Caratterizzazione immunoistochimica del microambiente immunitario dei sarcomi dei tessuti molli del cane

DIPARTIMENTO DI SCIENZE MEDICO-VETERINARIE CORSO DI LAUREA MAGISTRALE A CICLO UNICO IN Medicina Ve e ina ia Ca a e izzazione immunois ochimica del mic oambien e immuni a io dei sa comi dei essu i molli del cane Immunohis ochemical cha ac e iza ion o he immune mic oen i onmen o canine so issue sa comas Rela o e: Chia .ma P o .ssa Benede a Passe i Co ela o e: Chia .ma P o .ssa Anna Ma ia Can oni Lau eando: Se gio Minesso ANNO ACCADEMICO 2022-2023 2 3 Somma io ABSTRACT ................................................................................................................................................. 5 RIASSUNTO ............................................................................................................................................... 6 INTRODUZIONE ....................................................................................................................................... 7 SARCOMI DEI TESSUTI MOLLI ..................................................................................................................... 7 EPIDEMIOLOGIA ED EZIOLOGIA ..................................................................................................................... 7 CLASSIFICAZIONE E COMPORTAMENTO BIOLOGICO ..................................................................................... 8 FATTORI PROGNOSTICI ................................................................................................................................ 16 ASPETTI COMPARTIVI .................................................................................................................................. 19 MICROAMBIENTE IMMUNITARIO TUMORALE .......................................................................................... 20 ASPETTI GENERALI DEL MICROAMBIENTE IMMUNITARIO TUMORALE ........................................................ 20 CELLULE DENDRITICHE ............................................................................................................................... 21 MACROFAGI ASSOCIATI AL TUMORE (TAMS) ............................................................................................. 22 LINFOCITI INFILTRANTI IL TUMORE (TILS) ................................................................................................. 25 STRUTTURE LINFOIDI TERZIARIE (TLSS) .................................................................................................... 29 MICROAMBIENTE IMMUNITARIO DEI SARCOMI DEI TESSUTI MOLLI ............................................................ 30 SCOPO DELLO STUDIO ............................................................................................................................... 32 MATERIALI E METODI ........................................................................................................................ 33 SELEZIONE DEI CAMPIONI ......................................................................................................................... 33 COLORAZIONE CON EMATOSSILINA EOSINA ............................................................................................ 33 REVISIONE E GRADING .............................................................................................................................. 35 IMMUNOISTOCHIMICA ............................................................................................................................... 36 QUANTIFICAZIONE DELLE IMMUNO-POSITIVITÀ .................................................................................... 39 DATI E ANALISI STATISTICA ...................................................................................................................... 39 RISULTATI ............................................................................................................................................... 40 REVISIONE E GRADING .............................................................................................................................. 40 IMMUNOISTOCHIMICA ............................................................................................................................... 42 MACROFAGI M1 MAC387+ ........................................................................................................................ 42 4 LINFOCITI B CD20+ .................................................................................................................................... 44 PLASMACELLULE MUM-1+ ........................................................................................................................ 46 LINFOCITI T CD3+ ...................................................................................................................................... 47 LINFOCITI T REGOLATORI FOXP3+ ............................................................................................................. 48 CORRELAZIONE TRA CELLULE IMMUNITARIE ............................................................................................. 49 CORRELAZIONE TRA CELLULE IMMUNITARIE E INDICATORI PROGNOSTICI ................................................ 49 DISCUSSIONE .......................................................................................................................................... 52 CONCLUSIONI ........................................................................................................................................ 57 BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................... 58 5 Abs ac So issue sa comas (STS) ep esen a he e ogeneous g oup o mesenchymal neoplasms and accoun o 8% o 18% o canine cu aneous umo s. I is es ima ed ha 95,000 cases o STS a e diagnosed in dogs in he Uni ed S a es annually, wi h a mo ali y a e anging om 20% o 30%. Su gical emo al wi h wide ma gins is o en cu a i e, bu local ecu ence and me as asis can occu depending on he his ological g ade. STS a e adi ionally conside ed immunologically "cold" umo s, and he use o immune checkpoin inhibi o s (ICIs) o he ea men o human STS has yielded disappoin ing esul s. Da a ega ding human STS indica e ha umo -associa ed mac ophages (TAMs) a e he mos abundan cell ype in he umo mic oen i onmen (TME) o hese neoplasms. STS cha ac e ized by high in il a ion o B lymphocy es, T lymphocy es, and he o ma ion o e ia y lymphoid s uc u es (TLSs) ha e a mo e a o able p ognosis and espond be e o ICIs ea men . Li e a u e ega ding he TME o canine STS is ex emely limi ed, and he e a e no s udies examining i s cellula popula ions. Gi en he high incidence and nume ous simila i ies wi h he human coun e pa , dogs could ep esen a aluable spon aneous model o s udying he TME o STS. Thi y-one canine STS (15 pe i ascula wall umo s, 4 pe iphe al ne e shea h umo s, 4 liposa comas, 4 ib osa comas, 1 myxosa coma, and 3 undi e en ia ed sa comas) we e e iewed, g aded, and analyzed using immunohis ochemis y o iden i y CD3+, CD20+, MUM-1+, Foxp3+, and MAC387+ cells. M1 TAMs showed a widesp ead dis ibu ion wi hin he neoplas ic issue, while umo -in il a ing lymphocy es (TILs) we e p ima ily obse ed nea umo ascula u e. Al hough canine STS gene ally exhibi ed low immunogenici y, some cases we e cha ac e ized by a ying deg ees o in il a ion o immune cells wi h an i umo unc ion. The densi y o M1 TAMs showed a posi i e co ela ion wi h he densi y o B lymphocy es and plasma cells, sugges ing ha M1 TAMs condi ion he genesis o an e ec i e an i umo immune esponse in canine STS. The p esence o in il a ing egula o y T cells (T eg) sugges s ha hese may ep esen a possible mechanism o immune e asion in hese neoplasms. STS cha ac e ized by high in il a ion o immune cells we e dis inguished by he p esence o dense lymphocy ic agg ega es wi h a ollicle-like s uc u e in e p e ed as TLSs. No signi ican di e ences we e ound in he TME composi ion among STS o di e en g ades o his o ypes, and no co ela ions we e obse ed wi h he mi o ic index. These esul s a e consis en wi h knowledge abou human STS and suppo he po en ial use o canine STS as a spon aneous model o s udying he TME o hese neoplasms and de eloping new he apeu ic app oaches o bo h species. 6 Riassun o I sa comi dei essu i molli (STS) app esen ano un g uppo e e ogeneo di neoplasie di o igine mesenchimale e cos i uiscono dall’8 al 18% delle neoplasie cu anee del cane. Si s ima che ogni anno negli S a i Uni i engano diagnos ica i 95.000 casi di STS nella popolazione canina con una mo ali à che a dal 20% al 30%. La imozione chi u gica ad ampi ma gini è spesso isolu i a, ma la ecidi a locale e lo s iluppo di me as asi possono p esen a si dipenden emen e dal g ado is ologico. I STS sono adizionalmen e conside a i umo i immunologicamen e “ eddi” e l’impiego di inibi o i dei checkpoin immuni a i (ICIs) pe il a amen o dei STS dell’uomo ha es i ui o isul a i deluden i. Da i in me i o ai STS dell’uomo indicano che i mac o agi associa i al umo e (TAMs) app esen ano la ipologia cellula e più nume osa nel mic oambien e umo ale (TME) di ques e neoplasie e che umo i ca a e izza i da un’ele a a in il azione di lin oci i B, lin oci i T e dalla o mazione di s u u e lin oidi e zia ie (TLSs) p esen ano una p ognosi più a o e ole e una miglio e ispos a al a amen o con ICIs. La le e a u a in me i o al TME dei STS del cane è es emamene limi a a e non sono disponili ice che che ne s udino le popolazioni cellula i. Da a l’ele a a incidenza e le nume ose somiglianze con la con opa e umana, il cane po ebbe app esen a e un alido modello spon aneo pe lo s udio del TME dei STS. T en uno STS del cane (15 PWT, 4 PNST, 4 LS, 4 FSA, 1 MS e 3 US) sono s a i e isiona i, g ada i e analizza i median e IHC pe l’iden i icazione delle cellule CD3+. CD20+, MUM-1+, Foxp3+ e MAC387. I TAMs M1 hanno mos a o una dis ibuzione di usa all’in e no del essu o neoplas ico, men e i TILs sono s a i osse a i p incipalmen e in sede pe i ascola e. Sebbene i STS del cane abbiano p esen a o gene almen e una sca sa immunogenici à, alcuni casi sono s a i ca a e izza i da un’in il azione più o meno abbondan e di cellule immuni a ie con unzione an i umo ale. La densi à dei TAMs M1 ha mos a o una co elazione posi i a con la densi à di lin oci i B e plasmacellule sugge endo che i TAMs condizionino la genesi di un’e icace ispos a immuni a ia an i umo ale nei STS del cane. L’osse azione di lin oci i T egola o i in il an i i STS consen e di ipo izza e che ques i possano app esen a e un possible meccanismo di e asione immuni a ia in ques e neoplasie. I STS ca a e izza i da un’ele a a in il azione di cellule immuni a ie si sono dis in i pe la p esenza di densi agg ega i lin oci a i con una s u u a simil ollicola e in e p e a e come TLSs. Non sono s a e indi idua e di e enze signi ica i e nella composizione del TME di STS di di e so g ado o is o ipo e non sono s a e osse a e co elazioni con l’indice mi o ico. Tali isul a i sono compa ibili con le conoscenze in me i o ai STS dell’uomo e suppo ano il po enziale impiego dei STS del cane come modello spon aneo pe lo s udio del TME di ques e neoplasie e lo s iluppo di nuo i app occi e apeu ici a a o e di en ambe le specie. 7 In oduzione Sa comi dei essu i molli Epidemiologia ed eziologia I sa comi dei essu i molli (STS) app esen ano dall’8 al 18% delle neoplasie cu anee del cane [1]– [4]. L’incidenza annuale s ima a a dai 35 ai 122 casi su 100.000 cani a seconda degli s udi [2], [5]–[7]. Non sono s a e iden i ica e p edisposizioni di sesso [7]. Si osse a una maggio e p e alenza nei cani di e à a anza a e semb ano esse e maggio men e in e essa i i cani di media- g ossa aglia [2], [3]. Il Golden Re ie e ed il Lab ado Re ie e mos ano una p edisposizione in di e si s udi [3], [4], [8], [9]. Si s ima che ogni anno negli S a i Uni i engano diagnos ica i app ossima i amen e 95.000 casi di STS nella popolazione canina con una mo ali à che a dal 20% al 30% [10]. I si i ana omici maggio men e coin ol i sono gli a i ( ino al 60% dei casi), segui i dal onco (35% dei casi) e dalla es a (5%) [2], [11], [12]. Uno s udio ecen e condo o su 1435 casi di neoplasie cu anee indica che i STS app esen ano ino al 43% delle neoplasie cu anee dell’a o an e io e, il 30% dell’a o pos e io e, il 26% delle egioni del pe o e del piede pos e io e, il 14% della es a, il 12,5% del collo, il 12,5% del piede an e io e e il 9% del do so [4]. L’oncogenesi dei STS del cane non è s a a del u o chia i a [7]. L’in iammazione c onica semb a esse e coin ol a nella genesi e p og essione di alcuni sa comi negli animali domes ici [7], [13]. Ques o da o è a alo a o da singoli casi di STS s iluppa isi a segui o di aumi, al posizionamen o di impian i o opedici e all’esposizione a adiazioni [2], [14]–[21]. Inol e, l’in es azione da nema odi della specie Spi oce ca Lupi de e mina la o mazioni di noduli in iamma o i che e ol ono in sa comi eso agei nel 25% dei cani a e i [22], [23]. Nella specie elina, l’in iammazione c onica associa a a co pi es anei e accini è alla base dello s iluppo del Fib osa coma Felino nel si o di iniezione (FISS) [24]. Anche nel cane, è ipo a o il i o amen o di deposi i di alluminio all’in e no di sa comi mo ologicamen e simili ai FISS e localizza i in possibili si i di iniezione [25]. Nell’uomo, i STS engono suddi isi secondo il p o ilo molecola e in due g uppi: la maggio anza dei STS dell’uomo p esen a un p o ilo mu azionale complesso ca a e izza o da nume ose al e azioni gene iche aspeci iche; un g uppo più is e o include STS pe cui sono no e speci iche aslocazioni c omosomiche e mu azioni a ca ico di geni oncogeni [7]. S udi di RNA-seq hanno indi idua o di e enze signi ica i e nell’esp essione di geni po enzialmen e coin ol i nell’oncogenesi delle di e se ipologie STS del cane [10]. Tale dis ibuzione sugge isce l’assenza di un p o ilo comune a u i i STS: l’iniziazione dei STS po ebbe esse e un e en o casuale, p obabilmen e esace ba o dall’azione mu agena dall’ambien e in iamma o io locale [7]. 8 Classi icazione e compo amen o biologico I STS app esen ano un g uppo e e ogeneo di neoplasie di o igine mesenchimale. Nel cane, i STS o iginano più equen emen e a li ello cu aneo e so ocu aneo, ma possono s iluppa si dai essu i conne i i molli di qualsiasi si o ana omico: muscoli, endini, legamen i, capsule a icola i, asce, ne i e asi sanguigni [1]. Di e se ipologie umo ali sono s a e agg uppa e nella ca ego ia dei STS in unzione di ca a e is iche is ologiche comuni e di un compo amen o biologico i enu o simile [1], [2]. Il compo amen o biologico dei STS è ca a e izza o dalla o mazione di masse espansi e ci conda e da una pseudo-capsula o ma a dalla comp essione del essu o conne i o adiacen e [2], [7]. I ma gini is ologici dei STS sono poco de ini i e la c esci a ende ad in il a e i piani asciali [2], [7]. I STS p esen ano un compo amen o localmen e agg essi o con un indice di ecidi a basso/mode a o dopo aspo azione chi u gica [2]. La me as a izzazione a iene pe ia ema ogena, ma con un po enziale me as a ico basso e dipenden e dal g ado is ologico [2], [7]. Le neoplasie incluse nella ca ego ia dei STS (Tabella 1) sono il ib osa coma (FSA), i umo i della pa e e ascola e (Pe i ascula Wall Tumo – PWT, p eceden emen e emangiope ici oma), il liposa coma (LS), il sa coma pleomo o o is ioci oma ib oso maligno (Undi e en ia ed Pleomo phic Sa coma - UPS), il mesenchimoma maligno (MM), il mixosa coma (MS), il sa coma indi e enzia o (Undi e en ia ed Sa coma - US) e i umo i della guaina dei ne i pe i e ici (Pe iphe al Ne e Shea Tumo - PNST) ad eccezione di quelli o iginan i dai plessi b achiale e lombosac ale [1], [2]. Alcune neoplasie mesenchimali con o igine nei essu i molli sono cos an emen e escluse dalla ca ego ia dei STS poiché acilmen e dis inguibili sulla base delle ca a e is iche is ologiche, del si o ana omico di o igine o pe un compo amen o biologico più agg essi o [1]. Ques ’ul ime includono l’emangiosa coma (HSA), il sa coma sino iale (SS), i umo i s omali gas o-in es inali (GIST), il ib osa coma o ale e i PNST con o igine a li ello dei plessi b achiale e lombosac ale. Il abdomiosa coma (RMS), il leiomiosa coma (LMS) ed il lin angiosa coma engono inclusi nei STS solo da alcuni au o i [1], [2], [7]. Vis a la de i azione dalle cellule dend i iche in e s iziali CD18+ e il compo amen o ma ca amen e agg essi o, il sa coma is ioci ico (SH) è escluso dai STS [1], [26]. I STS del cane sono mo ologicamen e accomuna i dalla p esenza di cellule mesenchimali usa e o ganizza e in asci, o ici e lussi accompagna i da una ma ice ex acellula e di ib e collagene [1]. La classi icazione dei STS e l’iden i icazione dell’is o ipo si basa sulla somiglianza con il essu o adul o di o igine e l’iden i icazione di pa e n is ologici ca a e is ici (Tabella 1) [1]. Tu a ia, la ipizzazione dei STS, sia del cane che dell’uomo, è complica a dalla con empo anea p esenza di più pa e n is ologici e dalla condi isione di alcuni pa e n a più en i à pa ologiche [1], [8]. Ad esempio, la dis inzione di PWT e PNST è spesso di icile a causa della comunanza di di e se ca a e is iche is ologiche 9 [27]. Inol e, lo s esso ma ke immunois ochimico (IHC) iene esp esso da più ipi cellula i e eno ipi [2]. Nella maggio anza dei STS al amen e sdi e enzia i la classi icazione basa a sull’osse azione di sezioni colo a e con ema ossilina-eosina (HE) non è possibile e sono ichies e colo azioni di IHC [8]. Vis a la di icol à nella di e enziazione eno ipica e nella dis inzione delle o me benigne e il basso po enziale me as a ico ispe o ad al i sa comi, alcuni au o i sugge iscono che ques i umo i do ebbe o esse e agg uppa i nella de inizione di “ umo i delle cellule usa e dei essu i molli” [1], [2]. Tu a ia, sebbene si i enga che i STS abbiano un compo amen o biologico simile, i sono e idenze c escen i che sos engono l’esis enza di di e enze a gli is o ipi [2]. Il ib osa coma (FSA) o igina da ib oci i e ib oblas i ed è più equen e in cani di e à a anza a, ma con un’inso genza più p ecoce ispe o ad al i ipi di STS [2]. Golden Re ie e s e Dobe mann semb ano esse e p edispos i [2], [28]. I FSA possono o igina e come masse ocali in qualsiasi si o ana omico, ma in e essano con maggio e equenza la es a, gli a i e la ca i à o ale [2], [28]. Is ologicamen e, il FSA è ca a e izza o dalla p esenza di ib oblas i maligni o ganizza i in asci in eccia i o a spina di pesce ed imme si in s oma di ib e collagene di quan i à a iabile [1], [28]. Il ib osa coma cheloidale è ca a e izza o da ma ice ex acellula e compos a da ib e collagene ialinizza e [28]. I FSA esp imono gene almen e solo il ma ke mesenchimale Vimen ina (Vim) [28]. I FSA hanno un compo amen o in il a i o e endono a ecidi a e a segui o dell’exe esi chi u gica a ma gini incomple i [2]. Figu a 1: FSA ben di e enzia o (colo azione HE; ing andimen o 20X). No a e la ca a e is ica disposizione delle cellule neoplas iche usa e in asci in eccia i o a “spina di pesce”. 16 Fa o i p ognos ici I STS si p esen ano come masse con c esci a in il a i a e ma gini is ologici sca samen e de ini i [7]. In medicina e e ina ia, l’escissione chi u gica ad ampi ma gini ( ino a 3cm) è adizionalmen e conside a a l’opzione e apeu ica miglio e [7]. Tu a ia, la ecidi a locale a segui o della imozione chi u gica si p esen a in una pe cen uale di pazien i dal 7% al 75% e lo s iluppo di me as asi in e essa dal 7% al 41% dei casi [7]. Si s ima che dal 20% al 30% dei cani a e i da STS muoiano a causa della mala ia [7]. Nume osi s udi hanno e idenzia o l’impa o p ognos ico di di e si a o i nei STS del cane [1]. Tu a ia, la maggio pa e delle in o mazioni ci ca i a o i p ognos ici dei STS de i a da s udi mi a i a scopi di e si quali la compa azione di più app occi e apeu ici [1]. Inol e, ali s udi sono spesso limi a i dalla dimensione ido a della popolazione in esame, dalla mancanza di una diagnosi is ologica igo osa e dalla sca sa p ecisione nella s ima del asso di me as asi o di ecidi a locale [1], [7]. In più, di e si s udi hanno incluso en i à pa ologiche ca a e izza e da un compo amen o biologico ma ca amen e più agg essi o quali il sa coma is ioci ico, l’emangiosa coma, il leiomiosa coma ed il sa coma delle cellule sino iali [1]. Un ul e io e limi e di ques i s udi è lega o alla lo o na u a e ospe i a [1]. I a o i p ognos ici dei STS maggio men e alida i includono sia ca a e is iche is ologiche che mac oscopiche. Le p ime sono il ipo is ologico, il g ado e l’indice mi o ico; le seconde comp endono le dimensioni, la localizzazione e le ca a e is iche alla palpazione del umo e [1], [7]. Inol e, anche la comple ezza dei ma gini di escissione chi u gica ha un uolo p ognos ico signi ica i o [7]. Nessuno dei a o i p eceden emen e elenca i, se p eso singola men e, è in g ado di p e ede e l’esi o di un STS in modo soddis acen e [1]. Vi sono e idenze secondo cui i singoli is o ipi di STS dell’uomo p esen ano un compo amen o di e so pe quan o igua da l’in asi i à locale, il po enziale me as a ico e la ecidi a locale [1], [7]. I STS del cane engono adizionalmen e conside a i come un g uppo ai ini p ognos ici [7]. Tu a ia, anche nel cane, i sono p o e che sos engono l’esis enza di di e enze nella p esen azione e nell’esi o dei di e si is o ipi di STS [2]. È da so olinea e che gli s udi mi a i ad indi idua e di e enze nell’esi o dei di e si ipi di STS sono limi a i dalle dimensioni is e e della popolazione in esame o dalla sca sa app esen a i i à de i an e dalla a i à di de e mina i is o ipi come il LS e il UPS [1], [7]. Inol e, la di icol à nel dis ingue e is ologicamen e i di e si ipi di STS e di sepa a e le o me benigne da quelle maligne complica la comp ensione del uolo p ognos ico dell’is o ipo nei STS [1], [7]. Uno s udio e ospe i o basa o su 350 casi di STS ha ipo a o un asso di ecidi a locale del 20,8% e un asso me as a ico del 11,4%. Lo s esso s udio e idenzia una maggio e p opensione di ecidi a locale nel neu o- ib osa coma (32%), segui o dal 17 mixoma (30,7%) e dal ib osa coma (28,6%) [33]. Di e se on i a ibuiscono ai PWT un compo amen o biologico poco o non agg essi o ispe o agli al i ipi di STS, con addis in o da un asso di ecidi a locale ed un po enziale me as a ico basso [7], [32], [33]. Semb a che le di e enze nel compo amen o degli is o ipi possa esse e spiega o da una maggio e p opensione di alcune ipologie a p esen a si con un g ado e/o un indice mi o ico (mi osi in 10 campi HPF) ele a i [1]. A ualmen e, il ipo is ologico ha uno sca so impa o sulla ges ione clinica dei singoli casi di STS [1]. Il g ado is ologico è i enu o il a o e p ognos ico più signi ica i o nei STS dell’uomo [1]. Il sis ema di g ading is ologico dei STS del cane de i a da uno dei sis emi u ilizza i pe i STS dell’uomo s iluppa o da T ojani e al. e conosciu o come F ench g ading sys em [1], [34]. Tale sis ema è s a o applica o ai STS del cane pe la p ima ol a da Kun z e al. e oggi è il pa ame o is ologico maggio men e impiega o pe la de inizione della p ognosi dei STS [34], [35]. Il g ading dei STS classi ica i casi in g ado I (basso), g ado II (in e medio) e g ado III (al o) combinando e ca a e is iche is ologiche quali la di e enziazione, la pe cen uale di nec osi e l’indice mi o ico (MI) [1], [7]. Più s udi e ospe i i dimos ano un’associazione a il g ado dei STS, la sop a i enza globale e la ecidi a locale, ma non sono disponibili da i consis en i ci ca l’impa o del g ado sul po enziale me as a ico [33], [34], [36]. Tu a ia, la p obabili à di ecidi a locale è o emen e condiziona a dalla comple ezza dei ma gini chi u gici e pe an o il g ado non può esse e conside a o come unico a o e p ognos ico pe la ecidi a [34]. I STS di basso g ado sono quelli più equen emen e iscon a i nel cane e p esen ano la p obabili à più bassa di de e mina e ecidi a dopo l’escissione anche quando i ma gini chi u gici sono icini alla neoplasia [1]. I STS di g ado in e medio si osse ano meno equen emen e di quelli di basso g ado ispe o ai quali p esen ano una maggio e p opensione alla ecidi a locale quando i ma gini escissionali sono icini alla neoplasia [1], [36]. I STS di g ado al o sono i meno equen i (dal 7 al 17% dei STS cu anei e so ocu anei) e sono ca a e izza i dal più ele a o asso di ecidi a e po enziale me as a ico [1]. Anche nel caso di STS di al o g ado la ecidi a dopo l’escissione comple a è in equen e [1], [36]. Ciò spinge a conside a e lo s a o is ologico dei ma gini come il a o e p ognos ico di maggio e ile anza pe la ecidi a locale [34]. Il g ado is ologico dei STS del cane p ende in conside azione la di e enziazione, la nec osi e l’indice mi o ico [1]. La di e enziazione è misu a della somiglianza del essu o neoplas ico al no male essu o mesenchimale di de i azione [1]. I umo i ben di e enzia i sono quelli che somigliano maggio men e al no male essu o mesenchimale e pe cui è possibile de e mina e 18 l’is o ipo pe la p esenza di pa e n is ologici ca a e is ici [1]. I STS sca samen e di e enzia i p esen ano una somiglianza modes a con il essu o mesenchimale da cui de i ano, ma è comunque possibile iden i ica e l’is o ipo [1]. Pe i STS indi e enzia i non è possibile iden i ica e il essu o mesenchimale di de i azione [1]. Ciò non si applica nei casi in cui l’is ogenesi di un umo e è di icilmen e de e minabile pe la condi isione dei medesimi pa e n is ologici a più ipologie come nel caso di PWT e PNST [1]. L’es ensione della nec osi de e esse e alu a a di e enziando ques ’ul ima da a ee emo agiche, mixoidi o ialine ed escludendo le al e azioni associa e all’aspo azione chi u gica. L’indice mi o ico è de ini o come il nume o di mi osi con a e in 10 HPF e de e esse e misu a o nell’a ea con la maggio e densi à cellula e e con l’a i i à mi o ica maggio e [1]. Semb a che solamen e la nec osi e l’indice mi o ico siano elemen i s a is icamen e signi ica i i ai ini p ognos ici [1], [35]. Inol e, il li ello di di e enziazione isul a esse e ca a e izza o da una ele a a sogge i i à quando alu a o da più pa ologi [35]. Al con a io, l’indice mi o ico isul a esse e p edi i o pe lo s iluppo di me as asi, il empo di sop a i enza e la ecidi a locale e l’es ensione della nec osi ha un alo e p edi i o pe quan o igua da il empo di sop a i enza a segui o della chi u gia [35]. L’indice mi o ico può esse e conside a o un a o e p ognos ico anche se conside a o singola men e [1]. Un ele a o indice mi o ico è s a o associa o a una maggio e p opensione alla ecidi a ed una maggio e p ecoci à della s essa, allo s iluppo di me as asi e un ad un ido o empo di sop a i enza [1]. Inol e, l’esp essione di ma ke speci ici della p oli e azione cellula e quali AgNOR e Ki-67 è s a a co ela a ad un ido o empo di sop a i enza [1]. Sebbene le dimensioni del umo e possano a e e ipe cussioni sull’escissione chi u gica, di e si s udi non sono s a i in g ado di dimos a ne il signi ica o p ognos ico [1]. Al i au o i hanno iden i ica o che i STS con dimensioni >5cm p esen ino un empo p ima della ecidi a e un empo di sop a i enza globale mino i [1], [7]. Analogamen e, la localizzazione della neoplasia può condiziona e il isul a o della imozione chi u gica [1]. Tu a ia, di e si s udi non hanno iden i ica o di e enze nel empo di sop a i enza o nella ecidi a locale a le di e se localizzazioni [1]. Fanno eccezione i STS con localizzazione o ale e pe io ale in cui è no o un compo amen o più agg essi o [1]. 19 Aspe i compa i i Analogamen e alla specie canina, nell’uomo, la de inizione di STS comp ende nume ose ed e e ogenee neoplasie mesenchimali maligne con o igine a li ello dei essu i molli [37]. La ca ego ia dei STS dell’uomo include ol e 120 is o ipi [38]. La p e alenza dei STS nell’uomo è es emamen e bassa e app esen a solamen e l’1,5% del o ale nelle neoplasie umane. L’incidenza annuale è di 6 casi ogni 100.000 pe sone [37]. Con a iamen e, i STS del cane app esen ano dall’8 al 18% delle neoplasie cu anee e so ocu anee [1]–[4]. L’incidenza annuale nel cane a dai 35 ai 122 casi su 100.000 cani a seconda degli s udi [2], [5]–[7]. Ad eccezione dei sa comi gio anili, anche i STS dell’uomo sono più equen i nei pazien i anziani [37]. Similmen e al cane, nell’uomo, i STS hanno un compo amen o localmen e agg essi o e la imozione chi u gica dell’in e a massa è il a amen o più app op ia o; u a ia, la ecidi a locale e lo s iluppo di me as asi si possono più o meno p esen a e a seconda dell’is o ipo o del g ado di maligni à [37]. Di e si s udi ipo ano co ispondenza nelle ca a e is iche is ologiche e nella classi icazione dei STS del cane e dell’uomo [39]. Nume ose somiglianze sono s a e iscon a e sia nello schema di classi icazione che nelle ca a e is iche is ologiche e immunois ochimiche dei RMS del cane e dell’uomo [39]. In una ice ca compa a i a dei STS non RMS, (PWT, UPS, MS, LS, PNST e LS), le ca a e is iche is ologiche ed immunois ochimiche osse a e nel cane e ano simili alla con opa e umana [40]. Inol e, il sis ema di g ading p opos o da T ojani e . al., s iluppa o e alida o nell’uomo, è un a o e p ognos ico ou ina iamen e applica o nei STS del cane [37]. G azie ad un’ele a a incidenza di umo i, ad una du a a della i a maggio e ed alla condi isione del medesimo ambien e, la specie canina è s a a p opos a come modello al e na i o a quello mu ino pe lo s udio di di e se ipologie umo ali dell’uomo [39]. Da a l’ele a a incidenza e le nume ose somiglianze con la con opa e umana, il cane po ebbe app esen a e un alido modello spon aneo pe lo s udio della biologia dei STS e lo s iluppo di nuo i app occi e apeu ici a a o e di en ambe le specie [39]. 20 Mic oambien e immuni a io umo ale Aspe i gene ali del mic oambien e immuni a io umo ale Negli ul imi decenni, lo s udio dei umo i ha messo in luce come ques i p esen ino una complessi à che può esse e pa agonabile o supe a e quella dei essu i sani e che ede la p esenza di di e si ipi cellula i specializza i che in e agiscono a lo o e con le cellule neoplas iche [41]. Pe an o, la ice ca sulla biologia dei umo i ha da o la go spazio allo s udio del c.d. mic oambien e umo ale (TME) e del suo uolo nello s iluppo e nella p og essione dei umo i [42]. Il TME si compone, ol e che delle cellule neoplas iche, di cellule s aminali umo ali, cellule endo eliali, ib oblas i, e a ie ipologie di cellule immuni a ie comp ese nello s oma umo ale [42]. È s a o osse a o come le cellule immuni a ie con enu e nel TME possono in luenza e l’e oluzione, la c esci a la p og essione di di e se ipologie umo ali median e a i meccanismi [42]. Inol e, la ia i azione della ispos a immuni a ia an i umo ale median e inibi o i dei checkpoin immuni a i (ICIs), che ip is inano la unzioni nelle cellule immuni a ie nel TME, si è dimos a a un a amen o es emamen e alido in di e se ipologie umo ali dell’uomo [38]. Le cellule immuni a ie nel TME possono ese ci a e un’azione immunosopp essi a/p o- umo ale come i lin oci i T egola o i (T egs) e le cellule sopp esso ie di de i azione mieloide (MDSCs), oppu e immuno- s imola o ia/an i umo ale come nel caso dei lin oci i T ci o ossici (CTLs), cellule dend i iche (DCs), neu o ili N1-pola izza i e cellule na u al kille (NK) [43]. I mac o agi associa i al umo e (TAMs) possono assume e un eno ipo p o- umo ale M2 o an i umo ale M1 [43]. Il uolo delle cellule B nella p og essione del umo e semb a esse e con o e so [43]. Negli ul imi anni, la le e a u a in me i o al TME dei umo i del cane si è no e olmen e amplia a concen andosi su di e se ipologie umo ali a cui, il melanoma o ale, i ca cinomi mamma i, il ca cinoma squamocellula e, l’adenoca cinoma polmona e, il mas oci oma, il lin oma, il HS, l’os eosa coma, i gliomi e i meningiomi. Inol e, pe alcune di ques e, sono s a e e idenzia e associazioni a la composizione del TME e di e si indica o i p ognos ici. 21 Cellule dend i iche Le DCs de i ano da speci ici p ecu so i ema opoie ici del midollo osseo, si localizzano a li ello di essu i espos i ad an igeni es anei (pelle, in es ino, polmoni) e nei ela i i lin onodi ibu a i e possono esse e ichiama e nei si i di in ezione [44]. In ques e sedi, le DCs possono esse e a i a e median e il iconoscimen o inna o di p o ili molecola i associa i ai pa ogeni (PAMPs) o al danno cellula e (DAMPs) oppu e ami e media o i dell’in iammazione quali IL-1b, TNFa, IL-6 e PGE2 [44]. Le DCs sono specializza e nella cap azione, p ocessazione e p esen azione di an igeni e pe ciò engono de ini e come cellule p esen an i l’an igene (APCs) p o essionis e [44]. Ques a lo o unzione è ondamen ale pe il p iming dei lin oci i T a cui segue la di e enziazione in lin oci i T helpe o ci o ossici, l’espansione clonale degli s essi e lo s iluppo di lin oci i T memo ia [44]. L’in e azione a DCs e lin oci i T a iene median e un epe o io di molecole a cui si o ano il complesso maggio e di is ocompa ibili à di classe I e II (MHCI e II ) e le molecole di cos imolazione CD70 e CD80/CD86 [45]. Inol e, le DCs p esen ano an igeni anche ai lin oci i B, con ibuendo ul e io men e allo s iluppo della ispos a immuni a ia ada a i a [44]. Nel TME le DCs cap ano, p ocessano e p esen ano an igeni associa i al umo e (TAAs) in associazione a MHC, esp imono chemochine e molecole di cos imolazione e p oducono molecole solubili necessa ie all’a i azione dei lin oci i T [46]. T a le molecole di cos imolazione esp esse dalle DCs, CD80/CD86 s olgono un uolo chia e nel p iming dei lin oci i T in e agendo ispe i amen e con CD28 e CTLA-4. Il CD40, in e agendo con CD40L, de e mina ol e al p iming dei lin oci i T, anche l’ul e io e a i azione delle DCs. Il CD70 delle DCs è ondamen ale nel suppo o del p iming dei CTLs CD8+ [46]. Pe an o, la p esenza di DCs ma u e a i a e all’in e no del umo e consen e l’a i azione della ispos a immuni a ia an i umo ale ed il ichiamo di cellule e e ici [43]. In a i, s udi sul ca cinoma polmona e non a piccole cellule dell’uomo dimos ano come la p esenza di DCs ma u e all’in e no di s u u e lin oidi e zia ie (TLS) sia co ela o all’in il azione di lin oci i T e cos i uisca un o e a o e p ognos ico indipenden e [44], [47]. Tu a ia, alle DCs è a ibui o anche un impo an e uolo nel con ollo della olle anza sia e so an igeni sel che es anei [44]. Ad esempio, l’esp essione cos i u i a della b-ca enina app esen a il p incipale meccanismo a a e so il quale le APCs p omuo ono la olle anza nei con on i dei ba e i commensali a li ello cu aneo ed in es inale [44]. Analogamen e, la ia di segnalamen o della b-ca enina si è dimos a a esse e alla base dell’esclusione dei lin oci i T dal TME [44]. Un ul e io e meccanismo alla base della olle anza immunologica dipende dall’in e azione di di e se molecole esp esse dalle DCs con ece o i inibi o i esp essi dai lin oci i T quali PD-1 e CTLA-4 [44]. 22 Mac o agi associa i al umo e (TAMs) I mac o agi s olgono un uolo chia e sia nell’immuni à inna a che ada a i a median e la lo o ele a a plas ici à unzionale [48]. Essi sono implica i nella genesi dell’in iammazione e della ispos a immuni a ia e pa ecipano alla ipa azione issu ale [48]. Le p incipali unzioni immuni a ie dei mac o agi includono la agoci osi, la p esen azione an igenica, la sec ezione di ci ochine e di componen i del complemen o [48] I TAMs cos i uiscono una pa e signi ica i a del TME e de i ano p incipalmen e dai monoci i ci colan i ichiama i all’in e no del TME da media o i quali CCL2, CCL5, CSF-1, GM-CSF e C5a [48]. Tu a ia, semb a che una ce a quo a di TAMs possa de i a e anche da mac o agi issu ali esiden i e da MDSCs di e enzia e in mac o agi ma u i [49]. I TAMs subiscono una pola izzazione unzionale in luenza a dall’ambien e issu ale in cui si o ano [48]. La pola izzazione mac o agica consis e nella modi icazione del me abolismo, dell’esp essione genica e di ma ke di supe icie dei mac o agi susci a a dall’e e o di ci ochine e a o i di c esci a [49]. La pola izzazione e so il eno ipo M1 può esse e indo a da s imoli quali INFg, TNFa, LPS ed al i ligandi dei Toll like Recep o s (TLR). Al con a io, media o i quali IL-4, IL-10, IL-13 e TGF-b guidano la pola izzazione e so il eno ipo M2 [49]. I p incipali ma ke impiega i nell'uomo pe l’iden i icazione dei mac o agi M1 sono CD80, CD86, MHCII e CD64; men e i mac o agi M2 si dis inguono pe l’esp essone di CD163, CD204, CD206 e FIZZI [49]. I mac o agi pola izza i M1 hanno una unzione p o-in iamma o ia con addis in a dalla p oduzione di ci ochine, a cui TNFa, INFg IL-1b, IL-6 e IL-12 [48]. I mac o agi M1 esp imono l’ossido ni ico sin e asi (iNOS) esponsabile della p oduzione di ossido ni ico (NO) e specie ea i e dell’ossigeno (ROS) che de e minano la ci o ossici à di e a delle cellule umo ali [48]. Inol e, i mac o agi M1 uccidono le cellule umo ali median e meccanismi di ci o ossici à cellulo-media a an ico po dipenden e (ADCC) in p esenza di an ico pi i ol i e so TAAs [48]. Al con a io i mac o agi pola izza i M2 sono no malmen e esponsabili della imozione di de i i cellula i, della ipa azione issu ale e della p omozione dell’angiogenesi. Tali unzioni assumono un uolo p o- umo ale all’in e no del TME [48]. I TAMs M2 p oducono ci ochine an in iamma o ie quali IL-10 e TGF-b che con ibuiscono allo spegnimen o della ispos a immuni a ia con o le cellule umo ali [43], [48]. I mac o agi M2 sos engono di e amen e le cellule umo ali a a e so la p oduzione di a o i di c esci a, a cui EGF, PDGF, HGF [48]. Inol e, è s a o osse a o che il me abolismo dei TAMs suppo a la c esci a umo ale aumen ando la diponibili à di e o nel TME [49]. È no o che i mac o agi M2 sos engono lo s iluppo umo ale e la o mazione di me as asi median e la p omozione dell’angiogenesi ed il imodellamen o della ma ice ex acellula e nello s oma umo ale [43]. La p oduzione di me allop o easi (MMPs), 23 se ine e ca epsine da pa e dei mac o agi M2 è esponsabile della decomposizione della ma ice cellula e e delle giunzioni delle cellule endo eliali e s omali a o endo la mig azione e l’in a asazione delle cellule neoplas iche e quindi la o mazione di me as asi [48]. La p oli e azione di cellule endo eliali e la neoangiogenesi engono sos enu e da di e si media o i p odo i dai mac o agi M2 a cui BFGF, VEGF, IL-1, IL-8, TNFa, MMP-9, MMP-2 e COX-2 [48]. I TAMs s abiliscono complesse elazioni con le al e ipologie cellula i p esen i all’in e no del TME. Ad esempio, è s a o osse a o che sia i ib oblas i associa i al umo e che le cellule mesenchimali s omali suppo ano pola izzazione e so il eno ipo M2 [49]. I TAMs sono implica i nel man enimen o di un ambien e immunosopp essi o median e l’inibizione dei lin oci i T CD4+ e CD8+ e delle NK [49]. La p oli e azione delle cellule T iene inibi a dalla deplezione della L-a ginina nel TME di cui i TAMs sono esponsabili [49]. Inol e, I TAMs sos engono la di e enziazione dei T eg ed il eclu amen o degli s essi nel TME [49]. L’impa o p ognos ico dei TAMs è s a o ampiamen e s udia o sia nell’uomo che nel cane in di e se ipologie umo ali. I TAMs si sono dimos a i un a o e p edi i o anche pe quan o igua da la ispos a al a amen o e lo s iluppo di esis enza a di e si app occi e apeu ici [49]. Tu a ia, da o l’ele a o nume o di s udi, eme gono conclusioni con as an i ci ca l’impa o p ognos ico dei TAMs [49]. Tali isul a i do ebbe o esse e in e p e a i alla luce del a o che i ma ke impiega i pe l’iden i icazione dei TAMs e dei eno ipi M1/M2 possano a ia e a seconda degli s udi [49]. Inol e, i ma ke impiegan i nel cane sono gene almen e scel i sulla base di da i de i an i da s udi condo i nell’uomo e nel opo [49]. I p incipali ma ke impiega i pe l’iden i icazione dei TAMs nel cane sono Iba-1, MAC387, CD163, CD204, iNOS. Iba-1 (Ionized binding calcium adap e 1) è esp esso da mac o agi e cellule della mic oglia ed in medicina e e ina ia iene gene almen e impiega o pe l’iden i icazione dei TAMs o ali [50]. CD163 e CD204 sono conside a i ma ke ipici del eno ipo M2 [50]. MAC387, conosciu o anche come calp o ec ina o S100A8/A9 è esp esso da neu o ili, monoci i, cellule dend i iche e mac o agi a i a i e nel cane è s a o impiega o pe l’iden i icazione sia dei TAMs o ali che dei mac o agi M1 e dei mac o agi eclu a i ecen emen e [49]. L’esp essione di iNOS è conside a a una p e oga i a dei mac o agi M1 ed è s a a impiega a pe l’iden i icazione degli s essi nella specie canina [49], [51]. L’ele a a in il azione di TAMs si è dimos a a esse e associa a con una mino e sop a i enza complessi a, una maggio e incidenza di me as asi, un g ado is ologico maggio e, ed una maggio e esp essione di VEGF nei umo i mamma i del cane [49]. Al con a io, uno s udio ipo a un’associazione posi i a a il nume o di TAMs ed il empo di sop a i enza in casi di ca cinoma mamma io del cane. Tu a ia, conside ando solamen e i mac o agi M2, è s a a iscon a a una maggio e incidenza di me as asi lin onodali [49]. Il nume o di TAMs è isul a o esse e associa o ad un g ado umo ale maggio e in 24 gliomi, lin omi, mas oci omi e sa comi dei essu i molli del cane [49]. Nel melanoma o ale del cane l’in il azione di mac o agi M2 CD163+ è associa a con la con a mi o ica, l’a ipia nuclea e, lo s iluppo di me as asi e la mo e do u a alla mala ia neoplas ica [49]. Un ecen e s udio ha e idenzia o come il nume o di mac o agi M2 CD204+ sia associa o ad una sop a i enza complessi a ido a nel ca cinoma a cellule di ansizione e nell’adenoca cinoma polmona e del cane [52]. Al con a io, nell’os eosa coma canino è s a o osse a o un in e allo di empo maggio e p ima della ecidi a in associazione con l’in il azione di mac o agi M2 [49]. 25 Lin oci i in il an i il umo e (TILs) I e mine lin oci i in il an i il umo e (TILs) indica lin oci i che in il ano il umo e localizzandosi all’in e no dei nidi di cellule neoplas iche o all’es e no di essi ma in s e o con a o con le cellule neoplas iche. I TILs comp endono di e se ipologie cellula i quali p incipalmen e CD4+, CD8+, T eg, ma anche, lin oci i Tg/d cellule B CD20+, PC e cellule NK [53]. I lin oci i T CD3+ engono classi ica i a seconda delle subuni à che compongono il ece o e delle cellule T (TCR) e l’esp essione dei ma ke CD4 e CD8.[45] Le cellule TCRab+ CD4+ e CD8+ cos i uiscono la p incipale ipologia di cellule T iden i icabili in essu i sani e neoplas ici [45]. Le cellule T CD8+ o lin oci i T ci o ossici (CTLs) sono conside a i i p incipali e e o i della ispos a immuni a ia an i umo ale median e l’uccisione di e a delle cellule neoplas iche [43]. I CTL naï e sono in g ado di iconosce e an igeni p esen a i dalle DCs in associazione al complesso maggio e di is ocompa ibili à di classe I (MHCI) g azie al TCR [54]. Un ul e io e segnale di a i azione pe i CTLs è o ni o dalle molecole di co-s imolazione CD27 e CD28 che in e agiscono con i ispe i i ligandi CD70 e CD80/CD86 sulle DCs [54]. I CTLs a i a i acquisiscono la capaci à di iconosce e an igeni sulle cellule umo ali in associazione a MHCI [43], [54]. L’uccisione delle cellule umo ali da pa e dei CTLs può a eni e median e l’esoci osi di g anuli con enen i g anzimi e pe o ina oppu e ami e l’induzione dell’apop osi pe ia del ece o e FasL. Inol e, i CTLs a i a i p oducono INFg e TNFa che inducono la ci o ossici à nelle cellule umo ali e s imolano l’a i azione dei mac o agi M1 [43], [54]. I CTLs sono associa i ad una p ognosi più a o e ole in quasi u e le ipologie di canc o [45]. I CTLs non s olgono la lo o unzione indipenden emen e in quan o l’in e azione con i lin oci i T helpe CD4+ (Th) è necessa ia pe un’e icace ispos a immuni a ia an i umo ale [45]. I Th CD4+ iconoscono an igeni p esen a i in associazione al complesso maggio e di is ocompa ibili à di classe II (MHCII) e consen ono l’o imale a i azione dei CTLs ami e la p oduzione di INFg e IL-2. Inol e, i Th CD4+ p omuo ono l’a i azione delle DCs e la ela i a esp essione delle molecole di cos imolazione necessa ie all’a i azione dei CTLs [43]. Semb a che l’esp essione di CXCL13 da pa e dei Th sia coin ol a nella o mazione delle s u u e lin oidi e zia ie (TLSs) in a- umo ali [45]. In più, i Th possiedono meccanismi che consen ono la lisi di e a delle cellule neoplas iche [45] Tu a ia, la unzione an i- umo igenica dei lin oci i T all’in e no del TME è spesso inibi a da di e si meccanismi di e asione immuni a ia. Un ul e io e segnale di a i azione pe i CTLs è o ni o da ece o i no i come checkpoin immuni a i, i quali possono p esen a e una unzione s imola o ia oppu e inibi o ia come nel caso di CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG-3. È no o che di e se ipologie di umo e s uggano alla ispos a immuni a ia inibendo l’a i azione dei CTLs median e l’esp essione di ligandi come PD-L1 che in e agiscono 32 Scopo dello s udio I STS app esen ano dall’8 al 18% delle neoplasie cu anee del cane[1]–[4]. Si s ima che ogni anno negli S a i Uni i engano diagnos ica i app ossima i amen e 95.000 casi di STS nella popolazione canina con una mo ali à che a dal 20% al 30% [10]. I STS sono adizionalmen e conside a i umo i immunologicamen e “ eddi” sulla sco a della sca sa p esenza di cellule immuni a ie osse abili in is opa ologia [75], [76]. Conco demen e, l’impiego di an ico pi an i-PD-L1 pe il a amen o dei STS dell’uomo ha es i ui o isul a i deluden i. Tu a ia, s udi del TME dei STS dell’uomo i elano come i umo i ca a e izza i da un’ele a a in il azione di mac o agi M1, lin oci i T CD8+ e lin oci i B CD20+ p esen ino una p ognosi miglio e ispe o a quelli con un’ele a a in il azione di mac o agi M0/M2. Inol e, la p esenza di TLSs nei STS è s a a associa a ad una maggio e in il azione in a- umo ale di cellule immuni a ie e ad una miglio e ispos a al a amen o con ICIs [38]. La le e a u a in me i o al TME dei STS del cane è es emamene limi a a e non sono disponili s udi che ne ca a e izzino de aglia amen e le popolazioni cellula i [76]. Lo scopo del p esen e s udio è quello di ca a e izza le popolazioni cellula i immuni a ie p esen i nel TME di di e si is o ipi di STS del cane median e l’impiego di ecniche IHC. In pa icola e, lo s udio è ol o a iden i ica e e quan i ica e lin oci i T CD3+, lin oci i T eg Foxp3+, lin oci i B CD20+, plasmacellule MUM-1+ e mac o agi M1 MAC387+. Inol e, e anno s udia e le di e enze del TME a i a i is o ipi, le co elazioni a le di e se ipologie cellula i immuni a ie e a o i p ognos ici alida i pe i STS del cane (g ado e indice mi o ico). Una ca a e izzazione es ensi a del mic oambien e immuni a io dei STS del cane po ebbe isul a e nell’iden i icazione di indica o i p ognos ici o di possibili a ge e apeu ici. Inol e, lo s udio dei STS del cane po ebbe con ibui e alla comp ensione della con opa e umana in un’o ica compa a i a. 33 Ma e iali e me odi Selezione dei campioni È s a a esegui a una ice ca e ospe i a nell’a chi io in o ma ico dell’U.O. di Ana omia Pa ologica Ve e ina ia dell’Uni e si à di Pa ma; si è enu o con o dei e e i is opa ologici s esi dall’anno 2007 all’anno 2022. Sono s a i seleziona i casi soddis acen i i seguen i c i e i di inclusione: - Campioni issu ali biop ici o escissionali. Sono s a i esclusi i campioni ci ologici. - Diagnosi is opa ologica compa ibile con STS e ela i i so o ipi (PWT, PNST, FSA, MS, LS, LMS, RMS, UPS; MM e US). Sono s a i esclusi i casi di HSA, HS e SS. - Localizzazione cu anea, so ocu anea e o ale. Sono s a i esclusi i casi con localizzazione isce ale. - Disponibili à di campioni issu ali issa i in o malina e inclusi in pa a ina (FFPE) di dimensioni su icien i pe le successi e analisi (>0,5 cm). T en uno casi sono s a i inclusi nello s udio. Le in o mazioni dei ela i i cani, a cui e à, sesso, s e ilizzazione/cas azione, azza e localizzazione del umo e, sono s a e accol e median e una ice ca nel so wa e ges ionale ( eniceVET di ZakaSo s. .l) dell’Ospedale Ve e ina io Dida ico dell’Uni e si à di Pa ma Colo azione con ema ossilina eosina Pe ogni campione, una sezione dello spesso e di 5µm è s a a aglia a median e l’u ilizzo di un mic o omo. La sezione così o enu a è s a a a a dis ende e in acqua dis illa a edda e, successi amen e, in acqua dis illa a iscalda a a 45°C. Le sezione sono quindi s a e accol e su e ini po aogge o e lascia e ade i e in s u a pe una no e. Le sezioni sono s a e imme se pe 20 minu i in xilene pe consen i e l’eliminazione della pa a ina. Successi amen e le sezioni sono s a e eid a a e ami e imme sione pe cinque minu i ciascuno in una scala dec escen e di alcol 100%-100%-95% e acqua dis illa a. Le sezioni sono quindi s a e colo a e median e un passaggio di 3 minu i in ema ossilina di Maye ed un passaggio di 1 minu o in eosina. Successi amen e, le sezioni sono s a e la a e in acqua co en e, disid a a e median e passaggi in una scala c escen e di alcol e dia anizza e in xilene. Una e ino cop iogge o è s a o mon a o su ogni sezione median e liquido di mon aggio anid o (CVR Moun di Bio-Op ica) e lascia o asciuga e. 34 Caso Nume o egis o Razza Sesso E à (mesi) Localizzazione 1 277/21 Me iccio M 92 a o 2 126/21 (1) Me iccio 180 es a 3 22/21 (2) - M 96 a o 4 33/22 Me iccio FS 180 onco 5 349/20 Lab ado e ie e FS 144 onco 6 45/18 Boxe F 132 a o 7 114/20 Me iccio M 147 onco 8 321/21 Me iccio M 120 coda 9 69/21 Me iccio F 144 a o 10 324/21 Me iccio F 151 a o 11 222/21 Boxe F 143 12 488/20 Me iccio F 171 a o 13 98/15 Golden e ie e MC 144 onco 14 167/12 Pas o e edesco FS 144 onco 15 190/10 Segugio F 96 a o 16 5/10 Epagneul B e on F 24 onco 17 368/16 Poin e F 144 a o 18 60/10 Me iccio M 120 onco 19 173/13 Poin e F 156 a o 20 235/16 Pas o e Ma emmano F 144 a o 21 288/16 Me iccio F 156 a o 22 43/11 Pas o e Ma emmano M 144 onco 23 321/10 Me iccio F 156 onco 24 147/10 Me iccio F 120 25 191/20 (4) Pas o e edesco M 109 26 341/07 Sibe ian Husky FS 132 a o 27 175/16 (1) Lab ado e ie e M 120 a o 28 255/11 Me iccio F 156 a o 29 23/09 Epagneul B e on F 19 onco 30 537/20 - M 144 ca i à o ale 31 282/09 Puli MC 108 onco Tabella 2 Casi di STS inclusi nello s udio 35 Re isione e g ading Una sezione colo a a con HE è s a a esamina a al mic oscopio o ico pe ogni caso. I casi sono s a i iclassi ica i secondo la nomencla u a più ecen e in PWT, PNST, FSA, MS, LS, MM, UPS, LMS, e RMS median e il iconoscimen o di ca a e is iche is ologiche peculia i (Tabella 1). I casi in cui non è s a o possibile iden i ica e l’is o ipo sono s a i classi ica i come US. Successi amen e, i casi sono s a i classi ica i secondo il sis ema di g ading ipo a o da T ojani e . al. Di e enziazione 1 Sa comi che ip oducono il no male essu o mesenchimale adul o (e.g. PWT, PNST, FSA, LS ben di e enzia i). 2 Sa comi con sca sa somiglianza con il no male essu o mesenchimale adul o, ma pe i quali può esse e de e mina o l’is o ipo (e.g. PWT, PNST, FSA, LS sca samen e di e enzia i). 3 Sa comi indi e enzia i/ di ipo non no o Indice mi o ico (10 campi a 400X) 1 0-9 2 10-19 3 >19 Nec osi 0 Nec osi assen e 1 ≤50% 2 >50% G ado is ologico I ≤ 3 II 4-5 III ≥ 6 Tabella 3 Schema pe il g ading dei STS di T ojani e al. Il g ading è s a o esegui o seguendo le linee guida p eceden emen e ipo a e da Dennis e al. (2011). Pe ogni caso, è s a a alu a a al mic oscopio o ico una sezione is ologica colo a a con HE conside ando a ee ben issa e e non eccessi amen e complica e da emo agia o in iammazione. La di e enziazione è s a a alu a a ami e osse azione a piccolo ing andimen o e indi iduazione dei pa e n is ologici ca a e is ici (Tabella 1). L’indice mi o ico è s a o alu a o con ando il nume o di mi osi in 10 campi con igui a 400X nell’a ea con la maggio e a i i à mi o ica della sezione ed e i ando a ee con sca sa densi à cellula e, complica e da ulce azione, nec osi o emo agia, La nec osi è s a a alu a a enendo con o solamen e della nec osi in a- umo ale ed e i ando a ee di ulce azione supe iciale e aumi lega i alla imozione chi u gica/biop ica. 36 Immunois ochimica Pe ogni campione, un nume o adegua o di sezioni dello spesso e di 5µm è s a a aglia o median e l’u ilizzo di un mic o omo. La sezioni così o enu e sono s a e a e dis ende e in acqua dis illa a edda e, successi amen e, in acqua dis illa a iscalda a a 45°C. Le sezioni sono quindi s a e accol e su e ini polilisina i e lascia e ade i e in s u a pe una no e. I e ini sono s a i imme si pe 20 minu i in xilene pe consen i e l’eliminazione della pa a ina. Successi amen e i e ini sono s a i eid a a i ami e imme sione pe cinque minu i ciascuno in una scala dec escen e di alcol 100%-100%-95%-70% e acqua dis illa a. Nel p esen e s udio è s a o impiega o lo smasche amen o an igenico indo o da calo e (HIAR) median e cicli in mic oonde ed imme sione in un bu e di sodio ci a o a pH con olla o. A seconda dell’an igene ice ca o (Tabella 4), i e ini sono s a i inse i i in una soluzione di sodio ci a o a pH 6 o pH 8 (2.94 g di sodio ci a o ibasico diid a o, 1 L di Acqua Dis illa a e 500 mic oL di Tween-20). I e ini, imme si nella soluzione di sodio ci a o, sono s a i so opos i a e cicli in mic o-onde a 400W da 5 minu i ciascuno. Al comple amen o dei e cicli i campioni sono s a i a i a edda e in un bagno con ghiaccio pe 20 minu i. Dopo a e a edda o i e ini sono s a i e e ua i e la aggi da cinque minu i ciascuno in PBS 1X (Diluizione 1:5 di KCl 0.5g, KH2PO4 0.5g, NaCl 20g Na2HPO4 5,75g e 500ml di Acqua Dis illa a). Al ine di inibi e le pe ossidasi endogene i campioni sono s a i imme si in una soluzione di pe ossido di id ogeno al 6% in PBS pe ci ca 15 minu i. In segui o, sono s a i e e ua i e la aggi di 5 minu i ciascuno in PBS 1X. Pe l’an igen blocking, sono s a i impiega i il No mal Goa Se um (NGS) o il No mal Rabbi Se um (NRS) a seconda dell’an ico po seconda io u ilizza o (Tabella 4). Il sie o di in e esse è s a o dilui o 1:5 con albumina sie ica bo ina all’1% (BSA) e un’aliquo a di 250µl è s a a as e i a su ogni e ino. I e ini sono s a i pos i in una came a umida pe p e eni e la disid a azione delle sezioni di essu o du an e l’incubazione. I e ini sono s a i lascia i in incubazione con il sie o aspeci ico pe 20 minu i a empe a u a ambien e. Successi amen e, il sie o p eceden emen e deposi a o sul e ino è s a o imosso. In segui o, i e ini sono s a i nuo amen e posiziona i nella came a umida e sono s a i aggiun i su ogni e ino 250µl di an ico po p ima io dilui o secondo il ela i o p o ocollo (Tabella 4). Il con ollo posi i o è s a o alles i o con una sezione di lin onodo ea i o di cane, il con ollo nega i o ome endo l’applicazione dell’an ico po p ima io. L’incubazione è s a a esegui a ad una empe a u a di 4°C. Successi amen e, i e ini sono s a i lascia i a empe a u a ambien e pe ci ca 20 minu i segui i da e la aggi di 5 minu i ognuno in PBS 1X pe assicu a e l’eliminazione di an ico po p ima io in eccesso. In segui o, è s a a esegui a l’incubazione con l’an ico po seconda io bio inila o dilui o 1:200 (Tabella 4). È s a a dis ibui a un’aliquo a di 250µl su ogni e ino. È 37 segui a un’incubazione di 30 minu i al e mine della quale sono s a i e e ua i 3 la aggi in PBS 1X da 5 minu i ciascuno. Pe po e localizza e l’immunocomplesso an igene-an ico po è s a o impiega o il sis ema ABC (complesso a idina bio ina). Sono s a i deposi a i su ogni e ino 250µl di soluzione VECTASTAIN Eli e ABC-HRP (Vec o Labo a o ies) p epa a a secondo le indicazioni del p odu o e. È segui a un’incubazione nella came a umida di 20 minu i a empe a u a ambien e. A ine incubazione sono s a i esegui i 3 la aggi in PBS 1X da 5 minu i ciascuno. Pe po e ende e isibile al mic oscopio o ico il legame an igene-an ico po è s a o impiega o come subs a o della pe ossidasi il c omogeno DAB (3,3-diaminodenzidina e aid oclo u o): l’enzima ca alizza l’ossidazione del subs a o de e minando la o mazione di un p odo o inale di colo e osso. Sono s a i dis ibui i su ogni e ino 250µl di soluzione Vec o No aRED (Vec o Labo a o ies) p epa a a secondo le indicazioni del p odu o e. Lo s iluppo colo ime ico o imale è s a o de e mina o dallo spe imen a o e: una ol a s iluppa asi una colo azione osa- ossa sui e ini, ques i sono s a i imme si in PBS 1X pe 5 minu i e successi amen e la a i in acqua co en e. Successi amen e, è e e ua a la con o-colo azione median e ema ossilina di Maye , I campioni sono s a i imme si in una asche a con enen e il colo an e pe 1 minu o e poi sciacqua i abbondan emen e in acqua co en e. I e ini sono quindi s a i mon a i con dei e ini cop i-ogge o u ilizzando un mon an e acquoso (Aqueous Moun di Zy omed sys ems). Su ogni e ino è s a a pos a una goccia di mon an e pe poi lascia e ade i e il e ino cop i-ogge o applicando una legge a p essione pe e i a e la o mazione di bolle. Successi amen e il mon an e è s a o lascia o asciuga e. 38 Tabella 4 p o ocolli di IHC impiega i nello s udio An igene Ta ge Tipo cellula e Esp essione Smasche amen o an igenico Blocking se um Ab p ima io (clone/p odu o e) Diluizione Ab p ima io Ab seconda io bio inila o (clone/p odu o e) CD3 Lin oci i T Memb ana HIAR (pH 6) NGS Rabbi polyclonal an i-human CD3 (A0452/Dako) 1:80 Goa an i- abbi IgG (BA-1000-Vec o Labs) CD20 Lin oci i B Memb ana HIAR (pH 6) NGS Rabbi polyclonal an i-human CD20 IgG (PA5-16701/The mo Fishe ) 1:400 Goa an i- abbi IgG (BA-1000- Vec o Labs) MUM-1 Plasmacellule Nuclea e, ci oplasma ica HIAR (pH 8) NGS Rabbi monoclonal an i- human MUM-1 IgG (BC5/Bioca e) 1:100 Goa an i- abbi IgG (BA-1000- Vec o Labs) FOXP3 Lin oci i T egola o i Nuclea e HIAR (pH 8) NRS Ra monoclonal an i Foxp3 IgG (FJK-16s/A yme ix) 1:200 Rabbi an i- a IgG (BA-4001-Vec o Labs) MAC387 Mac o agi M1 Ci oplasma ica HIAR (pH 6 ) NGS Mouse an i-human mac ophages IgG (MAC387/Bio-Rad) 1:100 Goa an i-mouse IgG (BA-9200- Vec o Labs) 39 Quan i icazione delle immuno-posi i i à Tu i i campioni sono s a i alu a i median e osse azione al mic oscopio o ico (Nikon Eclipse E800). Le di e se ipologie di cellule immuni a ie sono s a e quan i ica e manualmen e in 10 campi HPF scel i casualmen e nell’a ea in a- umo ale. Le a ee pe i- umo ali, i ma gini, le a ee nec o iche, emo agiche o eccessi amen e complica e da in iammazione sono s a e escluse dal con eggio. Ragg uppamen i densi di lin oci i ip oducen i TLSs sono s a e e i a e nel con eggio. Il con eggio dei lin oci i T CD3+ è s a o esegui o enendo con o delle cellule con posi i i à di memb ana e mo ologia lin oci a ia dis in a. Il con eggio dei lin oci i B CD20+ è s a o esegui o enendo con o delle cellule con posi i i à di memb ana e mo ologia lin oci a ia dis in a. Il con eggio dei T eg Foxp3+ è s a o esegui o enendo con o delle cellule con posi i i à nuclea e e mo ologia lin oci a ia dis in a. Le cellule MUM-1 posi i e sono s a e con eggia e in caso di posi i i à nuclea e e ci oplasma ica e chia e mo ologia plasmoci oide. Pe il con eggio dei mac o agi M1 MAC397+ sono s a e con eggia e le cellule con immunoposi i i à ci oplasma ica e mo ologia is ioci oide; cellule mo ologicamen e compa ibili con neu o ili e monoci i non sono s a i inclusi nel con eggio. Da i e analisi s a is ica I da i sono s a i accol i e analizza i u ilizzando Mic oso Excel e IBM SPSS. I da i accol i comp endono azza, sesso, e à (mesi), localizzazione, diagnosi dopo la e isione is opa ologica, g ado (1/2/3), sco e di e enziazione (1/2/3), sco e nec osi (0/1/2), sco e mi osi (1/2/3) e indice mi o ico. La p esenza di cellule immuni a ie posi i e in IHC è s a a egis a a come nume o medio di cellule/HPF. Le a iabili ca ego iche sono s a e desc i e median e equenze e pe cen uali. Le a iabili con inue sono s a e desc i e median e media ± e o e s anda d della media e de iazione s anda d (s). Pe e i ica e se le a iabili con inue osse o dis ibui e no malmen e è s a o impiega o il es di Shapi o-Wilk. Poiché le a iabili hanno mos a o una dis ibuzione non no male le successi e analisi hanno impiega o es non pa ame ici. Il es di K uskal-Wallis e il con on o a coppie sono s a i impiega i pe compa a e la densi à di cellule immuni a ie a umo i di di e so is o ipo (PWT, PSNT, LS, FSA, MS e US), g ado (1/2/3), di e enziazione e nec osi. Il li ello di signi ica i i à del con on o a coppie è s a o aggius a o median e la co ezione di Bon e oni. La co elazione a la densi à delle di e se cellule immuni a ie e l’indice mi o ico è s a a s udia a median e la co elazione pe anghi di Spea man (una coda). I isul a i sono s a i conside a i s a is icamen e signi ica i i quando < 0,05. 40 Risul a i Re isione e g ading Nel p esen e s udio sono s a i inclusi 31 casi di STS ( abella 2). Sono s a i impiega i campioni chi u gici FFPE ad eccezione di un caso pe il quale è s a o impiega o un campione biop ico. Il 41,9% (13/31) dei casi è s a o app esen a o da me icci, segui i da Boxe (2/31, 6,5%), Epagneul B e on (2/31; 6,5%), Lab ado Re ie e (2/31, 6,5%), Pas o e Ma emmano (2/31, 6,5%), Pas o e Tedesco (2/31, 6,5%), Poin e (2/31, 6,5%), Golden Re ie e (1/31, 3,2%), Puli (1/31, 3,2%), Sibe ian Husky (1/31, 3,2%). In 3 casi non è s a o possibile de ini e la azza. Il 61,2% (19/31) dei casi e a app esen a o da cani di sesso emminile, di cui 4 emmine s e ilizza e. I maschi hanno app esen a o il 35,4% (11/31) dei casi e 2 di ques i e ano cas a i. Solo in un caso non è s a o possibile de e mina e il sesso. L’e à dei cani inclusi è comp esa a i 19 e 180 mesi con una media di 130 mesi (s = 37). La maggio pa e dei STS e a localizza o a li ello degli a i (14/31, 45,1%) ed a li ello del onco (11/31, 35,4%). Un solo caso p esen a a localizzazione a li ello della coda, 1 a li ello della es a ed 1 a li ello della ca i à o ale (pala o du o). In 3 casi non è s a o possibile iden i ica e la localizzazione della neoplasia. La maggio pa e dei casi inclusi nello s udio (15/31, 48,3%) è s a a iclassi ica a come PWT, segui i da PNST (4/31, 12,9%), LS (4/31, 12,9%), FSA (4/31, 12,9%), US (3/31, 9,7%) e MS (1/31, 3,2%). La localizzazione dei PWT è s a a nella maggio anza dei casi a li ello degli a i (9/13, 69,2%); la es an e pa e dei PWT pe cui è s a o possibile de ini e la localizzazione si o a ano a li ello del onco (4/13, 30,7%). Due PNST e ano localizza i a li ello degli a i (2/3, 66,7% ) ed 1 a li ello del onco. I LS sono s a i i o a i più equen emen e a li ello del onco (3/4, 75%) e solo in 1 caso a li ello degli a i. I FSA sono s a i localizza i a li ello del onco (2/4; 50%), degli a i (1/4; 25%) e della es a (1/4, 25%). I 3 US inclusi nello s udio e ano ispe i amen e localizza i a li ello di a i, onco e coda. Localizzazione PWT PNST LS FSA MS US To . A o 9 2 1 1 0 1 14 T onco 4 1 3 2 0 1 11 Ca i à o ale 0 0 0 0 1 0 1 Coda 0 0 0 0 0 1 1 Tes a 0 0 0 1 0 0 1 Non speci ica a 2 1 0 0 0 0 3 To . 15 4 4 4 1 3 31 Tabella 5: localizzazione e g ado dei STS. 41 I casi sono s a i classi ica i seguendo le linee guida pe il g ading ipo a e da Dennis e al. (2011). La maggio anza dei STS inclusi nello s udio p esen a a un basso g ado is ologico (G ado 1, 16/31, 51,6%). I STS di g ado in e medio hanno app esen a o il 32,2% del o ale dei casi (G ado 2, 10/31, 32,2%) men e quelli di al o g ado il 16,1% (G ado 3, 5/31, 16,1%). Conside ando i di e si is o ipi, i PWT hanno p esen a o un g ado is ologico basso nella maggio pa e dei casi (10/15, 66,7%) oppu e un g ado in e medio (5/15, 33,3%). I PNST hanno p esen a o un g ado basso nella maggio pa e dei casi (3/4, 75%) oppu e un g ado in e medio (1/4, 25%). I LS inclusi nello s udio e ano di g ado basso (2/4, 50%), g ado in e medio (1/4, 25%) e al o (1/4, 25%). I FSA inclusi hanno p esen a o un g ado in e medio (3/4, 75%) o ele a o (1/4, 25%). I US inclusi sono u i s a i classi ica i come di g ado al o. G ado PWT PNST LS FSA MS US To . 1 10 3 2 0 1 0 16 2 5 1 1 3 0 0 10 3 0 0 1 1 0 3 5 To . 15 4 4 4 1 3 31 Tabella 6 g ado e ipologia sei STS inclusi nello s udio A ee nec o iche in a umo ali sono s a e iden i ica e in 9/31 (29%) STS di cui 3 PWT, 3 US, 2 FSA e 1 LS. La pe cen uale di nec osi è s a a in e io e al 50% in 7/31 (23%) e supe io e al 50% in 2/31 (6,5%) casi en ambi app esen a i da US. L’indice mi o ico dei STS inclusi nello s udio a ia a da 0 a 61 mi osi pe 10 HPF, calcola i ispe i amen e in un PWT, un PNST ed in un FSA. L’indice mi o ico medio dell’in e o g uppo dei STS è s a o di 14,06 ± 2,97 mi osi/10 HPF (s = 16,54); 4,25 ± 2,66 mi osi/10 HPF (s =5,3) pe il g uppo dei PNST, 6,87 ± 1,95/10HPF (s = 7,57) pe il g uppo dei PWT, 12 ± 5,73 mi osi/10HPF (s = 11,46) nei LS, 25,67 ± 3,18 mi osi/10HPF (s = 5,5) nei US e 45,75 ± 10,12 mi osi/10HPF (s = 20,25) nei FSA. Il es di K uskal-Wallis ha e idenzia o una di e enza s a is icamen e signi ica i a a gli is o ipi pe quan o igua da l’indice mi o ico ( = 0,01). Il con on o a coppie ha e idenzia o che il g uppo dei FSA ha p esen a o un indice mi o ico maggio e ispe o al g uppo dei PNST ( = 0,049) e il g uppo dei PWT ( = 0,035). 48 Lin oci i T egola o i Foxp3+ Tu i i campioni inclusi nello s udio sono s a i so opos i ad analisi IHC pe l’iden i icazione di T eg median e l’an ico po an i Foxp3. L’IHC ha e idenzia o cellule con posi i i à nuclea e e ca a e izza e da dis in a mo ologia lin oci a ia sia nel con ollo posi i o che nei casi ogge o di s udio. Nei STS, i T eg Foxp3+ sono s a i iden i ica i p incipalmen e nelle a ee ca a e izza e dalla maggio e in il azione lin oci a ia, ma app esen ando una piccola quo a della o ali à dei lin oci i. I T eg Foxp3+ sono s a i osse a i p incipalmen e all’in e no di agg ega i lin oci a i pe i ascola i e di densi agg ega i compa ibili con TLSs. La p esenza di T eg Foxp3+ è s a a osse a a in 7/31 casi (22,6%) di cui 4/15 PWT (26,7%), 1/4 FSA, 1/3 US e nell’unico MS incluso nello s udio. La p esenza di T eg non è s a a osse a a all’in e no di LS e PNST. Un caso di PWT di basso g ado (caso 222/21) ha mos a o un’in il azione di T eg di usa all’in e no del pa enchima umo ale e la maggio e densi à di T eg in a- umo ali pa i a 9,6 cellule/HPF. La densi à media di Foxp3+ pe u o il g uppo dei STS è s a a di 0,56 ± 0,32 cellule/HPF (s =1,81). La densi à media di Foxp3+ è isul a a esse e legge men e maggio e nei umo i di basso g ado (0,95 ± 0,61 cellule/HPF, s = 2,4) ispe o ai umo i di g ado in e medio (0,14 ± 0,14 cellule/HPF, s = 0,44) e al o (0,16 ± 0,16 cellule/HPF, s = 0,35). La maggio e densi à media è s a a indi idua a nei PWT (0,97 ± 0,65 cellule/HPF, s = 2,55). Il es di K uskal- Wallis non ha iden i ica o alcuna di e enza signi ica i a nella densi à di Foxp3+ a g adi e is o ipi. Figu a 13: PWT di basso g ado con di usa in il azione di T eg Foxp3+. Si osse a la posi i i à nuclea e all’an ico po an i-Foxp3 (ing andimen o 20X). 49 Co elazione a cellule immuni a ie La co elazione pe anghi di Spea man (una coda) è s a a impiega a pe s udia e l’associazione a le cellule MAC387+, CD20+, MUM-1+, CD3+ e Foxp3+. La o za della co elazione è s a a alu a a come debole (0,00-0,39), mode a a (0,40-0,79) o o e (0,80-1). MAC387 CD3 Foxp3 CD20 MUM-1 MAC387 1,000 CD3 0,391 1,000 Foxp3 0,631** 0,831** 1,000 CD20 0,418* 0,695* 0,521** 1,000 MUM-1 0,462** 0,692* 0,627** 0,278 1,000 Tabella 7: indici di co elazione di Spea man ( * < 0,05; ** < 0,01). Sono s a e osse a e delle mode a e co elazioni posi i e a densi à di TAMs MAC387+ e le di e se ipologie di TILs ad eccezione dei CD3+. Ques ’ul imo da o de e esse e conside a o alla luce del a o che solamen e 10 campioni sono s a i so opos i ad IHC pe la ice ca dei CD3+. Sono s a e osse a e co elazioni posi i e mode a i- o i a le di e se ipologie di TILs: la densi à di CD3+ ha mos a o una mode a a co elazione posi i a con CD20 e MUM-1 e una o e co elazione posi i a con il nume o di Foxp3+. Co elazione a cellule immuni a ie e indica o i p ognos ici Il es di K uskal-Wallis non ha indi idua o alcuna di e enza s a is icamen e signi ica i a a i di e si g adi e is o ipi di STS. Nessuna di e enza signi ica i a è s a a osse a a a i di e si sco e che compongono il g ading dei STS (Sco e di e enziazione, sco e nec osi e sco e mi osi). La co elazioni pe anghi di Spea man non ha indi idua o una co elazione s a is icamen e signi ica i a a la densi à delle di e se ipologie di cellule immuni a ie e l’indice mi o ico. Le di e se localizzazioni dei STS non hanno mos a o di e enze s a is icamen e signi ica i e nella densi à di cellule immuni a ie. 50 No Nume o egis o Re isione MAC387 /HPF CD20 /HPF MUM-1 /HPF FOXP3/ HPF CD3 /HPF 1 277/21 FSA 0 4 0 0 - 2 126/21 (1) FSA - 2,1 0 0 - 3 22/21 (2) PNST 0 0,3 0 0 - 4 33/22 PNST 0 0 0 0 - 5 349/20 PWT 0 3,8 0 0 2 6 45/18 PWT 0,1 2,1 0 0 - 7 114/20 PWT 0 4,3 0 0 1 8 321/10 US 0 0 0 0 - 9 69/21 PWT 0,3 8,8 0 1,2 7,4 10 324/21 PWT 85,5 39 12 3,4 415 11 222/21 PWT 1,5 1,2 0 9,6 8,6 12 488/20 US - 0 0,3 0,8 - 13 98/15 LS 0 0 0 0 - 14 167/12 LS 4,7 0 0 0 0 15 190/10 LS 0 0 0 0 - 16 5/10 LS 0 0 0 0 - 17 368/16 PNST 0 0,1 0 0 0 18 60/10 PWT 1,1 0 0 0 - 19 173/13 PWT 0 0 0 0 - 20 235/16 PWT 0 0 0 0 - 21 288/16 PWT 0 0 0 0 - 22 43/11 PWT 0,9 0 0 0 - 23 321/21 US 4 1,5 0 0 - 24 147/10 PWT 39,3 39 0 0,3 0,5 25 191/20 (4) PNST 0 0,3 0 0 - 26 341/07 PWT 0,3 2,6 0 0 - 27 175/16 (1) PWT 0 0 0 0 - 28 255/11 PWT 0,9 0 0 0 0 29 23/09 FSA 0 0 0 0 - 30 537/20 MS 0,4 2,7 0 0,8 - 31 282/09 FSA 7,3 64 14,9 1,4 88,1 Tabella 8: densi à delle cellule MAC387+, CD20+, Foxp3+ e CD3+ nei casi ogge o di s udio. 51 Figu a 14: TLS si ua a ai ma gini di un PWT di basso g ado. Si no a la p esenza di un’a ea densamen e popola a da lin oci i B CD20+ ci conda a da nume osi lin oci i T CD3+ ed alcune PCs MUM-1+ (ing andimen o 10x). CD3 CD20 MUM-1 HE 52 Discussione I STS app esen ano un g uppo e e ogeneo di neoplasie di o igine mesenchimale e cos i uiscono una a le ipologie più comuni di neoplasie cu anee e so ocu anee del cane. I STS sono adizionalmen e conside a i umo i immunologicamen e “ eddi” [75], [76]. Tu a ia, s udi dei STS dell’uomo sugge iscono che alcuni umo i accompagna i da una maggio e in il azione di cellule immuni a ie p esen ano una p ognosi più a o e ole e che is o ipi di e en i mos ano una di e sa composizione del TME [38], [75]. Il p esen e s udio cos i uisce il p imo en a i o di ca a e izzazione es ensi a del TME dei STS del cane. Sono s a i e ospe i amen e seleziona i 31 STS con o igine a li ello cu aneo e so ocu aneo e o ale al ine di ca a e izza ne il TME median e IHC pe i ma ke CD3, CD20, MUM-1, Foxp3, MAC387. Le ca a e is iche gene ali della popolazione ogge o di s udio sono s a e compa ibili con la no male p esen azione dei STS del cane. I cani di sesso emminile (19/31) sono s a i di poco maggio men e app esen a i, ma la le e a u a non ipo a alcuna p edisposizione di sesso pe i STS [7]. I STS in e essano p incipalmen e cani anziani con un’e à media di inso genza comp esa a i 10 e gli 11 anni [7]. Conco demen e, l’e à media della popolazione ogge o del p esen e s udio è s a a di 130 mesi. Solo due casi hanno in e essa o cani di gio ane e à p esen an i un LS di al o g ado ed un FSA di g ado in e medio. Anche pe quan o igua da la localizzazione, i casi inclusi hanno ip odo o il no male compo amen o dei STS p esen andosi sop a u o a li ello degli a i (14/31, 45,1%) e del onco (11/31, 35,4%). I STS del cane engono adizionalmen e conside a i come un g uppo ai ini p ognos ici [7]. Tu a ia, sia pe i STS del cane che dell’uomo, i sono p o e che sos engono l’esis enza di di e enze nel compo amen o a gli is o ipi [2], A segui o della e isione is opa ologica, l’is o ipo maggio men e app esen a o nello s udio è s a o il PWT (15/31), al quale la le e a u a a ibuisce un compo amen o biologico meno agg essi o e ecidi e più a e ispe o agli al i is o ipi agg uppa i nei STS [2]. Al i so o ipi meno app esen a i sono s a i il PNST (4/31), LS (4/31), FSA (4/31), US (3/31) e MS (1/31). Tu a ia, la ipizzazione dei STS è complica a dalla con empo anea p esenza di più pa e n is ologici e dalla condi isione di alcuni pa e n a più en i à pa ologiche [1], [8]. Pe an o, il manca o impiego di ma ke IHC che suppo ino la e isione is opa ologica dei casi inclusi cos i uisce un po enziale limi e del p esen e s udio. Il g ado is ologico è il pa ame o maggio men e impiega o pe la de inizione della p ognosi dei STS [34], [35]. I STS di basso g ado sono quelli più equen emen e iscon a i e p esen ano la p obabili à più bassa di ecidi a e e di de e mina e la o mazione di me as asi [1]. La maggio anza dei STS inclusi nello s udio p esen a a un basso g ado is ologico (16/31, 51,6%), segui ano quelli di g ado in e medio (10/31; 32,2%) e quelli di al o g ado (5/31, 16,1%). Un 53 ele a o indice mi o ico è s a o associa o a una maggio e p opensione alla ecidi a ed una maggio e p ecoci à della s essa, allo s iluppo di me as asi e un ad un ido o empo di sop a i enza [1]. Nel p esen e s udio è s a a e idenzia a una di e enza s a is icamen e signi ica i a nell’indice mi o ico dei di e si is o ipi di STS ( = 0,01) a suppo o della eo ia secondo cui le di e enze nel compo amen o degli is o ipi possa esse e spiega o da una maggio e p opensione di alcune ipologie a p esen a si con un g ado e/o un indice mi o ico ele a i [1]. In pa icola e, il con on o a coppie ha e idenzia o che il g uppo dei FSA ha p esen a o un indice mi o ico maggio e ispe o al g uppo dei PNST ( = 0,049) ed al il g uppo dei PWT ( = 0,035). Un ul e io e limi e lega o alla na u a e ospe i a del p esen e s udio è app esen a o dall’assenza di in o mazioni in me i o alla ecidi a locale, allo s iluppo di me as asi ed ai empi di sop a i enza a segui o della imozione chi u gica. Di e se on i hanno e idenzia o come i TAMs siano la ipologia cellula e più abbondan e nel TME dei STS dell’uomo e che ques i siano più equen emen e pola izza i M2 [38], [78], [79]. In uno s udio basa o su 38 STS del cane i TAMs Iba1+ hanno app esen ano dal 6% al 62% delle cellule nel campo mic oscopico (media = 21%) ed una co elazione posi i a è s a a osse a a a l’a ea occupa a dai TAMs e l’indice mi o ico [77]. Tu a ia, ques ’ul imo la o o non ha ope a o una dis inzione a i di e si is o ipi di STS e non ha impiega o ma ke che consen isse o la dis inzione M1/M2. Nel p esen e s udio il ma ke MAC387 è s a o impiega o pe l’iden i icazione dei TAMs M1. Le cellule mac o agiche MAC387+ hanno p esen a o una dis in a mo ologia is ioci oide con equen i p olungamen i cellula i in con a o con le cellule neoplas iche. Hanno p esen a o MAC387+ in a umo ali 13/29 casi (44,82%). I TAMs MAC387+ sono s a i i o a i spa si all’in e no del pa enchima umo ale e occasionalmen e in piccoli agg ega i. La densi à di MAC387+ ha p esen a o un ampia a iabili à a i casi inclusi (media=5,04 ± 3,1 cellule/HPF; s = 17,12): la p esenza di MAC387+ non è s a a osse a a in più della me à dei casi e i casi posi i i hanno gene almen e mos a o una densi à bassa ad eccezione di 3/29 casi con una densi à mode a a-ele a a. I mac o agi pola izza i M1 sono con addis in i dalla p oduzione di ci ochine p o-in iamma o ie, a cui TNFa, INFg IL-1b, IL-6 e IL-12 che con ibuiscono alla s imolazione della ispos a immuni a ia [48]. Conco demen e, nel p esen e s udio la densi à di TAMs M1 MAC387+ ha mos a o una mode a a co elazione posi i a (Tabella 7) con la densi à di di e se ipologie di TILs (CD20, MUM-1 e Foxp3). La densi à di MAC387 ha mos a o una debole e non signi ica i a co elazione con la densi à di CD3+. Tu a ia, ques ’ul imo da o de e esse e analizza o alla luce del a o che solamen e 10 campioni sono s a i so opos i ad IHC pe la ice ca dei CD3+. Risul a i simili pe i STS dell’uomo sono ipo a i in un la o o di Deng e al. (2020) 54 basa o sull’analisi dei da i asc i omici di 869 STS, il quale ha iden i ica o e classi ca a e izza e da un dis in o p o ilo immuni a io: il g uppo A è s a o ca a e izza o da un’ ele a a in il azione di mac o agi M2 in associazione ad una sca sa p esenza di CD4+, il g uppo B si è i ela o esse e domina o dalla p esenza di mac o agi non pola izza i M0 men e il g uppo C, p esen an e un ele a a in il azione di mac o agi M1, dimos a a anche una maggio e p esenza di CD8+ e PCs [38]. Le co elazioni osse a e nel p esen e s udio sugge iscono che anche nei STS del cane i TAMs con ibuiscano a modella e il TME di ques e neoplasie e che i TAMs M1 p omuo ano lo s iluppo di una ispos a immuni a ia an i umo ale a o endo il ichiamo di di e se cellule dell’immuni à ada a i a. Al con a io, I TAMs M2 sono no i pe la p oduzione di ci ochine an in iamma o ie quali IL-10 e TGF-b che con ibuiscono allo spegnimen o della ispos a immuni a ia con o le cellule umo ali [43], [48]. Di e se on i indicano che i TAMs M2 cos i uiscono la ipologia cellula e maggio men e app esen a a nel TME dei STS dell’uomo [38]. Pe an o, u u e ice che do ebbe o indaga e la p esenza di TAMs M2 nei STS del cane, il ela i o e e o sulla composizione del TME ed il compo amen o di ques e neoplasie. Nel p esen e s udio non sono s a e osse a e di e enze s a is icamen e signi ica i e nella densi à di TAMs M1 a STS di di e so g ado. Tu a ia, sebbene in modo non signi ica i o, i STS di g ado basso (8,3 ± 5,69 cellule HPF, s = 22,76) e in e medio (7,41 ± 6,27 cellule HPF, s = 2,27) hanno mos a o una densi à media di TAMs M1 maggio e ispe o a quelli di g ado al o (1,33 ± 1,33 cellule/HPF, s = 2,3). Inol e, con a iamen e a quan o ipo a o da Fino ello e al. pe i TAMs Iba1+ [77], non è s a a e idenzia a nessuna co elazione posi i a con l’indice mi o ico. I TILs comp endono di e se ipologie cellula i quali p incipalmen e CD4+, CD8+, T eg, lin oci i B CD20+, PC e cellule NK [53]. Da i in me i o al STS dell’uomo indicano che i STS ca a e izza i da una maggio e in il azione di CD4+, CD8+ e CD20+ p esen ano una p ognosi più a o e ole ispe o a umo i immunologicamen e ina i i [38]. Nel p esen e s udio i ma ke CD3, Foxp3, CD20 e MUM-1 sono s a i ispe i amen e impiega i pe ice ca di lin oci i T, T eg, lin oci i B e PCs. I lin oci i T CD3+ comp endono sia i lin oci i Th che i CTLs i quali sono conside a i i p incipali a o i della ispos a an i umo ale essendo ispe i amen e depu a i all’a i azione delle cellule e e ici median e la p oduzione di ci ochine ed alla lisi di e a delle cellule neoplas iche [45]. Hanno p esen a o CD3+ in a umo ali 7/10 casi (70%) con una densi à ampiamen e a iabile a i casi analizza i (media = 52 ± 41,2 cellule/HPF; s = 130,30). Nel p esen e s udio non è s a o possibile impiega e ma ke u ili alla iden i icazione dei Th e dei CTLs. S udi u u i do ebbe o esse e mi a i a dis ingue e le di e se so opopolazioni di lin oci i T al ine ca a e izza e ul e io men e il TME di ques e neoplasie. La p esenza di lin oci i B è s a a associa a ad 55 un’aumen a a sop a i enza nei STS dell’uomo indipenden emen e dalla con empo anea p esenza di lin oci i CD8+. Inol e, la p esenza di cellule B è isul a a esse e p edi i a di una miglio e ispos a al a amen o con ICIs [38], [75], [79]. Nel p esen e s udio, i lin oci i B CD20+ in a- umo ali sono s a i osse a i in 16/31 (51%) casi con una densi à ampiamen e a iabile (media= 5,68 ± 2,6 cellule/HPF; s = 14,49). I T eg sono no i pe la lo o azione p o- umo ale do u a alla p oduzione di ci ochine immuno-sopp essi e quali IL-10, IL-35 e TGFb che de e minano la sopp essione della ispos a immuni a ia an i umo ale [45], [64]. La p esenza di T eg nel TME dei STS dell’uomo è s a a desc i a da di e si au o i e la s essa semb a esse e p edi i a di un aumen a o ischio di ecidi a locale [38], [80]. La p esenza di T eg nei STS del cane non è mai s a a in es iga a. Tu a ia, uno s udio ipo a una quan i à signi ica i amen e maggio e di T eg ci colan i in cani a e i da STS [76]. Nel p esen e s udio i T eg sono s a i ile a i nel pa enchima umo ale di 7/31 STS (22,6%) con una densi à bassa se pa agona a a quella di al e ipologie di cellule immuni a ie (media= 0,56 ± 0,32 cellule/HPF; s =1,81). Tu a ia, ale da o de e esse e in e p e a o enendo con o che i T eg app esen ano no malmen e una pa e mino i a ia del o ale dei lin oci i T CD3+. La p esenza di T eg Foxp3+ nei STS del cane sugge isce che ques i possano app esen a e un po enziale meccanismo di e asione immuni a ia s u a o da ques e neoplasie. Ul e io i s udi sono necessa i pe de ini e l’impa o p ognos ico di ques ’ul imi sul compo amen o dei STS del cane. La p esenza di PC è s a a associa a ad una p ognosi più a o e ole in di e se ipologie umo ali dell’uomo e alcune analisi sugge iscono che le PC abbiano un signi ica o p ognos ico più o e ispe o ai lin oci i B [72]. Nel p esen e s udio 3/31 STS hanno mos a o la p esenza di PCs MUM-1+ in il a e all’in e no del essu o neoplas ico e agg uppa e all’in e no di densi agg ega i lin oci a i. Le densi à delle di e se ipologie di TILs hanno mos a o a lo o co elazioni posi i e s a is icamen e signi ica i e (Tabella 7). I CD3+ hanno p esen a o una mode a a co elazione posi i a con i CD20+, con le PCs MUM-1+ ed una o e co elazione posi i a con i Foxp3. Ques ’ul imi hanno mos a o una mode a a co elazione posi i a sia con i CD20+ le cellule MUM-1+. Nessuna di e enza s a is icamen e signi ica i a nella densi à dei TILs è s a a osse a a in STS di di e so g ado e nemmeno l’indice mi o ico ha mos a o alcuna co elazione con nessuna delle ipologie di TILs. La composizione del TME di STS dell’uomo ha mos a o di e enze sos anziali in base agli is o ipi [38]. Pe an o, è ipo izzabile che anche nei STS del cane i di e si is o ipi p esen ino una dis in a composizione del TME e che la s essa possa con ibui e alle di e enze nel compo amen o di ques e neoplasie. Tu a ia, p obabilmen e a causa della sca sa nume osi à di alcune ipologie di STS, il p esen e s udio non ha indi idua o alcuna di e enza s a is icamen e signi ica i a nella 56 composizione del TME dei di e si is o ipi. S udi u u i bene ice ebbe o dell’inclusione di un nume o maggio e di casi di de e mina i is o ipi. Nel p esen e s udio non è s a a osse a a alcuna di e enza s a is icamen e signi ica i a nella densi à di MAC387+, CD20+, MUM-1+, CD3+ e Foxp3+ a STS di di e so g ado, di e enziazione e con di e sa es ensione della nec osi. Nessuna co elazione è s a a osse a a a l’indice mi o ico e la densi à delle di e se cellule immuni a ie. Sebbene un la o o di Vascella i e al. ipo i una maggio e in il azione di cellule immuni a ie nei FSA o iginan i a li ello di possibili si i di iniezione [25], nel p esen e s udio la localizzazione del STS non ha a u o alcuna in luenza sulla densi à delle di e se cellule immuni a ie. I isul a i del p esen e s udio indicano che, benché la maggio pa e dei STS p esen i una in il azione nulla o sca sa di cellule immuni a ie, una pa e mino i a ia dei STS è accompagna a da una ma ca a a i azione della ispos a immuni a ia ca a e izza a dalla p esenza di abbondan i TAMs M1 MAC387+, lin oci i T CD3+, lin oci i B CD20+ e PCs MUM-1+. Ques ’ul imi casi sono s a i ca a e izza i dalla p esenza di densi agg ega i pe i ascola i ip oducen i l’o ganizzazione s u u ale degli o gani lin oidi seconda i e in e p e a i come TLSs (Figu a 14). Nelle TLSs le DCs, i lin oci i T e B in e agiscono a lo o dando luogo di e si meccanismi an i umo ali, a cui l’a i azione e l’espansione clonale di cellule e e ici, la p oduzione di an ico pi e lo swi ch eno ipico an ico pale [45]. Nel p esen e s udio, ali s u u e sono s a e osse a e sia in sede in a- umo ale che in p ossimi à dei ma gini e hanno p esen a o una zona icca di cellule T CD3+ in associazione a un cen o ge mina i o di cellule B spesso in p ossimi à di PCs MUM-1+. Le TLSs osse a e nei casi ogge o di s udio si sono p esen a e a di e si s adi ma u a i i a iando da densi agg ega i lin oci a i ino a s u u e simil- ollicola i ben o ganizza e e p esen an i cen i ge mina i i p ima i o seconda i. Inol e, le TLSs sono s a e i o a e in s e a icinanza di s u u e ascola i ca a e izza e dalla p esenza di cellule endo eliali di o ma cubica e in e p e a e come HEVs. Analogamen e, il SIC (Sa coma Immune Classi ica ion) p opos o da Pe i p ez e al. pe i STS dell’uomo ha e idenzia o come i umo i p esen an i la maggio e in il azione di cellule immuni a ie siano ca a e izza i dalla maggio e esp essione di CXCL13 e dalla p esenza di TLSs sugge endo che ques e s u u e siano ondamen ali pe la genesi di una ispos a immuni a ia an i umo ale. Inol e, la p esenza di TLSs è isul a a esse e un a o e p edi i o pe la ispos a al a amen o con ICIs [75]. Tu a ia, la p esenza di T eg all’in e no di ali s u u e è s a a dimos a a in luenza e nega i amen e la capaci à delle s esse di gene a e un’e icace ispos a immuni a ia a segui o del a amen o con ICIs [81]. Nel p esen e s udio i T eg sono spesso s a i i o a i all’in e no di TLSs, ma app esen ando una piccola pa e dei CD3+. 57 Conclusioni Il p esen e s udio cos i uisce il p imo en a i o di ca a e izzazione es ensi a dei mic oambien e immuni a io dei STS del cane. I isul a i indicano che, sebbene i STS del cane p esen ino gene almen e una sca sa immunogenici à, alcuni casi sono ca a e izza i da un’in il azione più o meno abbondan e di cellule immuni a ie con unzione an i umo ale. I TAMs M1 hanno mos a o una dis ibuzione di usa all’in e no del essu o neoplas ico, men e i TILs sono s a i osse a i p incipalmen e in sede pe i ascola e. La densi à dei TAMs M1 ha mos a o una co elazione posi i a con la densi à di lin oci i B e PCs sugge endo che i TAMs condizionino la genesi di un’e icace ispos a immuni a ia an i umo ale nei STS del cane. L’osse azione di T eg in il an i i STS consen e di ipo izza e che ques i possano app esen a e un possible meccanismo di e asione immuni a ia in ques e neoplasie. I STS ca a e izza i da un’ele a a in il azione di cellule immuni a ie si sono dis in i pe la p esenza di densi agg ega i lin oci a i con una s u u a simil ollicola e in e p e a e come TLSs. Non sono s a e indi idua e di e enze signi ica i e nella composizione del TME di STS di di e so g ado e non sono s a e osse a e co elazioni con l’indice mi o ico. Tali isul a i sono compa ibili con le conoscenze in me i o ai STS dell’uomo e suppo ano il po enziale impiego dei STS del cane come modello spon aneo pe lo s udio del TME di ques e neoplasie e lo s iluppo di nuo i app occi e apeu ici a a o e di en ambe le specie. Ul e io i ice che do ebbe o esse e inalizza e a alu a e l’e e o della composizione del TME sulla ecidi a locale, lo s iluppo di me as asi e la sop a i enza complessi a. Inol e, da a l’ele a a e e ogenei à della classe dei STS, una pa icola e a enzione do ebbe esse e i ol a allo s udio di e en uali di e enze nella composizione del TME di is o ipi dis in i. 64 [64] K. Sakai e al., ‘Associa ion o umou -in il a ing egula o y T cells wi h ad e se ou comes in dogs wi h malignan umou s’, Ve Comp Oncol, ol. 16, no. 3, pp. 330–336, Sep. 2018, doi: 10.1111/VCO.12383. [65] J. 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