Csp3-H (str) C=O (str) 4-exo 3059.51, 3026.72 2992.02, 2950.55, 2876.21, 2833.88 1740.44 5-endo 3063.37, 3021.80 2991.05, 2947.66, 2871.49, 2800.13 1736.58 1H-RMN: Pela análise dos espectros obtidos para os cicloadutos 4-exo e 5-endo, é possível identificar-se alguns padrões, nomeadamente a presença de um multipleto na zona aromática e sinais relativos aos protões Csp2-H, H-5 e H-6, a campos baixos. De acrescentar a presença de um singleto típico dos protões do grupo -OCH3, compatível com o éster metílico. Na Tabela 2.2, encontram-se sumariados os protões relativos aos racematos 4-exo e 5-endo e correspondentes desvios químicos. Tabela 2.2 Desvios químicos de 1H-RMN para os cicloadutos 4-exo e 5-endo. 1H-RMN (δ / ppm) Sinais 4-exo 5-endo ArH 7.43 – 7.06 7.55 – 7.10 H-1 3.83 3.42 – 3.31 H-3 2.28 3.42 – 3.31 H-4 2.28 3.36 H-5 6.42 6.47 H-6 6.26 – 6.12 6.14 H-7syn 1.95 1.82 H-7anti 1.36 1.56 OCH3 3.55 3.56 Parte Teórica e Discussão de Resultados 80 Note-se que, o desvio químico do protão H-3 no racemato 4-exo surge a campos relativamente mais altos (δ = 2.28 ppm) em comparação com o mesmo protão no racemato 5-endo (δ = 3.36 ppm). De acrescentar que protão H-7syn do racemato 4-exo encontra-se mais desprotegido (δ = 1.95 ppm), pela maior proximidade do grupo éster, em comparação com o mesmo protão do racemato 5-endo (δ = 1.82 ppm). 13C-RMN e DEPT: Através da co-análise dos espectros obtidos para os cicloadutos 4-exo e 5endo, é possível identificar-se alguns padrões, nomeadamente a presença de um pico respeitante a um carbono quaternário a campos muito baixos, compatível com o éster metílico, -CO2CH3, e ainda um carbono quaternário na zona aromática, compatível com o carbono C-1' do anel aromático do grupo benzilo e ainda os restantes sinais nesta zona, corroborando a presença do grupo benzilo; verificam-se ainda os sinais correspondentes aos carbonos Csp2-H da olefina entre os carbonos C-5 e C-6; constata-se a presença do carbono do grupo metilo respeitante ao éster metílico e ainda é possível distinguir inequivocamente os carbonos metilénicos do grupo benzilo e da ponte metilénica do sistema biciclo, C-7, a campos relativamente mais altos. Na Tabela 2.3, encontram-se sumariados os resultados obtidos para os carbonos e correspondentes desvios químicos. A atribuição realizada está de acordo com a estrutura esperada. Tabela 2.3 Desvios químicos de 13C-RMN para os cicloadutos 4-exo e 5-endo. 13C-RMN e DEPT (δ / ppm) Sinais 4-exo 5-endo CO2CH3 174.60 173.06 C-1' 139.06 138.73 C-2' + C-6' 129.19 128.73 C-3' + C-5' 128.25 127.72 C-4' 127.12 126.60 C-1 64.34 64.47 C-3 64.90 65.42 C-4 48.55 47.41 C-5 136.67 138.31 C-6 133.71 134.65 C-7 46.69 44.83 CO2CH3 51.92 51.15 NCH2Ph 58.99 60.41 Parte Teórica e Discussão de Resultados 81 EM: Detetou-se, para ambos os cicloadutos 4-exo e 5-endo, a presença de um pico a m/z = 243 u.m.a., coincidente com o ião quasi-molecular, M+, da molécula-alvo (m/z esperado = 243 u.m.a.). Pode-se ainda constatar um pico m/z = 184 u.m.a., [M-59]+, que é compatível com o fragmento obtido pela α-clivagem, com eliminação do éster metílico (-CO2CH3); um pico a m/z = 152 u.m.a., [M-91]+, que corresponde ao fragmento obtido pela eliminação do grupo benzilo e, ainda, um pico a m/z = 91 u.m.a. que corresponde ao fragmento do próprio grupo benzilo, [Bn]+. 2.2.3. Síntese de cis-dióis vicinais Di-hidroxilação Vicinal Syn de alcenos com Tetróxido de Ósmio O tetróxido de ósmio (VII), OsO4, possui um arranjo espacial tetraédrico, por isso é uma molécula apolar. Este composto é volátil, sublimando à temperatura ambiente. Este, na sua forma pura é, provavelmente, incolor,212 sugerindo-se que a sua aparência trivial sob a forma de um sólido amarelo se deva a impurezas de dióxido de ósmio (OsO2).213 O OsO4 é um dos reagentes disponíveis mais fiáveis na di-hidroxilação de alcenos para a obtenção de dióis vicinais syn.214 Hoffman, foi pioneiro a documentar a redução do OsO4 por espécies insaturadas, mostrando que o OsO4 pode ser empregue como catalisador na presença de clorato de sódio (ou postássio) na hidroxilação de alcenos.212 O seu trabalho foi mais tarde complementado por Milas,215 que descreve a oxidação de alcenos usando OsO4 e H2O2. Tetróxido de ósmio (VII) Mecanismo de cis-hidroxilação O mecanismo de cis-hidroxilação proposto por Dewar,216,217,218 sugere ocorrer via ataque direto por parte do oxigénio a um dos carbonos insaturados resultando num estado de transição cíclico contendo seis eletrões, possibilitando desta forma a adição cis. 212Butler, I. S.; Harrod, J. F. Inorganic Chemistry: Principles and Applications, Benjamin / Cummings. 1989, p. 343. 213Cotton, F. A. Advanced Inorganic Chemistry, 6th ed., New Delhi, India: J. Wiley 2007, p. 1002. 214Schröeder, M. Chem. Rev. 1980, 80 (2), 187-213. 215Milas, N. A.; Sussman, S. J. Am. Soc. 1936, 58, 1302. 216Dewar, M. J. S. Ind. Chim. Belge 1950, 15, 181. 217Dewar, M. J. S.; Longuet-Higgins, H. C. Proc. R. Soc. A 1952, 214, 482. 218Dewar, M. J. S. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 3341. Parte Teórica e Discussão de Resultados 82 . Contudo, Sharpless et al.219 sugerem a possibilidade de um ataque nucleófilo por parte do alceno ao átomo de Os, visto este ser mais eletropositivo, com consequente formação de um intermediário organometálico. Zelikoff e Taylor,220 consideram que o intermediário organometálico sofre um rearranjo de forma a obter-se um complexo éster cíclico constituído por cinco membros, com subsequente hidrólise relativamente rápida. A hidrólise dos complexos éster de OsVI pode ser efetuada tanto por processos redutivos como por oxidativos.221 A hidrólise redutiva envolve espécies como sulfito ou bissulfito de sódio ou potássio, hidreto de alumínio ou sulfureto de hidrogénio.218 Neste processo são gerados os correspondentes cis-dióis juntamente com formas de ósmio que podem ser removidas por filtração.218 Os processos oxidativos envolvem o uso de cloratos metálicos, N-óxido de N-metilmorfolina (NOMM), H2O2 ou hidroperóxido de terc-butilo. Neste último processo, é gerado o cis-diol juntamente com OsO4, que por sua vez é regenerado o seu poder oxidante e, portanto, pode voltar a reagir com os alcenos, resvalando num processo cíclico. Outros compostos de ósmio podem ser usados como catalisadores, incluindo sais de OsVI, [OsO2(OH)4)]2-, e o tricloreto de ósmio hidratado, OsCl3·xH2O. Estas espécies, na presença de cooxidantes, oxidam a OsVIII.222 O uso de NOMM como co-oxidante no processo de di-hidroxilação de alcenos tem a vantagem de se obter maiores rendimentos relativamente quando são usados outros co-oxidantes como H2O2 ou cloretos de metais.221 Por este motivo, o uso de NOMM neste tipo de reações verifica-se como sendo um co-oxidante muito eficiente, sendo obtidos cis-dióis a partir dos correspondentes alcenos com bons rendimentos.223 218Dewar, M. J. S. J. Am. Chem. Soc. 1952, 74, 3341. 219Sharpless, K. B.; Teranishi, A. Y.; Bäckvall, J.-E. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 3120. 220Zelikoff, M.; Taylor, H. A. J. Am. Chem. Soc. 1950, 72, 5039. 221Schröder, M. Chem. Rev. 1980, 80, 187-213. 222Ogino, Y.; Chen, H.; Kwong, H.-L.; Sharpless, K. B. Tetrahedron Lett. 1991, 32 (32), 3965-3968. 223Rheenan, V. Van; Kelly, R. C.; Cha, D. Y. Tetrahedron Lett. 1976, 1973. Parte Teórica e Discussão de Resultados 83 Note-se que, a hidrólise dos complexos contendo ésteres de OsVI, ocorre com exclusiva quebra da ligação éster Os-O, pois a hidrólise em H218O revelou que não há incorporação de 18O nos dióis.224 Verifica-se ainda que, bases de Lewis como aminas terciárias e ainda derivados piridínicos aumentam a taxa de di-hidroxilação, uma vez que a doação eletrónica por parte de bases de Lewis ao centro metálico (Os) induz a quebra da ligação carbono-ósmio a uma taxa superior neste passo, levando à formação de complexos [OsO2(OR)L] e, finalmente, [OsO2(O2R)L2].219 Se a amina é quiral, então a di-hidroxilação pode proceder com enantiosseletividade.225 Resultados Próprios 2.2.3.1. Síntese de ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxilato de metilo (6-exo) A reação de di-hidroxilação do aduto 4-exo para obtenção dos correspondente cis-diol 6exo, pode ser descrita pela seguinte equação: O catalisador eleito para a di-hidroxilação do aduto 4-exo foi o OsO4, uma vez que apresenta um melhor perfil para a obtenção do cis-diol pretendido, 6-exo. A reação foi realizada à temperatura ambiente adicionando uma quantidade muito reduzida de OsO4 (0.01 equivalentes) a partir de uma solução de OsO4 0.01 M numa mistura dioxano/H2O (3:1), a uma solução do alceno 4-exo em THF/tBuOH (1:1). Elegeu-se como agente co-oxidante a NOMM (1.5 eq.) que regenera o estado de oxidação do centro metálico (OsVI OsVIII). 219Sharpless, K. B.; Teranishi, A. Y.; Bäckvall, J.-E. Soc. 1977, 99, 3120. 224Subbaraman, L. R.; Subbaraman, J.; Behrman, E. J. Inorgan. Chem. 1972, 11, 2621. 225Berrisford, D. J.; Bolm, C.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. Int. 1995, 34 (10), 1059-1070. Parte Teórica e Discussão de Resultados 90 Neste trabalho optou-se pela hidrólise catalisada por base (saponificação) dos ésteres 4-exo e 6-exo para obtenção dos respetivos ácidos carboxílicos, 8-exo e 7-exo. Para o efeito, utilizou-se o LiOH, uma vez que apresenta menor basicidade, i.e., menor habilidade para doar o anião hidroxilo, comparativamente com os restantes hidróxidos de metais alcalinos. O Li+ é o catião mais pequeno dos metais alcalinos, possuindo os seus sais, maior carácter covalente. Assim, a energia reticular destes é, geralmente, maior em comparação com os restantes metais alcalinos. A energia reticular, ao exceder a energia de hidratação, torna este sal menos solúvel em água. Desta forma, enquanto o NaOH ou KOH doam o anião hidroxilo rapidamente, o LiOH permite a hidrólise de ésteres mais lenta e mais seletiva. Assim, a basicidade aumenta ao longo do grupo, sendo que o CsOH é o mais básico dos hidróxidos de metais alcalinos e, portanto, o LiOH é o menos básico. Outra vantagem de usar o LiOH em detrimento de NaOH ou KOH é que, devido ao seu menor carácter básico, diminui o risco de ocorrência de epimerizações no carbono-α relativo ao grupo carbonilo. Para a preparação dos ácidos 7-exo e 8-exo partiu-se dos respetivos ésteres metílicos, 6-exo e 4-exo, dissolvendo-os numa mistura THF / H2O (1:1). Tendo em conta que o THF é solúvel em H2O, possibilita o encontro das espécies orgânicas com o LiOH, aumentando a velocidade de reação. O LiOH foi dissolvido no mesmo solvente usado para os ésteres metílicos sendo adicionado gota-a-gota, sob agitação, às soluções contendo 4-exo e 6-exo, previamente arrefecidas a 0ºC mediante banho de gelo, permitindo-se atingir a temperatura ambiente. Após o término das reações, estas foram sujeitas a extração líquido-líquido com CH2Cl2 de forma a remover composto de partida que, eventualmente, não tenha reagido e/ou produtos secundários. Note-se que, neste ponto, maior parte do composto pretendido encontra-se, no fim da reação, sob a forma de sal de lítio. Desta forma o composto de interesse será solúvel em água. Após este passo, a fase aquosa foi arrefecida a 0ºC, mediante banho de gelo, e procedeu-se à acidificação com adição de solução H2SO4 1M, gota-a-gota e com agitação magnética, até pH 4. Após este passo, a H2O foi eliminada com recurso a pressão reduzida tendo-se obtido um sólido branco que foi dissolvido numa mistura Et2O/EtOH (1:3), extraindo-se a quente, mediante filtração por gravidade. Em seguida, o solvente foi eliminado à secura, obtendo-se assim, os ácidos carboxílicos 7-exo e 8-exo. De destacar que os passos de acidificação e de extração a quente revelaram ser cruciais na obtenção do aminoácido 8-exo. Verificou-se que, a sobreacidificação das soluções aquosas contendo o composto 8-exo, origina degradação do mesmo. Ainda no que respeita à extração a quente, o sobreaquecimento também teve um impacto negativo na integridade deste composto. Desta forma, foram estudadas as condições de pH e temperatura ideias para a síntese desta classe de compostos. Parte Teórica e Discussão de Resultados 91 O composto 7-exo foi obtido com rendimentos compreendidos entre 74–82%, ao passo que para o composto 8-exo, alcançou-se rendimentos entre 78–95%. Na Tabela 2.5 encontram-se sumariados os resultados obtidos, assim como as condições experimentais. Tabela 2.5 Resultados obtidos na preparação dos aminoácidos prolinomiméticos 7-exo e 8-exo. Entrada Exp. m / g (n / mmol) pH T / ºC t / d Resultado (%) 6-exo 1 0.790 (2.85) 3 60 2 7-exo (74) 6-exo 2 0.71 (2.56) 4 60 2 7-exo (81) 6-exo 3 0.64 (2.31) 4 60 2 7-exo (82) 4-exo 4 0.100 (0.411) 2 60 5 Degradação 4-exo 5 0.107 (0.440) 3 60 4 Degradação 4-exo 6 0.101 (0.415) 4 60 4 Degradação 4-exo 7 0.100 (0.411) 4 40 5 Degradação 4-exo 8 0.500 (2.06) 4 40 6 8-exo (84) 4-exo 9 2.10 (8.63) 4 40 5 8-exo (95) 4-exo 10 1.03 (4.23) 4 40 5 8-exo (91) 4-exo 11 2.00 (8.22) 4 40 5 8-exo (78) 4-exo 12 1.03 (4.23) 4 40 5 8-exo (89) A análise estrutural dos ácidos carboxílicos 7-exo (secção 3.2.4.) e 8-exo (secção 3.2.5.) foi realizada mediante espectroscopia de 1H-RMN, 13C-RMN, DEPT e IV e, por espectrometria de massa, EI+-MS e IQ+-MS, respetivamente. Os resultados obtidos permitiram confirmar as estruturas esperadas para estes compostos. Ácido ( )-exo-2-benzil-5,6-di-hidroxi-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxílico (7-exo) IV: É clara a presença de uma banda larga entre 3700 e 2300 cm-1, característica do estiramento COO-H, confirmando a presença da função ácido carboxílico que, juntamente com a presença de uma banda forte, a 1616.06 cm-1, respeitante ao estiramento C=O, corrobora o sucesso da reação de hidrólise. De destacar uma banda a 3370.96 cm-1 relativa a estiramento O-H dos grupos hidroxilo do cis-diol. Nesta região não é possível identificar-se de forma inequívoca as bandas relativas ao estiramento Csp2-H do anel aromático uma vez que estas podem estar mascaradas pela banda intensa e larga do estiramento do ácido carboxílico. Verificam-se bandas relativas ao estiramento Csp3-H a 2951.52 e 2842.56 cm-1. Parte Teórica e Discussão de Resultados 92 1H-RMN: Pela análise deste espectro é possível identificar-se a presença de um multipleto na zona aromática (δ = 7.86 – 7.17 ppm), cuja integração é compatível com a presença de um anel aromático corroborando a presença do grupo benzilo; verifica-se a ausência do singleto característico do grupo metilo da função éster, por contraste com os dados espectroscópicos homólogos para o composto 6-exo (secção 3.2.3.). Outro aspeto observado é o deslocamento do protão H-3 a campos mais baixos (δ = 3.96 ppm) em comparação com os dados obtidos para o mesmo protão para o composto 6-exo (δ = 2.64 ppm). Este facto pode ser explicado tendo em conta que o H-3 é um Hα, encontrando-se eletronicamente mais desprotegido devido ao efeito indutivo negativo causado pela função ácido carboxílico adjacente. A atribuição dos restantes protões está de acordo com a estrutura esperada. 13C-RMN e DEPT: A co-análise dos espectros obtidos evidenciaram um pico respeitante a um carbono quaternário a δ = 171.68 ppm, compatível com o ácido carboxílico e sinais na zona aromática concordantes com a presença do anel aromático do grupo benzilo; nota-se a ausência do sinal correspondente ao carbono do grupo metilo da função éster, como previsto, resultante da reação de hidrólise. Foi ainda possível distinguir inequivocamente o carbono metilénico do grupo benzilo a δ = 54.26 ppm e, do carbono C-7, a δ = 30.10 ppm. A atribuição dos restantes carbonos está de acordo com a estrutura esperada. EM: Detetou-se a presença de um pico a m/z = 264.0 u.m.a., compatível com o ião quasi-molecular, MH+, da molécula-alvo (m/z esperado = 264.1 u.m.a.). Pode-se ainda constatar um pico m/z = 246.0 u.m.a., [M-17]+, compatível com o fragmento obtido pela eliminação de um grupo hidroxilo (-OH); um pico a m/z = 218.1 u.m.a., [M-44]+, compatível com o fragmento obtido pela α-clivagem, resultando na eliminação de CO2 protonado. Propõe-se o rearranjo de tipo McLafferty, segundo o Esquema 2.17, para justificar o sinal obtido a m/z = 202.1 u.m.a., [M-60]+, obtido pela eliminação do enol do ácido acético, que também é detetado a m/z = 60.9 u.m.a. e, ainda, o sinal a m/z = 158 u.m.a., [M-105]+, concordante com a eliminação de -NBn, também é detetado a m/z = 105.1 u.m.a. Verifica-se ainda um pico a m/z = 91 u.m.a., que corresponde ao fragmento do grupo benzilo, [Bn]+. Esquema 2.17 Rearranjo de tipo McLafferty proposto para o composto 7-exo. Parte Teórica e Discussão de Resultados 93 Ácido ( )-exo-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carboxílico (8-exo) IV: Verifica-se a presença de uma banda larga a entre 3700 e 2100 cm-1, característica do estiramento COO-H, confirmando a presença da função ácido carboxílico, juntamente com a presença de uma banda forte, a 1654.62 cm-1, respeitante ao estiramento C=O, corroborando o sucesso da reação de hidrólise. É ainda possível identificar-se bandas relativas ao estiramento Csp2-H do anel aromático e/ou da olefina entre C-5 e C-6, a 3060.48 e a 3032.51 cm-1. Nota-se ainda bandas de estiramento Csp3-H a 2927.41 e 2880.17 cm-1. 1H-RMN: Pela análise deste espectro é possível identificar-se a presença de um multipleto na zona aromática (δ = 7.57 – 7.14 ppm), cuja integração é compatível com a presença de um anel aromático corroborando a presença do grupo benzilo; verifica-se ainda ausência do singleto característico do grupo metilo da função éster, por contraste com os dados espectroscópicos homólogos para o composto 4-exo (secção 3.2.2.). Outro aspeto observado é o deslocamento do protão H-3 a campos mais baixos (δ = 3.45 ppm), em comparação com os dados obtidos para o mesmo protão para o composto 4-exo (δ = 2.28 ppm). A explicação para esta observação é análoga ao apresentado para os cicloadutos 7-exo. A atribuição dos restantes protões está de acordo com a estrutura esperada. 13C-RMN e DEPT: A co-análise dos espectros obtidos evidenciaram um pico respeitante a um carbono quaternário a δ = 171.09 ppm, compatível com o ácido carboxílico; sinais na zona aromática concordantes com a presença do anel aromático do grupo benzilo; nota-se a ausência do sinal correspondente ao carbono do grupo metilo da função éster, como previsto, resultante da reação de hidrólise. Foi ainda possível distinguir inequivocamente o carbono metilénico do grupo benzilo a δ = 51.17 ppm e, do carbono C-7, a δ = 45.50 ppm. A atribuição dos restantes carbonos está de acordo com a estrutura esperada. EM: Detetou-se a presença de um pico a m/z = 229.9 u.m.a., compatível com o ião quasi-molecular, M+, da molécula-alvo (m/z esperado = 229.1 u.m.a.). Pode-se ainda constatar um pico m/z = 185.0 u.m.a., [M-45]+, que é compatível com o fragmento obtido pela α-clivagem, resultando na eliminação de CO2 protonado; um pico a m/z = 123.0 u.m.a., [M-105]+, obtido pelo arranjo de tipo McLafferty, de forma análoga ao evidenciado em (a), no Esquema 2.17, concordante com a eliminação de -NBn, que também é detetado a m/z = 106.0 u.m.a.. Verifica-se ainda um pico a m/z = 91 u.m.a., que corresponde ao fragmento do grupo benzilo, [Bn]+. Parte Teórica e Discussão de Resultados 94 2.3. SÍNTESE DE PÉPTIDOS 2.3.1. Fundamentos da Síntese Péptidica No início do século XX, Curtius233 e Fisher234, de forma independente, deram os primeiros passos na síntese química de pequenos péptidos, com o intuito de sintetizar péptidos e proteínas biologicamente ativos. Desde então, até ao presente, a química da síntese peptídica tem oferecido desafios constantes. A metodologia aplicada no desenvolvimento de estruturas peptídicas sustenta-se sobre dois aspetos basilares: o conhecimento e eleição de grupos protetores seletivos para aminas e ácidos carboxílicos na formação da ligação peptídica, assim como para posterior desproteção seletiva e, ainda, a otimização das condições reacionais. Para além disso, é necessário o conhecimento da natureza química e estereoquímica dos aminoácidos, as metodologias para a formação das ligações peptídicas e importância da quiralidade na síntese peptídica. Para o efeito, recentes metodologias de síntese de péptidos utilizam dois tipos de abordagens – a síntese tradicional, i.e., síntese em solução, e a síntese em fase sólida – ainda que ambas se sustentem fundamentalmente nos mesmos princípios.235 2.3.2. Natureza química e estereoquímica dos aminoácidos Os α-aminoácidos são os monómeros que estão na base da formação de cadeias peptídicas. Os primeiros são compostos contendo um átomo de carbono ligado covalentemente a um grupo ácido carboxílico, um grupo amina, um átomo de hidrogénio e a uma cadeia lateral variável, responsável por conferir identidade a um dado α-aminoácido (Figura 2.5). O α-aminoácido mais simples é a glicina, cuja cadeia lateral é um átomo de hidrogénio, portanto, o carbono-α é um centro aquiral, resvalando na ausência de formas estereoquímicas distintas. Para os restantes α-aminoácidos, o carbono-α apresenta-se como um centro quiral e, desta forma, é possível duas configurações ou arranjos espaciais distintos em redor do carbono central, existindo duas formas estereoquímicas possíveis: isomeria L/D, de configurações opostas. Os α-aminoácidos "naturais" são L-isómeros e são designados desta forma pois possuem a mesma configuração que o gliceraldeído natural. De acordo com o sistema de nomenclatura de Cahn-Ingold-Prelog,236 os L-aminoácidos são aqueles que possuem configuração (S), exceto para a cisteína e seus derivados. 233Curtius, T. J. Prakt. Chemie. 1881, 24, 239. 234Fisher, E. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1907, 40, 1754. 235Tsuda, Y.; Okada, Y. Solution-Phase Peptide Synthesis. In Hughes, A. B. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, Ed., Wiley-VCH, Weinheim, 2011, vol. 3, p. 203. 236Moss, J. P. Pure Appl. Chem. 1996, 68, 2193. Parte Teórica e Discussão de Resultados 95 Figura 2.5 Natureza estereoquímica dos α-aminoácidos. 2.3.3. Abordagem genérica de proteção e formação da ligação peptídica Natureza Iónica dos aminoácidos Nos α-aminoácidos os grupos ácido carboxílico e amina podem existir na forma carregada ou não, tudo depende de dois parâmetros fundamentais: a natureza química e o pH da solução. O intervalo de pH em que um determinado grupo capta ou perde um protão, é melhor definido pelo logaritmo da constante de dissociação associada a cada grupo, designado por pKa, que corresponde ao pH no qual metade das moléculas se encontram protonadas (e metade não protonadas). Os valores de pKa para determinados grupos são influenciados por grupos adjacentes e por grupos na vizinhança (interações intermoleculares). A equação de Hendersen-Hasselbalch descreve a relação entre o pH e o rácio das duas formas. A pH inferior ao pKa do ácido carboxílico, o aminoácido apresenta-se sob a forma catiónica com o(s) grupo(s) amina(s) completamente protonado(s); a pH superior ao pKa do grupo amina, o aminoácido apresenta-se sob a forma aniónica com o(s) grupo(s) ácido(s) carboxílico(s) sob a forma de carboxilato(s); a pH entre os dois valores de pKa, o aminoácido apresenta-se sob a forma de ião dual, ou ião zwitter, sendo a sua carga global nula. Este fenómeno é responsável pela ausência de migração, para um dado valor de pH, de um ião zwitter ao longo de um gradiente de pH quando sujeito a um campo elétrico, valor esse específico para cada α-aminoácido, referido como ponto isoelétrico, pI. O conhecimento da natureza iónica dos aminoácidos é importante, na medida em que, durante a síntese peptídica, além do péptido pretendido, o material de partida pode afigurar-se como um contaminante durante o processo de purificação. Torna-se vantajoso este conhecimento, uma vez que o péptido protegido é solúvel em solventes orgânicos e insolúvel em água. Aminoácidos N-protegidos excedentes também são em regra solúveis em solventes orgânicos, contudo podem tornar-se insolúveis em solventes orgânicos e solúveis em soluções aquosas alcalinas, por desprotonação do ácido carboxílico; no que respeita aos α-aminoácidos sob a forma de ésteres, estes também são solúveis em solventes orgânicos, porém podem ser convertidos nas suas formas protonadas formando catiões alquilamónio em soluções aquosas ácidas. Parte Teórica e Discussão de Resultados 96 Desta forma pode-se obter o péptido desejado livre de material de partida remanescente tirando proveito do conhecimento da natureza iónica dos dois reagentes de partida, sendo estes removidos por lavagens aquosas (ácidas e alcalinas). Este método facilita as eventuais purificações subsequentes e deve ser o primeiro passo no processo de purificação, quando aplicável. 2.3.4. Metodologia genérica para a formação de ligações peptídicas Este tipo de ligação química é tipicamente sintetizado pela reação entre um ácido carboxílico e uma amina; contudo a formação de amidas – com a necessária eliminação de uma molécula de água – não ocorre espontaneamente à temperatura ambiente pela reação direta entre estes dois grupos, salvo a elevadas temperaturas (e.g. > 200ºC),237 condições tipicamente incompatíveis com a integridade dos próprios reagentes e, ainda, responsável por diminuir a energia de ativação necessária para a ocorrência de reações secundárias indesejáveis. Para formação de uma ligação amida, é necessário previamente suprimir a reatividade dos grupos funcionais nos aminoácidos (ou fragmentos peptídicos) que não se pretendam incorporar na mesma. Isto pode ser conseguido através de derivatizações desses grupos funcionais, mas também pode envolver a sua quelação com um ião metálico ou até mesmo a sua conversão na sua forma carregada. Contudo, é essencial que essa modificação seja reversível. Por esta razão, é normalmente necessário primeiramente ativar o ácido carboxílico, um processo que usualmente passa por converter o grupo -OH da função ácido carboxílico num bom grupo de saída antes de colocar a reagir com a amina (Esquema 2.18): Esquema 2.18 Ativação da função ácido carboxílico e consequente acoplamento peptídico com um α-aminoácido contendo o grupo amina livre e a função ácido carboxílico suprimida. GPN: grupo protetor de aminas; GPO: grupo protetor de ácidos carboxílicos. 237Jursic, B. S; Zdravkovdki, Z. Synth. Commun. 1993, 23, 2761-2770. Parte Teórica e Discussão de Resultados 97 Após a formação da primeira ligação amida, o passo seguinte para o enlongamento da cadeia peptídica passa por expor os grupos funcionais que se encontravam protegidos na etapa anterior para a formação da seguinte ligação péptídica – passo de desproteção. Este é o passo fundamental na síntese peptídica, uma vez que a desproteção de um grupo deve ser incólume para os restantes grupos. Para o efeito, cada grupo protegido deve ser desprotegido através de um mecanismo específico de forma a não interferir com os restantes. As operações de desproteção seletiva e acoplamento são repetidas até que a cadeia desejada seja alcançada. Todos os restantes grupos são depois removidos (caso não façam parte do objetivo de síntese) para originar cadeia peptídica pretendida. Quando dois grupos requerem diferentes mecanismos para a sua remoção estamos perante um sistema ortogonal, em que num dado conjunto de grupos protetores, cada um é removível na presença do outro, em qualquer ordem. Figura 2.6 Abordagem geral de proteção e desproteção na formação de ligações peptídicas num sistema ortogonal. R: cadeia lateral; GP: Grupo protetor. É, portanto, imperativo um planeamento prévio cuidadoso da metodologia de síntese empregue para cumprir o objetivo proposto. Para o efeito, torna-se crucial o conhecimento dos grupos protetores utilizados em síntese peptídica e os mecanismos de desproteção inerentes de forma a obterem-se sistemas ortogonais. Parte Teórica e Discussão de Resultados 98 2.3.5. Grupos Protetores Os compostos de partida para a síntese peptídica são α-aminoácidos (ou fragmentos peptídicos) protegidos. Entre as características essenciais ou desejáveis num bom grupo protetor é a sua fácil remoção através de um mecanismo que não conduza à formação de co-produtos (ou pelo menos de forma apreciável) e sem interferência na quiralidade dos resíduos de α-aminoácidos. A N-proteção e a C-proteção devem ocorrer através de mecanismos independentes de forma a conseguir-se desproteger um determinado grupo seletivamente sem interferir com os restantes, i.e., deve-se procurar obter um sistema ortogonal. 2.3.5.1. Proteção do grupo amina O método sobejamente empregue na proteção do grupo amina passa por converter as aminas dos α-aminoácidos em carbamatos, uma vez que estes oferecem grandes vantagens, nomeadamente estabilidade ótica, i.e., diminui a probabilidade de racemização dos centros quirais adjacentes aos carbamatos. Estes podem ser preparados a partir da respetiva amina na presença de um anidrido, que depende do grupo protetor que se pretende. Assim, dentro desta classe de grupos N-protetores, os mais frequentes são o benziloxicarbonilo (Z), o 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) e o terc-butoxicarbonilo (Boc). Z Fmoc Boc O grupo Z, introduzido por Bergman e Zervas,238 pode ser facilmente removido através de hidrogenação catalítica operando à temperatura ambiente e pressão atmosférica, ou, através de acidólise usando HBr.239 Outros métodos de desproteção deste grupo envolve o uso de sódio em amoníaco líquido ou HF. Modificações estruturais no grupo Z, conduziram ao desenvolvimento de inúmeros grupos protetores baseados na formação de carbamatos, que se distinguem pela sua estabilidade frente a diferentes condições químicas. O uso de um grupo específico deve, portanto, ser selecionado mediante as condições reacionais que serão empregues. 238Bergmann, M.; Zervas, L. Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1932, 65, 1192. 239Ben-Ishai, D.; Berger, A. J. Org. Chem. 1952, 17, 1564. Parte Teórica e Discussão de Resultados 99 Os aminoácidos N-protegidos com o grupo Fmoc obtêm-se, geralmente, a partir do respetivo cloreto de acilo. Esta reação é, no entanto, acompanhada por reações secundárias que culminam com a formação de pequenas quantidades de dipéptidos Fmoc. Desta forma, para evitar a formação destes co-produtos recorre-se, muitas vezes, a derivados do Fmoc, como por exemplo o Fmoc-OSu.240 Este grupo é muito estável na presença de ácidos e pode-se eliminar facilmente em determinadas condições básicas, geralmente pelo uso de piperidina em DMF à temperatura ambiente.241 Fmoc-OSu O grupo Boc, descrito por McKay e Albertson,242 é estável frente a hidrogenação catalítica, permitindo a utilização do grupo Z temporariamente e do grupo Boc de forma permanente, ou viceversa. Este grupo é facilmente desprotegido através do tratamento com ácidos de Brønsted fortes (TFA, HCl, HBr, HNO3 e H2SO4) e também alguns ácidos de Lewis. O TFA é o agente mais comummente usado quando se trata de aminoácidos, péptidos e seus derivados, dado ser seletivo, rápido e eficiente.243 Este grupo pode ser removido com uma solução de TFA à temperatura ambiente durante 30-60 min (Esquema 2.19),244 ou HCl (cerca de 10 eq.) em ácido acético, AcOEt ou dioxano, com eliminação deste grupo em menos de 30 min,245 condições estas praticamente inertes para o grupo Z. Esquema 2.19 Mecanismo de desproteção acidolítica do grupo Boc com TFA. 240Kortenaar, T.; Van Dijk, P. B. W.; Peeters, B. G.; Raaben, J. M.; Adams, P. J. H. M., Tesser, G. I. Int. J. Pept. Protein Res. 1986, 27, 398. 241Carpino, L. A. Acc. Chem. Res. 1987, 20, 401. 242(a) McKay, F. C.; Albertson, N. F. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 4686. (b) Tarbell, D. S.; Yamamoto, Y.; Pope, B. M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1972, 69, 730. (c) Moroder, L.; Hallett, A.; Wuensh, E.; Keller, O.; Wersin, G. Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1976, 357, 1651. 243Navathm R. S.; Pabbisetty, K. B.; Hu, L. Tetrahedron Lett. 2006, 47, 389-393. 244Carpino, L. A. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 98. 245Klee, W.; Breener, M. Helv. Chim. Acta 1950, 44, 2151. Parte Experimental 202 40 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 203 Parte Experimental 204 3.2.8. Síntese do ácido ( )-exo-2-(terc-butoxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxílico (20-exo) Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação do ácido 7-exo (secção 3.2.4.), procedeu-se à hidrólise alcalina de 19-exo (1.0664 g, 3.96 mmol, 1 eq.) deixando-se reagir durante 48 h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente. Obteve-se 20-exo como um sólido bege (803.3 mg). Rendimento de 84%. Composto ( )-20-exo: sólido bege. Rf: 0.11 em CH2Cl2/CH3OH (20:1). P.f.: 148–150ºC IV v (cm-1): 3370.96, 2971.77, 2923.56, 2877.27, 1741.41, 1698.98, 1636.30, 1603.52, 1585.20, 1477.21, 1431.89, 1407.78, 1365.35, 1317.14, 1304.61, 1286.29, 1245.79, 1231.33, 1199.51, 1188.90,1160.94, 113490, 1122.37, 1049.09, 955.555, 942.056, 927.593, 886.131, 855.275, 822.491, 791.636, 766.566, 747.281, 713.533. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ ppm: 9.27 (sl, 1H, permuta com D2O, CO2H), 4.42 – 4.22 (m, 1H, H-3), 4.15 (d, 1H, J = 2.8 H, H-1), 2.81(sl, 1H, H-4), 1.91 – 1.30 [1.43 (s), 15H, H-5+ H-6 + H-7 + Boc]. 13C-RMN e DEPT (CD3OD, 101 MHz) δ ppm: [174.15 (Cq), 173.87 (Cq), CO2H)], [154.47 (Cq), 154.17 (Cq), CO2tBu], [79.49 (Cq), 79.39 (Cq), C(CH3)3], [64.28 (CH), 63.52 (CH), C-3], [58.69 (CH), 57.38 (CH), C-1], [41.43 (CH), 40.98 (CH), C-4], [38.46 (CH2), 38.34 (CH2), C-7], [29.04 (CH2), 29.00 (CH2), C-6], [27.47 (3CH3), 27.29 (3CH3), Boc], [23.15 (CH2), 23.10 (CH2), C-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 248.14582 ([M+Li]+, 100, pico base), 242.28355 (MH+, 7), 186.22038 (62), 140.07115 (46). EMAR: cálculo para C12H19LiNO4+: 248.14686; obtida: 248.14582. Parte Experimental 205 40 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 206 Parte Experimental 207 3.3. SÉRIE P*LG 3.3.1. Síntese de (terc-butoxicarbonil)-L-leucilglicinato de metilo (11a) Num balão de fundo redondo dissolveu-se terc-butoxicarbonil-L-leucina mono-hidratada (9a) (1.98 g, 7.94 mmol, 1 eq.) em CH2Cl2 anidro (60 mL) num sistema previamente purgado com Ar. Colocou-se a solução num banho de gelo e adicionou-se DIEA (5.5 mL, 31.76 mmol, 4 eq.), em seguida, TBTU (3.82 g, 11.91 mmol, 1.5 eq.) e, por fim, hidrocloreto de glicinato de metilo (1.00 g, 7.94 mmol, 1 eq). Deixou-se a mistura em agitação contínua a 0ºC durante 3h e à t.a. durante 48h. Evaporou-se à secura e adicionou-se 80 mL de AcOEt e lavou-se a fase orgânica com solução saturada de NaHCO3 (2 x 80 mL) e, posteriormente, com solução saturada de NaCl (80 mL). Secou-se a fase orgânica obtida com adição de Na2SO4 anidro. Filtrou-se com recurso a pressão reduzida e eliminou-se o solvente à secura obtendo-se um sólido branco. O composto foi purificado recorrendo-se à cromatografia de adsorção em coluna de gel de SiO2, usando-se como eluente CH2Cl2/CH3OH (10:1) e procedeu-se, em seguida, à recristalização em éter etílico arrefecido a 0ºC mediante banho de gelo. Os cristais obtidos foram filtrados com recurso a funil de Büchner e pressão reduzida, obtendo-se um sólido cristalino (2.10 g), identificado como sendo o dipéptido protegido pretendido (11a). Rendimento de 87%. Composto 11a: sólido cristalino. Rf: 0.66 em CH2Cl2/CH3OH (10:1). P.f.: 131–133ºC IV v (cm-1): 3275.50, 3085.55, 2977.55, 2956.34, 2869.56, 1757.80, 1736.58, 1677.77, 1655.59, 1542.77, 1468.53, 1454.06, 1438.64, 1391.39, 1364.39, 1297.86, 1277.61, 1246.75, 1204.33, 1164.79, 1122.37, 1097.30, 1039.44, 1021.12, 987.375, 955.555, 920.843, 894.809, 874.560, 851.418, 789.707, 757.888. Parte Experimental 208 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ ppm: 6.83 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 5.03 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 4.17 (sl, 1H, HL-2), 3.99, (d, 2H, J = 5.2 Hz, HG-2) 3.72 (s, 3H, OCH3), 1.78 – 1.60 (m, 2H, HL-3), 1.51 – 1.36 [(m, 1H, HL-4) + 1.42 (s, 9H, Boc)], 0.98 – 0.86 (m, 6H, HL-5). 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 101 MHz) δ ppm: [173.02 (Cq), 170.16 (Cq), CONH + CO2CH3], 155.75 (Cq, CO2tBu), 80.10 (Cq, Boc), 52.93 (CH, CL-2), 52.28 (CH3, OCH3), 41.25 (CH2, CG2), 41.11 (CH2, CL-3), 28.29 (3CH3, Boc), 24.70 (CH, HL-4), [22.94 (CH3), 21.89 (CH3), CL-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 325.1724 ([M+Na]+, 46), 269.1116 (5), 247.1276 (21), 225.1204 (34), 203.1375 (100, pico base), 130.0881 (4), 86.0948 (64). EMAR: cálculo para C14H26N2NaO5+: 325.1734; obtida: 325.1724. Parte Experimental 209 50 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 210 Parte Experimental 211 3.3.2. Síntese do trifluoracetato de L-leucilglicinato de metilo amónio (12a) Sobre uma solução do dipéptido protegido (carbamato-éster) 11a (0.500 g, 1.65 mmol, 1 eq.) em CH2Cl2 (10 mL) num sistema previamente purgado com Ar e provida de agitação e arrefecida a 0ºC num banho de gelo, adicionou-se gota-a-gota, ATA (3.83 mL, 49.5 mmol, 30 eq.) que permaneceu em agitação durante 8h. Procedeu-se à eliminação dos solventes à secura sob pressão reduzida, obtendo-se um óleo viscoso ligeiramente acastanhado (0.517 g), identificado como trifluoracetato de amónio pretendido (12a). Rendimento de 99%. Composto 12a: óleo viscoso ligeiramente acastanhado. Rf: 0.26 em CH2Cl2/CH3OH (10:1). IV v (cm-1): 3082.65, 2962.13, 2877.27, 1742.37, 1664.27, 1534.10, 1470.46, 1438.64, 1411.64, 1371.14, 1179.26, 1134.90, 1026.91, 985.447, 837.919, 798.385, 722.211, 705.819. 1H-RMN (CD3OD, 400 MHz) δ ppm: 4.02 – 3.93, (parte A do sistema AB, 1H, J = 17.6 Hz, HG-2), 3.91 – 3.78 [(parte B do sistema AB, J = 17.6 Hz) + 3.83 (t, J = 6.8 Hz), 2H, HG-2 + HL2], 3.64 (s, 3H, OCH3), 1.75 – 1.52 (m, 3H, HL-3 + HL-4), 0.98 – 0.83 (m, 6H, HL-5). 13C-RMN e DEPT (CD3OD, 101 MHz) δ ppm: [170.89 (Cq), 170.82 (Cq), CONH + CO2CH3], 52.44 (CH, CL-2), 52.22 (CH3, OCH3), [41.31 (CH2), 41.22 (CH2), CL-3 + CG-2], 24.82 (CH, CL-4), [22.42 (CH3), 21.71 (CH3), CL-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 203.1390 (MH+, 45), 189.1248 (5), 171.1134 (1), 86.0754 (100, pico base). EMAR: cálculo para C9H19N2O3+: 203.1390; obtida: 203.1390. Parte Experimental 218 Parte Experimental 219 3.3.4. Síntese do {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (14a) e do {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicinato de metilo (14a') Sobre uma suspensão de Pd(OH)2/C 20% (0.040 g, 0.285 mmol, 0.5 eq.) em AcOEt seco (6 mL) adicionou-se uma solução da mistura dos tripéptidos protegidos (13a/13a') (0.237 g, 0.573 mmol, 1 eq.) em AcOEt seco (6 mL) num sistema previamente purgado em Ar. Saturou-se o sistema com H2 e deixou-se a mistura reacional em agitação contínua à t.a. sob pressão atmosférica de H2, com recurso a balões de H2, durante 8 dias. Removeu-se o catalisador por filtração com celite e lavagens com AcOEt (80 mL). O solvente foi eliminado por pressão reduzida originando-se um resíduo oleoso amarelo (213 mg) que se purificou por cromatografia de adsorção em coluna de gel de SiO2 usando como eluente AcOEt. Obteve-se de um óleo amarelo (154 mg), identificado como a mistura dos diastereoisómeros hidrogenados pretendidos, 14a/14a'. Rendimento de 83%. Compostos 14a/14a': óleo amarelo. Rf: 0.64 em Hex/AcOEt (1:9). IV v (cm-1): 3290.93, 2956.34, 2872.45, 1752.01, 1648.84, 1517.70, 1468.53, 1436.71, 1407.78, 1368.25, 1332.57, 1242.90, 1201.43, 1180.22, 1136.83, 1113.69, 1096.33, 1036.55, 1011.48, 953.627, 930.485, 889.023, 846.597, 800.314, 751.138. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): 8.59 (d, 1H, J = 7.9 Parte Experimental 220 Hz, permuta com D2O, CONH), 8.31 (d, 1H, J = 6.3 Hz, permuta com D2O, CONH), [8.05 (s), 7.97 (s), 7.89 (s), 2H, permutam com D2O, 2 x CONH), 4.72 – 4.25 [4.72 – 4.49 (m), 4.48 – 4.25 (m), 4H, 2 x (HL-2+ H-3)], 4.10 (s, 2H, 2 x H-1), 3.99 – 3.80 (m, 4H, 2 x HG-2), 3.63 (s, 6H, 2 x OCH3), [2.97 (s), 2.94 (s), 2H, 2 x H-4], 2.13 – 1.05 [mc, 20H, dois deles permutam com D2O 2 x (H-5, H-6, H-7, HL-3, HL-4, NH)], 0.93 – 0.63 (m, 12H, 2 x HL-5). 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 101 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): [173.50 (Cq), 173.42 (Cq), 171.26 (Cq), 170.11 (Cq), 167.72 (Cq), 167.63 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2CH3], [62.86 (CH), 62.28 (CH), 2 x C-3], [59.34 (CH), 59.18 (CH), 2 x C-1], [53.10 (CH), 52.53 (CH), 2 x CL-2], [52.40 (CH3), 52.20 (CH3), 2 x OCH3], [41.09 (CH2), 40.98 (CH2), 2 x CG-2], 40.57 (2CH2, 2 x CL-3), 39.93 (2CH, 2 x C-4), [38.55 (CH2), 38.47 (CH2), 2 x C-7], [26.45 (CH2), 26.31 (CH2), 2 x C-6], [24.75 (CH), 24.55 (CH), 2 x CL-4], [22.77 (CH3), 22.51 (CH2), 22.69 (CH3), 22.48 (CH2), CL-5 + 2 x C-5], [21.65 (CH3), 21.22 (CH3), CL-5]. EM (ESI) m/z (%): 326.2082 (MH+, 4), 237.1956 (19), 229.1545 (1), 209.1663 (2), 166.0865 (20), 138.0911 (21), 124.1072 (100, pico base), 110.0400 (5), 96.0682 (17). EMAR: cálculo para C16H28N3O4+: 326.2074; obtida: 326.2082. Parte Experimental 221 50 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 222 Parte Experimental 223 Parte Experimental 224 3.3.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil)}-L-leucilglicina (15a) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (15a') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação do ácido 7-exo (secção 3.2.4.), procedeu-se à hidrólise alcalina da mistura dos tripéptidos 14a/14a' (0.102 g, 0.313 mmol) deixando-se reagir durante 24h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente. Obtevese um óleo acastanhado (87 mg), identificado como a mistura dos tripéptidos 15a/15a'. Rendimento de 89%. Compostos 15a/15a': óleo acastanhado. Rf: 0.10 em AcOEt IV v (cm-1): 3270.68, 3069.16, 2955.38, 2871.49, 1761.65, 1746.23, 1696.09, 1648.84, 1542.77, 1471.42, 1416.46, 1366.32, 1320.04, 1295.93, 1247.72, 1199.51, 1177.33, 1160.94, 1121.40, 1039.44, 997.017, 957.484, 924.700, 889.987, 856.239, 801.278, 785.850, 762.709, 741.496, 714.497. 1H-RMN (CH3OD, 400 MHz) δ ppm: 4.54 – 4.32 (m, 2H, 2 x HL-2), 4.34 – 4.16 [4.28 (s) + 4.25 (s), 2H, 2 x H-3], 4.14 – 3.98 (m, 2H, 2 x H-1), 3.97 – 3.75 (s, 4H, 2 x HG-2), 3.12 – 2.85 [3.01 (s) + 2.95 (s), 2H, 2 x H-4], 2.06 – 1.08 [m, 18H, 2 x (H-5 + H-6 + H-7 + HL-3 + HL-4], 1.06 – 0.73 (m, 12H, 2 x HL5). Parte Experimental 225 13C-RMN e DEPT (CH3OD, 101 MHz) δ ppm: [174.32(Cq), 173.62 (Cq), 173.55 (Cq), 171.95 (Cq), 171.78 (Cq), 167.36 (Cq), 167.08 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2H], [62.60 (CH), 62.25 (CH), 2 x C-3], [59.15 (CH), 59.01 (CH), 2 x C-1], [52.60 (CH), 52.32 (CH), CL-2], [40.50 (CH), 40.24 (CH), 2 x C-4], [40.03 (CH2), 39.93 (CH2), 2 x CG-2], 37.88 (2CH2, 2 x CL-3), 35.65 (2CH2, 2 x C-7), [25.47 (CH2), 24.36 (CH2), 2 x C-6], [22.13 (CH2), 22.07 (CH2), 2 x C5], [21.86 (CH3), 20.58 (CH3), 20.07 (CH3), 19.47 (CH3), 2 x HL-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 312.1917 (MH+, 9), 282.2790 (2), 213.1228 (8), 181.0976 (14), 153.1038 (22), 96.0817 (100, pico base). EMAR: cálculo para C15H26N3O4+: 312.1918; obtida: 312.1917. Parte Experimental 226 40 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 227 Parte Experimental 234 3.3.7. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (22a) e de {(1R,3S,4S)-2-(terc-butiloxicarbonil)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (22a') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 7-exo (secção 3.2.4.), procedeu-se à hidrólise alcalina da mistura dos tripéptidos 21a/21a' (0.120 g, 0.282 mmol), porém utilizou-se CH3OH como solvente, deixando-se reagir durante 48h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente. Obteve-se um sólido branco de baixo ponto de fusão (105.5 mg) identificado como a mistura dos ácidos 22a/22a'. Rendimento de 91%. Composto 22a/22a': sólido branco. Rf: 0.12 em AcOEt. IV v (cm-1): 3297.68, 3077.83, 2957.30, 2927.41, 2871.49, 1647.88, 1524.45, 1471.42, 1391.39, 1365.35, 1295.93, 1253.50, 1208.18, 1159.97, 1118.51, 1048.12, 1036.55, 956.52, 930.485, 859.132, 821.527, 785.85, 771.387, 744.388. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ ppm: [8.00 – 7.43(m), 7.21 – 6.73 (m), 5.91 – 5.26 (m), 6H, 4 x CONH + 2 x CO2H), 4.90 – 3.45 [mc, 10H, 2 x (C-1 + C-3 + CL-2 + CG-2)], 2.98 – 2.53 [2.88 (s), 2.82 (s), 2.62 (s), 2H, 2 x C-4], 1.97 – 1.10 [1.42 (s), 1.40 (s), 36H, 2 x (C-5 + C-6 +C-7 + CL-3 + CL-4 + Boc)], 1.06 – 0.72 (m, 12H, 2 x CL-5). Parte Experimental 235 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 101 MHz) δ ppm: [174.72 (Cq), 174.68 (Cq), 174.53 (Cq), 173.93 (Cq), 173.89 (Cq), 173.66 (Cq), 171.66 (Cq), 171.36 (Cq), 171.34 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2H], [155.35 (Cq), 155.32 (Cq), CO2tBu], [80.56 (Cq), 79.76 (Cq), 2 x Boc], [65.70 (CH), 62.78 (CH), 61.63 (CH), 2 x C-3], [58.98, 2 x C-1], [51.38 (CH), 50.55 (CH), 2 x CL-2], [44.82 (CH2), 44.76 (CH2), 44.67 (CH2), 43.71 (CH2), 42.58 (CH2), 2 x CG-2], [41.30 (CH), 41.21 (CH), 41.11 (CH), 2 x C-4], [40.94 (CH2), 39.27 (CH2), 2 x C-7], 38.99 (2CH2, 2 x CL-3), , [29.95 (CH2), 29.65 (CH2), 2 x C-6], [28.28 (CH3), 28.20 (CH3), 28.12 (CH3), 2 x tBu], [24.95 (CH), 24.52 (CH), 2 x CL-4], [23.42 (CH2), 23.17 (CH3), 23.12 (CH3), 23.05 (CH2), 21.79 (CH3), 21.67 (CH3), 21.55 (CH3), 2 x (C-5 + CL-5)]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 434.22616 [(M+Na)+, 14], 412.24421 (MH+, 20), 348.15503 (27), 332.18689 (45), 318.171223 (74), 273.62881 (100, pico base), 199.20615 (42), 228.90115 (15), 157.59750 (15). EMAR: cálculo para C20H34N3O6+: 412.24424; obtida: 412.24421. Parte Experimental 236 70 110 80 90 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 237 Parte Experimental 238 Parte Experimental 239 3.3.8. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil)}-L-leucilglicina (15a) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-leucilglicina (15a') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 12a (secção 3.3.2.), a mistura dos tripéptido 22a/22a' (0.141 g, 0.343 mmol) foi dissolvida em CH2Cl2 (10 mL) deixando-se reagir durante 3h e, em seguida, efetuou-se o tratamento habitual, obtendo-se um óleo ligeiramente acastanhado. Em seguida, dissolveu-se a mistura em dH2O (10 mL), neutralizou-se com solução saturada de NaHCO3 e procedeu-se à extração com AcOEt. Juntaram-se as fases orgânicas e secouse com Na2SO4 anidro. Filtrou-se a suspensão obtida com recurso a pressão reduzida com lavagens de AcOEt e concentrou-se à secura, obtendo-se um óleo acastanhado (105 mg), identificado como a mistura dos tripéptidos pretendidos 15a/15a'. Rendimento de 98%. Compostos 15a/15b: óleo ligeiramente acastanhado. Os dados espectroscópicos obtidos são coincidentes com os constantes na secção 3.3.5.. Parte Experimental 240 3.4. SÉRIE P*GL 3.4.1. Síntese de (terc-butoxicarbonil)glicil-L-leucinato de metilo (11b) Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 11a (secção 3.3.1.), procedeu-se ao acoplamento entre 9b (0.97 g, 5.54 mmol, 1 eq.) e 10b (0.80 g, 5.54 mmol, 1eq.) em CH2Cl2 seco (50 mL) deixando-se reagir durante 48h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente. O composto foi purificado recorrendo-se à cromatografia de adsorção em coluna de gel de SiO2, usando-se como eluente CH2Cl2/CH3OH (20:1), tendo-se obtido um óleo amarelo (1.64 g), identificado como o correspondente dipéptido protegido 11b. Rendimento de 98%. Composto 11b: óleo amarelo. Rf: 0.39 em CH2Cl2/CH3OH (20:1). IV v (cm-1): 3308.29, 2957.30, 2871.49, 1742.37, 1713.44, 1671.02, 1509.03, 1437.67, 1366.32, 1272.79, 1246.75, 1204.33, 1150.33, 1050.05, 1025.94, 985.45, 945.91, 864.92, 781.03, 738.60. 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 7.02 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 5.64 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 4.53 (sl, 1H, HL-2), 3.75 (m, 2H, HG-2), 3.63 (s, 3H, OCH3), 1.67 – 1.53 (m, 3H, HL-3 + HL-4), 1.36 (s, 9H, Boc), 0.97 – 0.73 (m,6H, HL-5). 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 75 MHz) δ ppm: 173.29 (Cq, CONH), 169.66 (Cq, CO2CH3), 156.12 (Cq, CO2tBu), 79.79 (Cq, Boc), 52.13 (CH, CL-2), 50.56 (CH3, OCH3), 43.99 (CH2, CG2), 41.07 (CH2, CL-3), 28.17 (3CH3, Boc), 24.64 (CH, CL-4), 22.71 (CH3, CL-5), 21.65 (CH3, CL-5). EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 325.1734 ([M+Na]+, 48), 269.1101 (7), 247.1306 (37), 225.1503 (59), 203.1401 (46), 187.1073 (13), 146.1183 (100, pico base), 143.1184 (29), 117.1041 (40), 86.0955 (3). EMAR: cálculo para C14H26N2O5Na+: 325.1734; obtida: 325.1734. Parte Experimental 241 50 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 242 Parte Experimental 243 Parte Experimental 250 Parte Experimental 251 3.4.4. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucinato de metilo (14b) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucinato de metilo (14b') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 14a/14a' (secção 3.3.4.), o tripéptido 13b (0.285 g, 0.689 mmol) foi dissolvido em AcOEt seco (20 mL) deixando-se reagir durante 4d e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente, obtendo-se 305 mg de um óleo amarelo. Procedeu-se à purificação do composto pretendido por cromatografia em coluna de adsorção em gel de SiO2, utilizando como eluente Hex/AcOEt (1:4), e em seguida, MeOH, tendo-se obtido sólido amarelo de baixo ponto de fusão (163.7 mg), identificado como a mistura dos diastereoisómeros hidrogenados pretendidos, 14b/14b'. Rendimento de 73%. Compostos 14b/14b': sólido amarelo. P.f.: 28–30ºC Rf: 0.14 em AcOEt. IV v (cm-1): 3269.72, 3054.69, 2956.34, 2871.49, 1741.41, 1654.62, 1540.85, 1471.42, 1435.74, 1386.57, 1335.46, 1269.90, 1225.54, 1205.29, 1154.19, 1045.23, 1017.27, 983.518, 887.095, 850.454, 824.420, 744.388. Parte Experimental 252 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): [8.69 – 8.35 (m), 8.33 – 7.98 (m), 2H, permutam com D2O, 2 x CONH], 7.24 – 6.79 [7.18 (t, J = 8.5 Hz), 2H, permutam com D2O, 2 x CONH), 4.70 – 4.35 (m, 2H, 2 x HL-2), 4.17 – 3.30 [3.75 (s), 3.69 (s), 14H, 2 x (HG-2 + H-1 + H-3 + OCH3)], 2.76 (s, 2H, 2 x H-4), 1.78 – 1.01 [m, 20H, dois deles permutam com D2O, 2 x (H-5 + H-6 + H-7 + HL-3 + HL-4 + NH)], 0.99 – 0.75 (m, 12H, 2 x HL5). 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 75 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): [176.36 (Cq), 173.35 (Cq), 173.30 (Cq), 172.53 (Cq), 168.99 (Cq), 168.90 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2CH3], 62.64 (2CH, 2 x C-3), [56.61 (CH), 56.59 (CH), 2 x C-1], 52.21 (2CH3, 2 x OCH3), [50.75 (CH), 50.73 (CH), 50.45 (CH), 2 x CL-2], [43.15 (CH2), 43.04 (CH2), 2 x CG-2], [41.29 (CH), 41.28 (CH), 2 x C-4], 40.95 (2CH2, 2 x CL-3), 34.56 (2CH2, 2 x C-7), 29.57 (2CH2, 2 x C5), [27.78 (CH2), 27.76 (CH2), 2 x C-6], [24.92 (CH), 24.69 (CH), 2 x CL-4], [22.70 (CH3), 22.68 (CH3), 22.07 (CH3) 21.71 (CH3), 21.66 (CH3), 2 x CL-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 326.2066 (MH+, 59), 229.1538 (5), 203.1395 (11), 181.0977 (31), 153.1024 (38), 124.1130 (16), 105.0479 (25), 96.0805 (100, pico base). EMAR: cálculo para C16H28N3O4+: 326.2074; obtida: 326.2066. Parte Experimental 253 50 100 60 70 80 90 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 254 Parte Experimental 255 3.4.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucina (15b) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}glicil-L-leucina (15b') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação do ácido 7-exo (secção 3.2.4.), procedeu-se à hidrólise alcalina da mistura dos tripéptidos 14b/14b' (0.130 g, 0.399 mmol) deixando-se reagir durante 9h e, em seguida, efetuou-se o tratamento habitual. O composto pretendido foi purificado através de cromatografia adsorção em coluna de gel de SiO2 usando-se como eluente AcOEt e, em seguida, MeOH. Obteve-se um sólido bege cristalino de baixo ponto de fusão (0.106 g), identificado como a mistura dos correspondentes tripéptidos, 15b/15b'. Rendimento de 85%. Compostos 15b/15b': sólido bege. Rf: 0.44 em CH2Cl2/CH3OH (4:1). P.f.: 34–36 ºC IV v (cm-1): 3243.68, 3066.26, 2995.38, 2868.59, 1748.64, 1651.73, 1643.32, 1587.13, 1468.53, 1405.85, 1367.28, 1338.36, 1272.79, 1107.90, 1072.23, 1027.87, 971.947, 936.271, 883.238, 853.347. 1H-RMN (D2O, 300 MHz) δ ppm (verifica-se a presença de rotâmeros): 4.31 – 4.16 (m, 4H, 2 x HG-2), 4.12 (s, 2H, 2 x H-3), 4.03 – 3.97 (m, 2H, 2 x HL-2), 2.95 (s, 2H, 2 x H-1), 2.32 – 1.18 [m, 20H, 2 x (H-4 + H-5 + H-6 + H-7 + HL-3 + HL-4)], [0.90 (d, J = 5.5 Hz), 0.87 (d, J = 5.6 Hz), 12H, 2 x HL-5]. Parte Experimental 256 13C-RMN e DEPT (D2O, 75 MHz) δ ppm (verifica-se a presença de rotâmeros): [179.70 (Cq), 170.03 (Cq), 169.93 (Cq), 169.29 (Cq), 169.21 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2H], 62.59 (2CH, 2 x C-3), 58.87 (2CH, 2 x C-1), [53.81 (CH), 53.76 (CH), 2 x CL-2], 47.73, [42.67 (CH2), 42.60 (CH2), 2 x CG-2], 41.69 (2CH, 2 x C-4), [40.56(CH2), 40.54 (CH2), 2 x CL-3], [33.83 (CH2), 33.81 (CH2), 2 x C-7], [26.31 (CH2), 26.29 (CH2), 2 x C-5], [24.97 (CH2), 2 x C-6], [24.51 (CH), 22.49 (CH), 22.31 (CH), 2 x CL-4], [22.37 (CH3), 22.37 (CH3), 20.73 (CH3), 20.67 (CH3), 2 x CL-5]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 312.1925 (MH+, 50), 220.0977 (26), 181.0989 (20), 153.1031 (31), 124.1136 (23), 105.0461 (57), 96.0816 (100, pico base). EMAR: cálculo para C15H26N3O4+: 312.1918; obtida: 312.1925. Parte Experimental 257 40 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 258 Parte Experimental 259 3.5. SÉRIE P*VA 3.5.1. Síntese do (terc-butoxicarbonil)-L-valil-L-alaninato de metilo (11c) Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 11a (secção 3.3.1.), procedeu-se ao acoplamento entre 9c (0.153 g, 0.704 mmol, 1eq.) e 10c (0.099 g, 0.709 mmol, 1 eq) deixando-se reagir durante 48h e, em seguida, efetuou-se o tratamento habitual. O composto foi purificado recorrendo-se à cromatografia de adsorção em coluna de gel de SiO2, usando-se como eluente CH2Cl2/CH3OH (10:1) e procedeu-se, em seguida, à recristalização em hexano arrefecido a 0ºC mediante banho de gelo. Os cristais obtidos foram filtrados com recurso a funil de Büchner e pressão reduzida, obtendo-se um sólido cristalino branco com textura de algodão (0.185 g), identificado como sendo o dipéptido protegido 11c. Rendimento de 88%. Composto 11c: sólido cristalino branco. Rf: 0.79 em CH2Cl2/CH3OH (10:1). P.f.: 139–140ºC IV v (cm-1): 3307.32, 3246.57, 3076.87, 2975.62, 2933.20, 2874.38, 1750.08, 1679.69, 1646.91, 1557.24, 1524.45, 1455.99, 1392.35, 1367.28, 1303.64, 1250.61, 1209.15, 1162.87, 1118.51, 1045.23, 1019.19, 983.518, 932.414, 881.309, 855.275. 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ ppm: 6.63 (d, 1H, J = 7.1 Hz, permuta com D2O, CONH), 5.17 (d, 1H, J = 8.1 Hz, permuta com D2O, CONH), 4.58 (p, 1H, J = 7.2 Hz, HA-2), 3.97 – 3.93 (m, 1H, HV-2), 3.74 (s, 3H, OCH3), 2.09 (m, 1H, HV-3), 1.60 – 1.30 [1.45 (s), 1.41 (d, J = 7.3 Hz), 12H, Boc + HA-3], [0.97 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.93 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 6H, HV-4]. 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 75 MHz) δ ppm: [174.07 (Cq), 172.16 (Cq), CONH + CO2CH3], 156.77 (Cq, CO2tBu), 80.72 (Cq, Boc), 60.63 (CH3, OCH3), 53.29 (CH, CV-2), 48.85 (CH, CA2), 31.97 (CH, CV-3), 29.19 (3CH3, Boc), 20.04 (CH3, CV-4), 19.06 (CH3, CA-3), 18.65 (CH3, CV-4). EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 325.2 ([M+Na]+, 24), 288.3 (4), 269.1 (5), 247.1 (1), 241.1 (2), 225.1 (100, pico base), 203.1 (13), 116.1 (3), 104.1 (13), 72.1 (1). Parte Experimental 266 3.5.3. Síntese de {(1R,3R,4S)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carbonil}-L-valil-Lalaninato de metilo (13c) e de {(1S,3S,4R)-2-benzil-2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-eno-3-carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (13c') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 11a (secção 3.3.1.), procedeu-se ao acoplamento entre 8-exo (0.103 g, 0.449 mmol, 1 eq.) dissolvido em CH2Cl2 seco (20 mL) e 12c (0.142 g, 0.449 mmol, 1 eq) deixando-se reagir durante 48h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente, obtendo-se 260.0 mg de um óleo amarelo. Procedeuse à purificação do composto pretendido por cromatografia em coluna de adsorção em gel de SiO2, utilizando como eluente Hex/AcOEt (1:4) tendo-se obtido um sólido amarelo claro de baixo ponto de fusão (104.4 mg), identificado como a correspondente mistura de diastereoisómeros, 13c/13c'. Rendimento de 70%. Compostos 13c/13c': sólido amarelo claro. Rf: 0.53 em Hex/AcOEt (1:4). P.f.: 31–32ºC IV v (cm-1): 3298.64, 3060.48, 3030.59, 2960.20, 2877.27, 2841.60, 1746.23, 1645.95, 1508.06, 1453.10, 1370.18, 1315.21, 1267.00, 1205.29, 1162.87, 1053.91, 1028.84, 987.375, 926.628, 893.844, 848.525, 801.278, 732.817. Parte Experimental 267 1H-RMN (CDCl3, 500 MHz) δ ppm: 8.28 (d, 1H, J = 8.5 Hz, permuta com D2O, CONH), 8.16 (d, 1H, J = 9.5 Hz, permuta com D2O, CONH), 7.39 – 7.22 (m, 10H, 2 x ArH), 6.66 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 6.62 (sl, 1H, permuta com D2O, CONH), 6.56 (m, 2H, 2 x H-6), 6.23 (dd, J = 10.1, 4.0 Hz, 2H, 2 x H-5), [4.54 (p, J = 7.0 Hz), 4.53 (p, J = 7.0 Hz), 2 x HA-2], 4.22 (dd, 1H, J = 9.2, 6.5 Hz, 2H, 2 x HV-2), [3.85 (s), 3.80 (s), 2H, 2 x H-3], [3.74 (s), 3.73 (s), 6H, 2 x OCH3], 3.54 – 3.48 (parte A do sistema AB, J = 13.0 Hz, NCHHPh), 3.48 – 3.43 (Sistema AB, J = 13.0 Hz, NCH2Ph), 3.43 – 3.30 (parte B do Sistema AB, J = 13.0 Hz, NCHHPh), [3.24 (s), 3.22 (s), 2H, 2 x H-1], [2.41 (s), 2.37 (s), 2H, 2 x H-4), [2.24 – 2.13 (m, 1H), 2.08 – 1.98 (m, 1H), 2H, 2 x HV-3], 1.63 (t, 2H, J = 8.9 Hz, 2 x H-7syn), [1.39 (d, J = 7.0 Hz), 1.37 (d, J = 7.0 Hz), 8H, 2 x (HA-3 + H-7anti)], [0.97 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0.88 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0,79 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 12H, 2 x HV-4]. 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 125 MHz) δ ppm: [173.14 (Cq), 173.13 (Cq), 173.09 (Cq), 172.97 (Cq), 170.73 (Cq), 170.37 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2CH3], [138.51 (CH), 138.42 (CH), 2 x C-5], [137.79 (Cq), 137.71 (Cq), 2 x C-1'], [133.14 (CH), 132.97 (CH), 2 x C-6], [129.19 (2CH), 128.91 (2CH), 2 x (C-2' + C-6')], [128.66 (2CH), 128.52 (2CH), 2 x (C-3' + C-5')], [127.37 (CH), 127.24 (CH), 2 x C-4'), [66.91 (CH), 66.82 (CH), 2 x C-3], [64.32 (CH), 63.56 (CH), 2 x C-1], [58.55 (CH2), 58.24 (CH2), 2 x NCH2Ph], [58.09 (CH), 57.95 (CH), 2 x CV-2], 52.35 (CH3, 2 x OCH3), [49.15 (CH), 48.82 (CH), 2 x CA-2], [47.98 (CH), 47.91 (CH), 2 x CV-3], [45.95 (CH2), 45.91 (CH2), 2 x C-7], [31.04 (CH), 30.91 (CH), 2 x C-4)], [19.29 (CH3), 19.14 (CH3), 18.13 (CH3), 18.03 (CH3), 2 x CV-4)], 17.97 (2CH3, 2 x CA3). EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 414.2388 (MH+, 1), 348.1912 (18), 320.1971 (1), 316.1649 (2), 245.1286 (42), 217.1406 (100, pico base), 104.0728 (19), 91.0541 (22). EMAR: cálculo para C23H32N3O4+: 414.2387; obtida: 414.2388. Parte Experimental 268 40 110 60 80 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 269 Parte Experimental 270 3.5.4. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (14c) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alaninato de metilo (14c') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 14a/14a' (secção 3.3.4.), a mistura dos tripéptidos protegidos 13c/13c' (0.150 g, 0.363 mmol) foi dissolvida em AcOEt seco (20 mL) deixando-se reagir durante 5d e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente, obtendo-se 155.3 mg de um óleo amarelo. Procedeu-se à purificação do composto pretendido por cromatografia em coluna de adsorção em gel de SiO2, utilizando como eluente AcOEt, tendo-se obtido um sólido amarelo com baixo ponto de fusão (83.1 mg), identificado como a mistura dos diastereoisómeros hidrogenados pretendidos, 14c/14c'. Rendimento de 70%. Compostos 14c/14c': óleo amarelo. Rf: 0.10 em AcOEt. IV v (cm-1): 3282.25, 3060.48, 2961.16, 2874.38, 1743.33, 1645.95, 1538.92, 1518.67, 1450.21, 1382.71, 1332.57, 1291.11, 1272.79, 1206.26, 1162.87, 1052.94, 983.518, 924.700, 886.131, 849.490, 797.421. Parte Experimental 271 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ ppm (verifica-se a presença de rotâmeros): [8.38 (d, J = 9.2 Hz), 8.28 (d, J = 9.0 Hz), 7.82 (d, J = 8.9 Hz), 2H, permutam com D2O, 2 x CONH], [7.34 (d, J = 7.2 Hz), 7.23 (d, J = 7.1 Hz), 7.04 (d, J = 7.8 Hz), 2H, permutam com D2O, 2 x CONH], 4.48 (p, 2H, J = 7.1 Hz, 2 x HA-2), 4.31 – 4.15 (m, 2H, 2 x HV-2), 3.69 (s, 6H, 2 x OCH3), 3.63 (s, 2H,2 x H-3), 3.49 (s, 2H, 2 x H-1), 2.72 (d, 2H, J = 1.8 Hz, 2 x H-4), 2.24 – 1.97 (m, 2H, 2 x HV-3), 1.71 – 1.16 [1.35 (d, J = 7.0 Hz), 20H, dois deles permutam com D2O, 2 x (H-5 + H-6 + H-7 + HA-3 + NH)], [0.93 (d, J = 6.6 Hz), 0.91 (d, J = 6.6 Hz), 0.89 (d, J = 6.6 Hz), 0.88 (d, J = 6.6 Hz), 12H, 2 x HV-4]. 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 75 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): [173.28 (Cq), 173.18 (Cq), 172.99 (Cq), 172.27 (Cq), 170.92 (Cq), 170.90 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2CH3], 63.03 [(CH), 62.83 (CH), 2 x C-3], [58.51 (CH), 58.37 (CH), 2 x CV-2], [56.60 (CH), 56.25 (CH), 2 x C-1], [52.82 (CH3), 52.27 (CH3), 2 x OCH3], [48.03 (CH), 47.98 (CH), 2 x CA-2], [41.61 (CH), 41.33 (CH), 2 x C-4], [34.42 (CH2), 34.35 (CH2), 2 x C-7], 31.25 (2CH2, 2 x C-6) , [30.90 (CH), 30.72 (CH), 2 x CV-3], [28.09 (CH2), 27.89 (CH2), 2 x C-5], [19.22 (CH3), 18.18 (CH3), 17.94 (CH3), 17.76 (CH3), 2 x CV-4], 17.66 (2CH3, 2 x CA-3). EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 326.2091 (MH+, 34), 229.1510 (1), 223.1449 (26), 195.1546 (100, pico base), 124.1127 (9), 96.0844 (58). EMAR: cálculo para C16H28N3O4+: 326.2074; obtida: 326.2091. Parte Experimental 272 83 103 85 90 95 100 4000 7002000 1000 %T Wavenumber [cm-1] Parte Experimental 273 Parte Experimental 274 3.5.5. Síntese de {(1S,3R,4R)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alanina (15c) e de {(1R,3S,4S)-2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carbonil}-L-valil-L-alanina (15c') Segundo o procedimento descrito anteriormente para a preparação de 7-exo (secção 3.2.4.), procedeu-se à hidrólise alcalina da mistura dos tripéptidos 14c/14c' (0.169 g, 0.519 mmol) deixando-se reagir durante 48h e, em seguida, efetuou-se o tratamento corrente. O composto pretendido foi purificado através de cromatografia adsorção em coluna de gel de SiO2 usando-se como eluente CH2Cl2/CH3OH (1:1). Obteve-se um sólido bege cristalino de baixo ponto de fusão (0.120 g), identificado como a mistura dos correspondentes tripéptidos, 15c/15c'. Rendimento de 74%. Compostos 15c/15c': sólido bege cristalino. Rf: 0.31 em CH2Cl2/CH3OH (1:1). P.f.: 162–164ºC IV v (cm-1): 3249.47, 3057.58, 2964.05, 1722.12, 1649.80, 1542.77, 1454.06, 1372.10, 1267.00, 1099.23, 891.916, 844.669. 1H-RMN (CD3OD, 300 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): 4.55 – 3.94 [m, 8H, 2 x (HV-2 + HA-2 + H-1 + H-3)], 2.99 – 2.80 [2.92 (s), 2.87 (s), 2.84 (s), 2.70 (s), 2H, 2 x H-4], 2.32 – 1.48 [mc, 12H, 2 x (H-5 + H-6 + H-7syn + HV-3), 1.39 (d, J = 7.1 Hz, HA-3), 1.34 – 1.11 (m, 2H, 2 x H-7anti), 1.10 –0.83 (m, 12H, 2 x HV-4). Parte Experimental 275 13C-RMN e DEPT (CDCl3, 75 MHz) δ ppm (observa-se a presença de rotâmeros): [175.12 (Cq), 175.05 (Cq), 175.04 (Cq), 171.54 (Cq), 171.55 (Cq), 168.21 (Cq), 168.16 (Cq), 168.15 (Cq), 4 x CONH + 2 x CO2H], [65.70 (CH), 65.41 (CH), 2 x C-3], [62.53 (CH), 62.25 (CH), 61.39 (CH), 2 x CV-2], [59.67 (CH), 59.12 (CH), 59.45 (CH), 58.60, (2CH, 2 x C-1), [48.51 (CH), 48.42 (CH), 48.34 (CH), 48.23 (CH), 2 x C4], [43.11 (CH), 42.84 (CH), 42.35 (CH), 42.11 (CH), , 2 x CA-2], [34.82 (CH2), 34.71 (CH2), 33.72 (CH2), 33.64 (CH2), 2 x C-7], [30.67 (CH), 30.38 (CH), 2 x CV-3], [26.77 (CH2), 26.53 (CH2), 26.47 (CH2), 2 x C-6), [24.93 (CH2), 24.89 (CH2), 2 x C-5], [18.36 (CH3), 18.27 (CH3), 17.41 (CH3), 17.02 (CH3), 2 x CV-4)], [16.44 (CH3), 16.25 (CH3), 2 x CA-3)]. EM (ESI, CH3OH) m/z (%): 312.1922 (MH+, 31), 223.1583 (7), 215.1380 (1), 195.1495 (100, pico base), 166.0869 (4), 124.1128 (43), 96.0813 (58). EMAR: cálculo para C15H26N3O4+: 312.1918; obtida: 312.1922. Ensaios Farmacológicos 282 Transcorrido o tempo de incubação, transferiu-se 200 μL para uma microplaca Millipore GF/C, pré-tratada com polietilenimina a 0.5% e as amostras foram filtradas e lavadas quatro vezes com 250 μL de tampão de lavagem (Tris-HCl 50 mM, pH = 7.6; NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 4 mM, EDTA 1 mM). Os filtros foram secos e adicionou-se, em cada poço, 30 μL de cocktail de cintilação (Universol) e a radioatividade foi detetada mediante um contador de cintilação (Microbeta Trilux) para leitura de microplacas. Os dados expressam-se como um incremento da especificidade da união, mediante a seguinte equação (1): Onde, X: radioatividade detetada no poço ensaiado; BT: radioatividade detetada quando [3H]NPA foi incubado na ausência do composto; NSB: radioatividade detetada quando se co-incubou [3H]NPA com (+)-butaclamol 1 μM. A significância estatística avaliou-se segundo uma análise ANOVA, usando o software SPSS (V15.0), determinando-se o limite de significância em valores de P < 0.05. 4.1.2. Resultados Sobre seis novos compostos prolinomiméticos do tripéptido natural PLG na forma de misturas diastereoisoméricas, 13b-c/13b'-c', 14b-c/14b'-c' e 15b-c/15b'-c', previamente sintetizados, realizaram-se ensaios relativos à sua capacidade para potenciar a união do agonista [3H]NPA frente a recetores de dopamina D2 clonados, tal como descrevem Verma et al. 90. Estes compostos foram estudados em oito concentrações diferentes (compreendidas entre 10-12 a 10-5 M). Os dados obtidos para os análogos do PLG sobre a união de [3H]NPA, encontram-se em Anexo, segundo a Tabela 4.1. 90Verma, V.; Mann, A.; Costain, W.; Pontoriero, G.; Castellano, J., M.; Skoblenick, K.; Gupta, S. K.; Pristupa, Z.; Niznik, H. B.; Johnson, R. L.; Nair, V. D.; Mishra, R. K., J. Pharmacol. Exp.Ther. 2005, 315, 1228-1236. (1) Ensaios Farmacológicos 283 Tabela 4.1 Compostos prolinomiméticos utilizados nos ensaios biológicos de competição agonista/antagonista utilizando a técnica de fixação de ligandos para determinação do efeito modulador alostérico de recetores D2 de dopamina. Fórmula de Estrutura Compostos F. Molecular Código ID XG1ID01 13c/13c' C23H31N3O4 XG1ID02 13b/13b' C23H31N3O4 XG1ID03 15c/15c' C15H25N3O4 XG1ID04 14c/14c' C16H27N3O4 XG1ID05 14b/14b' C16H27N3O4 XG1ID06 15b/15b' C15H25N3O4 CAPÍTULO 5 Considerações Finais Considerações Finais 287 Neste trabalho foram desenvolvidas diferentes abordagens sintéticas de forma a contribuir para o aumento do pool de pseudoprolinas constringidas baseadas no sistema 2-azabiciclo[2.2.1]heptano. Primeiramente, procedeu-se à síntese de derivados N-benzilados, nomeadamente os prolinomiméticos racémicos 4-exo, 5-endo, 6-exo, 7-exo e 8-exo e, ulteriormente, desenvolveram-se percursores alternativos aos racematos 4-exo e 5-endo, a saber, 17-exo e 18-endo, bem como os seus derivados, 19-exo e 20-exo. Partiu-se dos precursores 8-exo de forma a criar três séries de prolinomiméticos do PLG. A metodologia adotada, nomeadamente via síntese convergente, com a preparação dos fragmentos peptídos C-terminais para cada série de forma independente, resultou na síntese de três dipéptidos N-protegidos (11a-c) e de três dipéptidos N-desprotegidos (12a-c), com excelentes rendimentos, tanto no acoplamento (87–98%) como na N-desproteção (98–99%). O acoplamento entre os prolinomiméticos racémicos 8-exo com os dipéptidos 12a-c, para a preparação dos correspondentes tripéptidos 13a-c/13a'-c', revelou-se uma metodologia muito prolífica, apresentando rendimentos na ordem dos 66–76%. A principal vantagem desta metodologia passa por diminuir o número de operações envolvendo o sistema bicíclico. Posteriormente, a hidrogenação e hidrogenólise destes tripéptidos conduziu à síntese dos respetivos tripéptidos N-desprotegidos, 14a-c/14a'-c'. Embora os rendimentos tenham sido, em geral, muito bons (70–83%), os tempos de reação foram muito extensos no que respeita à Ndesbenzilação, entre 4 a 8 dias (Tabela 2.21). O último passo de desproteção dos ésteres metílicos para obtenção dos correspondentes ácidos na sua forma livre revelou-se muito eficaz, com rendimentos na ordem dos 74–89%. Através do estudo da via alternativa para a síntese do PLG, utilizando derivados Nprotegidos sob a forma de carbamato de terc-butilo (Boc), verificou-se que estes últimos são melhores intermediários do que os derivados N-benzilados em termos de pureza e rendimento global do procedimento sintético utilizado, como pode ser constatado por comparação dos rendimentos globais relativos às sequências reacionais: 48% (8-exo → 13a/13a' → 14a/14a' → 15a/15a') vs. 69% (20-exo → 21a/21a' → 22a/22a' → 15a/15a'). O rendimento global das restantes séries, P*GL e P*VA, foi de 39 e 32%, respetivamente. No total, foram preparados 11 misturas de diastereoisómeros prolinomiméticos. Os ensaios biológicos levados a cabo para os tripéptidos 13b-c/13b'-c', 14b-c/14b'-c' e 15b-c/15b'-c', foram meramente estudos preliminares de caráter exploratório, uma vez que o objetivo primordial era proceder a este estudo com os tripéptidos enantiomericamente puros, contudo, como tal não foi possível, usaram-se as misturas diastereoisoméricas dos compostos supracitados de forma a instigar o seu potencial papel como moduladores positivos dos recetores de dopamina D2. Os resultados dos ensaios biológicos revelam que nenhuma das misturas de diastereoisómeros analisada induz afinidade dos recetores D2 para com o [3H]NPA. Considerações Finais 288 Todavia, estes resultados não são conclusivos uma vez que os tripéptidos foram analisados como uma mistura diatereoisomérica. Como tal, o efeito de um diatereoisómero poderá antagonizar o efeito de outro; ainda de destacar que a concentração usada em cada ensaio reflete a mistura de diastereoisómeros e não de cada diástereoisómero per se. Esta observação é de extrema importância, na medida em que, a atividade é padronizada em relação à concentração do PLG, que se encontra enantiomericamente puro (controlo positivo), assim poderão estar subvalorizados eventuais efeitos modulatórios frente aos recetores D2, mascarando a sua atividade contingencial. Apesar de não ter sido possível a separação dos diastereoisómeros presentes nas misturas obtidas para as diferentes séries, e portanto, a aferição do potencial efeito modulatório dos recetores D2 desta classe de análogos do PLG, este trabalho cumpriu com os objetivos propostos, nomeadamente o conhecimento da química desta classe de análogos do PLG como medida exploratória, tendo-se procedido ainda, de forma complementar, à otimização da via de síntese de prolinomiméticos do PLG através da via alternativa do P*LG. De enfatizar que, a proposta metodológica demonstrou-se muito eficáz, roubusta e pertinente, deste modo perspetiva-se, face aos resultados obtidos neste trabalho, o uso de sistemas prolinomiméticos sob a forma enantiomericamente pura na síntese de derivados do PLG, mediante a metodologia desenvolvida e otimizada nesta dissertação. Destarte, será possível a síntese de prolinomiméticos do PLG, na sua forma impermista, elegíveis portanto, para ensaios farmacológicos, elucidando de forma inequívoca acerca da sua potencialidade como candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos neuroprotetores pela modulação dos recetores D2 dopaminérgicos. Os tripéptidos preparados serão futuramente submetidos a um processo de avaliação biológica adicional para conhecer a sua atividade neuroprotetora, tanto em ausência como em presença de diferentes agentes neurotóxicos como glutamato (que induz excitotoxidade e morte neuronal através de uma sobrecarga de Ca2+ na célula), ou água oxigenada, que induz stresse oxidativo. 6. Anexos