Regenerative medicine applications in dog’s orthopedic and spinal cord disorders: case report

Dipa imen o di Scienze Medico-Ve e ina ie Co so di Lau ea Magis ale a Ciclo Unico in Medicina Ve e ina ia “Applicazioni di Medicina Rigene a i a nelle Pa ologie O opediche e del Midollo Spinale del cane: espe ienza pe sonale” “Regene a i e Medicine Applica ions in dog’s O hopedic and Spinal Co d Diso de s: case epo ” Rela o e: Chia .mo P o . STEFANO GROLLI Co ela o i: Chia .mo Do . ALBERTO GASPARET Chia .ma Do .ssa PRISCILLA BERNI Lau eanda: SOFIA SCHIANCHI ANNO ACCADEMICO 2022-2023 2 Indice 1. INTRODUZIONE .................................................................................................................... 8 1.1 MEDICINA RIGENERATIVA IN SCIENZE MEDICO-VETERINARIE ......................................................... 8 1.1.1 Cosa signi ica ‘Medicina igene a i a’ .............................................................................. 8 1.1.2 S a o co en e e no ma i a ............................................................................................. 10 1.2 CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSCS): GENERALITÀ ......................................................... 14 1.2.1 Cellule s aminali, cosa signi ica s aminali à .................................................................... 14 1.2.2 Classi icazione delle cellule s aminali ............................................................................. 16 1.2.3 Nomencla u a e ca a e is iche delle MSCs ................................................................... 20 1.2.4 Ca a e izzazione in i o delle MSCs .............................................................................. 23 1.2.5 Fon i di MSCs ................................................................................................................... 26 1.2.6 Isolamen o delle MSCs .................................................................................................... 30 1.2.7 Col u a delle MSCs .......................................................................................................... 33 1.2.8 Di e enziazione delle MSCs ............................................................................................ 36 1.2.9 Te apia au ologa e allogenica, cosa dice la no ma i a? ................................................. 39 1.3 CELLULE STROMALI MESENCHIMALI (MSCS): MECCANISMO D’AZIONE .......................................... 43 1.3.1 Il conce o di nicchia ....................................................................................................... 43 1.3.2 Homing e mig azione delle MSCs ................................................................................... 45 1.3.3 A i i à pa ac ina e sec e oma delle MSCs ..................................................................... 48 1.3.4 A i i à angiogenica delle MSCs ...................................................................................... 51 1.3.5 MSCs e sis ema immuni a io .......................................................................................... 53 1.3.6 Vie di somminis azione e dosaggi delle MSCs ............................................................... 55 1.4 CONCENTRATI PIASTRINICI ................................................................................................... 61 1.4.1 Gene ali à: plasma icco di pias ine (PRP), gel pias inico (PG), lisa o pias inico (PL) 61 1.4.2 Ca a e is iche del PRP .................................................................................................... 64 1.4.3 P epa azione del PRP ...................................................................................................... 66 1.4.4 E e i e apeu ici del PRP ............................................................................................... 67 1.4.5 Vie di somminis azione e dosaggi del PRP .................................................................... 69 1.5 APPLICAZIONI CLINICHE ....................................................................................................... 71 1.5.1 Te apie con enzionali ..................................................................................................... 71 1.5.2 MSCs nelle pa ologie del midollo spinale ....................................................................... 79 1.5.3 PRP in pa ologie o opediche ......................................................................................... 81 2. ESPERIENZA CLINICA .......................................................................................................... 83 2.1 OBIETTIVI ........................................................................................................................ 83 2.2 MATERIALI E METODI ......................................................................................................... 84 2.2.1 La scel a del pazien e ...................................................................................................... 84 2.2.2 MSCs – il p elie o del essu o, la sua conse azione e il suo aspo o ......................... 86 2.2.3 MSCs – dal essu o alle cellule ........................................................................................ 88 2.2.4 MSCs – dal labo a o io al pazien e ................................................................................. 91 2.2.5 PRP – p elie o del essu o e p epa azione ..................................................................... 93 2.2.6 Caso clinico MSCs allogeniche, Hannah: mielopa ia ischemica o aco-lomba e .......... 95 2.2.7 Caso clinico MSCs au ologhe, Elsa: es usione discale L1-L2 ......................................... 99 2.2.8 Caso clinico MSCs allogeniche, Luna: mielopa ia ischemica o aco-lomba e ............ 104 2.2.9 Caso clinico PRP, Lucky: o u a del legamen o c ocia o c aniale sinis o ................. 108 2.2.10 Caso clinico PRP, Adone: o u a del legamen o c ocia o c aniale sinis o .............. 112 3. DISCUSSIONE ................................................................................................................... 116 3 4. CONCLUSIONI .................................................................................................................. 123 5. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 124 4 RIASSUNTO La medicina igene a i a comp ende un insieme di app occi e apeu ici che a o iscono la igene azione issu ale, ami e l’applicazione di agen i biologici es e ni e la s imolazione dei p ocessi ipa a i i p op i del essu o. Ad oggi, in medicina e e ina ia i es ono un uolo impo an e le Cellule S aminali Mesenchimali (MSCs) e i concen a i pias inici, in pa icola e il plasma icco di pias ine (PRP). Le MSCs g azie alle lo o p op ie à immunomodulan i ed an in iamma o ie ed alle lo o ca a e is iche angiogeniche s olgono un uolo impo an e nei p ocessi di igene azione, men e il PRP, g azie ai a o i di c esci a che con iene, è c uciale nella p omozione dell’angiogenesi locale e nella egolazione dell’a i i à cellula e pe s imola e ed accele a e i empi di gua igione issu ale. Inol e, ecen i s udi hanno messo in e idenza come i due app occi igene a i i possano esse e u ilizza i in modo combina o: il PRP può in a i esse e usa o come e o e (sca old) delle MSCs s esse pe ampli ica ne l’e icacia e apeu ica. T a le specie più s udia e in medicina igene a i a i è il cane, in cui ques e e apie engono u ilizza e pe il a amen o di di e se pa ologie quali, ad esempio, pa ologie del midollo spinale e pa ologie o opediche. In medicina e e ina ia la e apia igene a i a è anco a conside a a spe imen ale, poiché i casi clinici disponibili non sono anco a abbas anza nume osi da po e esse e ogge o di alu azioni s a is iche a idabili e alidabili. L’obie i o pe il u u o è quello di ende li a amen i alida i, che possano sos i ui e e apie mediche a base di a maci an in iamma o i ed analgesici, conside a i sicu i, ma spesso associa i ad e e i colla e ali nega i i, sop a u o quando usa i pe il a amen o di pa ologie c oniche o degene a i e, che necessi ano quindi di una somminis azione a lungo e mine. Lo scopo del p esen e la o o di esi è di ipo a e l’espe ienza pe sonale ela i a all’uso di e apie igene a i e in medicina e e ina ia a a e so la desc izione di alcuni casi clinici. In pa icola e, sono s a i alu a i cani a a i con MSCs au ologhe o allogeniche pe pa ologie del midollo spinale (mielopa ia ischemica ed es usione del disco in e e eb ale) e cani a a i con PRP pe la o u a del legamen o c ocia o c aniale. Tu i i pazien i sono s a i segui i nel empo con ollow- up pe iodici che hanno a u o l’obie i o di alu a e come le e apie igene a i e applica e abbiano in luenza o i segni clinici e la lo o quali à di i a, g azie anche all’impo an e associazione con la iabili azione isica. I miglio amen i clinici si sono dimos a i di e en i pe ogni caso clinico, dipenden emen e dalla 5 pa ologia p esen e, da e en uali a amen i p eceden i medici o chi u gici e da e apie iabili a i e di suppo o. In u i i pazien i è s a a pe ò ondamen ale la lo o ges ione da pa e dei p op ie a i, nell’aiu a li du an e il ecupe o pos - a amen o, nello s imola li a s olge e a i i à isiche idonee e so oponendoli a sedu e di isio e apia di di e so ipo in modo cos an e nel empo. 6 ABSTRACT Regene a i e medicine comp ises a se o he apeu ic app oaches ha p omo e issue egene a ion, by applying ex e nal biological agen s and he s imula ion o he issue's own epa a i e p ocesses. To da e, Mesenchymal S em Cells (MSCs) and pla ele concen a es, in pa icula pla ele - ich plasma (PRP), play an impo an ole in e e ina y medicine. MSCs, hanks o hei immunomodula o y and an i-in lamma o y p ope ies and hei angiogenic cha ac e is ics, play an impo an ole in egene a ion p ocesses, while PRP, hanks o he g ow h ac o s i con ains, is c ucial in p omo ing local angiogenesis and egula ing cellula ac i i y o s imula e and accele a e issue healing. Mo eo e , ecen s udies ha e shown how he wo egene a i e app oaches can be used in combina ion: PRP can be used as a ca ie (sca old) o he MSCs o ampli y hei he apeu ic e icacy. Among he mos s udied species in egene a i e medicine is he dog, whe e hese he apies a e used o ea a ious pa hologies such as spinal co d diso de s and o hopaedic diseases. In e e ina y medicine, egene a i e he apy is s ill conside ed expe imen al, as he a ailable clinical cases a e no ye nume ous enough o be he subjec o eliable and alid s a is ical e alua ions. The goal o he u u e is o make alida ed ea men s ha can eplace medical he apies based on an i-in lamma o y and analgesic d ugs, which while conside ed sa e, a e o en associa ed wi h nega i e side e ec s, especially when used o ea ch onic o degene a i e diseases, which he e o e equi e long- e m adminis a ion. The aim o his hesis o epo pe sonal expe ience wi h he use o egene a i e he apies in e e ina y medicine h ough he desc ip ion o some clinical cases. In pa icula , dogs ea ed wi h au ologous o allogeneic MSCs o spinal co d pa hologies (ischemic myelopa hy and in e e eb al disc ex usion) and dogs ea ed wi h PRP o c anial c ucia e ligamen up u e we e e alua ed. All pa ien s we e ollowed up o e ime wi h pe iodic ollow-ups o aimed a assessing how he egene a i e he apies applied in luenced hei clinical signs and quali y o li e, hanks also o he impo an associa ion wi h physical ehabili a ion. Clinical imp o emen s p o ed o be di e en in each case, depending on he pa hology, on any p e ious medical o su gical ea men , o suppo i e ehabili a ion he apies. In all pa ien s, howe e , hei owne s' managemen was undamen al, in helping hem du ing hei pos - ea men eco e y, s imula ing hem o pe o m sui able physical ac i i ies, and subjec ing hem 7 o di e en ypes o physio he apy sessions consis en ly o e ime. 8 1. INTRODUZIONE 1.1 Medicina igene a i a in Scienze Medico-Ve e ina ie 1.1.1 Cosa signi ica ‘Medicina igene a i a’ Con il e mine di Medicina igene a i a si in ende quell’insieme di app occi e apeu ici che a o isce la igene azione issu ale, ami e l’applicazione di agen i biologici es e ni e la s imolazione dei p ocessi ipa a i i p op i del essu o. Ogni essu o ha capaci à igene a i e p op ie, che engono meno ogni ol a che ques o iene colpi o da una pa ologia. Negli ul imi anni, l’a enzione della scienza medica si è spos a a dalla ipa azione alla igene azione (Mocchi e al., 2020a). Nella medicina igene a i a le cellule sono u ilizza e pe igene a e o sos i ui e cellule o essu i che si o ano in uno s a o danneggia o e/o non unzionale (Mason e Dunnill, 2008). A ualmen e in medicina e e ina ia sono u ilizza i di e si app occi igene a i i. T a ques i i es ono pa icola e impo anza la e apia con cellule s aminali adul e, l’u ilizzo del plasma icco di pias ine (PRP, Pla ele Rich Plasma) e di al i concen a i pias inici, ed in ine l’u ilizzo di g asso mic o ammen a o (Vasan han e al., 2021) (Fig. 1). Figu a 1. T a amen i di medicina igene a i a 9 Nello speci ico, le cellule s aminali mesenchimali (MSCs, Mesenchymal S em Cells) sono cellule adul e isolabili dai essu i di o igine mesenchimale, indi e enzia e, non specializza e, capaci di da e o igine a di e si ipi cellula i in unzione della lo o o igine e degli s imoli a cui sono so opos e. Ques e cellule o ano ampia applicazione e apeu ica g azie alle lo o s a ia e unzioni biologiche in g ado di con ibui e alla ipa azione ed alla omeos asi dei essu i. Il PRP è in ece la azione liquida plasma ica del sangue pe i e ico au ologo elabo a a in modo ale da o ene e una concen azione pias inica supe io e a quella basale (Ma x, 2001). La e apia a base di PRP sos anzialmen e u ilizza le pias ine del pazien e pe ipa a e le lesioni e s imola e la gua igione. Ol e ad esso, a i de i a i pias inici nelle e apie igene a i e sono u ilizza i anche il plasma po e o di pias ine (PPP, Pla ele Poo Plasma), il lisa o pias inico (PL, Pla ele Lysa e) e il gel pias inico (PG, Pla ele Gel). Il essu o adiposo mic o a u a o, con iene popolazioni e e ogenee di cellule, a cui le cellule s aminali mesenchimali (Vasan han e al., 2021) e al i ipi cellula i che con ibuiscono alla igene azione dei essu i. Pe o ene e le cellule necessa ie al a amen o il essu o adiposo iene so opos o a mode a e o ze meccaniche (Panchal e al., 2018). La medicina igene a i a comp ende in eal à un’ampia a ie à di s a egie e apeu iche che p e edono, ad esempio, l’u ilizzo di e apie molecola i a base di molecole biologicamen e a i e come i a o i di c esci a e le ci ochine e ma e iali idimensionali di sos egno al essu o (sca olds), in g ado di a o i e la capaci à di ipa azione dei essu i (Kulebyakin e al., 2020; Pa uno e Ma inello, 2014). Non si a a solo di app occi singoli, più spesso le e apie p e edono l’u ilizzo di app occi in eg a i. La medicina igene a i a è una ecen e b anca della medicina umana e e e ina ia applica a nella p a ica clinica in modo limi a o, ma con impo an i p ospe i e u u e. A ques a disciplina si iconoscono po enziali à no e oli, ma anco a oggi pe nume ose pa ologie po enzialmen e a abili non si è in g ado di p opo e p o ocolli applica i i adegua i nelle modali à e nei empi co e i. 16 1.2.2 Classi icazione delle cellule s aminali Le cellule s aminali possono esse e classi ica e in base alla lo o o igine ed alla lo o capaci à di e enzia i a (Tab. 1). In base alla lo o o igine le cellule s aminali si dis inguono in (Fig. 3): • Cellule s aminali emb ionali (ESCs, Emb yonic s em cells) • Cellule s aminali e ali • Cellule s aminali adul e • Cellule s aminali plu ipo en i indo e (iPSC, Induced plu ipo en s em cells) Nel de aglio, le ESCs sono cellule plu ipo en i de i an i dalla pa e in e na della blas ocis i (bo one emb iona io, massa cellula e in e na), uno s adio dell’emb ione nella ase di p eimpian o, p esen e 5-6 gio ni dopo la econdazione (E ans e Kau man, 1981). Tali cellule sono in g ado di da e o igine a u e le ipologie cellula i che cos i uiscono l’o ganismo, gene ando i e oglie i ge mina i i, endode ma, mesode ma ed ec ode ma. Non sono in g ado di gene a e gli annessi emb iona i. Le ESCs possono anche esse e man enu e in uno s a o indi e enzia o pe un pe iodo p olunga o in col u a (Yao e al., 2006). Sono, in a i, cellule iden i ica e dalla p esenza di a o i di asc izione come Nanog e Oc 4 (Hambiliki e al., 2012) che le man engono in uno s a o indi e enzia o, in g ado di au o- inno a si. Le ESCs sono ampiamen e s udia e, ma engono poco u ilizza e in e apia: si ada ano in modo eccessi o agli s imoli, hanno po enziale eplica i o incon ollabile e sono conside a e pe icolose dal pun o di is a della cance ogenici à. Tabella 1. Classi icazione cellule s aminali in base alla lo o po enziali à di e enzia i a ed alla lo o o igine (Kolios e Moodley, 2012) 17 Sono in g ado di ada a si a di e si ambien i e possono quindi app esen a e un po enziale aiu o allo s iluppo di o me umo ali. Le cellule s aminali e ali sono cellule mul ipo en i p esen i negli o gani dei e i. Le cellule s aminali adul e sono cellule mul ipo en i o unipo en i isolabili dai essu i nell’o ganismo pos -na ale (Wage s e Weissman, 2004). La maggio pa e delle cellule s aminali esiden i nei essu i adul i sono do mien i, ma engono a i a e da segnali speci ici in caso di lesione pe ché me ano in p a ica le lo o capaci à di ipa azione e igene azione (Kolios e Moodley, 2012). Le iPCS, in ine, sono cellule s aminali plu ipo en i indo e p odo e da cellule soma iche adul e gene icamen e ip og amma e median e oppo une ecniche di labo a o io in uno s a o “ESC simile” (Takahashi e al., 2007). In base alla capaci à di e enzia i a si dis inguono cellule s aminali (Fig. 4): • To ipo en i • Plu ipo en i • Mul ipo en i • Oligopo en i • Unipo en i Le cellule s aminali o ipo en i sono il ipo più indi e enzia o, p esen e solo nello s iluppo p ecoce; sono o ipo en i l’o oci a econda o e le cellule delle p ime due di isioni, poiché in Figu a 3. Classi icazione cellule s aminali in base alla lo o o igine (Dias e al., 2019) 18 g ado di di e enzia si sia in essu i emb ionali che ex aemb ionali, o mando emb ione e placen a (Rossan , 2001). Le cellule s aminali plu ipo en i sono in g ado di di e enzia si in cellule che de i ano dai e oglie i emb ionali, da cui si s iluppano u i i essu i e gli o gani (de Miguel e al., 2010). Le cellule s aminali mul ipo en i sono ca a e izza e dalla capaci à di di e enzia si in un nume o limi a o ipi cellula i, a seconda dell’o igine del lo o s a o ge minale. Le MSCs sono cellule s aminali mul ipo en i (Voga e al., 2021) di o igine mesode mica. Le MSCs possono de i a e da una a ie à di essu i, a cui midollo osseo, essu o adiposo, osso, gela ina di Wha on, sangue del co done ombelicale e sangue pe i e ico (Augello e al., 2010). Si di e enziano in essu i de i a i dal mesode ma come essu o adiposo, osso, ca ilagine e muscolo; di ecen e le MSCs sono s a e di e enzia e in essu o neu onale di de i azione ec ode mica (Kolios e Moodley, 2012). Le cellule s aminali oligopo en i sono in g ado di au o- inno a si e o ma e due o più lineage all’in e no di un essu o speci ico. Le cellule s aminali ema opoie iche sono un ipico esempio di cellule s aminali oligopo en i, di e enziandosi sia nella linea mieloide che lin oide (Ma one e al., 2002). Le cellule s aminali unipo en i possono au o- inno a si e di e enzia si in un solo ipo cellula e speci ico o mando una sola linea (Kolios e Moodley, 2012). Il conce o di e apia cellula e s aminale inalizza o alla igene azione dei essu i è s a o in odo o nel 1991 da Caplan, secondo cui la di e enziazione massi a delle cellule nel essu o deside a o po e a esse e o enu a median e isolamen o, col i azione ed espansione delle cellule s aminali in i o ed in ine inoculazione nella sede issu ale danneggia a (Voga e al., 2021). Le MSCs in i o hanno la unzione di man ene e l’equilib io dei essu i in condizioni isiologiche e con ibui e alla lo o ipa azione in caso di danneggiamen o. Hanno quindi una unzione di man enimen o della omeos asi ondamen ale pe assicu a e il co e o unzionamen o degli o ganismi i en i: le cellule di e enzia e che compongono i di e si essu i de i ano da una 19 sequenza di ansizioni cellula i e molecola i dalla cellula s aminale iniziale al eno ipo inale, in unzione delle ichies e dell’o ganismo. Esis e quindi la possibili à di u ilizza e le MSCs di un pazien e come ma e iale di pa enza pe p o ocolli di ipa azione issu ale (A. I. Caplan, 1991). Rispe o ad al i ipi di cellule s aminali, le MSCs semb ano a ualmen e esse e le più ada e a scopi e apeu ici g azie alle lo o semplici ecniche di accol a e isolamen o, alla lo o espansione cellula e du an e la col u a in i o e alla mancanza di ques ioni e iche pe quan o igua da il lo o uso essendo cellule isola e da o ganismi adul i senza a eca e danno agli s essi (Voga e al., 2021). Figu a 4. Capaci à di e enzia i a cellule s aminali unipo en i e plu ipo en i a con on o (Kolios e Moodley, 2012) 20 1.2.3 Nomencla u a e ca a e is iche delle MSCs Il conce o di “cellule s aminali” è na o alla ine del XIX secolo come pos ula o eo ico che conside a a la capaci à di alcuni essu i di au o inno a si pe u a la i a di un o ganismo anche se compos i da cellule con i a b e e. Anni dopo, l’iden i icazione delle cellule s aminali come en i à cellula i disc e e è segui a allo s iluppo di me odi pe l’isolamen o di possibili cellule s aminali, in pa allelo con la p oge azione di igo osi bio es pe alu a ne la po enziali à dopo il apian o in i o (Bianco e al., 2008). Il conce o a uale di “cellule s aminali mesenchimali” (MSCs, e mine conia o pe la p ima ol a da Caplan nel 1991) può esse e icondo o ad espe imen i esegui i nel XIX secolo da Goujon che dimos a ano che il apian o di midollo osseo (BM, bone ma ow) a si i ana omici e e o opici si aduce a in una gene azione de no o di osso e midollo ec opici (Goujon, 1869). Nel 1968 Ta assoli e C osby dimos a ono l’esis enza di un po enziale os eogenico in inseco associa o al midollo osseo, anche se i lo o s udi u ono esegui i su ammen i di BM senza la p esenza di ossa e quindi l'iden i à p ecisa di qualsiasi cellula che unzionasse come p ogeni o e di cellule ossee di e enzia e (cellule mesenchimali non ema opoie iche) non po é esse e de ini a (Ta assoli e C osby, 1968). Sono s a i successi amen e F iedens ein ed i suoi colleghi in s udi esegui i a gli anni ’60 e ’70 a dimos a e che il po enziale os eogenico de ini o da Ta assoli e C osby e a associa o alla p esenza di una so opopolazione mino e di cellule del midollo osseo (F iedens ein, 1990). Ques e cellule e ano dis inguibili dalla maggio pa e delle cellule ema opoie iche pe la lo o apida ade enza alle pias e di col u a issu ale e pe l'aspe o simil- ib oblas ico della lo o p ogenie in col u a, indicando la lo o o igine dal compa imen o s omale del midollo osseo (Bianco e al., 2008). Il apian o in i o ha po a o a iconosce e che dalla p ogenie di una singola cellula s omale BM possono esse e gene a i spe imen almen e in i o i essu i osseo, ca ilagineo, adiposo e ib oso. Tale cellula è s a a de ini a da F iedens ein e Owen come “cellula s aminale os eogenica” (F iedens ein e al., 1987b) o “cellula s aminale s omale BM” (Owen e F iedens ein, 1988). In pa icola e, Owen ha esamina o le p o e dell’ipo esi che esis ano cellule s aminali s omali 21 p esen i nei essu i conne i i molli associa e alle supe ici del midollo e delle ossa in g ado di da e o igine ad una se ie di linee cellula i di e en i (Owen, 1988). Negli anni successi i la nozione di MSC si è e olu a ispe o al conce o di “cellula s aminale non ema opoie ica p esen e nel midollo osseo”. Nell’ul imo decennio, di e si dubbi sono s a i solle a i sull’uso co e o della denominazione “Cellule S aminali Mesenchimali”: le p op ie à a ualmen e iconosciu e a ques a popolazione di cellule semb ano in a i non ispe a e appieno i c i e i di s aminali à (Ho wi z e al., 2005). Poiché il e mine di cellula s aminale ichiama, in a i, ca a e is iche speci iche, il Mesenchymal and Tissue S em Cell Commi ee della Socie à In e nazionale pe la Te apia Cellula e (ISCT) ha accomanda o un chia imen o nella nomencla u a. Ho wi z e al. p opongono che le cellule in g ado di ade i e alla plas ica desc i e come “cellule s aminali mesenchimali” engano de ini e “cellule s omali mesenchimali mul ipo en i”. Il e mine “cellula s aminale mesenchimale” do ebbe, in ece, esse e ise a o ad un so oinsieme di ques e (o al e) cellule che dimos ano l’a i i à delle cellule s aminali secondo c i e i chia amen e indica i (Ho wi z e al., 2005). A de a nomencla u a si è a i a i a a e so di e se conside azioni: • il e mine “s aminale” ha una conno azione unzionale speci ica, è una cellula in g ado di au o inno a si e di e enzia si in più ipi cellula i; • i da i a uali sono insu icien i pe po e ca a e izza e le cellule del midollo ade en i alla plas ica come s aminali, quindi è meglio u ilizza e il e mine “s omale”, che indica le lo o p op ie à uniche senza pe ò a i e imen o all’omogenei à o all’a i i à delle cellule s aminali s esse; • gli s udi condo i ino a sugge iscono che ques e cellule sono di o igine mesenchimale e ale e mine iene pe ciò ipo a o nella nomencla u a, pu non acendo i e men o al lo o po enziale di di e enziazione; • ali cellule semb ano o a si in si u all’in e no del compa imen o s omale di suppo o ai essu i esiden i. 22 Quindi, indipenden emen e dalla on e di essu o da cui engono isola e le cellule, ad esempio midollo osseo, essu o adiposo, sangue del co done ombelicale e sangue pe i e ico, la popolazione non aziona a può esse e gius amen e de ini a come “cellule s omali”, e i ando qualsiasi i e imen o al lo o po enziale biologico o e apeu ico (Ho wi z e al., 2005). Il e mine cellule s aminali mesenchimali do ebbe esse e, in ece, ise a o alle cellule che soddis ano i c i e i di s aminali à. L’ac onimo MSCs può esse e u ilizza o pe en ambe le de inizioni, ma i ice ca o i lo de ono de ini e in modo scien i icamen e co e o a seconda del la o o scien i ico s ol o. 23 1.2.4 Ca a e izzazione in i o delle MSCs Le MSCs sono cellule che non possiedono nessuna molecola segnale speci ica (ma ke ) che pe me a di iconosce le con ce ezza. Sono cellule con biologia dipenden e dall’animale da cui engono p ele a e ed in g ado di isponde e a s imoli di e si p o enien i dall’ambien e ci cos an e, sia in i o che nella col i azione in i o. Ciò de e mina una o e e e ogenei à dei p epa a i cellula i ogge o di s udio. Pe ale mo i o si ce ca di inco aggia e gli s udiosi di MSCs ad ado a e c i e i minimi di iden i icazione (Tab. 2) delle popolazioni di MSCs u ilizza e nel en a i o di s anda dizza e i p epa a i cellula i e consen i e così un con on o a i di e si s udi scien i ici (Dominici e al., 2006). A al p oposi o, nel 2006 un la o o a nome di Dominici e al. ha desc i o i c i e i s anda d pe l’iden i icazione delle MSCs p opos i dal Mesenchymal and Tissue S em Cell Commi ee dell’ISCT (Dominici e al., 2006). Pe ché le cellule col i a e possano esse e de ini e MSCs de ono soddis a e e c i e i (Tab. 2): • ade enza alla plas ica • esp essione di an igeni (Ag) di supe icie speci ici • po enziale di di e enziazione mul ipo en e (Dominici e al., 2006) Le MSCs de ono esse e in g ado di ade i e alla plas ica delle iasche di col u a se man enu e in condizioni s anda d: è una p op ie à ben desc i a, man enu a anche in so oinsiemi di MSCs (Col e e al., n.d.). Tabella 2. C i e i di iden i icazione delle MSCs (Dominici e al., 2006) 24 Nonos an e ques o, Baksh e al., hanno dimos a o che le MSCs in g ado di di e enzia si in os eoblas i e ib oblas i sono in g ado di sop a i e e e p oli e a e in sospensione, indipenden emen e dall’adesione alla plas ica, ma con p o ocolli che ichiedono condizioni di col u a mol o speci iche (Baksh e al., 2003). L’esp essione di an igeni (Ag) di supe icie consen e una apida iden i icazione di una de e mina a popolazione cellula e. Pe iden i ica e le cellule di una popolazione come MSCs una pe cen uale maggio e al 95% di esse de e esp ime e gli Ag CD105, CD73 e CD90 (Dominici e al., 2006). Il ma ke CD105 è no o anche come endoglina; il ma ke CD73 è no o anche come ec o-5’- nucleo idasi; il ma ke CD90 è no o anche come Thy-1 (Dominici e al., 2006). Nessuno di ques i ma ke è speci ico, ossia è esp esso in modo uni oco, nelle MSCs. Pe e i a e che all’in e no di una popolazione cellula e e e ogenea le MSCs engano scambia e con al e cellule, la mancanza di esp essione di Ag ema opoie ici iene u ilizza a come c i e io aggiun i o di iden i icazione. Quindi, pe iden i ica e le cellule di una popolazione come MSCs una pe cen uale in e io e o uguale al 2% di ques e de e manca e d’esp essione pe gli Ag CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 ed HLA-DR classe II. CD45 è un ma ke pan-leucoci a io; CD34 è un ma ke d’iden i icazione pe p ogeni o i ema opoie ici p imi i i e cellule endo eliali; CD14 e CD11b sono ma ke s esp essi sop a u o da monoci i e mac o agi, le cellule più equen emen e p esen i come con aminan i all’in e no di col u e di MSCs; CD79α e CD19 sono ma ke s di cellule B che possono ade i e alle MSCs in col u a e imane e i ali a a e so in e azioni s omali (Dominici e al., 2006). In ine, le molecole HLA-DR non engono esp esse dalle MSCs se non quando s imola e, ad esempio da IFN-g. L’ul imo c i e io minimo che le MSCs de ono possede e pe po e esse e de ini e ali è la capaci à di di e enziazione mesenchimale in e linee cellula i iden i ica e dal la o o di Dominici e al.: in condizioni s anda d in i o de ono esse e in g ado di di e enzia si in os eoblas i, adipoci i e cond oblas i (Fig. 5). 25 La di e enziazione può esse e dimos a a ami e la colo azione Aliza in Red o Von Kossa pe gli os eoblas i, la colo azione con Oil Red O pe gli adipoci i, la colo azione Alcian blu o l’immunois ochimica (collagene di ipo II) pe i cond oblas i (Dominici e al., 2006). Le colo azioni u ilizza e pe e idenzia e gli os eoblas i ile ano deposi i di calcio nei essu i (ma ice ossea mine alizza a) e sali di calcio; la colo azione usa a pe gli adipoci i e idenzia i lipidi; la colo azione che pe me e di indi idua e i cond oblas i ile a la p esenza di mucine (mac omolecole iden i ica e come sos anza mixoide p odo a dai essu i conne i i). La di e enziazione può anche esse e dimos a a alu ando l’esp essione di geni coin ol i in modo speci ico nel de e mina e il des ino della linea cellula e. Figu a 5. Di e enziazione mesenchimale ilinea e delle MSCs (Sanz Nogués e al., 2016) 32 ossia l’insieme dei ipi cellula i isolabili dal essu o adiposo. Mol e di ques e cellule, a pa i e dalle MSCs e dalle cellule endo eliali e del sis ema immuni a io s olgono un uolo impo an e nella igene azione dei essu i (Gimble e al., 2007). L’SVF isul a più acile da isola e e consen e di o ene e un p odo o p on o all'uso dopo un minimo con a o con xeno- eagen i, senza la necessi à di esegui e sepa azione o espansione cellula e (Mocchi e al., 2020b); ha quindi c i e i no ma i i meno igo osi ispe o alle AD-MSCs. Tu a ia, con iene di e si ipi cellula i po enzialmen e in g ado di de e mina e una ispos a immunologica e ciò lo ende ada o solo a a amen i au ologhi. Tu a ia, s udi condo i in i o da Kemilew e al. u ilizzando SVF allogeniche ne hanno dimos a o la sicu ezza e l'e icacia (Kemilew e al., 2019). 33 1.2.7 Col u a delle MSCs In gene ale le MSCs possono esse e isola e da on i “liquide” come il sangue pe i e ico e il midollo osseo o da on i “solide” come il essu o adiposo e il co done ombelicale. Nel p imo caso il essu o iene so opos o ad una cen i ugazione da cui si o iene la azione di cellule mononuclea e di in e esse, poi pos a in col u a, men e nel secondo caso il essu o iene so opos o ad una diges ione enzima ica e la azione cellula e o enu a iene pos a in col u a in adesione (Ba achina e al., 2018). T a gli enzimi più equen emen e u ilizza i si i o ano la collagenasi di ipo I e II (Thi umala e al., 2010). Sia nell’isolamen o da on i “liquide” che in quello da on i “solide” la azione cellula e che non ade isce alla plas ica iene imossa a a e so un cambio del medium (Rane a e al., 2011; Tessie e al., 2015). Il medium di col u a u ilizza o pe l’espansione in i o delle MSCs può esse e app esen a o da: Basal Medium Eagle (BME), Minimum Essen ial Media (MEM) o Modi ied Eagles Medium di Dulbecco (DMEM), che di e iscono a di lo o pe il con enu o in aminoacidi e sali mine ali e pe la concen azione di glucosio (Mocchi e al., 2020b). Inol e, gli a uali p o ocolli di col u a delle MSCs p e edono l’in eg azione del medium con sie o e ale bo ino (FBS, e al bo ine se um), che appo a a o i nu i i i necessa i a sos ene e la c esci a delle MSCs e a suppo a ne l’adesione e l’espansione in i o. Tu a ia, all’uso di FBS sono associa i un’al a a iabili à nella composizione, il ischio di una ispos a immuni a ia dell’ospi e nei con on i di an igeni bo ini e un aumen o del cos o (Russell e Koch, 2016). L’FBS, essendo di o igine bo ina, con iene in a i xeno-p o eine in g ado di innesca e eazioni immuni a ie ed in iamma o ie nell’animale a a o (Sundin e al., 2007). Pe ques o mo i o negli ul imi anni sono s a i s udia i dei possibili sos i u i all’FBS, come il lisa o pias inico (PL) e il sie o au ologo, e l’u ilizzo di un medium di col u a senza sie o (SFM, se um- ee medium). Il lisa o pias inico è un p epa a o acellula e o enu o dal Pla ele Rich Plasma (PRP), a icchi o dai a o i biologicamen e a i i ilascia i dalle pias ine in segui o alla lo o lisi. I se um- ee medium sono dei medium di col u a nella cui composizione iene escluso l’u ilizzo di FBS, sos i ui o da o mulazioni a ie di amminoacidi, sali, a o i di c esci a e al e p o eine bioa i e. Idealmen e sie i a base di PL o se um- ee do ebbe o app esen a e mezzi di col u a 34 cellula e a en i le s esse ca a e is iche di un comune medium con enen e FBS, ma p i i dei ischi ad esso associa i. Russell e Koch hanno alu a o come le MSCs de i a e dal sangue del co done ombelicale equino (CB-MSCs) p oli e ino in un medium di col u a a icchi o con PL o FBS a di e en i concen azioni. Nel lo o s udio hanno dimos a o che il PL si compo a allo s esso modo del FBS a u e le concen azioni u ilizza e, ma alla soglia del 30% di PL hanno no a o una pe di a di CB-MSCs, al con a io delle cellule a a e con FBS che in ece mos a ano una con inua co elazione posi i a all’aumen o delle concen azioni (Russell e Koch, 2016). S udi più app o ondi i si endono necessa i pe de e mina e se l’e e o sulla p oli e azione cellula e di MSCs de i a e da di e en i on i possa esse e sos enu o pe pe iodi più lunghi e pe più passaggi cellula i in i o. Ad oggi il lisa o pias inico non sos i uisce nella ou ine di p epa azione delle MSCs in campo e e ina io l’u ilizzo del FBS. Lee e al. hanno in ece alu a o a a e so un’analisi compa a i a le ca a e is iche delle AD- MSCs umane col i a e in i o in SFM ispe o a medium con enen i FBS, dimos ando che le cellule col i a e in SFM hanno mino e senescenza cellula e, mino e immunogenici à e maggio e s abili à gene ica ispe o a quelle col i a e in mezzi con enen i FBS (J. Y. Lee e al., 2022). Un al o s udio e e ua o da Cla k e al. su MSCs canine ed equine col i a e in condizioni di col u a p i e di FBS ha dimos a o che ques o medium non al e a la capaci à p oli e a i a delle cellule, il eno ipo delle p o eine di supe icie o le unzioni immuni a ie. Tu a ia, sia le MSCs canine che equine espanse in SFM hanno mos a o una mino sec ezione di PGE2 ispe o alle cellule col i a e in mezzi con enen i FBS ed una mino capaci à di inibi e la p oduzione di ci ochine p o-in iamma o ie (Cla k e al., 2016). Al ine di p e eni e con aminazioni ba e iche, nel medium di col u a è impo an e anche inse i e an ibio ici; i più comunemen e usa i sono penicillina e s ep omicina. Il alo e del pH del medium a ia a 7,2 e 7,4, e pe man ene lo cos an e le iasche di col u a engono incuba e in un'a mos e a di CO2 al 5% (Mocchi e al., 2020b). 35 All’in e no delle iasche di col u a, passa o qualche gio no dall’isolamen o, iniziano a o ma si colonie cellula i che si espande anno p og essi amen e (Fig. 6). Quando le cellule icop ono l’in e a supe icie della iasca a i ando a con luenza sme ono di p oli e a e pe inibizione da con a o. Pe e i a e che ques o accada e a si che le cellule con inuino ad espande si in uno spazio adegua o, ques e engono s acca e enzima icamen e dalla supe icie di col u a, in gene e median e ipsina. In base all’applicazione clinica ichies a il nume o di MSCs necessa io pe la e apia è a iabile, ma pe ché la popolazione cellula e sia omogenea e il nume o di cellule sia adegua o, si u ilizzano con enzionalmen e i passaggi cellula i dal 2 al 4. L’u ilizzo di cellule a passaggi più ele a i è sconsiglia o: è in a i dimos a o che all’aumen a e dei empi di col u a il lo o po enziale p oli e a i o diminuisce, aumen a il ischio di ano mali à mo ologiche e anno incon o a senescenza (Vidal e al., 2012). Figu a 6. Espansione p og essi a colonia cellula e di MSCs ad ing andimen o 4x ispe i amen e a 24(a), 96(b) e 120(c) o e dall’isolamen o in iasca (sezione di Biochimica del Dipa imen o di Scienze Medico Ve e ina ie di Pa ma) a b c 36 1.2.8 Di e enziazione delle MSCs La di e enziazione delle MSCs è egola a da e en i gene ici che coin olgono a i a o i di asc izione (Pa el e al., 2013); esis ono in a i geni egola o i che possono indu e le cellule p ogeni ici a di e enzia si e so un pa icola e eno ipo. Ol e ai a o i di c esci a e alle sos anze chimiche di induzione, un mic oambien e cos ui o con impalca u e di bioma e iali può anche o ni e alle MSCs adegua e condizioni di p oli e azione e di e enziazione (Ding e al., 2011). Nonos an e le MSCs siano in g ado di di e enzia si in un ce o nume o di essu i in i o, la popolazione cellula e che ne de i a non app esen a comple amen e ali essu i nelle lo o p op ie à biochimiche e biomeccaniche (Hwang e al., 2009). La di e enziazione mesode mica è acilmen e de inibile pe le MSCs essendo esse della s essa o igine emb ionale (Ding e al., 2011). La di e enziazione nelle linee os eogenica, cond ogenica e adipogenica delle MSCs è s a a desc i a da di e si s udi in le e a u a. L’induzione alla di e enziazione os eogenica è un p ocesso complesso s e amen e con olla o da nume ose ie di segnalazione e a o i di asc izione (Deng e al., 2008) e che ichiede la p esenza di b-glice o os a o, acido asco bico 2- os a o, desame asone e sie o e ale bo ino (Ba y e Mu phy, 2004) e combinazioni del a o e di c esci a as o man e b (TGF-b), p o eine mo ogene iche ossee (BMP) e i amina D3 (Almalki e Ag awal, 2016). Quando engono col i a e in monos a o in p esenza di ques i in eg a o i, le cellule acquisiscono una mo ologia os eoblas ica con up- egula ion della os a asi alcalina e deposizione di una ma ice ex acellula e mine alizza a icca di calcio (Ba y e Mu phy, 2004). Sono le in e azioni a o moni e a o i di c esci a a con olla e la di e enziazione delle MSCs in os eoci i. I p incipali a o i di asc izione con ol i sono il a o e di asc izione 2 co ela o a Run (Runx2), os e ix e b-ca enina (Almalki e Ag awal, 2016). Il a o e di asc izione Runx2 è un egola o e ondamen ale pe la o mazione ossea e pe la di e enziazione os eogenica delle MSCs (Almalki e Ag awal, 2016); indi izza le MSCs a di e enzia si in p e-os eoblas i ed inibisce la di e enziazione adipogenica e cond ogenica (Komo i, 2006). 37 Os e ix appa iene alla amiglia delle p o eine di speci ici à 1 (Sp1) dei a o i di asc izione ed è essenziale pe la o mazione delle abecole ossee co icali du an e l’ossi icazione in amemb anosa o endocond ale (Nakashima e al., 2002). La b-ca enina s olge un uolo c uciale nella di e enziazione in os eoblas i delle MSCs in quan o, in sua assenza, ale di e enziazione iene blocca a, men e iene s imola a quella in cond oci i (Day e al., 2005). La di e enziazione cond ogenica si e i ica quando le MSCs sono col i a e in condizioni che includono una col u a idimensionale, un mezzo nu i i o p i o di sie o e l’aggiun a di un memb o della supe amiglia TGF-b (Ba y e Mu phy, 2004). Il mezzo nu i i o è in eg a o con os a o di acido asco bico, desame asone, albumina bo ina, acido linoleico, pi u a o di sodio, ans e ina, acido selenico, p olina e L-glu ammina (Almalki e Ag awal, 2016). In ali condizioni le cellule pe dono apidamen e la mo ologia ib oblas ica, iniziando ad esp ime e un ce o nume o di componen i della ma ice ex acellula e speci ici pe il essu o ca ilagineo. Sono s a i iden i ica i solo pochi a o i gene ici che egolano la cond ogenesi delle MSCs; il p incipale a o e di asc izione che ha un uolo chia e in ques a di e enziazione è il gene 9 (Sox9) che con olla l’esp essione del collagene di ipo 9 legandosi al suo p omo o e e o mando complessi ans-a i an i con al e p o eine (B idgewa e e al., 1998; Z. H. Wang e al., 2014). Al i a o i di asc izione s udia i pe il lo o uolo nella di e enziazione cond ogenica delle MSCs sono s a i ZNF145 (Zinc- inge p o ein 145), FOXO3A, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, STAT3 and Wn 11 (Almalki e Ag awal, 2016). La di e enziazione adipogenica delle MSCs è s imola a dalla lo o incubazione in un mezzo con enen e 3-isobu il-1-me ilxan ina, insulina, indome acina, iiodo ionina, Asc-2-P, FGF e desame asone (Almalki e Ag awal, 2016) e de e mina l’accumulo di lipidi in acuoli in acellula i (Almalki e Ag awal, 2016; Ba y & e Mu phy, 2004). Il ece o e g a i a o dalla p oli e azione del pe ossisoma speci ico adipogenico (PPAR-g) è uno dei più impo an i a o i di asc izione che egolano l’esp essione dei geni esponsabili di ques a di e enziazione (Almalki e Ag awal, 2016; Ba y & e Mu phy, 2004). È s a o ipo a o che PPAR-g iene so a egola o du an e la di e enziazione adipogenica delle MSCs e la sua inibizione sopp ime l’adipogenesi (Almalki e Ag awal, 2016). 38 Un al o a o e impo an e che induce la di e enziazione delle MSCs in adipoci i con e icienza compa abile a PPAR-g è EBF-1 (ea ly B cell ac o ) (Ake blad e al., 2005). Le MSCs, in aggiun a alla lo o capaci à di di e enzia si in os eoci i, cond oci i e adipoci i, sono anche in g ado di di e enzia si in cellule muscola i lisce, ca diomioci i, cellule endo eliali, epa oci i, neu oni e cellule panc ea iche (Almalki e Ag awal, 2016; Be ebichez-F idman e al., 2017). Il po enziale delle MSCs di di e enzia si in una pa icola e linea cellula e mesenchimale si basa sull’up- egula ion o sulla sopp essione di geni speci ici da pa e dei a o i di asc izione di de e mina e ie di segnalazione e dell’in e azione di al i a o i che ungono da co- egola o i. La di e enziazione delle MSCs in ciascuno di ques i lignaggi cellula i è p omossa da speci ici a o i di asc izione associa i a un lignaggio cellula e chia e (Almalki e Ag awal, 2016) (Fig. 7). Ad esempio, nella di e enziazione epa ica il a o e di c esci a epa oci a io e l'oncos a ina M sono s a i u ilizza i pe o ene e cellule cuboidi che esp imesse o ma ca o i app op ia i (a- e op o eina, glucosio 6- os a asi, i osina amino ans e asi e CK-18) e p oducesse o albumina in i o (Wei e al., 2008). La di e enziazione ec ode mica neu onale delle MSCs può esse e, in ece, indo a in i o da DMSO, bu ilid ossianisolo (BHA), b-me cap oe anolo, KCl, o skolina e id oco isone (Ding e al., 2011). Figu a 7. P incipali a o i di asc izione che p omuo ono la di e enziazione delle MSCs in os eoci i, cond oci i, adipoci i, cellule muscola i lisce, cellule muscola i schele iche e ca diomioci i (Almalki e Ag awal, 2016) 39 1.2.9 Te apia au ologa e allogenica, cosa dice la no ma i a? A ualmen e, esis ono due p incipali app occi pe la e apia con cellule s omali mesenchimali in medicina igene a i a, sia nell’uomo che in e e ina ia: il apian o di cellule au ologhe ed il apian o di cellule allogeniche. Nel apian o au ologo il pazien e ice e le p op ie cellule s aminali, men e nel apian o allogenico si u ilizzano le cellule s aminali accol e da un dona o e sano della s essa specie del pazien e ice en e. Esis e anche la possibili à di un apian o xenogenico in cui le cellule s aminali engono apian a e a specie animali di e se. Quando si sceglie il ipo di cellule più app op ia o pe una pa icola e e apia, la scel a a on i au ologhe e allogeniche può i ela si impegna i a e do ebbe o esse e enu i in conside azione an aggi e s an aggi pe l’una o pe l’al a opzione (Voga e al., 2020). L’uso delle MSCs allogeniche è sogge o a speci iche no ma i e nazionali, impo an i da conside a e pe le spe imen azioni e le applicazioni cliniche (Mocchi e al., 2020b). La e apia au ologa è i enu a più sicu a, ma il suo p incipale s an aggio è il lungo pe iodo di empo ichies o pe isola e ed espande e in i o la gius a quan i à di cellule necessa ia pe la e apia. Tale lasso di empo dipende dal ipo di essu o accol o, dalla capaci à eplica i a delle cellule s esse, dall'e à, dal sesso, dal ipo di mala ia del pazien e e da possibili pa ologie concomi an i (Siegel e al., 2013). La e apia allogenica o e dei an aggi impo an i ispe o a quella au ologa, come la disponibili à di a e e una banca di MSCs, p eceden emen e ca a e izza e in i o pe la alu azione di sicu ezza, e icacia e capaci à di di e enziazione, p on e all’uso in empi adegua i alle applicazioni e apeu iche, senza la necessi à di a ende e l'espansione della col u a cellula e au ologa. Ques o ipo di app occio idu ebbe la a iabili à ipica dei p odo i cellula i au ologhi, consen endo una maggio e omogenei à nei a amen i e, p esumibilmen e, nei isul a i (Mocchi e al., 2020b). La p eoccupazione p incipale igua dan e la e apia allogenica è la possibili à che le molecole di supe icie MHC-I p esen i sulle MSCs allogeniche siano iconosciu e dalle cellule CD8+T ice en i, 40 po ando alla ci o ossici à di e a nei con on i delle cellule es anee (Voga e al., 2020). Inol e, le molecole MHC-II possono esse e iconosciu e dalle cellule T CD4+ des ina a ie, po ando a una ispos a immuni a ia ci o ossica o umo ale (Voga e al., 2020). Le molecole di MHC po ebbe o anche esse e so opos e a iconoscimen o indi e o da pa e delle cellule p esen an i l'an igene, po ando alla p oduzione di alloan ico pi nelle cellule B (Wieczo ek e al., 2017). Gli s udi clinici esegui i negli ul imi anni hanno ce ca o di con on a e i due ipi di app occi e apeu ici su di e se specie animali, sop a u o sul cane e sul ca allo. L’obie i o di ali s udi è s a o quello di dimos a e la p esenza o l’assenza di una ispos a in iamma o ia sis emica e/o locale e di al i e e i a e si ispe o all’uso della e apia au ologa o allogenica. Nonos an e i isul a i p ome en i pe quan o igua da la sicu ezza delle MSCs allogeniche, di e si s udi condo i in i o e in i o hanno mos a o ispos e immunogeniche p o oca e dalla e apia. Joswig e al. (Joswig e al., 2017), Be oni e al. (Be oni e al., 2019) e Cabon e al. (Cabon e al., 2019) hanno ipo a o e e i colla e ali locali quando l'applicazione di cellule allogeniche iene ipe u a e hanno p opos o che le eazioni a e se siano mol o p obabilmen e do u e al iconoscimen o immuni a io delle cellule da pa e del des ina a io dopo la iesposizione (Voga e al., 2020). Tu a ia, in al i s udi (Ca ade e al., 2011)(Shah e al., 2018) in cui gli e e i delle applicazioni singole e ipe u e di cellule allogeniche sono s a i con on a i, non sono s a e osse a e di e enze clinicamen e ile an i nell'esi o. Nel 2011 Ca ade e al. hanno con on a o l’uso di MSCs au ologhe e allogeniche de i a e da placen a inocula e nelle a icolazioni con ola e ali di 16 ca alli sani: gli animali sono s a i esamina i igua do la p esenza di zoppia e sull’analisi del liquido sino iale, alu andoli a 0, 24, 48 e 72 o e dopo l’iniezione. L'iniezione di MSCs allogeniche non ha susci a o una ispos a sis emica e le ispos e locali come il gon io e a icola e o la zoppia e ano minime e a iabili (Ca ade e al., 2011). Non sono s a e e idenzia e di e enze signi ica i e a il g ado e il ipo di in iammazione susci a a dall’uso di MSCs au ologhe e allogeniche (Ca ade e al., 2011). 41 Nel 2018 Shah e al. hanno in ece alu a o il a amen o con MSCs allogeniche, de i a e da essu o adiposo di cani sani, su 203 cani a e i da a i e degene a i a con g a e dolo e c onico delle a icolazioni, zoppia, mobili à ido a e disabili à unzionale. Gli animali, alu a i dopo 10 se imane dal a amen o, hanno mos a o un miglio amen o signi ica i o dei sin omi, con iduzione del dolo e, miglio amen o della mobili à e aumen o dell’a i i à quo idiana; solo un cane ha mos a o un peggio amen o dei sin omi (Shah e al., 2018). Ques o s udio ha o ni o un suppo o clinico in me i o all’e icacia e alla sicu ezza dell’uso di MSCs allogeniche de i a e da essu o adiposo (Shah e al., 2018). Al i ipi di s udi hanno ce ca o di alu a e gli e e i a li ello molecola e o cellula e, osse abili in-si u dopo applicazione della e apia cellula e. La maggio pa e di ques i s udi sono s a i condo i su modelli di essu o danneggia o spe imen almen e, ma alcuni au o i sugge iscono che pe alu a e meglio i meccanismi d'azione delle MSCs sa ebbe necessa io applica e ali cellule nei essu i sani o comunque essu i a e i da pa ologia spon anea, pe p e ede e anche gli e e i colla e ali del apian o allogenico di MSCs negli animali (Gala e al., 2013). In linea con esi i clinici con addi o i igua dan i l'immunogenici à delle MSCs, sono s a i ipo a i anche isul a i con as an i in e mini di esp essione di MHC a seconda del lo o s a o, o igine issu ale, azze, singolo dona o e e condizioni di col u a (Voga e al., 2020). È s a o dimos a o che le MSCs p o enien i da nume ose on i e specie esp imono bassi li elli di p o eine di classe I (MHC-I) del complesso maggio e di is ocompa ibili à sulla lo o supe icie cellula e e bassi li elli di molecole co-s imolan i, come CD80 e CD86; inol e, nello s a o di isposo, le MSCs non esp imono p o eine di classe II (MHC-II) del complesso maggio e di is ocompa ibili à (Lohan e al., 2014). Mena d e al. hanno dimos a o che le AD-MSCs possiedono una maggio e capaci à di modula e le cellule immuni a ie e che il lo o p o ilo eno ipico è coe en e con una mino e immunogenici à ispe o alle BM-MSCs (Ména d e al., 2020). Indipenden emen e dai mol i isul a i posi i i degli s udi che inco aggiano l'uso delle MSCs allogeniche, di e si s udi hanno con e ma o che le lo o p op ie à immunosopp essi e non escludono la lo o immunogenici à (Voga e al., 2020). Ad oggi la scel a dell’u ilizzo clinico della e apia igene a i a au ologa e/o allogenica è mo i o di 48 1.3.3 A i i à pa ac ina e sec e oma delle MSCs L’azione e apeu ica delle MSCs non è solo associa a ad una comunicazione di e a cellula-cellula, ma anche ad una comunicazione pa ac ina, basa a sulla sec ezione di molecole bioa i e come a o i di c esci a, ci ochine e chemochine, in g ado di in luenza e i p ocessi biologici del mic oambien e ci cos an e come chemio assi, angiogenesi, con ollo dell’apop osi, p oli e azione e di e enziazione delle cellule esiden i, a i i à an i- ib o ica ed endo eliale (Jimenez-Pue a e al., 2020; W. S. Pa k e al., 2018) (Fig. 10). Sono u e asi ondamen ali pe il p ocesso di ipa azione issu ale. È p op io g azie alla comunicazione pa ac ina che dipende l’a i i à omeos a ica e immunomodulan e delle MSCs: in ispos a ai segnali che ice ono da un si o lesiona o esse si a i ano e sece nono a i a o i no i con il e mine gene ico di “sec e oma” (Y. Wang e al., 2014). T a ques i ien ano, ad esempio, il a o e di c esci a degli epa oci i (HGF), la p o eina del gene 6 s imola a dal TNF (TSG-6), il a o e di c esci a endo eliale ascola e (VEGF), il a o e basale di c esci a dei ib oblas i (bFGF), il a o e di c esci a insulino-simile (IGF-1), il ligando 2 delle chemochine (CCL-2), il a o e di c esci a epide mico (EGF), il a o e di c esci a pias inico (PDGF), IL-6, TGF-b, la p os aglandina E2, IDO (enzima indoleamina 2,3-diossigenasi-1) e il a o e 1 de i an e dalle cellule s omali (SDF-1) (Wei e al., 2013). Una ol a a i a e le MSCs la p oduzione di a o i di c esci a aumen a ino a aggiunge e i li elli o imali pe po e de e mina e una ispos a e icien e (Jimenez-Pue a e al., 2020). Un essu o danneggia o che ha subi o un p ocesso in iamma o io acu o ilascia una g ande quan i à di ci ochine p o-in iamma o ie che s imolano le MSCs ad a i a si e de ini e una miglio e ispos a immunosopp essi a (M. Wang e al., 2018). Pe ques o mo i o sono s a i alu a i l’u ilizzo di ci ochine p o-in iamma o ie o l’u ilizzo di inibi o i delle ci ochine an in iamma o ie p ima della somminis azione di MSCs pe il a amen o dell’in iammazione acu a (Abdi e al., 2018). Al con a io di un p ocesso acu o, du an e la eg essione di un’in iammazione c onica o a amen i immunosopp esso i, la p oduzione di ci ochine p o-in iamma o ie diminuisce, men e aumen a quella delle ci ochine an in iamma o ie (Jimenez-Pue a e al., 2020). 49 Le MSCs non sece nono solo molecole solubili che si di ondono g azie alla comunicazione pa ac ina, ma p oducono anche escicole ex acellula i (EVs, ex acellula escicles) comp enden i esosomi e mic o escicole, libe a e pe esoci osi, che di ondono ul e io i molecole bioa i e (Fig. 10). Inol e, a i meccanismi pa ac ino-p o e i i delle MSCs i è anche il as e imen o dei mi ocond i. Le dimensioni delle EVs sono di e se: men e gli esosomi hanno una dimensione massima di 100 nanome i, le mic o escicole aggiungono dimensioni di 200 nanome i. En ambi possono con ene e RNA messagge o (mRNA), RNA di aspo o ( RNA), mic oRNA (miRNA) e pep idi/p o eine in unzione ai segnali che a i ano alle MSCs dall’ambien e es e no e possono in e agi e con le cellule a ge ami e un meccanismo ece o iale o di endoci osi (Jimenez-Pue a e al., 2020). Di e si s udi hanno inol e dimos a o gli e e i e apeu ici delle EVs sulla ispos a immuni a ia inna a e acquisi a e che gli esosomi po ebbe o se i e pe as e i e mic oRNA a le cellule pe egola ne l'esp essione genica e o i e e e i e apeu ici pe di e en i pa ologie d’o gano (Hyun e al., 2015; Rad e al., 2019a; Zeng e al., 2021). Rispe o alle MSCs le EVs hanno di e si an aggi po enziali: sono più s abili du an e i p ocessi di congelamen o e scongelamen o g azie a un doppio s a o os olipidico, possiedono bassa immunogenici à, mancano del po enziale endogeno di o mazione umo ale, sono s abili in i o Figu a 10. Con enu o e a i i à delle EVs (Ab eu e al., 2021) 50 e mani es ano un'ele a a e icienza dopo la somminis azione (Jimenez-Pue a e al., 2020). Tu a ia, la dose di EVs inie a e e la ia di somminis azione in luenzano la lo o biodis ibuzione (Rad e al., 2019b). Ques i aspe i dimos ano che non se ono necessa iamen e le MSCs pe gua i e un essu o danneggia o: ad oggi si i iene in a i che l’in eg azione delle MSCs nella sede di impian o e la lo o sop a i enza a lungo e mine po ebbe non esse e necessa ia pe a o i e la gua igione e che la sola modulazione empo anea del p ocesso ipa a i o po ebbe esse e su icien e alla lo o azione e apeu ica. Sono pe ò necessa i ul e io i s udi clinici pe comp ende e meglio i meccanismi alla base delle unzioni delle EVs. 51 1.3.4 A i i à angiogenica delle MSCs Le MSCs ese ci ano i lo o e e i p o-angiogenici sop a u o g azie alla comunicazione pa ac ina. Il sec e oma con iene, in a i, di e si a o i di c esci a e ci ochine p o-angiogenici come il a o e di c esci a endo eliale ascola e (VEGF), il a o e 2 di c esci a dei ib oblas i (FGF-2 o bFGF), il a o e di c esci a de i a o dalle pias ine (PDGF), il a o e di c esci a as o man e b (TGF-b), il a o e di c esci a degli epa oci i (HGF), la p o eina chemio a ica dei monoci i 1 (MCP-1), il a o e de i an e dalle cellule s omali (SDF-1) e l’angiopoie ina 1 (Ang-1) (Fan e al., 2020; Rau iainen e al., 2021). Di e si s udi hanno ipo a o la capaci à delle MSCs di s imola e l’aumen o di capilla i e nuo i asi dopo la somminis azione in i o e in i o (Sanz e al., 2008; So ell e al., 2009): p omuo ono p oli e azione e mig azione delle cellule endo eliali (EC), inibendone l'apop osi e de e minando così la o mazione di s u u e ubola i (Fig. 11). L’angiogenesi è in a i un p ocesso complesso in cui si c ea una e e ascola e iniziale che iene ul e io men e o ganizza a dalla ge minazione dei asi s essi e che ichiede la c esci a delle cellule endo eliali (Fig. 11). Nei asi sanguigni ma u i, le MSCs egolano poi la pe meabili à ascola e (Fig. 11). VEGF p omuo e la di e enziazione delle MSCs e la mig azione delle cellule endo eliali inducendone la p oli e azione e la di e enziazione insieme a FGF-2 e PDGF (Lindne e al., 1990; P es a e al., 2005). Inol e, VEGF è no o pe p omuo e e l'angiogenesi e la asculogenesi, cioè la o mazione de no o dei asi sanguigni, e pe egola e la pe meabili à ascola e (Ylä-He uala e al., 2007); insieme a FGF-2, IL-6 e MCP-1 inibisce anche l'apop osi delle cellule endo eliali, aumen andone la sop a i enza (Hung e al., 2007). FGF-2 pa ecipa alla deg adazione della ma ice ex acellula e, impo an e ase del p ocesso di angiogenesi (P es a e al., 2005). TGF-b suppo a la o mazione di s u u e simil ubula i ed è un a o e essenziale nello s iluppo ascola e (Goumans e al., 2003). HGF p omuo e la c esci a e la mo ili à delle cellule endo eliali ed insieme all’SDF-1 p omuo e l’angiogenesi locale (Bussolino e al., 1992; Tao e al., 2016). 52 Inol e, SDF-1 s imola la p oli e azione delle cellule endo eliali e i capilla i di nuo a o mazione, men e HGF p omuo e la os o ilazione della i osina nelle cellule endo eliali e nelle cellule muscola i lisce (Fan e al., 2020). L'IL-6 p omuo e l'angiogenesi e la sop a i enza delle cellule endo eliali (Bo o e al., 2011). MCP-1 è una molecola chemio a ica ondamen ale pe l'angiogenesi (Boomsma e Geenen, 2012). Secondo di e si s udi i a o i solubili angiogenici sec e i dalle MSCs miglio ano l'angiogenesi e ip is inano l'a lusso di sangue nelle a ee ischemiche; u a ia, non è del u o chia o se siano ali a o i gli unici esponsabili di ques o meccanismo d’azione (Fan e al., 2020). Figu a 11. Angiogenesi indo a dalle MSCs (Rau iainen e al., 2021) 53 1.3.5 MSCs e sis ema immuni a io Le MSCs ispondono agli s imoli sece nendo a o i immuno egola o i in base ai di e si segnali che ice ono dal mic oambien e che le ci conda. La p oduzione di ali a o i dipende dalle in e azioni a i a o i pa ac ini che le MSCs ice ono e i ece o i p esen i sulla lo o supe icie come i Toll-like ecep o (TLR) (Sangio gi e Panepucci, 2016). Secondo uno s udio condo o da Wa e man e al. sulle MSCs umane il TLR può s imola e la lo o pola izzazione in due di e si eno ipi de i MSC1 e MSC2; il p imo eno ipo, s imola o dal TLR4, p oduce a o i p o-in iamma o i, men e il secondo, s imola o dal TLR3, p oduce a o i immunosopp essi i (Wa e man e al., 2010). Le MSCs hanno quindi una spicca a a i i à immunomodulan e, a endo un uolo impo an e nella ma u azione di di e se cellule immuni a ie, come lin oci i T e B, mac o agi, cellule na u al kille (NK) e cellule dend i iche. L’e e o immunosopp essi o sui lin oci i T è o enu o a a e so le in e azioni cellula-cellula. Nei p ocessi in iamma o i acu i le cellule T e e ici sece nono ci ochine p o-in iamma o ie che a i ano le MSCs, come INF-g, TNF, IL-1 e IL-17 (H. Li e al., 2018). In ispos a le MSCs ilasciano di e se molecole come la p os aglandina E2 (PGE2), l’enzima IDO, di e se chemochine e al i a o i in g ado di a a e chemio a icamen e le cellule T in icinanza delle MSCs a i a e. Qui l’enzima IDO iene ca abolizza o ed i suoi ca aboli i inibiscono le cellule T s esse, con conseguen e lo o apop osi. Inol e, la p oli e azione delle cellule T e la lo o di e enziazione in cellule T helpe (Th1 e Th17), possono esse e inibi e dal sec e oma delle MSCs, con enen e di e se molecole in g ado di s imola e i mac o agi a p odu e il a o e di c esci a as o man e-β (TGF-β) che p omuo e la di e enziazione delle cellule T nai e in cellule T egola o ie (T eg) (Jimenez-Pue a e al., 2020). Le MSCs s olgono anche a i i à immunomodulan e sulle cellule B. L’a i azione delle MSCs, in a i, inibisce la p oli e azione delle cellule B, la di e enziazione in plasmacellule e il conseguen e ilascio di IgE e IgG (Jimenez-Pue a e al., 2020). Le MSCs iconoscono anche le cellule na u al kille a i a e e sono in g ado di inibi ne la p oli e azione egolando la lo o a i azione ami e IL-2 e IL-15 (Spaggia i e Mo e a, 2013). 54 Anche i mac o agi in e agiscono con le MSCs: è s a o ipo a o che un’ele a a esp essione dell’enzima IDO po a i monoci i a di e enzia si nei mac o agi di ipo 2, a eno ipo immunosopp essi o e an in iamma o io (F ançois e al., 2012). Dal pun o di is a dell’applicazione clinica le MSCs engono ampiamen e u ilizza e nei p ocessi in iamma o i, in pa ologie d’o gano, dell’appa a o muscolo-schele ico e in pa ologie sis emiche. Sono cellule de ini e “immunop i ilegia e”, non enendo iconosciu e dal sis ema immuni a io dell’ospi e come cellule es anee o non-sel . In a i, men e u e le cellule appa enen i ad un o ganismo p esen ano sulla supe icie il complesso maggio e di is ocompa ibili à (MHC) che pe me e al sis ema immuni a io di iconosce e una cellula come sel o non-sel , le MSCs non esp imono le molecole MHC-II e p esen ano bassi li elli di MHC-I. Inol e, non esp imono nemmeno i ma ke CD80 o CD86 che s imolano le cellule T. Ques o è il mo i o pe cui le MSCs possono esse e usa e pe e apie allogeniche senza che l’o ganismo ospi e me a in a o una eazione immuni a ia nei lo o con on i. Ques i aspe i sono s a i ampiamen e dimos a i in i o, ma non è anco a chia o se ques a a i i à immunomodulan e possa esse e de ini a ale anche in i o, a causa delle complesse in e azioni a MSCs e cellule endogene e della p esenza di meccanismi issu ali speci ici (de Vasconcellos Machado e al., 2013). 55 1.3.6 Vie di somminis azione e dosaggi delle MSCs Oggi il Medico Ve e ina io u ilizza le MSCs nel a amen o di di e se pa ologie in di e en i specie animali. Si a a di una e apia conside a a spe imen ale, poiché de ini a dall’uso di p odo i biologici non omogenei e di e si pe eno ipo, esp essione di bioma ke e compo amen o, ques ’ul imo dipenden e dal essu o di p o enienza e dal si o di somminis azione. Non si a a di a maci adizionali, mo i o pe cui è ondamen ale pe una co e a p a ica clinica che il Medico Ve e ina io segua le egole del labo a o io di i e imen o pe quan o igua da la conse azione e le empis iche di somminis azione del p odo o. Le MSCs possono esse e somminis a e a a e so e p incipali ie: • applicazione opica • somminis azione locale • somminis azione sis emica L’applicazione opica può esse e: - cu anea - ocula e - in au e ina - in amamma ia L’applicazione locale può esse e: - in a endinea - in a icola e - in amuscola e - in aspinale - so ocu anea - so ogengi ale - in aocula e e si esegue in modo di e so a seconda della lesione o pa ologia da a a e. Ad esempio, può esse e ecoguida a nel caso di lesioni endinee e legamen ose, esegui a a a e so l’aiu o di a oscopia o al i mezzi diagnos ici se in a icola e, s ol a con l’uso di un in ensi ica o e di b illanza se in a ecale o epidu ale. 56 L’iniezione in a icola e è un’iniezione locale p op iamen e de a: da uno s udio e e ua o su più specie animali è eme so che le cellule inie a e pe ques a ia possono aggiunge e il endine lesiona o icino all’a icolazione zona di somminis azione, ma non si dis ibuiscono a li ello sis emico. Anche l’iniezione in amuscola e delle MSCs è conside a a una ia locale, a di e enza dei a maci adizionali, che se così somminis a i aggiungono in ece il ci colo sis emico (Sanchez-Diaz e al., 2021). In ine, la somminis azione sis emica può esse e: - endo enosa (IV o EV) - in a e iosa (IA) - in ape i oneale - in aepa ica, in asplenica, in aca diaca (pe ica diaca e mioca dica) In pa icola e, la somminis azione endo enosa è quella più semplice da esegui e dal pun o di is a p a ico, ma bisogna conside a e la biodis ibuzione delle MSCs. Il p imo il o che esse incon ano quando inie a e pe ques a ia è quello polmona e: pe un pe iodo a iabile dalle 24 o e ai 7 gio ni pos - a amen o la maggio pa e delle cellule somminis a e si e ma qui. In segui o, si dis ibuiscono p e alen emen e a li ello epa ico e enale e in mino misu a a li ello di al i o gani. La lo o biodis ibuzione è comunque semp e dipenden e dalla p esenza di s a i in iamma o i o pa ologici p esen i nell’o ganismo. La quan i à di MSCs somminis a a pe ia EV dipende dal peso dell’animale: nella maggio pa e dei la o i scien i ici si u ilizza un dosaggio pa i a 2x106 cellule/kg nel cane e nel ga o. Nel ca allo, in ece, si ende a somminis a e una quan i à di cellule pa i a 100x106 in 20mL di soluzione isiologica anche se gli esempi di somminis azione sis emica in ques a specie sono limi a i (Sanchez-Diaz e al., 2021). Nella somminis azione in a e iosa le MSCs sono più ampiamen e dis ibui e, poiché non incon ano il il o polmona e e possono quindi aggiunge e o gani quali il sis ema gas o- en e ico ed il Sis ema Ne oso Cen ale (SNC), anche in ques o caso semp e dipenden emen e dalla p esenza di s a i in iamma o i o pa ologici p esen i nell’o ganismo. Dal pun o is a p a ico la somminis azione di MSCs pe ia IA è più complessa, in quan o è più acile che aumen i il ischio di o mazione di ombi; la dose di MSCs usa a è quindi minima, pa i a 0,5-1x106 cellule in o ale. Una quan i à eccessi a di cellule cause ebbe la o mazione di agg ega i cellula i e quindi di ombi, aumen ando il ischio di mo e del pazien e (Sanchez-Diaz e al., 2021). La somminis azione di MSCs pe ia in ape i oneale compo a una dis ibuzione delle cellule 57 p incipalmen e nei essu i a con a o con il liquido pe i oneale, men e la lo o dis ibuzione sis emica è minima (Sanchez-Diaz e al., 2021). In ine, le somminis azioni in aepa ica, in asplenica, in ape ica dica e in amioca dica app esen ano ie complesse dal pun o di is a p a ico, in quan o è ondamen ale conosce e la ascola izzazione di ques i o gani pe capi e come le MSCs si po ebbe o dis ibui e in essi localmen e o p ende e la ia sis emica. Sono pe an o ie poco s u a e nella comune p a ica clinica (Sanchez-Diaz e al., 2021). Pe la co e a applicazione delle MSCs si de ono ene e in conside azione di e si a o i, che possono incide e sulla co e a esecuzione e sull’e icacia della e apia. Ad esempio, in caso di iniezione di e a delle cellule, sop a u o se è necessa ia una lo o isospensione in soluzione, è ondamen ale l’u ilizzo di un ago di dimensione adegua a: da uno s udio condo o da Lang e colleghi è eme so che se le MSCs engono isospese in modo ene gico usando aghi di diame o in e io e ai 20 Gauge subiscono un danno meccanico con lesione della memb ana cellula e e conseguen e aumen o di mo e cellula e s essa. Pe e i a e di de ini e un danno si u ilizza, quindi, una pipe a da labo a o io o un ago di diame o 18 o 20 Gauge. Se poi pe la somminis azione si ende necessa io l’u ilizzo di un ago di diame o in e io e è bene a enziona e anche l’iniezione s essa, semp e pe non c ea e uno s ess meccanico alle cellule (Lang e al., 2017). Inol e, è necessa io ene e in conside azione possibili in e azioni con a maci adizionali somminis a i in concomi anza alle MSCs o con cui l’animale a a o è in e apia. Nel de aglio, le MSCs possono esse e somminis a e in sospensione in soluzione isiologica (NaCl), Ringe La a o, PRP, sie o, plasma, acido ialu onico e non si e i icano e e i nega i i sul pazien e se somminis a e con empo aneamen e a e apie a macologiche con De omidina, Bu o anolo o FANS (I ano ska e al., 2022). Non si e e ua in ece un a amen o con MSCs se il pazien e s a eseguendo una e apia a macologica con an imic obici o co icos e oidi. Da uno s udio condo o in i o da Pa ke e al. è isul a o che alcuni an ibio ici iducono la i ali à delle MSCs e il lo o u ilizzo clinico associa o alla e apia con esse de e esse e quindi a enziona o (Pa ke e al., 2012). I co icos e oidi, in ece, in e e iscono con l’a i i à immunomodulan e delle MSCs (X. Chen e al., 2014). Ques e ul ime non engono, inol e, somminis a e ad un pazien e p eceden emen e seda o con Xilazina, la quale in e e isce con la i ali à delle cellule s esse iducendola su base dose- 64 1.4.2 Ca a e is iche del PRP I p imi s udi sulle ca a e is iche del PRP sono s a i e e ua i in medicina umana; successi amen e ques o p epa a o si è di uso anche in medicina e e ina ia, do e la le e a u a scien i ica ha dimos a o il uolo dei concen a i pias inici nella e apia di di e se pa ologie. I da i accumula i hanno anche pe messo di dimos a e la sicu ezza associa a all’applicazione di ques i p odo i che isul ano sos anzialmen e p i i di e e i colla e ali o eazioni a e se a b e e e a lungo e mine nel pazien e a a o. La composizione del PRP è i enu a essenziale pe un isul a o e apeu ico o imale. I pa ame i da alu a e sono, ol e al nume o di pias ine, la p esenza o assenza di: • leucoci i • e i oci i • cellule mononuclea e Il uolo dei globuli bianchi nel PRP è diba u o. Nonos an e ese ci ino di e se unzioni nel p ocesso di ipa azione dei essu i, allon anando de i i cellula i e agen i pa ogeni ed essendo coin ol i nella igene azione e nel con ollo della deposizione della ma ice ex acellula e, sono conside a e cellule p o-in iamma o ie. In uno s udio Ani ua e al. hanno accomanda o l’esclusione dei neu o ili dal PRP, p op io pe le lo o capaci à di ilascia e molecole p o-in iamma o e (Ani ua e al., 2008). Tu a ia, Zimme man e al. hanno e idenzia o come i globuli bianchi aumen ino la concen azione dei a o i di c esci a nei concen a i pias inici (Zimme mann e al., 2001). Ad oggi, non ci sono quindi ce ezze sull’inclusione o esclusione di ali cellule nel PRP. Un’al a concen azione di e i oci i nel PRP semb a indu e un aumen o della concen azione di media o i in iamma o i come IL-1 e TGF-a (Del Bue, 2018). Ciononos an e, anche pe ques e cellule non esis ono indicazioni p ecise su una lo o concen azione limi e nel PRP, ol e la quale po ebbe o e i ica si eazioni a e se. Pe quan o igua da le cellule mononuclea e non esis ono ad oggi s udi impo an i che abbiano messo in e idenza il lo o uolo nel PRP. Tu a ia, ecen i ice che hanno so olinea o come la lo o p esenza sia associa a ad un aumen o del me abolismo cellula e ed alla p oduzione di ib oblas i e collagene (Del Bue, 2018). 65 Le ca a e is iche quali a i e e quan i a i e del PRP sono, inol e, in luenza e dai p o ocolli di p epa azione, quali il ipo di an icoagulan e usa o, la o za cen i uga (g), la du a a delle cen i ugazioni, l’espe ienza dell’ope a o e e il me odo di a i azione e en ualmen e u ilizza o (Cao e al., 2021; Sha un, Pawde, e al., 2021). 66 1.4.3 P epa azione del PRP La p epa azione del PRP inizia dalla accol a del sangue au ologo del pazien e. A seconda della pa ologia da a a e e della sua g a i à ed es ensione, si p ele a una quan i à adegua a di sangue enoso pe i e ico ami e un p elie o ema ico dalle ene giugula e, ce alica o sa ena. La scel a della ena dipende da ca a e is iche del pazien e come specie, azza, docili à e possibili pa ologie che endono inaccessibile un si o enoso, come lebi i o lesioni cu anee, e anche dalla quan i à di sangue ichies a. Il sangue enoso iene accol o in si inghe o p o e e con enen i una soluzione an icoagulan e, come ad esempio il ci a o di sodio che è s a o dimos a o a e e minime in e e enze con la biologia delle pias ine, a di e enza dell’epa ina che le ende in ece meno a i e (N. Zhang e al., 2019). Inol e, men e al ci a o di sodio può esse e aggiun o calcio pe innesca e il p ocesso di coagulazione ed o ene e un e en uale gel pias inico, l’uso dell’epa ina non pe me e ebbe la coagulazione del plasma. Anche l’EDTA (acido e ilendiammino e aace ico) è un an icoagulan e che in e e isce con l’a i i à biologica delle pias ine e quindi non è di no ma u ilizza o nella p epa azione del PRP (Whi e, 2000). Nel pazien i in cui sono necessa i più a amen i il PRP non subi o somminis a o può esse e aliquo a o e conse a o a -80°C pe po e esse e successi amen e applica o come PL. Tu a ia, esis ono di e si ki comme ciali che pe me ono di o ene e PRP la o a o a “ci cui o chiuso”, cioè che non en a mai a con a o con l’ambien e es e no, basa i su sis emi di sepa azione che hanno o igine dalla medicina umana e sono s a i ada a i e alida i sulla medicina e e ina ia pe applicazioni sop a u o nel cane e nel ca allo. Ca e al. hanno con on a o 5 ki di p epa azione del PRP eseguendo uno s udio su 48 cani adul i sani di di e en i azze, sesso, e à e peso co po eo (Ca e al., 2016). Il p incipale s an aggio di ques i ki è il non esse e s anda dizzabili né pe la quali à del sangue né pe il ipo di lesione e ciò li ende poco s u abili nella p a ica clinica; in a i, nel cane il sangue ha ca a e is iche di e en i a azze e sogge i di e si ed inol e la pe cen uale di leucoci i p esen e nel PRP può in luenza e la e apia in base alla sede di somminis azione (Del Bue, 2018). 67 1.4.4 E e i e apeu ici del PRP Di e si s udi hanno dimos a o la capaci à del PRP di s imola e ed accele a e i empi di gua igione delle lesioni sia dei essu i du i che dei essu i molli. In pa icola e, iene usa o pe e i e cu anee chiuse chi u gicamen e con un lembo subde mico (Ka ayannopoulou e al., 2014), in p ocessi degene a i i a icola i come l’os eoa i e (Fila do e al., 2011), in lesioni legamen ose e endinee (Canapp, Canapp, e al., 2016), in pa ologie ocula i come le ulce e co neali (J. H. Lee e al., 2016), in pa ologie dell’o ecchio come l’o oema oma (Pe ego e al., 2021). Essendo un emode i a o ad uso au ologo i suoi e e i e apeu ici sono in luenza i da ca a e is iche del pazien e come e à, sesso e condizioni cliniche (Sha un, Jambagi, e al., 2021), in pa icola e da diso dini pias inici, congeni i o acquisi i, che possono modi ica e il nume o o la unzione delle pias ine s esse e l’a i i à dei a o i di c esci a in esse con enu i (E e s e al., 2006). Il PRP iene applica o sia nella clinica dei piccoli animali, cane e ga o, sia dei g ossi animali come il ca allo e il bo ino. I suoi e e i e apeu ici sono do u i ai a o i di c esci a con enu i nei g anuli pias inici, che s olgono un uolo c uciale nella p omozione dell’angiogenesi locale, nella egolazione dell’a i i à cellula e, nella p oli e azione, di e enziazione e nell’homing di cellule s aminali e nella deposizione di p o eine della ma ice che con ibuiscono alla igene azione dei essu i (Sha un, Jambagi, e al., 2021). Recen i s udi hanno, inol e, messo in e idenza come le pias ine iescano a ichiama e e s imola e le MSCs: il PRP è quindi anche u ilizza o come e o e di ques e cellule (sca old) pe ampli ica ne l’e icacia e apeu ica (Xie e al., 2012). La e apia basa a sull’uso combina o di MSCs e concen a i pias inici s u a, in a i, le a i i à speci iche che en ambi s olgono nella ipa azione di un danno (Fig. 12). Nello speci ico, le pias ine g azie alla sec ezione di di e si a o i di c esci a ad al e concen azioni s imolano la p oli e azione delle cellule s aminali esiden i (Bansal e al., 2017). Con empo aneamen e, le MSCs inie a e sece nono a o i di c esci a solubili in g ado di idu e il dolo e e l'in iammazione, aumen ando l'appo o di sangue nel si o di lesione s imolando l’angiogenesi (Bansal e al., 2017). 68 Nella p a ica clinica sul cane ques o ipo di app occio è s a o alu a o nel a amen o dell'os eoa i e (Fahie e al., 2013a) e delle endinopa ie (Canapp, Canapp, e al., 2016) do e ha messo in e idenza un'a i i à sine gica a pias ine e MSCs. Figu a 12. Diag amma della e apia combina a di MSCs e concen a i pias inici e po enziali applicazioni e apeu iche (Co ese e al., 2020) 69 1.4.5 Vie di somminis azione e dosaggi del PRP La e apia igene a i a basa a sul PRP è ampiamen e usa a dal pun o di is a clinico in di e se specie animali e pe di e en i pa ologie (Tab. 5). Il PRP iene somminis a o localmen e e nonos an e sia un emode i a o ad uso au ologo è impo an e che la zona da a a e enga p epa a a co e amen e, a a e so una osa u a del pelo se necessa ia ed una successi a s e ilizzazione con l’uso di alcol, clo exidina o iodopo idone. Anche la somminis azione di PRP de e a eni e seguendo i p incipi di s e ili à ed asepsi. Specialmen e nelle pa ologie o opediche si può esegui e un p imo a amen o con PRP au ologo e successi amen e, in base alla ispos a clinica o enu a, alle condizioni gene ali del pazien e ed al g ado della pa ologia o lesione che p esen a, il Medico Ve e ina io può decide e di esegui e ul e io i a amen i con PL au ologo, de i a o dal p imo p elie o ema ico (F anini e al., 2023) I dosaggi u ilizza i nella e apia con PRP sono dipenden i da: • ca a e is iche del pazien e ( aglia, peso, acili à di esecuzione del p elie o ema ico) • ipo e g ado di pa ologia da cui il pazien e è a e o Non esis ono, quindi, dosi s anda dizza e. PATOLOGIA VIE DI SOMMINISTRAZIONE RIFERIMENTi BIBLIOGRAFICi Pa ologie muscolo-schele iche • Bo si i • Tendini i • Lesioni legamen ose e meniscali • Os eoa i i • Displasia • Lussazioni • Lesioni della ca ilagine • In iammazioni acu e di endini e legamen i - Somminis azione in a icola e - Iniezione di e a nella sede di lesione (Bansal e al., 2017; Boyan e al., 2007; Canapp, Canapp, e al., 2016; Ca a ino e al., 2020; Fila do e al., 2011; Lopez- Vid ie o e al., 2010; Ma mo i e al., 2015; Mish a e al., 2009; Smy h e al., 2013) Pa ologie de ma ologiche • Lesioni cu anee es ese • Gua igione i a da a di e i e chi u giche e non • Ulce e e piaghe da decubi o - Iniezioni mul iple lungo i ma gini della e i a - Gocce di PRP somminis a e di e amen e sulla lesione - PRP apo izza o di e amen e sulla lesione Chung e al., 2015; C o e i e al., 2004; Kim e al., 2009) 70 • O oema oma - Somminis azione di e a nella pinna au icola e p e io d enaggio (Pe ego e al., 2021) Pa ologie o almiche • Ulce e da che a i e • E osioni e ulce e co neali • Di e i co neali epi eliali c onici - Gocce di PRP somminis a e di e amen e sulla supe icie ocula e - Iniezione pe ia subcongiun i ale o in as omale (Alio e al., 2017; Cha alambidou e al., 2018; Edelmann e al., 2018; Fa ghali e al., 2021; Va niko e al., 2020) Pa ologie odon oia iche • Riduzione dei p ocessi in iamma o i • Di e i ossei delle e i e • S imolazione della i ascola izzazione dei den i imma u i - Somminis azione di e a nella sede di lesione (S ambolsky e al., 2016; Tobi a e al., 2013; Zhu e al., 2012) Tabella 5. 71 1.5 Applicazioni cliniche 1.5.1 Te apie con enzionali 1.5.1.1 Te apie con enzionali nelle p incipali pa ologie del midollo spinale del cane T a le p incipali pa ologie acu e del midollo spinale che colpiscono il cane i sono la mielopa ia ischemica (o in a o del midollo spinale) e l’es usione del disco in e e eb ale, che possono po a e a de ici neu ologici pe manen i e g a i che colpiscono l’uni à mo o ia, senso iale e au onomica (N. Olby, 2010). La mielopa ia ischemica è comunemen e associa a all’embolizzazione di ma e iale ib oca ilagineo all’in e no della ascola izzazione del midollo spinale do e causa l’inso genza imp o isa di ischemia egionale con conseguen e nec osi del pa enchima (Fenn e al., 2016). Di e se eo ie sono s a e p opos e pe spiega e come il ma e iale ib oca ilagineo en i nel sis ema ascola e: pene azione di e a del ma e iale del nucleo polposo nei asi del midollo spinale o nei asi e eb ali, p esenza di asi emb ionali esidui all’in e no del nucleo polposo, neo ascola izzazione del disco in e e eb ale degene a o, e niazione meccanica del nucleo polposo nel midollo osseo e eb ale con successi o ing esso e og ado nei seni della ena e eb ale, me aplasia dell’endo elio ascola e che si ompe e si inse isce nei asi del midollo spinale (Risio e al., 2007). Inol e, la mielopa ia ischemica può anche esse e causa a da ma e iale os uen e la ascola izzazione in inseca spinale come ombi o emboli ba e ici, pa assi a i o neoplas ici (Cauzinille, 2000). L’es usione del disco è, in ece, una lesione con usi a che si e i ica a segui o di un auma indo o dalla uo iusci a del disco in e e eb ale dalla sua sede isiologica e può esse e di due ipi: Hansen di ipo I e Hansen di ipo II. La p ima è ca a e izza a da una degene azione cond oide del nucleo polposo ed è ipica delle azze cond odis o iche, men e la seconda è ca a e izza a da una degene azione ib oide del nucleo polposo ed è equen e in cani non cond odis o ici di qualsiasi e à (D . Tes a, 2003). La diagnosi de ini i a pe la mielopa ia ischemica e l’es usione discale ichiede ebbe l’esame is opa ologico della po zione di midollo spinale colpi a e una con e ma chi u gica nel caso dell’es usione del nucleo polposo, ma da a l’inso genza acu a di en ambe e la necessi à di in e eni e il p ima possibile, la diagnosi ad oggi si basa sulla p esenza di segni clinici ca a e is ici combina i con segni diagnos ici speci ici nella isonanza magne ica (MRI) (Fenn e al., 2016). 72 In pa icola e, i cani con mielopa ia ischemica p esen ano ipicamen e un’inso genza acu a di segni clinici non dolo osi, non p og essi i (dopo le p ime 24 o e) e spesso asimme ici. La diagnosi di ques a pa ologia si basa quindi sui segni clinici p esen i, la cui g a i à è anche dipenden e dalla neu olocalizzazione, sull’anamnesi ecen e e emo a e sull’esclusione di al e diagnosi di e enziali g azie all’u ilizzo di adiog a ie, analisi del liquido ce eb ospinale, mielog a ia, omog a ia compu e izza a (CT) ed MRI (Risio e al., 2007). Ques ’ul ima è pa icola men e u ile ai ini diagnos ici poiché, ol e ad esclude e al e cause di mielopa ia, può i ela e cambiamen i di in ensi à del segnale compa ibili con l’in a o spinale (Ab amson e al., 2005) a cui una lesione in amidolla e ocale, ela i amen e ben dema ca a, coin olgen e p e alen emen e la ma e ia g igia che appa e ipe in ensa ispe o alla no mali à (Risio e al., 2007). Tu a ia, non semp e si ha una con e ma diagnos ica dall’MRI: in uno s udio condo o da Risio e al. è eme so che alcuni cani con segni clinici compa ibili con mielopa ia ischemica so opos i a MRI a le 12 e le 72 o e dopo l’inso genza dei sin omi non mos a ano immagini signi ica i e (Risio e al., 2007). Inol e, la ile azione di cambiamen i del segnale du an e le p ime 24-48 o e dipende dalle dimensioni dell’in a o, dal g ado di insul o ischemico e dalla disponibili à di MRI ad al o con as o (Luo e al., 2003). Nei cani in cui si e i ica l’es usione del disco in e e eb ale, in ece, come conseguenza della con usione e della comp essione del midollo spinale e delle adici ne ose i sin omi clinici ile abili sono dolo e, pa esi o pa alisi e incon inenza da i enzione (Olby e al., 2022). La diagnosi iene e e ua a g azie a MRI, CT, mielo-CT, mielog a ia, che acili ano anche la piani icazione chi u gica e la p ognosi (Olby e al., 2022). L’MRI ha una sensibili à diagnos ica >98,5% ispe o alla CT nei cani con segni clinici pe acu i ed è u ili ai ini p ognos ici, dipenden emen e dalle sequenze u ilizza e (Olby e al., 2022). La e apia con enzionale pe la mielopa ia ischemica è conse a i a, di sos egno, basa a sulla somminis azione di agen i neu op o e i i come il me ilp ednisolone sodio succina o (MPSS) e il polie ilenglicole, che possono aiu a e a idu e al minimo lesioni seconda ie. Tu a ia, i lo o bene ici clinici non sono ad oggi pienamen e conosciu i e sono necessa i ul e io i s udi sui lo o po enziali e e i a e si (De Risio e Pla , 2010). 73 Fondamen ali sono, in ece, la isio e apia e le cu e in e mie is iche, che p omuo ono il ecupe o e aiu ano a p e eni e le complicanze. In pa icola e, la isio e apia s imola la plas ici à neu onale e minimizza i cambiamen i da disuso e immobilizzazione come l’a o ia muscola e e le con a u e muscola i ed a icola i, men e le cu e in e mie is iche e i ano complicazioni come piaghe da decubi o, in ezioni escicali, polmoni e ab inges is, a ele asia polmona e e al e (De Risio e Pla , 2010). La e apia con enzionale pe l’es usione discale può esse e medica (conse a i a) o chi u gica. La p ima si basa su una limi a a a i i à mo o ia e sull’analgesia, men e la seconda compo a la decomp essione del midollo spinale median e emilaminec omia con o senza enes azione del disco. Inol e, ondamen ale è la ges ione del dolo e, il a amen o dell’incon inenza da i enzione e la p e enzione ed il a amen o di danni cu anei come ulce e da decubi o (N. J. Olby e al., 2022). Nella ase acu a la e apia medica s u a l’uso di FANS (an in iamma o i non s e oidei) pe 5-7 gio ni non associa i a co icos e oidi, che possono in ece esse e somminis a i in ase c onica pe un b e e pe iodo di empo. Pe il a amen o del dolo e si possono somminis a e FANS, gabapen in o p egabalin pe il dolo e neu opa ico e ilassan i muscola i come diazepam e me oca bamolo. Nei cani con o e dolo e si può esegui e una e apia con oppioidi, consiglia a pe ò du an e l’ospedalizzazione (N. J. Olby e al., 2022). Pe en ambe le pa ologie la p ognosi ela i a alla gua igione è dipenden e alla g a i à dei sin omi al momen o della p esen azione clinica e alla empes i i à di diagnosi e a amen o. 80 spinale. Il lo o obie i o è s a o quello di con on a e gli e e i di ques e cellule con quelli del me ilp ednisolone sodio succina o, agen e neu op o e i o comunemen e usa o pe il a amen o di ques e pa ologie (Y. Kim e al., 2015). Ques o agen e a macologico è, in a i, conside a o quello s anda d pe il lo o a amen o clinico, in quan o diminuisce l’in iammazione e l’ischemia midolla e inibendo la pe ossidazione lipidica della memb ana cellula e (Y. Kim e al., 2015). Somminis a o in al e dosi p o oca u a ia di e se complicazioni quali un aumen o dell’incidenza di in ezioni, polmoni e, piaghe da decubi o, sanguinamen o gas oen e ico e ombosi enosa p o onda (Molano e al., 2002). L’obie i o u u o pe il a amen o di ques e pa ologie è quindi quello di u ilizza e me odi che limi ino e p e engano lesioni seconda ie e iducano i ischi associa i all’uso di al e dosi di glucoco icoidi (Y. Kim e al., 2015). Il apian o di MSCs è s a o dimos a o o ni e neu op o ezione, aumen a e la igene azione neu onale e miglio a e i sin omi clinici, ma anche miglio a e l’ambien e in iamma o io e la sop a i enza delle cellule ne ose endogene e idu e la o mazione di ib osi (Lim e al., 2007; S.-S. Pa k e al., 2011; Ryu e al., 2009). Con il lo o s udio Kim e colleghi hanno dimos a o che la somminis azione endo enosa di ADMSCs diminuisce i li elli di ci ochine p oin iamma o ie come COX-2, IL-6 e TNFa, iduce l’emo agia in apa enchimale, la mig azione di mic oglia e l’esp essione di me aboli i ossida i i (Y. Kim e al., 2015). Inol e, ques o s udio ha dimos a o che, nonos an e il me odo di somminis azione di MSCs più comune pe le pa ologie del midollo spinale sia l’iniezione di e a nel si o di lesione, la somminis azione endo enosa è associa a ad e e i neu op o e i i, ma anche ad una modulazione della ispos a immuni a ia sis emica (Y. Kim e al., 2015). 81 1.5.3 PRP in pa ologie o opediche Il PRP iene ad oggi u ilizza o in medicina e e ina ia pe la e apia di di e se pa ologie, comp ese le mala ie a icola i, g azie alle sue p op ie à an in iamma o ie ed ai a o i di c esci a che con iene (Kennedy e al., 2018; Masca enhas e al., 2014). Nonos an e il suo uso in a icola e (IA) sia s a o ogge o di diba i o pe i suoi e e i anabolizzan i ed an i-ca abolici ol i ad aumen a e la capaci à igene a i a della ca ilagine e la iduzione di media o i in iamma o i (Kennedy e al., 2018; Masca enhas e al., 2014), Fo ie e colleghi hanno, in ece, analizza o s udi di labo a o io in i o, s udi p eclinici su modelli animali ed anche s udi clinici umani che suppo ano l’uso del PRP pe lesioni ca ilaginee e dolo i a icola i (Fo ie e al., 2011). Pe ale mo i o, ad oggi, c’è un c escen e in e esse pe le e apie pias iniche au ologhe, da e appun o le lo o capaci à di con ibui e alla igene azione issu ale, di idu e gli s a i in iamma o i locali e di p omuo e e la sin esi della ca ilagine o di inibi ne la o u a (Fukui e al., 2001). Nel 2021 Al es e al. hanno alu a o l’e icacia della somminis azione in a icola e di PRP in cani da la o o con OA dell’anca bila e ale, con on andoli con un g uppo di con ollo (Al es e al., 2021). In pa icola e, il g uppo a a o ha ice u o due somminis azioni IA di PRP a dis anza di 14 gio ni, men e al g uppo di con ollo è s a a somminis a a soluzione salina IA (Al es e al., 2021). Nello s udio sono s a i enu i in conside azione isul a i p eceden i che hanno dimos a o che nei cani con OA non indo a da a amen i chi u gici la somminis azione IA di PRP miglio a i segni clinici in 12 se imane (Fahie e al., 2013a) ed è anche in g ado di miglio a e i segni clinici e il li ello di dolo e nei cani con OA da a da o u a del legamen o c ocia o c aniale e displasia dell’anca (Cue o e al., 2020; Vena o e al., 2020). I isul a i hanno dimos a o che l’iniezione IA di PRP ha un e e o bene ico nei cani a a i, anche in quelli con OA g a e, essendo in g ado di idu e il dolo e e miglio a e le lo o pe o mance da la o o. Rispe o al g uppo di con ollo, in a i, gli e e i bene ici del PRP sono s a i iscon a i pe un lungo pe iodo di empo (Al es e al., 2021). Nonos an e a segui o della somminis azione IA si siano e i ica i e e i colla e ali come dolo e ed in iammazione locali pe 2-10 gio ni, ai pazien i non è s a o somminis a o alcun a maco aggiun i o, essendo s a i ques i e en i au olimi an i (Al es e al., 2021). 82 Risul a i simili sono s a i desc i i in cani a a i con PRP pe la ges ione della displasia dell’anca in uno s udio esegui o da Cue o e colleghi nel 2020 (Cue o e al., 2020). In pa icola e, il lo o obie i o è s a o quello di alu a e l’e icacia del PRP somminis a o da solo o in combinazione con isio e apia di suppo o a pazien i con OA causa a da displasia dell’anca bila e ale. Dal lo o s udio è eme so che una singola in il azione IA di PRP è e icace nell’alle ia e il dolo e e nel miglio a e la unzionali à degli a i in modo signi ica i o, nonos an e gli e e i bene ici diminuiscano dopo ci ca 180 gio ni, men e ale a amen o combina o con la isio e apia con ibuisce a p olunga e gli e e i bene ici de i (Cue o e al., 2020). Uno s udio esegui o in ece da Vila e al. nel 2018 sull’uso IA del PRP in Bulldog Inglesi con mala ia degene a i a a icola e del ginocchio a segui o di o u a del legamen o c ocia o c aniale ha dimos a o e e i bene ici pe un più b e e pe iodo di empo, di ci ca 3-6 mesi (Vila e al., 2018a). Una possibile spiegazione a ques a a iabili à di e icacia di isul a i in e mini di empo pos - e apia può esse e lega a alla biomeccanica a icola e: l’OA dell’anca semb a esse e meglio olle a a ispe o all’OA di al e a icolazioni (Wilson e Smi h, 2016). Il PRP può quindi esse e conside a o una buona opzione e apeu ica pe la ges ione dell’OA, anche g a e (Al es e al., 2021). In ine, Ma os C uz e Mason hanno s udia o nel 2022 come il PRP possa anche app esen a e una e apia aggiun i a pe la displasia del gomi o (in pa icola e pe la mala ia del compa imen o mediale) nei cani e a a i al solo a amen o chi u gico (Ma os C uz e Mason, 2022). Conside ando il basso ischio di complicazioni e la acili à di accol a e somminis azione il PRP può app esen a e una alida e apia aggiun i a pe i di e i ca ilaginei e un p omo o e di gua igione nella mala ia del compa imen o mediale del cane. Ques o s udio ha in a i dimos a o che la somminis azione di PRP a segui o di una p ocedu a chi u gica di a oscopia e co onoidec omia sub o ale diminuisce il dolo e e miglio a la zoppia a lungo e mine dei pazien i a a i (Ma os C uz e Mason, 2022). 83 2. ESPERIENZA CLINICA 2.1 Obie i i Lo scopo del p esen e la o o di esi è ipo a e l’espe ienza pe sonale ela i a all’u ilizzo di e apie igene a i e in medicina e e ina ia. Si è ce ca o di chia i e, a a e so la desc izione di casi clinici emblema ici, le p ocedu e u ilizza e, i isul a i e apeu ici o enu i e la eale applicabili à di ques e e apie. In pa icola e, l’espe ienza pe sonale si è ocalizza a sulla alu azione dell’impo anza dell’associazione a a amen o e apeu ico e iabili azione isica pe miglio a e i segni clinici e la quali à di i a dei sogge i a a i. Ogge o dell’espe ienza clinica sono s a i cani a a i con MSCs au ologhe o allogeniche pe pa ologie del midollo spinale, in pa icola e mielopa ia ischemica ed es usione del disco in e e eb ale, e cani a a i con PRP pe o u a del legamen o c ocia o c aniale, una delle pa ologie o opediche più comuni del cane anziano. Tu i i casi clinici desc i i sono s a i alu a i con ollow-up pe iodici che hanno a u o l’obie i o di man ene e moni o a i i segni clinici, e idenziando il p og edi e o il eg edi e di e en uali miglio amen i e di come ques i siano s a i associa i o meno ad ul e io i e apie iabili a i e e/o alla con empo anea somminis azione di una e apia medica a macologica pe idu e il dolo e o l’in iammazione associa i alla pa ologia p esen e. L’obie i o u u o delle e apie igene a i e è, in a i, ce ca e di idu e la dipendenza da p odo i di sin esi chimica come a maci analgesici ed an in iamma o i, spesso associa i ad e e i colla e ali indeside a i, specialmen e se somminis a i ad al e dosi pe la e apia di pa ologie degene a i e o al amen e debili an i pe l’animale. 84 2.2 Ma e iali e me odi 2.2.1 La scel a del pazien e La selezione del pazien e e del a amen o o imale sono la base del successo della e apia igene a i a. È il Medico Ve e ina io, in base alla sua espe ienza clinica, alle sue compe enze in ma e ia ed alle e idenze o ni e dalla le e a u a scien i ica a p opo e un a amen o igene a i o in ece che adizionale ad un de e mina o pazien e. Le opzioni e apeu iche impiega e nei casi clinici desc i i sono s a e MSCs au ologhe o allogeniche, PRP e PL. La scel a e apeu ica è s a a basa a su: ca a e is iche cliniche del pazien e, espe ienza clinica del Medico Ve e ina io su una de e mina a opzione e apeu ica speci ica pe la pa ologia da a a e, disponibili à del p op ie a io in una co e a ges ione dell’animale a a o. Inol e, i p op ie a i dei di e si pazien i sono s a i in o ma i sulle ca a e is iche della e apia igene a i a e e ina ia e sulle sue di e enze ispe o alle e apie adizionali, sulle mo i azioni della scel a e apeu ica più ada a, sull’esecuzione del a amen o s esso comp esa la p epa azione del p odo o biologico e le sue ca a e is iche ipa a i e. In u i i casi a a i è s a o a o so osc i e e ai p op ie a i s essi un consenso in o ma o, necessa io non a andosi di e apie con enzionali. T a le ca a e is iche del pazien e che sono s a e enu e in conside azione pe la scel a della e apia ien ano: • ipo e g a i à della pa ologia • e apie p eceden i e ispos a clinica e idenzia a • empi di sospensione dalla somminis azione di a maci adizionali • empe amen o In gene ale i a amen i con MSCs sono s a i p opos i a pazien i con pa ologie del midollo spinale acu e o p eceden emen e a a e con e apie adizionali chi u giche o mediche pe un b e e pe iodo di empo che hanno po a o a sca si isul a i. I a amen i con PRP ed PL sono s a i, in ece, p opos i a pazien i più anziani con di e en i pa ologie o opediche, la cui isoluzione chi u gica sa ebbe s a a in asi a conside ando l’e à e la g a i à dei sin omi clinici. 85 Pe u e le ipologie di a amen o è s a a enu a in conside azione la p eceden e somminis azione di a maci, sop a u o an in iamma o i ed an idolo i ici, che do ebbe o esse e sospesi almeno le due se imane an eceden i al a amen o igene a i o s esso. In ine, è s a o p eso in conside azione il empe amen o del pazien e, che in luenza in modo signi ica i o il ecupe o pos - a amen o, pe iodo in cui è necessa io iposo o za o. In a i, ondamen ale pe un co e o successo della e apia igene a i a è anche la ges ione del pazien e da pa e del p op ie a io, ol e alla sua disponibili à a ene e moni o a i i miglio amen i clinici nel empo. 86 2.2.2 MSCs – il p elie o del essu o, la sua conse azione e il suo aspo o Nei casi clinici desc i i a a i con MSCs au ologhe le cellule sono s a e o enu e pa endo dal essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica. Ques o è s a o p ele a o nell’ambi o di un in e en o chi u gico di lie e in asi i à esegui o p e ia sedazione, in anes esia gene ale, in cui la egione ana omica di in e esse è s a a p epa a a seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi (Fig. 13). Nei casi clinici desc i i a a i con MSCs e e ologhe le cellule sono s a e o enu e pa endo dal essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica di un pazien e dona o e o da ammen i di co done ombelicale p ele a i du an e in e en i cesa ei. Il essu o adiposo so ocu aneo è s a o p ele a o come desc i o nel a amen o con MSCs au ologhe (Fig. 13). Pe l’applicazione clinica della e apia igene a i a e e ologa è s a o a o so osc i e e un consenso in o ma o ai p op ie a i dei pazien i a a i. La quan i à di essu o adiposo o di ammen i di co done ombelicale accol a in ogni in e en o chi u gico è s a a di 5 g ammi. Figu a 13. P elie o del essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica in cane Bouledogue ançais emmina esegui o p esso Clinica Ve e ina ia Rou e 62 – Lemignano Pa ma (PR) 87 Il essu o, immedia amen e dopo il p elie o, è s a o inse i o all’in e no di con eni o i di e o aspa en e con enen i un mezzo di man enimen o cos i ui o da una soluzione salina ampona a, osso enolo e an ibio ico al 2%, ed iden i ica i pe pazien e e da a di accol a. En o massimo 12 o e dalla accol a s essa il ma e iale è s a o spedi o all’Is i u o Zoop o ila ico Spe imen ale della Lomba dia e dell’Emilia-Romagna – Labo a o io Col u e Cellula i. Pe u a la du a a del aspo o il essu o p ele a o è s a o conse a o alla empe a u a di e ige azione di 4°C. I con eni o i di e o sono s a i, in a i, inse i i all’in e no di sca ole di polis i ene, ma e iale isolan e, insieme a pias e eu e iche come on e e ige an e. 88 2.2.3 MSCs – dal essu o alle cellule Il essu o p ele a o pe ogni caso clinico è s a o spedi o e la o a o dall’Is i u o Zoop o ila ico Spe imen ale della Lomba dia e dell’Emilia-Romagna – Labo a o io Col u e Cellula i. La col u a p ima ia iden i ica a come aADMSC CANINE con ca io ipo 2n = 38 è s a a col i a a in un medium di c esci a (Dulbecco’s modi ied Eagles medium in Ea le’s BSS) con enen e glucosio (1g /l ), sie o e ale bo ino (20%), penicillina (1000U/mL) e s ep omicina (500UI) ed in eg a o con sie o e ale di i ello (Foe al Cal Se um, FCS) de i an e da paesi libe i da BSE. Ai sensi della Di e i a 67/548 EEC e dei Regolamen i 1272/2008 e 790/2009 non ci sono sos anze pe icolose nella p epa azione. Nello speci ico, l’isolamen o di cellule s omali mesenchimali da essu o adiposo di cane segue la seguen e modali à: • imme sione del essu o adiposo in un con eni o e s e ile con enen e soluzione salina pe o gani; • la aggio del essu o pe almeno 3 ol e in soluzione salina pe o gani ino alla comple a eliminazione delle emazie p esen i; • eliminazione di e en uali acce di essu o conne i o; • ammen azione meccanica del essu o in pias a Pe i con enen e soluzione salina pe o gani ino all’o enimen o di una schiuma; • la aggio del essu o sminuzza o con l’ausilio di un colino s e ile pe almeno 2 ol e con soluzione salina pe o gani; • eliminazione della soluzione salina pe o gani e alu azione del peso del essu o; • as e imen o dei ammen i in una beu a s e ile e aggiun a di soluzione enzima ica an ibio a a 5x (20mg di Collagenasi 0,2% p/ pe ogni g ammo di essu o adiposo da dige i e); • imme sione della beu a in bagnoma ia a +37°C +-1°C ed esecuzione del p ocesso di dispe sione cellula e in blanda agi azione ino al comple o scioglimen o del essu o adiposo (ci ca 2-3 o e); • blocco della soluzione enzima ica con 10% / di FCS; • il azione del con enu o della beu a e suo as e imen o in p o e e da cen i uga da 50mL; 89 • cen i ugazione a 1200 x g pe 10 minu i a empe a u a ambien e; • eliminazione del su na an e; • isospensione del pelle in 10mL di e eno col u ale (DMEM low glucose + 20% FCS + an ibio ici 2x); • cen i ugazione a 360 x g pe 10 minu i a empe a u a ambien e pe almeno due passaggi; • isospensione del pelle in e eno col u ale con enen e an ibio ici 2x; • il azione con il i da 70 µm; • ul e io e cen i ugazione a 1400 pm pe 10 minu i a empe a u a ambien e al ine di elimina e ogni esiduo di soluzione enzima ica; • isospensione del pelle in e eno col u ale con enen e an ibio ici 2x e FCS (20%); • esecuzione di una con a di i ali à cellula e; • semina delle cellule alla concen azione di 30.000/40.000 cellule/mL di medium; • incubazione a 37°C +-1°C + 5% CO2; • sos i uzione del e eno non p ima di 48 o e, ecupe ando il su na an e, e e uando un la aggio con soluzione salina an ibio a a e aggiungendo nuo amen e e eno di col u a. I passaggi desc i i sono s a i esegui i dall’Is i u o Zoop o ila ico Spe imen ale della Lomba dia e dell’Emilia-Romagna – Labo a o io Col u e Cellula i. Bibliog a ia di i e imen o: (De Uga e e al., 2003). All’in e no delle iasche di col u a, passa o qualche gio no dall’isolamen o, iniziano a o ma si colonie cellula i che si espandono p og essi amen e. Quando le cellule icop ono l’in e a supe icie della iasca a i ando a con luenza sme ono di p oli e a e pe inibizione da con a o. Pe e i a e che ques o accada e a si che le cellule con inuino ad espande si in uno spazio adegua o, ques e engono s acca e enzima icamen e dalla supe icie di col u a, g azie all’u ilizzo di ipsina, e isemina e a densi à più bassa. Ques o as e imen o, ca a e izza o dal cambio del medium di col u a, si esegue ogni ol a che le cellule a i ano a ci ca il 70-80% di con luenza e iene de ini o “passaggio” (P); come egola, le MSCs non de ono mai aggiunge e la con luenza comple a. 96 g a emen e pa apa e ica con nocicezione assen e bila e almen e, ma i lesso es enso io c ocia o p esen e in en ambi i pos e io i; p esen a a, inol e, i enzione u ina ia, mo i o pe cui la escica eni a s o a a manualmen e. Visi a clinica e diagnosi Hannah è s a a so opos a ad una p ima isi a pe alu a e le sue condizioni cliniche gene ali e i sin omi ela i i alla pa ologia diagnos ica a, in modo da de ini e la e apia igene a i a più idonea. L’Esame Obie i o Gene ale (EOG) e l’Esame Obie i o Pa icola e (EOP) hanno con e ma o i segni clinici desc i i in anamnesi, p esen i dalle dimissioni dal cen o iabili a i o. In segui o alla isi a clinica, in acco do con il p op ie a io, è s a o scel o di a a e Hannah con una e apia con MSCs allogeniche de i an i dal essu o adiposo di un cane dona o e sano. Indagini diagnos iche Hannah è s a a so opos a ad una sola indagine diagnos ica di secondo li ello in da a 28 se emb e 2021. In pa icola e, la isonanza magne ica, esegui a con appa ecchio ESAOTE-VET MR G ande, ha mos a o ipe inensi à in amidolla e in sequenze pesa e T2 e STIR da T11 a L2 a p e alen e localizzazione nella sos anza g igia e maggio e la e alizzazione sinis a. La lesione, a segnale isoin enso in T1W, non p esen a a anomalo enhancemen nelle sequenze pos con as o. Una lie e cap azione del mezzo di con as o è s a a e idenzia a a ca ico dello spazio epidu ale en ale in T12-13. I DIV (dischi in e e eb ali) si mos a ano disid a a i a li ello di T8- 9 e T9-10, no moid a a i i es an i. Il DIV T12-13 mos a a una lie e dislocazione do sale. In ine, a ca ico dei muscoli mul i ido dei lombi ed e e o e della colonna è s a a e idenzia a un’ipe in ensi à STIR associa a a lie e/disomogeno enhancemen nelle sequenze pos con as o. Il quad o RM è isul a o pe an o compa ibile con una mielopa ia ischemica o aco-lomba e; possibile un’es usione discale acu a non comp essi a (ANNPE) e seconda ia con usione/edema midolla e. Poco p obabile, in ece, una lesione di na u a in iamma o ia/in e i a o umo ale a ca a e e in il a i o (Polo Neu ologico Ve e ina io – Repubblica di San Ma ino). Te apia igene a i a In da a 16 no emb e 2021 Hannah è s a a so opos a ad una e apia igene a i a con MSCs allogeniche de i an i dal essu o adiposo di un cane dona o e sano pe ia in a ecale, p e ia so osc izione di un consenso in o ma o da pa e del p op ie a io. 97 P ima del a amen o sono s a e esegui e una p e-anes esia IM, un’induzione anes e ica EV ed una p epa azione della egione di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Man enendo l’anes esia gene ale con un anes e ico inala o io sono s a e somminis a e 5+5x106 MSCs allogeniche in 5+5mL di soluzione isiologica s e ile in a ecali negli spazi L1-L2 e T13-L1 (Fig. 19). Te apie complemen a i Successi amen e all’RM, p ima della e apia igene a i a Hannah è s a a ico e a a p esso una s u u a iabili a i a do e ha esegui o sedu e di isio e apia che non hanno, pe ò, da o miglio amen i clinici e iden i. Nelle due se imane an eceden i il a amen o igene a i o la pazien e non ha assun o alcun ipo di e apia a macologica, se non degli in eg a o i pe il suppo o ca ilagineo, osseo, a icola e e ne oso; pe an o, i empi di sospensione indica i pe le e apie igene a i e sono s a i ispe a i. Qualche se imana dopo la somminis azione di MSCs Hannah ha inizia o a s olge e ese cizi di id o e apia e ol e alla se imana, ele os imolazione (TENS, s imolazione ele ica anscu anea) e e apia con ul asuoni. Da a, pe ò, la necessi à di esegui e ques i a amen i in Figu a 19. Hannah – Somminis azione in a ecale L1-L2 di 5x106 MSCs allogeniche in 5mL di soluzione isiologica esegui a p esso Clinica Ve e ina ia Rou e 62 – Lemignano Pa ma (PR) 98 modo egola e, i p op ie a i hanno inizia o a ges i e Hannah a casa, p a icando ogni gio no e apia con TENS ed ul asuoni. Con il passa e dei mesi le sedu e di id o e apia sono s a e ido e, men e il a amen o e apeu ico con TENS ed ul asuoni è s a o man enu o quo idianamen e a casa. Follow-up Hannah è s a a so opos a a isi e cliniche pe iodiche. In pa icola e, men e a 30 gio ni dalla e apia igene a i a la si uazione clinica appa i a s abile, nel mese successi o, al con ollo clinico a 60 gio ni, si sono esi e iden i degli impo an i miglio amen i clinici, anche dal pun o di is a dello s a o del senso io, isibilmen e più a i o. G azie alla ges ione dei suoi p op ie a i e alle sedu e di isio e apia s ol e Hannah si è in a i mos a a p og essi amen e più ene gica e ha inizia o a man ene e pe un empo più lungo la s azione quad upedale se posiziona a, sop a u o quando s imola a come du an e i pas i. Inol e, già pa i e dai p imi mesi del 2022 ha inizia o ad esegui e mo imen i al passo, s o zandosi di man ene e la s azione o di ip ende la, ed è o na o p esen e il mo imen o della coda, p ima assen e. Con il passa e dei mesi Hannah è anda a incon o a miglio amen i cos an i e egola i che l’hanno po a a a ip ende e a i i à come il gioco con i suoi simili ed i suoi p op ie a i e l’in e azione con l’ambien e ci cos an e e ad esegui e mo imen i semp e più complessi come piccole co se. Men e nelle p ime asi della iabili azione isica Hannah mos a a cedimen i dal pun o di is a mo o io, s ancandosi ad esegui e mo imen i pe lei complessi pe lungo empo, negli ul imi mesi del 2022 e all’inizio del 2023 ques i episodi si sono esi semp e meno equen i, mo i o pe cui la pazien e è o na a ad a e e una quali à di i a o imale, semp e compa ibilmen e con la sua si uazione pa ologica, i isol ibile comple amen e. Dal pun o di is a clinico la i enzione u ina ia non è mai miglio a a ed è semp e s a o necessa io lo s uo amen o manuale della escica, che ha po a o nel empo a cis i i ico en i con ema u ia, a a e con an ibio ico e apia che è s a o necessa io modi ica e pe mo i i di an ibio ico- esis enza. Nel lungo pe iodo di ip esa è s a o ondamen ale pe Hannah il suppo o da pa e dei suoi p op ie a i, che l’hanno aiu a a in ogni ase del ecupe o, pe me endole di s olge e la iabili azione isica necessa ia pe miglio a e la sua condizione e che nel empo ha da o isul a i più che o imali. Pu oppo, pe g a i complicazioni agli appa a i muscolo-schele ico ed u ina io che non pe me e ano più ad Hannah di a e e una buona quali à di i a, la pazien e è s a a so opos a ad eu anasia compassione ole nel mese di giugno 2023. 99 2.2.7 Caso clinico MSCs au ologhe, Elsa: es usione discale L1-L2 Segnalamen o • Specie: Cane • Razza: Bouledogue ançais • Sesso: Femmina • E à alla e apia igene a i a: 4 anni • Peso alla e apia igene a i a: 9,5kg Anamnesi La pazien e è s a a so opos a in da a 26 se emb e 2022 ad una isi a clinica p esso la Clinica Ve e ina ia di Russi pe imp o isa pe di a della unzione degli a i pos e io i e un’anamnesi ecen e (qualche mese) p ima di zoppia al pos e io e des o. Dall’Esame Obie i o è eme sa una pa aplegia con assenza di dolo e p o ondo a des a, p esen e in ece a sinis a, i lessi lesso i sui pos e io i assen i e dolo e alla palpazione o aco-lomba e; lo s a o men ale isul a a igile e i ne i c anici nella no ma. La pazien e p ima di ques o esame e a s a a so opos a ad una e apia con me adone e acep omazina, a maci che possono a e al e a o la isi a neu ologica s essa. Lo s esso gio no Elsa è s a a so opos a ad una isonanza magne ica (RM) o aco-lomba e p esso Blucen e Ra enna – Imaging Diagnos ico Ve e ina io. L’esame ha mos a o un’es usione discale L1-L2 mediana pa amediana des a a dis ibuzione os ale ed un’anomalia e eb ale con ci osi del achide di o igine mal o ma i a congeni a. Conside ando la isi a neu ologica e l’esi o dell’RM alla pazien e è s a a diagnos ica a una pa aplegia con dolo e p o ondo dubbio seconda io ad es usione discale. Il 27 se emb e 2022 è s a a so opos a ad un in e en o chi u gico di decomp essione esegui o median e miniemilaminec omia L1-L2 e L3-L4 ed emilaminec omia L3-L4 ed L4-L5. Visi a clinica e diagnosi Elsa è s a a so opos a ad una p ima isi a il 02 no emb e 2022 pe alu a e le sue condizioni cliniche gene ali e i sin omi ela i i alla pa ologia neu ologica diagnos ica a, non miglio a i dopo l’in e en o chi u gico esegui o, in modo da de ini e la e apia igene a i a più idonea. All’Esame Obie i o Gene ale (EOG) u i i pa ame i ien a ano nella no ma, ma in segui o alla lesione midolla e la pazien e p esen a a i enzione u ina ia, non a a a a macologicamen e. L’Esame Obie i o Pa icola e (EOP) ha con e ma o la pa aplegia con assenza di dolo e p o ondo, i lessi 100 lesso i assen i sui pos e io i e dolo e alla palpazione o aco-lomba e. Nonos an e i sin omi la pazien e si p esen a a igile. In segui o alla isi a clinica, in acco do con il p op ie a io, è s a o scel o di a a e Elsa con una e apia con MSCs au ologhe de i an i da essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica (emi o ace sinis o). Indagini diagnos iche Elsa è s a a so opos a ad una sola indagine diagnos ica di secondo li ello in da a 16 se emb e 2022. In pa icola e, la isonanza magne ica è s a a esegui a median e scansioni FSE T2 e SE T1 pesa e p ima e dopo la somminis azione del mezzo di con as o pa amagne ico (Do ag a ) o ien a e nei piani sagi ale e as e so dello spazio. Alle immagini (Fig. 20) si app ezza il disco in e e eb ale L1-L2 ma ca amen e disid a a o con es usione di ma e iale discale in sede endocanala e mediana pa amediana des a, dis ibui o os almen e al disco e ca a e izza o da ipe in ensi à di segnale in T2, da isoin ensi à in T1 e da disc e o enhancemen . Conseguono ma ca e comp essione e dislocazione do sola e ale sinis a del midollo spinale, il quale appa e in e essa o da una s uma a ipe in ensi à di segnale in T2, compa ibile con la p esenza di edema. Si no a una mal o mazione a cuneo della e eb a T12 esi an e in ocale de iazione in ci osi del achide, con pe di a del segnale del g asso epidu ale en ale. Tu i i es an i dischi in e e eb ali appaiono ca a e izza i da a i g adi di disid a azione, in assenza di pa a opie. Il quad o RM è pe an o compa ibile con un’es usione discale L1-L2 mediana pa amediana des a a dis ibuzione os ale ed un’anomalia e eb ale con ci osi del achide di o igine mal o ma i a congeni a (Blucen e Ra enna – Imaging Diagnos ico Ve e ina io) (Fig. 20). Figu a 20. Elsa – Risonanza magne ica esegui a in da a 26 se emb e 2022 p esso Blucen e – Imaging Diagnos ico Ve e ina io 101 Te apia igene a i a In da a 02 no emb e 2022 Elsa è s a a so opos a ad un in e en o chi u gico di lie e in asi i à esegui o p e ia sedazione, in anes esia gene ale, in cui la egione ana omica di in e esse è s a a p epa a a seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi al ine di p ele a e 5 g ammi di essu o adiposo so ocu aneo dalla egione o acica (Fig. 21 a,b). Da ques o sono s a e col i a e le MSCs au ologhe in i o e successi amen e, in da a 12 dicemb e 2022, Elsa è s a a so opos a ad una e apia igene a i a pe ia in a ecale ed endo enosa. P ima del a amen o sono s a e esegui e una p e-anes esia IM, un’induzione anes e ica EV ed una p epa azione delle egioni di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Man enendo l’anes esia gene ale con un anes e ico inala o io sono s a e somminis a e 6x106 MSCs au ologhe in 5mL di soluzione isiologica s e ile in a ecali L1-L2 (Fig. 22) e 20x106 MSCs au ologhe in 10mL di soluzione isiologica s e ile pe ia EV dalla ena ce alica des a. La somminis azione endo enosa è s a a e e ua a ami e l’u ilizzo di un sis ema a e ie al e nando il p epa a o di cellule ad una soluzione di NaCl (100mL o ali). Inol e, è s a o esegui o un la aggio della si inga u ilizza a pe la somminis azione EV con 10mL di soluzione isiologica s e ile al ine di ecupe a e e en uali cellule imas e adese alla plas ica. a b Figu a 21 a,b. Elsa – P elie o del essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica esegui o p esso Clinica Ve e ina ia Rou e 62 – Lemignano Pa ma (PR) 102 Te apie complemen a i Alla pazien e è s a o somminis a o un a maco an idolo i ico nei gio ni immedia amen e successi i all’in e en o chi u gico esegui o il 27 se emb e 2022. Inol e, p ima della e apia igene a i a Elsa ha segui o 12 sedu e di ossigeno e apia che non hanno da o miglio amen i clinici e iden i. Nelle due se imane an eceden i il a amen o igene a i o la pazien e non ha assun o alcun ipo di e apia a macologica; pe an o, i empi di sospensione indica i pe le e apie igene a i e sono s a i ispe a i. Successi amen e ad essa, in ece, Elsa ha s ol o due sedu e di ozono e apia, poi in e o e pe i isul a i clinici dubbi e pe il dolo e mos a o dalla pazien e du an e e nelle o e successi e a ques o a amen o. Inol e, semp e successi amen e alla e apia igene a i a con MSCs Elsa è s a a ico e a a in una s u u a iabili a i a pe qualche gio no, al ine di aiu a e il ecupe o pos - a amen o. Allo s a o a uale Elsa non s olge più alcun ipo di a amen o isio e apico o iabili a i o e non assume e apie a macologiche an in iamma o ie e/o an idolo i iche. Follow-up Elsa è s a a so opos a a isi e cliniche pe iodiche. In pa icola e, dopo 30 e 60 gio ni dalla e apia Figu a 22. Elsa – Somminis azione in a ecale L1-L2 di 6x106 MSCs au ologhe in 5mL di soluzione isiologica esegui a p esso Clinica Ve e ina ia Rou e 62 – Lemignano Pa ma (PR) 103 igene a i a non si sono iscon a i miglio amen i clinici e iden i, nonos an e le sedu e di isio e apia iabili a i a s ol e successi amen e alla e apia igene a i a in un cen o apposi o. Al con ollo clinico a 90 gio ni la pazien e ha in ece mos a o qualche miglio amen o clinico, che si è dimos a o cos an e a i ando allo s a o a uale, in cui Elsa si p esen a igile ed a i a nelle sue a i i à quo idiane, in cui ce ca di assume e la s azione quad upedale s o zando il mo imen o degli a i pos e io i e della schiena. Inol e, nonos an e l’a o pos e io e des o mani es i u ’o a pa aplegia con assenza di dolo e p o ondo, l’a o sinis o appa e più onico e con dolo e p o ondo anco a p esen e. Successi amen e alla e apia igene a i a pe aiu a e i p op ie a i nella ges ione della i enzione u ina ia de ini a dalla lesione al achide, Elsa ha inizia o ad assume e una e apia a base di be anecolo, un a maco che simula le con azioni escicali al ine di s imola e la minzione spon anea. Pe ché i miglio amen i clinici is i, anche se minimi, imangano s abili e non eg ediscano è ondamen ale la ges ione di Elsa da pa e dei suoi p op ie a i, che ce cano di s imola la con di e si ese cizi, aiu andola a mo imen a si con a i i à coin olgen i senza s o zi eccessi i. 104 2.2.8 Caso clinico MSCs allogeniche, Luna: mielopa ia ischemica o aco-lomba e Segnalamen o • Specie: Cane • Razza: Jack Russel Te ie • Sesso: Femmina • E à alla e apia igene a i a: 8 anni • Peso alla e apia igene a i a: 5kg Anamnesi La pazien e è s a a so opos a in da a 20 dicemb e 2022 ad una isonanza magne ica (RM) o aco- lomba e pe una pa ologia acu a mani es a asi nei qua o gio ni p eceden i con pa aplegia senza dolo e p o ondo p esso AniCu a – Clinica Ve e ina ia Apuana. L’esame si è dimos a o diagnos ico in p ima ipo esi pe una g a e mielopa ia ischemica o aco- lomba e T6-L3 con possibile concomi an e malacia incipien e. Visi a clinica e diagnosi Luna è s a a so opos a ad una p ima isi a pe alu a e le sue condizioni cliniche gene ali e i sin omi ela i i alla pa ologia diagnos ica a, in modo da de ini e la e apia igene a i a più idonea. All’Esame Obie i o Gene ale (EOG) u i i pa ame i ien a ano nella no ma, ma in segui o alla lesione midolla e la pazien e p esen a a i enzione u ina ia, non a a a a macologicamen e. L’Esame Obie i o Pa icola e (EOP) ha con e ma o la pa aplegia con assenza di dolo e p o ondo. Nonos an e i sin omi la pazien e si p esen a a igile con uno s a o del senso io no male. In segui o alla isi a clinica, in acco do con il p op ie a io, è s a o scel o di a a e Luna con una e apia con MSCs allogeniche de i an i dal essu o adiposo di un cane dona o e sano. Indagini diagnos iche Luna è s a a so opos a ad una sola indagine diagnos ica di secondo li ello in da a 20 dicemb e 2022. In pa icola e, la isonanza magne ica è s a a esegui a con sequenze FSE T2, STIR e T1 pesa e nei e piani dello spazio, p ima e dopo la somminis azione endo enosa di un mezzo di con as o pa amagne ico (gadolinio). Alle immagini (Fig. 23) si app ezza una signi ica i a lesione 105 del midollo spinale in co ispondenza del a o T6-L3 ci ca, sop a u o al passaggio o aco- lomba e e con p e alen e in e essamen o della sos anza g igia. Il segnale è ma ca amen e ipe in enso nelle immagini T2 pesa e e isoin enso in quelle T1, in assenza di ile an e p esa di con as o e compa ibile in p ima ipo esi con un danno ascola e (mielopa ia ischemica). Le es an i p incipali s u u e spinali sono complessi amen e nella no ma, ad eccezione di una mode a a e mul ipla degene azione dei dischi in e e eb ali, non associa a a lo o pa a opie e quindi di nessuna ile anza clinica. Il quad o RM è pe an o compa ibile in p ima ipo esi con una g a e mielopa ia ischemica o aco- lomba e ed una possibile concomi an e malacia incipien e (AniCu a – Clinica Ve e ina ia Apuana) (Fig. 23). Te apia igene a i a In da a 18 gennaio 2023 Luna è s a a so opos a ad una e apia igene a i a con MSCs allogeniche de i an i dal essu o adiposo di un cane dona o e sano pe ia in a ecale ed endo enosa, p e ia so osc izione di un consenso in o ma o da pa e del p op ie a io. P ima del a amen o sono s a e esegui e una p e-anes esia IM, un’induzione anes e ica EV ed una p epa azione delle egioni di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Man enendo l’anes esia gene ale con un anes e ico inala o io sono s a e somminis a e 6x106 MSCs allogeniche in 5mL di soluzione isiologica s e ile in a ecali L7-S1 (Fig. 24) e 10x106 MSCs allogeniche in 5mL di soluzione isiologica s e ile pe ia EV dalla ena ce alica des a (Fig. 25a). La somminis azione endo enosa è s a a e e ua a ami e l’u ilizzo di un sis ema a e ie al e nando il p epa a o di cellule ad una soluzione di NaCl (100mL o ali) (Fig. 25b). Inol e, è s a o esegui o un la aggio della si inga u ilizza a pe la somminis azione EV con 5mL di soluzione isiologica s e ile al ine di ecupe a e e en uali cellule imas e adese alla plas ica. Figu a 23. Luna – Risonanza magne ica esegui a in da a 20 dicemb e 2022 p esso AniCu a – Clinica Ve e ina ia Apuana 112 2.2.10 Caso clinico PRP, Adone: o u a del legamen o c ocia o c aniale sinis o Segnalamen o • Specie: Cane • Razza: Bo a o del Be nese • Sesso: Maschio • E à alla e apia igene a i a: 8 anni Anamnesi Il pazien e p esen a a zoppia pos e io e sinis a da ci ca un mese, inizialmen e a a a con un a maco an in iamma o io ed an idolo i ico pe OS a bassa concen azione. Visi a clinica e diagnosi Adone è s a o so opos o ad una isi a pe alu a e la zoppia e le sue condizioni cliniche gene ali, in modo da de ini e la e apia più idonea, da a la sua e à e il suo s ile di i a. All’Esame Obie i o Gene ale (EOG) u i i pa ame i ien a ano nella no ma, enendo in conside azione la già no a condizione pa ologica enale ed epa ica del pazien e. L’Esame Obie i o Pa icola e (EOP) è s a o esegui o pe alu a e la zoppia nel de aglio. In pa icola e, Adone è s a o so opos o ad un esame o opedico che ha a u o lo scopo di localizza e la zoppia, de ini e possibili diagnosi di e enziali ed ipo izza e la g a i à della lesione, a a e so un’osse azione in s azione e in mo imen o al passo e al o o, dalla quale si è e idenzia a una zoppia e iden e all’a o pos e io e sinis o (Tab. 7). In segui o, è s a a esegui a una palpazione dell’a o in e essa o al ine di localizza e la sede di algia e alu a e il ROM (Range o Mo ion) a icola e, che ha e idenzia o un’algia di g ado 1 in una scala da 0 a 4 coin olgen e l’a icolazione emo o- ibio- o ulea ed un ROM aumen a o ispe o a quello isiologico della s essa. In ine, sono s a e esegui e ul e io i manuali à al ine di con e ma e la diagnosi ipo e ica di Ro u a pa ziale del Legamen o C ocia o C aniale di sinis a: en ambe le manuali à esegui e, de ini e es del casse o e es di comp essione ibiale (TCT), sono isul a e posi i e e idenziando una sub- lussazione c aniale della ibia ispe o al emo e. In segui o alla isi a clinica, conside ando l’e à a anza a del pazien e, il suo s ile di i a e la sua condizione clinica enale ed epa ica, è s a o scel o, in acco do con il p op ie a io, di non a a e Adone con un in e en o chi u gico, in cui sa ebbe s a a necessa ia un’anes esia gene ale, ma con una e apia igene a i a a base di PRP. 113 Indagini diagnos iche Adone è s a o so opos o ad un’indagine adiog a ica in da a 01 giugno 2023. In pa icola e, è s a o esegui o uno s udio adiog a ico dell’a icolazione emo o- ibio- o ulea sinis a che ha con e ma o il sospe o diagnos ico di o u a pa ziale del legamen o c ocia o, e idenziando un a anzamen o c aniale della ibia ispe o al emo e (Fig. 27). La adiog a ia ha inol e e idenzia o lie i / mode a i segni di OA sop a u o a li ello della po zione dis ale della o ula e a li ello del condilo la e ale del emo e, ques i ul imi compa ibili con l’in iammazione i e i a alla o u a pa ziale del legamen o de a (Fig. 27). Te apia igene a i a In da a 01 giugno 2023 Adone è s a o so opos o ad una e apia igene a i a con PRP p epa a o e somminis a o pe ia in a icola e a li ello dell’a icolazione emo o- ibio- o ulea sinis a (Fig. 26 a,b). Il concen a o pias inico au ologo è s a o p epa a o pa endo da 30mL di sangue enoso p ele a i dalla ena ce alica, usando ci a o di sodio come an icoagulan e. Successi amen e al p elie o, esegui o in modo ase ico p e ia osa u a della pa e e sua disin ezione, il sangue enoso accol o è s a o so opos o a due cen i ugazioni. In pa icola e, la p ima cen i ugazione Figu a 27. Adone – Rx medio-la e ale a icolazione emo o- ibio- o ulea sinis a esegui a p esso Clinica Ve e ina ia Rou e 62 – Lemignano Pa ma (PR) 114 è s a a esegui a a 180 x g pe 20 minu i e da essa sono s a i o enu i 12mL di plasma, men e la seconda cen i ugazione è s a a esegui a a 900 x g pe 15 minu i. Il pelle pias inico o enu o è s a o isospeso in 3mL di plasma po e o di pias ine (PPP), men e i 9mL imanen i sono s a i congela i pe e en uali successi i a amen i. P ima della somminis azione in a icola e è s a a esegui a una sedazione IM ed una p epa azione della egione di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Con il pazien e in decubi o la e ale sono s a i somminis a i 3mL di PRP all’in e no dell’a icolazione de a e successi amen e è s a o s imola o manualmen e il mo imen o a icola e al ine di ga an i e una dis ibuzione uni o me del p odo o. Il es an e PPP è s a o congela o e somminis a o ad Adone come lisa o pias inico (PL) alla quan i à di 1,5mL, allo s esso modo del p eceden e in da a 20 giugno 2023 p e io scongelamen o. Te apie complemen a i Al pazien e è s a o somminis a o un a maco an in iamma o io pe OS a bassa concen azione p ima della e apia igene a i a, sospeso i 15 gio ni an eceden i alla s essa e non più somminis a o successi amen e. Adone non ha mai segui o sedu e di isio e apia iabili a i a, ma da a la sua mole e la possibile di icol à di ges ione da pa e dei suoi p op ie a i, ques i in acco do con il Medico Ve e ina io cu an e hanno deciso di u ilizza e un u o e igido di suppo o all’a icolazione in modo da sos ene e il pazien e du an e la deambulazione. Follow-up Adone è s a o so opos o ad una isi a clinica di con ollo dopo 20 gio ni dalla p ima somminis azione di PRP, in segui o alla quale il dolo e a icola e mani es a o il gio no immedia amen e successi o è s a o a a o con impacchi eddi. In comune acco do con i p op ie a i è s a o deciso di esegui e una seconda somminis azione di PL a 20 gio ni dal p imo a amen o igene a i o, in o mando pe ò gli s essi della p obabile sca sa e icacia di ques a seconda e apia, da o il b e e in e allo di empo asco so dalla p eceden e. Successi amen e a ques ’ul ima, i sin omi clinici sono anda i p og essi amen e miglio ando e alla isi a clinica esegui a 30 gio ni dopo la seconda e apia la zoppia e a appena pe cepibile (Tab. 7) e il dolo e alla palpazione ido o. Il pazien e ha icomincia o a deambula e p o ando meno dolo e e a s olge e b e i cammina e quo idiane di ci ca mezz’o a. Allo s a o a uale, dopo 3 mesi dal a amen o igene a i o Adone si p esen a mode a amen e a i o, ma è icompa sa una zoppia più e iden e (Tab. 7), sop a u o quando s olge a i i à isica più in ensa. Pe ques o mo i o, 115 Adone ad oggi s a assumendo quo idianamen e degli in eg a o i pe il suppo o a icola e ed è impo an e la sua ges ione da pa e dei p op ie a i, che ce cano di s imola lo a s olge e a i i à mo o ie non in ense, anche aiu a o da mezzi di sos egno. T a qualche mese si po à alu a e, in acco do con i p op ie a i, di esegui e un ul e io e a amen o igene a i o con PRP o di alu a e una e apia igene a i a con MSCs, conside ando pe ò i asco si e i isul a i clinici già o enu i, oppu e di e e ua e una sola e apia medica. G ado Zoppia Gio no 0 Gio no 20 Gio no 50 Si uazione a uale Dx Sn Dx Sn Dx Sn Dx Sn 0 Assen e X X X X 1 Appena pe cepibile X 2 E iden e X X X 3 E iden e appoggio dell’a o senza ca ico e solo pe il man enimen o dell’equilib io 4 Manca o appoggio dell’a o Tabella 7. 116 3. DISCUSSIONE Le MSCs e il PRP engono ad oggi u ilizza i come app occi di medicina igene a i a nel cane, pe il a amen o di di e en i pa ologie. T a ques e i sono pa ologie del midollo spinale, come la mielopa ia ischemica e l’es usione del disco in e e eb ale, e pa ologie o opediche, come la o u a del legamen o c ocia o c aniale. Nel p esen e la o o di esi è s a a ipo a a l’espe ienza pe sonale ela i a all’u ilizzo di ques e e apie. In pa icola e, sono s a i desc i i cinque di e si casi clinici segui i nel empo, dalla p ima isi a clinica ai successi ollow-up esegui i pe iodicamen e. Di ques i, due cani sono s a i a a i con MSCs allogeniche pe una condizione di mielopa ia ischemica o aco-lomba e, un cane è s a o a a o con MSCs au ologhe pe un’es usione discale L1-L2, men e i es an i due cani sono s a i a a i con PRP pe una o u a pa ziale del legamen o c ocia o c aniale sinis o. In u i i casi la scel a di esegui e un a amen o igene a i o si è basa a sulle e idenze o ni e dalla le e a u a scien i ica. In pa icola e, i casi clinici a a i con MSCs pe pa ologie del midollo spinale sono s a i ela i i a pazien i con pa ologie oppo g a i pe po e esse e a a e con un app occio chi u gico, nello speci ico i due casi di mielopa ia ischemica o aco-lomba e, oppu e pazien i già so opos i a a amen i medici e chi u gici adizionali che non hanno, pe ò, da o isul a i o imali miglio ando i segni clinici, nello speci ico il caso di es usione discale. Pe le pa ologie midolla i le MSCs possono esse e somminis a e di e amen e nel si o di lesione, pe ia endo enosa oppu e in associazione (Y. Kim e al., 2015). Tu a ia, in di e si s udi è s a o dimos a o che in en ambe le ipologie di iniezione le MSCs p omuo ono il ecupe o unzionale dopo una lesione midolla e, aiu ando a p ese a e assoni e cellule neu ali, o niscono neu op o ezione, miglio ano l’ambien e e la isposa in iamma o ia locale e sis emica diminuendo i li elli di ci ochine p oin iamma o ie e iducono la o mazione di ib osi (Y. Kim e al., 2015; Ryu e al., 2012). Le dosi e le ie di somminis azione di MSCs u ilizza e nei casi clinici a a i sono s a e de ini e enendo in conside azione quelle desc i e pe ogni pa ologia al so opa ag a o 1.3.6 del p esen e la o o di esi, ma anche conside ando la mole del pazien e e l’en i à della lesione. In ine, i due casi clinici scel i pe il a amen o con PRP sono s a i ela i i ad una o u a acu a pa ziale del legamen o c ocia o c aniale sinis o non a abile con e apia chi u gica, nel p imo caso pe l’a anza a e à del pazien e associa a alla sua mole, che a ebbe de e mina o un di icol oso ecupe o pos -in e en o, men e nel secondo caso pe le pa ologie epa iche e enali di cui il pazien e è a e o, che a ebbe o po u o de ini e un’esecuzione p oblema ica 117 dell’in e en o, esegui o in anes esia gene ale, e dalla p esenza di segni di OA isibili in adiog a ia. Ques i due pazien i sono s a i a a i con una p ima somminis azione in a icola e di PRP alle quan i à ispe i e di 1mL e 3mL e con una seconda somminis azione in a icola e di PL alle quan i à ispe i e di 1mL e 1,5mL, u e scel e in base alla mole del pazien e s esso, alla g a i à della lesione e alla concen azione pias inica o enu a successi amen e alla doppia cen i ugazione. Pe ques e e apie ci si è basa i su s udi scien i ici che hanno dimos a o come la somminis azione IA di PRP possa esse e u ile pe la modulazione del dolo e a icola e nella o u a del legamen o c ocia o c aniale: i a o i di c esci a che con iene possono aiu a e nell’analgesia, nella gua igione dei essu i molli p esen i nell’a icolazione, nella egolazione di segnali an in iamma o i e nella neo ascola izzazione del essu o (Sample e al., 2018; Vila e al., 2018). Inol e, il PRP può idu e la p og essione di OA associa a a o u a del legamen o c ocia o senza de ini e e e i colla e ali indeside a i (Fahie e al., 2013b; Sil a e al., 2013). Pe il pazien e a e o da es usione discale a a o con MSCs au ologhe le cellule sono s a e o enu e pa endo dal p elie o di 5 g ammi di essu o adiposo so ocu aneo della egione o acica del pazien e s esso. Pe i pazien i a a i con MSCs allogeniche, in ece, le cellule sono s a e o enu e pa endo dal essu o adiposo di un pazien e dona o e sano. In u i i casi il essu o è s a o spedi o e quindi p ocessa o dall’Is i u o Zoop o ila ico Spe imen ale della Lomba dia e dell’Emilia-Romagna – Labo a o io Col u e Cellula i. Una ol a o enu a la dose cellula e o imale pe l’applicazione e apeu ica, scel a dal Medico Ve e ina io in base alla sua espe ienza clinica, alle sue compe enze in ma e ia ed alle e idenze o ni e dalla le e a u a scien i ica, le MSCs sono s a e spedi e al Dipa imen o di Scienze Medico Ve e ina ie di Pa ma - Sezione di Biochimica, do e sono s a e s occa e in azo o liquido ino al momen o dell’applicazione. Il PRP, in ece, è s a o o enu o pa endo dalla accol a del sangue au ologo del pazien e in p o e e con enen i ci a o di sodio come an icoagulan e e la o a o dal Dipa imen o di Scienze Medico Ve e ina ie di Pa ma - Sezione di Biochimica. Men e pe l’o enimen o della dose e apeu ica di MSCs o imale sono s a e necessa ie dalle 4 alle 6 se imane di col u a cellula e in i o pe ogni caso clinico, la p epa azione del PRP è s a a esegui a pe ogni pazien e lo s esso gio no del p elie o ema ico, essendo basa a su due sole cen i ugazioni. Nei casi clinici ela i i a pa ologie del midollo spinale le MSCs sono s a e somminis a e pe ia EV e/o in a ecale man enendo l’anes esia gene ale con un anes e ico inala o io. P ima del a amen o sono s a e esegui e una p e-anes esia IM, un’induzione anes e ica EV ed una 118 p epa azione delle egioni di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Nei casi clinici ela i i alla o u a del legamen o c ocia o c aniale sinis o il PRP è s a o somminis a o pe ia in a icola e con il pazien e pos o in decubi o la e ale. P ima della somminis azione è s a a esegui a una sedazione IM ed una p epa azione della egione di in e esse seguendo u i i p incipi di s e ili à ed asepsi. Tu i i casi clinici desc i i sono s a i alu a i con ollow-up pe iodici che hanno a u o l’obie i o di man ene e moni o a i i segni clinici, e idenziando il p og edi e o il eg edi e di e en uali miglio amen i e di come ques i siano s a i associa i o meno ad ul e io i e apie iabili a i e e/o alla con empo anea somminis azione di una e apia medica a macologica. Uno degli obie i i u u i delle e apie igene a i e è, in a i, ce ca e di idu e la dipendenza da p odo i di sin esi chimica come a maci analgesici ed an in iamma o i, spesso associa i ad e e i colla e ali indeside a i, sop a u o se somminis a i a lungo e mine. Men e le e apie con enzionali sono app esen a e da u e quelle p a iche mediche che sono s a e alida e da nume osi s udi clinici e la cui e icacia è uni e salmen e iconosciu a, la e apia igene a i a è, in ece, una b anca della medicina che u ilizza la bioingegne ia pe po enzia e alcune a i i à isiologiche e s imola e i p ocessi di ipa azione issu ale (h ps://www. egene aps.o g/ e apie- igene a i e/). Delle e apie con enzionali anno pa e la e apia medica, che u ilizza sos anze di sin esi chimica pe ip is ina e, co egge e o modi ica e unzioni isiologiche, ese ci ando un'azione a macologica, immunologica o me abolica (Minis e o della Salu e, 2018), e la e apia chi u gica, basa a su p ocedu e che compo ano il aglio manuale o non di essu i pe cu a e mala ie, lesioni o de o mi à (Mohabi e Coombs, 2020). Al con a io, la medicina igene a i a ha l’obie i o di ipa a e i essu i danneggia i a o endo appun o la igene azione delle cellule che lo cos i uiscono, a a e so meccanismi di ipa azione insi i nei essu i s essi, senza l’uso di sos anze di sin esi. Ad oggi ques ’ul ima è anco a conside a a una e apia spe imen ale in quan o i casi clinici disponibili non sono anco a abbas anza nume osi da po e esse e ogge o di alu azioni s a is iche a idabili e alidabili. Pe ale mo i o è impo an e in o ma e il p op ie a io su an aggi e s an aggi di ques e e apie e sulle po enziali c i ici à o ganizza i e ed economiche. Essendo e apie de ini e in modo speci ico pe ogni caso clinico le e apie igene a i e o ono di e si an aggi pe il pazien e, come la possibili à di pe sonalizza e la cu a, ma si a a comunque di p odo i biologici e, in quan o ali, do a i di a iabili à. Nel caso della e apia igene a i a esegui a con MSCs au ologhe o PRP il p odo o biologico u ilizza o pe il a amen o è, pe l’appun o, au ologo, cioè appa enen e al pazien e s esso, Le MSCs allogeniche 119 app esen ano, in ece, una sos anza biologica appa enen e ad un al o sogge o e quindi, in eo ia, in g ado di causa e enomeni a e si più o meno g a i. Ques o è un al o aspe o su cui il p op ie a io dell’animale de e esse e adegua amen e in o ma o (h ps://www. egene aps.o g/ e apie- igene a i e/). In nessuno dei casi clinici desc i i nel p esen e la o o di esi sono s a e e idenzia e eazioni a e se come eazioni in iamma o ie nella sede di somminis azione, ipe e mia, eazioni alle giche, ana ilassi o mo e dell’animale nel b e e o nel lungo pe iodo di empo. Un aspe o chia e da ene e in conside azione quando si decide di esegui e una e apia igene a i a con MSCs è che ques e sono un p odo o biologico che non do ebbe esse e somminis a o come ul ima possibili à e apeu ica, indipenden emen e dal ipo di pa ologia da cui un animale è a e o. In a i, nelle pa ologie c oniche o in quelle a a e pe esempio chi u gicamen e, il essu o in iamma o iene s imola o alla p oduzione di essu o cica iziale, che può in icia e le po enziali à igene a i e delle MSCs s esse. Inol e, e apie con enzionali mediche p eceden i, esegui e pe un lungo pe iodo di empo, sop a u o nelle due se imane an eceden i il a amen o igene a i o, possono in e e i e e me e e in dubbio i isul a i di ques ’ul imo. Tu a ia, p op io pe ché ad oggi è anco a conside a a spe imen ale, la endenza nella p a ica clinica è quella di a a e il pazien e inizialmen e con e apie con enzionali mediche o chi u giche e solo successi amen e con MSCs. Ques o aspe o è s a o alu a o nei casi clinici segui i. In a i, i pazien i a a i con a maci analgesici o an in iamma o i al ine di miglio a e la lo o condizione clinica, sono s a i a a i con MSCs solo dopo a e ispe a o i empi di sospensione de i. Inol e, sono s a i scel i due pazien i con condizioni cliniche acu e non a a i chi u gicamen e e un pazien e so opos o, in ece, ad un in e en o chi u gico. Ciò ha pe messo di con on a e le di e se si uazioni cliniche al momen o della p ima isi a e come ques e siano e olu e nel empo alu andole ai ollow-up esegui i pe iodicamen e. Men e nei due casi di mielopa ia ischemica o aco-lomba e non a a i chi u gicamen e p ima della somminis azione con MSCs allogeniche e non a a i con e apia medica nelle due se imane an eceden i la s essa sono s a i e idenzia i dei miglio amen i clinici p og essi i e poi man enu isi cos an i nel empo, nel caso clinico di es usione discale L1-L2 a a o chi u gicamen e p ima della somminis azione con MSCs au ologhe non si è e idenzia a la s essa p og essione posi i a. Tu a ia, sui isul a i e apeu ici o enu i ha a u o un uolo ondamen ale la ges ione del pazien e da pa e del p op ie a io. Nel caso del a amen o con MSCs au ologhe la p ima pa e della 120 ges ione del pazien e speci ico ha igua da o il b e e pe iodo di empo che ha segui o l’in e en o chi u gico esegui o pe il p elie o del essu o adiposo. Essendo poco in asi o la ges ione non è s a a complessa e ha igua da o i 10-14 gio ni seguen i, du an e i quali il p op ie a io ha do u o assicu a si che il cane imanesse anquillo e non eseguisse mo imen i o za i o b uschi e che non si leccasse la e i a con il ischio di s appa si i pun i, c ea e in ezioni e i a da e quindi la gua igione. In ques o pe iodo è s a a anche p es a a a enzione all’a ea di su u a pe alu a e l’e en uale p esenza di gon io i, a ossamen i o sec ezioni, u e ca a e is iche da segnala e al Medico Ve e ina io, ma che gene almen e non compo ano ischi se co e amen e a enziona e. La ges ione e a e p op ia dei pazien i a a i ha igua da o, in ece, il pe iodo di ecupe o dopo la e apia igene a i a, indipenden emen e dal ipo di p odo o biologico u ilizza o (MSCs au ologhe, MSCs allogeniche, PRP). Anche in ques o caso du an e il ecupe o è s a o ondamen ale che il pazien e a a o imanesse anquillo e non eseguisse mo imen i o za i; in gene ale u i i cani a a i sono s a i enu i a iposo o za o pe 15 gio ni, in e allando 3-4 b e i usci e gio nalie e di ci ca 20 minu i, igo osamen e a guinzaglio. Il iposo pe me e, in a i, al p odo o biologico u ilizza o di agi e in modo o imale a o endo la ipa azione dei essu i danneggia i ed aiu a a idu e l’e en uale in iammazione p esen e alle iando il dolo e. Se pe ò du an e i p imi gio ni pos - a amen o i p op ie a i a esse o no a o a eggiamen i indice di o e dolo e come zoppia o in olle anza all’ese cizio isico po e ano somminis a e al pazien e una dose di analgesico pe OS a bassa concen azione, pe massimo 3- 4 gio ni. Ad un solo pazien e di quelli a a i è s a o necessa io somminis a e ques a e apia. In gene ale, i empi di ip esa pe le e apie igene a i e sono mol o a iabili e dipenden i dal singolo caso clinico. Un uolo impo an e nel p ocesso di ecupe o è s ol o dalla iabili azione, che può esse e s ol a con modali à e equenze di e en i in base al singolo pazien e. La isio e apia consen e, in a i, di aiu a e il in o zo muscola e, di p e eni e o minimizza e i p oblemi da disuso di ca ilagini, ossa, endini e legamen i, specialmen e nei casi a a i pe pa ologie al midollo spinale, e di p e eni e le al e azioni do u e all’eccessi a immobili à (S a ie i e Gamba). In pa icola e, in campo e e ina io la isio e apia p e ede l’u ilizzo di di e si ipi di a amen o: e mo e apia, massaggio, ese cizi passi i (PROM), s e ching, ese cizi a i i assis i i, ese cizi a i i, id o e apia (unde wa e eadmill) e e apia s umen ale. Nel de aglio, la e mo e apia è u ile pe la ges ione del dolo e, g azie all’applicazione di impacchi eddi (c io e apia) in ase acu a e impacchi caldi in ase c onica. Il massaggio è un p ocedimen o 121 e apeu ico che consis e nell’applicazione di p essioni, izioni e azioni dei essu i al ine di o ene e un e e o e apeu ico s imolando la ci colazione sanguigna e lin a ica, iducendo il dolo e e lo spasmo a li ello muscola e e p omuo endo il iasso bimen o degli edemi. Gli ese cizi passi i (PROM) sono mo imen i passi i delle a icolazioni pe u a la lo o possibili à di mo imen o (ROM, ange o mo ion), esegui i a a e so l’applicazione di o ze es e ne, che aiu ano a idu e la igidi à a icola e e muscola e e a a o i e il o ismo issu ale. Lo s e ching p e ede l’applicazione di una p essione es e na che de e mina l’aumen o del ROM a icola e pe diminui e le ensioni mio endinee, legamen ose e pe icapsula i. Gli ese cizi a i i assis i i si basano sul la o o muscola e a i o da pa e del pazien e, aiu a o dal e apis a, e possono esse e esegui i median e l’aiu o di suppo i come physio oll o a ole e p op ioce i e, men e gli ese cizi a i i s imolano in ece il mo imen o muscola e e a icola e a i o del pazien e g azie ad a ezzi come os acoli, piccoli pesi, elas ici o scale e/o ami e ese cizi che necessi ano la collabo azione dell’animale. L’id o e apia (unde wa e eadmill) è la deambulazione assis i a in acqua che, s u ando al ezze d’acqua di e en i, acili a il mo imen o e l’esecuzione di ese cizi più o meno complessi dal pun o di is a muscola e o a icola e iducendo il disagio. In ine, la e apia s umen ale u ilizza ele omedicali che s u ano ene gie isiche di e se pe idu e dolo e ed in iammazione, aumen a e la ci colazione sanguigna e lin a ica e idu e l’edema. T a ques i i sono gli ul asuoni, cioè ib azioni acus iche ad al a equenza che si p opagano nel essu o so o o ma di onde di comp essione/decomp essione de e minando bios imolazione cellula e, e l’ele os imolazione (TENS) che s u a la co en e ele ica anscu anea a scopo e apeu ico pe il a amen o del dolo e e pe il a o zo della massa muscola e (S a ie i e Gamba, La ges ione dell'os eoa i e c onica del cane - I manuali digi ali di Elanco). Al e e apie u ilizzabili a suppo o dei a amen i iabili a i i sono quelle in il a i e locali come l’ozono e apia e l’ossigeno e apia e e apie del dolo e quali l’agopun u a adizionale cinese o occiden ale (S a ie i e Gamba). Nei casi clinici ogge o del p esen e la o o di esi l’esecuzione della isio e apia come e apia di suppo o ai a amen i igene a i i è s a a impo an e pe l’o enimen o di miglio amen i clinici signi ica i i e pe il lo o man enimen o nel empo. Ques o è s a o eso e iden e dai ollow-up pe iodici esegui i. In a i, nei pazien i che hanno segui o ese cizi di iabili azione in modo egola e si è e idenzia a una buona p og essione dei segni clinici che ha poi in lui o sulla lo o quali à di i a, man enendola o imale, compa ibilmen e con la lo o condizione pa ologica iniziale. 128 Chen, C., Finge hu , J. M., & Yamashi a, Y. M. (2016). The ins(ide) and ou s(ide) o asymme ic s em cell di ision. Cu en Opinion in Cell Biology, 43, 1–6. h ps://doi.o g/10.1016/j.ceb.2016.06.001 Chen, X., Gan, Y., Li, W., Su, J., Zhang, Y., Huang, Y., Robe s, A. I., Han, Y., Li, J., Wang, Y., & Shi, Y. (2014). The in e ac ion be ween mesenchymal s em cells and s e oids du ing in lamma ion. Cell Dea h & Disease, 5(1), e1009. h ps://doi.o g/10.1038/cddis.2013.537 Chung, T.-H., Baek, D.-S., Kim, N., Pa k, J.-H., & Pa k, C. (2015). Topical allogeneic pla ele - ich plasma ea men o a massi e cu aneous lesion induced by dissemina ed in a ascula coagula ion in a oy b eed dog. 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