Determinação do intervalo postmortem através do decréscimo de citrato e DNA em ossos: influência das condições tropicais

I Maria João Teixeira Naia Determinação do Intervalo Postmortem através do decréscimo de citrato e DNA em ossos: Influência das condições tropicais Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Medicina Legal submetida ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto. Orientador – Professor Doutor Rodrigo Grazinoli Garrido Categoria – Biomédico; MSc; DSc; Perito Criminal; Diretor do IPPGF/PCERJ; Docente do Mestrado em Direito na UCP; Professor Adjunto na FND/UFRJ. Afiliação – Universidade Católica de Petrópolis. II III “O momento da morte, assim como o fim de uma história dá um sentido diferente ao que o precedeu.” Mary Catherine Bateson (escritora e antropologista) IV V AGRADECIMENTOS Este trabalho não é resultado de um esforço unilateral da minha parte, e só foi conseguido através do apoio e auxílio de mais pessoas que direta ou indiretamente estiveram envolvidos em todo o processo que deu origem a esta dissertação. Assim sendo, aproveito este meio para agradecer a todos aqueles que tornaram possível a conclusão deste ciclo de estudos. Em primeiro lugar quero agradecer à minha mãe Fátima, ao meu pai Joaquim, ao meu irmão Ricardo e à minha avó Eugénia, que me apoiaram financeiramente, psicologicamente e que foram pacientes comigo. Agradeço cordialmente à Diretora do curso de Mestrado em Medicina Legal, a Professora Doutora Maria José Carneiro de Sousa Pinto da Costa, por todo o apoio académico e burocrático. Agradeço ao meu Orientador, o Professor Doutor Rodrigo Grazinoli Garrido, por todo o apoio que me deu e por, em primeiro lugar, me ter aceitado como sua orientanda mesmo com as dificuldades logísticas que estiveram presentes desde o início. Agradeço à D. Ana, à Fabíola, ao Vicenzo e restante família por me terem recebido como se fosse da família, no Rio de Janeiro, e por todo o apoio que me deram durante a minha estadia. Agradeço a todo o pessoal do IPPGF/PC-RJ por me terem mostrado tudo o que envolve o trabalho nessa instituição e por me terem aceitado tão rapidamente no grupo de trabalho. Agradeço a todos os meus amigos. Agradeço a Deus por fazer com que esta jornada tenha sido percorrida da melhor forma. Obrigada! VI VII RESUMO A tanatologia forense é um ramo das Ciências Forenses, que estuda tudo o que envolve o corpo humano morto. Quando um cadáver humano é encontrado, em qualquer circunstância e em qualquer lugar, torna-se objetivo primário procurar responder a uma série de questões: Quem é?, Como morreu? e Porque morreu?. A outra questão fundamental nesta primeira avaliação necrópsica é relativamente à data da ocorrência da morte, isto é: Quando morreu?. O tempo que passa desde a morte de um indivíduo, até que este é encontrado, é cientificamente denominado como Intervalo Postmortem (IPM). Existem diversos métodos para a determinação deste IPM que podem ser dependentes de fatores internos e/ou externos ao próprio cadáver. Alguns desses métodos estão relacionados com fatores bióticos e abióticos do cadáver e resultam de observações da evolução natural da decomposição do corpo humano. Existem ainda métodos que analisam o meio envolvente, como a fauna e a flora do local, este método é denominado de Entomologia Forense. Atualmente, têm sido desenvolvidos métodos mais sofisticados e que, na sua maioria, são realizados em laboratório. No geral, estes novos métodos baseiam-se em alterações biológicas, metabólicas e orgânicas que ocorrem no cadáver. No entanto, não existe ainda um método que seja o método ideal de determinação do IPM. Todos os que existem até então, apresentam aspetos negativos e que atrapalham o andamento da investigação criminal. O uso da taxa de citrato no corpo humano para a determinação do IPM, mais especificamente no material ósseo, foi estudado em 2010 por Schwarcz et al. Nesse estudo, as condições ambientais estudadas dependiam de baixas temperaturas. Sendo assim, no sentido de fundamentar ou contra-argumentar esse trabalho, foi realizado um estudo análogo, acerca da variação do citrato no osso humano e a sua relação com o IPM. Uma vez que este estudo foi realizado em parceria com o IPPGF/PC-RJ, as variáveis climáticas utilizadas foram opostas às do estudo anterior. Desta vez, as temperaturas foram elevadas até cerca de 40ºC e a humidade foi também aumentada significativamente. Paralelamente a esta análise, foi feita a quantificação do DNA para demonstrar uma eventual relação temporal com o DNA existente nas mesmas amostras de osso humano, que estiveram sujeitas às mesmas condições climáticas. Foram ainda realizados ensaios estatísticos, uns relativos à criminalidade violenta no Rio de Janeiro, com dados recolhidos do ISP. Por outro lado, foram recolhidos dados referentes aos exames realizados no IPPGF/PC-RJ até à data, e respetivos resultados. VIII Teoricamente e à imagem do que resultou do estudo de Schwarcz et al, esperavase uma diminuição, ao longo do tempo, dos níveis de citrato no osso do cadáver. O decréscimo de citrato e de DNA foi constatado através da influência das altas temperaturas e humidade elevada, ou seja, em ambiente de clima tropical, apesar do curto período de tempo utilizado. IX ABSTRACT Forensic thanatology is a branch of forensic science that studies everything related to the dead human body. When a human corpse is found, under any circumstances and anywhere, the primary goal is to seek the answer to a series of questions: Who died?, How he/she die? and Why he/she die?. The other key issue in this first necropsy assessment is associated with the date of the occurrence of death, that is: When did he/she die?. The time that goes by since the death of an individual, until he/she is found, is scientifically called Postmortem interval (PMI). There are several methods for the determination of the PMI which can depend on internal and / or external factors to the body itself. Some of these methods are related to biotic and abiotic factors of the corpse and the result of observations of the natural evolution of the decomposition of the human body. There are also methods that analyze the surrounding environment, such as the flora and fauna of the place, this method is called forensic entomology. Currently, more sophisticated methods have been developed, which are mostly performed in the laboratory. Overall, these new methods are based on biological, organic and metabolic alterations that occur in the body. However, still there isn´t a method considered to be the ideal as far as determining the PMI concerned. Every method used so far, show negative aspects which interfere in the progress of the criminal investigation. The use of the rate of citrate in the human body to determine the IPM, more specifically in bone material was studied in 2010 by Schwarcz et al. In this study, the environmental conditions studied depended on low temperatures. Therefore, in order to support or argue against this work, a similar study was conducted on the variation of citrate in human bone and its relationship to the IPM. Since this study was conducted in partnership with the IPPGF/PC-RJ, climate variables were opposed to the previous study. This time, the temperatures were raised to about 40 ° C and humidity was also increased significantly. Parallel to this analysis, the DNA quantification was made to demonstrate a possible temporal relation with the existing DNA on the samples of human bone, which were subjected to the same climatic conditions. Statistical tests were also performed, some of them related to violent crime in Rio de Janeiro, with data collected from the ISP. Furthermore, data concerning tests performed in IPPGF/PC-RJ to date, and their outcomes were collected. Theoretically and similar to the results of Schwarcz et al study, the levels of citrate in the corpse bone were expected to decrease over time. The decrease of citrate and XVI representam os valores, em %, do DNA no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Os símbolos azuis (losangos) representam os valores, em %, do Citrato no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear……………48 Figura 15 - Comparação entre os testes de DNA e de Citrato, em %, nas condições de Temperatura de 40ºC e Humidade elevada, ao longo do tempo, em dias. Os símbolos vermelhos (quadrados) representam os valores, em %, do DNA no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Os símbolos azuis (losangos) representam os valores, em %, do Citrato no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear…………………………………………………………………………49 Figura 16 - Comparação entre os testes de DNA e de Citrato, em %, nas condições de Temperatura de 40ºC, ao longo do tempo, em dias. Os símbolos vermelhos (quadrados) representam os valores, em %, do DNA no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Os símbolos azuis (losangos) representam os valores, em %, do Citrato no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear…..……….50 XVII Índice de Quadros Quadro 1 – Dados oficiais das estatísticas de segurança pública do Estado do Rio de Janeiro referentes ao mês de Março de 2014 (Fonte: ISP)…………………………………35 Quadro 2 – Dados oficiais das estatísticas de segurança pública do Estado do Rio de Janeiro referentes ao mês de Abril de 2014 (Fonte: ISP)………………………………...…35 Quadro 3 – Dados oficiais das estatísticas de segurança pública do Estado do Rio de Janeiro referentes ao mês de Maio de 2014 (Fonte: ISP)…………………………………..36 XVIII 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. Tanatologia Forense Os principais objetivos decorrentes de uma investigação criminal envolvem a determinação da causa e modo da morte, a identificação do cadáver se for desconhecido e a determinação da data do evento. Para tanto, é preciso fazer a recolha de evidências do corpo que podem ser usadas como prova incriminativa ou de inocência de um suspeito e podem dar indicações de como a morte ocorreu: a documentação de feridas relevantes ou a falta destas e de como estas ocorreram; a documentação de doenças naturais do indivíduo; a determinação ou exclusão de outras causas que possam ter contribuído para a morte do individuo; e a providência de testemunhas para quando os casos seguem para o tribunal. Para além destes objetivos, ao longo da investigação podem surgir outros e pode não ser necessário ou não ser possível responder a todos. As dificuldades colocam-se muitas vezes por razões diversas e em quase todos os estágios da investigação. Ao tentar fazer-se a identificação do cadáver nem sempre é possível devido ao estado avançado de decomposição do cadáver ou à falta de familiares para estabelecer reconhecimento facial ou comparação de DNA. Também quando se tenta diagnosticar a causa da morte por vezes torna-se difícil ou até mesmo quase impossível uma vez que há mortes que permanecem indeterminadas ou inconclusivas. Para além desta dificuldade, por vezes mesmo conseguindo chegar à causa da morte, pode não ser possível realizar o diagnóstico diferencial (homicídio, suicídio, acidente) por falta de dados (informação clínica, informação familiar, informação policial, entre outras), por falhas no exame do local ou falhas na necrópsia (SWIFT, 2006). O ramo das ciências forenses que, partindo do exame do local, da informação acerca das circunstâncias da morte, e atendendo aos dados do exame necroscópico procuram responder a uma série de questões é a Tanatologia Forense (POUNDER, 2000). As mortes que têm interesse médico-legal podem ser classificadas quanto à reversibilidade em: aparente, relativa e absoluta; quanto à extensão: celular ou anatómica; quanto ao modo; natural, violenta, suspeita. É possível ainda classificar a morte quanto à rapidez em: súbita ou agónica. A morte em si pode ser definida como a cessação permanente das funções cardiacas e/ou respiratórias. Contudo, atualmente, devido ao desenvolvimento de 2 equipamentos específicos, é possível manter artificialmente os batimentos cardíacos e a ventilação do individuo. Este aspeto agregou uma outra definição de morte, a morte cerebral. Numa perspetiva médico-legal não é tão importante que seja definido o momento exato da morte porque a maior parte dos casos já são analisados após ser pronunciada a morte clínica. Assim, nesta perspetiva pode dizer-se que a morte é a cessação total e permanente de todas as funções vitais do corpo humano. Alguns autores referem ainda que a morte não é um momento, mas sim um processo que se desenrola ao longo de um determinado periodo de tempo (KNIGHT, 1996). Com a cessação das funções vitais, surgem fenómenos abióticos. Os fenómenos abióticos podem ser imediatos, surgindo imediatamente após a morte (perda da consciência, insensibilidade geral, ausência de batimento cardíaco, abolição do tónus muscular, cessação dos movimentos respiratórios); intermediários, relacionados com o relaxamento muscular inicial (midríase, queda da mandíbula, fenda palpebral, dilatação do ânus); consecutivos, importante para a cronotanatognose ou determinação do intervalo postmortem - IPM (dessecamento tegumentar, rigidez cadavérica, livores de hipóstase, arrefecimento corporal) (KNIGHT, 1996). 1.2. Cronotanatognose A morte é um acontecimento inevitável, embora ocorra de forma imprevisível. Na maioria dos casos, quando os cadáveres são descobertos não se sabe o momento do evento fatal, o que impossibilita o início de uma boa investigação. Essa datação é muitas vezes variável e dependente de diversos fatores, tais como o modo e o local da morte e as condições ambientais onde o corpo foi encontrado. Assim, um dos principais problemas que ainda existe na perícia criminal e médico-legal é a determinação do intervalo postmortem, principalmente nos casos onde haja suspeita de homicídio (JAFFE, 1983). Uma vez que a maioria das vítimas de homicídios são encontradas nas primeiras 48h, torna-se extremamente importante datar o IPM de uma maneira rápida e com especificidade e sensibilidade capaz de distinguir dentro desses valores (JOHNSON e FERRIS, 2002). Contudo, apesar dos inúmeros avanços científicos e tecnológicos, a capacidade para estimar a data da morte mantém-se limitada na prática forense. Os métodos existentes apresentam uma margem de erro de 8h o que dificulta essa determinação para cadáveres recentes (JOHNSON e FERRIS, 2002). 3 Para auxiliar essa datação, os profissionais recorrem ao cruzamento de informações obtidas de diversas fontes, nomeadamente de evidências do próprio cadáver, do meio que envolve o corpo e a partir da história clínica e dos acontecimentos e atividades que o indivíduo desenvolvia antes de morrer (JAFFE, 1983). Na verdade, a literatura é constantemente expandida por novos métodos que buscam determinar alterações ocorridas durante o intervalo postmortem, contribuindo para determinar com maior exatidão o intervalo temporal a partir da morte. Contudo, essas alterações sofrem importante variação decorrente das características do meio ambiente. O conceito cronotanatognose é constituído pelas palavras gregas kronos que significa tempo, thanatos nome do Deus grego relacionado com a morte e que, por isso, deu origem à palavra morte e gnosis que significa conhecimento. Assim, pode-se afirmar que cronotanatognose é o conhecimento ou a determinação do tempo que ocorreu após a morte até que o cadáver é encontrado, também anteriormente referido como IPM. Dessa forma, por meio de pesquisa exploratória e descritiva, desenvolvida a partir de documentação indireta de fontes secundárias como livros, artigos e sites, procurou-se mostrar os métodos usuais e aqueles atualmente propostos para a determinação do IPM. Além disso, foi proposta a reunião do que se conhece sobre as possíveis interferências das condições ambientais, em especial a alta temperatura e humidade comum das regiões tropicais, na determinação do IPM. Neste sentido, este estudo teve por principal objetivo desenvolver uma metodologia para determinação do IPM no Brasil, simulando-se em laboratório condições de elevadas temperatura e humidade. A escolha de amostras no estado do Rio de Janeiro, Brasil, deveu-se ao fato de se tratar de uma cidade com um número elevado de casos de crimes, sem identificação da maioria das vítimas, o que poderia contribuir para a elucidação de crimes, ou para a devolução do direito dos familiares terem as suas vítimas reconhecidas. 1.2.1. Importância da determinação do IPM O IPM (intervalo postmortem) corresponde ao período de tempo entre a ocorrência da morte e o momento em que o corpo é encontrado (GREENBERG e KUNICH, 2002). A determinação da data da morte é um dos componentes essenciais no decorrer de uma investigação forense, no entanto é ainda uma área pouco desenvolvida na medida em que existem poucos testes para determinar esse valor e mesmo esses, são por vezes falíveis com alguma facilidade. 4 Esta datação nem sempre é fácil de ser realizada, pois está demasiadamente dependente de diversos fatores. Superficialmente, ela está relacionada à análise dos fenómenos cadavéricos naturais do corpo, mas como também estes são pouco objetivos e variam consoante a influência de fatores internos e externos, o que resulta dessa análise, ou seja, a data provável do acontecimento é muitas vezes um valor aproximado ou até um intervalo de tempo (WOELFERT, 2003). Os fatores de que os fenómenos cadavéricos dependem para atuar podem ainda funcionar como impulsionadores ou inibidores da decomposição do cadáver, o que irá resultar num adiamento ou atraso do intervalo postmortem. É ainda de notar que quanto maior o tempo que se demora a encontrar um corpo, ou seja, quanto maior o IPM, mais difícil se torna para determinar o seu valor e, consequentemente, este será menos sensível podendo existir uma diferença de horas, dias ou até semanas. Em casos de morte violenta, a datação do IPM tem importância na reconstrução do modo e das circunstâncias da morte, na ligação do suspeito à(s) cena(s) do crime ou à vítima e no estabelecimento da veracidade das informações fornecidas por testemunhas. O IPM também tem aplicações na área cível, em casos de morte natural, acidental ou suicídio, por ter implicações em questões sucessórias (GREENBERG e KUNICH, 2002). Apesar da importância na determinação do IPM, existem poucos estudos que descrevam os efeitos climáticos que estão envolvidos na decomposição de restos mortais. Em estudo efetuado neste sentido, investigaram-se os efeitos sazonais, temperatura e pluviosidade com o índice de perda de massa de cadáveres de porcos e com a duração das fases dos processos de decomposição cadavérica. Verificou-se interação significativa entre a estação do ano e o tempo que faltava para completar a putrefação: seria maior no inverno, seguido do outono, primavera e verão. A precipitação e as altas temperaturas, como ocorrem nas regiões tropicais do globo, incrementam tanto os índices de perda de massa, como os índices de progressão das fases de decomposição (ARCHER, 2004). 1.2.2. Métodos Clássicos Os métodos de datação do IPM que se baseiam em avaliações subjetivas do cadáver demandam a análise e o conhecimento prévio das alterações e fenómenos cadavéricos que ocorrem em cada estágio após a morte. No entanto, uma vez que são métodos subjetivos os resultados podem não ser consensuais e podem até ser adulterados involuntariamente. Isto é, dependem da experiência do profissional, das 5 técnicas que ele usa e, ainda, de fatores externos que não são controlados, como a temperatura, a humidade e a ação de animais ou fatores inerentes ao próprio cadáver (fenómenos cadavéricos que podem acelerar, retardar ou conservar os processos de decomposição natural do cadáver). Estes métodos avaliam os fenómenos que se começam a verificar logo após a cessação da atividade biológica ou metabólica do indivíduo, são os denominados fenómenos postmortem. Classicamente, os fenómenos postmortem podem ser categorizados como abióticos ou transformativos. 1.2.2.1. Fenómenos cadavéricos abióticos Os fenómenos cadavéricos abióticos são aqueles que se tornam evidentes logo após a morte do indivíduo, ainda antes da proliferação bacteriana e têm curta duração. São exemplos: arrefecimento corporal, aparecimento de livores de hipóstase, dessecamento tegumentar e rigidez cadavérica. Estes ocorrem em todos os casos de morte e não dependem do modo como ocorreu o evento fatal (CAÑADAS et al, 2003). O arrefecimento corporal (“Algor mortis”) tem início logo que as funções vitais do corpo são cessadas, tais como os processos metabólicos e a circulação sanguínea, que mantêm a temperatura corporal constante em torno de 36ºC. Pelas leis da física, o corpo apresenta a tendência para atingir um equilíbrio térmico com o meio ambiente. Assim, prevê-se que o corpo humano perca em torno de 1ºC por hora após a morte (SWIFT, 2006). Portanto, o controlo da medição da temperatura do cadáver é um método válido para determinar o intervalo postmortem. Geralmente, a temperatura é obtida de regiões que não estão em contato direto com o meio ambiente, como por exemplo, das axilas e da região retal. Porém, esse método, apesar de fácil e rápido, apenas se mostra confiável para as primeiras 10 horas após a morte. A imprecisão do método de arrefecimento está relacionada com a velocidade a que se atinge o equilíbrio, que é uma junção de fatores muito específicos como, a temperatura ambiente que pode oscilar bastante, a quantidade de tecido adiposo no corpo, que funciona como isolante térmico, o volume corporal total e as vestes que eventualmente cubram o corpo (DAVY, 1839). O aparecimento de livores de hipóstases (livor mortis) e a lividez são dois fenómenos com características distintas que ocorrem ao mesmo tempo e nunca isoladamente com uma causa em comum. Com a morte do indivíduo, naturalmente a circulação sanguínea é cessada e assim o sangue parado no sistema tende a acumular- 6 se nas regiões mais baixas, mais próximas do solo, devido à ação da força gravitacional. Essas regiões vão tomar uma coloração muito intensa de tons arroxeados. Por outro lado, as regiões mais elevadas perderão o sangue e irão sofrer uma descoloração, denominada de lividez cadavérica (KNIGHT, 1996). A lividez e a hipóstase começam a surgir nas primeiras horas após a morte. Durante esses primeiros tempos, é possível verificar que pressionando o local hipostático, o sangue espalha-se e a cor desaparece e é restabelecida quase que de imediato ao cessar a pressão. Quando o IPM é maior, cerca de 6 a 15 horas, a pressão feita nessas zonas já não irá resultar no mesmo efeito, pois os livores estarão fixados. Quando não existem hemorragias ou em casos de asfixia, as regiões hipostáticas estão bem visíveis. A rigidez cadavérica (rigor mortis) é um dos últimos fenómenos cadavéricos de curta duração. Tem início de 2 a 4 horas após a morte e tem duração de cerca de 12 a 24 horas até que se dê o início dos fenómenos de putrefação (KNIGHT, 1996). A causa da rigidez dos músculos deriva da falta de ATP. Com a presença de ATP, a interação entre a actina e a miosina mantêm a musculatura relaxada. Porém, a rigidez cadavérica pode ainda ser afetada por outros fatores, tais como, um choque emocional no momento que antecedeu a morte o que resulta em precipitação deste fenómeno ou então, pelo contrário, se o indivíduo estava realizando algum exercício físico antes de morrer, isso poderá atrasar essa rigidez. Tal como acontece com todos os fenómenos cadavéricos, a rigidez é também dependente de influências climáticas. Por exemplo, quando um cadáver se encontra num ambiente com temperatura e humidade elevadas o fenómeno irá ocorrer mais tardiamente do que num cadáver mantido a temperaturas baixas (KNIGHT, 1996). O dessecamento tegumentar advém de um fenómeno de relaxamento que surge com o final da rigidez cadavérica, logo tem início entre as 12 e 18 horas após a morte. Nesta fase resulta em flacidez dos tecidos, o que levará ao dessecamento. É possível observar que, ao se fazer pressão nos tecidos, estes não vão retornar à forma anterior. Para além destes fenómenos existem ainda outras alterações no organismo capazes de fornecerem uma data aproximada da morte. É possível aferir o IPM pelos níveis de potássio no humor vítreo. É sabido que a quantidade de potássio aumenta, progressivamente, à medida que transcorre o tempo após a morte, sendo que os valores progressivos são confiáveis para os climas quentes, apenas para as primeiras 12 horas posteriores ao óbito. Por outro lado, em climas frios, a precisão pode estender-se por 24 horas. Assim sendo, este método não é aconselhável ser utilizado na realidade brasileira, ou em países de clima tropical. 7 A avaliação do conteúdo gástrico do indivíduo pode dar também alguma indicação significativa do IPM, permitindo verificar em que fases de digestão se encontram os alimentos. Contudo, o tempo de esvaziamento do estômago é variável, tanto pelo tipo dos alimentos ingeridos, como pelas idiossincrasias normais ou patológicas de cada pessoa. Importa verificar as principais substâncias constituintes dos alimentos, bem como os reflexos hormonais autónomos, entre o estômago e o duodeno. Isto torna-se decisivo para influenciar o tempo de permanência dos alimentos no organismo. Assim, os lípidos são os que apresentam um trânsito intestinal mais demorado e, em contrapartida, os hidratos de carbono são os que apresentam uma permanência mais breve no organismo, sendo certo que as proteínas ocupam um lugar intermediário. Quando o conteúdo do estômago do cadáver exibe alimentos não digeridos, podese concluir que alguma refeição foi realizada, pelo menos, nas últimas duas horas antes do óbito. Existe um determinado conjunto de alimentos que podem ser encontrados no estômago e cujo achado pode servir como indício cronológico do lapso transcorrido desde a sua ingestão. Por exemplo, alimentos líquidos como a água, leite, chá ou café, permanecem no estômago do vivo até 2 horas após a ingestão. Por outro lado, alimentos mais difíceis de processar, como por exemplo carne de porco e legumes, podem permanecer até 5 horas no organismo. Desde que conhecidos os hábitos alimentares da vítima, como por exemplo, os seus horários de refeições, tipos de alimentos ingeridos e quantidade de alimentos por refeição, os achados do conteúdo gástrico poderão auxiliar, ainda mais, na determinação do momento do óbito (HENSSGE et al, 2002). É ainda possível verificar alterações oculares nos cadáveres, tais como, dilatação pupilar, tela viscosa da córnea, segmentação da coluna sanguínea dos vasos oculares e perda da turgência dos globos oculares. Foi desenvolvida uma técnica de tonometria ocular que consiste no estabelecimento de uma correlação confiável entre a desidratação e o tempo transcorrido desde o decesso. Esta técnica é simples, rápida e de baixo custo e ainda apresenta uma margem de erro de apenas 1 hora, para avaliação feita nas 24 horas após o óbito (RUTTY, 2001). 1.2.2.2. Fenómenos cadavéricos transformativos Os fenómenos cadavéricos transformativos são responsáveis por modificações da morfologia e estrutura mais profundas e duradouras do cadáver e são causados por uma 14 O clima tropical no país caracteriza-se pela existência de temperaturas médias superiores a 18ºC e diferenças sazonais marcadas pelo regime de pluviosidade, períodos que também regulam os regimes fluviais. Tal como nas regiões de baixas altitudes, nas quais está inserido o Brasil, ocorre um fenómeno de isotermia, isto é, a amplitude térmica anual não varia além de 6ºC, (ROSS, 2003) o que pode ser observado na Figura 2, para o Rio de Janeiro. A elevada taxa de humidade, no território brasileiro, é também influenciada pela cobertura vegetal fechada e abundante no país (ROSS, 2003). Figura 2 - Variação da temperatura (ºC) ao longo do ano 2013 na cidade do Rio de Janeiro. (Fonte: INMET) Apesar das características da tropicalidade se manifestarem em quase todo o país, encontram-se algumas diferenças entre algumas regiões. No entanto, o clima no geral permanece sempre tropical (ROSS, 2003). Cada método usado atualmente para determinar o IPM é dependente das variações de temperatura e de humidade existentes no local onde o corpo foi encontrado. Assim, as elevadas temperaturas e o grande percentual de humidade característicos dos trópicos, contribuem significativamente para a proliferação dos fenómenos putrefativos e deterioramento do aspeto morfológico do cadáver, o que faz com que seja fundamental manter cautela e um maior rigor na hora de determinar o IPM. Para além disso, estes fatores climáticos influenciam ainda o aparecimento de alterações macroscópicas que resultam da ação de fatores externos e internos, tais como danos peri e/ou postmortem (LUCIO, 2013). Alguns autores afirmam que a temperatura ideal para que ocorra a decomposição do cadáver varia entre os 21 e os 38ºC, tais valores enquadram-se dentro dos valores de 15 temperatura médios que são verificados no Brasil e que podem também ser observados na Figura 2 referente ao Rio de Janeiro. Para além disso, essa temperatura aliada a elevados níveis de humidade, ativam mais ainda a decomposição (POUNDER, 2000). Assim, ainda não se pode afirmar que exista um método que possa atender a todos os casos, ou seja, um “método perfeito”. Quando se pretende datar o evento da morte, tem de se ter em conta diversas variáveis que estão implícitas ao cadáver, mas também aquelas que estão no meio envolvente e que podem ser significativas, dando origem a resultados, por vezes, discrepantes. 1.4. Mortes violentas O homicídio é, muitas vezes, encarado como uma simples ferramenta usada pelos criminosos violentos para alcançarem os seus objetivos. Na realidade essa ideia é errada assim como a ideia de que apenas um determinado grupo de indivíduos da sociedade, os marginalizados, são capazes de cometer esse tipo de crime (UNODC, 2013). Como o homicídio afeta todo o tipo de pessoas, tanto autores como vítimas, é preciso que a violência letal seja analisada e avaliada sob vários pontos de vista. O homicídio é um dos principais fatores medidores da violência nas sociedades. Sendo assim, os dados acerca de homicídios podem ter um papel preponderante na monitoração da segurança e da justiça de um país (UNODC, 2013). De acordo com a UNODC, existem três tipos de homicídios: homicídio relacionado com outras atividades criminosas; homicídios interpessoais; homicídios socio-politicos. Este tipo de classificação encontra-se esquematizado na seguinte Figura 3 onde, para além destas classificações enumeradas anteriormente, pode ver-se outras subclassificações consideradas pelo UNODC. 16 Figura 3Classificação das Mortes violentas segundo o UNODC. (Editado de: UNODC) Segundo o estudo “Global Study Homicide 2013”, o homicídio intencional causou a morte de cerca de meio milhão de pessoas no mundo, em 2012. Sendo que no continente americano a percentagem desses crimes foi mais elevada, cerca de 36%, relativamente aos outros continentes. Em África ocorreram 31% desses homicídios, na Ásia 28%, na Europa 5% e na Oceânia apenas 0,3% (UNODC, 2013). Os níveis elevados de homicídios no continente americano são um legado da sua história de anos e décadas de violência politica e criminosa, o que tem levado a um declínio dos níveis de homicídios em certos países. Contudo, os níveis de homicídios em alguns países americanos, tais como o Brasil, estão estagnados, embora a um nível elevado. Por outro lado, em países com valores históricos elevados, tais como África do sul, Lesotho, Rússia Federal e países da Ásia Central, têm vindo a ser aplicadas estratégias no sentido de quebrar o seu próprio ciclo de violência e têm vindo a registar um declínio na taxa de homicídios (UNODC, 2013). A morte violenta é o tipo de morte que é consequência de um crime violento e que não é natural. Entre elas encontram-se o homicídio, suicídio ou a morte acidental, que apresentam particularidades que devem ser analisados numa investigação criminal para poder existir um diagnóstico da causa jurídica (SANTOS, M.C.C.L., 1997). A etiologia da palavra homicídio tem origem no latim hominis excidium que significa morte injusta de um homem praticado por outro. De acordo com o Código Penal Brasileiro está descrito no art. 121º como o ato de matar alguém. Também na Lei Mortes Violentas Mortes de Guerra/Conflitos Suicídios Mortes não relacionadas com conflitos Homicídio Intencional Relacionado com outras atividades criminosas Interpessoais Socio-políticos Morte por legítima defesa Morte por intervenções legais Homicídios não intencionais Negligente Não negligente 17 Portuguesa, no art. 132º do Código Penal, quem “matar outra pessoa” será punido. Dentro da categoria de homicídios existem diversos tipos, no entanto destacam-se ainda os crimes infantis como os abortos que também estão previstos na Lei, com consequente punição. A morte acidental, como o nome sugere, não é uma morte previsível nem premeditada. Assim, pode acontecer de várias formas geralmente relacionada com acidentes de trabalho ou com acidentes de viação. É considerada uma morte violenta por não ocorrer de forma natural (CÓDIGO PENAL, 2014). O suicídio ou morte voluntária é um “auto-homicídio”. Durkheim dizia que o “suicídio é todo o caso de morte que resulta, direta ou indiretamente de um ato positivo ou negativo, realizado pela própria vítima, a qual sabia dever produzir este resultado”. As causas que levam a este acontecimento são diversas e podem estar associadas a fatores intrínsecos ou extrínsecos à própria vítima. Hoje em dia, os problemas psicossociais são os principais motivos da ocorrência do suicídio. Historicamente, na antiga Roma punia-se o suicídio do soldado por prejuízo causado ao Estado e ainda do réu e do escravo por prejuízo patrimonial. (DURKHEIM, E. 2001) No Código Penal Brasileiro o suicídio aparece no art. 122 mas é punido aquele que induz, instiga e auxilia o suicídio e não o próprio suicida. 18 2. OBJETIVOS Através da análise de estudos anteriores, verificou-se a existência de um método de determinação do IPM através da concentração do citrato no osso. Este estudo tinha analisado a eficácia do método em ambiente com temperaturas negativas (SCHWARCZ et al, 2010). Assim sendo, pretendeu-se com este trabalho testar o uso do método, referido anteriormente, em amostras humanas e em condições ambientais simulando as que se fazem sentir no Rio de Janeiro e, paralelamente, verificar a sua mesma utilidade procurando tornar-se possível o seu uso recorrente em investigações criminais. Simultaneamente foi também analisado o DNA das amostras e, assim, pretendeuse avaliar a quantidade e qualidade do material extraído e se possível determinar-se os perfis genéticos das amostras, para que se tenha uma análise com mais informações para se poder trabalhar e fundamentar e argumentar melhor este trabalho. No decorrer do desenvolvimento deste trabalho foi ainda realizado uma recolha de dados estatísticos relativos aos exames realizados no IPPGF/PC-RJ que fossem relevantes para o estudo, nomeadamente aqueles que teriam sido realizados com o intuito de “Identificação de cadáver” e ainda os que teriam usado o material ósseo como amostra a examinar. Uma vez que este instituto trata de todos os casos do estado do Rio de Janeiro, seria ainda importante observar e avaliar as estatísticas do Instituto de Segurança Pública no que toca aos temas da violência e aos dados de morte violenta que têm ocorrido nessa área geográfica. Espera-se então que, com este trabalho, se possam chegar a algumas conclusões tais como:  eficácia do método do citrato em clima tropical;  eficiência do método do citrato num curto espaço de tempo de experimentação;  avaliação do material biológico em relação à quantidade e qualidade do DNA;  análise da relação entre concentração de citrato e quantidade de DNA por amostra;  adequação e necessidade do uso do método na realidade quotidiana do Rio de Janeiro;  determinação das estatísticas de morte violenta no Rio de Janeiro;  determinação dos dados estatísticos acerca dos exames de identificação de cadáver realizados no Rio de Janeiro. 19 3. MATERIAL E MÉTODOS Numa primeira fase do trabalho e de forma a fundamentar com mais consistência o estudo, foi realizada uma recolha de dados e a sua posterior análise estatística. Por um lado foram levantados os dados internos do Instituto de Perícias e Pesquisas em Genética Forense da Polícia Civil do Rio de Janeiro. No qual foram identificados os exames realizados neste estabelecimento com o intuito de identificação humana e que fizeram uso de material ósseo para chegarem a essas conclusões, no período compreendido entre 2007 e maio de 2014. Esses dados foram cedidos pelo Diretor do IPPGF que se prontificou a ajudar e colocou à disposição todo esse material. Estas informações estão registadas em relatórios com formatação própria e neles insere-se toda a informação explicativa acerca de cada caso associado ao laudo correspondente. Posteriormente fez-se a análise estatística recorrendo à realização de gráficos em função do tempo. Paralelamente a este teste estatístico foram ainda recolhidos os dados oficiais do Instituto de Segurança Pública que é o “órgão responsável pela pesquisa, análise criminal, capacitação profissional e Coordenação dos Conselhos Comunitários de Segurança no Estado do Rio de Janeiro.” Esta recolha foi realizada através da página de internet da instituição (www.isp.rj.gov.br) que divulga frequentemente os dados estatísticos que estão constantemente sujeitos a atualizações. Desta recolha resultaram um conjunto de tabelas com as informações estatísticas dos dados da criminalidade violenta que ocorreu no Rio de Janeiro, durante os meses de janeiro e maio de 2014, que o estudo foi realizado. Essas tabelas foram editadas para que se adequassem ao contexto onde se inserem, ou seja, na esfera da morte violenta. Para a parte laboratorial deste trabalho foi utilizado um pedaço de osso longo (fémur), do sexo masculino, com massa total de 95,051g. Esta amostra estava previamente identificada com o GRC 288/2013, proveniente da Delegacia 21ª do Rio de Janeiro. A colheita desta parte de fémur foi realizada no dia 16 de outubro de 2013, sendo que o cadáver deu entrada no Instituto de Medicina Legal Afrânio Peixoto, Rio de Janeiro, no dia 15 de outubro de 2013. O osso foi cortado em 4 partes, 3 delas com semelhantes massas e outra menor. O corte do osso foi realizado no IPPGF/PC-RJ com o auxílio de um técnico especializado e num local próprio para o efeito. Cada uma das partes foi seguidamente incubada em condições ambientais diferentes. A primeira, com massa 32,782 g, foi aquela que sofreu influência da temperatura elevada (40ºC). Esta foi denominada de Amostra de Osso dependente da Temperatura a 20 40ºC (OT40). Utilizou-se um recipiente de vidro vedado com parafilme e colocou-se num banho termostatizado (40ºC). O propósito de vedar o recipiente é para não existir influência da humidade elevada que, nesse ambiente, certamente se faz sentir. A outra parte, com massa 28,054 g, foi mantida em temperatura ambiente (24ºC) não sofrendo outra alteração. Foi então denominada de Amostra de Osso dependente da Temperatura Ambiente (OTA). Este recipiente foi também vedado com parafilme a fim de não sofrer ataques de insetos ou libertação de maus odores e também serviu como uma prevenção para outro tipo de possíveis acidentes, tais como queda do material ou entrada de objetos estranhos. A terceira parte do osso, com massa 31,295 g, foi dependente de alterações ao nível da temperatura (40ºC) e da humidade elevada (≈100%). Esta amostra foi denominada de Amostra de Osso dependente da Temperatura a 40ºC e Humidade elevada (OTH). Assim, este material foi inserido num recipiente de vidro que foi tapado com um material de tecido não tecido (TNT), sobrepondo-se 4 camadas deste material, que é fino e permeável. Uma vez que este recipiente foi colocado num banho termostatizado seria de prever que ocorresse uma precipitação excessiva diretamente no material ósseo o que poderia comprometer o trabalho experimental. No entanto, como o material é permeável, manteve-se a influência da humidade no osso. A última parte que foi cortada, bem menor que as outras, com massa 2,904g, foi inserida num tubo Falcon e armazenada num congelador (-20ºC), para ser analisada apenas no último dia de colheitas. É de referir que durante uma parte da atividade experimental ocorreram alguns erros inesperados e sem influência dos envolvidos neste trabalho em relação ao banho termostatizado. Os erros técnicos que surgiram no aparelho fizeram com que pelo menos durante 16 dias da experiência, a temperatura e a humidade das amostras OTH e OT40 não tenham sido rigorosamente controladas, o que pode ter comprometido alguns resultados. 3.1. Extração do citrato Para a extração do citrato, o método utilizado foi adaptado do método realizado por Schwarcz (SCHWARCZ et al, 2010). 1. Cortou-se 2/3 g de cada parte do osso mantida em condição climática diferente. 21 2. Desse corte, cerca de metade foi usada para a extração do citrato. 3. Pulverizaram-se as amostras de osso em nitrogénio líquido arrefecido, reduzindoas em partículas <10 µm, na CryoMill. 4. Em 0,05 g de pó acrescentou-se 300 µL de uma solução de clorofórmio e etanol (1:1), a fim de desengordurar o material ósseo. 5. Agitou-se, no vórtex, durante 1 min. 6. Centrifugaram-se os tubos a 5000 rpm, por 5 min, na centrifuga HT Modelo MCD 2000. 7. De seguida descartou-se o sobrenadante. 8. Secou-se o pellet com a ajuda de um Concentrador Eppendorf 5301, por 2 min. 9. Adicionaram-se 2 mL de HCl (1,0 M). 10. Levou-se a mistura anterior a um banho termostatizado (60ºC), durante 1 hora. 11. Baixou-se o pH da solução (pH=5), através da adição de KOH (0,5 M). 12. Centrifugou-se a 1200 g por 5 min, causando a formação de um pellet. 13. Decantou-se o sobrenadante para um novo tubo e armazenou-se no frigorífico esterilizado (4ºC) até ser realizada a análise do citrato. 3.2. Quantificação do citrato O citrato foi determinado usando o método da citrato liase (baseia-se na clivagem completa da substância por preparações purificadas da liase do citrato na presença de iões de zinco; o ensaio da citrato liase também é significativamente melhorado pela adição do zinco), usando kits analíticos da Xygen Diagnostics Inc. A enzima converte o citrato numa mistura de oxaloacetato e piruvato, que vai reagir com NADH. A quantidade de citrato é monitorizada pela deteção da diminuição, em absorção de UV, pelo NADH a 340nm usando um espectrofotómetro de UV. Esta reação foi calibrada usando a solução de citrato de sódio armazenada dando origem a uma resposta linear para valores acima de 0,4, para 0,0001 mg/mL de citrato. 22 3.3. Extração do DNA Para a extração do DNA das amostras de osso foi utilizado o método orgânico – Fenol Clorofórmio, que é frequentemente e diariamente usado no laboratório do IPPGF. 1. Cortou-se 2/3 g de cada parte do osso mantida em condição climática diferente. 2. Desse corte, cerca de metade foi usada para a extração do DNA. 3. Adicionaram-se 3 mL de tampão de incubação de osso (35 µL de Proteína K e 40 µL de DTT). 4. Levaram-se os tubos a incubar a 56ºC, por um período de 18-24 h. 5. Centrifugou-se a 5000 rpm, durante 5-10 min, numa Centrifuga Excelsa. 6. Recuperou-se o sobrenadante. 7. Adicionou-se o mesmo volume de clorofane a cada amostra. 8. Agitou-se com o vortex. 9. Centrifugou-se a 10000 rpm, durante 5 min. 10. Recuperou-se o sobrenadante transferindo-o para um novo tubo. 11. Adicionou-se 10% do volume de NaCl e o dobro de etanol absoluto. 12. Incubou-se durante 2h a uma temperatura de -20ºC. 13. Centrifugou-se a 10000 rpm durante 15 min. 14. Descartou-se o sobrenadante. 15. Adicionou-se 1 mL de etanol 70% e agitou-se por inversão. 16. Centrifugou-se a 10000 rpm por 15 min e desprezou-se o sobrenadante. 17. Descartou-se o etanol e secou-se o material com o auxilio da Speed Vac. 18. Ressuspendeu-se em 30 µL de TE-4. 3.4. Quantificação do DNA A quantificação do DNA foi feita usando o Kit Genómico de Quantificação de DNA, da Genomic. Este faz uso da PCR em tempo real para assim amplificar no mesmo tubo e de forma específica as sequências que estão presentes nos cromossomas autossómicos e Y humanos. O kit conta ainda com um controlo interno que se constitui por uma sequência de DNA sintético. O principal objetivo é analisar a presença de possíveis inibidores da reação presentes nas amostras forenses extraídas. 23 O kit de quantificação do DNA serve ainda para confirmar se a quantidade de DNA humano por amostra é viável para posterior utilização nos sistemas de identificação humana, tais como análises de STRs, SNPs e DIPs, e é indicado ainda para verificar se a amostra possui determinados inibidores. 30 Figura 7 - Evolução da quantidade de exames de identificação de cadáver que tiveram como objeto de investigação material ósseo e que obtiveram resultados positivos, realizados no IPPGF/PC-RJ desde 2007 até Maio de 2014. 4.2. Testes Experimentais Laboratoriais Tendo em conta o grande número de homicídios que ocorrem atualmente e particularmente no Rio de Janeiro, tal como foi registado pelo ISP e pode ser observado nos quadros que estão disponíveis no ponto 4.1.1. Sendo assim, em muitos casos de mortes violentas a vítima, ou seja, o cadáver, só é localizada em adiantado estado de putrefação e/ou já em fase de ossificação. Portanto, a determinação do IPM torna-se importante para a investigação criminal e para a identificação da vítima que só pode ser feita recorrendo ao exame de DNA. Assim sendo, neste estudo foram realizadas também análises relativamente à quantificação do DNA presente nas amostras de osso estudadas, paralelamente à quantificação do citrato. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Nº de Exames Tempo (anos) 31 4.2.1. Quantificação do DNA Do processo de quantificação de DNA, resultaram informações que estão descritas na Figura 8, no qual está representada a variação da quantidade de DNA em % no osso, em condições de temperatura ambiente, ao longo do tempo, com os respetivos desviospadrão. Figura 8 - Variação da quantidade de DNA no osso (%), em condições de temperatura ambiente, ao longo do tempo (dias). Este gráfico não oferece informações conclusivas da relação existente entre o decréscimo do DNA e o intervalo de tempo estudado (46 dias). O que pode significar que, para este período de tempo e nestas condições de temperatura, não existe uma relação direta entre o IPM e a quantidade de DNA no osso humano. Assim não se pode concluir que, para as condições de temperatura ambiente exista aumento ou diminuição de quantidade de DNA no osso humano, à medida que aumenta o IPM. Este resultado pouco conclusivo pode estar relacionado com o fato do trabalho laboratorial ter ocorrido em pouco tempo, o que fez com que existisse um conjunto de 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 DNA no osso (%) Tempo (dias) 32 dados menor do que seria recomendável. Quanto mais informação disponível, melhor seria a avaliação das informações e levaria a que as conclusões fossem mais fundamentadas. Também foi avaliada a quantidade de DNA no osso humano com o aumento do IPM em condições de temperatura de cerca de 40ºC e com humidade elevada. Isto pretendia simular o clima tropical que se sente na maior parte do território do Rio de Janeiro, onde foi realizado o estudo. Estas condições estão demonstradas visualmente no gráfico da Figura 9, com os respetivos desvios-padrão. Figura 9 - Variação da quantidade de DNA, em %, no osso em condições de Temperatura de 40ºC e Humidade elevadas, ao longo do tempo, em dias. Através da observação da Figura 9 pode concluir-se que existe uma certa influência da humidade e da temperatura elevadas no decréscimo da quantidade de DNA no osso humano, com o aumento do IPM. Verifica-se uma grande diminuição do DNA da primeira para a segunda extração o que pode informar que estas condições degradam o DNA numa fase inicial do IPM e que depois a degradação não será tão acentuada. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 DNA no osso (%) Tempo (dias) 33 Como no gráfico da Figura 8 não se verificaram alterações com a influência da temperatura ambiente, pode ser que neste caso o que esteja a danificar o DNA seja apenas a humidade. Contudo isso não pode ser afirmado, uma vez que neste estudo foram analisadas as duas condições em conjunto. O que pode informar que as duas condições, em conjunto, fazem decrescer, significativamente, a quantidade de DNA no osso do cadáver humano, ao longo do IPM. Foi ainda avaliada a relação existente entre a quantidade de DNA no osso humano com o IPM em condições de temperatura elevada, ou seja, com valores de cerca de 40ºC. Estas condições estão apresentadas no gráfico da Figura 10, que se segue. Figura 10 - Variação da quantidade de DNA, em %, no osso em condições de Temperatura elevada (40ºC), ao longo do tempo, em dias. Neste gráfico estão relatados os dados referentes à influência da temperatura elevada (40ºC) no aumento do IPM com a quantidade de DNA no osso humano. Mais uma vez não existem conclusões significativas com a influência da temperatura na 0 100 200 300 400 500 600 700 0 10 20 30 40 50 60 70 80 DNA no osso (%) Tempo (dias) 34 quantidade do DNA uma vez que neste caso se verifica que existe uma pequena variação nos valores do DNA e que não transmitem resultados significativos. Importa ainda referir que, para a condição da temperatura elevada, existem 4 pontos estudados porque foi feita uma outra extração posterior, relativamente às outras duas amostras. Numa visão geral, parece ser certo que o DNA presente no osso humano, quando exposto a condições de humidade elevada conjuntamente com altas temperaturas (40ºC), ao longo do tempo após a morte, seja degradado e diminua a quantidade deste no osso. Por outro lado, parece ser certo também que a temperatura, por si só, não tenha relevância para a alteração de DNA no osso humano, uma vez que não se tenha chegado a conclusões relevantes e a relação existente entre a quantidade de DNA no osso humano e o IPM não se tenha traduzido em algum tipo de relação direta. 4.2.2. Quantificação do Citrato Paralelamente ao que foi feito com a quantidade de DNA no osso humano, também foi analisada a quantidade de citrato no mesmo osso humano. No seguinte gráfico da Figura 11 pode observar-se a variação de quantidade de citrato no osso humano ao longo do aumento do IPM, ou seja, à medida que o tempo vai passando. Isto foi realizado em 46 dias o que poderia, à partida, não resultar em dados conclusivos. No entanto, para este caso, cujo osso foi dependente da influência da temperatura ambiente, registou-se uma variação decrescente de citrato o que confirma a teoria apresentada por SCHWARCZ et al de que à medida que o IPM aumenta diminui a quantidade de citrato no osso humano. O que faria com que a medição de citrato fosse um bom método de datação do IPM. 35 Figura 11 - Variação da quantidade de Citrato, em %, no osso em condições de Temperatura Ambiente, ao longo do tempo, em dias. Para além dessas condições foram ainda testadas as condições de temperatura e humidade elevadas e a sua influência na quantidade de citrato no osso humano, ao longo do aumento do IPM. Estes resultados podem ser observados na seguinte Figura 12. Nesta está retratada uma variação decrescente de citrato no osso, mas não é linear. O que indica que poderá existir um decréscimo de citrato no osso humano, em condições de temperatura e humidade elevadas, mas este não se apresenta de forma significativa no intervalo de tempo estudado, que foi de apenas 46 dias. Porém, fazendo uma análise dos pontos 1 e 3, é possível verificar que existe um claro decréscimo da percentagem de citrato no osso, o que pode indicar que o intervalo de colheita e análise deve ser maior para que as conclusões sejam mais visíveis e assertivas. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 Citrato no osso (%) Tempo (dias) 36 Figura 12 - Variação da quantidade de Citrato, em %, no osso em condições de Temperatura (40ºC) e Humidade elevadas, ao longo do tempo, em dias. Foi ainda estudada a influência de apenas a temperatura elevada, de cerca de 40ºC, na quantidade de citrato no osso humano, com o aumento do IPM. Estes dados estão representados no seguinte gráfico na Figura 13. Este gráfico traduz uma alternância de resultados que podem significar que a influência da temperatura não seja relevante para a diminuição ou aumento do citrato no osso humano. Estes resultados já eram, de certa forma, esperados tendo em conta o estudo que serviu de base para este trabalho feito por SCHWARCZ et al. Nesse estudo, também foi concluído que a temperatura não tem efeito negativo para a diminuição de citrato no osso humano com o aumento do IPM. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 Citrato no osso (%) Tempo (dias) 37 Figura 13 - Variação da quantidade de Citrato, em %, no osso em condições de Temperatura elevada (40ºC), ao longo do tempo, em dias. Numa visão geral, existe também uma relação direta entre a quantidade de citrato no osso humano quando este se encontra exposto a uma temperatura ambiente. No entanto, quando se encontra exposto a uma temperatura de 40ºC não existe relação linear. Quando a humidade elevada também está a atuar sobre o osso humano à medida que aumenta o IPM, esta faz com que, aparentemente, exista um decréscimo dos níveis de citrato no osso humano. No entanto, essa diminuição não ocorreu de forma linear o que pode ter a ver com o período de IPM que, neste caso, foi baixo, de apenas 46 dias. 4.2.3. Comparação entre a quantificação do DNA e a quantificação do citrato Após a análise individual dos resultados da quantificação do Citrato e do DNA nas amostra estudadas de osso humano, foram realizados gráficos comparativos de ambos os estudos. Essa comparação está demonstrada nas seguintes Figuras (14, 15 e 16). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Citrato no osso (%) Tempo (dias) 38 Na Figura 14 pode observar-se a tendência da variação do Citrato e do DNA no osso humano em estudo, ao longo do tempo da experiência, em condições de temperatura ambiente. Pode afirmar-se que existe uma coerência e concordância entre os dois estudos, pois ambos apresentam uma tendência decrescente na relação temporal com a respetiva quantidade em percentagem. Figura 14 - Comparação entre os testes de DNA e de Citrato, em %, nas condições de Temperatura Ambiente, ao longo do tempo (dias). Os símbolos vermelhos (quadrados) representam os valores, em %, do DNA no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Os símbolos azuis (losangos) representam os valores, em %, do Citrato no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. No caso da Figura 15, que se segue, estão representados os dois estudos comparando no caso em que se encontram dependentes das condições de temperatura a 40ºC e humidade elevadas, ao longo do tempo. Aqui é visível também um certo paralelismo entre os dois estudos, uma vez que ambos demonstram uma tendência decrescente da quantidade tanto de DNA como de citrato no osso, à medida que o IPM aumenta. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Quantidade (%) Tempo (dias) 39 Figura 15 - Comparação entre os testes de DNA e de Citrato, em %, nas condições de Temperatura de 40ºC e Humidade elevada, ao longo do tempo, em dias. Os símbolos vermelhos (quadrados) representam os valores, em %, do DNA no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Os símbolos azuis (losangos) representam os valores, em %, do Citrato no osso e a reta da mesma cor é a respetiva reta de tendência linear. Por fim, na Figura 16, está representada a comparação dos estudos da quantificação de citrato e de DNA nas amostras de osso humano estudadas à medida que o IPM aumenta, em condições de temperatura a 40ºC. À imagem do que ocorreu nas outras duas comparações de estudos, também neste caso é visível uma concordância entre a quantificação de citrato e DNA. No entanto, desta vez, ambos os estudos apresentam uma tendência crescente ao longo do tempo. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Quantidade (%) Tempo (dias) 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 62