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VALIDACIÓN DEL MÉTODO CUANTITATIVO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN UN ENTORNO ACREDITABLE POR ENAC. VALIDATION OF THE QUANTITATIVE METHOD OF A PROTEIN DETERMINATION IN A CONTEXT ACREDITABLE BY ENAC. Autor/es Andrea Pérez Lite Director/es Agustín Ariño Moneva, Jesús Betrán Aso y Antonio López Aliaga. Facultad de Veterinaria 2021 Trabajo Fin de Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Agradecimientos Empecé la carrera en el año 2010, con mucha ilusión sin saber lo que el futuro me depararía, dos meses después, recibí una ansiada llamada, mi primer trabajo en un laboratorio. Desde ese mismo día, luché por poder compaginar los estudios con la jornada completa del trabajo, fue realmente complicado en ciertos momentos. Pero desde luego sin la ayuda de muchos de los profesores que han pasado por mis años de grado (8 ni más ni menos) hubiera sido imposible y sobre todo agradecer a los profesores de los últimos años por las facilidades, la amabilidad y la comprensión que han mostrado siempre conmigo. Agustín Ariño darte las gracias por ofrecerte de manera desinteresada en ayudarme con este trabajo. Y no puedo olvidarme de todos compañeros de clase, prácticas… que he conocido en esta aventura y también han aportado su granito. ¡¡GRACIAS!! ¡¡GRACIAS!!, a mis compañeros del Laboratorio Agroambiental, quienes siempre me han visto como su “HIJICA”, me han animado siempre a continuar cuando tiraba la toalla, además de formarme en todo lo relacionado con aspectos laborales, son muchos y no podría nombrarlos a todos, pero en especial a Antonio López y Jesús Betrán por aventurarse (conociéndome) a ayudarme con el Trabajo Fin de Grado, sin ellos no hubiera sido lo mismo. Finalmente a mis padres, mi marido y ahora mi futuro a bebe en camino, ¡¡MIL GRACIAS!!, por haber compartido el sufrimiento conmigo, por secar las lagrimas y por brindar los aprobados, pero sobre todo por confiar hasta el último día que yo si que podría. ÍNDICE IÍNDICE DE TABLAS IIÍNDICE DE FIGURAS 1RESUMEN ……………………………………………………………..………………………………………………1 2ABSTRACT ………………………………………………………….………………………………………………….2 3INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………….……………………..….3 3.1 ¿Qué es una validación? ……………………………………………………………………………………3 3.2 Proceso de validación …………………………………………………………………..…………………..4 3.3 Entorno acreditable …………………………………………………………………………………..……..5 3.4 Importancia del análisis de proteína …………………………………………………………………5 3.5 Comparativa del análisis de proteína mediante método Dumas respecto a método Kjeldahl………………………………………………………………………………………….......6 3.6 Requisitos del Sistema de calidad..……………………………………………………………………6 3.7 Parámetros de caracterización de la validación……………….………………………..………7 3.7.1 Exactitud ………………………………..…………………………..………………………………….7 3.7.2 Precisión…………………………………………………………….….……………………………….8 3.7.3 Límite de detección y cuantificación…………………….…………………………………9 3.7.4 Incertidumbre…………………………………………………..…………………………………….9 3.8. Criterios previos a la validación ………………………………..…………………………………..10 4JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS …………………………………………..……………………………………12 5METODOLOGIA …………………………………………………………..……………………………….……..13 5.1 Desarrollo del método analítico Dumas de determinación cuantitativa de proteína en productos cárnicos. ……………………………………………………………………13 5.2 Obtención de datos de validación mediante revisiones bibliográficas de datos (Validación retrospectiva). ………………………………………………………………….…..…… 14 5.3 Obtención de datos de resultados de análisis experimentales (validación prospectiva). ………………………………………………………………………………..……..……….16 5.4 Cálculos de los parámetros de caracterización del método ……….………..…………23 5.4.1 Exactitud, precisión e incertidumbre ……………………………………23 5.4.2 Límites de detección y cuantificación……………….….……………….23 6RESULTADOS Y DISCUSIÓN …………………………………………………………….……………..…….25 6.1 Aprobación y distribución del método………………………………………………...…..25 6.2 Validación retrospectiva, cálculo de incertidumbre partiendo de los datos obtenidos. ………………………………………………………………………………………………….…26 6.3 Validación prospectiva, cálculo de incertidumbre partiendo de los datos obtenidos y resultados de los parámetros de caracterización ……………………….26 6.3.1 Exactitud…………………………………………………..………………………………26 6.3.2 Precisión……………………………………………………………………………………27 6.3.3 Límites de detección y cuantificación…………………………………………28 6.3.4 Cálculo de la incertidumbre……………….………………………………………30 6.4 Valoración de las incertidumbre de los dos métodos de validación.…………33 7CONCLUSIONES ……………………………………………………………………….………………………….34 8CONCLUSIONS ……………………………………………………………………….……………………………35 9VALORACIÓN PERSONAL …………………………………………………………..…………………………36 10BIBLIOGRAFIA …………………………………………………………..…………………………………………37 11ANEXOS ………………………………………………………………………………………………………………39 Anexo I Comparativa métodos Dumas – Kjeldahl………………….………………………………39 Anexo II tabla de la distribución t-student ………………..…………………………………………44 Anexo III Método de análisis cuantitativo de proteína por Dumas en productos cárnicos …………………….…………………………………………………………………………………..……45 IÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Valores de proteína para la validación retrospectiva de materiales interlaboratorio desde 2009 a 2019 buscados en los cuadernos de interlaboratorios del laboratorio. Tabla 2. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 11/11/2020 Tabla 3. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 12/11/2020 Tabla 4. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 13/11/2020 Tabla 5. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4484/17 en el día 11/11/2020 Tabla 6. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4484/17 en el día 12/11/2020 Tabla 7. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4484/17 en el día 13/11/2020 Tabla 8. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4635/19 en el día 11/11/2020 Tabla 9. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4635/19 en el día 12/11/2020 Tabla 10. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4635/19 en el día 13/11/2020. Tabla 11. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña Material de Referencia 1Rango Bajo. Formato acreditado, propio del Laboratorio Agroambiental. Tabla 12. Valores obtenidos en el programa del aparato LECO de blancos con cápsula de estaño para el cálculo de límites de detección y cuantificación. Tabla 13. Resultados obtenidos de la validación retrospectiva de materiales de referencia antiguos con el programa propio del laboratorio ( PRG-UGC-03 rev1) acreditado por ENAC Tabla 14. Valores obtenidos del formato (FT-UGC-427 rev 1) para comprobación de la veracidad del método de validación. Tabla 15. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango bajo. Tabla 16. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango medio. Tabla 17. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango alto. Tabla 18. Tabla con los resultados de las deviaciones estándar obtenidas según formato propio del laboratorio (FT-UGC-425. Rev 1) . Rango bajo – medio - alto Tabla 19. Valores % de proteína, desviación estándar y media obtenidos del análisis de proteína con método Dumas del Material de Referencia Medio para comprobación del límite de detección Tabla 20. Valores % de proteína, desviación estándar y media obtenidos del análisis de proteína con método Dumas del Material de Referencia Medio para comprobación del límite de cuantificación Tabla 21. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. Tabla 22. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. Tabla 23. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. IIÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema del proceso de validación (Duffau et al, 2010). 1 1RESUMEN El objetivo principal de este trabajo es la puesta a punto y validación de la determinación de proteína por el método Dumas en el Laboratorio Agroambiental del Gobierno de Aragón. Interesa al Laboratorio la puesta en marcha del método en matrices de productos cárnicos para su posterior acreditación por ENAC. El Laboratorio dispone de dos procedimientos analíticos para proteína, el método Kjeldahl y el método Dumas, y ya se ha comprobado en otras matrices que no presentan diferencias significativas en sus resultados. Como primer paso se ha redactado la descripción del método de análisis cuantitativo de proteína por Dumas en productos cárnicos. Después, se desarrolla un plan de validación. Al tratarse de un método que se usa desde hace tiempo en el Laboratorio, resulta posible comparar dos formas de validación: prospectiva y retrospectiva. La validación retrospectiva, obteniendo resultados que provienen de la participación en ejercicios de intercomparación. Se realizó una búsqueda en los registros de ejercicios de intercomparación realizados en los últimos 10 años, encontrando más de 40 ejercicios. De estos, solo 22 reunían toda la información necesaria para este tipo de validación. La segunda forma de validar, la prospectiva, se lleva a cabo a través de la repetición analítica, en al menos 3 días diferentes, de materiales de referencia de valor conocido, obteniendo resultados que con un tratamiento estadístico permiten validar el método. En ambas validaciones obtenemos la veracidad, la precisión y finalmente la incertidumbre, lo que permite compararlas y concluir que los resultados obtenidos son similares. Todo el proceso ha sido desarrollado en un Laboratorio acreditado por la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC), lo que hace posible que este método llegue a ser acreditado. Se concluye que el método Dumas es aplicable a la determinación de proteína en productos cárnicos con unos parámetros adecuados al uso previsto. Palabras clave: validación, interlaboratorios, método Dumas, cárnicos, proteína 2 2ABSTRACT The main objective of this work is the development and validation of the protein determination by the Dumas method in the “Laboratorio Agroambiental del Gobierno de Aragón”. The Laboratory is interested in the implementation of the method in matrices of meat products for its subsequent accreditation by ENAC. The Laboratory has two analytical procedures for protein, the Kjeldahl method and the Dumas method, and it has already been proven in other matrices that there are no significant differences in their results. As a first step, a description of the method for quantitative protein analysis by Dumas in meat products has been written. Then, a validation plan is developed. As this method has been used for a long time in the laboratory, it is possible to compare two forms of validation: prospective and retrospective. Retrospective validation, obtaining results from participation in intercomparison exercises. A search of the records of intercomparison exercises conducted in the last 10 years found more than 40 exercises. Of these, only 22 had all the information necessary for this type of validation. The second form of validation, prospective validation, is carried out through the analytical repetition, on at least 3 different days, of reference materials of known value, obtaining results that, with statistical treatment, allow the method to be validated. In both validations we obtain the trueness, precision and finally the uncertainty, which allows us to compare them and conclude that the results obtained are similar. The whole process has been developed in a laboratory accredited by the National Accreditation Entity (ENAC), which makes it possible for this method to be accredited. It is concluded that the Dumas method is applicable to the determination of protein in meat products with parameters suitable for the intended use. Key words: validation, interlaboratory, Dumas method, meat, protein. 3 3INTRODUCCIÓN 3.1 ¿Qué es una validación? La validación de un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados entregados por dicho método son confiables. Cuando se realiza la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines previstos. La validación es el objetivo principal de este trabajo ya que es requerida en normas sobre sistemas de gestión de la calidad, particularmente en la norma ISO 17025 sobre requisitos generales para laboratorios de calibración y ensayo. Es importante que el laboratorio tenga claro antes de iniciar la validación cuales son los requerimientos del método para establecer el alcance de la validación. Es esencial conocer el método a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, su concentración (nivel, límite de detección, límite de cuantificación, etc.) y la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar (Lazos y Hernández, 2004). El resultado de una validación es una declaración sobre el cumplimiento, o incumplimiento, de los requisitos para el uso o aplicación dada, sustentada en evidencias, necesariamente objetivas. En la Figura 1 se muestra un esquema de tipos de validaciones según tipos de métodos a validar. La validación puede ser compleja, pero cuando se utiliza correctamente, puede ahorrar tiempo y dinero a largo plazo permitiendo un trabajo más fiable y generando unos procesos más controlados y estables. Conocer el proceso ayudará a reducir los resultados no conformes y facilitará la demostración en una auditoría de que se tiene el control de los procesos (López, 2012). Figura 1. Esquema del proceso de validación (Duffau et al, 2010). 10 𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒)𝑑𝑒)𝑐𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛=10)𝑥)𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛)𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟)𝑑𝑒)10)𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 Para ambas determinaciones, se utilizan blancos, que son cápsulas de estaño que no contienen el analito de interés, pero que utiliza todos los pasos del procedimiento solo con los reactivos. 3.7.4 Incertidumbre: Rango de valores entre los que se encuentra el resultado correcto con una determinada probabilidad (generalmente el 95%). La Norma UNE/ISO/IEC 17025:2017 de “Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración” pone especial énfasis en la necesidad de estimar la incertidumbre del ensayo (ISO 17025:2017, 2017) y por ello es un objetivo en la validación. La incertidumbre se puede estimar en base al modelo “caja negra”. Hay ciertos términos que configuran la estimación de la incertidumbre por el modelo global o caja negra, que son denominados “contribuciones a la incertidumbre” (Reyes y Cerezo, 2009): - Incertidumbre del material de referencia - Diferencia entre del valor medio obtenido y el de referencia del Material de Referencia Certificado (MRC) (también conocido como sesgo o recuperación) - Reproducibilidad de la medición Por tanto, los términos a tener en cuenta son: i. Incertidumbre del MRC ii. Veracidad o Exactitud iii. Precisión 𝑈𝑟𝑒𝑙) ( % ) =2𝑥 WX 𝐶𝑉 √ 𝑛)𝑑𝑖𝑎 Y !+𝑢)(%)+ [ 𝑅)(%) √ 3 ! \ Siendo: Urel (%): incertidumbre expandida relativa u (%): Incertidumbre material de referencia CV: precisión aplicada como control de calidad R: sesgo máximo de la recuperación (%) n: nº de repeticiones día 11 La incertidumbre se expresa asociada al valor central en los informes de resultados. 3.8 Criterios previos para la validación Antes de proceder a la validación, y en función de las necesidades de uso de los resultados, debe contarse con algún criterio que deberá cumplir el método para considerarlo adecuado. En ocasiones se dispone de criterios establecidos por la legislación, pero en este caso no disponemos de requisitos que sean de obligado cumplimiento. Al no disponer de esos criterios resulta más complicado establecer objetivos de validación, en estos casos la fuente de información debe ser, además de las diferentes referencias bibliográficas, la propia experiencia adquirida en la puesta a punto del método, nuestra experiencia con métodos similares o la experiencia del “mercado”. Se opta por establecer un criterio para la desviación estándar de modo que sea menor de 0,91, que es el correspondiente al promedio de las desviaciones estándar de todos los materiales de referencia recopilados durante los últimos 10 años. 12 4JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS La realización de este trabajo busca, principalmente, la caracterización del método Dumas de análisis de proteína en productos cárnicos, generando una validación completa, con la estimación de la incertidumbre, que nos indicará los límites dentro de los cuales se encuentra nuestro dato con una probabilidad del 95% (K=2 coeficiente de cobertura). En el laboratorio donde se realizan los análisis experimentales existe un interés especial en la implantación del método Dumas como alternativa válida al método Kjeldahl. Fundamentalmente por las mejoras que esta metodología aporta al día a día, como la rapidez analítica, las mejoras medioambientales o la seguridad. El objetivo principal es la validación del método Dumas, comparando dos métodos de validación (retrospectivo y prospectivo). Aunque para poder llegar a una conclusión final, es necesario alcanzar unos objetivos parciales: 1Desarrollar el método de determinación cuantitativa de proteína mediante el método Dumas en productos cárnicos. 2Obtener datos de validación mediante revisiones bibliográficas de datos (Validación retrospectiva), para proceder a la validación una vez recopilados. 3Obtener resultados de análisis experimentales (Validación prospectiva), para proceder a la validación una vez realizados los análisis y obtenidos los resultados. 4Calcular los parámetros de caracterización de ambas validaciones mediante la aplicación de herramientas estadísticas. 13 5METODOLOGIA 5.1 Desarrollo del método analítico Dumas de determinación cuantitativa de proteína en productos cárnicos. El ensayo a validar es el análisis de proteína por el método Dumas, en matriz de productos cárnicos (frescos, en paté, o curados). Este método de cuantificación de proteína no es el método oficial (Boe.es, 1979), que es Kjeldahl, es un método permitido por la legislación en el caso de piensos por ejemplo, que tiene la misma validez que el método oficial siempre que puedas demostrar que no existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos con ambos métodos. El primer paso fue demostrar que no existen diferencias significativas entre ambos métodos mediante el análisis estadístico de varios resultados de muestras analizadas tanto por el método oficial (Kjeldahl) como por el método alternativo (Dumas), ver en (Anexo I). Tras la búsqueda de los documentos y formatos necesarios según el actual sistema de calidad implantado en el Laboratorio Agroambiental, generaremos un método que tendrá un código (MT-ALI-XX). La redacción de los métodos en este laboratorio tiene que seguir un riguroso orden marcado por el índice, en el que se incluye: 1OBJETO, 2ALCANCE (campo de aplicación, objeto de ensayo y parámetros), 3SEGURIDAD E HIGIENE, 4DESCRIPCIÓN, 5-REALIZACIÓN (equipos, materiales, condiciones, procedimientos, documentos, registros…), 7CONTROL DE CALIDAD (trazabilidad, repetibilidad, tendencias…), 8RESPONSABILIDADES, 9REFERENCIAS Y 10ANEXOS. Inicialmente se parte de un método similar ya descrito (MT-ALI-010) con el titulo de : “nitrógeno por combustión y detector de conductividad térmica (método Dumas) y proteína bruta”. Este método solo abarca a piensos y sus materias primas, cereales y sus derivados, pero hay muchos apartados comunes que podemos aplicar a nuestro nuevo método para productos cárnicos. Una vez completados todos los apartados anteriores, se comprueba si existen criterios marcados en cuanto a repetibilidad, reproducibilidad… por alguna legislación vigente, pero el procedimiento oficial de análisis del nitrógeno en carne (Boe.es, 1979), solo marca en el apartado 5.5 que el porcentaje de proteína total será: 6,25 x porcentaje de N total. También hace referencia a una norma ISO R-937 (ISO 937:1978, 1978) que no indica más información en cuanto a límites de cuantificación y detección, repetibilidad, etc. Por lo tanto, será el laboratorio previa experiencia, el que marque estos límites necesarios para el seguimiento de la validación y de los posteriores análisis diarios. 14 Actualmente se trabaja en productos cárnicos, para la aceptación de los resultados, se realiza cada muestra por triplicado y estos tres valores tienen que cumplir una repetibilidad de 0,3% en nitrógeno, lo que corresponde a 1,88 % en proteína. Además es obligatorio introducir en cada tanda de trabajo un control (material de referencia procedente de un ejercicio interlaboratorio) donde se aplica como incertidumbre 2 veces la desviación estándar del material, debido a que en este momento, por no estar validado el método, se utiliza como aproximación a la incertidumbre a aplicar. Finalmente, el procedimiento de análisis Dumas se basa en la combustión (a 850°C) de una pequeña cantidad de muestra (aproximadamente 0,3-0,5 gramos) pesada en una capsula de estaño. En la combustión se generan diversos gases que pasan por el circuito interno del aparato, hasta llegar a un detector de conductividad térmica que cuantifica el nitrógeno , donde se obtendrá la cantidad de nitrógeno en miligramos, que con el peso introducido previamente y el factor para conversión de nitrógeno a proteína (6,25), se obtiene el porcentaje de nitrógeno y proteína. Se realiza en primer lugar una limpieza del aparato, dejando al aparato unos 20 minutos pasando gases en vacío, tras esto dos análisis de blanco con cápsula y por último una recta de calibrado con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), se trata de un patrón certificado, con un contenido de nitrógeno de 9,56 % ± 0,06, se utilizan 5 pesos diferentes para esta recta (0,05, 0,10, 0,15, 0,20 y 0,25 gramos), tras el recalibración del aparato todas las medidas de EDTA deben de cumplir que su porcentaje de nitrógeno varié entre 9,50 y 9,62. Después de la aceptación de la recta se procederá a pesar las muestras e iniciar el análisis. El método completo al detalle se adjunta en Anexo III. Para que éste sea válido, y tenga su codificación, tiene que ser revisado y aprobado por el responsable de la Unidad de Garantía de Calidad y por el director del laboratorio, que junto a la persona que lo ha elaborado se hacen responsables del método. Una vez finalizado este trámite será distribuido por el jefe de la Unidad de Garantía de Calidad. 5.2 Obtener datos de validación mediante recopilación de datos históricos (validación retrospectiva). Validación retrospectiva, basada en la recopilación de resultados de ejercicios intercomparación realizados por el laboratorio en diferentes años. Estos datos incluyen el valor de consenso de proteína, la desviación estándar obtenida entre los resultados de los diferentes laboratorios participantes en el ejercicio de intercomparación. Y finalmente el valor de proteína informado por el laboratorio mediante la técnica Dumas. 15 Estos datos se almacenan en el laboratorio, durante varios años (10-15 años) teniendo en cuenta que la fecha de caducidad es de 5 años para cada material. Se trata de una búsqueda de los resultados de diferentes ejercicios de intercomparación en los que el Laboratorio ha participado para esta determinación y matriz. Desde el año 2009 hasta 2019 se encontraron un total de 40 ejercicios; se ordenaron en una hoja Excel los valores de: resultado reportado por el laboratorio, resultado de consenso de ejercicio, y la desviación estándar. Tras el estudio realizado, solo 22 de los ejercicios anteriores tienen los 3 valores requeridos, con los que se va a trabajar (Tabla 1). Mediante un programa Excel (PRG-UGC-03 Rev1), dentro del sistema de gestión de calidad del Laboratorio Agroambiental, se calculan los sesgos (es decir, la diferencia entre el valor emitido por el Laboratorio y valor asignado por el proveedor del ejercicio), y el z-score (que es la división del sesgo entre la desviación estándar) de cada ejercicio. Como último paso, se calcula la incertidumbre del método de proteína Dumas, para ello se calcula cada contribución a la incertidumbre: media y desviación estándar de los sesgos. Con todos estos datos podremos calcular: la incertidumbre, la precisión (como desviación estándar o coeficiente de variación), y la veracidad del proceso (como recuperación). Tabla 1. Valores de proteína para la validación retrospectiva de materiales interlaboratorio desde 2009 a 2019 buscados en los cuadernos de interlaboratorios del laboratorio. Nº Nº DE INTERCOLABORATIVO VALOR ASIGNADO VALOR MEDIO SESGO 1 811/11 11,91 11,45 -0,46 2 3522/11 21,94 21,35 -0,59 3 4381/11 19,55 20,03 0,48 4 537/12 13,15 12,99 -0,16 5 341/13 12,71 11,79 -0,92 6 3803/14 24,89 25,7 0,81 7 813/15 9,58 7,78 -1,80 8 957/16 12,25 12,31 0,06 9 4247/15 28,86 21,65 -7,21 10 3804/14 9,81 9,54 -0,27 11 1374/17 13,12 12,63 -0,49 12 3521/13 22,83 23,34 0,51 13 3623/16 28,75 29,31 0,56 14 249/18 13,56 13,31 -0,25 16 15 2045/17 13,12 13,12 0,00 16 4484/17 13,01 12,94 -0,07 17 4486/17 9,89 10,02 0,13 18 1691/18 13,69 13,13 -0,56 19 2310/19 28,69 28,88 0,19 20 4635/19 28,85 29,33 0,48 21 3720/16 7,49 7,43 -0,06 22 4814/19 7,19 7,13 -0,06 5.3 Obtener datos de resultados de análisis experimentales (validación prospectiva). Validación prospectiva, basada en la repetición de análisis de proteína por el método Dumas. Para la obtención de valores que sean significativos se realiza un plan de validación. En este plan se valoran los materiales disponibles en ese momento, se comprueba cual es el rango habitual de trabajo; que se establece desde 7 a 30 % p/p en proteína, finalmente se eligen 3 materiales de referencia que estén en el rango bajo (7%), rango medio (13-15%) y un rango alto (28-30%), y se recoge la información necesaria de cada material para el cálculo posterior de la validación: - Material de rango Bajo (nº de registro laboratorio: 3720/16): Se trata de un producto cárnico (Tocino entrevetado), son restos de un ejercicio interlaboratorios del año 2016, de la entidad JUNAN ( JUNAN 13/16 M2), se obtiene el certificado en octubre de 2016, con una caducidad del producto de 5 años, guardando los restos de muestra en el congelador a -18°C. El valor real o certificado de % de proteína sobre materia natural es de 7,49 ± 1,50 % p/p proteína sobre materia natural (smn). El valor que el laboratorio reportó en ese ejercicio fue de 7,43 % p/p proteína smn. Obteniendo un z-score -0,07 y una desviación estándar del ejercicio de 0,7491. - Material de rango Medio (Nº de registro de laboratorio: 4484/17) : Se trata de un producto cárnico (Jamón cocido), son restos de un ejercicio interlaboratorios del año 2017, de la entidad JUNAN ( Ensayo 10/17 M1), se obtiene el certificado en noviembre de 2017, con una caducidad del producto de 5 años, guardando los restos de muestra en el congelador a -18°C. El valor real es de 13,01 ± 1,301 % p/p proteína smn. El valor 17 que el laboratorio reportó en ese ejercicio fue de 12,94 % p/p proteína smn. Obteniendo un z-score -0,11 y una desviación estándar del ejercicio de 0,6505. - Material de rango Alto (nº de registro laboratorio: 4635/19): Se trata de un producto cárnico (Jamón curado), son restos de un ejercicio interlaboratorios del año 2019, de la entidad Gabinete de servicios para la Calidad (GSC-MEAT/2019M1B), se obtiene el certificado en enero de 2020, con una caducidad del producto de 5 años, guardando los restos de muestra en el congelador a – 18°C. El valor real es de 28,85 ± 2,88 % p/p proteína smn. El valor que el laboratorio reportó en ese ejercicio fue de 29,33 % p/p proteína smn. Obteniendo un z-score 0,33 y una desviación estándar del ejercicio de 1,44. Para que esta validación sea representativa, se realizarán 10 análisis diarios de proteína de cada material (rango bajo, medio y alto) durante 3 días diferentes, siguiendo el método Dumas descrito en el Anexo III, en total esto serán 90 resultados independientes. Se recogerán los datos obtenidos y se ordenarán en una hoja Excel para el posterior tratamiento de datos. Estos materiales se conservan congelados, por lo que un día antes se procede a mantener en refrigeración para su descongelación. Se aplicó el procedimiento tal cual se describe en el método, tomando pesos de partida de entre 0,300 y 0,500 gramos. Previamente a las pesadas se homogeneizo el material de referencia con un molinillo adecuado para asegurar la homogeneidad de la muestra y, por tanto, la repetibilidad en los valores del análisis. Con carácter previo al uso del equipo, tal como indica el método, se procede a poner a punto el instrumento de medida de la marca (LECO) de análisis de nitrógeno por método Dumas, mediante la limpieza y calibración, obteniendo la recta de calibrado. De este modo se procedió cada día de análisis: Día 1: 11/Noviembre/2020; Día 2: 12/Noviembre/2020; Día 3: 13/Noviembre/2020. A. RANGO BAJO Se pesan 10 cápsulas del material y se introducen en el auto-muestreador del LECO obteniendo los datos de % de proteína reflejados en las Tablas 2, 3 y 4 corresponden al rango bajo, las Tablas 5,6 y 7 al rango medio y por último las Tablas 8, 9 y 10 al rango alto: DIA 1 18 Tabla 2. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 11/11/2020. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína 3720-1 0,4352 1,0570 6,25 6,607 3720-2 0,4402 1,0115 6,25 6,322 3720-3 0,3876 1,1549 6,25 7,218 3720-4 0,4522 1,1003 6,25 6,877 3720-5 0,3224 1,0780 6,25 6,738 3720-6 0,4375 0,9969 6,25 6,231 3720-7 0,4000 0,9855 6,25 6,160 3720-8 0,3795 1,0417 6,25 6,511 3720-9 0,4188 1,1577 6,25 7,236 3720-10 0,3507 1,1934 6,25 7,460 DIA 2 Tabla 3. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 12/11/2020. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína 3720-1 0,2642 0,9950 6,25 6,219 3720-2 0,4239 1,1773 6,25 7,358 3720-3 0,3215 1,0900 6,25 6,813 3720-4 0,3328 0,9806 6,25 6,129 3720-5 0,3318 1,1161 6,25 6,976 3720-6 0,2527 1,0208 6,25 6,380 3720-7 0,3857 1,0675 6,25 6,672 3720-8 0,3000 1,0282 6,25 6,426 3720-9 0,3156 0,9991 6,25 6,245 3720-10 0,3782 1,0390 6,25 6,494 DIA 3 Tabla 4. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 3720/16 en el día 13/11/2020. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína 3720-1 0,3360 1,1703 6,25 7,315 3720-2 0,3345 1,0432 6,25 6,520 3720-3 0,4225 0,9403 6,25 5,877 19 3720-4 0,5204 1,0392 6,25 6,495 3720-5 0,4180 1,0891 6,25 6,807 3720-6 0,4790 1,0385 6,25 6,491 3720-7 0,3638 1,0234 6,25 6,396 3720-8 0,3692 1,0095 6,25 6,309 3720-9 0,3959 0,9863 6,25 6,165 3720-20 0,2785 1,0152 6,25 6,345 B. RANGO MEDIO DIA 1 Tabla 5. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4484/17 en el día 11/11/2020. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína 4484-1 0,3488 2,1061 6,25 13,16 4484-2 0,3289 2,1148 6,25 13,22 4484-3 0,3996 2,1388 6,25 13,37 4484-4 0,2752 2,1417 6,25 13,39 4484-5 0,4543 2,0943 6,25 13,09 4484-6 0,6105 2,0460 6,25 12,79 4484-7 0,3735 2,1166 6,25 13,23 4484-8 0,4562 2,1345 6,25 13,34 4484-9 0,4743 2,0780 6,25 12,99 4484-10 0,4042 2,1021 6,25 13,14 DIA 2 Tabla 6. Resultados obtenidos del programa Leco para el material 4484/17 en el día 12/11/2020. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína 4484-1 0,5841 2,1002 6,25 13,13 4484-2 0,4533 2,1787 6,25 13,62 4484-3 0,6636 2,1636 6,25 13,52 4484-4 0,4291 2,2039 6,25 13,77 4484-5 0,2809 2,2099 6,25 13,81 4484-6 0,4846 2,1835 6,25 13,65 4484-7 0,4578 2,1794 6,25 13,62 26 Además de obtener la incertidumbre, se comprueba la veracidad con el estudio de tStudent, donde se obtiene una t calculada de 1,278 y la t tabulada de 1,721 para una probabilidad del 95 % y 21 grados de libertad (v). Como la t-calculada es inferior que la t tabulada, se confirma la validez a este método de validación (Tabla 14). Tabla 14. Valores obtenidos del formato (FT-UGC-427 rev 1) para comprobación de la veracidad del método de validación. 6.3 Validación prospectiva, cálculo de incertidumbre partiendo de los datos obtenidos y resultados de los parámetros de caracterización 6.3.1 Exactitud Se comparan los valores obtenidos con los valores de referencia, mediante un estudio estadístico del test t-Student valoraremos su aptitud y validez (Tabla, 15,16 y 17). Mediante la tabla del Anexo II, buscamos el valor de t tabulada para 9 grados de libertad (v=10-1) y un 95% de probabilidad, el valor obtenido es de 1,833. o Rango bajo Tabla 15. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango bajo. 3720/16 (7,49%) Día 1 Día 2 Día 3 Total de días Media ( % P/P proteína) 6,74 6,57 6,47 6,635 Sesgo -0,63 -0,92 -1,02 -0,85 T calculada 0,522 0,753 0,842 1,26 o Rango medio Tabla 16. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango medio. 4484/17 (13,01%) Día 1 Día 2 Día 3 Total de días VERACIDAD t cal 1,278 t tab 1,721 27 Media ( % proteína) 13,17 13,60 13,33 13,39 Sesgo 0,16 0,59 0,32 0,38 T cal 0,273 0,971 0,592 1,01 o Rango Alto Tabla 17. Cálculo de t-Student desde los sesgos del valor referencia y el valor medio de análisis en rango alto 4635/19 (28,85%) Día 1 Día 2 Día 3 Total de días Media ( % proteína) 29,93 29,87 30,24 30,00 Sesgo 1,08 1,02 1,39 1,15 T cal 1,308 0,526 1,218 0,796 Todos los valores de t calculadas están por debajo de la t tabulada, por lo que no existen diferencias significativas al 95% de probabilidad entre los diferentes días de análisis y el material de referencia utilizado. Por lo tanto la exactitud de este método es aceptable. 6.3.2 Precisión Se calcula la desviación estándar de las medias de los 3 días, estos datos se obtienen desde el programa interno del Laboratorio (FT-UGC-425. Rev 1): Rango bajo = 0,133 Rango medio = 0,217 Rango Alto = 0,211 o Repetibilidad: Desviación estándar obtenida al analizar una misma muestra varias veces, en un periodo corto de tiempo, sin cambiar de equipo de medida, reactivos o analista. Válido para las repeticiones diarias (Tabla 18). Tabla 18. Tabla con los resultados de las deviaciones estándar obtenidas según formato propio del laboratorio (FT-UGC-425. Rev 1) . Rango bajo – medio – alto. 3720/16 (7,49% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 Desviación estándar 0,454 0,386 0,383 4484/17 (13,01% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 28 Desviación estándar 0,185 0,192 0,171 4635/19 (28,85% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 Desviación estándar 0,261 0,613 0,361 o Reproducibilidad Esta desviación corresponde a la serie completa de los 30 análisis en conjunto, donde cambian tanto los días de análisis, como las rectas de calibrado. Rango bajo = 0,410 Rango medio = 0,252 Rango Alto = 0,457 En todos los casos estas desviaciones son bastante inferiores de 0,91 que es el valor objetivo propuesto inicialmente, como no existe una legislación que marque ningún parámetro, se decidió coger la desviación estándar media de todos los materiales de referencia trabajados en la validación retrospectiva. El resultado es muy positivo en este aspecto. Se puede concluir diciendo que es un método que demuestra tener una alta precisión. 6.3.3 Límites de detección y cuantificación. Desviación estándar absoluta del % de proteína obtenida de los valores Tabla 12: 0,0689 Límite de Detección= 3 x desviación estándar absoluta = 1,29 % en proteína Límite de Cuantificación= 10 x desviación estándar absoluta = 4,31 % en proteína Los valores calculados de límites de detección serán 1,29% y para el límite de cuantificación 4,31%. Se procede a la comprobación de los límites matemáticos con muestras reales, según la metodología descrita, obteniendo los siguientes valores (Tabla 19 y 20). Tabla 19. Valores % de proteína, desviación estándar y media obtenidos del análisis de proteína con método Dumas del material de referencia para comprobación del límite de detección. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína Material de referencia 0,9100 0,21325 6,25 1,333 29 Material de referencia 0,9750 0,20747 6,25 1,297 Material de referencia 0,9360 0,20488 6,25 1,281 Desviación estándar 0.0266 Media de los valores 1,30% Tabla 20. Valores % de proteína, desviación estándar y media obtenidos del análisis de proteína con método Dumas del material de referencia para comprobación del límite de cuantificación. Nº de muestra Peso (gramos) % de nitrógeno factor % de proteína Material de referencia 0,4731 0,7251 6,25 4,532 Material de referencia 0,4434 0,7163 6,25 4,477 Material de referencia 0,4362 0,7000 6,25 4,375 Desviación estándar 0,0797 Media de los valores 4,46% Se concluye que los límites de detección y cuantificación calculados matemáticamente obtenidos de los resultados del análisis de blancos con cápsula por el método Dumas son datos fiables, porque tras la realización de la comprobación con muestra real se detecta una media de 1,30 % de proteína (cuando el límite de detección calculado es 1,29 %) y en el límite de cuantificación una media de 4,46 % (siendo el valor calculado de 4,31%). Finalmente proponemos que el rango de trabajo sea por encima de 5% p/p proteína, y por debajo de ese valor no podemos asegurar que el resultado sea válido y cuantificable con certeza por el método Dumas. 6.3.4 Cálculo de la incertidumbre 30 Con el mismo programa que hemos estado trabajando anteriormente (FT-UGC-425 rev 1) se obtienen los resultados de las incertidumbres de los diferentes rangos de trabajo, recogidas en las Tablas 21, 22 y 23 que se muestran a continuación. - Rango bajo: Se obtiene un valor de incertidumbre relativa de 20,67% y una recuperación de 88,02% . Tabla 21. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. MATERIAL DE REFERENCIA (1) Rango bajo PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 6,736 6,571 6,472 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,454 0,386 0,383 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 6,73 % 5,87 % 5,92 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 6,593 6,593 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,133 0,410 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 2,02 % 6,22 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 88,02 % RANGO 99,60 % 78,46 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIAD DEL 95%) 1,363 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 20,67 % - Rango medio: Se obtiene un valor de incertidumbre relativa de 6,36 % y una recuperación de 102,76% 31 Tabla 22. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. MATERIAL DE REFERENCIA (2) Rango medio PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 13,172 13,601 13,334 DESVIACION ESTANDAR 0,185 0,192 0,171 COEFICIENTE DE VARIACION (%) 1,40 % 1,41 % 1,28 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 13,369 13,369 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,217 0,252 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 1,62 % 1,89 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 102,76 % RANGO 106,15 % 98,31 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIDAD DEL 95%) 0,8501 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 6,36 % - Rango alto: Se obtiene un valor de incertidumbre relativa de 6,77% y una recuperación de 104,00% Tabla 23. Formato de cálculo de incertidumbre de acuerdo con (FT-UGC-425 rev 1), pestaña resumen. Formato acreditado, propio del laboratorio Agroambiental. MATERIAL DE REFERENCIA (3) Rango Alto PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 29,932 29,836 30,240 32 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,261 0,613 0,361 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 0,87 % 2,05 % 1,19 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 30,003 30,003 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,211 0,457 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 0,70 % 1,52 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 104,00 % RANGO 107,80 % 101,59 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIDAD DEL 95%) 2,031 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 6,77 % Con la obtención se de las tres incertidumbres relativas correspondientes a los diferentes rangos que hemos trabajado, se calcula su media, y este valor es la incertidumbre media relativa de nuestro método de proteína Dumas. % de INCERTIDUMBRE MEDIA RELATIVA 11,27% Se observa claramente una discordancia en los resultados de % de incertidumbre relativa de rango bajo respecto a los del rango medio y alto, pues este valor es 3 veces mayor. Con estos resultados la mejor opción es hacer una validación por rangos, trabajando con una incertidumbre exclusiva para rango bajo (por ejemplo valores de % p/p proteína menores del 10%, aplicarán un % de incertidumbre del 20,67%), y otra incertidumbre para el resto de rangos (por ejemplo valores de % p/p proteína mayores del 10%, aplicarán un % de incertidumbre del 6,77%). Por comodidad y porque el objetivo del trabajo es comparar los dos diferentes métodos de validación, se trabaja con la incertidumbre media de 11,27%. El principal problema que puede causar usar una única incertidumbre es que los controles diarios de trabajo que se encuentren con valores menores del 10% no cumplan con el valor objetivo, y se tenga que repetir la tanda de trabajo. 33 6.4 Valoración de las incertidumbres de los dos métodos de validación (retrospectiva y prospectiva). Es el momento de llegar al objetivo principal de este trabajo, que además de la realización del método de análisis de proteína por Dumas para productos cárnicos, consiste en su validación. El objetivo es comparar las dos formas de validación para concluir cual es más precisa, y más fiable de utilizar, y esto se puede comparar con dos resultados que se obtienen en ambas validaciones: % incertidumbre relativa y % de recuperación. Resultados finales: - Validación retrospectiva: incertidumbre relativa media 11,98 % y % de recuperación medio: 97,35% - Validación prospectiva: incertidumbre relativa media 11,27% y % de recuperación media: 98,26%. Se puede concluir que las incertidumbres relativas son similares tan solo existe una diferencia de 0,71%, y en el porcentaje de recuperación los resultados igualmente son muy similares con una diferencia de 0,91%. Ambos métodos de validación han demostrado su utilidad sin aportar grandes diferencias en los resultados finales. Las mayores diferencias que se aprecian entre los dos métodos de validación son el tiempo que cuesta realizar las validaciones: para el caso de validación retrospectiva, el tiempo es corto, pero es necesario disponer de mucha información documental, también es necesario que el laboratorio participe en ejercicios intercomparación para el análisis que se quiera validar; además normalmente es difícil encontrar muchos valores útiles para la validación, por lo que en algunos casos las validaciones no suelen ser representativas. Para las validaciones prospectivas, es necesario contar con materiales de referencia certificados con la cantidad suficiente para realizar las tandas de trabajo. Asimismo, disponer de un buen plan de validación, acortaría los tiempos de trabajo, aunque el tiempo depende de los métodos que validar no es lo mismo validar un análisis directo (Ej. pH) que un método que necesite digestiones…(Ej. análisis de espectrofotometría), lo que puede variar de unos pocos días a varias semanas. Pero, independientemente del tiempo, este tipo de validación permite la obtención de muchos resultados diferentes, que aportan muchos datos a la validación. 34 7CONCLUSIONES Como principales conclusiones del trabajo se destaca: • Tras la constatación de que no existen diferencias significativas entre los dos métodos de análisis de proteína (Dumas y Kjeldahl), se redacta, revisa y valida el método cuantitativo de análisis de proteínas por combustión y conductividad térmica (Dumas) para productos cárnicos. Este método se incorporará así al listado de métodos internos del Laboratorio Agroambiental. • Trabajar con un laboratorio que tiene implantado un sistema de calidad robusto ha facilitado tanto la obtención de resultados de proteína, procedentes de su participación en ejercicios interlaboratorio, como la realización con esos resultados de la validación retrospectiva a través de sus propios formatos internos acreditados. Finalmente se ha obtenido una incertidumbre válida con los datos de análisis de proteína recopilados de 22 ejercicios intercomparación. Este procedimiento de validación no supone un coste adicional, puesto que el trabajo estaba ya realizado como parte del control de calidad. • La validación prospectiva permite obtener la incertidumbre por rangos de trabajo, y estimar el límite de detección y el límite de cuantificación. Sin embargo, este tipo de validación, al necesitar obtener los datos mediante un trabajo experimental en el laboratorio, requiere un tiempo de trabajo extra, e implica además un consumo de reactivos y materiales de referencia, lo que supone un coste adicional. • Se ha comprobado que para validar el método de análisis de proteína por Dumas, los dos sistemas utilizados (retrospectivo y prospectivo), ofrecen resultados similares, y se pueden utilizar indistintamente según los objetivos planteados. • Finalmente, queda documentado y validado el procedimiento para la determinación de proteína por el método Dumas, con unos parámetros de caracterización que son aceptables para el uso previsto de los resultados. 35 8CONCLUSIONS The main conclusions of the work are as follows: • Following the finding that there are no significant differences between the two protein analysis methods (Dumas and Kjeldahl), the quantitative method of protein analysis by combustion and thermal conductivity (Dumas) for meat products is drafted, revised and validated. This method will thus be incorporated into the list of internal methods of the “Laboratorio Agroambiental”. • Working with a laboratory that has a robust quality system in place has facilitated both the obtaining of protein results from its participation in interlaboratory exercises and the use of these results for retrospective validation through its own internal accredited formats. Finally, a valid uncertainty has been obtained with the protein analysis data collected from 22 intercomparison exercises. This validation procedure does not involve any additional cost, since the work was already done as part of quality control. • Prospective validation makes it possible to obtain the uncertainty by working ranges, and to estimate the limit of detection and the limit of quantification. However, this type of validation, since it requires obtaining the data through experimental work in the laboratory, requires extra work time, and also involves the consumption of reagents and reference materials, which entails an additional cost. • It has been proven that to validate the protein analysis method by Dumas, the two systems used (retrospective and prospective), offer similar results, and can be used indistinctly according to the objectives set. • Finally, the procedure for protein determination by the Dumas method is documented and validated, with characterization parameters that are acceptable for the intended use of the results. 42 -0,01 -0,23 0,40 -0,35 -0,09 -0,42 0,25 -0,03 0,84 -0,37 0,38 -0,17 0,67 -0,40 0,19 -0,24 0,09 -0,27 0,65 -0,86 0,25 -0,22 0,03 -0,02 0,17 -0,14 1,89 -0,39 0,15 -0,20 0,33 -0,30 0,07 -0,04 0,52 -0,41 1,81 -0,43 0,97 -0,31 0,64 -0,43 0,92 -0,78 0,75 -0,34 0,02 -0,07 0,01 -0,07 0,61 -0,23 1,04 -0,24 0,23 -0,60 0,66 -0,19 0,07 -0,27 0,63 -1,15 0,25 -0,22 0,51 -0,05 43 1,63 -0,09 1,34 -0,39 0,52 -0,15 Tabla 27. Aplicación del test estadístico t-student y valores de t calculada y t tabulada para una probabilidad del 95% y 38 grados de libertad Media 0,52 -0,31 Desviación estándar 0,501 0,244 nº datos 39 39 t calculada 0,165 0,202 t tabulada 2,024 2,024 En ambos casos las t calculadas muestras valores inferiores a las t tabuladas, por lo que no hay diferencias significativas entre los métodos de análisis de proteína. Dumas versus Kjeldahl Dumas versus Kjeldahl diferencias EN LABORATORIO diferencias CON VALORES CONSENSO 44 Anexo II: Tabla de la distribución t-student , donde alfa corresponder a la probabilidad y v corresponde a los grados de libertad. 45 Anexo III Método de análisis de proteína por método Dumas en productos cárnicos. LABORATORIO AGROAMBIENTAL MÉTODOS DE ENSAYO NITRÓGENO Y PROTEÍNA BRUTA POR EL MÉTODO DUMAS EN DERIVADOS CÁRNICOS. Documento: MT-XXX-XX Revisión: 0 Fecha aprobación: Pagina 1 de 11 Elaborado por: Andrea Pérez Lite y Antonio López Aliaga Firma: Revisado por: Jesús Betrán Aso Firma: Aprobado por: Nicolás Abancens Tejero Firma: Distribuido por el jefe de la Unidad de Garantía de Calidad. CAMBIOS INTRODUCIDOS RESPECTO A LA REVISIÓN ANTERIOR: Respecto a las personas cualificadas para la revisión anterior, ESTA REVISIÓN: ¿REQUIERE RECUALIFICACIÓN?: x NO (Cambios menores que se les comunican) □ SI (Sólo para el caso de métodos) ¿SE REQUIERE REVISIÓN DE LA VALIDACIÓN?: x NO □ SI Fecha: ________ ¿CAMBIA EL PLAN DE CONTROL DE CALIDAD?: x NO □ SI Fecha: ________ 46 0.ÍNDICE 1. OBJETO. 3 2. ALCANCE. 3 2.1.-) Campo de aplicación. 3 2.2.-) Objeto sometido a ensayo. 3 2.3.-) Parámetros y magnitudes a determinar. 3 3. SEGURIDAD E HIGIENE. 3 4. DEFINICIONES. 3 5. DESCRIPCIÓN. 4 6. REALIZACIÓN. 6.1.-) Equipos. 4 6.2.-) Materiales y reactivos. 4 6.3.-) Condiciones de realización. 5 6.4.-) Procedimientos relacionados. 5 6.5.-) Documentos requeridos. 5 6.6.-) Registros generados. 5 6.7.-) Aplicaciones informáticas 5 6.8.-) Procedimiento o realización 6 7. CONTROL DE CALIDAD. 9 7.1.-) Control de la trazabilidad. 9 7.2.-) Repetibilidad. 9 7.3.-) Análisis de tendencias. 10 7.4.-) Ensayos de aptitud. 10 8. RESPONSABILIDADES. 10 9. REFERENCIAS. 11 9.1.-) Documentos internos. 11 9.2.-) Documentos externos. 11 10. ANEXOS. 11 47 1. OBJETO. Describe el procedimiento para la determinación de nitrógeno y su conversión en proteína por combustión y detector de conductividad térmica. Método de ensayo AOAC 990.03 2. ALCANCE. 2.1.-) Campo de aplicación. Determinación de nitrógeno (proteína bruta) en todo tipo de productos y derivados cárnicos con un limite inferior de trabajo de 0.8 % de nitrógeno (5% en proteína). 2.2.-) Objeto sometido a ensayo. Derivados y productos cárnicos. 2.3.-) Parámetros y magnitudes a determinar. El parámetro a determinar es el nitrógeno que al multiplicarlo por un factor (se usa el factor 6,25) nos da el contenido en proteína. El resultado se expresa en % p/p, normalmente sobre materia natural. 3. SEGURIDAD E HIGIENE. Ir provisto de guantes 4. DEFINICIONES. - Derivados cárnicos: Son los productos alimenticios preparados total o parcialmente con carnes o menudencias de los animales citadas en el punto 1.1 del anexo I del Reglamento 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 por el que se establecen normas especificas de higiene de los alimentos de origen animal y sometidos a operaciones especificas antes de su puesta al consumo. Serán preparados o productos cárnicos según lo establecido en la normativa comunitaria de aplicación. 48 - Método Dumas: Método de determinación del nitrógeno por combustión de la muestra. Es una alternativa muy fiable, segura y limpia al método Kjeldahl (método oficial por RD 2257/1994 no6). - Proteína: Macromolécula orgánica constituida por aminoácidos, cuya composición elemental incluye Carbono, Hidrógeno, Oxigeno y Nitrógeno, y en muchos casos también Azufre. Son componente fundamental de los seres vivos, y son esenciales en la alimentación de los animales. Por termino medio contienen un 16 % de nitrógeno, por lo que 6,25 g de proteína contienen 1 g de nitrógeno. De este modo, el factor 6,25 se utiliza con frecuencia para obtener la proteína a partir del contenido de nitrógeno. - Proteína Bruta: Total de proteína contenida en todos los componentes de la muestra, obtenida a través del nitrógeno total en la muestra. 5. DESCRIPCIÓN. La muestra se combustiona a 850oC, en el proceso de combustión se genera CO2,H2O,N2, NOx. Primero los gases se hacen pasar por cobre caliente para quitar el oxígeno y reducir los óxidos de nitrógeno a nitrógeno molecular. A continuación los gases se pasan por un primer filtro (Lecosorb) donde se queda retenido el dióxido de carbono, seguidamente se hacen pasar por un segundo filtro (Anhidrona) donde se retiene el agua vapor. Finalmente el nitrógeno molecular con helio portador es medido en una celda de termo conductividad diferencial. El resultado final se muestra como porcentaje en peso de nitrógeno con el factor que le introduces al programa te calcula el % de proteína. 6. REALIZACIÓN. 6.1.-) Equipos. • - Analizador de nitrógeno LECO FP-528 • - Balanza con resolución de 1mg. 6.2.-) Materiales y reactivos. • - Restos de muestra de ejercicios de intercomparación (para usar como referencia). • - Capsulas de latón o estaño: D.20mm • - EDTA9,56 % de nitrógeno ±0.06 • - Gases: Gas portador – He o Ar (40psi) Gas de combustión – O2 (40psi) y Gas neumático – aire comprimido libre de agua y aceite (40psi). 49 - Reagent tube repacking: Glass wool Anhydrona Lecosorb - Furnace filter tube: Quartz wool strips Steel wool - Reduction heater tube repacking: Copper sticks Copper turnings N-Catalyst - Combustion tube: Honeycomb ceramic Quartz wool strips Furnace reagent magnesium oxide beads Furnace reagent Alumina oxide pellets 6.3.-) Condiciones de realización. No se requieren condiciones ambientales especiales. 6.4.-) Procedimientos relacionados. • - Instrucción Técnica de calibración y verificación de balanzas (IT-GEN-301) • - Instrucción Técnica de preparación de muestras (IT-ALI-101). 6.5-) Documentos requeridos. • - Hoja de trabajo (FT-ALI-010). • - Libro de equipo de la balanza. • - Libro de equipo del Analizador de nitrógeno LECO FP-528 (AN-ALI-01). • - Evaluación de los controles de calidad (FT-ALI-303). 6.6-) Registros generados. • - Hoja de trabajo (FT-ALI-010). • - Boletín de análisis (FT-UGC-023). 50 - Evaluación de los controles de calidad (FT-ALI-303) 6.7-) Aplicaciones informáticas. • - Software del Analizador de nitrógeno LECO FP-528 • - Programa informático para evaluación de los controles de calidad (PRG-ALI-008) 6.8.-) Procedimiento o realización. a) Controles previos. Encender el equipo, posee un interruptor en la parte frontal con dos posiciones On y Off, y el ordenador. Dejar que el sistema se caliente y estabilice durante una o dos horas. Encender el software. Antes de comenzar con el análisis de las muestras se debe comprobar una serie de puntos: Temperatura del horno de combustión: debe ser aproximadamente 850 oC. Temperatura del tubo de reducción: debe ser aproximadamente 750 oC. Si esto no es así dejar que el equipo se estabilice y alcance dicha temperatura. Menú Configuration – System : • - Combustion furnace temperature: poner 850 oC • - Reduction Heater: poner 750 oC Botón Aceptar. Para comprobar la temperatura: Menu Diagnostics – Ambients, allíˆ vemos las temperaturas. 2. Posibles fugas de los gases en el sistema, tanto de oxígeno como de helio, para ello hay que realizar un test de fugas para cada uno de los gases. Test de fugas (Leak Check): A) abrir las llaves de los gases, comprobar en el manómetro que la presión sea 2,5 bares (esta marcado con una raya negra) y el paso de los mismos (F8 ON) B) Menu Diagnostics – Leak Check – pestaña Leak Check C) Oxygen: botón Oxigen Leak Check Helio: botón Helium Leak Check b) Preparación de la muestra. 51 La muestra para la realización del análisis, se prepara según instrucción técnica IT-ALI-101. c) Procedimiento. 1Blancos Realizar una serie de blancos (sin cápsula, solamente pasando los gases), hasta ver que el contenido de nitrógeno es inferior al 0.04% nitrógeno. Realizar dos blancos más con capsulas sin muestra. Para el análisis de blancos en el equipo: Menú Sample – Login. Rellenar todos los campos (Nombre muestra, peso, método habitual y factor de proteína). Seleccionamos los resultados de los blancos con la cápsula y vamos a: Menú configuration-blank y aceptar, el equipo tendrሠen cuenta el valor de estos blancos a la hora de calcular el nitrógeno de las muestras Una vez el equipo está a punto, se han comprobado las temperaturas, se ha hecho el chequeo de los gases y se han realizado los blancos, vamos a calibrar el equipo. 2Calibración Obtención de la recta de calibrado Para obtener la recta de calibrado pesamos alrededor de 0.050g, 0.100g, 0.150g, 0.200g, 0.250 g, de EDTA, en sus respectivas cápsulas de latón se cierran y se introducen en el carrusel para su análisis (para comenzar el análisis presionar el botón Analyze F5). Tipo de curva----De primer orden (sin fijar en el origen) Peso----1/certificado. La calibración se considera correcta cuando en todos los puntos que forman parte de la recta, el % de nitrógeno del EDTA, esté comprendido en el intervalo 9.56 ± 0.06%. Si alguno de los puntos no cumple este requisito se podrሠeliminar siempre y cuando queden al menos 4 puntos, o en otro caso se deberሠrepetir la calibración, (pendiente recta entre 0.900 y 1.100).