Senescência eritrocitária : interacções lipo-proteicas da membrana globular

ACTA MÉDICA PORTUGUESA 1986:7: 131-134 FICHA BIOQUÍMICA APLICADA SENESCÊNCIA ERITROCITÁRIA: INTERACÇÕES LIPO-PROTEICAS DA MEMBRANA GLOBULAR CARLOTA SALDANHA, J. MARTINS E SILVA Instituto de Bioquímica, Fac. Medicina de Lisboa. 1600 Lisboa Portugal. — PREÂMBULO As causas do envelhecimento têm desde sempre preocu pado o homem em geral e os cientistas em particular. E, embora tenham sido registados nos últimos decénios progres sos espectaculares na redução da mortalidade infantil e aumento da perspectiva de vida humana, esses benefícios pouco ou nada têm a ver com a modulação dos mecanismos de envelhecimento, O aumento da vida média humana tem sido conseguido quase exclusivamente através da minimização de vários flagelos, tais como as infecções, parasitoses e, em data mais recente, pela redução de alguns factores de risco cardio vascular. Todavia, as causas de perda de memória e limitação de outras capacidades psíquicas, da incapacidade em executar funções vitais e outras características de envelhecimento que culminam, em período mais ou menos tardio, na mdrte, conti nuam por esclarecer. Os mecanismos subjacentes a esse pro cesso natural como que estão exacerbados em determinadas situações patológicas, como na doença de Alzheimer, em que se assiste a envelhecimento celular prematuro. Em contraste, uma das doenças que actualmente mais con tribui para a mortalidade da espécie humana o cancro caracteriza-se pela proliferação explosiva e incontrolável de células que não envelhecem. Face a este paradoxo, não são de estranhar múltiplas inves tidas da ciência, em que se destacam estudos bioquímicos, visando esclarecer o envelhecimento celular e causas da morte humana. O glóbulo vermelho apesar de desprovido do núcleo, mito condrias e outros organitos (próprios de todas as células huma nas) permanece activo e funcional em circulação durante cerca de 120 dias. Nesse intervalo assegura a oxigenação a trocas gasosas teciduais, contribui para o controlo do pH corporal e, aparentemente, está envolvido no transporte de diversos mediadores hormonais para células-alvo. Ao fim daquele prazo, os glóbulos são eliminados da circulação, dando lugar a glóbulos jovens por estimulação permanente e controlada da eritropoiese medular. O mecanismo que determina a vida média globular é desco nhecido. Todavia, e em comum com os restantes tipos de células corporais, o eritrócito apresenta um revestimento estruturalmente muito semelhante. Tendo como base hipóte ses que atribuem à membrana citoplásmica participação deter minante no envelhecimento, parece legítimo utilizar o glóbulo vermelho — facilmente acessível e sem outras estruturas inter nas — para esclarecimento das causas de envelhecimento celu lar, numa primeira fase do estudo daquele problema. II CARACTERÍSTICAS DA MEMBRANA ERITROCITÁRIA Desde que o envelhecimento eritrocitário começou a ser estudado sistematicamente, várias hipóteses têm sido formula das para explicar aquele fenómeno. Na generalidade, essas hipóteses reportam-se a alterações morfológicas e ou metabó licas que progridem com a idade globular e que acabam por afectar a capacidade de deformação eritrocitária à acção cons trigente da microcirculação. Por sua vez, as propriedades físico-químicas do fluxo san guíneo, assim como a remoção e subsequente destruição de glóbulos anormais ou senescentes da circulação, dependem de vários factores, com destaque para a agregação e, sobretudo, para a deformabilidade eritrocitária (re~’isão em 1 e 2 ). A deformabilidade eritrocitária é influenciada pela relação área volume, propriedades viscoelásticas da membrana e vis cosidade interna3. As duas primeiras variáveis são afectadas pela natureza química e estrutural da membrana e interacções moleculares implícitas. Assim, verifica-se que a composição lipídica e relação colesterol fosfolípidos influenciam a fluidez da membrana (e por conseguinte a deformabilidade eritrocitária4, enquanto a distribuição assimétrica dos fosfolípidos na membrana entro citária contribui para a manutenção do potencial da mem brana, assegura a inte~ridade celular e influência a actividade de algumas enzimas5~ . A assimetria lipídica é afectada pelo colesterol1 e proteínas do citoesqueleto55. Estas proteínas (extrínsecas) da face interna da membrana eritrocitária, esta belecem interacções com os fosfolípidos8 e com as proteínas intrínsecas9 e citoplásmicas’°. A integridade química e estrutural do citoesqueleto afigura-se fundamental para a manutenção da deformabili dade eritrocitária. Na constituição do citoesqueleto participam a espectrina, actina e proteína 4.1. A espectrina é formada por 2 cadeias (a e /3), referenciadas como as bandas 1 e 2 da nomenclatura de Fairbanks~; ao associarem-se entre si, topo a topo, formam dímeros e tetrâmeros em equilíbrio relativo; in vitro predominam os heterotetrâmeros’2 A espectrina, ao ligar-se à actina (banda 5) e proteína 4.1 constitui um monómero que, por repetição, forma a malha ou rede que reveste a face interna da membrana erjtrocjtá 9,1~,14 ria. A proteína 2.1 (designada por anquirina) estabelece a liga ção entre a espectrina e a proteína intrínseca banda 3 (canal aniónico)9. A esta glicoproteína ligam-se as seguintes proteí nas: hemoglobina, aldolase, fosfogliceratocináse, gliceraldeído-fosfato-desidrogenase e fosfofrutocinase’5. Tam bém associadas à banda 3 parecem estar as enzimas Na~, Recebido para publicaçâo: 6 de Maio 1986 131 C. SALDANHA, J. M. E SILVA AS5IMETR~ LIPÍD(CA Subcomodc in~ernc CITOESQUELETO FLUiDEZ LIPÍDICA BANDA 3-PROTEÍNAS CITO SÓ L IC AS Figura 1: A membrana eritrocitária apresenta assimetria lipídica com predomínio de fosfatidilcolina (PC) e esfingomielina (SM) na subcamada externa. A fosfatidilserina (PS) e fosfatidiletanolamina (PE) existem em maior quantidades na subcamada interna. A fluidez lipídica é influenciada pelo comprimento, grau de insaturação dos ácidos gordos e razão de concentrações colesterol/fosfolípidos ([C]/[PD. À glicoproteína banda 3 ligam-se: (i) proteínas citosólicas, tais como hemoglobina (Hb), aldolase (a). fosfofrutocinase (PFIC). fosfoglicerato cinase (PGK) e gliceraideido 3-fosfato-desidrogenase (G3PD); (ii) proteína extrínseca anquirina (A), que estabelece a ponte com o citoesqueleto. Este polímero é constituído por espectrina (cadeias a e fi), acima (acT) e proteína 4.1. K1-ATPase e a acetilcolinesterase.’6’ ~ Enquanto para a pri meira, a função está perfeitamente esclarecida, (hidrólise do ATP associada, ao’ transporte activo de sódio e potássio), a da segunda continua desconhecida. A actividade de ambas as enzimas é fortemente influenciada pelos lípidos.’8’ 19 As interacções lipoproteicas podem ser agrupadas em hidroióbicas ou electrostáticas, e o seu conhecimento ser abor dado pelo estudo do comportamento alostérico da acetilcoli nesterase. A fluidez lipídica é um regulador fisioló,~ico do carácter alostérico das enximas ligadas à membrana.2 Assim, o estudo da. influência das alterações da membrana no comportamento cooperativo das enzimas integrais é um processo que conduz à confirmação das interacções lipoproteicas. A composição química, estrutura, metabolismo, proprie dades e funções do eritrócito estão perfeitamente interligadas, interdependentes e reguladas. Será de esperar que em situações patológicas e ou pelo envelhecimento ocorram disfunções em qualquer ou todos os parâmetros. III — ENVELHECIMENTO DO ERITRÓCITO O envelhecimento eritrocitário começou a ser estudado em 1938, por Stephens2’ e desde então várias hipóteses têm sido apresentadas para o explicar. O estudo de Rouss22 demonstrou que dos eritrócitos nor mais in vivo são removidas porções da membrana, por frag mentação mecânica, sem perda de hemoglobina. Este processo induz, com o tempo, aumento da rigidez celular que compro mete a sobrevivência a nível da microcirculação. Um segundo mecanismo também baseado no decréscimo da deformabilidade ao longo do tempo baseia-se nas interac ções entre o cálcio e a membrana moduladas pelo ATP.23 A concentração do ATP diminui com a idade celular,24 com consequente aumento da interacção entre o cálcio e as proteí nas da membrana. Concomitantemente resulta menor flexibi lidade e deformabilidade das células senescentes. Estes dois mecanismos foram simulados e confirmados in vitro.25 Durante o envelhecimento do eritrócito, as dimensões25 a fragilidade osmótica2t e a flexibilidade mecânica27 decrescem em conjunto com o declínio das actividades de algumas enzi mas.28 A piruvato-cinase do eritrócito apresenta duas formas moleculares (R’ e R2~ cuja acção R2 R’ aumenta com o enve lhecimento globular. 6 A transformação de R’ em R2 é acom panhada por acréscimo da capacidade de fosforilação e dimi nuição da afinidade para o fosfoenolpiruvato.3° A actividade enzimática da acetilcolinesterase da membrana eritrocitária diminui com a idade globular.3’ Estudos cinéticos revelaram que o valor da constante de afinidade da enzima para o subs trato (km) não é afectado pela idade, embora a velocidade máxima diminua com a senescência.32 Subcomadc exi~ernc c~ø II 132 SENESCËNCIA ERITROCITÁRIA: INTERACÇÕES LIPO-PROTEICAS DA MEMBRANA GLOBULAR O reconhecimento imunológico é alterado no envelheci mento por exposição de receptores anti~énicos na superfície globular33 e aumento de ligação da I~ G. Os glóbulos envelhecidos são mais receptíveis à acção do peróxido de hidrogénio, iii vitro, com consequente agregação das proteínas de alto peso molecular.35 A ocorrência destes agregados proteicos pode também resultar de uma simulação de envelhecimento eritrocitário por deplecção metabólica (diminuição da concentração de precursores de ATP e GSH).36 Os complexos proteicos são de dois tipos, de acordo com o peso molecular.35 A concentração dos agregados de elevado peso molecular aumenta com o tempo de incubação, ao con trário do observado com os complexos de baixo peso molecu lar.37 In vivo, este comportamento é confirmado pelo estudo de Synder e colaboradores, onde se evidencia que as fracções mais densas de eritrócitos (glóbulos mais envelhecidos~ contêm agregados de espectrina e hemoglobina (cadeias a). 8 O conteúdo em ácido slálico dos eritrócitos diminui com a idade globular.39 Experiências em ratos demonstraram que a redução de carga superficial induzida pela acção de neuramini dase é acompanhada de rápida remoção dos glóbulos em circulação.4° No entanto, muitas propriedades bioquímicas e biofísicas mantêm-se inalteradas: deformabilidade,42 fragili dade osmótica,’6 concentração de ~ nível de lactato,4’ actividade enzimáticas (piruvato-cinase,4° glicose 6-fosfato — desidrogenase)4’ e índices celulares)6 A acção das proteases de membrana, o processo de vesicu lação ou diminuição do pH podem conduzir ao mesmo estado deficitário de carga.43’ ~ ~ Incubações de eritrócitos em meio contendo cálcio e magnésio mas desprovido de glicose condu zem ao envelhecimento eritrocitário, demonstrado por deple ção em ATP, transformação de discócitos em equinócitos e libertação de vesiculas.45 Estas transformações originam diminuição do conteúdo em ácido siálico na forma ligada a glicopéptidos e ou vesícu las.45 O cálcio reforça a saída de sialoglicopéptidos, induzida por diminuição de pH ou depleção metabólica.45 O Mg2’ e o ATP regulam a forma do eritrócito, por estimu lação de uma cinase independente do AMPc, que fosforila a espectrina (cadeia f3),46 O Ca2~ inibe a cinase e por conseguinte diminui a fosforilação da espectrina.47 Além destas, são conhecidas várias alterações bioquímicas e biofísicas do eritrócito, induzidas pela depleção em ATP ou aumento da concentração intracelular em Ca.2~ Todavia, em conjunto, não há uma resposta conclusiva sobre as causas de envelhecimento globular e, muito menos, se este fenómeno afecta a evolução clínica de algumas situações patológicas banais, quer directamente quer por reflectir uma situação comum a outras células corporais. BIBLIOGRAFIA l. SCHMID-SCHONBEIN. H., WELLS, R.. GOLDSTONE.J. lnfluence of deformability of human red cells upon blood vis cosity. Circ. Res. 25: 131, 1969. 2. WEED. R. 1. The importance of erythrocyte deformability. Am. J. Mcd. 49: 147, 1970. 3. CHIEN. S. Determinants of blood viscosity and red ccli defor mability. Scand. J. Clin. Lab. lnvest. 41: (suppl. 156). 7; 1981. 4. COOPER, R. A., LESLLE. M. H., FISCHKOFF, S., SHI NITZKY, M.. SHATTIL, S. J. Factors influencing the Iipid composition and fluidity of red celI membranes in vitro: Produc tion of red cdl possessing more than two cholesterol per phospho lipids. Biochem. 17: 327, 1978. 5. HAEST, C. W. M., BEUTICKE, B. Experimentalalterationof phospholipid protein intraction within the human erythrocyte membrane. Dependence on glycolytic metabolism. Blochim. Blophys. Acta 401: 468, 1975. 6. LANGE, L. C., VAN MEER. G.. OPDENKAMP, J. A. F., VAN DUNEN. L. L. M. Hemolysis of rat erythrocytes by replace ment of the externai phosphatidylcholine. Eur. J. Biochem. 110: 115, 1980. 7. MOHANDA,N.,WYATT,J.,MEL,S.F.,ROSSI,M.E.,SHO HET, S. B. — Lipid transiocation across lhe human erythrocyte membrane, J. Biol. Chem. 257: 6537. 1982. 8. DRESSLER, V., HAEST. C. W. M., PLASE, G., DEUTICKE, B., ERUSALINSKY. J. D. Stabilizing factors ofphospholipid asymmetry in the erythrocyte membrane. Biochem. Biophys. Acta 775: 189. 1984, 9. BENNELTT, V.. STENBUCK. P. J. The membrane attach ment protein for spectrin is associated whith band 3 in human erythrocyte membranes. Nature 280: 468, 1979. lO. SAUBERMAN, N.. FORTIER, W., PIOTROWSKI, J. Y., SNYDER, L. M. Spectrin haemoglobin crosslinkages associa ted with n vitro oxidant hypersensitivity jn pathoiogic and artifi cially dehydrated red celis. Brit. J. llaematol. 54: 15. 1983. II. FAIRBANKS. G.. STECK, T. L., WALLACH. D. F. H. Electrophoretic anaiysis of the major polypeptids of the human erythrocyte membrane. Biochem. lO: 2606. 1971. 12. MARCHESI. V. T. Spectrin present status ofa putativecyto -skeietai protein ofthe red cdl membrane. J, Memb. Biol. 5!: 101, 1979. 13. LUX. S. E. Dissecting lhe red ccli membraneskeIeton. Nature 281: 426. 1979, 14. GOODMAN, S. R.. NEIDER. S. A. Binding of spectrin. tetramers to human erythrocyte membranes. J. Biol. Chem. 255: 8082. 1980. 5. BOIVIN. P.. GARBARZ. M. Interactionsdesenzymescytoso iiques avec la membrane du globule rouge. C. R. Soc. Biol. 174: 605, 1980. ftj, FOSSEL, E. T., SOLOMON. A. K. Relation between red ccli membrane (Na. K) ATPase and band 3 protein. Biochim. Biophys. Acta 649: 557. 1981. 17. SIHOTANG. K. Acetyichoiinesterase and its association with iipid. Eur. J. Biochem. 63: 519. 1976. 18. TANAKA. R.. SAKAMOTO, T. Molecular structure jn phosphoiipid essential lo activate (Na. K. Mgj dependent ATPase and (K - Mg) dependent phosphatase of bovine cerebral cortex. Biochim. Biophys. Acta 193: 384, 1969. 19. BLAUREGARD. G.. RONFOGALIS. B. D. The role of tightly bound phospholipid in the activity of erythrocyte acetyl cholinesterase. Biochem. Biophys. R. Comm. 77: 211. 1977. 20. BIOJ.G.,MORERO,R.D..FARIAS.R.N..TRUCCO.R.E. Membrane iipid fatty acid and reguiation of membrane bound enzymes. Aliosteric behaviour of erythrocyte Mg2~ ATPase (Na~, K) ATPase and AChE from rats fed different fat suppiemented diets. Biochim. Biophys. Acta 311: 67. 1973. 2!. STEPHENS. J. O. Stratified blood sedimentation. Isolantion of immature red edis. Nature 141: 1058, 1938. 22. ROUSS. P.. ROBERTSON, O. H. The normal fate oferythroc ytes. The findings in heaIthy animais. J. Exp. Mcd. 25: 651, 1917. 23. WEED, R. 1.. LA CELLE. P. L.. MERRIL. E. W. Metabolic dependence of red ccli deformability. J. Clin. lnvest.48: 795,1969. 24. RAMOT. B., BROK, F.. BEN BASSET, 1. Alterations in the metaboiism of humanerythrocyteswithaging. XII Cong. lnt. Soc. Hematol. N.Y. p. 169, 1968. 25. LA CELLE. P. L.. KIRKPATRICK. F. H., VDKOW, M. p,, ARKIN. B. Membrane fregmentation and Ca~ membrane interaction: potencial mechanisms of shapc in the senescent red cdl. Nouv. Rev. Franc. Hem. 6: 789. 1972. 26. RIFKING. Y. M., ARAKI. K., MADLEY. E. Therelationship between the osmotic fragility of human erythrocytes and cdl age. Arch. Biochem. Biophys. 22: 582. 1983. 27. WEED, R. 1., LA CELLE, P., MERRIL, E. W. Metaboljc dependence of red ccii deformability. J. Clin. lnvest. 48: 795, 1969. 28. PIOMELLI. S., WYSS, 5. R. Metabolic death of lhe RBC. Blood 38: 832, 1971. 29. NAKASJIMA, K. Further evidence of molecular alteration and abnormalities of erythrocyte pyruvate kinase. Clin. Chim. Acta. 55: 245, 1974. 30. FUJII, S. Molecular aging and phosphorylation oferythrocyte pyruvate kinase. BulI. Yamaguchi, Mcd. Sch. 27: 107, 1980. 3!. ALLISON,A. C.. BURN. O. P. Enzymeactivityasafunction 133 C. SALDANHA, J. M. E SILVA of age in the human erythrocyte. Brit. J. Haematol. 1: 291. 1955. 32. GALBRAITH. D. A.. WATFS. D. C. Human erythrocyte acetylcholinesterase in relation to celi age. Biochem. J. 195: 221, 1981. 33. GATTEGNO. L., BLADIER. D., GARNIER, M., CORNIL LOT. P — Changes in carbohydrate content ofsurface membrane of human erythrocyte during aging carbohydrate. Research 52: 197. I976. 34. KAY, M. M. B. — Mechanism of removal os senescent celis by human macrophages in situ. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 72: 3521. 1975. 35. SAUBERMAN. N., PIOTROWSHI, J., JOSHI, W., FORTIER, N., SNYDER, L. M. Irreversible spectrin hemoglobin crossli nkages associated with oxidant hypersensivity in pathologic or artificially dehydrated red celis. Blood 58: 34 a, 1981. 36. BROVELLI, A.. SUHAIL. M., PAI,.LAVICINI, G.. SINIGA GLIA. F., BALDUIN1. C. Selfdigestion of human erythrocyte membranes. Role of ATP and GSH. Biochem. J.. 164: 469. 1977. 37. BROVELLI. A., SEPPI, C., BALDUINI, C. Modification of membrane protein organization during in vitro aging o human erythrocyte. Int. J. Biochem. 16: 1115, 1984. 38. SNYDER, L. M.. LELO. L., PIOTROWSKI,J., SANBERMAN, 5.. LIU, C.. FORTIER, N. L. Irreversible spectrin haemoglo bin condinting in vivo: a marker for red ccli senescente. Brit. J. Haematol. 53: 379, 1983. - 39. GREENWALT, T. Y., STEANE. E. A. Quantitative haemo glutination IV. Effect of neuraminidase treatment on agglutina tion by blood group antibodies. Br. J. Haematol. 25: 207. 1973. 40. STEPHEN. A., TENFORDE. L. T., SCHOOLEY. J. C. — Decreased surface change and accelerated senescence of red blood edis following neuraminidase treatment. J. Lab. Clin. Med. 89: 581, 1977. 41. DUROCHER, J. R.. PAYNE, R. C., CONRAD, M. E. Role of sialic acid in erythrocyte survival. Blood 45: li, 1975. 42. GILCHER, R., CONRAD, M. The relationship of RBC sur face charge to RBC deformability. Blood 38: 807, 1971. 43. ALLEN, D., BILLAH, M., FIMAN, Y. B., MICHELL, R. H. Release of diacylglycerol rol enriched vesicles from erythrocytes with increased intraecellular Ca2~. Nature 261: 58, 1976. 44. LUTZ. H. V.. LIU, 5. C., PALEK, J. Release ofspectrin free vesicles from human erythrocytes during ATP depletion. 1 Cha racterization of spectrin-free vesicles. J. Ccli. Biol. 73: 548, 1977. 45. BOCCI, V., PESSINE. P., PAULESU, L., PACINI, A., MUS CETTOLE, M. — Studies of factors regulating the aging of human erythrocytes 1 the role of pH and of divalent cations. lnt. J. Biochem. lO: 19, 1979. 46. BOIVIN, P., GARBARY, M., DHELMY, D., GALAND, C. In vitro phosphorylation of the red ceIl cytoskeleton complex by cyclic AMP dependent prottein kinase from erythrocyte mcm brane. Biochem. Biophys. Acta 647: 1, 1981. 47. QUIST. E. E. Regulation of the shape of unsealed erythrocyte membrane by Mg2~ ATP and Ca2. Arch. Biochem. Biophys. 203: 123. 1980. Pedidos de Separatas: J. Martins e Silva Institutode Bioquímica Faculdade dc Medicina de Lisboa Lisboa. 134