Avaliação e caraterização por métodos computacionais de diferentes radioisótopos no contexto da terapia paliativa de metástases ósseas

FRANCISCO DIOGO CARVALHO GUERRA LIBERAL AVALIAÇÃO E CARATERIZAÇÃO POR MÉTODOS COMPUTACIONAIS DE DIFERENTES RADIOISÓTOPOS NO CONTEXTO DA TERAPIA PALIATIVA DE METÁSTASES ÓSSEAS Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto Julho 2014 AVALIAÇÃO E CARATERIZAÇÃO POR MÉTODOS COMPUTACIONAIS DE DIFERENTES RADIOISÓTOPOS NO CONTEXTO DA TERAPIA PALIATIVA DE METÁSTASES Dissertação submetida à Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto para satisfação parcial dos requisitos do: MESTRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA Por: Francisco Diogo Carvalho Guerra Liberal Licenciado em Engenharia Biomédica pela Universidade de Trás-osMontes e Alto Douro (2012) Orientador: João Manuel R. S. Tavares Professor Associado do Departamento de Engenharia Mecânica da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto Coorientador: Adriana Alexandre S. Tavares Consultora da Molecular NeuroImaging (MNI), LLC New Haven, Connecticut, USA Agradecimentos Nunca seria capaz de realizar esta dissertação sem a preciosa orientação da Drª. Adriana Tavares e do Professor João Tavares, ajuda dos meus amigos e apoio da minha família. Gostava de expressar a minha gratidão ao meu orientador, Professor João Tavares, pela excelente orientação, paciência. Gostava também de agradecer a Drª. Adriana Tavares, que pacientemente corrigiu a minha escrita, pensamentos e suportou a minha pesquisa. Não podia deixar de agradecer ao Dr. Robert Stewart (School of Health Sciences – Purdue University, USA) pelo fornecimento do pacote de simuladores utilizados. Por último, gostaria de agradecer à minha família e amigos, que estiveram sempre ao meu lado para me apoiar e encorajar com os seus desejos e amizade. vii Sumário As metástases ósseas podem ocorrer em 30 a 70% dos doentes portadores de neoplasias. Os tumores malignos que mais frequentemente metastizam para o tecido ósseo incluem o carcinoma da mama, próstata e pulmões, e cerca de 65-75% dos doentes com cancro na próstata desenvolve metástases ósseas. A radioterapia externa ou interna, bem como o uso de analgésicos, podem ser utilizados como métodos de tratamento paliativo das metástases ósseas, cuja finalidade é o alívio dos sintomas, promovendo a melhoria da qualidade de vida do doente. A radioterapia interna dirigida com utilização de radioisótopos é uma abordagem particularmente interessante para terapia paliativa de metástases ósseas quando os doentes apresentam múltiplos focos de metástases dispersos pelo esqueleto. Atualmente, diversos radioisótopos encontram-se em utilização na prática clínica, bem como sob investigação para este fim. Exemplos incluem o Fósforo-32 (32P), Estrôncio-89 (89Sr), Ítrio-90 (90Y), Estanho-117m (117mSn), Samário153 (153Sm), Hólmio-166 (166Ho), Túlio-170 (170Tm), Lutécio-177 (177Lu), Rénio-186 (186Re), Rénio-188 (188Re) e Rádio-223 (223Ra). Com recurso a simuladores computacionais desenvolvidos com base no algoritmo Monte Carlo é possível modelar de uma forma simples e eficaz diferentes cenários de irradiação, o que possibilita o estudo de diferentes propriedades radiobiológicas dos radioisótopos acima enumerados num período de tempo reduzido, quando comparado com estudos em culturas celulares. Assim, este trabalho tem por objetivo avaliar os efeitos radiobiológicos de onze radioisótopos utilizados na radioterapia paliativa de metástases ósseas, bem como inferir sobre a sua potencial eficiência terapêutica, através do recurso a métodos computacionais. Os resultados obtidos nesta Dissertação permitem concluir que as partículas α do 223Ra, bem como as partículas βemitidas pelos radioisótopos 177Lu e 170Tm, apresentam a maior capacidade de indução de morte celular de entre todos os radioisótopos investigados. Por outro lado a fração de sobrevida celular é maior após irradiação com 89Sr e 153Sm, os dois radioisótopos frequentemente utilizados na viii pratica clinica do tratamento paliativo de metástases ósseas, do que com as partículas βdo 177Lu, 170Tm e as partículas α do 223Ra. A avaliação dos resultados obtidos pelo simuladores e dos dados da pesquisa bibliográfica permite concluir que o 223Ra e 177Lu possuem o maior potencial para o tratamento paliativo de metástases ósseas. Em particular, o 223Ra (o único emissor α estudado) demonstrou superioridade em relação aos restantes radioisótopos estudados em todos os testes realizados, sendo o dicloreto de rádio-223 o único radiofármaco com capacidade de aumentar a esperança média de vida dos doentes com metástases ósseas. Os dados apresentados nesta Dissertação incentivam a realização de estudos futuros in vitro e in vivo para comparação dos diferentes radioisótopos para o tratamento paliativo das metástases ósseas. Para além disso, os dados recolhidos nesta Dissertação sugerem a necessidade de reavaliar o uso clínico sistemático do 89Sr e 153Sm, em particular agora que o uso de outros radioisótopos, tais como o 223Ra e o 177Lu, é promovido com base em dados clínicos e estudos in silico e in vitro. ix Abstract Bone metastases occur in 30-70% of patients with cancer. Malignant tumors often metastasize to bone include breast, prostate and lung, and about 65-75% of prostate cancer patients develop bone metastases. Radiation therapy and analgesics, can be used as methods of palliative treatment of bone metastases, whose purpose is the relief of symptoms, further improving the quality. The localized radiation therapy with radioisotopes is a particularly interesting approach to palliative therapy of bone metastases when patients have multiple foci of metastases scattered throughout the skeleton. Currently, several radioisotopes are in use in clinical practice as well as under investigation for this purpose. Examples include Phosphorus-32 (32P), Strontium-89 (89Sr), Yttrium-90 (90Y), Tin-117m (117mSn), Samarium-153 (153Sm), Holmium-166 (166Ho), Thulium-170 (170Tm), Lutetium-177 (177Lu), Rhenium-186 (186Re), Rhenium-188 (188Re) and Radium-223 (223Ra). Using computational simulation developed based on Monte Carlo algorithm is possible to model a simple and effective manner different irradiation scenarios, which enables the study of different radiobiological properties of radioisotopes listed above in a short period of time, when compared with studies in cell cultures. This study aims to evaluate the radiobiological effects of eleven radioisotopes used in palliative radiotherapy for bone metastases as well as inferences about its potential therapeutic efficiency, through the use of computational methods. Therefore possible to estimate the percentage of lesions in deoxyribonucleic acid (DNA) using the Monte Carlo Damage Simulator (MCDS), the probability of a correct DNA repair with the Monte Carlo Excision Repair (MCER) and the effects of radiation on cell kinetics through the Virtual Cell Radiobiology algorithm (VC) after irradiation with the above particles. The results obtained in this dissertation conclusion that the α particles of 223Ra, as well as the β-particles emitted by radioisotopes 177Lu and 170Tm, have the highest ability to induce cell death from all radioisotopes investigated. On the other hand the fraction of cell survival after irradiation is greater with 89Sr and 153Sm, the xvi Índice de Tabelas TABELA 1. EXEMPLOS DE GENES IMPORTANTES NO PROCESSO DE CARCINOGÉNESE CELULAR. ...............................................18 TABELA 2. CARATERIZAÇÃO TEMPORAL DOS PRINCIPAIS EFEITOS DA RADIAÇÃO NO TECIDO ALVO. ........................................29 TABELA 3. QUANTIFICAÇÃO DE DIFERENTES EVENTOS E EFEITOS BIOLÓGICOS APÓS A IRRADIAÇÃO COM 1 GY DE DIFERENTE QUALIDADE NUMA CÉLULA DE MAMÍFEROS. ...................................................................................................................35 TABELA 4. PRINCIPAIS PARÂMETROS CINÉTICOS DE DIFERENTES FENÓTIPOS DAS CÉLULAS DA PRÓSTATA. .............................61 TABELA 5. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS RADIOISÓTOPOS ATUALMENTE EM USO CLÍNICO OU SOB INVESTIGAÇÃO PARA TERAPIA PALIATIVA DAS METÁSTASES ÓSSEAS. ...............................................................................................................71 TABELA 6. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DO DECAIMENTO RADIOATIVO DO 32P. ...............................73 TABELA 7. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 89SR. ........................74 TABELA 8. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 90Y. ..........................76 TABELA 9. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 117MSN. .77 TABELA 10. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 153SM. 79 TABELA 11. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 166HO. 81 TABELA 12. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 170TM. 82 TABELA 13. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 177LU. .84 TABELA 14: SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 186RE. .86 TABELA 15. SUMÁRIO DAS PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 188RE. .88 TABELA 16. SUMÁRIO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICAS DOS PRINCIPAIS DECAIMENTOS RADIOATIVOS DO 223RA. ...................89 TABELA 17. SUMÁRIO DOS RESULTADOS CLÍNICOS DOS TRATAMENTOS PALIATIVOS DAS METÁSTASES ÓSSEAS COM DIFERENTES RADIOFÁRMACOS.........................................................................................................................................93 TABELA 18. CLASSIFICAÇÃO DAS DIFERENTES QUEBRAS DO ADN ......................................................................................... 101 TABELA 19. COMPARAÇÃO DE RESULTADOS OBTIDOS COM O MCDS COM OS VALORES TEÓRICOS ESPERADOS PARA DIFERENTES ESPECTROS DE DANOS. ............................................................................................................................. 104 TABELA 20. CONDIÇÕES DE INPUT SIMULADORES MCDS E MCER. .................................................................................... 122 TABELA 21. CONDIÇÕES DE INPUT COMUNS DO SIMULADOR VC. ........................................................................................ 123 TABELA 22. CONDIÇÕES ESPECÍFICAS DE INPUT UTILIZADAS NO SIMULADOR VC. ................................................................ 124 TABELA 23. PROBABILIDADE DE CONTROLO TUMORAL APÓS IRRADIAÇÃO COM 223RA. ...................................................... 139 xvii Lista de Abreviaturas α – Alfa β – Beta 117mSn – Estanho-117m 153Sm – Samário-153 166Ho – Hólmio-166 170Tm – Túlio-170 177Lu – Lutécio-177 186Re – Rénio-186 188Re – Rénio-188 223Ra – Rádio-223 32P – Fósforo-32 89Sr – Estrôncio-89 90Y – Ítrio-90 ADN – Ácido Desoxirribonucleico AIF – Fator Indutor de Apoptose AP – Apurínico ARN – Ácido Ribonucleico BAP – Fosfatase Alcalina Especifica do Osso BER – Reparação por Excisão de Bases bFGF – Fator de Crescimento Básico dos Fibroblastos BMPs – Proteínas Morfogenéticas do Osso bp – Pares de Base BSP – Sialoproteína Óssea CDKIs – Inibidores de Quinases Dependentes de Ciclina CDKs – Quinases Dependentes de Ciclina CT – Tomografia Computacional DOTA – 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-ácido tetra-acético DOTMP – Ácido Tetra-Azaciclo-Dodecano Tetra-Metileno-Fosfónico DPD – Deoxipiridinolina xviii DSB – Quebra Dupla (Double Strand Break) DTPA – Ácido Dietileno-Triamina-Pentacético EDTMP – Ácido Tetra-Metilfosfonico-Etilenodiamina EMA – Agencia Europeia de Medicamentos EMC – Matriz Extracelular FDA – Agencia Americana de Controlo de Alimentação e Drogas FDG – Fluorodeoxiglucose GF – Fração celular em crescimento HEDP – Hidroxietileno Difosfonato ICRU – Comissão Internacional de Unidades de Radiação IGF – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina KD – Taxa de Morte Celular KP – Percentagem de proliferação LET – Transferência Linear de Energia LPL – Modelo Linear Letal - Potencialmente Letal LQ – Linear quadrático MCDS – Monte Carlo Damage Simulator MCER – Monte Carlo Excision Repair MDP – Metildifosfato MMR – Reparação por Erro de Emparelhamento MRI – Imagem por Ressonância Magnética NER – Reparação por Excisão de Nucleótidos NHEJ – Recombinação Não-Homóloga OER – Razão de Enriquecimento em Oxigénio OPG – Osteoprotegrina PDTMP - Ácido 1,2-Propileno-Diamino-Tetrametil-1-Enefosfórico PET – Tomografia de Emissão de Positrões PSA – Antigénio Especifico da Próstata PTHrP – Proteína Relacionada com a Hormona Tiroideia PYD – Piridinolina PYP – Pirofosfato de Sódio RANKL – Ligante Receptor-Ativador do Fator Nuclear kβ xix RBE – Eficiência Biológica Relativa RMR – Modelo Linear Reparação - Não Reparação SSB – Quebra Simples (Single Strand Break) TC – Tempo de ciclo celular TD – Tempo de duplicação do volume tumoral TGF-β – Fator de Transformação do Crescimento Beta TLK – Modelo Cinético de Duas Lesões Tpot – Tempo potencial de duplicação do volume tumoral TTF – Transferase Termina VC – Virtual Cell VEGF-A – Fator de Crescimento Vascular Endotelial A Capítulo 1 INTRODUÇÃO E ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO 3 1.1 INTRODUÇÃO As metástases ósseas são uma das mais importantes complicações associadas ao desenvolvimento e proliferação de células tumorais malignas. Estas são também um dos maiores problemas que um doente com cancro pode experienciar, sendo que cerca de 80-100% dos doentes que morrem de cancro da próstata, mama e pulmão possuem metástases ósseas. De entre esses doentes, mais de 75% experienciam dores ósseas incapacitantes e cerca de 50% desses reportam analgesia inadequada.1 O cancro da próstata é o segundo cancro mais frequente no homem em todo o mundo e estima-se que cerca de 65-75% dos doentes com este tumor maligno desenvolvem metástases ósseas.2 O alívio dos sintomas induzidos pelas metástases ósseas pode ser conseguido por via de tratamentos de radiação externa, com taxas de sucesso a rondar os 80%. Contudo com o uso dessa modalidade de irradiação corporal externa, todos os tecidos no campo de irradiação estão expostos a elevados níveis de radiação, o que pode causar efeitos secundários consideráveis, em particular para os tecidos saudáveis que se encontram à volta do tecido tumoral. Por sua vez a terapia com recurso a radiofármacos é menos invasiva, tipicamente melhor tolerada e produz resultados no alívio da dor de forma semelhante. Contudo, são necessários estudos para investigar, nomeadamente, quais as melhores vias de administração, doses, frequência de administração e radioisótopos que garantam a otimização da captação do radiofármaco pelo tecido alvo. Atualmente, a seleção do radioisótopo a utilizar na terapia paliativa de metástases ósseas é geralmente realizada com base na facilidade de aceso e custo do mesmo e não pela sua real eficiência terapêutica. Vários estudos tem vindo a ser realizados com o intuito de aumentar o número de radiofármacos existentes para o tratamento paliativo das metástases ósseas, contudo, até à data, estudos comparativos que investigam todos os radioisótopos no mesmo cenário radiobiológico são limitados ou inexistentes. Esta Dissertação apresenta os resultados de um estudo comparativo dos diferentes radioisótopos com potencial terapêutico no contexto da terapia paliativa das metástases ósseas obtidos com recurso a simuladores computacionais, retirando partido do fato dos simuladores computacionais apresentarem um baixo custo e 4 uma maior rapidez na obtenção dos resultados que as análises realizadas em culturas celulares. Através do estudo das lesões na estrutura do ADN de uma célula irradiada é possível determinar a probabilidade desta subsequentemente ser conduzida à morte celular, nomeadamente por via da apoptose. Nesta Dissertação simula-se as lesões no ADN provocadas pela radiação pelo uso de simulador Monte Carlo Damage Simulator (MCDS). Para além disso, o simulador Monte Carlo Excision Repair (MCER) é utilizado neste trabalho para simular o rendimento de cada mecanismo de reparação celular intrínseco e por último o simulador Virtual Cell (VC) é utilizado para simular a eficiência radiobiológica da radiação numa população celular. Nesta Dissertação, as populações celulares em estudo são células saudáveis da próstata em comparação com células com perfil neoplásico e células metastáticas. 1.2 OBJECTIVOS Estudos e publicações recentes documentam o interesse da terapia com recurso a radiação, com múltiplas aplicações na área oncológica, constituindo assim um tema de particular interesse nos dias de hoje. Neste sentido, estudos radiobiológicos, como o que se realiza na presente Dissertação, são absolutamente pertinentes e necessários para de uma forma simples e económica melhor se caracterize a natureza dos efeitos produzidos pelos diferentes radioisótopos em diferentes cenários radiobiológicos, bem como o seu potencial terapêutico, para melhor desenhar, planificar e realizar o tratamento paliativo de metástases ósseas. Assim, com esta Dissertação “Avaliação e Caraterização por Métodos Computacionais de Diferentes Radioisótopos no Contexto da Terapia Paliativa de Metástases Ósseas ”, espera-se contribuir para um maior conhecimento científico sobre:  A avaliação dos efeitos radiobiológicos das principais emissões de cada radioisótopo para terapia paliativa de metástases ósseas em vários cenários de irradiação; 5  A análise comparativa de onze radioisótopos para terapia paliativa das metástases ósseas no contexto do cancro da próstata, nas mesmas condições experimentais;  O eventual potencial terapêutico de cada radioisótopo estudado, nomeadamente através da análise dos efeitos radiobiológicos produzidos pelas principais emissões de cada um. Por outro lado, esta Dissertação pretende ser um documento conciso do estado da ciência no que refere a radioisótopos e radiofármacos atualmente em uso na prática clínica e sob investigação para o tratamento paliativo de metástases ósseas. 1.3 ESTRUTURA Pretendeu-se organizar a presente Dissertação de forma autónoma e independente para facilitar o acesso aos diversos temas abordados e estruturados em sete capítulos. Assim, descreve-se de seguida sucintamente o tema central de cada um dos restantes seis capítulos:  Capítulo 2: Ciclo Celular, Carcinogénese e Radiobiologia Celular Neste capítulo realiza-se uma descrição global, dos principais conceitos do ciclo celular, bem como a relação deste com a morte celular programada. Descrevese ainda os mecanismos de reparação intrínsecos da célula em resposta a alterações na estrutura do ADN e ainda o processo carcinogénico. São também abordados neste capítulo as noções básicas de radiobiologia celular, nomeadamente, sobrevida celular, resposta celular à irradiação e efeitos diretos e indiretos da radiação. Este capítulo reveste-se de capital importância pois para a compreensão do restante documento é essencial que se compreenda os princípios associados ao funcionamento do ciclo celular, do processo de carcinogénese e da radiobiologia. 12 normalidade, serão geneticamente idênticas à célula-mãe. Por sua vez, estas célulasfilhas podem tornar-se células-mães da geração seguinte. Assim, a vida de uma célula começa quando esta surge a partir da célula-mãe e acaba, quando ela própria se divide para originar duas células-filha. O conjunto de transformações e processos que decorrem desde a formação da célula até ao momento em que ela própria se divide constitui um processo dinâmico e continuo, denominado ciclo celular. Durante a divisão celular, os organelos, as enzimas e outros constituintes da célula são distribuídos de igual modo pelas células-filha. O ADN é exatamente autoduplicado e as cópias rigorosamente divididas. É esta fidelidade na duplicação e na distribuição do material genético pelas células-filha que assegura a continuidade genética. Todo o procedimento do ciclo celular é controlado por diversas proteínas e enzimas que além de garantirem a ausência de erros, asseguram a coordenação da cinética do ciclo, isto é, a duração de cada fase específica do processo e o tempo total necessário para que todo o processo ocorra. Uma mutação numa proteína ou enzima de controlo pode ter consequências significativas na cinética celular. Por exemplo, as células carcinogénicas, em geral, têm uma duração do ciclo celular muito inferior às células normais, devido a alterações em genes elementares no controlo do ciclo celular, designados por oncogenes ou supressores tumorais. O ciclo celular é dividido em 4 fases distintas: fase G1, fase S, fase G2 e fase mitótica ou M. A duração de cada fase varia para cada tipo de célula, contudo os processos ocorridos em cada fase são idênticos para todas as células. O ciclo celular visa assegurar que o ADN de uma dada célula é fielmente replicado durante a fase S e posteriormente igualmente dividido na fase M.  Fase G1 Nesta fase, ocorrem os processos de preparação para a síntese de ADN, por via da mobilização de bases púricas e pirimídicas, dos fosfatos e das riboses, para a síntese de nucleótidos. Para além disso, nesta fase são também mobilizados aminoácidos para a síntese de proteínas e enzimas. Esta fase caracteriza-se por uma intensa atividade biosintética, nomeadamente, proteínas, enzimas e ácido ribonucleico (ARN). Ocorre ainda a formação de organelos celulares e subsequente 13 crescimento da célula. Estes processos de biossíntese são indispensáveis para que a célula passe da fase G1 para a fase S.  Fase S Nesta fase, o ADN é inteiramente duplicado, sendo que as novas moléculas associam-se às respetivas proteínas e a partir desse momento cada cromossoma passa a ser constituído por dois cromatídeos ligados pelo centrómero. Ao nível do citoplasma de células animais, ocorre ainda a duplicação de feixes curtos de microtúbulos, denominados centríolos, que se encontram localizados no citoplasma de células eucariontes.  Fase G2 Durante esta etapa são produzidas as moléculas que serão necessárias durante a Fase M, ocorrendo também a um avaliação para comprovar que a replicação do ADN ocorreu na ausência de erros.  Fase mitótica ou M A fase mitótica é comummente dividida em duas etapas principais: a mitose, que corresponde à divisão do núcleo, e a citocinese, que corresponde à divisão do citoplasma. A mitose, embora seja um processo contínuo, é convencionalmente subdividida em prófase, metáfase, anáfase e telófase. A prófase é, de um modo geral, a etapa mais longa da mitose. Nesta fase, sucede a condensação dos cromossomas, tornando-se mais espessos e curtos, e os dois centríolos começam a afastar-se em sentidos opostos, formando-se o fuso acromático. Na metáfase os cromossomas atingem o máximo de encurtamento, o fuso acromático fica completo e os centríolos atingem os pólos da célula. Para além disso, os cromossomas orientam-se com os centrómeros no plano equatorial, voltados com as terminações para o exterior. Durante a anáfase surge a clivagem dos centrómeros, separando-se os dois cromatídeos que passam a constituir dois cromossomas independentes. Durante esta fase ocorre a ascensão dos cromossomas filhos aos polos da célula. Por ultimo, na telófase, a membrana nuclear reorganiza-se em torno dos cromossomas de cada célula-filha, o fuso mitótico é degradado e os cromossomas descondensam, 14 terminado assim a mitose. A citocinese carateriza-se pela divisão do citoplasma e consequente individualização de cada célula-filha. Este processo começa a ser preparado durante a fase final da mitose com a formação do anel contráctil de filamentos proteicos. Durante a citocinese estes filamentos contraem-se e puxam a membrana celular para o interior da célula, causando um sulco de clivagem, que vai lentamente estrangulando o citoplasma até separar as células-filha.3 A passagem da célula de uma fase do ciclo celular para a seguinte é firmemente regulado por um conjunto de controlos que regulam a transcrição dos genes das ciclinas, a degradação das ciclinas e a modificação da subunidade das quinases pela fosforização. Um conjunto de mecanismos de feedback positivos e negativos contribui para o controlo do ciclo celular. O controlo do ciclo celular é maioritariamente regulado pelas quinases dependentes da ciclina (CDKs - cyclin dependent kinases) e pelos inibidores das quinases dependentes da ciclina (CDKIs - cyclin dependent kinase inhibitors), que estão presentes durante todo o ciclo celular. De uma forma geral, os complexos CDKs e as ciclinas são reguladores positivos e aceleram a progressão das células no ciclo celular, enquanto os CDKIs impedem/travam a progressão das células no ciclo celular. O complexo CDK, quando ativado, induz a ativação ou inativação de várias proteínas, por via da fosforilação, necessárias à progressão da célula no ciclo celular. Nas células dos mamíferos, subunidades de quinases (CDK4, CDK6, CDK2 e CDK1), juntamente com ciclinas (cyclin D, E, A, e B), são expressas conforme a célula avança da fase G1 até à fase M.4 Por exemplo, o complexo CDK4 e CDK6 com a ciclina D atuam na parte inicial da fase G1, provavelmente em resposta a fatores de crescimento. Por outro lado, os complexos CDK2 ligados à ciclina E ou A são essenciais à transição entre a fase G1 e S, bem como à replicação do DNA. Finalmente, o complexo CDK2 ligado à ciclina A ou B é essencial para a mitose. Existem dois grupos de CDKIs: (1) CDKIs membros da família INK, que incluem, INK4A (p16), INK4B (p15), INK4C (p18) e INK4D (p19), os quais exercem a sua capacidade inibitória por via da ligação à CDK4 e CDK6, prevenindo assim a sua ligação a ciclina D; e (2) CDKIs membros da família CIP/KIP, que incluem, CIP1 (p21), KIP1 (p27) e KIP2 (p57). A CIP1, por exemplo, é um dos efetores mais importantes do 15 p53, que é uma proteína supressora tumoral importante nos pontos de avaliação do ADN.4 Uma representação esquemática das principais atividades das CDKs e das CDKIs é apresentada na Figura 1. Figura 1: Esquema das diferentes fases do ciclo celular e principais processos de regulação e progressão do mesmo por via de diversos complexos de CDK e CDKI. Adaptado de Stewart e Kleihues, 2003.5 Como referido acima, uma importante proteína no controlo do ciclo celular é a p53, a qual quando ligada ao ADN, ativa a transcrição da proteína p21, que subsequentemente impede a ativação de uma CDK necessária para a progressão na fase G1. Este bloqueio permite à célula ter tempo suficiente para reparar os danos de ADN antes da replicação do mesmo, ou, caso tal não seja possível porque o ADN apresenta lesões muito extensas que não podem ser reparadas, possibilita a iniciação do processo de morte celular programada. Outras proteínas que interrompem o ciclo celular através da inibição de CDKs são o p16 e o RB. Devido ao seu papel fundamental no controlo do ciclo celular, mutações nos genes que produzem estas proteínas têm sido identificadas como uma característica comum ao aparecimento de cancros, pelo que esses genes são denominados de genes supressores tumorais.5 16 Durante o ciclo celular existem etapas de avaliação interna que determinam a progressão ou interrupção do ciclo celular, designados por checkpoints. O checkpoint 1 ocorre no final da fase G1 e o checkpoint 2 ocorre no final a fase G2. Estes checkpoints são controlados por uma série de CDKs.6 Se o resultado da avaliação for negativo, as células param o seu processo de divisão e permanecem num período prolongado de repouso, denominado fase G0, por tempo indeterminado ou até à sua morte. Nesta fase G0, as células apresentam uma menor atividade metabólica e não respondem aos estímulos que normalmente iniciam a síntese de ADN. Se pelo contrário, a avaliação efetuada for positiva, as células prosseguem para a fase seguinte do ciclo celular. A duração das subfases do ciclo celular varia com o tipo de célula animal ou vegetal, tipo de tecido e com o estado de desenvolvimento do organismo. Tipicamente o tempo de duplicação celular humana varia entre 10 a 40 horas com a fase G1 a durar 30%, a fase S 50%, a fase G2 15% e a mitose 5% do tempo do ciclo celular.7 2.3 CARCINOGÉNESE As células cancerosas proliferam, tornando-se geralmente em massas altamente desorganizadas, e todo o seu processo de crescimento e divisão é desregulado. Existem essencialmente seis alterações na estrutura e biologia celular que caraterizam o crescimento e proliferação celulares malignos. Estas alterações estão presentes em todos os tipos de cancro e incluem: (1) sinalização autossuficiente de desenvolvimento; (2) insensibilidade aos inibidores de crescimento; (3) evasão à apoptose; (4) potencial replicativo ilimitado; (5) vascularização muito sustentada; e (6) invasão tecidular e metástases. A instabilidade genómica, resultante do crescimento mutagénico desregulado, é considerado o principal fator para a manifestação destas alterações celulares.4 Atendendo aos eventos supranumerados, o cancro pode ser definido como uma doença onde um grupo anormal de células cresce incontrolavelmente. As células normais estão constantemente sujeitas a um conjunto de estímulos que ditam se estas se devem dividir, diferenciar ou morrer. Contrariamente, as células 17 tumorais desenvolvem um grau de autonomia em relação a esses estímulos, devido a alterações a nível do genoma celular que se observam nas células tumorais em comparação com as células normais. Estas mutações produzem proteínas que comprometem o equilíbrio entre a divisão celular, quiescência e morte celular, resultando em células que entram em divisão desregulada. Para além disso, em contraste com as células normais, as células cancerosas conseguem invadir e proliferar noutros tecidos que não os seus de origem. Assim, o crescimento sem controlo e a proliferação noutros tecidos são característicos que distinguem as células cancerosas das células normais. O processo de conversão de uma célula normal para uma célula cancerosa é dividido em três fases principais: iniciação, promoção e progressão. Durante a fase de iniciação da carcinogénese, uma alteração permanente no genoma da célula garante-lhe uma vantagem no crescimento em relação as células vizinhas. A maioria das mutações iniciais ocorrem em genes supressores tumorais ou em protooncogenes. Os proto-oncogenes codificam uma vasta gama de fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento, enzimas ou fatores de transcrição que promovem o crescimento ou divisão celular (Tabela 1). Versões mutadas de proto-oncogenes que promovem a proliferação de células anormais são designados por oncogenes. Os oncogenes ativam as cascatas de sinalização continuamente, resultando num aumento da produção de fatores de crescimento que estimula os crescimento celular. Por exemplo, o myc é um proto-oncogene que atua como fator de transcrição. Uma versão mutada do myc converte-o num oncogene associado a 70% dos cancros. Outro oncogene é o ras que normalmente funciona como um interruptor das cascatas de sinalização. Uma mutação no ras causa a abertura permanente da via de sinalização, levando a um crescimento celular descontrolado. Cerca de 30% dos tumores apresentam uma mutação no ras, incluindo os carcinomas do pâncreas, tiroide, cólon e pulmões. Por sua vez os genes supressores tumorais evitam a carcinogénese e inibem o crescimento celular, pelo que, a perda destes genes facilita o desenvolvimento tumoral.6 As proteínas codificadas pelos genes supressores tumorais atuam, geralmente, ao nível da membrana celular, do citoplasma ou do núcleo. O RB e o p53 são supressores tumorais mais conhecidos. O p53 é o gene supressor tumoral mais comummente 18 relacionado com os cancros e o mais amplamente investigado, é um importante fator nos períodos de avaliação do ciclo celular. Conforme referido anteriormente, uma das suas funções em resposta a danos genotoxicos, é atrasar a progressão da célula no ciclo celular numa tentativa de reparar os dados antes da replicação.6 Na maioria das células, o p53 induz a apoptose quando expresso em excesso e é necessário para iniciar o mecanismo de morte celular programada em resposta de lesões no ADN. Apesar de uma vasta gama de oncogenes, os dados apontam para que uma percentagem significativa dos processos de carcinogénese assente principalmente em 2 supressores tumorais, o RB e o p53, sendo as mutações mais presentes nas células tumorais.6 Por exemplo, alterações nestes genes são encontradas em aproximadamente 70% dos cancros do cólon e em 50% dos cancros da mama e pulmão 4. Tabela 1. Exemplos de genes importantes no processo de carcinogénese celular.2,6 Designação Função/Descrição Tipo de gene APC Regulação da transcrição de genes Supressor tumoral BCL2 Estimulação da angiogénese Oncogene BRA1 Controlo do ciclo celular Supressor tumoral BRA2 Reparação do ADN Supressor tumoral HER2 Recepção de fatores de crescimento Oncogene myc Regulação da interação entre biomoléculas Oncogene p16 e p21 Inibição de quinases Supressor tumoral p53 Regulação da apoptose Supressor tumoral ras Sinalização da cascata do ciclo celular Oncogene RB Regulação do ciclo celular Supressor tumoral SIS Fator de crescimento Oncogene A segunda etapa do processo de carcinogénese, isto é, a promoção, estimula o crescimento da célula que sofreu mutação, podendo ocorrer a qualquer momento, 19 após a transformação celular inicial. Os fatores de promoção podem ser, por exemplo, agentes químicos, processos inflamatórios ou fatores que atuam no crescimento celular normal. Os agentes promotores atuam através da ativação de componentes da cascata de sinalização intracelular ou do aumento de níveis de Ca2+ e da produção de enzimas no interior da célula. Na terceira etapa da carcinogénese, isto é, a progressão, as células mutadas, que possuem vantagem no desenvolvimento e divisão celular, sofrem novamente mais danos. A exposição contínua aos agentes carcinogénicos e promotores fazem com que mais lesões apareçam de forma inevitável. Caso estas mutações afetem a capacidade proliferativa e diferencial da célula, então as células mutadas podem tornar-se suficientemente malignas para desencadear o aparecimento de um tumor. O processo de carcinogénese pode iniciar-se de forma espontânea ou ser provocada por ação de agentes ditos carcinogénicos, os quais podem ser agentes químicos, físicos ou biológicos. Em ambos os casos, verifica-se a indução de alterações mutagénicas ou epigenéticas nas células. Estudos têm vindo a demonstrar que a carcinogénese está frequentemente associada a mutações e anomalias na expressão de várias ciclinas, CDKs e CDKIs. De facto, a expressão aumentada da ciclina D é uma das anomalias mais frequentes no cancro, ocorrendo em cerca de 60% dos casos de cancro da mama e 20% dos casos de cancro da próstata.4 Similarmente, mutações ou deleções no gene da INK4A são frequentemente encontradas em várias células malignas ou transformadas humanas, sugerindo que a inativação da INK4A promove uma vantagem seletiva no crescimento celular. 2.4 MORTE CELULAR PROGRAMADA A apoptose é um mecanismo de morte celular programada e carateriza-se por ocorrer de forma controlada, não infligindo, por isso, danos às células vizinhas. A morte celular por apoptose ocorre em múltiplas situações fisiológicas normais e problemas na regulação da apoptose podem conduzir ao aparecimento de inúmeras situações patológicas, nomeadamente cancro.3 O processo apoptótico desencadeia-se quando as células recebem um sinal ou estimulo para entrarem em apoptose. Aquando da recepção desse sinal ou 20 estímulo, as células iniciam um vasto conjunto de alterações que culmina na morte da célula. Uma família de proteínas denominada caspases é tipicamente ativada nas fases iniciais do processo, sendo responsável pela degradação de componentes celulares fundamentais para o funcionamento celular normal, incluindo enzimas responsáveis pela reparação do ADN. Por outro lado, as caspases podem ainda ativar enzimas destruidoras, tais como, ADNases, que iniciam a quebra do ADN. A sensibilidade da célula face a um estímulo apoptótico depende de um número de fatores, tais como, a expressão de proteínas indutoras e anti-apoptóticas, a intensidade do estímulo e o estádio do ciclo celular. A relação entre o ciclo celular e a apoptose é mediada por diversos genes e proteínas, nomeadamente, c-Myc, p53, Rb, ras, PKA, PKC, Bcl-2, NF-kB, CDK, ciclinas e CDKI. Pelo que, estas proteínas podem induzir proliferação celular, interrupção do ciclo celular ou morte celular programada. Os componentes do processo apoptótico podem ser divididos em duas grandes partes, os sensores de sinais apoptóticos e os componentes efetores da apoptose. Os sensores apoptóticos monitorizam o ambiente interno e externo da célula para detetar alterações nas condições ambientais que possam influenciar o destino da célula (sobreviver, dividir ou morrer). Estes sensores estão intimamente ligados aos componentes executantes ou efetores, que têm a tarefa de iniciar o processo. A apoptose pode ser desencadeada por estímulos extrínsecos, através da ligação de indutores de apoptose a receptores da membrana celular, denominados recetores de morte celular. Sinais ou estímulos apoptóticos externos incluem a exposição a toxinas e certas hormonas. Por outro lado, a apoptose pode ser induzida por sinais intrínsecos que produzem stresse celular, devido à exposição à radiação, a químicos ou a vírus, bem como por uma privação de fatores de crescimento ou stresse oxidativo induzido pela formação de radicais livres. Lesões no ADN e ativação do p53 são eventos iniciais intrínsecos da indução da apoptose. Para além disso, estímulos apoptóticos que atuam a nível das mitocôndrias, provocam uma variedade de alterações nestas, incluindo a produção de radicais livres e a abertura dos poros membranares. Estes eventos levam a libertação de fatores apoptóticos como o citocromo C e o fator indutor de apoptose (AIF, apoptosis-inducing factor).8 A 21 resposta celular aos estímulos apoptóticos é fortemente influenciada pela informação genética existente, o microambiente, a extensão de dano no ADN e a concentração de diferentes proteínas.6 O equilíbrio entre um processo apoptótico eficaz ou deficiente pode ser um fator crítico para o desencadear e subsequente desenvolvimento do processo de carcinogénese. Defeitos no processo de apoptose pode permitir a sobrevivência de células neoplásicas. Por exemplo, estudos têm demonstrado que o crescimento tumoral em resposta a carcinogénicos químicos está diretamente ligado às alterações nas taxas de apoptose no tecido afetado.5 As células tumorais podem evitar a apoptose de várias formas, sendo que a forma mais comum envolve a mutação do gene supressor tumoral p53. Dado que o p53 é um avaliador das lesões de ADN da célula, responsável pelos mecanismos de reparação ou apoptose em resposta aos danos, a sua mutação terá consequências no desenvolvimento de tumores. A célula em apoptose apresenta uma morfologia distinta e caraterística, que tem início com a redução do volume celular devido à destruição dos filamentos de actina e lâminas do citoesqueleto. Posteriormente ocorre a quebra da cromatina no núcleo que conduz frequentemente à condensação nuclear e, muitas vezes, o núcleo celular adquire uma aparência em ferradura. De seguida verifica-se uma contínua redução do volume celular, de forma a permitir a posterior remoção dos restos celulares pelos macrófagos. Na fase final da apoptose surgem pequenas esferas membranares, que formam vesículas, denominados corpos apoptóticos. Estas alterações morfológicas são comuns a todas as células em apoptose explícita, independentemente do agente indutor do processo.3 Contrariamente, à apoptose, a morte celular por necrose é caraterizada, morfologicamente, por um aumento do volume citoplasmático e mitocondrial, seguido da ruptura da membrana plasmática e extravasamento do conteúdo celular, induzindo deste modo uma resposta inflamatória, que pode causar dano e, por vezes até morte às células vizinhas. Deste modo, quando a morte celular ocorre por via da necrose, um grande número de células é afetado e lesado durante o processo inflamatório. Em oposição ao processo de retração celular observada aquando do processo apoptótico, na necrose observa- 28 de origem até reagirem com uma molécula orgânica.10,13 Assim, de uma forma geral, quando a radiação ionizante interage com o material biológico, principalmente o ADN, provoca alterações na sua estrutura num curto espaço de tempo, entre 10-3 e 10-5 segundos, estimulando a quebras de ligações químicas do ADN. Contudo, os efeitos biológicos de tal lesão surgem tardiamente, após um período de latência que pode demorar desde algumas horas até vários anos. Como consequência dos danos no ADN a célula pode sofrer uma mutação, entrar em apoptose ou tornar-se numa célula carcinogénea.13 Um dos fenómenos biológicos observado após a irradiação de células é o efeito bystander, isto é, numa população de células em que apenas algumas são atingidas pela radiação, as células diretamente irradiadas enviam sinais às células vizinhas para que estas respondam ao stresse oxidativo. A resposta pode ser, por exemplo, através do aumento da ocorrência de mutações e instabilidade genética, indução da apoptose e sequestro das células na fase G0. Caso a morte celular seja o destino final da célula irradiada, esta pode ocorrer dentro de algumas horas, isto é, efeitos precoces da radiação. Contudo, se o dano for oncogénico, a sua expressão pode ser adiada durante anos, isto é, efeito tardio da radiação. Figura 5: Evolução temporal dos efeitos resultantes da deposição da radiação ionizante nas células. Adaptado de Klein 2009.14 29 Tabela 2. Caraterização temporal dos principais efeitos da radiação no tecido alvo.13 Fase Tempo Evento Fase Física 10-18 s Partícula atravessa a molécula 10-15 s Ionização 10-14 s Excitação (vibração e dissociação molecular) Fase Química 10-12 s Dissociação dos radicais livres 10-10 s Radicais livres reagem com o soluto 10-8 s Formação de produtos moleculares 10-5 s Conclusão das reações químicas Fase Bioquímica 1s - 1h Reações enzimáticas e processos de reparação Fase Biológica 1h - 10 anos Morte celular ou carcinogénese 2.5.3 TIPOS DE DANOS CELULARES RADIOINDUZIDOS As células expressam os danos radioinduzidos aquando da sua divisão e multiplicação. Lesões que provocam aberrações cromossómicas e mutações genéticas nas células podem levar à morte celular, inibição da divisão celular ou a transformações malignas. Estas alterações celulares podem ter como consequências finais a alteração da função tecidular, morte tecidular ou indução de cancro. Suntharalingam e colegas em 2002 classificaram os danos provocados pela radiação em células de mamíferos em três grandes grupos: 15  Danos letais: os quais são irreversíveis, conduzindo à morte da célula;  Danos subletais: podem ser reparados em algumas horas exceto se outros danos subletais forem adicionados durante a reparação celular, o que conduzirá ao aparecimento de um dano letal;  Danos potencialmente letais: podem ser processados pelos mecanismos de reparação quando as células são retidas no estádio G0. Como consequência dos danos provocados pela radiação, a célula experienciar nove possíveis destinos finais:15 30  Ausência de efeito;  Atraso na divisão: célula fica retida no estádio G0;  Apoptose: a célula morre antes ou após a divisão por fragmentação em pequenos corpos, que são posteriormente absorvidos;  Falha reprodutiva: a célula morre na tentativa de executar mitose;  Instabilidade genómica: carateriza-se por um atraso da falha reprodutiva como resultado da introdução de instabilidade genómica;  Mutação: a célula sobrevive, mas está mutada;  Transformações: a célula sobrevive, mas a mutação leva a alterações de fenótipo e possibilidade de carcinogénese;  Efeito bystander: a célula irradiada envia sinais às células vizinhas não irradiadas, induzindo danos genéticos nas mesmas;  Resposta adaptativa: a célula irradiada é estimulada para reagir e tornar-se mais resistentes à radiação. A interação de radiação ionizante com o material biológico provoca uma cascata de eventos nefastos para a estrutura e função do material em causa. Quando a radiação interage diretamente com enzimas, alterações da estrutura terciária ou disrupção das ligações químicas das enzimas podem ocorrer, levando à inibição da atividade enzimática ou a alterações do metabolismo celular. Por sua vez, se a radiação interage diretamente com as membranas celulares pode ocorrer um aumento da permeabilidade aos iões, resultando em potenciais alterações da composição intracelular e extracelular da célula.3 Por outro lado, quando existe interação entre radiação e o ADN, um dos seguintes efeitos biológicos na estrutura do ADN podem ocorrer: (1) alteração das ligações entre as bases, devido a substituição de bases; adição de novas bases ou remoção de bases existentes; e substituição cruzada de bases; (2) quebras simples da cadeia de ADN (SSB, Single Strand Break); ou (3) quebras duplas da cadeia de ADN (DSB, Double Strand Break). Estes danos do ADN podem conduzir a alterações na função do mesmo, levando a uma das seguintes situações: inibição temporária ou permanente da síntese de ADN, síntese de ADN incorreto, inibição ou prevenção da mitose ou síntese de proteínas incorretas. 31 2.5.4 MECANISMOS DE REPARAÇÃO CELULAR Dependendo da energia depositada pela radiação ionizante na célula irradiada podem ocorrer quebras de apenas uma cadeia de ADN ou quebras nas duas cadeias de ADN (mencionadas anteriormente). Em termos biológicos as SSBs são tipicamente de fácil reparação, não apresentando assim grandes consequências celulares, a não ser em casos de reparação incorreta os quais podem conduzir ao aparecimento de uma mutação. Também as DSBs separadas por vários pares de bases são frequentemente facilmente reparados pelos mecanismos celulares. Porém as DSBs complexas, separadas por poucos pares de bases são uma das lesões mais tóxicas e mutagénicas nas células humanas, pelo que uma única DSB tem potencial para remover mais de 100 milhões de pares de base de informação genética.13 O número de lesões no ADN geradas pela radiação é elevado, mas o número de células que morrem devido às lesões do ADN é substancialmente mais reduzido. Tipicamente, o número de lesões induzidas no ADN por uma radiação de 1-2 Gy é aproximadamente de 1000 SSBs e 40 DSBs. Dados experimentais demonstram que as DSBs induzidas por radiações de baixo LET são tipicamente mais facilmente reparadas que as DSBs provocadas por radiações de alto LET, pelo que a obtenção de conhecimento relativo às interações e trajetos da radiação (track structure) na matéria tem vindo a ser utilizado para explicar as variações e diferentes distribuições das lesões no ADN.10 Existem múltiplos mecanismos enzimáticos de reparação do ADN nas células que atuam em diferentes tipos de lesões e que são capazes, em muitos casos, de conduzir a célula de volta ao seu estado inicial. Para as lesões DSBs, os principais mecanismos de reparação são a recombinação homóloga (Homologous Recombination) e a recombinação não-homóloga (Non-Homologous End Joining, NHEJ).16 A recombinação homóloga requer que parte do ADN não esteja danificado para servir como molde para síntese de novo ADN, sendo um mecanismo raro, sem erros, e que acontece essencialmente após a replicação, na fase final do estádio S e G2 do ciclo celular. Este tipo de reparação inicia-se com a ligação de um complexo proteico aos locais das lesões. De seguida ocorre a síntese dos nucleótidos em falta, de forma a criar um complexo cruzado entre as cadeias de ADN lesadas e normais, designado de junção de Holliday. Por último ocorre a quebra da junção Holliday, que 32 é o passo final no processo de reparação por recombinação homóloga. Por sue vez, a recombinação não-homóloga provoca lesões pré-mutagénicas, as quais podem ser letais no caso de aberrações em anel, dicêntricas ou pontes de anáfase; ou não-letais se forem pequenas deleções ou translocações simétricas. Este mecanismo opera na ponta do fragmento de ADN, após a identificação por parte da proteína Ku70/Ku80 do local da lesão. De seguida, a proteína de reparação liga-se à subunidade ADNproteína quinase (DNA-PK, DNA-protein-kinase), o qual promove uma reconexão dos fragmentos de ADN. Este mecanismo ocorre essencialmente na fase final do estádio G1 e fase S do ciclo celular.16 Existem mecanismos de reparação menos complexos que os descritos acima e que são utilizados principalmente nas quebras simples, como é o caso da reparação por excisão de bases (BER, Base Excision Repair), que permite corrigir problemas em bases individuais através da produção de um local AP (local apurínico ou apirimidínico); e reparação por excisão de nucleótidos (NER, Nucleotide Excision Repair), que corrige dímeros de timidina através da remoção de oligonucleótidos e reparação de erros de emparelhamento (MMR, Mismatch Repair).7 O mecanismo BER é um processo celular que repara lesões no ADN fora do ciclo celular (G0). É responsável primeiramente pela remoção de lesões pequenas e simples nas bases do genoma, que de outra forma poderiam causar mutações por reparações incorretas ou quebras na duplicação do ADN. O processo BER é iniciado pela glicosilase (DNA glycosylases), que reconhece e remove as bases lesadas ou alteradas da cadeia de ADN, formando locais AP. Estes locais são então clivados pela endonuclease AP (AP endonuclease). Subsequentemente, a quebra simples resultante pode então ser processada pelo denominado Short-patch BER (SP-BER), no qual um único nucleótido é substituído; ou pelo Long-patch BER (LP-BER), no qual são sintetizados 2-10 novos nucleótidos. Fatores como o tipo de lesão, a fase do ciclo celular e o grau de diferenciação da célula influencia a decisão celular na escolha entre reparação por SP-BER ou LP-BER. Por outro lado, o processo NER é um mecanismo de excisão importante que remove mutações resultantes da radiação, tais como dímeros de timidina. O reconhecimento da lesão leva à remoção de um pequeno segmento da cadeia de ADN que a contém. A cadeia de ADN sem lesão é utilizada pela ADN-polimerase como molde para a síntese da sequência 33 complementar em falta. Por fim, a ADN-ligase produz a ligação que completa o processo e origina a dupla cadeia de ADN reparada. A Figura 6, apresentada abaixo, sintetiza de forma simples os processos BER e NER que ocorrem em células dos mamíferos.17 Figura 6: Esquema dos mecanismos de reparação do ADN: (A) BER e (B) NER. Adaptado de Blakely, 1989.17 2.5.5 CURVAS DE SOBREVIDA E MODELOS DE RADIOBIOLOGIA CELULAR O procedimento padrão utilizado para medir a radiossensibilidade de uma população celular é a retenção da sua integridade reprodutiva. Este é referido como a sobrevida celular e percentagem de sobrevida após irradiação, assumindo que existe uma relação clara entre a morte celular programada, o crescimento celular e a sobrevivência celular para um vasto intervalo de doses. O tipo de radiação influencia a forma da curva de sobrevida celular, sendo que radiações densamente ionizantes apresentam curvas de sobrevida quase exponenciais face à dose absorvida, enquanto radiações pouco ionizantes 34 apresentam uma pequena diminuição inicial, seguida de uma região denominada em ombro e de um decréscimo constante para altas doses (Figura 7).3 As curvas de sobrevida são melhor expressas em gráficos semi-logarítmicos de sobrevivência celular versus dose de radiação. Figura 7: Curvas de sobrevida celular típica para radiação de alta LET e baixa LET: (a) primeiro modelo e (b) modelo atual.3 (α representa a inclinação inicial da curva e β a componente quadrática de morte celular para descrever o declive da sobrevida (S) com o aumento da dose (D)). A Tabela 3 apresenta um resumo da quantificação dos efeitos celulares determinados após irradiação com 1 Gy de radiação de diferente qualidade (baixo e alto LET). Estudos têm demonstrado que a taxa de sobrevivência celular é superior quando uma dose de radiação é administrada de forma fracionada num período superior a 2 horas, comparado com uma única dose de radiação. Esta variação na resposta celular à radiação pode ser atribuída aos diferentes tempos de reparações requeridos para o processamento das lesões subletais. Em geral, o período de reparação de metade das lesões subletais em células em cultura varia entre 0.5 a 1 hora, podendo este período de reparação ser maior em tecidos. Contudo, a reparação completa de lesões subletais em células em cultura pode demorar entre 6 a 8 horas (podendo também ser mais moroso em tecidos).7 Deste modo, pode-se concluir que existe uma velocidade máxima de reparação do dano, que é observada quando a lesão atinge níveis de saturação, análogo à cinética enzimática. Assim, a 35 reparação de danos celulares é menos bem-sucedida para irradiações de altas taxas de doses, apresentado maior sucesso para baixas taxas de doses. Para além disso, o sucesso crescente da sobrevivência celular a baixas doses ou com doses muito espaçadas no tempo é consistente com a importância dada ao tempo de reparação das lesões subletais.7 Tabela 3. Quantificação de diferentes eventos e efeitos biológicos após a irradiação com 1 Gy de diferente qualidade numa célula de mamíferos.13 Evento Baixo LET Alto LET Trajetórias no núcleo 1000 2 Ionizações no núcleo 100000 100000 Ionizações no ADN 1500 1500 Bases lesadas 104 104 SSBs 850 450 Crosslink de proteínas 150 - Aberrações cromossómicas 0-3 2-5 Aberrações completas 10% 45% Instabilidade cromossómica <10% 40% Inativação celular 30% 85% Sabe-se que o controlo tumoral depende da destruição das células germinativas tumorais, da percentagem destas células no tumor e do tamanho do tumor. Para um modelo simples, que assume que a resposta tumoral à radiação depende da resposta individual das células, a dose de radiação necessária para atingir o controlo tumoral depende unicamente da radiossensibilidade das células germinativas tumorais e do seu número. O mesmo princípio aplicado às curvas de sobrevida para as células do tumor possibilita estimar o valor de sobrevida celular após uma determinada dose de radiação, embora, devido à natureza aleatória das lesões provocadas pela radiação e à existência do efeito bystander, haverá uma flutuação de incerteza em volta desse valor.10 Deste modo, é possível desenvolver 36 um modelo teórico do controlo tumoral em função das curvas de sobrevida, expresso por uma relação sigmoidal. A posição da curva relativamente à dose vai depender do número de células germinativas e do declive da radiossensibilidade dessas mesmas células. É expectável que tumores de maiores dimensões necessitem de ser tratados com doses superiores que os de menores dimensões, sendo este efeito exacerbado por diferentes condições do microambiente que influenciam a radiossensibilidade celular, tais como a hipóxia. As primeiras aplicações de modelos de radiobiologia foram desenvolvidas em 1967 por Butts e Katz, que utilizaram a distribuição espacial de energia para mapear a resposta biológica de radiações de baixa LET.18 Estes modelos assentavam na extrapolação dos efeitos biológicos para altas taxas de dose utilizando dados de dose-resposta recolhidos. Desde então, os modelos de radiobiologia celular têm contribuído para a interpretação das relações dose-efeito, para o estudo das diferenças entre radiações de alta e baixa LET, para a quantificação das lesões no ADN e para a avaliação e classificação do espectro de lesões.19 O modelo mais utilizado na atualidade é o modelo linear-quadrático (LQ)20, o qual utiliza um polinómio de segunda ordem, em que as constantes α representa a inclinação inicial da curva e β a componente quadrática de morte celular para descrever o declive da sobrevida (S) com o aumento da dose (D): 𝑆 = 𝑒−(𝛼𝐷+𝛽𝐷2) A razão α/β fornece a dose para a qual os componentes quadráticos e lineares da morte celular são iguais.3,21 Outros modelos com importância na investigação em radiobiologia incluem o modelo cinético designado modelo linear reparação-não reparação (RMR, linear repair-misrepair)18,22 e o modelo leta-potencialmente letal (LPL, lethal-potentially lethal )20, que utilizam ambos um sistema de reparação de lesões baseado em equações diferenciais de segunda ordem e um sistema de equações de primeira ordem para a junção de lesões. O modelo cinético de duas-lesões (TLK, two-lesion kinetic)20 foi outro dos modelos radiobiológicos recentemente proposto e que postula uma associação direta entre os processos bioquímicos das lesões no ADN e a 37 morte celular. No modelo TLK, as DSBs são subdivididas em DSBs simples ou complexas. Como demonstrado acima, a resposta biológica das células após irradiação pode levar horas ou mesmo anos a ser observada. Por outro lado, o uso de modelos radiobiológicos possibilita o estudo e quantificação do espectro dos danos moleculares produzido por radiação de diferentes qualidades no genoma humano num curto espaço de tempo. Vários modelos radiobiológicos têm sido implementados em simuladores computacionais desenvolvidos com base no código Monte Carlo.19 O uso de modelos radiobiológicos e de simuladores computacionais, para além de possibilitarem o estudo dos danos biológicos radioinduzidos num curto espaço de tempo, permitem também a:  Interpretação e modelação da relação dose-efeito;  Estudo das diferenças entre radiações de baixo e alto LET;  Investigação dos efeitos relacionados com baixas doses;  Estudo do espectro de lesões no ADN;  Avaliação do conceito da lesão simples versos aglomerados de lesões;  Quantificação do número de lesões no ADN;  Desenvolvimento de modelos de aplicação. 2.6 IRRADIAÇÃO CELULAR E APOPTOSE A presente Dissertação versa sobre o estudo dos efeitos da irradiação do ADN celular e de diferentes tipos de células com radioisótopos e, conforme referido anteriormente, o processo apoptótico pode ser iniciado por sinais intrínsecos que induzem stresse celular devido à exposição à radiação. De facto, em 2001, Wang et al. concluíram que os padrões de resposta celular adotados pelas células quando sujeitas a irradiação com 89Sr, um dos isótopos mais utilizados clinicamente para terapia paliativa de metástases ósseas, incluíam morte celular por apoptose ou necrose dependendo da dose e concentração radioativa utilizadas. Estes autores verificaram que, quando a dose cumulativa absorvida pela célula era menor do que 2 Gy, com baixa concentração radioativa (2960 kBq/mL), apesar de existir inibição da proliferação celular e um retardamento do ciclo celular, não era evidente nenhum 44 isto é, as “sementes”, estão dispersas por todo o corpo, contudo estas “sementes” só poderão sobreviver e crescer quando chegam a um tecido ou órgão com características ótimas para o seu desenvolvimento.23–25 De uma forma simplista, Paget comparou o processo de metastização óssea com o processo de plantação de sementes: “When a plant goes to seed, its seed are carried in all directions: but they only live and grow if they fall on congenial soil”.24 Quarenta anos depois, em 1928 James Ewing apresentou uma nova visão, propondo que as células metastáticas desenvolvem-se num determinado local porque são arrastadas pela corrente sanguínea para esse mesmo local.26 Mais recentemente, em 2002, Isaiah Fidler refinou a teoria Seed and Soil utilizando três princípios básicos.26 O primeiro princípio definia o tecido tumoral como sendo composto por uma população celular heterogénea com diferentes propriedades de angiogénese, de invasão tecidular e de metastização. O segundo princípio postulava que o processo metastático é seletivo para células que sobrevivam a uma longa jornada na corrente sanguínea até ao local de destino. Por ultimo, o terceiro princípio assumia que o sucesso das células metastáticas estava dependente da capacidade destas interagirem com o novo ambiente. O aparecimento e desenvolvimento de metástases é o resultado final de várias etapas interdependestes, que fazem parte de um processo multifacetado que inclui uma complexa interação entre o tumor e o local hospedeiro. Os principais passos associados ao processo metastático incluem:25,27  Invasão local: as células cancerosas invadem tecido vizinho normal;  Invasão dos vasos: as células cancerosas invadem e movem-se através das paredes dos vasos linfáticos e sanguíneos adjacentes;  Circulação: as células cancerosas movem-se pelo sistema linfático e corrente sanguínea para outros locais do corpo;  Extravasão: as células cancerosas param de se mover em pequenos capilares, onde invadem a parede dos capilares e migram pelo tecido envolvente;  Proliferação: as células cancerosas multiplicam-se no novo local e formam pequenos tumores, designados de micrometástases; 45  Angiogenese: os pequenos tumores estimulam o desenvolvimento de vasos sanguíneos, fundamentais para a obtenção de oxigénio e nutrientes, permitindo assim o desenvolvimento contínuo do tumor metastático. Tipicamente, o crescimento dos tumores para além de alguns milímetros de diâmetro não ocorre sem neovascularização. Várias alterações genéticas associadas à progressão maligna (mutação do gene RAS, perda do p53, entre outras) induzem um fenótipo angiogénico (desenvolvimento de vasos sanguíneos), através da indução de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF-A, vascular endotelial growth factor) e o fator de crescimento básico dos fibroblastos (bFGF, basic fibroblast growth factor). O bFGF é tipicamente sobre-expresso nos cancros, especialmente aquando dos processos de invasão tecidular, no qual as células tumorais interagem com as células hospedeiras. Vários fatores contribuem para a tendência de metástases no tecido ósseo. Por exemplo, a circulação sanguínea é elevada nas zonas da medula óssea e as células tumorais produzem moléculas que aderem às células do estroma da medula e da matriz óssea. Estas interações adesivas causam um aumento da produção de fatores de crescimento e absorção por parte das células ósseas que encorajam o crescimento tumoral. Para além disso, o osso também apresenta uma reserva considerável de vários fatores de crescimento celular, tais como o fator de transformação do crescimento beta (TGF-β), as proteínas morfogenéticas do osso (BMPs), o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), os fatores de crescimento semelhantes à insulina I e II (IGF-I, IGF-II) e o cálcio.28 A disseminação tumoral do local de origem para um novo local não contíguo depende de diversas interações entre as células tumorais e o ambiente hospedeiro, sendo que, na maioria dos casos, a matriz extracelular (EMC) serve como modelador. Componentes da ECM e correspondentes recetores sofrem alterações durante o desenvolvimento normal e anormal das células. Consequentemente, a degradação localizada dos componentes da ECM é um pré-requisito para as células tumorais migrarem. Também as interações célula-célula e célula-ECM são alteradas durante a 46 transformação maligna e progressão neoplásica, e representam um potencial mecanismo inerente à disseminação tumoral para locais distantes do de origem.29 Apesar da presença significativa de metástases em diversos tipos de cancros, o processo metastático em si é ineficiente, pois apenas uma proporção muito pequena das células tumorais (menos de 0.1%) que entra em circulação produz eventualmente metástases.30,31 3.3 PROCESSO METÁSTICO NO CONTEXTO DO CANCRO DA PRÓSTATA O cancro da próstata é um dos cancros mais comummente diagnosticado nos indivíduos de sexo masculino, sendo que mais de 70% dos casos de cancro da próstata são diagnosticados em homens com mais de 65 anos.29 O cancro da próstata é a segunda maior causa de mortes relacionadas com cancros em homens a seguir ao cancro do pulmão. Este cancro apresenta uma taxa de metastização de aproximadamente 70%, sendo o tecido ósseo o local mais afetado (aproximadamente 90%).29,32 Todos os anos, é estimado que mais de 100.000 doentes desenvolvam metástases ósseas, dos quais 65-75% apresentam cancros primários da próstata ou mama.33 Como referido anteriormente, um passo importante no processo metastático envolve o aparecimento de alterações na adesão celular às células adjacentes e à ECM. No caso das células da próstata, a sua passagem de um fenótipo normal para um fenótipo neoplásico ou metastático observa-se devido à perda de receptores da integrina α6β4, sendo esta perda tão acentuada quanto maior for a malignidade da célula.26 A disseminação das células tumorais da próstata ocorre maioritariamente via corrente sanguínea ou linfática. Após a sua entrada na microvasculatura estas tem que evitar o ataque por parte do sistema imunitário. Para sobreviver, durante este processo de transporte na corrente sanguínea ou linfática, as células tumorais submetem-se a um processo de “de-adesão” via alterações internas da célula ou de formação de aglomerados (por exemplo, de células tumorais e/ou de plaquetas) para recriar a sinalização celular aderente, o que lhes confere alguma resistência. Quando estas células individuais ou aglomerados atingem o tecido alvo, extravasam- 47 se da microvasculatura e migram para dentro do tecido. Caso o tecido alvo garanta a sinalização extracelular em falta, as células proliferam para formar focos metastáticos. O conjunto de sinalização necessária à proliferação dos focos metastáticos depende das alterações intrínsecas das células tumorais, as quais são responsáveis pela sua sobrevivência e crescimento no local secundário. No caso do cancro da próstata, existe uma correlação entre a agressividade tumoral e a independência de androgénios.34 Na Figura 9 apresenta-se um esquema do processo metastático no tecido ósseo de tumores primários da próstata. Figura 9: Fases principais do processo metastático no tecido ósseo de tumores primários da próstata. Legenda:(1) crescimento do tumor no tecido original (tecido da próstata); (2) evasão do tecido original; (3) sobrevivência das células neoplásicas na circulação sanguínea e linfática; (4) extravasão das células neoplásicas da microvasculatura para o tecido ósseo; (5) proliferação da metástase no osso; (6) interação das células neoplásicas com as células nativas do osso (Ocl, osteoclastos; Obl, osteoblastos). Adaptado de Tantivejkul, 2004. 3.4 DETEÇÃO E TRATAMENTO DE METÁSTASES ÓSSEAS A morbilidade e mortalidade associadas à maioria dos cancros ocorre devido à progressão do tumor desde sua localização primária até locais remotos. Os tumores primários são, geralmente, acessíveis e podem ser removidos por cirurgia ou eliminados por via de tratamentos com recurso à radiação. Contudo, quando o 48 tumor se estende para além das suas fronteiras na localização primária, estas abordagens terapêuticas são ineficazes. Pelo que, nesses casos, terapêuticas globais ou amplamente aplicadas serão necessárias. As metástases ósseas são um exemplo da disseminação de tumores primários para um local remoto. Estas são bastantes frequentes, sendo que cerca de 65% dos doentes com cancros na próstata, pulmões e mama vão, em alguma fase da sua doença, desenvolver metástases ósseas. A esperança média de vida após o aparecimento de metástases ósseas varia entre 2 a 4 anos para os cancros da próstata podendo chegar a um máximo de 10 anos.35 Abaixo apresentam-se os principais sinais e sintomas associados à ocorrência de metástases ósseas, bem como os principais meios de diagnóstico e tratamento das mesmas. 3.4.1 SINAIS E SINTOMAS Os principais sintomas associados às metástases ósseas são:  Dor óssea Dado que os tumores malignos mais comuns, tais como o cancro da mama, próstata e pulmões frequentemente metastizam para o osso, não é surpreendente que cerca de 60 a 80% dos doentes com cancros avançados sofram de dor óssea. Assim, a dor óssea é o sintoma mais comum, estando presente tanto em lesões osteolíticas como em lesões osteoblásticas. A dor óssea proveniente de metástases é de intensidade variável e intermitente nas fases iniciais da patologia, progredindo para uma dor contínua de baixa intensidade com episódios de dores severas, atingindo em fases finais da patologia um estado de dor crónica. O mecanismo de dor está usualmente associado à perda óssea em lesões líticas, todavia, lesões blásticas podem igualmente enfraquecer o osso através da perda da integridade estrutural, o que também causa dor.  Fraturas patológicas Em alguns casos, as fraturas patológicas podem ser o primeiro sinal da presença de metástases ósseas. O mecanismo inerente ao aparecimento de fraturas ósseas está relacionado com a destruição do osso cortical, que reduz a capacidade do tecido ósseo de suportar pesos e tensões, resultando em microfraturas do osso 49 trabecular com subsequentemente perda da integridade do osso. Estas fraturas ósseas podem ocorrer de forma espontânea ou após uma lesão trivial.  Hipercalcemia A hipercalcemia é definida como o aumento da concentração de cálcio no sangue. Esta ocorre frequentemente em doentes com metástases ósseas derivadas de mielomas, cancro da mama, pulmão ou próstata. O aumento da concentração de cálcio está relacionado com o aparecimento de dores ósseas, bem como de vómitos, náuseas, desidratação, fraqueza e distúrbios mentais. Na maioria dos casos, o mecanismo adjacente à hipercalcemia está relacionado com um ou mais fatores sistémicos produzidos pelas células tumorais, como por exemplo a proteína relacionada com a hormona tiroideia (PTHrP), que estimulam a reabsorção óssea por via dos osteoclastos e aumentam a reabsorção tubular renal.  Instabilidade e compressão da coluna vertebral A coluna vertebral é um dos locais mais comuns para as metástases ósseas. A ocorrência de metástases ósseas nessa zona pode conduzir a instabilidade e distúrbios neurológicos, dado que a espinal medula processa a condução de impulsos da periferia para o sistema nervoso central e vice-versa. Por outro lado, a compressão da espinal medula pode levar a perda de capacidades motoras, o que pode ter um impacto significativo na qualidade de vida do doente. 3.4.2 MÉTODOS DE DETEÇÃO Existem muitas técnicas de imagem que possibilitam a deteção de metástases ósseas, das quais se destacam as radiografias, as cintigrafias ósseas e as técnicas tomográficas de emissão ou transmissão. Os métodos mais comummente utilizados para deteção de metástases ósseas são a cintigrafia óssea e a radiografia.  Exames de raio-X Exames de raio-X podem mostrar a invasão do cancro do tecido ósseo. Geralmente este é um dos primeiros exames a ser realizado quando um doente com cancro se queixa de dores ósseas. As lesões osteolíticas aparecem tipicamente no exame como zonas escuras no osso. Contrariamente, as lesões osteoblásticas aparecem como uma zona mais clara do que o restante osso envolvente. 50  Cintigrafia óssea Uma das vantagens deste exame reside na possibilidade de visualizar a totalidade do esqueleto, permitindo assim a deteção de metástases ósseas que ainda não provocam sintomas. Neste exame, áreas de elevada atividade óssea, tais como os locais das lesões, aparecem como pontos hipercaptantes pois atraem uma maior quantidade de radiofármaco. Esta técnica de imagem tem maior sensibilidade que a técnica de raios-X, dado que deteta danos funcionais no tecido ósseo, em vez de danos estruturais, pelo que consegue detetar as lesões ósseas mais precocemente. Contudo, esta técnica baseia-se na distribuição e captação óssea do radiofármaco, o qual se concentra não só na matriz óssea saudável, mas também em áreas de nova formação óssea normal, bem como nas metástases ósseas. Consequentemente, as imagens cintigráficas devem ser devidamente analisadas e a idade do doente deve ser considerada, pois doentes cuja matriz óssea não esteja totalmente calcificada podem apresentar áreas de captação anormal que coincidem com áreas de formação óssea nova e não áreas de metástases. A deteção de lesões puramente osteolíticas pode ser difícil atendendo às características associadas à aquisição de imagens cintigráficas do esqueleto.  Tomografia computorizada (CT) O exame de tomografia computorizada (CT) caracteriza-se pela aquisição de imagens recolhidas em vários ângulos em torno da parte anatómica em estudo, obtidas pela rotação de 360° de uma ampola de raios-X. O computador combina as imagens recolhidas numa imagem tridimensional, que pode subsequentemente ser secionada e interpretada pelo médico. Este tipo de exame é importante na avaliação do tamanho e forma da metástase óssea, bem como no estudo da estabilidade do osso que contém a metástase. Para além disso, este exame é aconselhado para lesões puramente osteolíticas, pois ajuda a perceber o tamanho e forma da lesão.  Imagem por Ressonância Magnética (MRI) O exame de Ressonância Magnética (MRI) usa campos eletromagnéticos elevados para adquirir imagens de uma área anatómica de interesse, em vez de radiação ionizante. Essencialmente, esta técnica determina as propriedades de um determinado tecido com base nos níveis de energia rotacionais dos diferentes núcleos presentes nos tecidos em estudo, pela magnetização e subsequente 51 desmagnetização dos mesmos. Este exame é muito utilizado para avaliação de suspeita de compressão da medula espinhal induzida pela metástase óssea.  Tomografia por emissão de positrões (PET) Para a realização de um exame de tomografia de emissão de positrões (PET), um radiofármaco é injetado por via endovenosa e imagens tridimensionais são adquiridas de todo o corpo ou de uma área anatómica de interesse, utilizando uma camara PET. No contexto de pesquisa de metástases ósseas, duas abordagens são frequentemente utilizadas: (1) administração de 18F-FDG (18F-Fluorodeoxiglucose) para avaliação da proliferação e metabolismo da lesão óssea; e (2) administração de 18F-Floreto de sódio para estudo da matriz óssea. A elevada sensibilidade das imagens PET permite a deteção mais precoce de metástases ósseas, comparado com outras técnicas de imagem anatómica, tais como radiografia, CT e MR.  Análises laboratoriais Quando um cancro atinge o osso, pode causar a libertação de algumas substâncias na corrente sanguínea que podem ser detetadas através de exames sanguíneos de rotina. Por exemplo, a presença de metástases ósseas leva a um aumento dos níveis de cálcio no sangue, bem como aumento da concentração de fosfatase alcalina. Para além disso, alguns tipos de cancros libertam substâncias designadas por marcadores tumorais na corrente sanguínea (por exemplo, nos cancros da próstata verifica-se a libertação do antigénio específico da próstata, PSA), pelo que, um aumento na concentração destes marcadores pode indicar que o cancro se disseminou para áreas secundárias ao tumor primário.  Biopsias A confirmação de tecido metastático é frequentemente conseguida por via de exames histopatológicos, nomeadamente através da recolha e análise de uma amostra de tecido por recurso à biopsia. 3.4.3 MÉTODOS DE TRATAMENTO Atualmente, a maioria dos tratamentos dos tumores metastáticos ósseos tem como principal objetivo o controlo do desenvolvimento do cancro e o alívio dos sintomas provocados por este através de cuidados paliativos. A terapêutica paliativa é centrada no controlo sintomático e preservação da qualidade de vida do doente, 52 não sendo portanto uma terapia com objetivo de cura. Assim, os principais objetivos dos tratamentos paliativos são: alívio da dor, manutenção da função óssea e controlo do crescimento tumoral local tanto quando possível. O tratamento paliativo tem duas vertentes principais: analgesia e estabilização. A analgesia pode ser conseguida pelo uso de, por exemplo, anti-inflamatórios não esteroides, analgésicos potentes (morfina) e tratamentos que diminuam a reabsorção óssea, tais como os bifosfonatos ou radioterapia local. Por outro lado, a estabilização da patologia pode ser conseguida através da estabilização de fraturas, cirurgia e monitorização dos ossos em risco. A escolha do tratamento das metástases ósseas depende de inúmeros fatores, tais como, tipo de cancro, número e locais dos ossos afetados, fragilidade dos ossos ou presença de fraturas, historial clínico do doente e idade e condição de saúde geral do doente. Tipicamente, os tumores metastáticos são tratados com terapias sistémicas (por exemplo, quimioterapia, radioterapia interna e terapia hormonal), terapia local (por exemplo, cirurgia e radioterapia externa localizada) ou uma combinação de vários tratamentos.  Tratamentos sistémicos Em muitos casos, especialmente quando o cancro se disseminou para muitos ossos, os tratamentos sistémicos são o método de tratamento preferido, pois conseguem atingir as células carcinogénicas espalhadas por todo o corpo. Abaixo são apresentados os principais métodos de tratamento sistémico de metástases ósseas. o Terapia com bifosfonatos Os bifosfonatos são grupos de fármacos caracterizados por uma estrutura central contendo fósforo-carbono-fósforo (P-C-P), que promove a ligação à matriz mineralizada do osso.36 O princípio inerente ao uso de bifosfonatos no contexto da terapia das metástases ósseas assenta na sua capacidade inibitória sobre os osteoclastos, diminuindo assim a sua capacidade de reabsorção óssea. Os bifosfonatos provocam também a apoptose dos osteoclastos.36–38 Estes fármacos estão indicados para o tratamento de dor óssea proveniente de metástases originárias de cancros primários da mama ou próstata, bem como, prevenção de eventos relacionados com a patologia. Juntamente com a reidratação, os bifosfonatos são o método terapêutico eficiente no controlo da hipercalcemia.36 53 o Quimioterapia A quimioterapia utiliza fármacos que usualmente são injetados por via endovenosa ou ingeridos por via oral. Estes fármacos entram na corrente sanguínea e atingem as células tumorais. Contudo dado que entram na corrente sanguínea, estes fármacos atingem sempre células normais não-alvo, causando efeitos secundários que dependem do fármaco utilizado e da quantidade administrada. Alguns efeitos secundários comuns da quimioterapia incluem: náuseas, vómitos, perda de cabelo e diarreia. o Tratamento hormonal Dado que algumas hormonas estimulam o crescimento tumoral, uma das opções terapêuticas no contexto das metástases ósseas é o bloqueio hormonal. Esse bloqueio hormonal é conseguido através da administração de fármacos que impedem a produção de determinadas hormonas ou por remoção cirúrgica do órgão produtor da hormona. o Imunoterapia A imunoterapia é uma terapia sistémica que visa fortalecer o sistema imunitário ou utilizar proteínas do sistema imunitário para destruir as células tumorais. Vários tipos de imunoterapia são utilizados para combater os cancros metastáticos, tais como citoquinas, anticorpos monoclonais ou vacinas tumorais. o Radioterapia com radiofármacos A radioterapia é muitas vezes utilizada com intenção paliativa, a fim de suprimir o crescimento tumoral das lesões metastáticas que não ameacem biomecanicamente a estrutura óssea, sendo também utilizada para melhorar a qualidade de vida dos pacientes sem condições para serem submetidos a cirurgia. O tratamento paliativo das metástases ósseas com recurso a radiofármacos é caraterizado pela libertação seletiva de radiação nos tecidos-alvo. O seu sucesso depende da capacidade do radiofármaco ser captado de forma seletiva e mantido de forma prolongada no tecido tumoral. Como será demonstrado no capítulo 4, existem vários radiofármacos atualmente em uso na prática clínica ou em investigação para o tratamento paliativo das metástases ósseas. 39 60 eficiente.49 Possivelmente este fenómeno de ineficácia da terapia hormonal em fases avançadas do cancro da próstata ocorre devido à heterogeneidade celular no tumor que aumenta ao longo do tempo, bem como, à presença de células independentes de androgénios nos focos tumorais. O Kp é calculado através da divisão do valor da fração de células em crescimento (GF) para um dado tipo de célula pelo período intermitótico Tc desse mesmo tipo de célula (expresso em dias), com posterior multiplicação do resultado por 100. O GF é determinado por análises imunocitoquimicas para detetar células em ciclo celular, através da deteção do antigene Ki67 presente em células em proliferação (G1, S, G2) e ausente em células fora de ciclo (G0). Ou seja, o GF é a porção de células da amostra marcadas positivamente com o antigene Ki67. Por outro lado, o Tc é determinado pela observação de culturas de células através de um vídeo com subsequente determinação e quantificação do tempo entre mitoses. O valor Kd, que expressa em percentagem a taxa de morte celular diária, é calculado dividindo a fração de células cuja extremidade do ADN está marcada com transferase terminal (TTF, terminal transferase) pela semi-vida das células marcadas, multiplicado por 100. Por último, a taxa de crescimento celular é dada pela subtração de Kd a Kp para cada tipo particular de célula. No estudo de Berges et al. em 1995 concluiu-se que a população de células da próstata em condições normais estáveis, isto é, em condições em que existe renovação celular sem que haja um crescimento significativo da população ou regressão da mesma, apresenta um Tc=48±5 horas, e que nestas condições uma renovação completa da população (TD) ocorre em 500±79 dias. Contudo, quando estas células são transformadas obtendo um perfil neoplásico, existe um crescimento de 6.9 vezes Kp com apenas um crescimento de 4 vezes no valor do Kd havendo assim um excesso na proliferação celular, baixando o tempo de duplicação celular nestas condições para 154±22 dias. Quando estas células apresentam um fenótipo metastático esta diferença ainda é mais significativa, pois o Kp apresenta um aumento de 11 vezes o valor da célula normal e 36% superior aos das células neoplásicas, e o Kd aumenta apenas 3.8 vezes em relação as células normais, culminando num tempo de duplicação de 54±5 dias (Tabela 4).49 61 Tabela 4. Principais parâmetros cinéticos de diferentes fenótipos das células da próstata.49 Fenótipo celular Kp (%) Kd (%) Tempo de duplicação (dias) Células epiteliais 0.19±0.03 0.20±0.03 500±70 Células neoplásicas 1.25±0.30 0.80±0.24 154±22 Células metastáticas 2.04±0.29 0.79±0.16 54±5 3.7 SUMÁRIO O processo metastático é a disseminação de células tumorais a partir do local primário para locais remotos, resultando no estabelecimento de tumores secundários em localizações distantes da original. Certos tipos de tumores têm preferências por locais específicos para o desenvolvimento de metástases, por exemplo, os tumores da próstata e mama geralmente atingem o tecido ósseo. As metástases ósseas têm implicações clínicas significativas e conduzem frequentemente a uma acentuada perda de qualidade de vida dos doentes. As principais manifestações clínicas das metástases incluem dor óssea severa, suscetibilidade a fraturas patológicas e hipercalcemia. O aparecimento de metástases é o resultado final de várias etapas interdependentes. Essas etapas incluem: disseminação das células tumorais da neoplasia primária para a corrente sanguínea, sobrevivência e migração na circulação sanguínea, extravasão da microvasculatura para o tecido ósseo, colonização e proliferação do osso através de interações com as células ósseas. Várias citosinas e fatores de crescimento produzidos pelas células tumorais interagem com as células do tecido ósseo, de forma a quebrar o equilíbrio no processo normal da renovação osso, desencadeando assim um ciclo vicioso que permite a metástase estabelecer-se e desenvolver-se no tecido ósseo. As células normais da próstata apresentam um tempo de duplicação celular longo (~500 dias). Após a ocorrência de mutações em genes específicos, estas células podem adquirir um perfil neoplásico com um encurtamento do tempo de duplicação celular (~154 dias) ou um perfil metastático com um encurtamento do tempo de 62 duplicação celular ainda mais acentuado (~54 dias). Esta transformação do fenótipo celular pode ser o resultado de alterações genéticas com consequente modificação da cinética celular, dado que conforme explicado no capítulo anterior, o ciclo celular é regulado por diversos controlos mediados por moléculas, enzimas e proteínas que são suscetíveis a mutações após dano celular. Capítulo 4 RADIOFÁRMACOS PARA TERAPIA PALIATIVA DAS METASTASES ÓSSEAS 65 4.1 INTRODUÇÃO A terapia com recurso a radiofármacos com afinidade pelo tecido ósseo é um dos procedimentos mais antigos na Medicina Nuclear, sendo utilizado há várias décadas como um método eficiente para o tratamento paliativo de metástases ósseas. Vários novos radiofármacos para tratamento paliativo das metástases ósseas têm sido desenvolvidos e apresentados nas últimas décadas. Radiofármacos com afinidade pelo tecido ósseo são capazes de libertar quantidades significativas de radiação ionizante diretamente no tecido ósseo metastático, mesmo quando este se encontra disperso por todo o esqueleto. Neste capítulo define-se o conceito de radiofármaco ideal para terapia, descreve-se as características físicas dos radionuclídeos a analisar na presente Dissertação, bem como as evidências pré-clínicas e clínicas de estudos com diferentes radiofármacos desenvolvidos para tratamento paliativo das metástases ósseas. 4.2 RADIOFÁRMACOS PARA TERAPIA PALIATIVA DAS METASTASES ÓSSEAS Um radiofármaco é definido como uma molécula que combina um composto químico (ex. EDTMP) com um isótopo radioativo (153Sm), por exemplo, 153SmEDTMP.50 Contudo este pode também ser apenas o elemento radioativo, como por exemplo, o 32P. Um radiofármaco pode ser usado para diagnóstico ou tratamento de diferentes patologias. Na Medicina Nuclear cerca de 95% dos radiofármacos são utilizados com propósito de diagnóstico e apenas 5% dos radiofármacos são usados para tratamento.50 Dado que os radiofármacos são desenvolvidos para administração em humanos, estes devem obedecer a todas a regras associadas com a administração de fármacos, nomeadamente, ser estéreis e apirogénicos, e devem também respeitar as regras associadas com o uso de material radioativo. A utilidade de um radiofármaco para terapia é ditada pelas características físicas do radioisótopo, nomeadamente, modo de decaimento, energia, tempo de semi-vida e poder de penetração; bem como pelas propriedades químicas da 66 molécula a este associada (se aplicável), a qual determina a biodistribuição do radiofármaco in vivo.51 4.2.1 CARACTERÍSTICAS DE UM RADIOFÁRMACO IDEAL PARA TERAPIA O sucesso da terapia com radiofármacos assenta essencialmente na capacidade do radiofármaco ser captado de forma seletiva e mantido por tempo prolongado no tecido tumoral. Esta terapia visa a libertação de energia radioativa controlada e localizada ao tecido alvo com toxicidade limitada e poucos efeitos secundários de longa duração. Algumas das principais características de um radiofármaco ideal para terapia são as seguintes:  Facilmente disponível: o radiofármaco deve ser facilmente produzido, deve ter um baixo custo de produção e deve estar acessível a qualquer departamento de Medicina Nuclear. Métodos complexos de produção de radionuclídeos ou precursores para a síntese do radiofármaco, são subótimos e aumentam os seus custos de produção. Também a distância geográfica entre o local de produção e o utilizador final limita a utilização de radiofármacos de curta semivida.  Elevada razão tecido alvo/tecido não-alvo: É desejável que o radiofármaco se localize preferencialmente no órgão a tratar (isto é no tecido alvo), pois a concentração da radioatividade em tecidos adjacentes não-alvo pode provocar efeitos secundários indesejados. Quando maior a razão alvo/não-alvo, maior será a eficácia terapêutica e menor serão as doses de radiação aos tecidos saudáveis.  Rápida remoção da corrente sanguínea e dos tecidos não-alvo: É desejável que o radiofármaco seja captado pelo tecido alvo tão rápido quanto possível, ficando subsequentemente retido nele, mas também que a sua eliminação do sistema sanguíneo e dos tecidos não-alvo seja realizada de forma eficiente e no menor período de tempo possível, reduzindo assim a exposição à radiação dos tecidos saudáveis. 67  Distribuição uniforme da radiação pelo tecido alvo: a emissão de radiação (partículas ou fotões) deve atingir todas as células do tecido alvo de forma semelhante para garantir um tratamento eficiente e homogéneo, mesmo em tumores heterogéneos e de elevadas dimensões.  Estabilidade radioquímica: um radiofármaco tem que ser estável quer in vitro quer in vivo, pois a quebra de ligações no radiofármaco sintetizado irá levar à formação de moléculas diferentes da original, as quais poderão ter uma biodistribuição indesejável in vivo, potencialmente levando à irradiação de tecidos não-alvo. 4.2.2 CONSIDERAÇÕES NA ESCOLHA DOS RADIOFARMACOS PARA TERAPIA PALIATIVA DAS METASTATES ÓSSEAS A escolha do radiofármaco a utilizar em terapia paliativa das metástases ósseas assenta em diversos critérios, nomeadamente, na semi-vida física do radioisótopo; na extensão da doença metastática; no volume de cada lesão, o que tem implicações ao nível do poder de penetração das partículas emitidos pelo radioisótopo; na capacidade funcional da medula óssea; e na disponibilidade e custo do radiofármaco.39 Abaixo descreve-se em maior pormenor alguns dos aspetos a considerar aquando da escolha ou do desenvolvimento de um radiofármaco para terapia:  Semi-vida física do radioisótopo: A semi-vida física é uma variável importante a considerar aquando do design do radiofármaco, pois pode influenciar a eficácia do mesmo. Para se maximizar a eficácia terapêutica do agente, a taxa de decaimento do radioisótopo deve ser adequada à biodistribuição do agente no tecido alvo bem como à remoção deste da corrente sanguínea e restantes tecidos não-alvo. Do ponto de vista da produção e distribuição do radiofármaco, radioisótopos com semi-vidas longas asseguram tempo para a síntese do radiofármaco, bem como para a realização dos testes de qualidade e despacho do mesmo para longas distâncias com perdas mínimas 68 devido ao decaimento, o que garante uma produção economicamente viável.51  Tipo de partícula radioativa emitida pelo radioisótopo: Vários tipos de partículas radioativas têm sido avaliados para terapia com recurso a radioisótopos, nomeadamente, partículas beta, alfa e eletrões de Auger. Tradicionalmente, radioisótopos emissores de partículas βtêm sido os mais utilizados, devido à grande disponibilidade de radiofármacos radiomarcados com emissores de partículas β-.52 Contudo, alguns destes radioisótopos não são ideais quando o objetivo é a distribuição global dos mesmos, devido a níveis de disponibilidade insuficientes, à incapacidade de obter o radioisótopo com elevada atividade específica ou a semi-vidas reduzidas.39 Nos últimos anos, as partículas alfa têm despoletado um elevado grau de interesse na comunidade científica, pois estas partículas estão associadas a uma elevada LET e a uma reduzida distância de penetração. Por seu lado os eletrões Auger têm sido considerados como partículas com significativo potencial terapêutico, pois quando depositados nas vizinhanças do núcleo celular, os eletrões de Auger têm um comportamento idêntico à radiação de elevada LET.  Distância de penetração da partícula radioativa: Existem essencialmente três principais tipos de partículas radiativas com interesse para a radioterapia localizada: partículas beta menos (β-), partículas alfa (α) e eletrões Auger. As partículas α, cuja deposição de energia se observa num curto raio em torno do local de emissão, atinge frequentemente um pequeno grupo de células (poder de penetração típico inferior a 100 μm). As partículas βapresentam um poder de penetração de alguns milímetros, que porventura pode resultar na irradiação das células vizinhas, fenómeno designado de crossfire. Os eletrões Auger são eletrões de baixa energia (energia típica de aproximadamente 20-100 keV) e com baixo poder de penetração, entre poucos nanómetros até alguns micrómetros. Devido ao baixo poder de penetração tanto dos eletrões Auger como 69 das partículas α, a radioterapia sistémica localizada com recurso a estas partículas radioativas provoca, geralmente, uma menor toxicidade a medula óssea quando comparados com as partículas β-.  Emissão de fotões gama pelo radioisótopo: A emissão de fotões gamas pelo radioisótopo é útil para a realização de imagem médica, a qual possibilita a observação da biodistribuição do radiofármaco para avaliação da resposta terapêutica, bem como a obtenção de estudos de dosimetria que visam determinar qual a dose de radiofármaco adequada ao tratamento de um dado doente.  Capacidade funcional da medula óssea: O órgão crítico nas terapias paliativas das metástases ósseas com recurso a radiofármacos é a medula óssea, pois encontra-se localizado no interior do osso (isto é, o tecido alvo) e é extremamente sensível a radiação. Contudo, todos os radioisótopos frequentemente utilizados em terapia paliativa das metástase ósseas, quando utilizados em doses recomendadas, estão a associados a uma toxicidade medular reduzida e transitória, com exceção do 32P, que provoca mais efeitos hematológicos que os restantes radioisótopos tipicamente utilizados para terapia paliativa das metástases ósseas. 4.2.3 MECANISMOS DE CAPTAÇÃO ÓSSEA DO RADIOFÁRMACO O radiofármaco, uma vez administrado por via endovenosa, viaja pela corrente sanguínea e concentra-se no tecido ósseo. A captação dos radiofármacos é maior em locais de nova formação óssea ou em locais de atividade óssea aumentada, devido ao elevado fluxo sanguíneo e ao aumento da área de contato com moléculas da matriz da hidroxiapatita, à medida que esta vai sendo formada, nesses locais. Deste modo, a eficiência da captação do radiofármaco pelas metástases ósseas baseia-se na captação seletiva e na retenção prolongada do mesmo nos locais de elevada atividade osteoblástica, isto porque, conforme explicado anteriormente no capítulo 3, a remodelação da matriz óssea ocorre como consequência da presença de células neoplásicas. Assim, o uso de radiofármacos 76 complexos de ítrio-transferrina, os quais têm a tendência de se acumular em órgãos do sistema reticuloendotelial.72 Por estes motivos, o uso de 90Y enquanto agente radioterapêutico com contexto das metástases ósseas foi descartado, preferindo-se a utilização do 90Y ligado ao EDTMP ou ao complexo 1,4,7,10-tetraazaciclododecano1,4,7,10-ácido tetra-acético (DOTA) conjugado com bifosfonatos (DOTA-HBP).73 Tabela 8. Sumário das principais características físicas dos decaimentos radioativos do 90Y. Emissão Energia Média (KeV) Fração de decaimento (% ) CE-K 768.7 0.003 β0,1 163.7 0.017 β0,0 926.7 99.98 O complexo 90Y-EDTMP apresentam uma rápida remoção da corrente sanguínea e uma elevada concentração no tecido ósseo. Em ratazanas, verificou-se que após injeção de 90Y-EDTMP, 45% da dose injetada se localizava no tecido ósseo.71 Em ratos, este radiofármaco apresenta uma semi-vida biológica superior a 72 horas no osso.72 Também o complexo 90Y-DOTA-HBP apresenta uma rápida remoção da atividade dos tecidos moles e corrente sanguínea, bem como uma elevada acumulação no tecido ósseo.73 Estudos clínicos com recurso ao 90Y-EDTMP ou ao 90Y-DOTA-HBP para tratamento paliativo das metástases ósseas não se encontram atualmente disponíveis, pelo que dados relativos à resposta terapêutica dos mesmos são desconhecidos. Contudo, num estudo de dosimetria com recurso a Ítrio-86 (86Y) e PET, foi possível confirmar a captação de 86Y-EDTMP por parte das metástases ósseas de doentes com cancro na próstata,74 sugerindo que o uso de 90Y-EDTMP pode ser útil no tratamento de metástases ósseas em humanos. Uma potencial limitação da utilidade do 90Y no contexto da terapia paliativa das metástases ósseas relaciona-se com o elevado poder de penetração das suas partículas β- (cerca de 4 mm), que pode levar ao aparecimento efeitos secundários indesejáveis, nomeadamente ao nível da capacidade funcional da medula óssea. 77 4.3.4 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM ESTANHO-117m (117mSn) O 117mSn decai por transformação isomérica com emissão de fotões gama e eletrões para o Estanho-117 estável (Tabela 9). A energia máxima dos eletrões emitidos aquando do decaimento do 117mSn ronda os 0.16 MeV, enquanto a energia máxima dos fotões gama é de 159 keV (86%). O 117mSn tem uma semi-vida física de 13.6 dias. Os eletrões emitidos pela conversão electrónica tem um pequeno poder de penetração na tecido mole (máximo de 0.3 mm). O 117mSn pode ser produzido tanto por enriquecimento do 116Sn, 116Sn(n,γ)117mSn, ou do 117Sn, 117Sn(n,n’)117mSn; porém a sua produção em larga escala apresenta limitações, motivo pelo qual outros processos de produção de 117mSn têm sido investigados, nomeadamente métodos de bombardeamento de Cádmio-116 (116Cd) e do Índio-115 (115In) com 3He.75 Tabela 9. Sumário das principais características físicas dos principais decaimentos radioativos do 117mSn. Emissão Energia Média (KeV) Intensidade de decaimento ((Bq-s)-1) Auger-L 3.0 91.0 Auger-K 21.0 10.8 CE-K1 126.8 64.8 CE-K2 129.4 11.7 CE-L1 151.9 26.1 CE-L2 154.1 1.5 CE-M1 155.1 5.6 Fotões Gama 158.6 86.4 78 O 117mSn-DTPA é um radiofármaco atualmente em estudo para o tratamento de metástases ósseas.76,77 Estudos de dosimetria anteriormente publicados em humanos demonstraram que a administração de 117mSn-DTPA resulta numa dose absorvida média de 0.043 cGy/Mbq na medula óssea e de 1.07 cGy/MBq no osso, verificando-se ainda que cerca de 77.6% da atividade administrada estava contida no osso.76 O pico de captação óssea do 117mSn-DTPA é atingido entre os 3 e 7 dias, não ocorrendo posterior redistribuição do radiofarmaco após a sua captação. Estima-se que a taxa de resposta ao tratamento com 117mSn-DTPA é de 75% (60-83%), com respostas completas em 30% dos casos. A duração do tratamento é de cerca de 98 dias, apresentando como efeitos secundários uma pequena mielossupressão.76 4.3.5 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM SAMÁRIO-153 (153Sm) O 153Sm foi aprovado com uso clínico nos anos 90.58 Este radioisótopo desintegra-se, com concomitante emissão de partículas β-, para o Európio-153. A energia máxima e média das partículas emitidas é de 0.81 MeV e de 0.23 MeV, respetivamente. A penetração média das partículas βdo 153Sm é de cerca de 0.6 mm em tecidos moles, podendo atingir uma penetração máxima de 2 a 3 mm. Aquando do seu processo de decaimento radioativo, o 153Sm emite ainda radiação gama (28% de abundancia) com energia de 0.103 MeV (Tabela 10). A semi-vida característica do 153Sm é de 1.9 dias (46.3 horas). O 153Sm pode ser obtido num reator nuclear por via de bombardeamento do 152Sm2O3 com neutrinos (152Sm(n,γ)153Sm) ou com recurso ao enriquecimento do Neodímio-150 (150Nd(α,n)153Sm).62 O 153Sm ligado ao EDTMP78–81 ou ao ácido tetra-azaciclo-dodecano tetrametileno-fosfónico (DOTMP)82 apresenta uma biodistribuição favorável para o tratamento de metástases ósseas, uma vez que se acumula preferencialmente em zonas de formação de tecido ósseo.83 79 Tabela 10. Sumário das principais características físicas dos principais decaimentos radioativos do 153Sm. Emissão Energia Média (KeV) Fração de decaimento (% ) Auger-L 3.4-7.8 53.0 CE-K5,3 21.154 20.5 CE-K3,0 54.66 41.4 β0,5 199.7 30.4 β0,3 225.3 49.2 β0,0 264.3 19.5 γ3,0 103.2 29.2 O 153Sm-EDTMP apresenta efeitos significativos no alívio da dor e consumo de analgésicos. Em doentes com metástases ósseas ocorre uma captação de 50 até 65% da atividade injetada no tecido ósseo, com maior incidência nos locais de metástases osteoblásticas. A restante percentagem de radiofármaco não acumulado no osso é totalmente removida da circulação nas primeiras horas, com acumulação mínima nos outros órgãos não alvo e uma excreção principalmente por via renal. O 153Sm-EDTMP apresenta uma razão que varia entre 4:1 e 7:1 entre os locais das lesões metastáticas e o osso normal.64 O grau de mielossupressão induzida pela administração do 153Sm-EDTMP é proporcional à dose administrada. A dose recomendada de 153Sm-EDTMP é de 37 MBq/kg (1mCi/kg), a ser administrada por via endovenosa, com repetição do tratamento possível após 2 meses da última administração.80 A mielossupressão suave provocada pelo tratamento é totalmente recuperável após um período entre 6 a 8 semanas. O tempo de resposta ao tratamento varia entre 3 e 30 dias após a administração de 153Sm-EDTMP e tem uma duração média de 3 meses. A taxa de resposta à terapêutica pode chegar até aos 83%.84 80 Também o 153Sm-DOTMP se apresenta como um radiofarmaco promissor no tratamento de metástases ósseas. Apesar de ainda não existirem dados clínicos, estudos em modelos animais (ratos) demonstraram que este radiofármaco apresentava uma captação por parte do tecido ósseo a variar entre 40% até 70% da atividade administrada, sendo o remanescente excretado por via do sistema urinário.82 Destas observações, pode-se concluir que o 153Sm-DOTMP apresenta uma biodistribuição muito similar à do 153Sm-EDTMP. A grande vantagem do 153SmDOTMP em relação ao 153Sm-EDTMP e que o 153Sm-EDTMP apresenta saturação do sistema urinário a quando da administração de doses elevadas, algo que ainda não foi detetado com a administração de 153Sm-DOTMP, permitindo assim, administrar doses que possibilitariam uma terapia curativa sem comprometer o sistema urinário.82 4.3.6 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM HÓLMIO-166 (166Ho) O 166Ho decai com concomitante emissão de partículas βpara níveis excitados do Érbio-166, com um valor de energia de decaimento total de 1,84 MeV e um tempo de semi-vida de 26.795 dias (Tabela 11). As partículas βemitidas pelo 166Ho apresentam um elevado poder de penetração nos tecidos moles atingindo um máximo de 8 mm (penetração média de 3.3 mm). O 166Ho pode ser obtido tanto por enriquecimento do 165Ho, como com recurso ao decaimento do Érbio-167, 167Er(t)- 166Ho, ou do Dísprosio-166, 166Dy (T1/2= 81.6 horas).62 Vários compostos químicos têm sido radiomarcados com 166Ho de forma a produzir radiofármacos para terapia paliativa das metástases ósseas, nomeadamente, o DOTMP, o EDTMP e o ácido 1,2-propileno-diamino-tetrametil-1enefosfórico (PDTMP). O 166Ho-DOTMP é um agente promissor para o tratamento paliativo das metástases ósseas, uma vez que apresenta uma elevada acumulação nas zonas ativas do tecido ósseo, juntamente com uma rápida remoção da corrente sanguínea e uma excreção maioritariamente urinária. Contudo, o seu potencial para o tratamento de metástases ósseas pode ser limitado devido à elevada energia das suas partículas β- (Emax= 1.84 MeV) e ao seu elevado poder de penetração.85 81 Tabela 11. Sumário das principais características físicas dos principais decaimentos radioativos do 166Ho. Emissão Energia Média (KeV) Fração de decaimento (%) Auger-L 3.9-7.6 28.0 CE-L1,0 70.82-72.2 20.5 β0,1 651.1 50.5 β0,0 693.8 48.2 A escolha da radiomarcação da molécula DOTMP invés do tradicional EDTMP, baseia-se na necessidade de manter os níveis de massa do radiofármaco administrado tão baixo quanto possível, e tal não seria exequível se se utilizasse o EDTMP, pois seria necessário usar uma elevada massa de EDTMP para estabilizar o hólmio. Estudos futuros são necessários para determinar a eficiência deste radiofármaco, bem como quantidades e métodos de administração, contudo resultados da Fase I de ensaios clínicos, demonstram uma grande variedade da captação óssea que varia entre 16% até 54% da atividade administrado, sendo o restante maioritariamente (83%) excretado pelo sistema urinário num prazo de até 12 horas.86 Estes resultados também demostram uma acumulação significativa do radiofármaco na bexiga e rins, deixando neste caso a medula óssea de ser o órgão crítico.87 Num outro ensaio clinico realizado no final dos anos 90, foi possível observar que com uma administração média de 1548 mCi de 166Ho-DOTMP ocorria uma completa remissão das metástases ósseas, com uma toxicidade da medula óssea aceitável.88 Também o 166Ho-EDTMP, apesar do seu problema da necessidade de uma elevada massa de EDTMP para uma radiomarcação bem sucedida, tem vindo a ser estudado em ratos como potencial agente terapêutico das metástases ósseas. Este radiofármaco apresenta uma biodistribuição favorável, com uma rápida captação pelo tecido ósseo (até 70% da atividade administrada) e uma rápida eliminação da circulação e dos restantes tecidos moles.89 82 Em 2012 um novo composto, o 166Ho-PDTMP, foi desenvolvido para terapia paliativa das metástases ósseas. Em ratos, o 166Ho-PDTMP apresenta uma remoção da corrente sanguínea num período inferior a 48 horas, sendo maioritariamente acumulado no tecido ósseo ativo, e apresentado uma acumulação negligenciável nos tecidos moles.90 4.3.7 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM TÚLIO-170 (170Tm) O 170Tm desintegra-se, com concomitante emissão de partículas β-, quer para um nível excitado intermédio de 84.25 keV (18.3%) com subsequente decaimento para o estado fundamental do elemento Itérbio-170 (Yb-170), quer diretamente para o estado fundamental do elemento Yb-170 (81%). Para além disso, o 170Tm pode também decair por captura electrónica para um nível excitado intermédio de 78.6 keV (0.03%) com subsequente decaimento para o estado fundamental do Érbio-170 (Er-170) ou diretamente para o estado fundamental do Er-170 (0.12%). O 170Tm apresenta uma semi-vida longa de 128.4 dias e uma energia total de emissão das partículas β-, de captura electrónica e de emissão gama de 968 keV, 314.4 keV e 84 keV, respetivamente (Tabela 12). O 170Tm e produzido por bombardeamento do Túlio-169 com neutrões (169Tm(n,γ)170Tm), ou do Érmio-170 com protões (170Er(p,n)170Tm). Ambas os métodos de produção podem conduzir à co-eluição de impurezas, tais como o 168Tm, no produto final. Tabela 12. Sumário das principais características físicas dos principais decaimentos radioativos do 170Tm. Emissão Energia Média (KeV) Fração de decaimento (% ) CE-L1,0 73.77-75.31 9.4 β0,1 290.5 18.3 β0,0 323.1 81.6 γ1,0 82.254 2.51 83 Para uma biodistribuição adequada com captação preferencial pelo tecido ósseo, o 170Tm necessita de estar associado ao EDTMP. Estudos de biodistribuição em ratos demonstram que, após administração de 170Tm-EDTMP, 50-55% da atividade injetada de se concentrava no tecido ósseo, sem acumulação significativa nos restantes órgãos vitais.54 Em 2009, Das e colaboradores calcularam que as doses absorvidas após administração de 170Tm-EDTMP rondavam os 4.3 Gy/MBq no osso e os 0.5µGy/MBq pela medula óssea.54 O uso de 170Tm-EDTMP encontra-se ainda numa fase experimental préclínica, pelo que o seu potencial terapêutico em populações humanas requer estudos futuros. 4.3.8 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM LÚTECIO-177 (177Lu) O 177Lu desintegra-se, com concomitante emissão de partículas β-, para o estado fundamental e três estados excitados do Háfnio-177 (Hf-177). O 177Lu apresenta uma semi-vida de 6.71 dias e emissões de partículas βcom energias máximas de 497 keV (78.6%), 384 keV (9.1%) e 176 keV (12.2%) e penetração média de 0.3 mm. Para além disso aquando do seu decaimento, o 177Lu emite radiação gama com energias de 113 keV (6.4%) e 204 keV (11%), adequadas para a aquisição de imagem (Tabela 13). O 177Lu pode ser produzido tanto por enriquecimento do Lutécio-166, (176Lu(n,γ) 177Lu) ou do 177Yb (176Yb(n,γ)177Yb→177Lu).39,91 Uma das grandes vantagens do 177Lu em relação aos demais radiosótopos tipicamente utilizados em terapia paliativa das metástases ósseas é a capacidade de produção deste radioisótopo em larga escala.91 Para o 177Lu apresentar uma biodistribuição ótima para o tratamento de metástases ósseas, este necessita de ser associado a uma molécula química com afinidade pelo tecido ósseo. Existem vários compostos químicos que podem ser radiomarcados com 177Lu, destacando-se o DOTMP 60,92, o metildifosfato (MDP)93, o pirofosfato de sódio (PYP)94 e o EDTMP 60,95–97. Estes compostos apresentam acumulação no tecido ósseo ativo significativa, podendo atingindo os 70% da atividade injetada. A excreção destes radiofármacos é rápida, efetuando-se principalmente pela via urinária, e o seu uso está associado a uma reduzida toxicidade. 84 Tabela 13. Sumário das principais características físicas dos principais decaimentos radioativos do 177Lu. Emissão Energia Média (KeV) Fração de decaimento (% ) Auger-L 4.3-11.2 8.75 CE-L1,0 101.67 6.84 β0,3 47.66 11.64 β0,1 111.7 9.1 β0,0 149.4 79.3 γ3,1 208.36 10.38 Em modelos animais, a administração de uma dada dose de 177Lu-DOTMP resulta num menor nível de mielossupressão que aquele causado pela mesma dose de 153Sm-EDTMP.98 Estes resultados podem ser consequência das emissões menos energéticas do 177Lu em comparação com as emissões do 153Sm, dado que, a deposição da energia total das partículas βdo 177Lu ocorre num volume correspondente a uma esfera de diâmetro máximo de 5 mm.95 A dose ótima para tratamento de metástases ósseas ainda necessita de ser estabelecida, mas os baixos níveis de mielossupressão sugerem que elevadas doses radioativas devem ser bem toleradas. Em ensaios clínicos em humanos, o 177Lu-EDTMP demonstrou ser um promissor agente terapêutico no contexto paliativo das metástases ósseas, apresentando uma adequada captação óssea, na ordem dos 70% da atividade administrada, bem como, uma rápida remoção da corrente sanguínea, sem acumulação significativa do composto nos tecidos moles e excreção maioritariamente por via do sistema urinário.99 Com uma única dose de 1.3 até 3.7 GBq de 177Lu-EDTMP é possível obter uma redução significativa da dor óssea, bem como o aumento da mobilidade, elevando a qualidade de vida do doente, sem que 85 com isso fique comprometido o sistema imunológico pois os níveis de toxicidade da medula óssea são muito reduzidos.100,101 Um estudo comparativo entre o 177Lu-DOTMP e 177Lu-EDTMP demonstrou que, apesar de uma biodistribuição muito semelhante e propicia ao tratamento de metástases ósseas, o 177Lu-DOTMP apresenta uma acumulação óssea marginalmente superior ao 177Lu-EDTMP, porém o 177Lu-EDTMP apresentam uma remoção mais rápida da corrente sanguínea é uma menor acumulação nos restantes tecidos moles.102 Também os compostos 177Lu-MDP e 177Lu-PYP foram recentemente investigados como agentes terapêuticos em ratos. O composto MDP é recorrentemente utilizado para a cintigrafia óssea quando radiomarcado com Tecnécio-99m, 99mTc-MDP, o que garante que a biodistribuição 177Lu-MDP coincide com a desejada. De facto, em ratos, até cerca de 31% da atividade administrada de 177Lu-MDP concentra-se no tecido ósseo.93 O PYP é um análogo do MDP, pelo que é expectável que o 177Lu-PYP tenha uma biodistribuição adequada ao tratamento paliativo de metástases ósseas, contudo ainda não foram publicados estudos biológicos com 177Lu-PYP.94 4.3.9 RADIOFÁRMACOS MARCADOS COM RÉNIO-186 (186Re) O 186Re decai, com concomitante emissão de partículas β-, para o estado fundamental e excitado a 137 keV do Ósmio-186 (92.5%) e por captura electrónica para o Tungsténio-186 (7.5%). O 186Re tem uma semi-vida de 3.72 dias. A energia máxima das partículas βemitidas pelo 186Re varia entre 0.58 MeV e 1.07 MeV.103 Este radionuclídeo é um emissor β-, cujas partículas emitidas possuem uma energia média de 0.349 MeV e uma penetração média nos tecidos de 1.1 mm (penetração máxima de 4.5 mm). Aquando do seu decaimento, o 186Re também emite uma pequena componente de radiação gama (9%, 0.137 MeV), permitindo assim aquisição de imagem pós-administração do radiofármaco (Tabela 14). O 186Re pode ser produzido tanto num reator nuclear ou num acelerador de partículas. No primeiro método, enriquece-se o 185Re através da captura de neutrões, o que resulta na formação do complexo 186ReO4-. Porém o método de produção mais utilizado 92 Hoje em dia o mercado da Medicina Nuclear ultrapassa os vários milhões de euros, em que 90% do mercado correspondo aos gastos associados a intervenções de diagnóstico e os restantes 10% a intervenções terapêuticas. É estimado que a descoberta de formas mais eficientes de produção dos diferentes radiofármacos bem como metodologias de administração mais eficientes possam corresponder a redução de gastos na ordem de 1 milhão de euros.123 93 Tabela 17. Sumário dos resultados clínicos dos tratamentos paliativos das metástases ósseas com diferentes radiofármacos.7,64,65,118 Caraterística 32P-ortofosfato 89SrCl2 90Y-EDTMP 117mSnDTPA 153Sm-EDTMP 166Ho-DOTMP 170TmEDTMP 177LuDOTMP 186Re-HEDP 188Re-HEDP 223RaCl2 % acumulação óssea 85% 55% 45-50% 77% 65% 16-54% 50-55% 70% 55% 30% 41% Principal via de excreção Renal Renal Renal Renal Renal Renal Renal Renal Renal Renal Fecal Resposta geral à terapia 50-87% 65-90% * 60-83% 55-83% * * * 55-85% 64-77% 58-75% Resposta completa 20% 5-20% * 30% Variável * * * 20% 22-26% Variável Tempo de resposta (dias) 5-14 14-30 * 14-30 7-30 * * * 2-7 2-7 14 Duração da resposta 2-7 meses 3-6 meses * 4-5 meses 2-3 meses * * * 2-4 meses 3-6 meses 2-3 meses Intervalo tempo Retratamento 3 meses 3 meses * 2 meses 2 meses * * * 2 meses 2 meses 1 mês Efeitos secundários Significativos Significativos * Suaves Moderados Moderados * Ligeiros Ligeiros Ligeiros Moderados Legenda: * - Sem dados publicados Nota: Os valores dos radiofármacos 90Y-EDTMP e 170Tm-EDTMP são provenientes de ensaios pré-clínicos. 94 4.5 SUMÁRIO A terapia com radiofármacos com alta afinidade pelo tecido ósseo é uma das intervenções terapêuticas utilizada como um método efetivo no tratamento paliativo de metástases ósseas. Atualmente são comercializados 5 radiofármacos para fins terapêuticos no contexto das metástases ósseas, sendo eles o 32Portofoafato, o 89SrCl2, o 153Sm-EDMP, o 223RaCl2 e o 186Re-HEDP. Muitos outros agentes terapêuticos encontram-se em ensaios clínicos ou em fases de estudo préclínico, nomeadamente radiofármacos marcados com 117mSn, 170Tm, 177Lu ou 188Re. A utilidade do radiofármaco para terapia é ditada pelas características físicas do radioisótopo, nomeadamente, modo de decaimento, energia, tempo de semivida e poder de penetração; bem como pelas propriedades químicas da molécula a este associada (se aplicável), pois esta determina a biodistribuição do radiofármaco in vivo e por último a capacidade funcional da medula óssea do paciente, pois este é frequentemente o órgão critico no tratamento. Atualmente estão disponíveis para uso clínico ou em investigação uma grande diversidade de radiofármacos com energias de emissão a variar entre 0.127 MeV do 117mSn até 5.78 MeV do 223Ra e um tempo de semi-vida que varia desde 0.7 dias do 188Re até 128.6 dias com o 170Tm. Neste capítulo foram apresentados os diferentes radioisótopos com potencial terapêutico no contexto de metástases ósseas, bem como as suas características físicas e métodos de produção. Também neste capítulo foram apresentados os principais resultados de estudos clínicos e pré-clínicos realizados com os radiofármacos mais importantes na área de tratamento paliativo das metástases ósseas. Apesar do interesse crescente e o aumento do número de publicações existentes sobre a terapia paliativas das metástases ósseas, não existe consenso na escolha do radiofarmaco a utilizar neste contexto, sendo que estes são escolhidos em função da sua acessibilidade ou disponibilidade e não da sua eficiência, uma vez que não existem estudos comparativos de todos os radiofármacos sob as mesmas condições. Assim, o objetivo desta Dissertação é contribuir para um maior conhecimento nesta área, com recurso a simuladores computacionais. Capítulo 5 SIMULADORES EM RADIOBIOLOGIA 97 5.1 INTRODUÇÃO Um passo essencial no estudo da eficiência da terapia com radiofármacos é a análise dos efeitos provocados pelas partículas emitidas pelos radioisótopos no material biológico, nomeadamente no ADN e nas células. Uma forma simples e rápida de realizar tais estudos é através do recurso a simuladores computacionais que utilizam o código Monte Carlo para descrever o transporte e a interação da energia com um meio, tendo por base diversos parâmetros extrapolados de ensaios in vitro e in vivo. Esta Dissertação visa avaliar e caracterizar, por métodos computacionais, os efeitos radiobiológicos induzidos pela irradiação de ADN e células com diferentes radioisótopos atualmente em uso clínico ou sob investigação para terapia paliativa das metástases ósseas. Para tal, foram escolhidos os seguintes simuladores: simulador Monte Carlo de danos do ADN (MCDS, Monte Carlo Damage Simulator), simulador Monte Carlo de reparação de danos do ADN (MCER, Monte Carlo Excision Repair) e simulador da resposta celular à radiação (VC, Virtual Cell). Neste capítulo descrevem-se os princípios gerais de funcionamento dos diferentes simuladores utilizados na presente Dissertação, bem como as vantagens e desvantagens do uso se simuladores para estudos radiobiológicos. 5.2 SIMULADORES Os simuladores computacionais de radiobiologia celular são, desde há muito tempo, uma fonte útil de informação sobre o potencial efeito terapêutico de diferentes agentes irradiantes, entre eles, os radioisótopos utilizados em terapia paliativa das metástases ósseas, sendo de crucial importância no campo da radioterapia molecular e planificação de tratamentos com recurso à radiação.124 Um dos primeiros simuladores desenvolvido para o estudo dos efeitos da radiação foi o simulador Monte Carlo. O método Monte Carlo é um conjunto de técnicas estocásticas baseadas em números aleatórios e probabilidades estatísticas que é utilizado para investigar problemas científicos. O seu uso possibilita analisar sistemas complexos, como aqueles aplicados ao estudo da radiobiologia celular, que de outro modo não seriam possíveis de estudar. Com o método Monte Carlo um 98 sistema complexo pode ser amostrado em números de configurações aleatórias e a informação recolhida pode ser utilizada para descrever o sistema como um todo.3 Como referido, os métodos computacionais Monte Carlo possibilitam o estudo das interações entre a radiação e a matéria de uma forma conveniente.124 Porém, o seu uso acarreta algumas desvantagens, entre as quais a sua exigência computacional. Nessa perspetiva, o algoritmo Monte Carlo escolhido para a realização desta dissertação, o MCDS, embora menos complexo e detalhado que o algoritmo Monte Carlo convencional, apresenta uma boa correlação para a maioria dos espectros de danos radioinduzidos do ADN, o que sugere que a distribuição espacial de danos elementares do ADN é determinada primariamente por eventos independentes estocásticos. A sua rapidez face ao Monte Carlo convencional, em termos de processamento de informação, possibilita a simulação de um cenário de 100000 células a 1 Gy de radiação em 1.5 minutos num Intel Pentium III Xeon a 2.4 GHz, necessitando de uma memoria de 1.3 Megabytes.125 Contrariamente a este simulador MCDS, o algoritmo Monte Carlo CELLDOSE, por exemplo, necessita de algumas horas num Pentium 4-EM64T a 3 GHz com 1 Gb de memória RAM para avaliar os efeitos da radiação em esferas de água isoladas. Também o simulador de radiobiologia utilizado nesta tese (VC – Virtual Cell) fornece informações sobre sobrevida celular, probabilidade de controlo tumoral, indução de mutagénese, entre outros, em apenas alguns minutos. Existem outros métodos baseados em código Monte Carlo para o estudo dos efeitos da radiação no ADN, como o GEANT4-DNA e o PENELOPE (PENetration and Energy LOss os Positrons and Electrons), contudo esses métodos encontram-se fora do âmbito desta Dissertação. 5.3 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO USO DE SIMULADORES Uma das principais vantagens do uso de simuladores assenta sobre a sua versatilidade e capacidade de em intervalos de tempo reduzidos, entre alguns segundos e poucos minutos, obter informação que de qualquer outro modo demoraria longos períodos de tempo e exigiriam grande disponibilidade de recursos e capacidades. Por exemplo, as culturas de células, de grande utilidade, possibilitam 99 o conhecimento do comportamento e função de uma população isolada de células, bem como, o estudo de fenómenos impossíveis de produzir em tecidos intatos, contudo possuem também várias características desvantajosas e limitantes, entre as quais se realçam: gastos elevados em material; dependência das condições de crescimento da cultura; instabilidade da cultura celular e perda de características de fenótipo. Em relação às culturas de células, os simuladores computacionais possuem algumas vantagens. Por exemplo, dado que os simuladores permitirem obter informação de uma forma mais rápida e flexível, estes possibilitam a cobertura de múltiplos parâmetros do cenário de irradiação em causa num curto espaço de tempo, pois não existem as limitações impostas pela cinética das culturas, isto é, instabilidade e risco de contaminação, que inviabiliza a utilização dos resultados e força os investigadores a repetir todo o processo. Para além disso, o custo associado à simulação do processo é largamente inferior ao associado ao uso de culturas celulares, existindo mesmo simuladores para investigação na área de domínio publico. Apesar das vantagens associadas ao uso de simuladores referidas acima, algumas desvantagens associadas ao seu uso também têm sido identificadas, tais como avaliações estimadas em resultados experimentais prévios e conhecimentos atuais ou por interpolação destes dados, que pode não ser efetivamente verdadeiro no organismo vivo, e a modelização da cinética celular de forma mecanista, que pode subvalorizar ou sobrevalorizar certos parâmetros e resultados. Por último os simuladores são limitados a uma gama de entradas de cada parâmetro que nem sempre cobre todos os valores necessários para os diversos estudos. 5.4 PRINCÍPIOS DO MCDS Informação detalhada sobre o espectro de possíveis configurações de danos induzidos pela radiação ionizante no ADN é frequentemente obtida pelo uso de simuladores de trilhos estruturais Monte Carlo em combinação com modelos geométricos do ADN e da cromatina. Nos modelos de trilhos estruturais, as radiações de baixa LET conduzem à formação de aproximadamente 1000 quebras 100 simples (SSB) e 40 quebras duplas (DSB) por Gray (Gy) numa célula de mamífero típica. O nível de danos provocados nas bases é estimado em 2500 para 25000/Gy/célula e, para além dos danos isolados, a radiação ionizante tem a capacidade de produzir também múltiplos locais de danos (MDS, Multiply Damage Sites), que consistem em dois ou mais danos elementares num curto espaço de hélices enroladas em torno do ADN.125 Nikjoo e colaboradores, em 1998, definiram dois métodos alternativos de classificação de quebras nas cadeias de ADN.19 Esses esquemas de classificação consideravam que: (1) os padrões de quebras de acordo com a complexidade do dano (simples, duplo e combinações) numa ou ambas as cadeias de ADN; e (2) classificação das quebras como resultado direto ou indireto da radiação (devido a radicais livres). As classificações propostas por Nikjoo e colaboradores estão esquematicamente representadas na Figura 12 e na Tabela 18.13,19 As DSB e outras classes de MDS são, geralmente, as causas primárias de indução de apoptose por radiação ou mutagénese. O simulador de danos Monte Carlo MCDS é um método simples e rápido para a produção do espectro de danos no ADN que apresenta apenas quatro parâmetros ajustáveis, dois dos quais podem ser restringidos a um intervalo de valores razoáveis com base em resultados experimentais.125 Estes quatro parâmetros são: número de quebras/Gy/célula (σSb), número de danos a bases do ADN/Gy/célula (σBd), comprimento do segmento de ADN medido em pares de bases (bp)/Gy/célula (nseg) e comprimento mínimo de ADN não danificado entre danos elementares entre segmentos vizinhos medido em pares de bases (Nmin). Figura 12: Esquema de classificação de danos do ADN segundo Nikjoo e colaboradores (1998).13 101 Tabela 18. Classificação das diferentes quebras do ADN segundo Nikjoo e colaboradores (1998).19 Fase Evento Ausência de quebra Nem a deposição energética por efeito direto, nem a deposição devido a radicais livres conduz à formação de quebras no ADN SSB Quebra simples do ADN SSB+ Duas quebras simples na mesma cadeia de ADN 2SSB Duas ou mais quebras simples em cadeias opostas separadas por >10 Pb DSB Duas quebras simples opostas e separadas por ≤ 10 Pb DSB+ Uma quebra dupla acompanhada por uma ou mais quebras simples separadas por < 10 Pb DSB++ Mais de uma quebra dupla no segmento de ADN separadas por >10 Pb O algoritmo do simulador MCDS processa-se em duas fases principais (Figura 13): (1) distribuição aleatória no segmento de ADN (parâmetro nseg) do número esperado de danos elementares produzidos numa célula por uma determinada quantidade e qualidade de radiação; e (2) subdivisão da distribuição de danos elementares no segmento em lesões, sendo aqui determinante o parâmetro Nmin. Figura 13: Representação esquemática das principais fases do simulador MCDS.3 •Número de quebras/Gy/célula (σSb) •Número de danos debases/Gy/célula (σBd) • Comprimento do segmento de ADN (nseg) •Comprimento mínimo do segmento não danificado (Nmin) Parâmetros Inicias •Distribuição aleatoria dos danos no ADN 1ª Fase •Subdivisão dos danos em lesões 2ª Fase 108 probabilidades: probabilidade de SP-BER (PSP), probabilidade de LPBER (PLP), probabilidade de NER (PNER), cuja soma é 1. 6. Seleção do tipo de substituição: a substituição SP-BER é caracterizada pela substituição de um único nucleótido danificado. Para o tipo LPBER e NER, os quais envolvem a remoção de mais do que um nucleótido, a simulação da excisão do dano e a nova síntese de ADN é repetida para cada nucleótido ao longo do comprimento do segmento a reparar. 7. Tipo de lesão: quando a lesão a remover é uma quebra do ADN, a iniciação da incisão do ADN (passo 8) não pode ocorrer, bem como a criação de DBS enzimáticas (passo 9), assim, nestes casos, avança-se para o passo 10, ou seja, a nova síntese de ADN. Por outro lado, se a lesão detetada para remoção é uma base danificada ou local AP, então segue-se para o passo 8. 8. Inibição da incisão de ADN: estudos recentes demonstram que a reparação BER de duas lesões espacialmente próximas na mesma ou cadeias opostas. O efeito inibitório é ainda mais pronunciado quando a lesão oposta é uma quebra ou um local AP. Este fenómeno é simulado pelo MCER pela especificação da distância de inibição (Ninh, em bp), com base no estudo de 2001 realizado por Blaisdell e colaboradores o MCER apresenta uma Ninh=3. 9. DSB enzimáticas: em alguns tipos de configurações de danos, uma quebra de ADN não reparada pode apresentar uma base danificada oposta ou um local AP que tenha sido marcado para remoção. Se, durante o processo de remoção destes dois tipos de lesões, um excerto de ADN é inserido no espaço danificado perto de uma quebra de ADN existente na cadeia oposta, uma DSB enzimática ocorrerá. Em suma, a reparação de quebras pode conduzir a dois resultados independentes: reparação correta (sem substituição de bases) e reparação com substituição de pelo menos uma base (mutação). Por seu lado, o processo de excisão de reparação de uma base danificada 109 e local AP pode resultar em 3 possíveis destinos: reparação correta, reparação com mutação e formação de um DSB enzimática. 10. Substituição de bases: atualmente, o modelo MCER não considera a formação de mutações por inserção ou deleção. O modelo MCER possibilita, no entanto, a avaliação da inserção não complementar de um nucleótido oposto a uma cadeia não danificada pela polimerase ADN. As taxas de erro das polimerases são extremamente baixas e podem variar ordens de magnitude (10-4-10-7 por cada deoxinucleótido incorporado), dependendo das características da polimerase em causa. A polimerase β é a principal responsável pela reparação via SP-BER, enquanto a polimerase δ e/ou ξ sintetizam sequencias de ADN durante o processo de reparação LP-BER ou NER. Os valores utilizados pelo MCER são: 10-4 para a polimerase β e 10-6 para as polimerases δ e ξ. O processo de inserção aleatório é simulado por dos parâmetros BD e BL que descrevem a probabilidade de erro na inserção do nucleótido. Esta probabilidade é de 0.75, pois existem 4 bases. 11. Reparação completa: quando a reparação de todos os nucleótidos num dado segmento em reparação esta finalizada, a simulação regressa ao passo 4 e seleciona o próximo nucleótido danificado para reparação. Esta reparação sequencial de lesões leva a criação de um conceito de ciclos de reparações, sendo que, um ciclo se inicia aquando da seleção da lesão a reparar (passo 4) e termina com a formação de uma DSB enzimática (passo 9) ou com a substituição de todos os nucleótidos pertencentes ao segmento de reparação (passo 11). 12. Terminar a simulação: o simulador finaliza quando todos os danos no segmento completo de ADN em estudo tiverem sido processados. Os danos que não foram classificados como DSB radioinduzidos são classificados como danos corretamente reparados, danos reparados com mutações e danos convertidos em DSB. O rendimento de cada classe de danos é tabulado em número de lesões por danos múltiplos 110 (clusters). O número de ciclos de reparação necessários para remover cada classe de danos também é transmitido no ficheiro de output. 5.5.1 INFORMAÇÃO DE ENTRADA E SAÍDA No MCER, tal como no MCDS, para a execução do simulador basta escrever na linha de comandos: MCER {nome do ficheiro de input}.inp. Esta linha inicia de imediato o simulador e cria um ficheiro de outup, que mais uma vez, é um ficheiro de texto ASCII. O ficheiro de input deste simulador é em parte igual ao ficheiro de input do MCDS (dados necessários para a simulação dos danos), seguido pelos dados necessários para simular a reparação. Os parâmetros de entrada MCER são:  Distância de inibição: Ninh geralmente é igual a 3 bp.  Probabilidade de escolha da cadeia de ADN: P=0.5 quando ambas as cadeias tem a mesma probabilidade de serem escolhidas.  Taxa de erro da polimerase utlizada na reparação SP-BER: 10-4 para a polimerase β.  Taxa de erro da polimerase utlizada na reparação LP-BER: 10-6 para as polimerases δ e ξ.  Probabilidade de inserção incorreta para bases danificadas: PhiBd=0.75.  Probabilidade de inserção incorreta para bases perdidas: PhiBl=0.75. O ficheiro de output do MCER é uma tabela que fornece os seguintes resultados:  Tempo de execução do simulador (em minutos).  Resumo das condições de input.  Resultados do MCDS.  Resultados do MCER: o Probabilidade dos três possíveis resultados dos métodos de reparação por excisão: reparação correta, mutada ou evolução para DSB enzimática. 111 o Número de ciclos de reparação necessários. o Resultados detalhados dos quatro cenários de reparação por excisão: SP-BER, LP-BER, SP-NER e LP-NER. Vários estudos têm demostrado que a apoptose é, geralmente, iniciada pela replicação de ADN danificado.129 Sendo assim, os resultados obtidos pelo MCER podem constituir um método de avaliação indireto para a estimação da probabilidade de indução de apoptose, com base nos dados de reparação do ADN. 5.6 PRINCÍPIOS DO VC Quando a radiação ionizante interage com uma célula, DSB e outras lesões do ADN são produzidas em menos de um milissegundo. De seguida, os danos radioinduzidos são processados lentamente, por várias vias enzimáticas e reações de reparação erróneas, cujo desempenho determina, o destino da célula em causa. Por outro lado, a cinética do ciclo celular pode ser altamente influenciada pelo processamento da cinética do dano. O dano crítico ao ADN é o evento iniciador de apoptose, contudo, também os danos a membranas celulares e a outros constituintes da célula podem induzir apoptose. Assim, a avaliação dos danos ao ADN radioinduzido, em particular das DSB, fornecem informação sobre o destino final da célula irradiada, pelo que, modelos de avaliação cinética da radiobiologia celular são de extrema importância. Os simuladores em radiobiologia assentam em modelos de relação doseresposta, que tem vindo a ser uma área de grande estudo e desenvolvimento. Estes modelos avaliam o número médio de DSB por célula e outras lesões ao longo do espaço temporal, aplicando equações de cinética química para produção e reparação correta e mutada de lesões. Alguns dos modelos mais conhecidos incluem: o RMR (Repair-MisRepair)18, o LPL (Lethal-Potentially Lethal)20 e o TLK (Two-Lesion Kinetic)20. Os modelos RMR e LPL acentuam as reparações erróneas, como, a produção de cromossomas dicêntricos e outras lesões letais devido à interação de duas DSB.22 No modelo LPL (Curtis, 1986)22, as quatro características importantes que 112 determinam o destino celular, quando expostas à radiação são: rendimento inicial de DSB/Gy/célula, rendimento inicial de lesões irreparáveis/Gy/célula, taxa de reagrupamento de primeira ordem e taxa de danos por emparelhamento, isto é, taxa de agrupamento de segunda ordem. Por seu lado, no modelo RMR (Tobias, 1985) cinco parâmetros chave são utilizados para determinar o potencial mutagénico e letal da radiação ionizante: rendimento inicial de DSB/Gy/célula, probabilidade da DSB ser incorretamente reparada, probabilidade da reparação errónea da DSB ser letal, taxa de reagrupamento DSB de primeira ordem e segunda ordem. O modelo adotado no Virtual Cell para correr as simulações foi o TLK. Este modelo é conceptualmente similar ao modelo RMR, contudo, neste a radiação produz efetivamente dois tipos de DSB, simples e complexas, enquanto o modelo RMR apenas considera DSB de um tipo. Por outro lado, o modelo RMR é monofásico, enquanto o modelo TLK avalia os efeitos da radiação em células, nomeadamente, a cinética de reagrupamento de uma forma mono ou bifásica.3 Devido ao aumento da flexibilidade permitido pelo TLK, o modelo necessita de oito parâmetros chave: rendimento de DSB simples e complexas/Gy/célula, probabilidade da DSB ser incorretamente reparada, probabilidade de reparação errónea letal da DSB, taxa de reagrupamento da DSB de primeira ordem, taxa de danos por emparelhamento (segunda ordem).125 5.6.1 INFORMAÇÃO DE ENTRADA E SAÍDA O simulador VC é uma solução útil e capaz de simular dois dos desfechos biológicos em células irradiadas: a morte celular e a transformação neoplástica. Este simulador fornece ainda informação sobre formação de danos e reparações no ADN, mas também sobre rendimentos de aberrações cromossómicas, indução de instabilidade genética, cinética do ciclo celular (antes e após irradiação) e probabilidade de irradicação tumoral após radioterapia celular. Sendo um esforço inicial para estudar os processos envolvidos no tratamento do cancro. Também o simulador VC, à semelhança dos anteriores, é executado a partir de uma janela de comando e iniciado com o comando: VC {nome do ficheiro de input}.ind-d-s (código para debug do simulador). 113 O ficheiro de input do simulador VC, é um ficheiro de texto ASCII dividido em vários subgrupos: cenário de exposição (exposição a uma única dose, exposição a varias doses fraccionadas, exposição a radionuclídeos devido ao decaimento exponencial e radioterapia multi-fraccionada), modelos para simulação de formação e reparação de ADN (LPL, RMR, TLK) e modelos para simulação da cinética celular e tecidular. Adicionalmente podem ser simulados cenários de instabilidade genómica ou transformações neoplásticas, bem como, cenários com ruído aleatório. Os parâmetros principais do ficheiro input do simulador VC são:  Linha de código: MODEL o DRM = TKL: seleção do modelo de reparações dos danos a utilizar, no caso dos ensaios testados, é o modelo TLK. o CMK = QECK: especifica o modelo cinético de crescimento celular (quasi-exponential cell kinetics). Sendo determinada pelos parâmetros KAP e VOL do subgrupo CCKM. Neste modelo um vasto número de densidade celular (1.038 células) é utilizado para evitar erros de excesso de fluxo.  Linha de código: CELL o DNA = 5.667D+09: conteúdo de ADN celular, em número de pares de bases, na fase G0 ou G1 do ciclo celular. o NC = 46: número de cromossomas por célula. Em células eucarióticas de humanos o valor é de 23 pares de cromossomas.  Linha de código: ENDO o DSB = 4.3349E-03: número esperado de DSB complexas endógenas por hora em cada célula.  Linha de código: IRAD o DSB = {50.149; 50.055; 49.906; 49.880; 49.631; 49.890; 50.151; 50.430; 49.635; 49.944; 130.338}: número de DSB esperado por Gy/célula. 114 o FCB = {0.13171; 0.13029; 0.13062; 0.13442; 0.13145; 0.12969; 0.13474; 0.13385; 0.12934; 0.12963; 0.45652}: fação de DSB por unidade de dose de radiação ionizante que são complexas.  Linha de código: CLRP o RHT = XXX: tempo de semi-vida para reparação de DSB, em horas. Caso se pretenda especificar que as quebras simples são mais rapidamente reparadas que as quebras duplas, devese aplicar a seguinte linha de código: RHT=XXX/XXX=0.25/9. o ETA = 2.5E-04: taxa de interação da reparação errónea com mutação, expressa em horas. o PHI = 0.005: probabilidade de uma reparação errónea de uma DSB ser letal (0.5% das reparações erróneas das DSB são letais). o A0 = AAA: probabilidade de uma reparação correta das DSB. Caso se pretenda distinguir entre a reparação de quebras simples e duplas, então é necessária a seguinte linha de código: A0=AAA/AAA=0.95/0.25. o GAM = 0.25: fração de danos erróneos que são letais, segundo a literatura 25% das aberrações cromossómicas formadas pela reparação errónea são letais.22  Linha de código: CCKM o TCC: tempo médio para uma célula completar mitose, expresso em horas. o TPOT: tempo de duplicação celular, expresso em dias. o GF: fração da população celular que se encontra ativamente em divisão (em mitose). Se GF=0, nenhuma célula se encontra em divisão (quiescentes), se GF=1 todas as células estão em divisão ativa. Para valores de GF>0, o tempo de divisão é determinado pelo TCC e TPOT. o N0: número inicial de células no início da simulação (t=0). o KAP: máximo de densidade celular (células/cm3). Quando KAP=1.0D+38, a densidade celular é elevadíssima. 115 o VOL: volume efetivo da massa celular em causa (cm3).  Linha de código: SOLVE o DBLV: nível de debug do simulador. Existem 3 níveis: 0 - Informação mínima, 1 - Informação intermédia e 2 – Informação Máxima. Quanto maior o nível de debug, maior é o tempo de CPU requerido para realizar a simulação. o ETOL: método para quantificação e determinação do erro de tolerância. Erros de tolerância na ordem dos 10-7 a 10-12 apresentam bons resultados. O tempo de processamento aumenta com a diminuição do valor ETOL. o MXSS: numero máximo de subpassos do simulador. São recomendados valores elevados. o HMAX: máxima duração do subpasso, sendo recomendado valores entre 1 e 24 horas.  Linha de código: SIMCON o FSDX: fracionamento do tempo de simulação para obtenção de resultados durante ou depois (se FSDX=0.001 resultados durante, se FSDX=1 resultados no fim da simulação). o TSAX: duração de cada subpasso após a simulação, expresso em horas. Recomenda-se valores reduzidos, de forma a obter mais informação sobre a cinética de reparação do dano e controlar melhor o fim da simulação. o TCUT: tempo após a exposição para reparação dos danos, expresso em horas. Por exemplo, se TCUT=1, a simulação será terminada a uma hora após a exposição independentemente do tempo de exposição. o FRDL: fração de danos residuais no fim da simulação que são tratados como danos letais. o ACUT: dano residual absoluto por célula no final da simulação, expresso em número de danos do ADN por célula. A simulação é terminada quando a quantidade de danos residuais (irreparáveis) é menor que o valor ACUT. 116  Linha de código: DECAY o BGDR: taxa de dose absorvida devido à radiação de fundo, expressa em Gy/h. Sabe-se que a radiação natural média do planeta é de aproximadamente 2.4 mGy/ano, logo o BGDR será de 2.73784E-07. o DCUT: dose de cutoff, em Gy. Parâmetro que limita a simulação para reparação dos danos a uma determinada dose mínima. o LAM: constante de decaimento radioativo (específica para cada radioisótopo), expressa em horas. o RHL: semi-vida física do radionuclídeo em estudo, expresso em horas. o STOL: tolerância na duração do subpasso do simulador (Gy/h). A medida que o valor STOL diminui, o tempo de cada subpasso diminui e a natureza exponencial da verdadeira taxa de dose é modelada mais eficazmente. o TCUT: tempo de cut off, em horas. Tempo utilizado para suprimir a função de taxa de dose num dado momento do tempo, após a irradiação do sistema celular de interesse. o SAD: dose absorvida no intervalo de tempo [0, TCUT], expressa em Gy. 5.7 SUMÁRIO Diversos simuladores computacionais foram criados com base no método Monte Carlo, incluindo os escolhidos para desenvolver esta Dissertação. O algoritmo utilizado para construção dos simuladores utilizados neste trabalho (MCDS, MCER e VC) é um método simplificado do código Monte Carlo, pelo que as exigências computacionais são ultrapassadas e um simples computador de uso pessoal pode ser utilizado para obtenção dos resultados. Os modelos cinéticos da produção de danos radioinduzidos e o seu processamento podem facilitar a interpretação das observações radiobiológicas. 117 Possibilitando assim a realização de estimativas quantitativas da relação doseresposta, apresentando assim grandes aplicações na área da radioterapia. Os simuladores expostos neste capítulo (MCDS, MCER e VC) apresentam pontos de ligação comuns, sendo que informações de saída de um simulador são utilizadas como dados de entrada do simulador seguinte, como se pode concluir na Figura 14. Figura 14: Esquema dos diferentes métodos utilizados na presente Dissertação para obtenção dos resultados e suas interligações.3 •Simulador de danos no ADN celular MCDS •Rendimento de cada tipo de dano/Gy/célula Output/Input •Simulador de reparação dos danos no ADN celular MCER •Resultados dos processoes de reparação BER e NER Output/Input •Simulador da cinetica celular após irradiação Virtual Cell 124 Tabela 22. Condições específicas de input utilizadas no simulador VC. Partículas Energia (MeV) RHL (Horas) LAM DSB FCB Tipo de Células TCC TPOT GF 32P 0.6955 342.72 0.00202 50.149 0.13171 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 89Sr 0.5846 1212 0.00057 50.055 0.13029 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 90Y 0.9267 64.08 0.01082 49.906 0.13062 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 117mSn 0.1268 326.4 0.00212 49.880 0.13442 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 153Sm 0.2253 46.8 0.01480 49.631 0.13145 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 166Ho 0.6511 643.2 0.00180 49.890 0.12969 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 170Tm 0.3231 3086.4 0.02626 50.151 0.13474 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 177Lu 0.1494 160.8 0.00431 50.430 0.13385 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 186Re 0.3596 90.48 0.00766 49.635 0.12934 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 188Re 2.1204 16.8 0.00170 49.944 0.12963 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 223Ra 5.71581 274.32 0.00253 130.338 0.45652 Próstata 48 500 0 / 0.5 /1 Neoplásicas 48 154 0 / 0.5 /1 Metastáticas 48 54 0 / 0.5 /1 125 Figura 15: Percentagem total das SSB radioinduzidas após irradiação com os diferentes isótopos. Figura 16: Percentagem de duas ou mais SSB na mesma sequencia de ADN (2SSB), duas ou mais SSB em segmentos opostos separados por 10 ou mais pares de bases (2 ou +SSB). 126 Figura 17: Fração de SSB complexas após irradiação com os diferentes isótopos. Figura 18: Percentagem total das DSB radioinduzidas após irradiação com os diferentes isótopos. 127 Figura 19: Percentagem de uma DSB e uma ou mais SSB separadas por no máximo 10 pares de bases (1 ou +DSB) Figure 20: Fração de DSB complexas após irradiação com os diferentes isótopos. 128 6.4 RESULTADOS DO MCER Os resultados compilados no simulador MCER estão expostos de forma conjunta no Anexo A.2. Estes incluem os resultados dos quatro principais mecanismos de reparação de quebras simples do ADN, explicados no capítulo 2: SPBER, LP-BER, SP-NER e LP-NER. O aumento do número de danos no ADN, bem como o aumento da sua complexidade dificulta o processo de reparação com sucesso, como se observa pelos resultados obtidos pelo simulador MCER. Estes resultados permitem concluir que a probabilidade de reparação correta apresenta a seguinte ordem: 166Ho > 90Y, 89Sr, 188Re > 32P, 186Re > 170Tm, 153Sm > 117mSn > 177Lu >> 223Ra, (Figura 21). Os resultados da probabilidade de uma reparação mutada após irradiação com as diferente partículas radioativas em estudo podem ser consultados na Figura 22. Para além disso, a probabilidade de evolução para DSB do ADN é: 223Ra >> 177Lu, 170Tm, 117mSn > 153Sm, 89Sr > 186Re, 90Y > 188Re, 166Ho > 32P (Figura 23). Os resultados indicam que são necessários mais ciclos de reparação para o 223Ra seguido pelo 177Lu, 117mSn > 170Tm > 90Y > 153Sm > 89Sr > 186Re, 32P > 166Ho, 188Re (Figura 24). Figura 21: Probabilidade de uma reparação correta (p COR), para SP-BER, LP-BER, SP-NER e LP-NER. 129 Figura 22: Probabilidade de reparação com mutações (p MUT), para SP-BER, LP-BER, SP-NER e LP-NER. Figura 23: Probabilidade de uma reparação com evolução para DSB (p DSB), para SP-BER, LP-BER, SPNER e LP-NER. 130 Figura 24: Número médio de ciclos necessários para reparação, para SP-BER, LP-BER, SP-NER e LPNER. 6.5 RESULTADOS DO VC Os resultados gerados pelo simulador VC estão expostos na Figura 25 até à Figura 35 e nos Anexos A.3 até A.14. A Figura 25 apresenta a fração de células que sobrevivem após irradiação com os diferentes agentes. Estes resultados demonstram que o 223Ra apresenta a menor fração de sobrevida após irradiação com uma fração média de sobrevida de cerca de 0.375, seguido pelo 170Tm com uma fração média de sobrevida de 0.783 e pelo 177Lu com uma fração média de sobrevida de 0.795. Como termo de comparação apresentam-se também na Figura 26 os resultados médios obtidos para o 153Sm (fração média de sobrevida de 0.796) e para o 89Sr (fração média de sobrevida de 0.801), dado que estes radioisótopos são mais comummente utilizados na prática clínica para alívio da dor óssea. A fração de sobrevida apresenta a seguinte ordem: 166Ho > 186Re, 188Re > 89Sr > 32P > 90Y > 117mSn > 153Sm > 177Lu > 170Tm >> 223Ra. Diferenças estatisticamente significativas são observadas em relação aos 11 131 agentes irradiantes estudados quanto a fração de sobrevida apresentada (p<0.0001 e p=0.0053 ANOVA, com e sem os valores relativos ao 223Ra, respetivamente). Figura 25: Fração de sobrevida após irradiação com os diferentes radioisótopos com e sem o 223Ra (A e B, respetivamente). 132 Figura 26: Fração de sobrevida média após irradiação com os diferentes radioisótopos. A Figura 27, Figura e a Tabela do anexo A.3 apresentam-se os resultados obtidos em termos de mutações letais por célula. Estes resultados demonstram que o 223Ra, o 170Tm e o 177Lu são os radioisótopos que induzem maior número de danos letais nas células irradiadas de entre todos os estudados (Tabela presente no anexo A.3), sendo que o 223Ra apresenta maior potencial para indução de danos letais nas células irradiadas induzindo cerca de 8.10 lesões por célula, seguido pelo 170Tm com 0.337 lesões por célula e do 177Lu com 0.317 lesões por célula. O 153Sm e o 89Sr, dois dos radioisótopos mais comummente utilizados na prática clínica para terapia paliativa das metástases ósseas, induziram cerca de 0.311 e 0.303 lesões por célula, respetivamente. Quando se analisa especificamente estes 5 radioisótopos, verificamse diferenças estatisticamente significativas com (p=0.0023, teste ANOVA) ou sem (p=0.0048, teste ANOVA) os resultados do 223Ra. Na Figura 27 é possível observar o número de lesões letais provocadas nas células por cada isótopo nos diferentes cenários testados, sendo possível concluir que com o aumento da quantidade da radiação existe um aumento do número de lesões e o contrário ocorre com o aumento do período de exposição. Estes resultados reforçam e suportam, mais uma vez, os resultados dos outros simuladores. 133 Figura 27: Danos letais provocados no ADN após irradiação com os diferentes radioisótopos. Resultados com e sem o 223Ra (A e B, respetivamente).