Repositorio Institucional de Documentos
Abstract
Dada la creciente incidencia y la alta tasa de mortalidad del cáncer colorrectal en el mundo, es necesario desarrollar nuevos agentes quimioterapéuticos que sean a un tiempo eficaces y seguros. Para ello, debe optarse por compuestos capaces de actuar frente a dianas selectivas, como por ejemplo proteínas sobreexpresadas por la célula tumoral y que resulten clave para su correcto funcionamiento. En este sentido, destacan los complejos de oro(I) por su capacidad de inhibir a la enzima redox tiorredoxina reductasa, necesaria para mantener la homeostasis redox de la célula cancerígena. <br />Sin embargo, el potencial antitumoral de los complejos de oro(I) va más allá de esta acción biológica. En la presente tesis doctoral se ha evaluado el efecto de una serie de derivados de oro(I) de nueva síntesis sobre la línea celular Caco-2 como un modelo de carcinoma de colon humano. Tras escoger a los más prometedores atendiendo a su IC50 e Índice de selectividad, se realizó un estudio en profundidad de su mecanismo de acción y el tipo de muerte celular inducida por cada uno de ellos. Se observaron algunos comportamientos no notificados hasta el momento, como la capacidad de uno de ellos de inducir formas de muerte celular alternativas a la apoptosis intrínseca o la afinidad hacia dianas no canónicas de otros de ellos. <br />Los resultados obtenidos muestran el potencial de los complejos de oro(I) para el tratamiento del cáncer colorrectal y los posicionan como una interesante alternativa a la terapia basada en platino que se lleva a cabo en la actualidad. <br /> <br /> Mármol Peguero, Inés; Cerrada Lamuela, Elena ; Rodríguez Yoldi, María Jesús
Full text
2021
106
Inés Má mol Pegue o
E aluación del e ec o an i umo al
de nue os complejos de o o (I)
como po enciales agen es en e al
cánce colo ec a.
Di ec o /es
Ce ada Lamuela, Elena
Rod íguez Yoldi, Ma ía Jesús
© Uni e sidad de Za agoza
Se icio de Publicaciones
ISSN 2254-7606
Inés Má mol Pegue o
EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTITUMORAL DE
NUEVOS COMPLEJOS DE ORO (I) COMO
POTENCIALES AGENTES FRENTE AL CÁNCER
COLORRECTA.
Di ec o /es
Ce ada Lamuela, Elena
Rod íguez Yoldi, Ma ía Jesús
Tesis Doc o al
Au o
2020
Reposi o io de la Uni e sidad de Za agoza – Zaguan h p://zaguan.uniza .es
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Escuela de Doc o ado
P og ama de Doc o ado en Ciencias Biomédicas y Bio ecnológicas
E aluación del e ec o an i umo al de
nue os complejos de o o(I) como
po enciales agen es en e al cánce
colo ec al
Inés Má mol Pegue o
Doc o ado en Ciencias Biomédicas y Bio ecnológicas
Uni e sidad de Za agoza
E aluación del e ec o an i umo al de
nue os complejos de o o(I) como
po enciales agen es en e al cánce
colo ec al
Inés Má mol Pegue o
Tesis doc o al
Doc o ado en Ciencias Biomédicas y Bio ecnológicas
Di ec o as:
D a. Elena Ce ada Lamuela
D a. Mª Jesús Rod íguez Yoldi
Mª Jesús Rod íguez Yoldi, Ca ed á ica del depa amen o de Fa macología y Fisiología
de la Uni e sidad de Za agoza
Elena Ce ada Lamuela, P o eso a Ti ula del depa amen o de Química Ino gánica
de la Uni e sidad de Za agoza
CERTIFICAN:
Que Dª Inés Má mol Pegue o , G aduada en Bio ecnología po la Uni e sidad de
Za agoza, ha ealizado en los depa amen os de Fa macología y Fisiología y de Química
Ino gánica de la Uni e sidad de Za agoza, bajo nues a di ección, el abajo “E aluación
del e ec o an i umo al de nue os complejos de o o(I) como po enciales agen es en e al
cánce colo ec al”, que cons i uye su memo ia pa a aspi a al g ado de Doc o en
Ciencias Biomédicas y Bio ecnológicas euniendo, a nues o juicio, las condiciones
necesa ias pa a se p esen ada y de endida an e el ibunal co espondien e.
En Za agoza a 21 de Sep iemb e de 2020
Fdo. D a. Elena Ce ada Lamuela Fdo. D a Mª Jesús Rod íguez Yoldi
ÍNDICE
Resumen/Abs ac …………………………………………………………………………………………………………………13
Ab e iaciones…………………………………………………………………………………………………………………………19
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………………………21
T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al………………………………23
Mue e celula . Apop osis, nec op osis y au o agia…………………………………………………………….33
Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del cispla ino……………….43
Búsqueda de soluciones a las limi aciones del cispla ino…………………………………………………….51
Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del au ano in.59
Fa macociné ica. La albúmina sé ica como anspo ado de á macos………………………………69
Obje i os…………………………………………………………………………………………………………………………….73
Re e encias…………………………………………………………………………………………………………………………75
MATERIAL AND METHODS.…………………………………………………………………………………………………….93
RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………………113
Capí ulo 1……………………………………………………………………………………………………………………………..115
Re e encias……………………………………………………………………………………………………………………….157
Capí ulo 2……………………………………………………………………………………………………………………………..167
Re e encias……………………………………………………………………………………………………………………….190
Capí ulo 3……………………………………………………………………………………………………………………………..195
Fos ino complejos…………………………………………………………………………………………………………….202
Ca beno complejos…………………………………………………………………………………………………………..220
Re e encias……………………………………………………………………………………………………………………….230
Capí ulo 4……………………………………………………………………………………………………………………………..243
Re e encias……………………………………………………………………………………………………………………….269
CONCLUSIONES/CONCLUSIONS…………………………………………………………………………………………….277
13
RESUMEN
Dado el cons an e c ecimien o del núme o de casos de cánce de colon a ni el
mundial, es necesa io el desa ollo de nue as e apias más segu as y e icaces pa a
mejo a la calidad y la espe anza de ida de los pacien es de es e as o no. Los
de i ados de o o(I) se han pos ulado como una in e esan e al e na i a a los ac uales
á macos de pla ino, pues o que sus dianas e apéu icas son, en su mayo ía, p o eínas
sob eexp esadas en las células umo ales. Es o los con ie e en á macos
p esumiblemen e más segu os, al iempo que man ienen la e icacia e apéu ica de sus
p edeceso es de pla ino.
La p esen e Tesis Doc o al se ha cen ado en el es udio de nue os complejos de o o(I)
en e a un modelo celula de cánce de colon, la línea Caco-2. Se ha p o undizado en la
in luencia de los ligandos de coo dinación en el e ec o biológico de la molécula
esul an e, lle ando a cabo pa a ello di e sos ensayos en e los que se encuen an el
es udio de las poblaciones apop ó icas, la medida de los ni eles de especies eac i as
de oxígeno y el análisis de la ac i idad de di e sas enzimas y p o eínas, en e o os.
Asimismo, se ha desa ollado una nue a o mulación compues a po un alquino
de i ado de o o(I) y un ex ac o ege al, se ha e aluado la capacidad an ibac e iana de
una se ie de de i ados de o o(I) siguiendo la iloso ía del d ug epu posing y se ha
es udiado la in luencia del cen o me álico en cuan o a la acción biológica del complejo
en e al cánce de colon median e la sus i ución del o o(I) po pla a(I). La memo ia se
ha es uc u ado en cua o capí ulos que se de allan a con inuación.
En el p ime capí ulo, se ha compa ado el e ec o an i umo al en e a la línea Caco-2
de es alquino de i ados de o o(I) coo dinados con os inas solubles en agua:
[Au(C≡CPh)(PTA)], [Au(C≡CPh)(DAPTA)] y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)]. Se obse ó que
cambios apa en emen e mínimos en el diseño de la molécula pueden da luga a
g andes di e encias en cuan o al mecanismo de acción causado po un á maco
an i umo al. Así, el complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] inhibe a la enzima edox io edoxina
educ asa y causa un inc emen o en los ni eles de especies eac i as de oxígeno,
p oduciendo la mue e de las células umo ales po apop osis in ínseca. Po su pa e,
el complejo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] no mues a a inidad po la io edoxina educ asa
e induce nec op osis en luga de apop osis. Se c ee que es e cambio en el mecanismo
de acción pod ía es a mo i ado po la o mación de ag egados de a ios complejos en
la mi ocond ia, lo que p o oca ía un g an aumen o en los ni eles de especies eac i as
de oxígeno, causando como consecuencia la ac i ación de la p o eína RIP-1, esponsable
de la nec op osis.
En el segundo capí ulo, se es udió el e ec o combinado del complejo [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)] y un ex ac o de poli enoles ácidos del u o de la Rosa canina sob e la
línea Caco-2. La in e acción en e ambos á macos esul ó se de ipo adi i o, de modo
que suponía un inc emen o de la ac i idad an i umo al espec o al e ec o de cada
14
componen e po sepa ado. Dicha combinación p oduce un bloqueo de la nec op osis
causada po el complejo me álico; en su luga , desencadena la mue e po apop osis,
p esumiblemen e debido a un bloqueo del lujo au o ágico p o ocado po la
alcalinización de los lisosomas, que pa ece es a causado a su ez po una dis upción de
la unción no mal mi ocond ial. Dado que es os e ec os no se han desc i o al a a el
cul i o con los componen es aislados de es e nue o cóc el, se puede conclui que los
esul ados obse ados pa ecen se debidos al e ec o conjun o de ambos.
En el e ce capí ulo, se es udió el e ec o de la unidad 3-hid oxi la ona como ligando
de coo dinación en cua o se ies de alquino de i ados de o o(I): [Au(L2a-d)PPh3],
[Au(L2a-d)PTA], [Au(L2a-d)(IMe)] y [Au(L2a-d)(IP )]. Mien as que los os ino complejos
mos a on un in e esan e e ec o an i umo al, así como una buena selec i idad, los
ca beno complejos ue on desca ados como po enciales agen es quimio e apéu icos
po su escaso po encial an i umo al en compa ación con o os complejos de o o(I). No
obs an e, se obse ó que algunos de ellos poseían un conside able e ec o
an ibac e iano, al mos a una capacidad an ibac e iana mode ada en e a especies
G am nega i as y G am posi i as.
Po su pa e, los os ino complejos ue on ensayados no solo en e a la línea Caco-2,
sino que se incluye on dos modelos umo ales adicionales (líneas MCF-7 y HepG2,
adenoca cinoma de mama y hepa oca cinoma espec i amen e) pa a de e mina una
posible selec i idad en e a cánce colo ec al, obse ándose una mejo espues a
en e al modelo de cánce colo ec al. Un es udio en p o undidad del mecanismo de
acción de los complejos más ac i os [Au(L2b)PPh3] y [Au(L2c)PTA], e eló que el
complejo [Au(L2b)PPh3] es capaz de inhibi a las enzimas io edoxina educ asa y
ciclooxigenasa 2, causando una up u a del equilib io edox y la mue e po apop osis,
mien as que el complejo [Au(L2c)PTA] bloquea la acción de las enzima edox glu a ión
educ asa y io edoxina educ asa, así como la enzima ciclooxigenasa 1, siendo ambién
capaz de induci la mue e po apop osis; no obs an e, su e ec o p o-apop ó ico es más
educido que el del complejo [Au(L2b)PPh3] du an e las p ime as 24h de incubación, lo
que pod ía es a mediado po un aumen o de la au o agia ci op o ec o a en espues a
al a amien o. En cualquie caso, ambos de i ados se han e elado como complejos
mul idiana y apa en emen e selec i os en e al cánce colo ec al, lo que se ía de g an
in e és de ca a a sus i ui al oxalipla ino.
En el cua o capí ulo, se han ensayado una se ie de de i ados de o o(I) y pla a(I)
coo dinados con ligandos de i ados de la 2-anilinopi idina. Al es udia en p o undidad
el e ec o e apéu ico de los complejos [Au(L1)(PPh3)](T O) y [Ag(T O)(L1)(PPh3)], se
obse ó que no compa ían dianas molecula es, al menos al se ensayados en una
concen ación equi alen e a sus IC50. El de i ado de o o [Au(L1)(PPh3)](T O) esul ó se
capaz de inhibi a la enzima edox io edoxina educ asa y a la subunidad 20S del
p o easoma, de modo que se a a de un complejo mul idiana, mien as que el
15
mecanismo de acción del complejo de pla a [Ag(T O)(L1)(PPh3)] no pudo se
iden i icado, si bien los da os ob enidos sugie en que pod ía causa un allo mi ocond ial
que da ía luga a una ac i ación de la apop osis, siendo es e p oceso independien e del
ni el de especies eac i as de oxígeno. Po su pa e, el a amien o de las células Caco-
2 con el complejo [Au(L1)(PPh3)](T O) u o como consecuencia un aumen o en la
ac i ación de la caspasa 8, lo que sugie e que los de i ados de o o(I) pod ían ac i a no
solo la ía in ínseca de la apop osis, sino ambién la ex ínseca. La ausencia de un
mecanismo de acción compa ido en e los de i ados de o o(I) y pla a(I) pod ía indica
que no exis i ían esis encias c uzadas en e ambos. Po úl imo, en es e caso conc e o
se concluye que el complejo de o o [Au(L1)(PPh3)](T O) pod ía se de mayo in e és que
el análogo de pla a [Ag(T O)(L1)(PPh3)] en e al a amien o del cánce colo ec al, dado
que, aunque mues an alo es compa ables en cuan o a su e icacia, el de i ado de o o(I)
pa ece mos a una mayo selec i idad que su análogo de pla a(I).
En de ini i a, los da os ob enidos sugie en que los de i ados de o o(I) ensayados
pod ían ene un in e esan e u u o como agen es quimio e apéu icos en e al cánce
de colon, ya que se a a de complejos más selec i os que los á macos de e e encia
u ilizados, siendo ambién su e ec i idad mayo que la de es os en algunos casos.
16
ABSTRACT
Gi en he incessan g ow h in colo ec al cance cases wo ldwide, he de elopmen
o no el, sa e and mo e e ec i e he apeu ic s a egies is needed o imp o e bo h
quali y-o -li e and li e expec ancy o pa ien s. Gold(I) de i a i es ha e a isen as a
p omising al e na i e o cu en pla inum-con aining d ugs due o hei a ini y o
p o eins ha a e o e exp essed on umo cells. The e o e, his kind o d ugs a e
supposed o be sa e bu o main ain he he apeu ic e icacy o pla inum-based
me allod ugs.
This Thesis has been ocused on he e alua ion o no el gold(I) complexes owa ds a
model o colo ec al cance , Caco-2 cell line. The in luence o coo dina ion ligands on he
biological e ec o he esul an molecule has been in dep h s udied wi h a a ie y o
assays ha includes analysis o apop o ic popula ions, measu emen o eac i e oxygen
species le els and analysis o ce ain enzyma ic and p o eic ac i i ies among o he s.
Mo eo e , a no el d ug combina ion con aining an alkynyl gold(I) de i a i e and plan
ex ac s has been de eloped, he an ibac e ial ac i i y o a se ies o gold(I) de i a i es
has been e alua ed acco ding o d ug epu posing philoso y and he eplacemen o
gold(I) by sil e (I) in ega ds o an i-colo ec al cance ac i i y has been s udied. Tex has
been s uc u ed on ou chap e s de ailed below.
On he i s chap e , he an i umo e ec o h ee alkynyl gold(I) de i a i es
coo dina ed wi h wa e soluble phosphines has been e alua ed on Caco-2 cell line:
[Au(C≡CPh)(PTA)] (1a), [Au(C≡CPh)(DAPTA)] (1b) y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). I was
obse ed ha appa en ly minimal changes on molecule design migh lead o g ea
di e ences ega ding o he mechanism o ac ion o an an i umo d ug. Complex
[Au(C≡CPh)(PTA)] inhibi ed edox enzyme hio edoxin educ ase and induced an
inc ease in eac i e oxygen species le els, hus leading o in insic apop o ic cance cells
dea h. On he o he hand, complex [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] did no show any a ini y o
his enzyme and igge ed nec op osis ins ead o apop osis. This swich on he
mechanism o ac ion migh be explained by complex agg ega ion on mi ochond ia,
which would lead o a high inc ease in eac i e oxygen species le els ha igge ed
p o ein RIP-1 ac i a ion, one o he main esponsibles o nec op osis.
On he second chap e , he combined e ec o complex [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a)
and acidic polyphenols ex ac om he osehip o Rosa canina on Caco-2 cell line was
s udied. The addi i e pha macological in e ac ion was esponsible o an inc ease in
an i umo ac i i y in compa ison o he e ec o each agen indi idually. D ug
combina ion induced a blockage o nec op osis igge ed by he me allod ug; ins ead,
d ug combina ion lead o apop o ic cell dea h, p obably due o an impai men o he
au ophagic lux igge ed by lysosomes alkaliza ion, which was caused by mi ochond ial
no mal unc ion dis up ion, was obse ed. Since he obse ed e ec s we e no no iced
17
upon cell cul u e ea men wi h he single agen s, he ob ained esul s migh be a di ec
consequence o he concomi an addi ion o bo h o hem.
On he hi d chap e , he in luence o he molecule de i ed om 3-hyd oxy la one
uni as ligand in ou se ies o alkynyl gold(I) de i a i es, namely [Au(L2a-d)PPh3],
[Au(L2a-d)PTA], [Au(L2a-d)(IMe)] and [Au(L2a-d)(IP )], was e alua ed. Whe eas he
phosphine de i a i es showed a p omising an i umo e ec as well as adequa e
selec i i y as will be de ailed below, ca bene de i a i es we e disca ded as po en ial
chemo he apeu ic agen s due o hei low an i umo po en ial compa ed wi h he
phosphine analogues. Howe e , some o hem showed ce ain an ibac e ial e ec
owa ds bo h G am posi i e and G am nega i e s ains.
The an i umo po en ial o he phosphine de i a i es was e alua ed on Caco-2 cell
line and on wo addi ional umo models (MCF-7 and HepG2 cell lines, b eas
adenoca cinoma and hepa oca cinoma espec i ely) o analyze a likely selec i i y
owa d colo ec al cance , and he colo ec al cance model showed he bes esponse o
ea men . An in-deep s udy o he mechanism o ac ion o he mos ac i e complexes,
[Au(L2b)PPh3] and [Au(L2c)PTA], e ealed ha complex [Au(L2b)PPh3] inhibi s bo h
hio edoxin educ asa and cyclooxygenase-2 enzymes, leading o a edox balance
dis up ion and apop osis, whe eas complex [Au(L2c)PTA] was able o block edox
enzymes glu a hione educ ase and hio edoxin educ ase ac i i ies as well as
cyclooxygenase-1, igge ing apop o ic cell dea h; howe e , i s p o-apop o ic e ec
seems o be lowe han he obse ed o [Au(L2b)PPh3] on he i s 24h o incuba ion,
which migh be a consequence o an inc ease in cy op o ec i e au ophagy as a esponse
o ea men . Ne e heless, bo h de i a i es a e conside ed as mul i a ge complexes
and appa en ly selec i e owa d colo ec al cance , which migh be o g ea in e es in
o de o eplace oxalipla in.
On he ou h chap e , a se ies o gold(I) and sil e (I) de i a i es wi h ligands de i ed
om 2-anilino-py idine we e analyzed. A e in-deep analyzing he biological ac ion o
complexes [Au(L1)(PPh3)](T O) and [Ag(T O)(L1)(PPh3)], whe e L1 consis s o an
adi ional py idine moi ie, i was obse ed ha hey did no sha e molecula a ge s, a
leas when incuba ed a hei IC50 alues. Gold de i a i e [Au(L1)(PPh3)](T O) was ound
o be able o inhibi ing edox enzyme hio edoxin educ ase and 20S p o easome, hus
being a mul i a ge complex, whe eas he mechanism o ac ion o sil e complex
[Ag(T O)(L1)(PPh3)] emains unclea , al hough he ob ained da a sugges ha
mi ochond ial dis up ion migh lead o ROS-independen apop osis. On he o he hand
ea men o Caco-2 cells wi h complex [Au(L1)(PPh3)](T O) esul ed in an inc ease o
caspase 8 ac i a ion, which sugges s ha gold(I) de i a i es migh be able o igge
ex insic apop osis as well as he in insic pa hway as has been widely epo ed
p e iously. The lack o a sha ed mechanism o ac ion be ween gold(I) and sil e (I)
de i a i es migh be indica i e o an absence o c oss- esis ance among hem. Las ly, in
18
his speci ic case, he gold complex [Au(L1)(PPh3)](T O) migh be o g ea e in e es han
i s sil e analogue [Ag(T O)(L1)(PPh3)] o colo ec al cance ea men , since he gold(I)
de i a i e shows highe selec i i y han i s sil e (I) analogue despi e o displaying
compa able e icacy.
In summa y, collec ed da a sugge s ha he es ed gold(I) de i a i es migh display a
p omising u u e as chemo he apeu ic agen s o colo ec al cance he apy, gi en hei
highe selec i i y in compa ison o e e ence d ugs and e en hei g ea e e icacy in
some cases.
19
ABREVIACIONES
Δψ: po encial de memb ana mi ocond ial
AECC: Asociación Española Con a el Cánce
AP: Acidic Polyphenol; poli enoles ácidos
Apa -1: Apop osis P o ease-Ac i a ing Fac o 1; ac o induc o de apop osis 1
Au ano in: 2,3,4,6- e a-6-ace il-1- io-β-D-glucopi anosa o-S- i enil os ina o o(I)
BSA: Bo in Se um Albumin; albúmina sé ica bo ina
CIMP: CpG Island Me hyla o Pheno ype; eno ipo me ilado de las islas CpG
CIN: Ch omosomal ins abili y; ines abilidad c omosómica
Cispla ino: cis-diaminodiclo opla ino(II)
COX: ciclooxigenasa 2
CQ: clo oquina
CRC: Colo ec al Cance ; cánce colo ec al
DAPTA: 3,7-diace il-1,3,7- iaza-5- os abiciclo[3.3.1]nonano
DC: D ug Combina ion; cóc el a macológico
DHFR: dihid o ola o educ asa
DMARDs: Disease-Modi ying An i heuma ic D ugs
DMSO: dime ilsul óxido
DTNB: 5,5-di hio-bis(2-ni obenzoic acid)
FBS: Fe al Bo ine Se um
FDA: Food and D ug Adminis a ion
FITC: Fluo escein iso iocyana e
GC: Gold Complex; complejo de o o
GR: glu a ión educ asa
H2DCF-DA: 2’,7’-dichlo odihyd o luo escein diace a e
HSA: Human Se um Albumin; albúmina sé ica
20
IAPs: Inhibi o y Apop osis P o eins; p o eínas inhibi o ias de la apop osis
IMe: 1,3-dime ilimidazol-2-ilideno
IP : 1,3-bis(2,6-di-i-p opil enil)imidazol-2-ilideno
LADME: Libe ación, Abso ción, Dis ibución, Me abolismo y Exc eción
MLKL: Mixed Lineage Kinase Domain-Like
MOMP: Mi ochond ial Ou e Memb ane Pe meabiliza ion; pe meabilización de la
memb ana ex e na mi ocond ial
MSI: Mic osa elli e ins abili y; ines abilidad de los mic osa éli es
MTT: 3-(4,5-dime hyl-2- hiazoyl)-2,5-diphenyl e azolium b omide
NAC: N-ace il-cis eína
Nec-1: nec os a ina-1
NF-κB: Nuclea Fac o Kappa-Ligh -Chain-Enhance o Ac i a ed B Cells
NP: Neu al Polyphenols; poli enoles neu os
PARP-1: poli ADP ibosa polime asa 1
PBS: Phospha e Bu e ed Saline
PTA: 1,3,5- iaza-7- os aadaman ano
RIP-1: Recep o In e ac ing P o ein 1
ROS: Reac i e Oxygen Species; especies eac i as de oxígeno
SEOM: Sociedad Española de Oncología Médica
SI: Selec i i y Index; índice de selec i idad
SRB: Sul o hodamine B
TE: To al Ex ac ; ex ac o o al
TNF: Tumo Nec osis Fac o ; ac o de nec osis umo al
TNFR1: TNF Recep o 1
T xR: io edoxina educ asa
VEGF: Vascula Endo helial G ow h Fac o ; ac o de c ecimien o del endo elio ascula
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
27
Figu a 3. Rep esen ación esquemá ica de los pasos de la secuencia adenoma-ca cinoma en la
mucosa in es inal a lo la go del iempo.
Los ac o es de iesgo del CRC pueden clasi ica se en dos g andes g upos:
modi icables y no modi icables (Figu a 4). Los ac o es de iesgo no modi icables pueden
di idi se, a su ez, en p ima ios y secunda ios. Los p ima ios son debidos a as o nos
gené icos he edi a ios, y son los esponsables de solamen e una p opo ción muy baja
den o del o al de casos de cánce de colon12, mien as que los secunda ios son
consecuencia de una en e medad p eexis en e, p incipalmen e los as o nos que se
engloban bajo el é mino “en e medad in lama o ia in es inal”. A es e espec o es
necesa io ma iza que, si bien el indi iduo no iene con ol sob e la exis encia p e ia de
es os ac o es, sí puede, has a cie o pun o, e asa la o mación de los umo es y
mejo a su p onós ico en caso de que lleguen a apa ece , a a és de los ac o es no
modi icables21. Se plan ea án a con inuación dos ejemplos pa a ilus a es a
in e dependencia en e los ac o es de iesgo no modi icables y los modi icables:
- El sínd ome de Lynch es un as o no gené ico he edi a io que se conside a
ac o de iesgo no modi icable de ipo p ima io, y es á elacionado con la
p edisposición a su i di e sos ipos de umo es, en e ellos el colo ec al. No
obs an e, no odos los pacien es que su en es a en e medad acaban
desa ollando CRC, lo que sugie e que debe exis i algún ac o exógeno que
in luencie la apa ición de es e as o no. Es udios epidemiológicos han pues o el
oco sob e el abaquismo y la obesidad como los p incipales ac o es de iesgo
de desa olla un umo colo ec al en pe sonas con la en e medad de Lynch22,23.
- El abaco puede ag a a ambién las lesiones de los pacien es de en e medades
in lama o ias in es inales y con ibui a la o mación de un adenoma, ya que
inc emen a la in lamación de la mucosa al mismo iempo que induce disbiosis21.
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
28
Figu a 4. Fac o es de iesgo que in luyen sob e la apa ición de un umo colo ec al. Se clasi ican
en no modi icables y modi icables, los cuales a su ez pueden in lui sob e los p ime os al
acele a o ena el desa ollo de la masa umo al.
Como ya se había adelan ado, no cabe duda de que el es ilo de ida iene un g an
peso en la apa ición y el desa ollo de los umo es colo ec ales. Es a in luencia puede
es a mediada po dos ías. Po un lado, de e minados ac o es exógenos pueden
po encia una acumulación de po enciales ca cinógenos en el ac o gas oin es inal. El
abaquismo es el mejo exponen e de es e supues o, ya que en e sus componen es
apa ecen di e sas moléculas de p obado e ec o mu agénico, además de se capaces de
induci disbiosis como se ha mencionado an e io men e21. Po o o lado, el es ilo de ida
ambién puede al e a la homeos asis edox e induci p ocesos in lama o ios en la
mucosa in es inal. Tan o el es és oxida i o como la in lamación c ónicos pueden da
luga a las lesiones in es inales que pod ían ac ua como p ecu so as del CRC (Figu a 3).
En lo ela i o al papel de la die a, es muy habi ual cae en la alacia de supone que
exis en alimen os p o ec o es y alimen os dañinos. Sin emba go, no es an impo an e
la con ibución de un único alimen o conc e o sino el cómpu o global de alimen os
consumidos po la pe sona a lo la go de su ida dia ia lo que pod ía in lui sob e la
apa ición de umo es colo ec ales. En es e aspec o, debe ene se en cuen a además el
impac o de la globalización sob e la die a. T adicionalmen e, los alimen os que se
consumían en una egión e an los que se p oducían en esa zona conc e a. Es o pe mi ía
habla de pa ones die é icos muy di e en es en e sí, como la die a medi e ánea o la
die a nó dica. Ambos casos enían en común un al o consumo de u as y e du as,
pescado azul y ce eales, di e en es en cada caso dependiendo de las condiciones
climá icas de cada egión, en e o os muchos ac o es. La globalización ha di uminado
las an es bien de inidas on e as en e los di e en es egímenes alimen icios a ni el
mundial, pe mi iendo que puedan consumi se de mane a habi ual p oduc os que
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
29
an iguamen e esul aba imposible adqui i . El p incipal incon enien e de es a si uación
apa ece cuando se impo an compo amien os que pueden in lui nega i amen e sob e
la salud del indi iduo. El más cla o exponen e es la denominada die a occiden al
(Wes e n Die ). La pied a angula de es e pa ón die é ico son los alimen os
ul ap ocesados, icos en g asas animales, sal y azúca es, en de imen o de un consumo
egula de u as y e du as escas. Mien as que la adhe encia a pa ones die é icos
adicionales, como es la die a medi e ánea en nues o país, se asocia con una meno
incidencia de en e medades degene a i as, en e ellas CRC, la die a occiden al induce
in lamación y disbiosis, po lo que se la conside a en pa e esponsable de la apa ición
de es e as o no24–26 (Figu a 5). Los países en ías de desa ollo son un cla o e lejo de
la elación en e die a occiden al y cánce colo ec al, ya que la indus ialización ha ido
de la mano con la adopción de es a die a y un ala man e aumen o de la incidencia de la
en e medad. El inc emen o del núme o de casos unido a la ausencia de p og amas de
de ección p ecoz ha hecho que la asa de mue e es mayo en es as zonas que en países
con una economía más consolidada13,14.
Figu a 5. Rep esen ación esquemá ica de las p incipales di e encias a ni el de con enido en e
la Wes e n die y la die a medi e ánea, así como sus p incipales e ec os en elación al iesgo de
su i cánce colo ec al.
De lo an e io se deduce que el consumo habi ual de alimen os de o igen ege al
pod ía ene un e ec o p e en i o en la apa ición de los umo es colo ec ales. Se c ee
que los esponsables de ello son su con enido en ib a y poli enoles. Bajo el é mino
ib a se engloban odos aquellos polisacá idos que no son dige idos ni abso bidos po el
ac o in es inal. El des ino de dichos polisacá idos es, o bien pasa a o ma pa e de las
heces, o bien se ap o echados po algunas bac e ias de la lo a in es inal; a es os
úl imos se les denomina p ebió icos, é mino que no debe se con undido con
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
30
p obió ico (mic oo ganismos i os que son adminis ados pa a modi ica la lo a no mal
del indi iduo, po ejemplo median e alimen os uncionales)27. El componen e
mayo i a io de la ib a es la celulosa, aunque ambién con iene almidón esis en e o
pec inas en e o os. El consumo de ib a se asocia, po un lado, a un aumen o del
ánsi o in es inal y a un inc emen o del olumen de las heces. En consecuencia, los
po enciales ca cinógenos que se encuen en en el lumen an a es a más diluidos y
pe manece án menos iempo en con ac o con el epi elio in es inal, educiendo las
posibilidades de que causen al e aciones gené icas21,28. Po o a pa e, el po encial
p ebió ico de algunos de es os polisacá idos a o ece la p oli e ación de bac e ias
p oduc o as de bu i a o. El bu i a o es un ácido g aso de cadena co a que p omue e la
exp esión de genes p o-apop ó icos en las células in es inales, po lo que posee
po encial an i umo al. Es un p oduc o no mal del me abolismo de las bac e ias
bu i ogénicas as la e men ación de algunos polisacá idos. El consumo de p ebió icos
iene un bene icio secunda io, ya que un aumen o en la p opo ción de bac e ias
bu i ogénicas iene como consecuencia una disminución en el núme o de o as especies
que pueden p omo e la o mación de umo es, en e las que des aca Fusobac e ium
nuclea um12,21,29. Es e po encial de los p ebió icos de co egi una po encial disbiosis y
educi así el iesgo de desa olla un umo colo ec al puede e se bene iciado po el
consumo concomi an e de alimen os uncionales icos en p obió icos30, ya que
con ibui ía a aumen a la población de bac e ias “p o ec o as” y disminui a la de
bac e ias po encialmen e pelig osas.
Los poli enoles, po su pa e, son un g upo de me aboli os secunda ios de las plan as,
he e ogéneo en cuan o a su es uc u a química y a las unciones que desempeñan
den o del ege al. En si uación basal, los poli enoles es án implicados en el desa ollo
de la plan a, su pigmen ación o la de ensa en e a pa ógenos úngicos, po ejemplo,
aunque son de especial in e és en la espues a adap a i a en e a di e en es ipos de
es és: sequía, suelos con al a salinidad o empe a u as ex emas, po ci a algunos. La
plan a modi ica su composición enólica, an o en con enido como en can idad, pa a
aumen a sus p obabilidades de éxi o en e a es os ac o es ambien ales des a o ables.
También in luyen ac o es endógenos sob e la composición enólica, siendo el más
e iden e la edad del ege al. Es deci , la composición en poli enoles de una plan a es a á
de e minada po las condiciones en las que se ha desa ollado y su edad,
p incipalmen e. De ello se deduce que dos plan as de la misma especie que hayan
c ecido en egiones di e en es no an a ene la misma composición en poli enoles y,
po supues o, es a composición a ia á incluso más en e di e en es ipos de plan as31–
34. Al ma gen de sus unciones en el ege al en el que se o iginan, en el o ganismo
humano los poli enoles ac úan como an ioxidan es y an iin lama o ios. De ahí su posible
e ec o p e en i o en la apa ición de umo es colo ec ales, ya que se c ee que pueden
educi la in lamación y el es és oxida i o en la mucosa in es inal y disminui así la
posibilidad de adqui i mu aciones que conduzcan a la ans o mación umo al (Figu a
3). En es e sen ido, un es udio ealizado po in es igado es de la Uni e sidad Pública de
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
31
Na a a y la Uni e sidad de Za agoza, en el que pa icipó la au o a de la p esen e esis
doc o al, demos ó el e ec o p o ec o de poli enoles ex aídos de las pa es no
comes ibles de la alcacho a sob e un modelo de la mucosa in es inal some ida a es és
oxida i o exógeno. Los au o es sugie en que los poli enoles pod ían u iliza se como
ing edien es cla e en nue os alimen os uncionales que mejo en la homeos asis del
colon en pe sonas con un iesgo medio de desa olla es a en e medad35.
No obs an e, ya que el CRC es una en e medad mul i ac o ial, lle a un es ilo de ida
adecuado no es ga an ía de no llega a desa olla en algún momen o un umo
colo ec al. Además, debe ene se en cuen a que los g upos de bajo iesgo no en an en
los p og amas de de ección p ecoz, y dado que las e apas iniciales de la en e medad son
asin omá icas, la lesión p ecance osa puede no se ex i pada a iempo en odos los
casos. Una ez que la secuencia adenoma-ca cinoma se ha comple ado y se ha
es ablecido un ca cinoma en la egión colo ec al, se pueden dis ingui a ias e apas de
acue do con el g ado de desa ollo e in asión del umo . Es as e apas o es adios se
co elacionan con la p ognosis y de e minan el ipo de a amien o a escoge . El sis ema
de es adi icación TNM (Tamaño-Nodo-Me ás asis) es uno de los más u ilizados pa a
de e mina la e apa de desa ollo de un umo . Se basa en el análisis de es pa áme os,
y el es udio conjun o de los alo es ob enidos pa a cada pa áme o de e mina el es adio
de la en e medad36,37. Dichos pa áme os son:
- G ado de in asión local (Local in asion dep h; pa áme o T). Hace e e encia, a
g andes asgos, al amaño del umo y a cuán as de las capas de la pa ed
in es inal se han is o a ec adas.
- Ni el de p opagación a los ganglios lin á icos adyacen es (Lymph node
in ol emen ; pa áme o N). Dependiendo del g ado de a ance del umo , es e
puede a ec a a los ganglios lin á icos más ce canos a la zona en la que se o igina.
- P esencia de me ás asis en egiones dis an es al pun o en el que se o mó
inicialmen e la masa umo al (P esence o dis an me as ases; pa áme o M).
De acue do con es os pa áme os, se ob iene inalmen e la es a i icación de los
g ados de ag esi idad de un umo que se mues a en la Figu a 6.
INTRODUCCIÓN: T ans o mación umo al. Apa ición y desa ollo del cánce colo ec al
32
Figu a 6. Rep esen ación esquemá ica de las di e en es e apas del desa ollo del CRC, siendo 0
la e apa menos a anzada y IV la más ag esi a.
Los umo es en los es adios del 0 al III se eliminan median e ci ugía, aunque pa a los
umo es en es adio III, además de los casos más g a es en es adio II, es necesa io lle a
a cabo ambién un a amien o de quimio e apia36. El abo daje de un umo en es adio
IV esul a bas an e más complicado, siendo algunos de ellos incluso incu ables. En es e
ex emo se suele ecu i a la combinación de a ias es a egias e apéu icas,
incluyendo ci ugía, quimio e apia y adio e apia38. Dependiendo de si la quimio e apia
se adminis a an es o después de la ci ugía, podemos habla de quimio e apia
adyu an e o neoadyu an e. La p ime a busca elimina oda célula umo al que haya
podido pe manece en el o ganismo as la ci ugía, mien as que la segunda se
adminis a p e iamen e a la esección pa a disminui el amaño de la masa umo al y
acili a el p ocedimien o. Po lo gene al, los umo es en es adios II y III eciben
quimio e apia adyu an e, mien as que la quimio e apia neoadyu an e es más p opia
del es adio IV o de casos muy a anzados en el es adio III39. En cualquie caso, ambas
ienen el mismo in: causa la mue e de las células umo ales. Po consiguien e, en el
p óximo apa ado se a a discu i en p o undidad el concep o de mue e celula , así
como algunas de las p incipales ías a a és de las cuales se induce es e p oceso.
INTRODUCCIÓN: Mue e cellula . Apop osis, nec op osis y au o agia
33
1.2. MUERTE CELULAR. APOPTOSIS, NECROPTOSIS Y AUTOFAGIA
A pesa de que en la ac ualidad se sabe que son a ias las ías a a és de las cuales
puede p oduci se la mue e de las células, que de acue do con lo desa ollado has a el
momen o es el obje i o úl imo de la quimio e apia, las dos más es udiadas y, po lo
an o, mejo ca ac e izadas, son apop osis y nec osis.
La apop osis o mue e p og amada es un p ocedimien o habi ual en el o ganismo
pa a man ene una can idad cons an e de células, así como pa a elimina células que
hayan su ido algún daño y no puedan ealiza su unción co ec amen e. Es e p oceso
es á al amen e egulado y culmina con la ac i ación de unas p o easas denominadas
caspasas ejecu o as, las caspasas 3, 6 y 7. La unción de es as caspasas ejecu o as
consis e en des ui di e sas es uc u as del in e io celula , en e las que se encuen an
los ilamen os de ac ina del ci oesquele o, de modo que se p oduce un cambio en la
mo ología celula obse able median e mic oscopía óp ica. El encogimien o celula a
acompañado de una pé dida de sus conexiones con las células adyacen es. Se p oduce,
además, una condensación y pos e io agmen ación del núcleo celula . Finalmen e, la
célula apop ó ica de i a en una se ie de pequeñas esículas denominadas cue pos
apop ó icos. Los cue pos apop ó icos se o man a pa i de la memb ana plasmá ica,
que o ma esículas que con ienen los dis in os o gánulos y agmen os del núcleo. Los
cue pos apop ó icos se án agoci ados po los mac ó agos del sis ema inmune,
inalizando así la apop osis40,41. O a de las dianas de las caspasas ejecu o as son las
DNAsas, que quedan ac i adas en consecuencia y deg adan el ADN nuclea . La
agmen ación del ADN se p oduce en un ca ac e ís ico pa ón en escale a, que
adicionalmen e ha sido uno de los ma cado es molecula es del p oceso apop ó ico al
analiza lo median e elec o o esis41.
La ac i ación de las caspasas ejecu o as puede da se a a és de dos ías dis in as,
que se di e encian en el es ímulo que induce el inicio de la apop osis (Figu a 7). Po un
lado, la ía ex ínseca depende de la ac i ación de los denominados ecep o es de
mue e. Dichos ecep o es pe enecen a la amilia de los ecep o es del ac o de
nec osis umo al (Tumo Nec osis Fac o , TNF) y se encuen an en la supe icie ex e io
de la célula, siendo algunos ejemplos Fas, TNFR1 o T ail42. Los dis in os ligandos de es os
ecep o es se encuen an exp esados en la supe icie de células del sis ema inmune. La
unión en e ligando y ecep o p omue e la mig ación de la p o-caspasa 8 a la
memb ana plasmá ica, lo cual esul a en su ac i ación. Una ez la caspasa 8 es á
ac i ada, es esponsable de la inducción de la apop osis de mane a di ec a o indi ec a,
dependiendo del ipo de célula. De acue do a cómo esponden a la ac i ación de la
caspasa 8, se puede clasi ica a las células en ipo I y ipo II. En las células ipo I, la caspasa
8 ac i a a las caspasas ejecu o as sin necesidad de in e media ios, mien as que en las
células ipo II es necesa ia la inhibición de las p o eínas inhibi o ias de la apop osis
INTRODUCCIÓN: Mue e cellula . Apop osis, nec op osis y au o agia
34
(Inhibi o y Apop osis P o eins; IAPs) median e p o eínas libe adas po la mi ocond ia,
en e las que des aca Smac43,44.
La apop osis in ínseca, po su pa e, puede se causada po una g an a iedad de
es ímulos. A g andes asgos, es os es ímulos se pueden di idi en posi i os y nega i os.
Los es ímulos nega i os son aquellas sus ancias que p omue en la supe i encia de la
célula en condiciones no males, como algunas ho monas, ci oquinas o ac o es de
c ecimien o, de modo que su ausencia en el medio ex acelula supone la señal de inicio
pa a la ac i ación de la maquina ia apop ó ica. Los ac o es posi i os inducen daños en
la célula que la hacen inadecuada pa a un co ec o uncionamien o, po lo que debe se
eliminada. En e es os ac o es se cuen an los ni eles al os de especies eac i as de
oxígeno (Reac i e Oxygen Species; ROS), in ecciones í icas o la en ada de oxinas en la
célula. Una g an can idad de á macos quimio e apéu icos, en e ellos el cispla ino45,
del que se habla á más adelan e, ac úan como iniciado es de la ía in ínseca de la
apop osis.
En espues a a los daños p oducidos po los es ímulos mencionados, se ompe el
equilib io en e las p o eínas p o y an i-apop ó icas de la amilia Bcl-2. En si uación
basal, ambos ipos de p o eínas se encuen an en la misma p opo ción en el in e io
celula , y las an i-apop ó icas inhiben a la acción de sus análogas median e in e acciones
p o eína-p o eína. Al ompe se el equilib io en a o de las p o-apop ó icas, en e las
que des acan BAX y BAK, és as pod án lle a a cabo su unción no mal, que no es o a
que gene a po os en la memb ana ex e na mi ocond ial. Como consecuencia, se
induce un aumen o de la pe meabilización de la memb ana ex e na mi ocond ial
(Mi ochond ial Ou e Memb ane Pe meabiliza ion, MOMP), lo que se aduce en una
pé dida del po encial de memb ana mi ocond ial. Además, se p oduce la libe ación de
p o eínas mi ocond iales como la an e io men e mencionada Smac o el ci oc omo c.
Es e úl imo esul a de especial in e és po su ele ancia a la ho a de o ma el complejo
p o eico denominado apop osoma jun o con Apa -1 (Apop osis P o ease-Ac i a ing
Fac o 1). El apop osoma induce la ac i ación de la caspasa 9, la cual a su ez ac i a á a
las caspasas ejecu o as43,46.
Aunque ambas ías con e gen en la ac i ación de las caspasas ejecu o as, es e no es
su único pun o en común, ya que la caspasa 8 ambién es capaz de induci la MOMP.
Es o es a causa de su capacidad de ac i a a la p o eína BID, la cual a su ez puede ac i a
a las p o eínas p o-apop ó icas BAX y BAK pa a que induzcan la o mación de po os en
la mi ocond ia44.
INTRODUCCIÓN: Mue e cellula . Apop osis, nec op osis y au o agia
35
Figu a 7. Vías ex ínseca e in ínseca de la apop osis.
Exis e una es echa elación en e la apop osis y el a ance en el ciclo celula , siendo
es e el conjun o de ases que conducen a la di isión de una célula en dos células hijas. A
g andes asgos, el ciclo celula cons a de dos ases: in e ase y di isión. Exis e, a su ez,
una e apa quiescen e o G0, du an e la cual la célula no se p epa a pa a di idi se. En la
ase G0, la célula lle a a cabo las unciones p opias del ejido en el que se encuen a, y
se man end á en es e es ado has a que sea necesa io di idi se, po ejemplo, al
p oduci se algún daño en el ejido que equie a de nue as células pa a sus i ui a las
al e adas. Cuando la célula comienza el p oceso de di isión, pasa de es e es ado
quiescen e a la p ime a de las e apas de la in e ase, la ase G1. El obje i o de es a e apa
es con ola la in eg idad del genoma pa a asegu a la ausencia de mu aciones que
pudiesen esul a en células hijas al e adas. Pa a ello, exis en los denominados pun os
de con ol del ciclo celula (Figu a 8). A con inuación, se en a en la ase S, en la que se
p oduce la eplicación del ADN. De es a e apa se pasa a la ase G2, cuya azón de se es
idén ica a la de la ase G1: asegu a que no exis en e o es en el nue o ADN eplicado.
Es as es e apas cons i uyen la in e ase, que da paso a la ase M, en la que se p oduce
inalmen e la di isión celula 47–49.
La azón que subyace a la an es mencionada elación en e apop osis y ciclo celula
es que un cese en la p oli e ación del cul i o suele i acompañado po un inc emen o en
la asa de mue e celula . Ambos p ocesos es án es echamen e egulados po los genes
sup eso es de umo es ales como TP53, de modo que mu aciones en los mismos
conduci án no solo a una pé dida de sensibilidad hacia la mue e celula sino ambién a
un aumen o de la p oli e ación. En e o as unciones, la p o eína p53 es capaz de
induci un cese en el a ance en e ases del ciclo celula , lo que se aduce en un
d amá ico aumen o del núme o de e en os en una ase en conc e o, siendo las más
INTRODUCCIÓN: Mue e cellula . Apop osis, nec op osis y au o agia
36
habi uales G1 y G2. Es o es debido a que, al ac i a se, p53 bloquea a las p o eínas
esponsables de la ansición en e ases, que son las ciclinas D y E en el caso de la
ansición G1-S y la ciclina B pa a el paso en e la ase G2 y la mi osis. Es as ciclinas
cons i uyen los ya mencionados pun os de con ol del ciclo celula (Figu a 8). El es udio
de la dis ibución de las poblaciones celula es en cada ase del ciclo es un p oceso
habi ual a la ho a de de e mina el posible mecanismo de acción de un compues o, ya
que los compues os que p o ocan un a es o en la ase G2/M suelen causa más daños
que los que lo bloquean en la ase G0/G150–52. En es e sen ido, el hallazgo de un aumen o
en la población celula en la ase G2/M pod ía se una señal de ala ma en elación a la
oxicidad sob e ejidos sanos. Es a es una de las causas po las que la inducción de daños
sob e el ADN como p incipal mecanismo de acción de un á maco quimio e apéu ico53,54
puede esul a po encialmen e pelig oso, según se discu i á más adelan e.
Figu a 8. T ansición en el ciclo celula y p incipales pun os de con ol en e ases.
Exis en a ios pun os dignos de mención en cuan o a la in e conexión en e apop osis
y cánce . En p ime luga , en el apa ado 1.1. se mencionaba la pé dida de sensibilidad
a la mue e celula como uno de las p incipales consecuencias del p oceso de
ans o mación umo al4,5. Al p incipio del p esen e apa ado, se comen aba que una de
las unciones de la apop osis es elimina a las células dañadas, en e las que se cuen an
aquellas que han su ido la ans o mación maligna. La ans o mación umo al es un
p oceso que iene luga a dia io en el o ganismo humano, ya que los e o es en la
eplicación del ADN son algo habi ual; el p oblema apa ece cuando es as al e aciones
gené icas a ec an a genes elacionados con el con ol de la apop osis, pues o que
en onces es as células dañadas no se án eliminadas y pod án con inua p oli e ando,
dando luga así a un umo . Las mu aciones en genes sup eso es de umo es y p o o-
oncogenes elacionadas con es e espec o ienen como consecuencia p incipal la
sob eexp esión de p o eínas an i-apop ó icas de la amilia Bcl-2, de modo que impiden
la ac i ación de la ía in ínseca. Po el con a io, la exp esión de las caspasas ejecu o as
se encuen a en ni eles muy bajos55,56. En la Tabla 1 se ecogen los p incipales
mecanismos de esis encia a la apop osis que se elacionan con el desa ollo de las
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
43
1.3. QUIMIOTERAPIA. DESCUBRIMIENTO DE LAS PROPIEDADES
ANTITUMORALES DEL CISPLATINO.
Según se adelan aba en el apa ado 1.1, el p opósi o de la quimio e apia consis e en
induci la mue e de las células umo ales median e el uso de á macos. El medicamen o
quimio e apéu ico ideal debe ía euni dos ca ac e ís icas: se e ec i o, es deci , esul a
al amen e óxico pa a la célula cance osa, al iempo que selec i o, lo cual implica que
no causa daños sob e los ejidos sanos. En la ac ualidad, se dispone de una amplia gama
de compues os químicos que p esen an una po en e acción an i umo al, pe o de
limi ada selec i idad, dando luga a se e os e ec os secunda ios pa a el pacien e. En
consecuencia, aunque el a amien o log e inalmen e elimina el umo , una lac a muy
se ia del a amien o se á la me ma de la calidad de ida del pacien e oncológico. Debe
ene se en cuen a que el é mino “calidad de ida” hace e e encia a un concep o
comple amen e subje i o que engloba an o el bienes a ísico como emocional del
indi iduo, pe o que, educido a su mínima exp esión, se puede en ende como una
si uación de bienes a en la que el indi iduo es capaz de lle a una ida no mal con la
que se encuen e sa is echo92,93. Los concep os espe anza de ida y calidad de ida no
deben, po lo an o, con undi se. Las p ác icas clínicas ac uales han log ado aumen a
la p ime a, pe o es o no en odos los casos a acompañado po una mejo a de la
segunda. Los supe i ien es del cánce colo ec al expe imen an un de imen o de su
salud ísica que, en muchos casos, a unido a episodios de dep esión y de o os
as o nos psicológicos94–96. Po ello, es necesa io encon a una al e na i a a las
ac uales opciones a macológicas que sea selec i a además de e ec i a, pa a mejo a
an o la calidad como la espe anza de ida de los pacien es de cánce de colon.
Los dos pila es que sos ienen el desa ollo de e apias selec i as son la in es igación
básica y la medicina pe sonalizada. La in es igación básica es esencial pa a conoce las
di e encias en e una célula umo al y una célula sana, lo que pe mi i á iden i ica dianas
molecula es cla e y diseña los nue os compues os an i umo ales en consecuencia. Po
o a pa e, la medicina pe sonalizada implica ealiza un análisis en p o undidad de las
ca ac e ís icas bioquímicas de cada umo , pa a así pode escoge el mejo á maco o
combinación de á macos pa a un pacien e en conc e o. Ambas disciplinas equie en
iempo y una g an in e sión económica, además de necesi a de una comunicación
cons an e en e los in es igado es y los p o esionales de la medicina, pe o los bene icios
a ob ene son inmensos. Uno de los casos más ep esen a i os del g an a ance que
implica la unión de ambos concep os lo encon amos en el a amien o del cánce de
mama. An iguamen e, se endía a pensa que odos los umo es que se desa ollaban
en una zona conc e a del o ganismo e an iguales, po lo que se adminis aba el mismo
a amien o a odos los pacien es. No obs an e, no odos los pacien es de cánce de
mama espondían igual a la quimio e apia, lo que esul aba en una al a asa de
mo alidad. Po ello, se decidió analiza cada umo de mane a indi idualizada,
encon ándose di e encias signi ica i as en e unos y o os, siendo una de las más
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
44
e iden es la exp esión o no del ecep o de es ógenos en las células umo ales. Es o
pe mi ió diseña e apias di igidas hacia es a diana, en el caso de umo es que la
exp esaban, y aumen a el núme o de cu aciones de o ma conside able. De igual
o ma, se desa olla on nue as es a egias e apéu icas comple amen e di e en es pa a
los umo es que no exp esaban el ecep o de es ógenos, g acias a es udios pos e io es
que log a on iden i ica nue as dianas molecula es especí icas pa a cada sub ipo de
cánce de mama, aumen ando oda ía más la e icacia de la e apia97,98.
Los a ances ealizados a es e espec o en el desa ollo de e apias en e al cánce
colo ec al son más disc e os, pe o no po ello desdeñables. Día a día, se ca ac e izan
nue os bioma cado es que pe mi en un diagnós ico más ápido y iable del pe il
molecula del umo , lo que pe mi e al oncólogo escoge el a amien o más adecuado
pa a cada pacien e. Además, es as nue as écnicas de diagnós ico son menos in asi as,
más idedignas y más ba a as en compa ación con los mé odos adicionales como la
colonoscopia12,99. Es deci , en la ac ualidad con amos con he amien as que acili an la
oma de decisiones en lo ela i o a la quimio e apia pa a a a el cánce colo ec al. A
con inuación, se e oma á el concep o de quimio e apia adyu an e desa ollado
an e io men e pa a ahonda en los a ances de la medicina pe sonalizada en el
a amien o de es a clase de umo .
Según la de inición p e ia ( e apa ado 1.1) la quimio e apia adyu an e busca
educi las posibilidades de ecu encia y me ás asis as ex ae el umo median e
ci ugía, des uyendo a las células umo ales que hayan podido pe manece en el
o ganismo as la in e ención. Du an e el siglo XX, se enía la c eencia de que es e in
pod ía log a se con un único á maco muy po en e, de mane a simila a ecu i a un
solo an ibió ico pa a elimina una in ección bac e iana. No obs an e, como ya hemos
discu ido a lo la go de es a sección, el uso de agen es quimio e ápicos muy po en es
puede ene como consecuencia g a es e ec os secunda ios. Así, uno de los p incipales
a ances de la medicina pe sonalizada en la lucha con a el CRC ue el desa ollo de
cóc eles de á macos, es deci , combinaciones de a ios medicamen os, cada uno
di igido hacia una diana e apéu ica. Es a ap oximación con aba con dos g andes
en ajas. En p ime luga , pe mi ía educi las can idades indi iduales de cada
compues o, lo que suponía un meno iesgo de e ec os secunda ios po su acumulación
a la go plazo en los ejidos sanos. Po o o lado, se aumen aba la e icacia del a amien o
al a aca a la célula umo al po a ios lancos de mane a simul ánea. O a posible
es a egia consis e en u iliza un único á maco en combinación con adio e apia, ya que
el ejido i adiado es más sensible a la acción del agen e quimio e ápico y pe mi e
u iliza lo en una dosis meno pa a disminui los e ec os secunda ios. La Figu a 11
mues a un esumen de las posibles opciones a elegi pa a a a el cánce colo ec al
dependiendo del es adio en el que se encuen a, mien as que en la Figu a 12 se ecogen
las es uc u as químicas de algunos de los p incipales agen es quimio e apéu icos que
se mencionan en la igu a an e io 37,39.
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
45
Figu a 11. Esquema ización de los ipos de quimio e apia adyu an e a adminis a dependiendo
del es adio en el que se encuen a el umo colo ec al.
N
H
2
P
H
2
N
O
OO
OH
N
NH
F
O
O
H
NN
H
N
NH
N
H
N
O
O
HO
HO O
O H O
NH
2
Oxalipla ino 5-Fluo acilo
Leu oco in
Capeci abine
HO OH
O
N
N
F
HN
O
OCH
3
O
N
N O
ON
N
O
O
O
HO
I inoca ecán
Figu a 12. Es uc u a química de algunos de los p incipales agen es u ilizados en quimio e apia
adyu an e en e al cánce colo ec al.
De acue do con la Figu a 11, uno de los componen es más habi uales de los cóc eles
de quimio e ápicos u ilizados en e al CRC es un de i ado me álico de pla ino, el
denominado oxalipla ino ans-L-1,2-diaminociclohexanoxala opla ino(II). Es habi ual
adminis a lo jun o con moléculas o gánicas ales como leuco o in, 5- luo ou acilo,
capeci abine o i inoca ecán (Figu a 12), así como con an icue pos monoclonales. El
oxalipla ino es un ejemplo in e esan e ace ca de las en ajas de combina in es igación
básica y medicina pe sonalizada en la e apia en e al cánce colo ec al, y pa a
en ende el a ance que supuso es e á maco pa a los pacien es de CRC, es necesa io
habla en p ime luga de su p ecu so , el de i ado cispla ino.
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
46
Cispla ino es el nomb e común que ecibe el complejo cis-diaminodiclo opla ino(II),
cuya es uc u a se ecoge en la Figu a 13. El in e és de es e compues o eside en que
ue el p ime compues o de pla ino ap obado po la FDA (Food and D ug Adminis a ion)
pa a su uso en e apia clínica, así como el p ime compues o me álico en se ap obado
como á maco an i umo al. Los p ime os da os ace ca del cispla ino da an del siglo XIX,
cuando ue desc i o po p ime a ez, pe o no se ía has a los años 70 cuando se
descub i ía su acción an icance ígena.
N
H
2
P
H
2
N
O
OO
O
Oxalipla ino
H
3
N
P
H
3
N
Cl
Cl
Cispla ino
Figu a 13. Es uc u a química de los de i ados de pla ino cispla ino y oxalipla ino.
El paso p e io a es e hallazgo ue un abajo publicado en 1965 po los in es igado es
Rosenbe g, Van Camp y K igas, quienes obse a on que al adminis a es e compues o
a un cul i o de la bac e ia Esche ichia coli se log aba educi su c ecimien o, pues o que
el cispla ino impedía la di isión celula 100. Dada la al a asa de p oli e ación de las células
umo ales, se plan eó la posibilidad de que es e compues o ac uase de mane a simila
a la obse ada sob e un cul i o de células humanas cance osas. Así, se lle a on a cabo
di e sas in es igaciones ace ca del po encial an i umo al del cispla ino sob e dis in os
modelos umo ales, ob eniéndose esul ados muy p ome edo es. El g an éxi o de los
es udios p eclínicos llegó cuando se obse ó un descenso del c ecimien o de la masa
umo al en un modelo animal, lo que ab ió la pue a inalmen e a los ensayos en
humanos. En es a e apa, no obs an e, los esul ados ue on ag idulces. Po un lado, el
cispla ino mos aba una al a asa de e icacia sob e dis in os ipos de umo es, al y como
cabía espe a as los es udios p e ios. Sin emba go, esul aba muy óxico pa a los
ejidos sanos, p oduciendo una amplia gama de e ec os secunda ios en e los que
des acaban los daños a ni el enal y neu ológico. La aleg ía inicial que supuso el
descub imien o del cispla ino se en ió al obse a el descenso en la calidad de ida de
los pacien es a los que se les adminis aba85,101.
La azón po la cual el cispla ino esul a a la ez an po en e y dañino eside en su
mecanismo de acción (Figu a 14). Es e complejo es inicialmen e inac i o, y no se á has a
que en e a la célula y su a una eacción de acuación cuando se á capaz de lle a a cabo
su e ec o biológico. En la acuación, uno o los dos ligandos clo o de la molécula son
eemplazados po sendas moléculas de H2O. Es e p oceso ocu e espon áneamen e
debido a la baja concen ación del ion clo u o en el in e io de la célula. La especie
esul an e de sus i ui los ligandos clo u o po moléculas de agua posee dos ca gas
posi i as, po lo que sien e una ue e a acción po los g upos os a o que o man pa e
de las cadenas de ADN. La a inidad en e el cispla ino y las bases ni ogenadas es
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
47
especialmen e in ensa en el caso de la guanina, con la que se une de o ma co alen e a
a és del N7 del anillo imidazol. La in e acción en e el cispla ino y las bases
ni ogenadas iene como p ime a consecuencia la o mación de un monoaduc o. Los
monoaduc os pueden de i a en c uzamien os in a o in e heb a, en caso de que se
es ablezca una segunda in e acción en e el á maco y o a base ni ogenada. La
o mación de es os aduc os gene a o sión sob e la doble heb a de ADN, lo que le causa
se ios daños y es la p incipal causa de la mue e de la célula85,102. Aunque la célula
no malmen e cuen a con sis emas que econocen especí icamen e los aduc os ADN-
cispla ino y puede elimina los, algunos umo es poseen de iciencias en es e sis ema. Es
po ello que unos ipos de cánce an a esponde mucho mejo a la e apia con
cispla ino que o os85. En e los umo es sob e los que es ac i o el cispla ino se
encuen an algunos sub ipos de cánce de o a io, p ós a a, mama y cabeza y cuello. Sin
emba go, no se u iliza de o ma habi ual en e al CRC dado su escaso e ec o103.
Figu a 14. Esquema ización del mecanismo de acción del cispla ino en la célula umo al. T as
in e cambia los ligandos clo u o po moléculas de agua, se acumula en el núcleo y en la
mi ocond ia, o mando aduc os an o con el ADN genómico como con el mi ocond ial. Los daños
causados en el ADN mi ocond ial inducen un allo en el uncionamien o no mal de la
mi ocond ia, que iene como consecuencia una p oducción excesi a de ROS. El es és oxida i o
induce, a su ez, daños sob e el ADN genómico, que ya se encon aba al e ado po la p e ia
o mación de aduc os con el á maco. Es o conduce inalmen e a la mue e de la célula.
La o mación del monoaduc o inicial no siemp e conduce a un c uzamien o in a o
in e heb a, ya que exis e la posibilidad de que se o me un aduc o ADN-cispla ino-
p o eína, debido a la a acción en e el á maco ac i ado y los g upos iol de las
p o eínas. Las p o eínas que in e ienen en es a clase de aduc os son las que
no malmen e se encuen an en es echa conexión con el ADN, en e ellas las his onas,
y es os aduc os e cia ios bloquean el acceso al es o de p o eínas que deben
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
48
in e acciona con el ADN. Po ello, se impiden p ocesos como la eplicación o la
epa ación del ADN, con ibuyendo a la mue e de la célula85,104.
La a acción en e el ADN y el cispla ino no se limi a al ADN genómico, sino que el
ADN mi ocond ial ambién es suscep ible de o ma aduc os con el á maco. Es o gene a
un allo en es e o gánulo que da luga a al os ni eles de especies eac i as de oxígeno.
El es és oxida i o induce daños sob e dis in as es uc u as celula es, siendo uno de los
más g a es el gene ado sob e el ADN105. Las células umo ales, además, son
especialmen e sensibles a la up u a de su homeos asis edox, ya que gene an una
mayo p opo ción de ROS que una célula sana po su al a asa de p oli e ación. Pa a
compensa es a p oducción excesi a, sus de ensas an ioxidan es es án sob eexp esadas
en compa ación con las de una célula no umo al, pe o se es ablece así un equilib io
muy delicado cuya up u a iene como consecuencia ine i able la mue e de la célula
umo al106. Se ha obse ado que el es és oxida i o que se gene a en espues a a es e
a amien o es un componen e necesa io pa a la mue e de la célula umo al inducida
po el cispla ino jun o con la o mación de aduc os con el ADN (Figu a 14)107.
Re omando las conside aciones iniciales en elación a la impo ancia de que un
á maco sea al mismo iempo e ec i o y selec i o, no debe esul a so p enden e que el
uso clínico del cispla ino se ea limi ado po sus g a es e ec os secunda ios. Al es a su
mecanismo de acción basado en su a acción po las bases ni ogenadas del ADN y en la
p oducción de es és oxida i o, que es á mediada a su ez po su capacidad de daña al
ADN mi ocond ial, no se di ige con a una diana molecula exclusi a de la célula
umo al, ya que es a mac omolécula es á p esen e en odas y cada una de las células
del o ganismo. Se a a, pues, de un compues o con una selec i idad p ác icamen e
nula. Po ello, causa á se ios daños sob e células cuya asa de p oli e ación sea al a y,
además, en las que sean especialmen e sensibles al es és oxida i o. Según se
adelan aba en el apa ado 1.2, los daños en el ADN ienen como consecuencia un cese
del a ance en el ciclo celula en la ase G2/M, lo que se co esponde con g a es
al e aciones a ni el celula 52. La Tabla 3 ecoge las p incipales es uc u as a ec adas po
la e apia con cispla ino. A es os e ec os secunda ios consecuencia de un a amien o
de du ación de e minada, debe añadí seles el iesgo de que la e apia dé luga a nue os
umo es, en especial leucemias, dado el po encial e ec o mu ágeno del á maco a la go
plazo53,54.
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
49
Tabla 3. Resumen de las p incipales egiones del o ganismo a ec adas po el cispla ino y de las
consecuencias que ello conlle a pa a el pacien e.
REGIÓN AFECTADA
CONSECUENCIA
REFERENCIA
CÉLULAS DE LA CÓCLEA
Pé dida i e e sible de la
audición
She h
e al
.
108
CÉLULAS TUBULARES
RENALES
Insu iciencia
enal aguda
Vola e ic
e al
.
109
CÉLULAS MADRE
HEMATOPOYÉTICAS DE LA
MÉDULA ÓSEA
Mielosup esión
Basu
e al
.
53
CÉLULAS EPITELIALES DEL
TRACTO GASTROINTESTINAL
T as o nos
gas oin es inales: mucosi is,
náuseas, dia ea,
malabso ción, e c.
Shahid
e al
.
110
Además de que su uso clínico implique se ios iesgos pa a la salud del pacien e, exis e
un p oblema adicional a la e apia con cispla ino: la c ecien e esis encia de los umo es
al a amien o. Como su p opio nomb e indica, la esis encia a un medicamen o supone
una pé dida de su capacidad a macológica debido al desa ollo de mecanismos
adap a i os po pa e de la célula umo al. La esis encia a un medicamen o puede se
in ínseca o adqui ida. La p ime a clase implica que el umo jamás esponde á a ese
a amien o; en el segundo caso, el a amien o unciona ía inicialmen e, pe o pasado
un iempo pe de ía su e ec o po comple o. Es o es un enómeno ecuen e en los
umo es que eapa ecen as una emisión inicial111. En es e pun o, esul a in e esan e
in oduci los concep os de quimio e apia de p ime a elección y quimio e apia de
segunda elección, ya que es a úl ima es a la que se ecu e cuando alla la p ime a
opción, ecuen emen e en elación a la apa ición de esis encias.
En el caso conc e o del cispla ino, exis en a ias es a egias que las células umo ales
pueden lle a a cabo pa a sob e i i a la e apia83–85, en e las que se encuen an:
- Sob eexp esión de los sis emas de epa ación del ADN: se inc emen an los
ni eles de exp esión de aquellas p o eínas que econocen y eliminan los aduc os
cispla ino-ADN, e i ando el daño y, en consecuencia, la mue e celula .
- Descenso en los ni eles de exp esión del anspo ado que pe mi e la en ada
en la célula del cispla ino: con es o, la célula log a una meno concen ación
in acelula del á maco, lo que disminuye su e ec o an i umo al.
- Aumen o en la exp esión de anspo ado es de memb ana que expulsan al
cispla ino del in e io celula : el e ec o inal es el mismo que en el caso an e io .
INTRODUCCIÓN: Quimio e apia. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales del
cispla ino
50
- Inac i ación median e la conjugación con glu a ión o me alo ioneínas: es a
p opiedad se basa en la capacidad del complejo de es ablece uniones no
especí icas con di e sas es uc u as del in e io celula , en e las que se
encuen an, como se ha mencionado an e io men e, las p o eínas. Los aduc os
esul an es no son óxicos pa a la célula.
- Des egulación de la maquina ia apop ó ica: según se adelan aba en el apa ado
1.2, algunos umo es pueden desa olla una pé dida de sensibilidad a la mue e
ía apop osis en espues a a una exposición p olongada a un medicamen o66,67.
En el caso conc e o del cispla ino, los mecanismos más habi uales son los que
implican la up u a del equilib io en e p o eínas p o y an i-apop ó icas.
INTRODUCCIÓN: Búsqueda de soluciones a las limi aciones del cispla ino
51
1.4. BÚSQUEDA DE SOLUCIONES A LAS LIMITACIONES DEL
CISPLATINO
A la is a de los p oblemas de i ados del uso clínico del cispla ino, du an e los úl imos
años se han lle ado a cabo nume osos in en os con el in de educi sus e ec os
secunda ios y/o e i a la esis encia adqui ida po los umo es. Es as es a egias pod ían
engloba se en es g upos: uso de nanopo ado es, diseño de análogos a pa i de
modi icaciones de la es uc u a química del cispla ino y desa ollo de e apias
combina o ias.
El obje i o de los nanopo ado es o nanoca ie s consis e en acili a la llegada del
á maco al mic oen o no umo al. Con es o se consigue, po un lado, maximiza la
can idad del agen e quimio e ápico que en a en las células cance ígenas, con lo que la
e icacia del a amien o aumen a conside ablemen e. Po o o, se educe la
concen ación de á maco en el es o de ejidos, pa a disminui los e ec os secunda ios.
Exis en o as en ajas al ma gen de es os dos pun os cla e, en e las que se encuen an
aumen a la ida ú il del á maco, pues o que su exposición a agen es educ o es y/u
oxidan es se e educida, o acili a su en ada en la célula, especialmen e ú il pa a
moléculas con un ma cado ca ác e hid ó ilo112. Un ejemplo de nanoca ie que ha sido
u o de nume osas in es igaciones du an e los úl imos años son las nanopa ículas de
o o, ya que p esen an una se ie de p opiedades que las hace muy in e esan es pa a el
anspo e de á macos quimio e apéu icos en el o ganismo. Des aca su capacidad de
uncionaliza las pa a maximiza su concen ación en el mic oen o no umo al113. El uso
de nanopa ículas de o o pa a mejo a la e apia con cispla ino pe mi e aumen a la
e icacia del a amien o a la pa que educi sus e ec os secunda ios114–117. No obs an e,
los nanoca ie s ambién pueden da p oblemas po su oxicidad in ínseca118, po lo
que es a es a egia oda ía debe se op imizada pa a pode u iliza con segu idad a
aquellos agen es quimio e apéu icos que, como el cispla ino, sean po encialmen e
dañinos pa a los ejidos sanos.
Po o a pa e, modi ica la es uc u a química del cispla ino pa a educi sus e ec os
secunda ios ha conducido a la sín esis de oda una se ie de análogos del mismo, algunos
de los cuales han sido ap obados po la FDA y pos e io men e a ni el mundial
(ca bopla ino y oxalipla ino), mien as que o os son u ilizados en países conc e os
(lobapla ino en China, hep apla ino en Co ea del Su y nedapla ino en Japón) (Figu a 15).
La p ime a oleada de análogos del cispla ino que se desa olla on as el descub imien o
de sus p opiedades an i umo ales en los años 60 se denomina on análogos de segunda
gene ación, en e los que des aca el ca bopla ino. Es e complejo se di e encia de su
p edeceso en que los ligandos clo u o ue on sus i uidos po el ligando biden ado del
ipo dica boxila o que le con ie e mayo es abilidad al o ma un quela o. Su e ec o
an i umo al es compa able al del cispla ino, pe o sus e ec os secunda ios son meno es,
especialmen e a ni el hema ológico. No obs an e, el ca bopla ino no esponde igual de
INTRODUCCIÓN: Búsqueda de soluciones a las limi aciones del cispla ino
52
bien en e a odos los ipos de umo es que sí se en a ec ados po el a amien o con
cispla ino119,120. Po consiguien e, se con inua on sin e izando análogos del cispla ino,
llegando así a la denominada e ce a gene ación de análogos. De los análogos de e ce a
gene ación se a a esal a al oxalipla ino, pues o que, es e complejo es ampliamen e
u ilizado en el a amien o del cánce colo ec al ( e apa ado 1.3; Figu a 11).
N
H
2
P
H
2
N
O
OO
O
Oxalipla ino
H
3
N
P
H
3
N
O
O
Ca bopla ino
O
O
N
P
N
O
O
O
Lobapla ino
N
P
N
O
O
O
O
Hep apla ino
O
OH
3
N
P
H
3
N
O
OO
Nedapla ino
H
2
H
2
H
2
H
2
Figu a 15. Es uc u as de los di e en es análogos del cispla ino.
El oxalipla ino p esen a di e encias signi ica i as espec o a la sencilla es uc u a
química de su p edeceso . En p ime luga , los ligandos amoniaco del cispla ino son
sus i uidos po el ligando biden ado diaminociclohexano, mien as que los dos á omos
de clo o son eemplazados po el anión oxala o. Dicho anión esul a cla e pa a su
uncionamien o, ya que en plasma es eemplazado y pe mi e la ac i ación de la
molécula, lo que en el caso de su p edeceso ocu ía en el in e io celula con la eacción
de acuación. En cuan o a su mecanismo de acción (Figu a 16), el oxalipla ino ac i ado
sien e la misma a acción po las bases ni ogenadas del ADN que el cispla ino, po lo
que a a o ma aduc os y c uzamien os in a e in e heb as de igual mane a. El e ec o
inal, po lo an o, se á daña el ADN e impedi su eplicación y epa ación. Sin emba go,
la p esencia del ligando diaminociclohexano en la molécula de oxalipla ino es la
esponsable de que es e á maco ocasione una mayo o sión sob e la heb a de ADN,
causando lesiones más se e as que el cispla ino y esul ando, en consecuencia, un
quimio e ápico más ac i o. Cu iosamen e, el oxalipla ino o ma menos aduc os con el
ADN que el cispla ino, lo cual es indica i o de la exis encia de o os mecanismos de
acción adicionales121,122.
Dado que, según se mencionaba an e io men e, la inducción de es és oxida i o es
undamen al pa a el mecanismo de acción del cispla ino ( e apa ado 1.3, pág. 45;
Figu a 14), cab ía pensa que su análogo oxalipla ino pod ía igualmen e causa una
up u a del equilib io edox como pa e de su e ec o an icance ígeno, especialmen e si
se iene en cuen a la exis encia de los mecanismos de acción adicionales a la o mación
de aduc os con el ADN. No obs an e, se han ealizado escasas in es igaciones a es e
espec o. De acue do con la Figu a 11 (apa ado 1.3, pág. 46), es habi ual adminis a al
oxalipla ino en combinación con an icue pos monoclonales pa a el a amien o de
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
59
1.5. USO DEL ORO EN MEDICINA. DESCUBRIMIENTO DE LAS
PROPIEDADES ANTITUMORALES DEL AURANOFIN
En e la amplia gama de me ales a los que puede ecu i la quimio e apia, el o o
ocupa un luga des acado. La elación en e el o o y la medicina iene de lejos, pues o
que las p ime as p uebas que se ienen ace ca de su uso con ines e apéu icos da an
del año 3000 a.c. ap oximadamen e. Los p ime os egis os ace ca del uso del o o con
ines no o namen ales apa ecen en la cul u a egipcia, si bien se le a ibuían p opiedades
más mís icas que e apéu icas, en elación al man enimien o de la ju en ud y la
i alidad. Mejo documen ada es á la p ác ica médica en la an igua China, ya que se
desc iben con de alle dis in os emedios que incluían o o pa a a a di e sas
a ecciones, como el uso de pol o de o o pa a sana he idas. O as in e esan es
p opiedades que se le a ibuían es aban elacionadas con el ali io de la os o la cu a de
la ieb e i oidea153,154.
No obs an e, con el paso de los años las p opiedades que ealmen e pudiese ene el
o o sob e el o ganismo se pe die on en a o de un e o no a es e mis icismo que
cul i aban los an iguos egipcios. Du an e la Edad Media, los alquimis as ol ie on a
pensa en el o o como la cla e de la ju en ud e e na, y busca on nue os mé odos pa a
ob ene el mayo g ado de pu eza del me al, así como in en os de ansmu a o os
me ales en o o. E iden emen e, es os in en os queda on en nada, y en el siglo XV se
e omó el es udio de las p opiedades médicas del o o, aunque no se ía has a algunos
siglos después cuando se log asen a ances signi ica i os en es e campo. El p ime
hallazgo ealmen e cien í ico ace ca del po encial e apéu ico del o o ecae sob e
Robe Koch y su descub imien o de las p opiedades bac e ios á icas del complejo de
o o(III) K[Au(CN)2]155. Su es udio esul ó de g an ele ancia, dado que escogió como
modelo bac e iano al bacilo de la ube culosis, el causan e de una de las g andes
epidemias de la época, ya que en el siglo XIX la ube culosis e a la p ime a causa de
mue e en Es ados Unidos156. No obs an e, los ensayos sob e pacien es e ela on que
es e compues o no solo no e a e ec i o en e al bacilo in i o, sino que además
esul aba muy óxico, po lo que se dejó de adminis a pasados unos años. De igual
mane a que la medicina mode na ha in en ado educi la oxicidad del cispla ino
diseñando nue os análogos, la lucha con a la ube culosis en el siglo XX buscó nue os
compues os de o o cuyo uso clínico esul ase más segu o. Si bien se e minó
desca ando es a in es igación po in uc uosa, se obse ó que algunos pacien es a los
que se les adminis aban iola o de i ados de o o(I) no aban una mejo ía en el dolo
a icula . Es o hizo sospecha a los in es igado es de la época que sus complejos pod ían
ene una aplicación en medicina alejada de la que habían buscado inicialmen e, así que
se ab ió una nue a ía de in es igación en el campo de la a i is euma oide. A
di e encia de lo que había ocu ido en el a amien o de la ube culosis, en e a es a
o a en e medad se ob u ie on éxi os no ables157–159. Algunos de los p incipales
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
60
complejos de o o que se han u ilizado en la p ác ica clínica po sus bene icios en e a la
a i is euma oide se mues an en la Figu a 18.
Figu a 18. Es uc u a de una se ie de complejos de o o(I) u ilizados en el a amien o de la
a i is euma oide.
Se acuño así el é mino “c iso e apia”, que hace e e encia p ecisamen e al uso de
complejos de o o en medicina. Los que se mues an en la Figu a 18 son una se ie de
iola os de o o(I) que pe enecen al g upo de medicamen os an i eumá icos
modi icado es de la en e medad o DMARDs (Disease-Modi ying An i heuma ic D ugs).
A pesa de que los DMARDs no hacen desapa ece la en e medad, ienen un e ec o
bene icioso e asando su cu so na u al. En el caso conc e o de los complejos ecogidos
en la Figu a 18, su adminis ación in a enosa educía los sín omas asociados a la
en e medad g acias a su e ec o an iin lama o io. Los p ime os en se come cializados
ue on el iomala o sódico de o o o Mioc isina™ y la au o ioglucosa o Solganol™, pe o
su uso no epo ó g andes bene icios pa a los pacien es po que eje cían su e ec o
e apéu ico a la go plazo, lo cual aumen aba el iesgo de su i e ec os secunda ios,
en e los que des acaban ne o oxicidad y di e sos p oblemas cu áneos158–160. El
desa ollo del au ano in (2,3,4,6- e a-6-ace il-1- io-β-D-glucopi anosa o-S-
i enil os ina o o(I)) supuso un g an a ance en el campo de la c iso e apia, aunque en
su momen o no se pudiese in ui la epe cusión que es e compues o acaba ía eniendo
en la medicina mode na.
Al igual que sus p edeceso es, el au ano in posee un cen o me álico de o o(I),
aunque p esen a la no edad de ene dos ligandos coo dinados al mismo: una molécula
de ie il os ina y un g upo iola o de ipo ca bohid a o ( ioglucosa). La os ina le do a
de ca ác e lipó ilo, po lo que iene una mayo solubilidad que los complejos an e io es,
lo que pe mi ió que uese adminis ado po ía o al en luga de in a enosa. Pe o,
aunque su oxicidad sob e los ejidos sanos uese meno que la mos ada po sus
p edeceso es, su e ec o e apéu ico ambién e a menos acusado. Po ello, se ue
educiendo su uso en e a la a i is euma oide158,159.
No obs an e, se obse ó una meno p edisposición al desa ollo de umo es en
aquellos pacien es de a i is euma oide que habían sido a ados con au ano in161.
Es e hecho, jun o con el descub imien o de las p opiedades an i umo ales del cispla ino
y sus análogos, animó a los in es igado es a e alua el e ec o del au ano in sob e
di e sas líneas umo ales162–167, encon ándose esul ados espe anzado es que
conduje on a esul ados in i o. Así, se comenza on a sin e iza nue os análogos de es e
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
61
complejo y se con inua on los ensayos, llegándose a la conclusión de que el o o pod ía
ene un u u o muy p ome edo en la lucha con a el cánce 158,159.
El o o puede p esen a a ios es ados de oxidación, siendo los es ados I y III los únicos
en los que es es able en un medio acuoso, po lo que son los más in e esan es de ca a a
diseña á macos. Los complejos de o o(I) p esen an cie as en ajas en e a los de
o o(III), ya que son más es ables desde un pun o de is a e modinámico y además son
menos suscep ibles de se educidos a o o me álico. No obs an e, la sín esis de
complejos de o o(III) pod ía p esen a en ajas signi ica i as en el campo de la
quimio e apia, pues o que es isoelec ónico con el cispla ino (ambos poseen una
con igu ación elec ónica d8), dando una geome ía plano cuad ada. Se pensaba, po
consiguien e, que los complejos de o o(III) pod ían posee un mecanismo de acción
simila al del cispla ino, así como un e ec o e apéu ico compa able158,159,168. A pesa de
que a p io i poseen una meno es abilidad que los complejos de o o(I), una adecuada
elección de ligandos de coo dinación ha pe mi ido sin e iza nume osos de i ados de
o o(III) con un in e esan e po encial an icance ígeno, según puede obse a se en
exhaus i as e isiones bibliog á icas ealizadas du an e los úl imos años168–177. A pesa
de que la p esen e memo ia se a a cen a en el papel an i umo al de los complejos de
o o(I), exis en algunos pun os in e esan es a conside a en cuan o al po encial clínico de
los complejos de o o(III). Dadas sus simili udes con el cispla ino, pod ía pensa se que el
uso de es os de i ados pod ía da luga igualmen e a g a es e ec os secunda ios debido
a una hipo é ica capacidad de in e acciona con el ADN. Aunque sí se han desc i o
algunos casos en los que la in e acción di ec a con es a mac omolécula pa ece se uno
de sus mecanismos de acción178–180, ambién se han iden i icado o as dianas
molecula es di e en es y de g an in e és en e apia. Po ejemplo, des aca la capacidad
de algunos de i ados de o o(III) de induci una disminución en los ni eles de exp esión
de la ciclina B1, lo que induce un cese del a ance en el ciclo celula en la ase G2/M181, o
la a inidad que mues an o os complejos de es a clase de inhibi a la enzima poli ADP
ibosa polime asa 1 (PARP-1), de modo que pueden bloquea la epa ación del ADN182–
184. Es os es udios mues an que, a pesa de las ca ac e ís icas que compa en el
cispla ino y los complejos de o o(III), es os úl imos ienen un mayo po encial
an i umo al en cuan o a las dianas molecula es con las que pueden in e acciona , de
modo que poseen un in e esan e y p ome edo u u o en quimio e apia.
Po su pa e, el po encial an icance ígeno de los complejos de o o(I) ha sido obje o
de un mayo núme o de in es igaciones du an e los úl imos años. Solamen e en lo
espec i o a su uso en e al cánce de colon se han publicado al ededo de un cen ena
de a ículos cien í icos, cen ados en la sín esis y ca ac e ización de complejos an o
mononuclea es como dinuclea es. Los a ances más ecien es han sido ecogidos en una
e isión en la que pa icipó la au o a de la p esen e esis doc o al113; en dicho a ículo,
se de alla el mecanismo de acción de complejos de ipo os ino de i ados mono y
dinuclea es con os inas mono y biden adas, complejos con ligandos S-dado es, ca beno
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
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de i ados, en e los que se cuen an los bisca beno complejos, en su mayo ía
mononuclea es y, po úl imo, los alquinil de i ados, de los que se incluye un meno
núme o de ejemplos. Además, los ensayos ealizados en el ma co de es a esis doc o al
se han cen ado, p incipalmen e, en el uso de complejos de o o(I) como po enciales
agen es quimio e apéu icos en e a cánce colo ec al.
Los complejos de o o(I) p esen an de o ma gene al una geome ía lineal. El cen o
me álico puede es a coo dinado a di e en es ipos de ligandos pa a modi ica sus
p opiedades químicas y biológicas. A di e encia de lo que ocu ía en el p oceso de
ac i ación del oxalipla ino, es a clase de complejos no suelen su i p ocesos de
acuación; sin emba go, los ligandos pueden in e cambia se po biomoléculas una ez en
el in e io de la célula158,159.
Al se un ácido blando185, el o o(I) sien e una especial a acción po los á omos de
azu e y selenio, pe o no an a po el ni ógeno como les ocu e a los de i ados de
pla ino, ni po el oxígeno. Es po ello que los complejos de o o(I) an a p esen a una
meno a inidad po el ADN que el cispla ino y sus análogos en condiciones isiológicas186.
En su luga , es os complejos in e accionan p incipalmen e con los g upos iol de
p o eínas y pép idos, en especial po aquellas que con engan azu e y/o selenio como
las selenop o eínas.
Las selenop o eínas son un g upo de p o eínas que con ienen el esiduo
selenocis eína. La selenocis eína es una modi icación del aminoácido esencial cis eína,
y dada su impo ancia en el co ec o uncionamien o del o ganismo, exis e una co ien e
de in es igado es que la conside an un aminoácido esencial más. Po lo gene al, el
esiduo selenocis eína se localiza en el cen o ac i o de es as p o eínas y es cla e pa a
su unción, que suele es a elacionada con eacciones de oxidación- educción187.
Des aca como selenop o eína de g an in e és pa a el p opósi o de la p esen e esis
doc o al la io eoxina educ asa (T xR), el posible pun o de con e gencia en e el
e ec o an i umo al del au ano in y su uso como DMARD.
La T xR es una oxido educ asa que o ma pa e del sis ema io edoxina, necesa io
pa a el man enimien o de la homeos asis edox en el in e io celula . Es e sis ema, que
se encuen a an o en el ci osol como en el in e io mi ocond ial, cuen a con es
componen es: la io edoxina, la io edoxina educ asa y el NADPH. La Figu a 19
mues a el ciclo de eacciones oxidación- educción que ca ac e izan a es e sis ema. La
unción de es e sis ema edox consis e en ac i a a las pe oxidasas in acelula es pa a
que és as puedan elimina ac i amen e el pe óxido de hid ógeno. Es a ac i ación es
lle ada a cabo po la io edoxina, median e el aspaso de elec ones p o enien es del
NADPH. En el p oceso, la enzima queda oxidada y debe ol e a su o ma educida pa a
se uncional de nue o. Es aquí cuando in e iene la T xR, quien oma los elec ones del
NADPH en p ime luga y los ans ie e a la io edoxina oxidada, comple ando el ciclo.
Es deci , ni la io edoxina ni la io edoxina educ asa son enzimas con capacidad
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
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an ioxidan e pe se, sino que su con ibución sob e el equilib io edox es indi ec a,
aunque no po ello menos impo an e188,189. Como puede obse a se en la Figu a 19, los
es componen es del sis ema ienen el mismo peso en el p oceso, y la ausencia o el
mal uncionamien o de cualquie a de ellos conduci ía a un inc emen o en los ni eles de
ROS que end ía consecuencias ca as ó icas pa a la célula. Es o es debido a que, como
adelan ábamos al desc ibi el mecanismo de acción del cispla ino ( e apa ado 1.3, pág.
45; Figu a 14) y del oxalipla ino ( e apa ado 1.4, pág. 54Figu a 16), los adicales lib es
dañan dis in as es uc u as del in e io celula y ienen un papel cla e en la inducción
de la mue e celula 105,107,123. Al con ibui al co ec o man enimien o de los ni eles de
ROS, el sis ema io edoxina y, po ex ensión la T xR, es án in oluc ados en el con ol de
nume osos p ocesos celula es de g an impo ancia, en e los que se cuen an la
p og esión en el ciclo celula o la egulación de la mue e celula 188.
Figu a 19. Funcionamien o del sis ema an ioxidan e io edoxina. La io edoxina ac i a a las
pe oxidasas in acelula es al dona le los elec ones que p o ienen del NADPH, quedando
oxidada du an e el p oceso. Al ansmi i le los elec ones del NADPH, la io edoxina educ asa
es capaz de educi a la io edoxina oxidada y de ol e la así a un es ado uncional.
Dada la ele ancia del sis ema io edoxina pa a la célula, exis e un segundo sis ema
an ioxidan e que si e como e ue zo en caso de que es é comp ome ido: el sis ema
glu a ión-glu a edoxina (Figu a 20). Es e sis ema se compone de cua o elemen os:
NADPH, glu a ión educ asa (GR), glu a ión y glu a edoxina. La GR pe enece a la misma
amilia de oxido educ asas que la T xR, aunque se di e encian en que la p ime a no es
una selenop o eína. Pese a es o, la unción de ambas enzimas es p ác icamen e idén ica:
ans e i elec ones del NADPH a o a en idad, que en es e caso es el pép ido glu a ión,
pa a inalmen e ac i a a la glu a edoxina, enca gada inal del man enimien o de la
homeos asis edox median e la ac i ación de las pe oxidasas celula es, al igual que la
io edoxina. No obs an e, la glu a edoxina iene una ac i idad al ma gen de su unción
an ioxidan e indi ec a, que no es o a que la ac i ación de cie as p o eínas, como po
ejemplo la ibonucleasa, median e la educción de puen es disul u o que se hayan
podido o ma en un en o no con un ma cado ca ác e p o-oxidan e. Es o hace que el
sis ema glu a ión-glu a edoxina es é implicado en p ocesos celula es como la sín esis
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
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de los desoxi ibonucleó idos del ADN. Finalmen e, la glu a edoxina es capaz de cede le
elec ones a la io edoxina oxidada cuando la T xR es incapaz de hace lo, de ahí su papel
como e ue zo del sis ema io edoxina cuando su ac i idad puede e se comp ome ida
que se mencionaba an es189,190.
Figu a 20. Funcionamien o del sis ema glu a ión-glu a edoxina. La glu a ión educ asa (GR)
ans ie e los elec ones del NADPH al pép ido glu a ión, quien a su ez se los ans ie e a la
glu a edoxina. Una ez ac i ada, la glu a edoxina puede ans e i sus elec ones a la
io edoxina, en caso de que la ac i idad de la io edoxina educ asa se encuen e
comp ome ida, o bien ac i a a o as p o eínas al educi los puen es disul u o que se hayan
podido o ma en un ambien e p o-oxidan e.
Aunque su de ec o pueda es a elacionado con la apa ición de pa ologías, ambién
un excesi o uncionamien o del sis ema io edoxina puede con ibui a la apa ición o
al desa ollo de cie as pa ologías. La a i is euma oide pa ece se una de es as
en e medades elacionadas con la sob eexp esión de io edoxina y T xR. Ambas
p o eínas se encuen an en una can idad muy supe io a lo espe ado en el líquido
sino ial de las egiones in lamadas de pacien es de es e as o no191. E óneamen e,
pod ía supone se que la sob eexp esión de los componen es del sis ema es un
mecanismo pa a comba i el es és oxida i o que p omue e el desa ollo de es a
en e medad. No obs an e, el e ec o eal es el con a io. La io edoxina p omue e el
eclu amien o y la madu ación de las células dend í icas, quienes sec e an ci oquinas
p o-in lama o ias y con ibuyen al p og eso del as o no192. De ahí el po encial
e apéu ico del au ano in en e a la a i is euma oide.
Al se una selenop o eína, el au ano in se a a sen i na u almen e a aído hacia la
T xR. Si es a enzima, además, es á sob eexp esada, las posibilidades de que á maco y
enzima se encuen en en el medio ex acelula o in acelula se mul iplican. Así, se
piensa que el e ec o an i-in lama o io de es e compues o puede es a mediado po la
inhibición de la ac i idad no mal de la io edoxina educ asa. Al inu iliza a la T xR, odo
el sis ema io edoxina deja de unciona , gene ando un g an es és oxida i o que causa
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la mue e de aquellas células que sob eexp esen a los componen es de es e sis ema,
que como se ha mencionado an e io men e son las esponsables de la libe ación de
ci oquinas p o-in lama o ias192,193.
También se ha encon ado una sob eexp esión de la io edoxina educ asa en
algunos ipos de umo es, siendo especialmen e llama i o el caso del cánce colo ec al.
Dado que las células umo ales p oducen una mayo can idad de ROS que las células
sanas po su ápido me abolismo, ambién cuen an con una mayo exp esión de los
sis emas de de ensa an ioxidan e pa a compensa . El es udio de los ni eles de exp esión
de la T xR se u iliza pa a de e mina la p ognosis de un umo , ya que cuan o mayo sea
es e alo , más al o se á el g ado de ag esi idad de la en e medad187,188. Se es ablece
así un pa alelismo en e la a i is euma oide y el cánce , siendo el pun o de
con e gencia los ni eles ano malmen e al os de T xR y la e ec i idad del au ano in
en e a ambos as o nos, po lo demás an di e en es. E ec i amen e, di e sas
in es igaciones independien es apun an a es a enzima edox como la p incipal diana
e apéu ica del au ano in194. En gene al, los complejos de o o(I) que se han sin e izado
y e aluado du an e la úl ima década compa en con su p edeceso la capacidad de
inhibi a la T xR, po lo que se han des inado g andes es ue zos a mejo a la in e acción
complejo-enzima y así aumen a la e ec i idad de la e apia113,195,196. Es a es a egia
cuen a, además, con la en aja de se selec i a en e a las células umo ales, pues o
que su sensibilidad al es és oxida i o es mayo que la de una célula no mal106. En
consecuencia, los complejos de o o pod ían se una al e na i a igual o más e icaz que
los de pla ino en e al CRC, y, dado que su mecanismo de acción pa ece más selec i o,
su oxicidad en ejidos sanos pod ía se meno . Además, a ios de i ados han sido
p obados con éxi o sob e líneas celula es esis en es a cispla ino, lo que apun a a un
posible uso de los complejos de o o(I) en umo es esis en es a las es a egias
e apéu icas adicionales197,198. También es in e esan e, aunque haya sido obje o de
meno es in es igaciones has a el momen o, la capacidad del au ano in de inhibi la
exp esión de la iso o ma mi ocond ial de es a enzima (T xR2)164, ya que apun a ía a una
posible capacidad de los de i ados de o o(I) a inhibi la acción de es a enzima no solo
de o ma di ec a, sino ambién indi ec a.
De acue do con in es igaciones pos e io es, el mecanismo de acción del au ano in
no se limi a a la inhibición de la T xR, sino que exis en o as dianas molecula es con las
que pod ía in e acciona . Es ela i amen e ecien e el descub imien o de la capacidad
de es e complejo de in e e i con el sis ema ubiqui ina-p o easoma, esponsable de la
eno ación p o eica en el in e io celula . El p o easoma es una es uc u a p o eica cuya
unción p incipal es la p o eólisis, es deci , la deg adación enzimá ica de p o eínas, con
lo que e i a la o mación de ag egados p o eicos que es án de ás de di e sos
as o nos199–205. Es á compues o po dos subunidades, la 19S o pa ícula egulado a,
que p epa a al sus a o pa a la deg adación, y la 20S, la pa ícula cen al, la que posee
la ac i idad p o easa. Como paso p e io a su des ucción en el p o easoma, las enzimas
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ubiqui inasas añaden esiduos de ubiqui ina a aquellas p o eínas que an a se
deg adadas, en e las que se cuen an no solo las iejas sino ambién las mal plegadas.
Los esiduos de ubiqui ina son iden i icados po el p o easoma, lo que pe mi e que la
p o eólisis sea selec i a y con olada206–208.
Dada su capacidad p o eolí ica, el p o easoma es á di ec amen e elacionado con el
con ol de di e sos p ocesos celula es, en e los que se cuen an la p og esión en el ciclo
celula , la espues a inmune o la mue e celula . Además, esul a c ucial pa a la
espues a a di e sos es eses, ya que debe elimina a las p o eínas que se dañen como
consecuencia206–209. Po ello, según se ha mencionado an e io men e, al e aciones en el
p o easoma que le impidan ealiza su unción no mal son la base de di e sas
en e medades, en e las que des acan las neu odegene a i as199–202.
Po o a pa e, de o ma simila a lo que ocu ía en el caso de la io edoxina
educ asa, algunas células umo ales, en e las que se encuen an las de CRC, ienen una
dependencia muy al a del p o easoma. Exis en a ias azones que lo explican. En p ime
luga , las células ans o madas se alen de su p o easoma pa a elimina a las p o eínas
que con olan el a ance en el ciclo celula , pa a así pode con inua con su al a asa de
p oli e ación; ambién lo u ilizan pa a deg ada a las p o eínas esul an es de la
exp esión de los genes sup eso es de umo es. Po o a pa e, el p o easoma es
esponsable de la ac i ación del ac o de ansc ipción NF-κB, que es á di ec amen e
implicado en el desa ollo umo al al induci la sín esis de ci oquinas p o-in lama o ias
y de p o eínas an i-apop ó icas. En si uación basal, el ac o NF-κB se encuen a e enido
en el ci oplasma po la p o eína IκB, que es ubiqui inada en p esencia de ci oquinas p o-
in lama o ias y pos e io men e deg adada en el p o easoma; es o pe mi e que el ac o
NF-κB mig e al núcleo, donde p omue e la ansc ipción de los genes elacionados con
los p ocesos an es mencionados (in lamación e inhibición de la apop osis)210. Po es os
mo i os, el uso de inhibido es del sis ema ubiqui ina-p o easoma con ines
quimio e apéu icos esul a una ap oximación in e esan e. Uno de los ejemplos más
ep esen a i os es el an icue po bo ezomib, capaz de inhibi la unción p o easomal en
un 30%, de modo que es óxico pa a una célula umo al pe o no pa a una célula sana210.
A la is a de es os da os, el sis ema ubiqui ina-p o easoma puede se conside ado como
una diana especí ica de cánce colo ec al, de o ma simila a lo que ocu e con la
io edoxina educ asa.
El a amien o con au ano in causa un inc emen o en los ni eles de p o eínas
ubiqui inadas en el in e io celula . Es e e ec o es á mediado po una inhibición de las
deubiqui inasas asociadas a la subunidad 19S; es deci , el a amien o no a ec a
di ec amen e a la ac i idad p o eolí ica de la subunidad 20S, pe o al impedi la
deubiqui inación és a se bloquea y se acumulan p o eínas iejas y/o mal plegadas en el
in e io celula , causando la mue e de la célula. La inhibición de es e sis ema es pa e
esencial de la inducción de mue e mediada po es e complejo de o o(I), an o o más
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
67
como la inhibición de la T xR. A es a conclusión llega on Liu e al. as ealiza una se ie
de ensayos sob e la línea HepG2 en p esencia de dos compues os an ioxidan es: N-
ace il-cis eína y e bu il hid oquinona. El p ime o de ellos, además de se capaz de
educi los ni eles de ROS en el medio in acelula , causa un cambio es uc u al en la
molécula de au ano in que le impide lle a a cabo la inhibición de las deubiqui inasas,
de modo que e ie e po comple o su le alidad sob e las células umo ales. La e bu il
hid oquinona, sin emba go, solamen e iene unción an ioxidan e, de modo que educe
la capacidad del au ano in de causa la mue e celula , pe o no la elimina
comple amen e211. Po lo an o, an o la inhibición de la unción p o easomal como de
la io edoxina educ asa son elemen os necesa ios pa a el e ec o an i umo al del
au ano in.
Figu a 21. Esquema ización del mecanismo de acción del au ano in en la célula umo al. Una
ez en el in e io de la célula, el au ano in es capaz de bloquea la ac i idad de la iso o ma
ci oplasmá ica de la enzima edox io edoxina educ asa, causando un aumen o de adicales
lib es que con ibuye a la mue e de la célula; además, es capaz de educi la exp esión de la
iso o ma 2, que se exp esa en la mi ocond ia. Po úl imo, puede inhibi a las deubiqui inasas
asociadas a la subunidad 19S del p o easoma, lo que de o ma indi ec a p o oca el bloqueo de
la deg adación p o eica que lle a a cabo es e o gánulo de o ma no mal.
Es e descub imien o plan ea la posibilidad de que los complejos de o o(I) puedan ac ua
como complejos mul idiana o “mul i a ge ”, siendo capaces de a aca a la célula
umo al po a ias ías simul áneamen e. An e io men e, mencionábamos que el e ec o
del oxalipla ino se e po enciado al se adminis ado jun o con o os á macos que
ac úan siguiendo dis in os mecanismos, ya que, en e o os bene icios, se consigue
educi la apa ición de esis encias121. Cuando se in e ie e con una sola diana, a la célula
umo al le esul a ela i amen e sencillo desa olla un mecanismo pa a sol en a el
INTRODUCCIÓN: Uso del o o en medicina. Descub imien o de las p opiedades an i umo ales
del au ano in
68
p oblema. En el caso del oxalipla ino o el cispla ino, consis i ía en sob eexp esa los
sis emas de epa ación del DNA83,84,128. Sin emba go, cuando la acción de a ios
componen es celula es se e a ec ada, como ocu e al u iliza cóc eles de
medicamen os o compues os mul i a ge , la célula umo al iene más complicado
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MATERIALS AND METHODS
94
Expe imen al
95
Syn hesis o me allic complexes
Gold(I) and sil e (I) complexes we e syn he ized by membe s o Ino ganic Chemis y
depa men o Uni e si y o Za agoza.
1. Syn hesis o alkynyl gold(I) complexes coo dina ed wi h soluble phosphines PTA
and DAPTA: [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a), [Au(C≡CPh)(DAPTA)] (1b) and [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)] (2a).
Desc ibed by Ve ga a e al.1 To a solu ion o KOH (0.022 g, 0.385 mmol) in MeOH (ca.
10 ml) con aining he alkyne (0.308 mmol) was added [AuCl(PR’3)] (PR’3 = PTA, DAPTA)
(0.257 mmol). Then, he mix u e was s i ed o ca. 20 h a oom empe a u e; he
p ecipi a e was isola ed by il a ion, washed wi h me hanol and die hyl e he and d ied
in ai e.
2. Syn hesis o alkynyl gold(I) complexes de i ed om 3-hyd oxy la ones
Gene al p ocedu e o he p epa a ion o he 3-hyd oxy la ones (HL-1a-d). NaOH (0.4
g) was added o a me hanol (20 mL) solu ion o 2-hyd oxyace ophenone (3.32 mmol)
and benzaldehyde o he di e en pa a-subs i u ed benzaldehydes (3.32 mmol). The
eac ion was e luxed o 3 h un il i acqui es an in ense o ange colo . The eac ion was
cooled o oom empe a u e and ollowed by he addi ion o NaOH (0.4 g) dissol ed in
20 mL o wa e and 1.45 mL o H2O2 (33% w/ ). A e 3 h o s i ing, he mix u e was
pou ed in o an ice-wa e solu ion a o ding yellow solids, which we e il e ed o and
d ied in ai .
Gene al p ocedu e o he p epa a ion o he p opa gyl la ones (HL-2a-d). K2CO3 in
excess and p opa gylb omide (1.6 equi alen s) we e added o a solu ion o la ones HL-
1a-d. The eac ion was hea ed unde e lux o 6 hou s, and a e his ime, he excess
o base was il e ed o and he esidue was e apo a ed o d yness.
Syn hesis o 3a-d and 4a-d se ies was desc ibed by Má mol e al.2 To a solu ion o
KOH (0.225 mmol) in MeOH (ca. 10 mL) con aining L2a-d (0.15 mmol) was added
[AuCl(PR’3)] (PR’3 = PPh3, PTA) (0.15 mmol). The co esponding solids p ecipi a ed in he
me hanolic solu ion, and we e isola ed by il a ion a e 20 h o s i ing a oom
empe a u e, washed wi h me hanol and die hyl e he , and d ied in acuo.
Syn hesis o he [Au(L)(NHC)] complexes (se ies 5a-d and 6a-d). To a solu ion o KOH
(0.35 mmol) in MeOH (ca. 10 mL) con aining La-d (0.2 mmol) was added [AuCl(NHC)]
(NHC = IMe, IP ) (0.18 mmol). The co esponding solu ion was e apo a ed o d yness
a e 8 h o s i ing a oom empe a u e. Dichlo ome hane (10 mL) was added and he
solu ion was il e ed o e Celi e, concen a ed and he addi ion o die hyl e he lead o
whi e solids, which isola ed by il a ion and d ied in ai .
Expe imen al
96
3. Syn hesis o gold(I) and sil e (I) complexes wi h N- o S-dono ligands de i ed
om 2-anilino-py idine
Syn hesis o he ligands {(4-pyCO)N(Ph)(py)} (L1) and {(2-(C4H4S)CO)N(Ph)(py)} (L2).
To a dichlo ome hane solu ion (10 mL) o 2-anilinopy idine (0.3404 g, 2 mmol) unde
a gon a mosphe e was added NE 3 (0.2626 g, 2.6 mmol) and 4-chlo oca bonylpy idine
(0.3560 g, 2 mmol) o 2-chlo oca bonyl hiophene (0.2932 g ,2 mmol). The eac ion was
s i ed o 24h a oom empe a u e. The solu ion was washed wi h a sa u a ed solu ion
o NaHCO3 and hen washed wi h dichlo ome hane (3x20mL) and d ied wi h anhyd ous
MgSO4. Then he solu ion was il e ed h ough Celi e and he solu ion was educed o
minimum olume unde acuum. The addi ion o n-hexane a o ded a whi e solid which
was il e ed o and washed wi h n-hexane.
Syn hesis o he complexes [Au(L)(PPh3)](OT ) (L1, 7a; L2, 7b). To a dichlo ome hane
solu ion (10 mL) o [AuCl(PPh3)] (0.1484 g, 0.3 mmol) was added [Ag(OT )] (0.0848 g,
0.33 mmol). A e 45 min o s i ing p o ec ed om ligh , he whi e solid (AgCl) was
il e ed h ough Celi e and he solu ion was added o dichlo ome hane solu ion (10 mL)
o L1 (0.0743 g, 0.27 mmol) o L2 (0.0757 g, 0.27 mmol). The eac ion was s i ed o 2h
a oom empe a u e. Then he solu ion was educed o minimum olume unde
acuum. A whi e solid was ob ained and washed wi h n-hexane.
Syn hesis o he complexes [Ag(OT )(L)(PPh3)] (L1, 8a; L2, 8b). To a dichlo ome hane
solu ion (10 mL) o [Ag(OT )(PPh3)] (0.1557 g, 0.3 mmol) was added L1 o L2 (0.3 mmol).
A e 45 min o s i ing p o ec ed om ligh a oom empe a u e, he solu ion was
educed o minimum olume unde acuum. A whi e solid was ob ained and washed
wi h n-hexane.
Syn hesis o he complexes [Ag2(OT )2(L)(PPh3)2] (L1, 9a; L2, 9b). To a
dichlo ome hane solu ion (10 mL) o [Ag(OT )(PPh3)] (0.1557 g, 0.6 mmol) was added L1
o L2 (0.3 mmol). A e 45 min o s i ing p o ec ed om ligh a oom empe a u e, he
solu ion was educed o minimum olume unde acuum. A whi e solid was ob ained
and washed wi h n-hexane.
Syn hesis o he complexes [Ag(OT )(L)]2 (L1, 10a; L2, 10b). To a dichlo ome hane
solu ion (10 mL) o [Ag(OT )] (0.051 g, 0.2 mmol) was added L1 o L2 (0.2 mmol). A e
45 min o s i ing p o ec ed om ligh a oom empe a u e, he solu ion was educed
o minimum olume unde acuum. A whi e solid was ob ained and washed wi h n-
hexane.
Syn hesis o he complexes [Ag(OT )(L)2] (L1, 11a; L2, 11b). To a dichlo ome hane
solu ion (10 mL) o [Ag(OT )] (0.051 g, 0.2 mmol) was added L1 o L2 (0.4 mmol). A e
45 min o s i ing p o ec ed om ligh a oom empe a u e, he solu ion was educed
o minimum olume unde acuum. A whi e solid was ob ained and washed wi h n-
hexane.
Expe imen al
97
Dis ibu ion coe icien calcula ion
N-oc anol-wa e pa i ion coe icien was de e mined by he shake- lask me hod. PBS
bu e ed dis illed wa e (100 ml, phospha e bu e [PO43-] = 10 μM, 0.15 mM NaCl, pH
7.4) and 100 ml o n-oc anol we e shaken oge he 72h o allow sa u a ion o bo h
phases. App oxima ely 1 mg o each complex was mixed in 5 ml o aqueous and o ganic
phase o 10 min espec i ely. The esul an emulsion was cen i uged o sepa a e he
phases and complex concen a ion on each one was de e mined by UV abso bance
spec oscopy. LogP7.4 was de ined as log([compound(o ganic)]/[compound(aqueous)]).
S udy o complex-BSA in e ac ion
A 1 mM s ock solu ion o bo ine se um albumin (A2153 Sigma-Ald ich) was p epa ed
in PBS a pH 7.4 ( eal concen a ion was con i med by UV-Vis spec oscopy, Ɛ280 nm =
43,284 M-1·cm-1). Gold complexes we e dissol ed on DMSO o achie e a 6 mM s ock
solu ion and six aliquo s o 2.5 μl we e added o a 50 mM solu ion o BSA in PBS placed
in a qua z cu e e o 1 cm op ical pa h, gi ing ise o he inal concen a ions o 5, 10,
15, 20, 25 and 30 μM. The luo escence spec a we e eco ded on a Jobin-Y on-Ho iba
luo olog FL-3-11 spec ome e . The samples we e exci ed a 295 nm and he emission
spec a we e eco ded in a ange om 310 o 450 nm wi h emission sli s se o 1.6 nm.
Samples we e measu ed upon 4 min incuba ion wi h each gold aliquo . Fluo escence
in ensi ies o PBS and gold complexes we e i ele an unde desc ibed condi ions, as
we e he e ec o he addi ion o gold aliquo s and he e ec o incuba ion ime
be ween measu emen s. Da a we e analyzed by using S e n-Volme equa ion: F0/F = 1
+ Ks [gold complex] = 1 + KqƬ0[gold complex], in o de o ob ain S e n-Volme Quenching
cons an (Ks ).
The binding cons an (Kb) was quan i ied by using he modi ied S e n-Volme
equa ion: log[(F0-F)/F] = logKb + nlog[gold complex]
P epa a ion o
Rosa canina
ex ac s
R. canina osehip ex ac s we e p o ided by membe s o Applied Chemis y
depa men om Public Uni e si y o Na a a as desc ibed by Jiménez e al.3
Rosehips we e ha es ed in 2014 om a ield called Ca’l e o , loca ed in Ma iola
Moun ain, Alican e, Spain. Rosehip peel and pulp (10 g) we e homogenized wi h ul a-
u ax and hen mace a ed o 24 h in a 250 mL ace one:wa e (80:20 / ) solu ion. A e
his phase, he sample was lyophilized (Tels a , model C yodos-50, Spain) o elimina e
sol en s and all he an ioxidan s a e p esen in he esidue ob ained (To al Ex ac , TE).
This ex ac was hen ac iona ed using a solid phase ch oma og aphy o ob ain h ee
di e en an ioxidan s ac ions. Fi s o all, he esidue was sol ed in sulphu ic acid (5
ml, 0.5 M), he solu ion was cen i uged (15000 pm, 30 min) and passed h ough a
Ch omabond C-18 ca idge (Scha lab S.L., Ba celona) p e iously condi ioned (2 ml o
Expe imen al
98
me hanol and 5 ml o 5 mM H2SO4). Pola subs ances, such as i amin C, we e ex ac ed
wi h 2 mL o 5 mM H2SO4. Phenolic compounds e ained in he ca idge, we e elu ed
wi h me hanol (2 ml) and dis illed wa e (5 ml). F om his solu ion, conside ed as pu i ied
osehip ex ac , neu al and acidic phenols we e ex ac ed and ac ioned. In b ie , he
pu i ied osehip ex ac pH was adjus ed o 7.0 (using a 2 M NaOH solu ion) and passed
h ough a p econdi ioned Ch omabod ca idge wi h 8 mL o me hanol ollowed by 4 mL
o dis illed-deionized wa e . The column was washed wi h 10 ml o dis illed-deionized
wa e and neu al phenols (NP) we e elu ed using me hanol (12 ml). The e luen
po ion pH was adjus ed o 2.0 (using 2.0 M HCl) and hen i was passed h ough a
ca idge p econdi ioned wi h me hanol (8 ml) and HCl (4 ml, 0.01 M). Subsequen ly
column was washed wi h HCl (5 ml, 0.01 M) and he e ained ac ion (acidic phenols,
AP) was elu ed using me hanol (12 ml). The h ee ac ions we e d ied using he
lyophilize and hen we e ozen a -80°C un il dilu ion on cell cul u e medium o cell
ea men (see below ‘Cell ea men ’ sec ion).
Cell cul u e
Fou di e en human cance cell lines ha e been used du ing he p e iously
discussed wo k. De ails ega ding hei o igin a e summa ized:
- Caco-2 cells: colo ec al adenoca cinoma. Kindly p o ided by D . Edi h B o -
La oche (Uni e si é Pie e e Ma ie Cu ie-Pa is 6 UMR S872, Les Co delie s,
F ance).
- HepG2 : hepa ocellula ca cinoma. Kindly p o ided by D . Ma ía Angeles Ala a
(Depa amen o de Bioquímica y Biología Molecula , Uni e sidad de Za agoza,
Spain).
- MCF-7: b eas adenoca cinoma. Kindly p o ided by D . Ca los J. Ciudad and D .
Ve ònica Noé (Depa amen o de Bioquímica y Fisiología, Facul ad de Fa macia,
Uni e sidad de Ba celona, Spain).
- MDA-MB-231: b eas adenoca cinoma. Kindly p o ided by D . Ca los J. Ciudad
and D . Ve ònica Noé (Depa amen o de Bioquímica y Fisiología, Facul ad de
Fa macia, Uni e sidad de Ba celona, Spain).
Cell lines we e main ained in a humidi ied a mosphe e o 5% CO2 a 37ºC. Cells
(passages 20-40) we e g own in Dulbecco’s Modi ied Eagles medium (DMEM) (Gibco
In i ogen, Paisley, UK) supplemen ed wi h 20% e al bo ine se um, 1% non-essen ial
amino acids, 1% penicillin (1000 U/ml), 1% s ep omycin (1000 μg/ml) and 1%
ampho e icin (250 U/ml). Cul u e medium was eplaced e e y wo days and cells we e
passaged enzyma ically wi h 0.25% ypsin-1 mM EDTA and sub-cul u ed on 25 cm2
lasks a a densi y o 2·104 cells/cm2.
Expe imen al
99
Fo assays on cance cell models (undi e en ia ed Caco-2, HepG2, MCF-7 and MDA-
231 cells), ea men was added 24h pos -seeding and hen incuba ed he equi ed ime
o each expe imen .
Fo assays on di e en ia ed Caco-2 cells -a model o he gas oin es inal ba ie -, cells
we e cul u ed on 96-wells pla es unde s anda d cul u e condi ions o 7 o 9 days, un il
eaching 80% con luence as con i med by op ic mic oscopy obse ance. T adi ionally, i
was conside ed ha di e en ia ion was eached upon wo weeks pos -seeding;
howe e , Na oli e al.4 ound ha sub-cul u ing cells a 50% con luence o main enance
ins ead a 80% esul ed in a high conse a ion o p oli e a i e capaci y, hus eaching
di e en ia ion as e . T ea men was added a e his di e en ia ion ime wi hou
u he conside a ions.
Cell ea men
Gold(I) and sil e (I) complexes we e ini ially sol ed on DMSO o a concen a ion o
20 mM and hen dilu ed on cell cul u e medium wi hou e al bo ine se um (FBS) o he
equi ed wo k concen a ions. Rosa canina ex ac s we e sol ed on FBS- ee medium o
a concen a ion o 1 mg/ml and hen dilu ed on FBS- ee medium o he equi ed wo k
concen a ions.
Fo ea men , cell cul u e medium was eplaced wi h medium con aining complexes
and/o plan ex ac s and cells we e incuba ed a 37ºC o a a iable ime depending on
he assay. Mock- ea ed cells o nega i e con ol was included on each expe imen (cells
ea ed wi h 3.5 nM DMSO).
When a p e-incuba ion wi h a selec ed compound was needed p io o cell ea men
wi h me allic complexes/plan ex ac , hose compounds we e p e iously sol ed on he
equi ed sol en as summa ized below and hen dilu ed on FBS- ee medium o wo k
concen a ions. Cells we e p e-incuba ed a 37ºC and hen cell cul u e medium was
eplaced wi h medium con aining me allic complexes and/o plan ex ac s o u he
incuba ion a 37ºC.
- Nec os a in-1 (N9037, Sigma-Ald ich): 20 mg/ml DMSO
- N-ace yl-cys eine (A9165, Sigma-Ald ich): 33 mg/ml DMSO
- SN-50 (481480, Sigma-Ald ich): al eady sol ed
- TNFR1 analog (SRP6389, Sigma-Ald ich): 50 μg/mL PBS (phospha e bu e ed
saline)
- Chlo oquine (C6628, Sigma-Ald ich): 10 ml/ml PBS
Expe imen al
100
Cell p oli e a ion de e mina ion
1. MTT assay
MTT assay depends on 3-(4,5-dime hyl-2- hiazoyl)-2,5-diphenyl e azolium b omide
(MTT) (CT01-5 Sigma-Ald ich). Mi ochond ial dehyd ogenase om iable cells is able o
educe MTT eac i e o o mazan, a eac ion ha can be ollowed
spec opho ome ically due o he colo change om yellow o blue5. MTT eac i e was
sol ed on DMSO o a concen a ion o 5 mg/ml.
Cells we e pla ed in 96-well pla es a a densi y o 4000 cells pe well, incuba ed 24h
unde s anda d cell cul u e condi ions ( o assays wi h cance models) and hen ea ed
and incuba ed he equi ed ime o each de e mina ion. A e such incuba ion wi h
ea men , 10 μl o 5 mg/ml MTT solu ion we e added o each well and cells we e hen
incuba ed o 3 h a 37ºC. Medium was eplaced by in e sion and 100 μl DMSO we e
added o each well o sol e o mazan c ys als. Pla es we e shaken 5 min and abso bance
was measu ed a 560 nm wi h DTX 800 (Beckman Coul e ) (chap e 1) o SPECTROs a
Nano (BMG Lab ech) (chap e s 2-4). Abso bance was p opo ional o numbe o li ing
cells and con e ed o pe cen age o cell iabili y compa ing o da a ob ained om
nega i e con ol.
2. SRB assay
The sul o hodamine B (SRB) assay is conside ed as an indi ec me hod o de e mine
cell iabili y, and i is ecommended o hose si ua ions when MTT assay should be
a oided6,7. This me hod is based on he capaci y o SRB o bind cell p o eins, hus he
amoun o dye migh be co ela ed o cell mass8.
Cells we e pla ed in 96-well pla es a a densi y o 4000 cells pe well, incuba ed 24h
unde s anda d cell cul u e condi ions ( o assays wi h cance models) and hen ea ed
and incuba ed he equi ed ime o each de e mina ion. A e such incuba ion wi h
ea men , cells we e ixed wi h 500 g/l ichlo oace ic acid o 1h a 4ºC, washed wi h
PBS and s ained wi h 4g/l o SRB o 20 min a oom empe a u e co e ed om ligh .
Pla es we e washed h ee imes wi h 10 ml/l o ace ic acid o emo e unbounded dye
and p o ein-bound dye was ex ac ed wi h 10 mmol/l T is base. Abso bance was
measu ed a 540/620 nm wi h SPECTROs a Nano (BMG Lab ech) and conside ed
equi alen o cell iabili y. Resul s we e exp essed as pe cen age o cell iabili y
compa ing o da a ob ained om nega i e con ol.
IC50 and Selec i i y Index calcula ion
Fo IC50 calcula ion, a s ock solu ion o gold(I) and sil e (I) complexes in DMSO was
added o cells in a concen a ion ange o :
Expe imen al
107
solu ion and incuba ed 15 min a oom empe a u e co e ed om ligh . A e
incuba ion, cells we e washed wi h 2 ml PBS con aining 0.1% digi onin and cen i uged
300 g 5 min. 2 μl o - Recombinan An i-TXNRD1 an ibody [EPNCIR129] (Alexa Fluo ®
647) (ab203261, Abcam). (Ex) = 652 nm;Em) =668 nm. we e added o each sample
and he esul an mix u e was incuba ed 1h a oom empe a u e. Finally, cells we e
cen i uged 5 min a 500 g, washed wice wi h PBS and esuspended in 400 μl o PBS.
Fluo escence was analyzed wi h FACSARRAY BD equipped wi h an a gon ion lase .
Measu emen o cellula GR ac i i y
Glu a hione educ ase ac i i y can be ollowed spec opho ome ically due o he
loss o abso bance a 340 nm, consequence o NADPH oxida ion12.
Caco-2 cells we e g own in 96-wells pla es a a densi y o 4000 cells pe well, and
a e o e nigh incuba ion unde s anda d cul u e condi ions, we e exposed o
ea men o he equi ed incuba ion ime. Then, cell cul u e medium was emo ed and
eplaced wi h modi ied RIPA bu e (50 mM T is-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% T i on
X-100, 1% SDS, 1% DOC, 1 mM NaF, miliQ wa e , EDTA- ee p o ease inhibi o cock ail).
Samples we e shaken 20 min and 25 μl PBS we e added o each well. Then, eac ion mix
(0.1 M T is-HCl pH 8, 0.02 mM NADPH, miliQ wa e ) was added o each sample and
eac ion was hen s a ed by adding 0.52 mM GSSG. Abso bance a 340 nm was
eco ded o 6 min DTX 800 (Beckman Coul e ) (chap e 1) o SPECTROs a Nano (BMG
Lab ech) (chap e s 3 and 4).
In o de o con e abso bance da a in pe cen age o GR ac i i y, he ollowing
calcula ions we e pe o med:
GR ac i i y = |ΔAbs|
Ɛ··[]
whe e |ΔAbs| = AbsLas cycle -Abs0, ƐGSSG = 373 M·cm-1 and [P o ] was de e mined wi h
B ad o d me hod. GR ac i i y alue ob ained om complex- ee samples (nega i e
con ol) was conside ed as 100% o ac i i y, and he es o condi ions we e exp essed
in consequence.
Measu emen o in acellula ROS le els
2’,7’-dichlo odihyd o luo escein diace a e (H2DCF-DA) is a cell-pe meable p obe ha
becomes luo escen when oxidized (DCF), hus luo escence signal is conside ed as a
di ec measu emen o in acellula ROS le els13. A s ock solu ion o 3981 μM was
p epa ed on me hanol, hen dilu ed on PBS o he equi ed wo k concen a ion.
Caco-2 cells we e g own in 96-wells pla es a a densi y o 4000 cells pe well, and
a e o e nigh incuba ion unde s anda d cul u e condi ions, we e exposed o
ea men o he equi ed incuba ion ime. Then, cells we e washed wice wi h PBS and
Expe imen al
108
incuba ed 20 min wi h 100 μl o 20 mM H2DCF-DA (410217, Sigma Ald ich) a 37ºC
co e ed om ligh . Cells we e washed h ee imes wi h PBS and 100 μl o PBS we e
added o each well. Fluo escence was hen analyzed wi h DTX 800 (Beckman Coun e )
(chap e 1) o FLUOs a Omega (BMG Lab ech) (chap e s 2-4). Exci a ion and emission
se ings we e 485 and 535 nm espec i ely.
Analysis o in acellula ROS le els by luo escence mic oscopy
Caco-2 cells we e pla ed in 96-well pla es a a densi y o 4000 cells pe well, hen
incuba ed 24h unde s anda d cell cul u e condi ions and exposed o IC50 o [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)] (2a) o 80 min. Then, CellROX® Deep Red Reagen (C10422, The moFishe )
was added o each well o a inal concen a ion o 5 μM. Cells we e incuba ed 30 min a
37ºC and luo escence was analyzed using con ocal mic oscopy in a Nikon Eclipse Ti®
in e ed luo escence mic oscope, coupled wi h a con ocal module. Exci a ion and
emission se ings we e 644 and 665 nm espec i ely. Fluo escence in ensi y was
analyzed wi h Fiji so wa e.
De e mina ion o RIP-1 p o ein le els
Caco-2 cells we e pla ed on 75 cm2 lasks a a densi y o 500,000 cell pe lask,
incuba ed 24h unde s anda d cell cul u e condi ions and hen exposed o IC50 alue o
[Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) o 2a+acidic polyphenols ex ac om R. canina (DC) o
24h. Cells we e hen collec ed by ipsiniza ion and 100 μl o ixa ion solu ion INTRACELL
(In a 100-T, Immunos ep) we e added o each 50 μl o cells. The esul an mix u e was
hen incuba ed o 5 min a oom empe a u e and washed wi h PBS. Cells we e
esuspended on 50 μl o PBS and 100 μl o pe meabilisa ion solu ion INTRACELL (In a
100-T, Immunos ep) along wi h 3 μl an i-RIP-1 an ibody (ab72139, Abcam) we e added
o each sample. A e 1 h incuba ion a 4ºC, cells we e washed wi h 1 ml PBS and 50 μl
o pe meabilisa ion solu ion INTRACELL (In a 100-T, Immunos ep) we e added. Finally,
seconda y an ibody goa an i-mouse ALEXA 488 was added and samples we e incuba ed
o 30 min a 4ºC. Cells we e washed and esuspended on 200 μl o PBS and luo escence
was analyzed using FACSARRAY BD equipped wi h an a gon ion lase .
Measu emen o au ophagosomes o ma ion
Caco-2 cells we e seeded in 96-well pla es a a densi y o 4·103 cells/well, g own 24h
unde s anda d cell cul u e condi ions and hen incuba ed wi h ea men o he
equi ed ime. Fo au ophagosomes o ma ion, Au ophagy Assay Ki (MAK138, Sigma
Ald ich) was used acco ding o manu ac u e ’s ins uc ion. Fluo escence in ensi y
(λex=360/λem=520 nm) was measu ed wi h FLUOs a Omega (BMG Lab ech).
Fluo escence in ensi y was no malized wi h cell iabili y o assays a 24h incuba ion.
The ob ained alues o luo escence in ensi y a e conside ed as a e lec ion o o al
au ophagosomes o ma ion.
Expe imen al
109
De e mina ion o lysosomal alkaliza ion
Caco-2 cells we e pla ed on 25 cm2 lasks a a densi y o 300,000 cell pe lask,
incuba ed 24h unde s anda d cell cul u e condi ions and hen exposed o he
co esponding ea men (D ug Combina ion (DC): [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) and
acidic polyphenols om Rosa canina) o 24 o 48h. Cells we e hen collec ed by
ipsiniza ion and changes in lysosomal acid con en we e measu ed wi h LysoT acke
G een DND-26 (L7526, Molecula P obes). The dye was i s dilu ed on DMEM o a
concen a ion o 75 nM. Then, 1 mL o dilu ed LysoT acke was added o each 50 μL o
cell sample. Cells we e incuba ed 2h a oom empe a u e co e ed om ligh and hen
we e cen i uged 5 min a 1200 pm. Pelle was esuspended on 200 μL o PBS and he
luo escence signal (λex=504/λem=511 nm) was analyzed by FACSARIA BD equipped wi h
an a gon ion lase .
Measu emen o COX-1/2 ac i i y
Caco-2 cells we e pla ed on 25 cm2 lasks a a densi y o 300,000 cell pe lask,
incuba ed 24h unde s anda d cell cul u e condi ions and hen exposed o IC50 alues o
[Au(L2b)PPh3] (3b) o [Au(L2c)PTA] (4c) o 2 o 24h. Cell medium was collec ed and
cells we e sc aped and lysed. COX-1/2 enzyma ic ac i i y o cell lysa es was analyzed
wi h Cyclooxygenase (COX) Ac i i y Assay Ki (ab204699, Abcam) acco ding o
manu ac u e ’s ins uc ions. Fluo escence was measu ed wi h FLUOs a Omega
Mic opla e Reade (BMG Lab ech).
Analysis o 20S p o easome ac i i y
Caco-2 cells we e g own a 25 cm2 lasks a a densi y o 300.000 cells pe lask and
incuba ed o e nigh unde s anda d cul u e condi ions. Cells we e exposed o IC50
alues o [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) and [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) o 24h, hen collec ed by
ipsiniza ion, lysed wi h saponine (5 mg/ml in PBS) and cen i uged a 13000 pm o 15
min a 4ºC. Supe na an was u he analyzed wi h P o easome 20S Ac i i y Assay Ki
(MAK172, Sigma Ald ich) acco ding manu ac u e ’s ins uc ions. Fluo escence was
measu ed wi h FLUOs a Omega (BMG Lab ech). P o ein concen a ion was de e mined
wi h B ad o d me hod as p e iously desc ibed.
Caco-2 sphe oids gene a ion
Caco-2 cells (3·103 cells pe pla e) we e mixed wi h a high iscosi y me hylcellulose
solu ion p e iously desc ibed by Ayuso e al.14. 100 μl o he esul an solu ion we e
seeded on a ound-bo om 96-well pla e. Sphe oids we e g own o 72h and incuba ed
wi h ising concen a ions o [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) (3, 4 and 5 μM) o 24h.
Fo cell iabili y measu emen , sphe oids we e s ained wi h Hoechs 33342 (4 mg/ml)
and p opidium iodide (4 mg/ml) o 30 min. Then, luo escence was analyzed using
Expe imen al
110
con ocal mic oscopy in a Nikon Eclipse Ti® in e ed luo escence mic oscope, coupled
wi h a con ocal module and luo escence in ensi y was analyzed wi h Fiji so wa e.
Disk di usion es
A disk di usion assay was used o de e mine he diame e o he inhibi ion zone o
complexes 5a-d and 6b-d on selec ed bac e ia s ains (E. coli, P. ae uginosa, S. en e ica,
E. aecalis, L. monocy ogenes, S. epide midis, S. au eus; see Table 17 on Chap e 3 o
u he de ails) and was pe o med ollowing he me hod by Clinical & Labo a o y
S anda ds Ins i u e (CLSI)15. Each disk (Oxoid, England) (6 mm in diame e ) was
imp egna ed wi h 10 µL o each gold complex o con ol (DMSO o nega i e con ol,
phenol o posi i e con ol). Ac i e cul u es (0.5 McFa land) om all s ains p e iously
showed on Table 17 (see Chap e 3) we e sp ead wi h a co on swab on o Muelle -
Hin on Aga (MHA, Oxoid, England). Pla es we e allowed o d y o 3 o 5 minu es. Flame
s e ilized weeze s we e used o place he disks on o inocula ed MHA pla es, one disk in
each o he eigh equal pa s. The pla es we e allowed o s and o 15 minu es and hen
hey we e in e ed and incuba ed o 22 h ± 2 h a 37 ºC ± 1 °C. Upon incuba ion,
diame e o inhibi ion zone was measu ed.
S a is ical analysis
All assays we e pe o med a leas h ee imes, and he ob ained da a we e subjec ed
o one- ailed S uden ’s es . Di e ences we e conside ed signi ican a p < 0.05.
Expe imen al
111
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Expe imen al
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113
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
114
115
CAPITULO 1
ALQUINIL DERIVADOS DE
ORO(I) CON FOSFINAS
HIDROSOLUBLES
-
J Ino g Biochem
.
2017
; 166:108
-
121
- J Ino g Biochem. 2017; 176:123-133
116
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
123
Pa a ob ene una p ime a idea ace ca de la selec i idad de 1a y 2a, se incuba on
du an e 72h sob e la línea Caco-2 di e enciada en can idades equi alen es a sus IC50
(Tabla 4). En ninguno de los dos casos se ob u ie on di e encias signi ica i as espec o
al con ol nega i o, si bien es cie o que la ep oducibilidad de los ensayos no ue la ideal
(Figu a 26). Los da os ob enidos pa ecen indica que la mucosa in es inal pod ía ole a
bien el a amien o con ambos de i ados, aunque con es os da os p elimina es no
pueden desca a se que en un o ganismo i o se p odujesen as o nos
gas oin es inales a consecuencia de la e apia. Se ían necesa ios es udios sob e
modelos animales pa a amplia la in o mación al espec o.
Figu a 26. Es udio de la oxicidad sob e un modelo in i o de la mucosa in es inal. E ec o de 72h
de incubación con 1a (2,65 µM) o 2a (3,80 µM) en la línea Caco-2 di e enciada.
Con [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) se lle ó a cabo una segunda ap oximación ace ca
de su oxicidad en ejidos sanos al calcula el alo de su IC50 en células Caco-2
di e enciadas. A pa i de es e alo y del ob enido p e iamen e en células
indi e enciadas (Tabla 4), se calculó el alo del índice de selec i idad (Selec i i y Index;
SI). Se usa on cispla ino y au ano in como con oles posi i os. Si bien en cuan o a su
e ec i idad 2a esul a menos po en e que el au ano in, aunque es a di e encia no es
demasiado p onunciada, su uso clínico pod ía supone una en aja conside able en
cuan o a su oxicidad sob e ejidos sanos, ya que su SI es mucho mayo que el de es e
á maco come cial (Tabla 5). Po consiguien e, los da os ob enidos has a el momen o
apun an hacia la posibilidad de que es e nue o de i ado de o o eúna las ca ac e ís icas
de e icacia y selec i idad que mencionábamos necesa ias pa a el quimio e ápico ideal.
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
124
Tabla 5. Valo es de IC50 y SI de 2a, así como de los á macos come ciales cispla ino y au ano in,
calculados as 72h de incubación sob e células Caco-2 di e enciadas.
Complejo
IC
50
(µM)
SI
[Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) 51,04 ± 1,28 13,43
Au ano in
6,21
±
0,44
3,45
Cispla in
151,13
±
58,12
3,31
An es de p o undiza en el mecanismo de acción de ambos complejos, se conside ó
que pod ía se in e esan e ob ene una idea p elimina ace ca de sus p opiedades
a macociné icas, en conc e o con aquellas elacionadas con su dis ibución en el
o ganismo. De acue do con lo desa ollado en el apa ado 1.6, la albúmina sé ica es una
de las p incipales implicadas en el anspo e de g an pa e de los á macos po el
o en e sanguíneo. Dado que la albúmina sé ica bo ina (Bo in Se um Albumin; BSA)
p esen a una homología del 75,6% con la HSA43, es posible u iliza la como modelo pa a
p edeci el compo amien o de un á maco en p esencia de la albúmina sé ica humana.
De los 583 esiduos que cons i uyen a la BSA, des acan los ip ó anos en posición 134,
localizado en la supe icie del subdominio IB, y en posición 212 en el bolsillo hid o óbico
del subdominio IIA. El in e és de ambos esiduos eside en que do an a la p o eína de
luo escencia in ínseca, y dado que el espec o de luo escencia de una molécula es á
condicionado po su en o no, en caso de que una molécula es ablezca una in e acción
con la BSA se aduci á en una modi icación de dicho espec o de luo escencia. Es e
enómeno se denomina desac i ación o “quenching” de la luo escencia, y se de ine
como el descenso en la in ensidad de la luo escencia de una molécula debido a cambios
con o macionales de la misma o a la in e acción con moléculas adicionales44–46. Po lo
an o, se analizó el espec o de luo escencia de la BSA en p esencia de di e en es
concen aciones del complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) de acue do con el p ocedimien o
desc i o en la sección expe imen al. En la Figu a 27 puede obse a se que se p oduce
un descenso en la luo escencia de la p o eína con o me se aumen a la concen ación
del complejo me álico.
Es os da os de luo escencia ue on analizados pa a ob ene la cons an e de
desac i ación de S e n-Vome KSV. Pa a ello, se u ilizó la ecuación de S e n-Volme
desc i a en la sección expe imen al y se ep esen ó el alo F0/F (F0 y F = in ensidad en
ausencia y p esencia del complejo me álico 1a espec i amen e) en e a las
concen aciones del mismo; la línea ob enida (Figu a 28A) p opo ciona el alo de la
cons an e de desac i ación, que se ecoge asimismo en la Tabla 6. De igual mane a, se
es udió la in e acción en e BSA y el complejo me álico a di e en es empe a u as pa a
elucida el posible mecanismo a a és del cual se p oducía dicha in e acción. La
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
125
ecuación de S e n-Volme modi icada ( e sección expe imen al) pe mi ió calcula la
cons an e de enlace Kb o cons an e de asociación apa en e, así como el núme o de si ios
de unión o alo n. Ambos pa áme os, que se ecogen en la Tabla 6, pueden se
deducidos a pa i de la pendien e y la o denada en el o igen, espec i amen e, de la
ec a esul an e de ep esen a log[(F0-F)/F] e sus concen ación de 1a (Figu a 28B).
Figu a 27. Es udio de la in e acción de 1a con la p o eína BSA. Desac i ación de la luo escencia
in ínseca de la BSA a 295 K en p esencia de concen aciones c ecien es de 1a (5, 10, 15, 20, 25
y 30 μM). La lecha indica la disminución de la in ensidad de la señal con o me aumen a la
concen ación del complejo me álico.
Tabla 6. Valo es de la cons an e de desac i ación (Ks ), la cons an e de unión (Kb) y los
pa áme os e modinámicos ela i os a la in e acción en e BSA y 1a a di e en es empe a u as.
T (K) n
K
s
(L·mol-1·104) Kb (M-1) ΔG0
(KJ·mol-1)
ΔH0
(KJ·mol-1)
ΔS0 (J·mol-
1·K-1)
295
1,09
2,9
7,21·10
4
-
27,60
161,13
639,76
304
1,34
1,75
6,38·10
5
-
33,36
161,13
639,76
310
1,
44
1,61
1,66·10
6
-
37,20
161,13
639,76
La cons an e de enlace Kb calculada a 295 K iene un alo de 7,21·104 M-1, una ci a
que, si bien es mayo que la ob enida po o os au o es pa a la in e acción en e
cispla ino y HSA47, se a a de un da o muy p óximo al de o os complejos de o o(I) y
o o(III)48,49, ya que se encuen an den o de un ango de en e 103 y 104 M-1. Es e
esul ado pa ece suge i que 1a es capaz de in e acciona signi ica i amen e con la
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
126
p o eína BSA, lo que pod ía implica que la BSA se ía la p incipal esponsable de
anspo a lo po el o en e sanguíneo.
Figu a 28. A) Rep esen ación de la ecuación de S e n-Volme que mues a la pé dida de
luo escencia de la BSA en p esencia de concen aciones c ecien es de 1a a 295 K, a pa i de la
cual se ob iene el alo de Ks . B) Rep esen ación de la ecuación modi icada de S e n-Volme que
mues a la pé dida de luo escencia de la BSA en p esencia de concen aciones c ecien es de 1a
a 295 K, a pa i de la cual se ob iene el alo de Kb. C) Rep esen ación de lnKb en e a 1/T.
En la Figu a 28A se puede obse a que se ob iene una elación lineal al ep esen a
F0/F en e a la concen ación del complejo me álico, lo que se co esponde con la
exis encia de un único mecanismo de desac i ación de la señal luminiscen e. Se han
desc i o dos ipos de mecanismos a a és de los cuales puede p oduci se la
desac i ación de la luo escencia. Po un lado, la desac i ación de ipo es á ica iene
luga cuando el agen e desac i an e o ma un complejo no luo escen e al in e acciona
con el luo ó o o; po o o, cuando ambos agen es colisionan de o ma con inuada se
habla de una desac i ación dinámica50. Es a úl ima depende de la di usión, de modo que
al as empe a u as dan luga a mayo es coe icien es de di usión y po lo an o a un
mayo alo de la cons a e Ks . El análisis de la in e acción en e ambos agen es ealizado
y = -19380x + 76,946
R² = 0,9915
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034
LnKb
1/T (K-1)
y = 29000x + 0,9577
R² = 0,9643
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,0E+00 1,0E-05 2,0E-05 3,0E-05
F0/F
[Complex] (mol L-1)
y = 1,0951x + 4,8581
R² = 0,9816
-1,4
-1,2
-1
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
-5,4 -5,15 -4,9 -4,65 -4,4
log[(F0-F)/F]
log[complex]
A
B
C
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
127
a di e en es empe a u as pe mi e de e mina el ipo de mecanismo según el cual se
induce la desac i ación de la luo escencia. Según se ecoge en la Tabla 6, los alo es de
ambas cons an es Ks y Kb disminuyen con o me se aumen a la empe a u a, lo que
implica que se o ma un complejo en e la BSA y 1a. Es deci , se a a de un mecanismo
de desac i ación de ipo es á ico50,51.
Finalmen e, se calcula on los pa áme os e modinámicos ΔGo, ΔHo, y ΔSo con la
ecuación de an’ Ho (lnKb = -Ho/RT + So/R; Kb es la cons an e de unión a di e en es
empe a u as y R la cons an e de los gases) pa a así pode de e mina las ue zas que
pe mi en la in e acción en e BSA y 1a, pudiendo a a se de in e acciones de an de
Waals, puen es de hid ógeno y/o a acciones de ipo elec os á icas e hid o óbicas. La
en alpia de in e cambio Ho se calcula a pa i de la pendien e de la línea ob enida al
ep esen a lnKb en e a 1/T ( igu a 28C) y Go se es ima a pa i de la ecuación Go =
Ho -TSo. En es e caso, se han ob enido alo es de ΔHo y ΔSo po encima de 0 (Tabla 6),
que indican la exis encia de in e acciones hid o óbicas en e la p o eína y el de i ado
me álico52. Po o o lado, el alo de ΔGo se encuen a po debajo de ce o, lo que es
indica i o de que es e p oceso iene luga de o ma espon ánea. Finalmen e, al
aumen a el núme o de si ios de unión (pa áme o n de la Tabla 6) al induci se el
inc emen o de la empe a u a, puede conclui se que exis e un componen e dinámico
en la unión en e ambas moléculas.
A con inuación, se lle ó a cabo el mismo es udio con [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a).
Tal como puede ap ecia se en la Figu a 29, con o me se inc emen aba la concen ación
del de i ado se obse aba un descenso en la luo escencia de la BSA, de o ma simila a
lo que ocu ía con su análogo 1a. No obs an e, al p ocesa los da os de luo escencia
ob enidos median e la ecuación de S e n-Volme y ep esen a el cocien e F0/F en e a
la concen ación de 2a se ob iene una cu a ascenden e (Figu a 30A) en luga de una
ec a como ocu ía en el caso de 1a (Figu a 28A). Mien as que la ec a indica la
exis encia de un único mecanismo de desac i ación de la luminiscencia, la cu a
ascenden e sugie e que coexis en los dos mecanismos p e iamen e desc i os.
Asimismo, es e pa ón pod ía se consecuencia de que el complejo me álico es capaz de
uni se en más de un luga de la p o eína; en es e supues o, el complejo pod ía sen i
una a inidad dis in a po cada uno de es os si ios, o bien la p o eína pod ía expe imen a
un cambio con o macional como consecuencia de la in e acción, dejando así expues os
o os si ios de in e acción que esul aban p e iamen e inaccesibles50.
De nue o, se es udió la in e acción en e el complejo me álico y la p o eína a dis in as
empe a u as pa a así pode de e mina los alo es de Kb a dichas empe a u as y
calcula los pa áme os e modinámicos ΔHo, ΔSo y ΔGo (Tabla 7) al y como lo habíamos
medido en el caso del complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a). En es e caso, el alo de la
cons an e de enlace a empe a u a ambien e es del o den de 108 M-1, un alo muy
supe io al p e iamen e calculado pa a el análogo 1a (Tabla 6); es a ci a es más simila
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
128
a la hallada po Ji e al. al analiza la in e acción en e una se ie de nanopa ículas de
o o y la BSA53.
Finalmen e, median e el cálculo de los pa áme os e modinámicos se ha
de e minado el ipo de enlaces que pod ían media la in e acción en e 2a y la BSA. Al
ob ene se un alo nega i o pa a ΔGo, se puede conclui que el p oceso es espon áneo,
igual que pasaba en el caso an e io , aunque al calcula los alo es de ΔHo y ΔSo
encon amos o a di e encia con espec o a 1a, dado que en es e caso ambos se
encuen an po debajo de ce o; es o sugie e que la in e acción en e el complejo 2a y la
BSA depende de la o mación de enlaces de hid ógeno y ue zas de Van de Waals54. Los
esul ados ob enidos has a el momen o apun an a que ambos de i ados de o o(I) son
capaces de in e acciona con la p o eína BSA, de modo que es azonable supone que la
albúmina sé ica pod ía se la p incipal esponsable de anspo a los po el o en e
sanguíneo. No obs an e, se han obse ado di e encias signi ica i as en cuan o a la
na u aleza de la in e acción con la p o eína en e los dos complejos, que pod ían es a
causadas po la p esencia del ni ógeno adicional en la ó mula química de 2a.
Figu a 29. Es udio de la in e acción de 2a con la p o eína BSA. Desac i ación de la luo escencia
in ínseca de la BSA a 295 K en p esencia de concen aciones c ecien es de 2a (5, 10, 15, 20, 25
y 30 μM). La lecha indica la disminución de la in ensidad de la señal con o me aumen a la
conce ación del complejo me álico.
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
129
Figu a 30. A) Rep esen ación de la ecuación de S e n-Volme que ep esen a la pé dida de
luo escencia de la BSA en p esencia de concen aciones c ecien es de 2a a 295 K, a pa i de la
cual se ob iene el alo de Ks . B) Rep esen ación de la ecuación modi icada de S e n-Volme que
ep esen a la pé dida de luo escencia de la BSA en p esencia de concen aciones c ecien es de
2a a 295 K, a pa i de la cual se ob iene el alo de Kb. C) Rep esen ación de lnKb en e a 1/T.
Tabla 7. Valo es de la cons an e de desac i ación (Ks ), la cons an e de unión (Kb) y los
pa áme os e modinámicos ela i os a la in e acción en e BSA y 1a a di e en es empe a u as.
T (K) n Kb (M-1) ΔG0
(KJ·mol-1)
ΔH0
(KJ·mol-1)
ΔS
0
(J·mol-1·K-1)
295
1,70
2,3·10
8
-
78,78
-
105,9
47,54
304
1,62
8,98·10
7
-
78,78
-
105,9
46,58
310
1,60
5,95·10
7
-
78,78
-
105,9
45,95
A con inuación, se e omó el es udio ela i o ace ca del e ec o an i umo al de ambos
complejos [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) y [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). Pa a ello, se edujo el
iempo de exposición de 72 a 24h y odos los expe imen os desa ollados a con inuación
ue on ealizados sob e células Caco-2 indi e enciadas, añadiendo una can idad
equi alen e al IC50 de los complejos que se mues a en la Tabla 4 sal o que se especi ique
y = 1,1205e65043x
R² = 0,9947
0
2
4
6
8
10
0,0E+00 1,5E-05 3,0E-05
F0/F
[2a] (mol L-1)
y = 1,6956x + 8,3916
R² = 0,9919
-1,4
-0,9
-0,4
0,1
0,6
1,1
-5,5 -5 -4,5
log[(F0-F)/F]
log[2a]
y = 9476x - 12,738
y = 9476x - 12,738
R² = 0,9826
16
18
20
0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034
Ln Kb
1/T (K-1)
C
A
B
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
130
lo con a io. Al ealiza se una p ime a de e minación de la iabilidad celula con los
pa áme os especi icados, puede obse a se que ambos complejos son capaces de
disminui la p oli e ación del cul i o, si bien el complejo 1a pa ece se más e ec i o que
el 2a (Figu a 31A). Debido a ello, se quiso ahonda en el e ec o an ip oli e a i o de 2a.
Con es e in, se ealizó una cu a dosis- espues a a dos iempos de incubación (24 y 72h)
con el complejo 2a pa a analiza el e ec o de iempo y concen ación sob e su e ec o
ci o óxico, encon ándose que e a dependien e de ambos ac o es (Figu a 31B). Es os
da os sugie en que, pa a iguala el e ec o an i umo al del complejo 1a en un iempo de
incubación conc e o, pod ía se necesa io aumen a la concen ación de 2a. Con es a
p ime a ap oximación se plan ean dos escena ios: o bien el compues o 2a iene más
di icul ades pa a accede a la célula, y po consiguien e equie e más iempo pa a
eje ce su acción biológica, o bien sus mecanismos de acción di ie en, siendo más len o
el de dicho complejo.
A
B
Figu a 31. Análisis del e ec o ci o óxico sob e células Caco-2 indi e enciadas. A) E ec o de 1a y
2a as 24h de incubación en células Caco-2 indi e enciadas en can idades equi alen es a sus
IC50. *p<0,05 s con ol nega i o. B) Cu a dosis- espues a as 24 (cuad ados) o 72h (cí culos)
de exposición con 2a.
La siguien e e apa del es udio consis ió en analiza el ipo de mue e inducida po
ambos complejos sob e la línea Caco-2 as 24h de incubación. Pa a ello, se ecu ió a la
doble inción Anexina V-FITC (Fluo escein iso iocyana e) y yodu o de p opidio55. Es a
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
131
écnica pe mi e dis ingui cua o poblaciones celula es di e en es: células i as,
nec ó icas, en apop osis emp ana y en apop osis a día. Uno de los p ime os e en os
de la apop osis consis e en la anslocación del os olípido os a idilse ina de la ca a
ci oplasmá ica a la ex acelula de la memb ana plasmá ica. La anexina V es capaz de
uni se a es e os olípido, po lo que coo dina la con un compues o luo escen e como el
iso iociana o de luo esceína pe mi i á iden i ica a las células en apop osis emp ana.
El yodu o de p opidio, po su pa e, es capaz de uni se a los ácidos nucleicos, pe o dado
que no puede a a esa la memb ana plasmá ica solo da á luo escencia en aquellas
células cuya memb ana es é comp ome ida, que se án las nec ó icas y las que se
encuen en en la ase a día de la apop osis; es as úl imas, además, se án doble
posi i as po que ambién da án la señal FITC. Finalmen e, las células i as se án doble
nega i as.
Los esul ados ob enidos se mues an en la Figu a 32. En p ime luga , es des acable
el hecho de que ninguno de los complejos es udiados induce aumen os signi ica i os en
el núme o de células nec ó icas, lo que es de in e és clínico de acue do con lo
desa ollado en el apa ado 1.256. En lo que espec a al complejo [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a),
puede obse a se un conside able aumen o del núme o de células en apop osis a día,
lo que pod ía se indica i o no solo de su capacidad de induci apop osis sino además
de su ya mencionado posible ápido e ec o biológico. No obs an e, el esul ado ob enido
pa a su análogo [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a) es muy di e en e, ya que en es e caso solo
se ob u o un lige o aumen o en la población celula en apop osis a día, jun o con un
inc emen o no signi ica i o del núme o de células en apop osis emp ana.
Figu a 32. Es udio de las poblaciones apop ó icas y nec ó icas en un cul i o de células Caco-2
indi e enciadas as 24h de a amien o con A) DMSO (con ol nega i o; 2 μM); B) 1a (IC50); C)
2a (IC50). La Figu a 28 se oma además como ejemplo pa a indica la elación en e cada uno de
los cuad an es del his og ama y la luo escencia de las dos sondas u ilizadas. Células i as:
ausencia de luo escencia. Células nec ó icas: luo escencia yodu o de p opidio. Células en
apop osis emp ana: luo escencia FITC. Células en apop osis a día: doble luo escencia.
A pesa de que la hipó esis inicial de que 1a ac úa a mayo elocidad que 2a pa ece
es a alidada po los esul ados mos ados en las Figu as 31A y 32, el lige o aumen o
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
132
en el núme o de células en apop osis a día inducido en espues a al a amien o con
2a no pe mi e aplica el p incipio de Ockham y acep a como álida es a suposición, ya
que la disminución en la iabilidad del cul i o e lejada en la Figu a 31A no puede
explica se únicamen e con ese le e inc emen o de células en apop osis a día. Es o
obliga a busca al e na i as a la hipó esis inicial, en e las que se encuen an supone
que 2a no causa la mue e de las células umo ales median e la inducción de apop osis.
Pa a comp oba lo, se es udió median e doble inción luo escen e Hoechs 33342 y
CellE en Caspase-3/7 G een de ec ion eagen la ac i ación de las caspasas ejecu o as
3 y 7 as 24h de exposición a 2a (Figu a 33). Al no encon a se e idencias de la
ac i ación de dichas p o easas, se pudo conclui que el de i ado causaba la mue e
celula a a és de un mecanismo independien e de caspasas, lo que pod ía desca a la
inducción de apop osis. La imagen de luo escencia e ela, además, o os dos da os de
g an ele ancia. El p ime o de ellos, una e ec i a disminución de la población celula en
espues a al a amien o que concue da con la Figu a 31A. El segundo y de mayo
in e és, el aumen o del olumen celula como consecuencia de la incubación con 2a.
Es a ca ac e ís ica mo ológica no es p opia de las células apop ó icas, ya que es e ipo
de mue e celula cu sa con un encogimien o del olumen celula 57,58. Si bien se han
documen ado casos en los que un agen e quimio e apéu ico puede induci apop osis
po ías que no equie en la ac i ación de las caspasas, la o mación de los cue pos
apop ó icos pa ece se una e apa común y obliga o ia59–61. Po an o, la ausencia de es e
ma cado , jun o con la ya mencionada no ac i ación de caspasas ejecu o as, pe mi e
conclui que 2a induce un ipo de mue e dis in o an o a apop osis como a nec osis.
Figu a 33. Doble inción con Hoechs 33342 (azul) y CellE en Caspase-3/7 G een de ec ion
eagen ( e de) as 24h de incubación con 2a (IC50). Se ma can con lechas blancas células cuyo
olumen ha aumen ado de o ma ap eciable.
Llegados a es e pun o, había quedado pa en e que la espues a celula a iaba
conside ablemen e dependiendo de a qué complejo uese expues a, po lo que se io
necesa io es udia po sepa ado el e ec o biológico de cada uno de ellos. Así pues, se
decidió con inua ca ac e izando el ipo de apop osis inducida po el complejo
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
139
E ec i amen e, los esul ados mos ados en la Tabla 8 e elan que la incubación con 1a
no solo no educe la ac i idad de la GR, sino que incluso la aumen a lige amen e, aunque
de o ma no signi ica i a. Es e aumen o puede se consecuencia del an es mencionado
papel del sis ema glu a ión-glu a edoxina como “cus odio” de la ac i idad de la
io edoxina an e una dis unción de la T xR ( e apa ado 1.5, pág. 64; Figu a 20).
Tabla 8. Medida de ac i idades de enzimas edox como po enciales dianas e apéu icas 1a. Se
incluyen esul ados ob enidos con enzimas ecombinan es y p oceden es de lisados celula es
(células Caco-2 as 24h de incubación con el complejo). *p<0,05 s con ol nega i o. **p<0,005
s con ol nega i o.
Concen ación 1a
(µM)
Enzima
Ac i idad enzimá ica
(μmol·mg− 1·min− 1)
% ac i idad
enzimá ica
0 (con ol nega i o)
T xR ( ecombinan e)
0,30 ±
0,03
100
2,65
T xR ( ecombinan e)
0,22 ± 0,03
*
72,63
5,30
T xR ( ecombinan e)
0,19 ± 0,02
**
64,86
0 (con ol nega i o)
T xR (cél. Caco
-
2)
0,15 ± 0,03
100
2,65
T xR (cél. Caco
-
2)
0,13 ± 0,01
*
85,
84
0 (con ol nega i o)
GR (cél. Caco
-
2)
1,55 ± 0,33
100
2,65
GR (cél. Caco
-
2)
1,75 ± 0,53
112,
67
Si bien se ha comp obado que 1a es capaz de ealiza un bloqueo di ec o de la
ac i idad de la T xR, con los da os ob enidos has a el momen o no se puede desca a
que ambién lle e a cabo una inhibición indi ec a de la enzima, es o es, una educción
de su ni el de exp esión. Chen e al. obse a on que el a amien o con au ano in podía
disminui los ni eles de exp esión de la iso o ma mi ocond ial de la io edoxina
educ asa88, de modo que inspi ados po sus esul ados se decidió analiza los ni eles
de exp esión de la io edoxina y la T xR de células Caco-2 as 24h de exposición al
complejo me álico. Las Figu as 39A y 39B mues an que la exp esión de ambos genes
TXN y TXNRD1 se inc emen aba en espues a al a amien o. Es os esul ados
pe mi ie on desca a que 1a lle ase a cabo una inhibición indi ec a de cualquie a de las
dos enzimas, pues o que ocu ía jus o lo opues o.
T as ob ene se es os da os, se de e minó la can idad de la enzima T xR p esen e en
el in e io celula median e ci ome ía de lujo, obse ándose un inc emen o e ec i o
en espues a a la sob eexp esión del gen (Figu a 39C). Es e aumen o de la exp esión
génica, que se aduce a su ez en una mayo can idad de p o eína, pod ía se la
espues a de la célula al bloqueo a macológico de la T xR, un p e-mecanismo de
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
140
esis encia a la e apia. No obs an e, de acue do con los da os ob enidos, es a es a egia
no consigue e i a la mue e celula . Sin emba go, la capacidad de la célula de
sob eexp esa an o la T xR como la io edoxina, así como el hecho de que se
inc emen e la ac i idad de la GR (Tabla 8), debe se enido en conside ación, ya que una
e apia p olongada pod ía da luga a una esis encia e ec i a a a és de la combinación
de es os es elemen os. Fu u os expe imen os en modelos animales debe án ene en
cuen a es os da os pa a a a de hace más e ec i a la e apia usando los complejos de
o o jun o a bloquean es del sis ema glu a ión-glu a edoxina pa a quizá aumen a las
posibilidades de éxi o del a amien o, ya que, según se desa olla á más adelan e, la
inhibición concomi an e de T xR y GR implica una mayo p obabilidad de éxi o
e apéu ico89.
Figu a 39. E ec o de 24h de a amien o con 1a (IC50) sob e la exp esión génica de células Caco-
2. A) De e minación del ni el de exp esión del gen TXN. B) De e minación del ni el de exp esión
del gen TXNRD1. C) Medida de la can idad de p o eína T xR en el in e io celula .
Dado el papel cla e de la T xR en el man enimien o de la homeos asis edox, al inhibi
su ac i idad median e la incubación con 1a e a espe able un inc emen o en los ni eles
de especies eac i as de oxígeno. De acue do con in es igaciones p e ias espec o al
mecanismo de acción del au ano in, la up u a del equilib io edox es a ía di ec amen e
elacionada con la capacidad del compues o de induci la mue e de la célula
umo al15,90–92. Po lo an o, se midie on los ni eles de ROS en células Caco-2 as 1h de
exposición a 1a y a au ano in como con ol posi i o. Se obse ó un aumen o signi ica i o
(p<0,001) con espec o al con ol nega i o (Figu a 40), lo que pe mi ió conclui que,
e ec i amen e, el bloqueo de la T xR se adujo en una up u a del equilib io edox que
pod ía se una de las causas de la inducción de apop osis.
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
141
Figu a 40. Medida de los ni eles de ROS en células Caco-2 as 1h de exposición a 1a (IC50) o a
un con ol posi i o (au ano in, 1,80 µM). Los esul ados se exp esan como alo es p omedio de
unidades a bi a ias de luo escencia. **p<0,005 s con ol nega i o. ***p<0,001 s con ol
nega i o.
Es e inc emen o en los ni eles de ROS ambién pod ía se la azón po la que se
obse a un a es o en la ase G2/M del ciclo celula (Figu a 37). Wang e al. obse a on
que una al a p oducción de ROS enía como consecuencia la ac i ación de Chk1/2, una
p o eína que bloquea la acción de Cdc25C, la cual a su ez p omue e el paso de la ase
G2 a la mi osis93. Po o a pa e, de acue do con los esul ados ob enidos po Kang e al.,
la ac i ación de la p o eína p38 en espues a a un inc emen o en los ni eles de ROS es á
a su ez elacionada con un cese del ciclo en la ase G2/M94. En es e sen ido, nues os
esul ados pod ían suge i que los ele ados ni eles de ROS causados a consecuencia del
a amien o con el complejo me álico causan g a es daños en el ADN du an e la ase G2
del ciclo, lo que p o oca ía que el pun o de con ol que de e mina la en ada en la
mi osis iniciase la apop osis pa a man ene la in eg idad del genoma. Así mismo, es a
p oducción abe an e de ROS ambién pod ía es a elacionada con la inducción de
apop osis a a és de una segunda ía, dado que la ac i ación de la p o eína p38 ambién
es á elacionada con un inc emen o en la asa de ac i ación de la caspasa 993,94. No
obs an e, en nues o caso conc e o es o es poco p obable, dada la escasa ac i ación de
es a caspasa según se puede ap ecia en la Figu a 36A.
Po úl imo, el exceso de ROS pod ía se ambién esponsable del e ec o obse ado
sob e la exp esión génica de los miemb os del sis ema io edoxina (Figu a 39). En
p esencia de al as can idades de ROS, se p oduce una es abilización del mRNA que
codi ica a la T xR pa a así con ibui a una mayo p oducción de es a enzima y pode
e i a la mue e desencadenada po una can idad abe an e de ROS95. Es o pod ía
explica po qué el aumen o de exp esión del gen TXNRD1 (Figu a 39B) se aduce en un
inc emen o e ec i o de la can idad de T xR en el medio in acelula (Figu a 39C). Es a
explicación ambién es aplicable al aumen o de exp esión del gen TXN96.
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
142
Así, se da po concluido el es udio p elimina ace ca del uso po encial del complejo
1a con ines quimio e apéu icos en e al CRC. Su mecanismo de acción se esquema iza
en la Figu a 41.
Figu a 41. Rep esen ación esquemá ica del mecanismo de acción del complejo 1a sob e células
Caco-2.
Se e omó en onces el análisis de las p opiedades an ip oli e a i as del complejo
[Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a). El escaso aumen o en los ni eles de apop osis y nec osis de
acue do con los da os de ci ome ía de lujo (Figu a 32), unido a la ausencia de ac i ación
de caspasas y el eno ipo nec ó ico (Figu a 33) nos induje on a sospecha que es e
de i ado pod ía induci nec op osis en luga de apop osis.
Además de las ya ci adas e idencias, es pe inen e menciona una más. A la ho a de
de ec a células nec op ó icas median e ci ome ía de lujo, la doble inción con anexina
V-FITC y yodu o de p opidio posee una impo an e limi ación. Ya que du an e la
nec op osis no se p oduce la aslocación de la os a idil se ina a la ca a ex e na de la
memb ana plasmá ica, pod ía cae se en el e o de supone que las células
nec op ó icas da ían un ma caje nega i o pa a anexina V-FITC. No obs an e, en la
p ác ica las células en apop osis a día y las nec op ó icas pueden con undi se. Debe
ene se en cuen a que uno de los p ime os e en os de la nec op osis es la up u a de la
memb ana plasmá ica debido a la excesi a hinchazón celula , lo que a a pe mi i la
en ada en la célula de ambas sondas, de o ma simila a lo que les ocu e a las células
en apop osis a día97. De ahí que sea necesa io medi o os pa áme os, como el amaño
de las células, o inclui ma cado es especí icos de nec op osis en la mezcla de sondas
pa a pode di e encia ambas poblaciones. En nues o caso conc e o, el aumen o de la
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
143
población celula en apop osis a día espec o al con ol nega i o (Figu a 32C) pod ía
a a se, en ealidad, de células nec op ó icas mal clasi icadas.
Se comenzó el es udio de ma cado es nec op ó icos median e el análisis de la asa
de ac i ación de la p o eína RIP-1, que en el apa ado 1.2 se mencionaba como una de
las p incipales esponsables de es e ipo de mue e ( e Figu a 9; pág. 41) as incuba
un cul i o de células Caco-2 con 2a du an e 24h. Se obse ó un aumen o de 8,5 eces
en su ni el de exp esión (Figu a 42A), lo cual pa ecía con i ma su implicación en el ipo
de mue e inducida po el complejo me álico. Pa a con i ma lo, se p e-incubó el cul i o
con el inhibido especí ico de RIP-1 nec os a ina-1 (Nec-1). De acue do con la Figu a 42B,
el p e- a amien o con Nec-1 aumen ó signi ica i amen e la iabilidad celula en
compa ación con aquellas que solamen e ue on incubadas con el complejo 2a (p<0,05),
si bien no se consiguió educi po comple o el e ec o an ip oli e a i o del complejo de
o o.
A B
Figu a 42. Análisis de la implicación de RIP-1 en la mue e celula inducida as 24h de incubación
con 2a (IC50). A) Ni eles de exp esión de la p o eína RIP-1 as 24h de incubación con DMSO
(panel supe io ; con ol nega i o, 2 μM) o 2a (panel in e io ). B) Es udio del e ec o del inhibido
de RIP-1 nec os a ina-1 (50 µM, 1h) sob e la capacidad an ip oli e a i a de 2a. *p<0,05 espec o
al con ol nega i o. #p<0,05 espec o a células a adas con 2a.
Una ez demos ada la implicación de RIP-1 en la mue e celula inducida po 2a, se
amplió el es udio u ilizando dos inhibido es de pun os cla e de la u a nec op ó ica
mejo ca ac e izada: aquella que depende de la unión en e TNF-α y su ecep o TNFR1
( e apa ado 1.2, pág. 41; Figu a 9). En p ime luga , se ecu ió a un análogo del TNFR1
que impide su unión con TNF-α, obse ándose que el p e- a amien o con es e
compues o enía un e ec o simila al p e iamen e encon ado con Nec-1 (Figu a 43A). A
con inuación, se u ilizó el compues o SN50, capaz de bloquea la aslocación al núcleo
de NF-κB y, po consiguien e, su e ec o sob e la exp esión de di e sos genes
elacionados con la exp esión de ci oquinas p o-in lama o ias en e las que se incluye el
p opio TNF-α, y se encon ó de nue o que emi ía el e ec o an ip oli e a i o de 2a
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
144
(Figu a 43B). Po lo an o, los esul ados mos ados en las Figu as 42 y 43, sugie en que
2a induce la u a nec op ó ica dependien e de TNF-α.
A
B
Figu a 43. E ec o de inhibido es de pun os cla e de la nec op osis dependien e de TNF-α sob e
la capacidad an ip oli e a i a de 2a (IC50) as 24h de incubación. A) P e-incubación con un
análogo de TNFR1 (5 μM, 1 h). *p<0,05 espec o al con ol nega i o. #p<0,05 espec o a células
a adas con 2a. B) P e-incubación con SN50 (1 μM, 1 h). *p<0,05 espec o al con ol nega i o.
#p<0,05 espec o a células a adas con 2a.
No obs an e, según puede obse a se en las Figu as 42B y 43 ninguno de los es
inhibido es u ilizados dio luga a una ecupe ación de la iabilidad celula compa able a
la del con ol nega i o, es deci , no se p odujo en ningún caso una anulación del e ec o
an ip oli e a i o de 2a. Kim e al.98 obse a on que el p e- a amien o con Nec-1
ampoco pudo bloquea po comple o la nec op osis causada po un compues o na u al
sob e células NSCLC, un modelo de cánce de pulmón de células no pequeñas. Cui e al.
99 ob u ie on esul ados simila es al induci nec op osis sob e células de cánce de
p ós a a (línea PC-3) con seleni o. En es e caso pa icula , sin emba go, sí log a on una
p o ección comple a al ecu i a un inhibido selec i o de la RIP-3. Tomando es os dos
abajos en conside ación, es posible deduci que RIP-3 puede ene un papel mucho
más ele an e que RIP-1 en cuan o al con ol del p oceso nec op ó ico, a pesa de que
o zosamen e deba se ac i ada po RIP-1, lo que se e apoyado po los esul ados
ob enidos po o os in es igado es ace ca de su implicación c ucial en la nec op osis
mediada po TNF-α100. En es e sen ido, se pod ía quizá es ablece una compa ación
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
145
en e RIP-3 y las caspasas ejecu o as en cuan o a su papel de e minan e pa a el p oceso
de mue e celula .
Dado que en el es udio del e ec o de 2a nos hemos limi ado a analiza el e ec o de
RIP-1 u ilizando al inhibido selec i o Nec-1, la hipó esis ace ca del mayo peso de RIP-
3 en es e p oceso no puede se con i mada ni desca ada po el momen o. Debe ene se
en cuen a, además, que no exis en da os has a el momen o ace ca del papel de RIP-3
en la inducción de nec op osis sob e la línea Caco-2, de modo que son necesa ios más
da os ela i os a es e modelo umo al pa a escla ece el po qué de los da os ob enidos
has a el momen o.
Al ma gen de es a posible ele ancia de RIP-3, exis e una segunda hipó esis que
pod ía explica los esul ados mos ados en las Figu as 42B y 43, undamen ada en la
es echa elación en e los di e en es ipos de mue e celula . An e io men e, se ha
discu ido ace ca del papel de la nec op osis como mecanismo de eme gencia en caso de
que la apop osis se encuen e bloqueada101. Se han encon ado ambién e idencias de
que puede sucede a la in e sa, es deci , que el bloqueo de la nec op osis enga como
consecuencia un aumen o de la apop osis. Han e al.102 obse a on que el uso de Nec-1
podía causa un aumen o de la apop osis en dos modelos de leucemia (líneas K562 y
HL60) a adas con el compues o na u al shikonina. También se han dado casos en los
que un único compues o puede induci al mismo iempo apop osis y nec op osis, de
acue do con la in es igación ealizada po Kho sandi e al.103 ace ca del e ec o
an i umo al de la que ce ina sob e células MCF-7 (ca cinoma de mama). Los au o es
demos a on que, an o la inhibición de las caspasas mediada po zVAD (un conocido
inhibido de la apop osis) como el bloqueo de la nec op osis causado po Nec-1
p omo ían una ecupe ación pa cial de la iabilidad celula as el a amien o con
que ce ina. Obse a on, además, que el uso de Nec-1 enía como consecuencia
inespe ada un descenso en los ni eles de exp esión de BAX jun o con un aumen o en los
de Bcl-2 en compa ación con células a adas únicamen e con que ce ina. Es deci , el
bloqueo de la nec op osis podía ene un e ec o an i-apop ó ico como consecuencia,
obse ándose que el uso de Nec-1 enía un mayo e ec o p o ec o que el de z-VAD pa a
la iabilidad del cul i o a ado con que ce ina.
En is a de es a cu iosa elación en e ambos ipos de mue e celula , conside amos
in e esan e ol e a analiza con la doble inción anexina V-FITC y yodu o de p opidio al
cul i o de Caco-2 as 24h de incubación con 2a, aunque en es a ocasión as una p e-
incubación con Nec-1. Se ob u o un inc emen o en el núme o de células en apop osis
emp ana, concomi an e con un descenso en la población en apop osis a día (Figu a
44). De acue do con la suposición inicial de que las células en apop osis a día pod ían
se células nec op ó icas97, los esul ados ob enidos sugie en que, al bloquea la
nec op osis con Nec-1, los daños inducidos po 2a son oda ía incompa ibles con la ida,
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
146
po lo que la mue e de la célula es ine i able y se induce apop osis de mane a
al e na i a.
Figu a 44. Es udio de las poblaciones apop ó icas de un cul i o de células Caco-2 incubadas
du an e 24h con 2a (IC50) en p esencia o ausencia de un p e- a amien o con Nec-1 (50 µM, 1h).
Si bien las p uebas ob enidas has a el momen o pa ecen indica que 2a
e ec i amen e induce la mue e po nec op osis como p ime a al e na i a, oda ía
quedaba pendien e de e mina el mecanismo molecula que desencadenaba es a
espues a. Además, dado el di e en e compo amien o mos ado espec o a 1a, no
podía desca a se que odos los p ocesos desc i os has a el momen o uesen
consecuencia de una in e acción di ec a con el ADN. Es a hipó esis se sus en aba sob e
el hecho de que, ecien emen e, se ha descubie o la capacidad del cispla ino pa a
induci nec op osis sob e algunas líneas celula es104. Además, o os au o es han
elacionado la inducción de daños sob e el ADN con la mue e po nec op osis105. Po
an o, se e aluó la capacidad de 2a de in e acciona con el plásmido pIRES2-EGFP. Se
u iliza on dos concen aciones dis in as del complejo y al cispla ino como con ol
posi i o. La Figu a 45 pe mi e desca a la in e acción di ec a en e el ADN y 2a, lo que,
además de suge i que el de i ado de o o pod ía se menos óxico que el cispla ino, algo
que ya se había sospechado al calcula sus espec i os índices de selec i idad (Tabla 5),
da pie a con inua la búsqueda de su mecanismo de acción, p esumiblemen e más
selec i o.
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
147
Figu a 45. In e acción en e el plásmido pIRES2-EGFP (ca il 2) con 2a en una p opo ción
complejo:plásmido de 0,5 (ca il 6), 1 (ca il 7) o 2 (ca il 8), así como con cispla ino como con ol
posi i o ( a io 0,5 ca il 3; a io 1 ca il 4; a io 2 ca il 5). Ma cado de peso molecula en el
ca il 1.
T as habe desca ado una in e acción di ec a con el ADN como esponsable de la
inducción de la nec op osis, pasamos a conside a una hipo é ica up u a del equilib io
edox como causa de la misma. Exis en nume osas e e encias ace ca del papel cla e de
las especies eac i as de oxígeno en es a clase de mue e celula . Se ha obse ado que
la p opia p o eína RIP-1, una ez ac i ada, pod ía induci la p oducción de ROS al causa
un descenso en los ni eles de exp esión de la enzima mi ocond ial esponsable de la
con e sión de ADP en ATP. Es e aumen o de ROS gene a, a su ez, un bucle de
e oalimen ación que conduce a un mayo aumen o de la ac i idad de la RIP-1106,107.
También la ac i ación de la RIP-3 puede in e eni en la up u a de la homeos asis edox,
ya que en su caso es capaz de ac i a a enzimas elacionadas con la glicólisis y la
espi ación ae obia. Al aumen a ambos p ocesos, se p oduce como consecuencia un
exceso de ROS106,108, que p esumiblemen e con ibui ía a man ene a la RIP-1 ac i ada
y uncional según lo desc i o an e io men e, con ibuyendo asimismo a la ac i ación de
la p opia RIP-3. Si bien es cie o que es os da os no apun an a la gene ación de ROS
como p incipales esponsables de la nec op osis, sí dejan pa en e su ele ancia pa a que
el p oceso con inúe. Una p ueba más con unden e ace ca del papel de las ROS como
induc o es de es e ipo de mue e la p esen a on Yu e al.109, al de alla la acción
an i umo al de la ci onela sob e un modelo de cánce de pulmón humano (células NC1-
H1299). En el ci ado abajo, los au o es obse a on dos picos en la p oducción de ROS:
el p ime o de ellos se daba an es de inaliza las 6h de incubación, po lo que lo
a ibuye on al e ec o di ec o de la ci onela, mien as que el segundo pico se daba
pasadas 12h de a amien o y lo a ibuye on al bucle de e oalimen ación, es deci , al
p oceso nec op ó ico en sí.
Po odo ello, se analiza on los ni eles de ROS en células Caco-2 as 1h de incubación
con 2a. Se u ilizó la sonda luo escen e CellROX® Deep Red Reagen y mic oscopía de
luo escencia. La Figu a 46A mues a un no able aumen o de la luo escencia, que se
co esponde con un inc emen o del ni el in acelula de ROS en espues a al
a amien o con el de i ado me álico. Pa a con i ma que es e hecho gua daba elación
con la mue e celula , se analizó la iabilidad del cul i o as un p e- a amien o con el
CAPÍTULO 1: Alquinil de i ados de o o(I) con os inas hid osolubles
148
an ioxidan e N-ace il-cis eína (NAC). El uso de es e compues o sí e i ió po comple o
el e ec o del complejo me álico sob e la mue e del cul i o (Figu a 46B), lo que no se
había conseguido con ninguno de los inhibido es especí icos de la nec op osis u ilizados
p e iamen e (Figu as 42B y 43). Es o demues a el papel cen al de la p oducción de
ROS en la mue e celula inducida po 2a.
Figu a 46. In luencia de 2a sob e la p oducción de ROS. A) Análisis de la can idad o al de ROS
en el in e io celula as 1h de incubación con DMSO (panel izquie do; con ol nega i o, 2 μM)
o 2a (IC50) (panel de echo) u ilizando la sonda luo escen e CellROX® Deep Red Reagen . B)
In luencia de la p e-incubación con NAC (30 mM, 1h) sob e la iabilidad celula as 24h de
incubación con 2a (IC50). *p<0,05 s con ol nega i o. #p<0,05 s 2a.
Una ez demos ado el papel esencial de la inducción de es és oxida i o pa a el
e ec o an ip oli e a i o de [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), se decidió es udia el po encial
de RIP-1 en es a p oducción de ROS, ya que de acue do con los abajos an e io men e
mencionados la ac i ación de es a p o eína puede ene como consecuencia un
aumen o en los ni eles de especies eac i as de oxígeno106–108. Se de e mina on los
ni eles de ROS as una p e-incubación con Nec-1 y se encon ó que, e ec i amen e, la
inhibición de RIP-1 p omo ía un descenso en los ni eles de ROS, compa able an o al del
con ol nega i o como al u iliza NAC (Figu a 47). Es os esul ados son simila es a los
ob enidos po Yu e al. 109 en elación al pico de ROS ob enido una ez se ac i aba la
maquina ia nec op ó ica, y dejan cons ancia una ez más del papel de RIP-1 en la
gene ación de ROS, necesa ia a su ez pa a el bucle de e oalimen ación ROS-RIP-1 que
induce la o mación del nec osoma y la consiguien e mue e celula ía nec op osis.
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
251
En nues a expe iencia, la endencia que mues an los complejos de o o(I) es a eje ce
un mayo e ec o an ip oli e a i o sob e el modelo de cánce colo ec al, lo que se hace
e iden e si obse amos los esul ados ob enidos con las se ies 3a-d y 4a-d ( e Capí ulo
3, pág. 205; Tabla 12). Es e compo amien o ambién se obse ó con el complejo
[Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), cuyo IC50 sob e células MCF-7 iene un alo de 19,02 ±
0,02 µM, 5 eces mayo que sob e células Caco-233. T abajos de o os au o es mues an
pau as simila es an o con complejos de o o(I)34, como de o o(III)35. Una posible
explicación a es as di e encias eside en la a inidad de los complejos de o o po la
io edoxina educ asa, enzima que es á sob eexp esada de o ma habi ual en cánce
colo ec al, pe o no en odos los sub ipos de cánce de mama. En es e sen ido, la
inhibición de la T xR puede se de g an in e és en umo es colo ec ales dada su al a
dependencia de su acción edox36,37, pe o se ha obse ado que en umo es de mama
posi i os pa a el ecep o de es ógenos la si uación es comple amen e di e en e. Un
es udio lle ado a cabo po Cañas e al.38 sob e la línea MCF-7, modelo de cánce de
mama posi i o pa a el ecep o de es ógenos, e eló que la inhibición de la T xR
causada po au ano in enía como consecuencia un aumen o en la can idad de p o eínas
ni osiladas. Es a up u a de la homeos asis S-ni oso iol causaba un e ec o p oli e a i o
sob e el cul i o celula . Es deci , en el caso de complejos de o o cuya única diana sea la
T xR, es espe able que su e ec o e apéu ico sea meno en la línea MCF-7 que en o os
modelos celula es como puede se la línea Caco-2. De hecho, es o explica ía en pa e el
hecho de que el complejo [Au(L2b)PPh3] (3b) (siendo L2b el alquino de i ado de la 3-
hid oxi la ona 2-(4-b omo enil)-3-hid oxi-4H-c omen-4-one) u iese un e ec o
conside ablemen e mayo sob e la línea Caco-2 que sob e la MCF-7 ( e Capí ulo 3, pág.
205; Tabla 12), ya que dos de sus dianas e apéu icas e an la COX-2), que no se exp esa
en la línea MCF-7, y además la T xR, cuya inhibición pod ía incluso ene el e ec o
con a io al deseado38. Re omando el papel del complejo [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) sob e
la línea MCF-7 a la is a de es as conside aciones, es os da os pod ían in e p e a se de
dos mane as. Puede supone se que es e complejo ca ece de a inidad po la T xR y que
en su luga a ec a a o a diana, o bien que se a a de un complejo mul i a ge y que
además de inhibi a dicha enzima a ec e a o as dianas que sí son cla e pa a la
supe i encia de la línea MCF-7.
Tomando como modelo a la línea Caco-2, se decidió analiza la capacidad de 7a de
inhibi a la T xR as 24h de incubación. Se encon ó un descenso signi ica i o (p<0,05)
en la ac i idad de la enzima (Figu a 75), lo cual la señala como una de sus po enciales
dianas e apéu icas. Po lo an o, es o pa ece in alida la p ime a de las hipó esis
plan eadas.
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
252
Figu a 75. E ec o del complejo 7a (IC50) sob e la T xR de células Caco-2 as 24h de incubación.
*p<0,05 s con ol nega i o.
En el ya mencionado abajo de Cañas e al.38, los au o es descub ie on que la
inhibición de la T xR lle ada a cabo po el a amien o con au ano in sí causaba la
mue e de las células MCF-7 si se bloqueaba al mismo iempo la exp esión del ecep o
de es ógenos. De acue do con es os esul ados, cab ía la posibilidad de que el complejo
7a ac úe no solo como inhibido de la T xR sino, además, como un an agonis a del
ecep o de es ógenos. De acue do con es a ap oximación, el e ec o p oli e a i o
causado po la inhibición de la io edoxina educ asa pod ía queda anulado y causa la
mue e de la célula. Es e e ec o an agonis a pod ía es a mediado po un bloqueo
di ec o del ecep o o bien po una inhibición indi ec a al educi su ni el de exp esión.
Se decidió lle a a cabo un ensayo p elimina pa a de e mina si el mecanismo de acción
de los ligandos y los complejos pod ía es a elacionado con el ecep o de es ógenos.
Pa a ello, se calculó el IC50 de ambos ligandos y de los complejos [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a)
y [Au(L2)(PPh3)](T O) (7b) a modo de ejemplo sob e la línea celula MDA-MB-231, un
modelo de cánce de mama que no exp esa el ecep o de es ógenos39. Los alo es
ob enidos as 72h de incubación se mues an en la Tabla 20.
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
253
Tabla 20. Valo es de IC50 (µM) ob enidos pa a los complejos 7a y 7b, así como pa a sus ligandos
L1 y L2, as 72h de incubación en células MDA-MB-231. Los esul ados se exp esan como media
± des iación es ánda . *p<0,05 s ligando.
Complejo
IC
50
(
μ
M)
L1
5,69
±
0,11
[Au(L1)(PPh
3
)](T O) (
7a
)
0,78
± 0,20*
L2
154,09
± 0,01
[Au(L2)(PPh
3
)](T O) (
7b
)
0,27
±
0,05*
Si compa amos es os esul ados con los p e iamen e ob enidos sob e la línea MCF-7
(Tabla 19), el da o más llama i o es el IC50 del ligando L2, ya que es ap oximadamen e
12 eces mayo en el modelo que no exp esa el ecep o de es ógenos que en el que sí
lo exp esa. Es a ma cada di e encia pod ía implica que el ligando L2 es capaz de
in e acciona con el ecep o de es ógenos, lo que explica ía su conside able e ec o
sob e la línea MCF-7. El ligando L1, po el con a io, esul a más e ec i o en e al
modelo nega i o pa a el ecep o de es ógenos que pa a el posi i o, po lo que se
desca a la hipó esis plan eada en es e supues o. De igual mane a, los dos de i ados de
o o(I) ensayados sob e la línea MDA-MB-231 mues an alo es compa ables a los
p e iamen e ob enidos en la línea MCF-7 (complejo 7a), o incluso exhiben un mayo
e ec o an ip oli e a i o (complejo 7b). Po an o, pa ece queda desca ada la
posibilidad de que el e ec o biológico de los complejos es é mediado po una ue e
in e acción con el ecep o de es ógenos. No obs an e, los da os ob enidos en la línea
MDA-MB-231 esul an in e esan es en an o a que odos los esul ados ob enidos has a
el momen o apun an a que es a se ie de de i ados de o o(I) pod ían ene un u u o
p ome edo en el a amien o del cánce de mama, independien emen e de que se
exp ese o no el ecep o de es ógenos. Exis en e idencias de que el au ano in es capaz
de educi la ac i idad de la enzima elome asa median e la p oducción de ROS y la
inac i ación de STAT3 en células MDA-MB-23140. Pues o que la ac i idad elome asa es
cla e pa a las células umo ales, es a pod ía se una de las dianas a a és de las cuales
los complejos 7a y 7b lle an a cabo su e ec o an ip oli e a i o. No obs an e, se án
necesa ios u u os ensayos en es a di ección pa a pode ahonda en es a hipó esis.
A con inuación, se p ocede á a compa a la e ec i idad de los dis in os de i ados de
pla a de acue do con los alo es de sus IC50 ecogidos en la Tabla 19. En el caso de los
complejos 7-11a con el ligando L1 (N- enil-N-(pi idin-2-il)isonico inamida), aquellos
de i ados coo dinados con un único ligando (complejos [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) y
[Ag2(T O)2(L1)(PPh3)2] (9a)) mues an un mayo e ec o an ip oli e a i o que sus
análogos coo dinados con dos ligandos (complejos 10a y 11a) sob e ambos modelos
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
254
umo ales. Los da os ob enidos pa ecen indica que la p esencia de es os dos ligandos
ipo 2-anilinopi idina pod ía di icul a la en ada en la célula o bien impedi una unión
e ec i a a la diana e apéu ica, lo que explica ía su meno e ec o an ip oli e a i o en
compa ación con sus análogos. De igual mane a, son en gene al más e ec i os los
complejos con dos cen os me álicos ([Ag2(T O)2(L1)(PPh3)2] (9a) y [Ag(T O)(L1)]2 (10a))
que aquellos que cuen an con un único á omo de pla a, sal o la ya mencionada
excepción de 10a en la línea MCF-7. A g andes asgos, es os de i ados pod ían
o dena se de acue do con su e ec o e apéu ico de la siguien e mane a: 9a > 8a > 10a >
11a. Los complejos con el ligando io eno L2 (N- enil-N-(pi idin-2-il) io eno-2-
ca boxamida) (7b-11b), sin emba go, mues an un compo amien o di e en e, pues o
que los de i ados coo dinados con dos ligandos L2 (complejos [Ag(T O)(L2)]2 (10b) y
[Ag(T O)(L2)2] (11b)) ienen un mayo e ec o an i umo al que los que solo cuen an con
un ligando. Conside ando que el ligando L2 posee un e ec o ci o óxico conside able po
sí solo, es os esul ados no debe ían se so p enden es, pues o que g an pa e de la
acción biológica de los de i ados pod ía se consecuencia di ec a de la p esencia del
ligando. En es e caso, además, las di e encias en e los de i ados mono o dinuclea es
son menos acusadas que en el caso de los complejos 7a-11a.
Pos e io men e, se ob u o una p ime a ap oximación ace ca de la oxicidad de los
de i ados de o o y pla a sob e ejidos sanos calculando el alo del IC50 as 72h de
exposición sob e la línea Caco-2 di e enciada, así como los alo es del índice de
selec i idad co espondien es (Tabla 21). Según puede obse a se, son a ios los
complejos con un índice de selec i idad supe io al del cispla ino y au ano in. Po el
con a io, los ligandos lib es mues an una selec i idad escasa, con alo es de SI en el
mismo ango que el de los dos con oles posi i os en la línea Caco-2 y en el ango del
au ano in en la línea MCF-7. Es os da os sugie en que, a pesa de que los ligandos
mues an un cie o e ec o an ip oli e a i o po sí solos, especialmen e sob e la línea
Caco-2 (Tabla 19), su uso como quimio e ápicos es a ía desca ado debido a su po encial
oxicidad sob e los ejidos sanos.
De en e los complejos que poseen índices de selec i idad supe io es a los de
cispla ino y au ano in, se escogió a aquellos que, además, des acasen po su po encial
an ip oli e a i o. Teniendo en cuen a, po lo an o, los da os de las Tablas 19 y 21 de
mane a conjun a, los de i ados más p ome edo es esul a on se los complejos
[Au(L1)(PPh3)](T O) (7a), [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a), [Ag(T O)(L2)]2 (10b) y Ag(T O)(L2)2]
(11b). No obs an e, se op ó po desca a a los dos de i ados con el ligando L2, pues o
que según se ha mencionado an e io men e, g an pa e de su e ec o biológico pod ía
es a mediado po el ligando, siendo la coo dinación al cen o me álico una o ma de
educi su oxicidad en ejidos sanos más que una es a egia pa a aumen a su acción
an i umo al. Po consiguien e, en u u os ensayos solamen e se oma án en
conside ación los complejos 7a y 8a. Dado que ambos complejos son mononuclea es y
poseen un único ligando de ipo 2-anilinopi idina, se ap o echó además pa a compa a
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
255
la e icacia del cen o me álico en dos complejos que po lo demás son análogos. Es deci ,
se compa ó el po encial an icance ígeno de un complejo de o o(I) con el de uno de
pla a(I).
Tabla 21. Es udio p elimina de la selec i idad de los complejos de o o y pla a median e el
cálculo del IC50 as 72h de exposición en células Caco-2 di e enciadas y la de e minación del
índice de selec i idad a pa i de los da os de IC50 en células umo ales.
Complejo IC50 (µM) en Caco-2
di e enciadas
Índice de selec i idad
Caco
-
2
MCF
-
7
L1
125,76
± 13,43
1,26
7,21
[Au(L1)(PPh
3
)](T O) (
7a
)
39,40
± 23,39
17,67
85,65
[Ag(T O)(L1)(PPh
3
)] (
8a
)
9,44
± 2,12
1,71
1,31
[Ag
2
(T O)
2
(L1)(PPh
3
)
2
] (
9a
)
10,88
± 2,82
43,52
2,65
[Ag(T O)(L1)]
2
(
10a
)
48,74
± 10,01
6,50
-
[Ag(T O)(L1)
2
]
(
11a
)
120,51
± 11,52
11,79
7,73
L2
124,29
± 7,50
2,56
9,96
[Au(L2)(PPh
3
)](T O) (
7b
)
13,53
± 0,02
3,61
3,83
[Ag(T O)(L2)(PPh
3
)] (
8b
)
10,23
± 4,02
1,44
1,52
[Ag
2
(T O)
2
(L2)(PPh
3
)
2
] (
9b
)
39,65
± 19,06
2,75
5,34
[Ag(T O)(L2)]
2
(
10b
)
55,40
± 1,43
41,97
20,91
[Ag(T O)(L2)
2
]
(
11b
)
80,26
± 26,90
19,02
89,18
Cispla in
o
151,13
±
58,12
3,31
3,61
Au ano in
6,21
±
0,44
3,45
8,06
Pues o que ya se ha p opues o a la io edoxina educ asa como po encial diana del
complejo de o o 7a, y exis en algunas e idencias de que los de i ados de pla a pod ían
in e acciona de mane a simila con es a enzima 25,41, se analizó la ac i idad de la T xR
de un cul i o de células Caco-2 as 24h de incubación con el complejo de pla a 8a. Al
no encon a se ningún e ec o sob e la unción de la enzima a ando el cul i o con una
can idad equi alen e al IC50 del complejo (5 μM), se duplicó es a can idad, ob eniéndose
en onces una educción signi ica i a (p<0,05) en la ac i idad enzimá ica (Figu a 76).
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
256
Figu a 76. E ec o de dos concen aciones de 8a (IC50: 5 μM y 2xIC50: 10 μM) sob e la enzima T x
de células Caco-2 as 24h de incubación. *p<0,05 s con ol nega i o.
Es os esul ados pa ecen suge i que el complejo [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) es capaz de
in e acciona con la T xR, si bien es necesa io aumen a la can idad del mismo en el
cul i o pa a obse a un e ec o signi ica i o. Es o pod ía suge i que la T xR no es la
diana p incipal del complejo, sino que se in e acciona con ella una ez que es a
hipo é ica diana p incipal queda sa u ada. Po an o, es os esul ados no in alida ían los
p e iamen e encon ados po o os au o es sob e enzimas ecombinan es, ya que en
e ec o pa ece exis i una cie a a acción en e los complejos de pla a(I) y la io edoxina
educ asa, aunque puede que no sea la diana molecula po la que sien en una mayo
a inidad, de modo que es posible que la T xR no sea la única diana de es a clase de
complejos.
Si bien los esul ados de Ci a e al.41 sugie en que los complejos de pla a pod ían se
inac i os en e a la enzima glu a ión educ asa (GR), Lee e al.42 obse a on que la
adminis ación de ni a o de pla a en la plan a acuá ica Lemna paucicos a a enía un
conside able e ec o inhibi o io sob e dicha enzima. Aunque debe íamos basa nos en los
esul ados de Ci a e al.41, ya que ue on ob enidos sob e un modelo umo al, no puede
se desca ada la exis encia de una cie a a inidad en e los complejos de pla a y la
enzima GR no i icada po Lee e al.42, lo que pod ía apun a a es a p o eína como una
po encial diana de 8a. Po lo an o, se decidió e alua la ac i idad de es a enzima en
células Caco-2 as 24h de incubación con los dos complejos de o o y pla a 7a y 8a
espec i amen e (Figu a 77). El complejo de o o 7a ue incluido en el es udio pa a
de e mina si se a aba de un inhibido especí ico de la T xR o si, po el con a io, se
a aba de un compues o mul i a ge .
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
257
Figu a 77. Análisis de la ac i idad GR de células Caco-2 as 24h de incubación con los complejos
de o o y pla a. A) E ec o de 7a (IC50). B) E ec o de 8a (IC50 y 2xIC50). *p<0,05 s con ol nega i o.
#p<0,05 s IC50.
De acue do con los da os de la Figu a 77A, el complejo [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a)
pa ece se un inhibido selec i o de la T xR, como es habi ual pa a los complejos de
o o(I) dada su al a a inidad po las selenop o eínas como la io edoxina educ asa43,44.
En es e caso, no se encuen a un aumen o de la ac i idad GR pa a compensa el bloqueo
de la io edoxina educ asa que sí se había obse ado en apa ados an e io es de la
p esen e memo ia ( e Capí ulo 3, pág. 212; Figu a 69B).
En cuan o al cul i o a ado con el complejo [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a), los esul ados
esul an so p enden es (Figu a 77B). Al incuba las células con una can idad equi alen e
al IC50 del de i ado de pla a, se obse a un eno me inc emen o de la ac i idad de la
enzima, que su e una educción al duplica la can idad de compues o a añadi ,
ecupe ándose unos alo es compa ables a los del con ol nega i o. Es e aumen o en la
ac i idad de la GR pod ía co esponde se con un mecanismo de la célula umo al pa a
e i a el e ec o an iapop ó ico de 8a, ya que la sob eexp esión de la GR se puede
co elaciona con la esis encia a la quimio e apia45. Po o a pa e, ambién puede
p oduci se un aumen o en los ni eles de ac i idad de la GR sin necesidad de que
aumen e su ni el de exp esión. Es os cambios son dependien es de los ni eles de ROS y
se c ee que son pa e de un mecanismo de ensi o de la célula en e a un exceso de
es és oxida i o, siendo su misión p incipal man ene cons an es los ni eles de glu a ión
educido pa a e i a la mue e celula 46. En cualquie caso, al aumen a la concen ación
de 8a iene luga una conside able pé dida en la ac i idad de la GR, has a al pun o que
no exis en di e encias signi ica i as espec o al con ol nega i o. Puede supone se que
el posible e ec o p o ec o se pe de ía, quizá debido al bloqueo de o as
mac omoléculas cla e pa a la célula umo al, po ejemplo la T xR (Figu a 76). En
cualquie caso, ninguna de las enzimas edox es udiadas has a el momen o pa ecen se
las dianas p incipales del de i ado de pla a(I) 8a.
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
258
A la is a de los esul ados ob enidos has a el momen o, se decidió analiza los ni eles
de ROS as 1h de incubación con ambos complejos; del complejo 8a se ensaya on las
dos concen aciones ya p obadas pa a medi las ac i idades enzimá icas. Tal y como
cabía espe a , se obse a un inc emen o signi ica i o (p<0,05) de los ni eles de ROS as
la incubación con el complejo de o o 7a, siendo es a la consecuencia del bloqueo de la
T xR (Figu a 78A). Po o a pa e, el a amien o con el IC50 del complejo de pla a 8a no
iene ningún e ec o sob e el equilib io edox, si bien al duplica la can idad a añadi sí se
ob iene un aumen o signi ica i o (p<0,05) espec o al con ol nega i o (Figu a 78B). De
nue o, es os esul ados se co elacionan con los p e iamen e ob enidos al analiza la
ac i idad T xR (Figu a 76), ya que cuando se añade al cul i o una can idad equi alen e
al IC50 de 8a no se obse an cambios en la unción de la enzima, no así al duplica la
concen ación. Po o o lado, se desca a que el aumen o en la ac i idad de la GR
obse ado al a a el cul i o con el IC50 del de i ado de pla a es é mo i ado po un
exceso de ROS, según se plan eaba an e io men e46.
Figu a 78. Medida de los ni eles de ROS en células Caco-2 as 1h de incubación con A) 7a (IC50)
o B) dos concen aciones de 8a (IC50 y 2xIC50). *p<0,05 s con ol nega i o.
T as desca a a es as dos enzimas edox como p incipales dianas e apéu icas del
complejo de pla a 8a, y obse a que el complejo de o o 7a pod ía ac ua como un
inhibido selec i o de la T xR, pasamos a in es iga el posible papel del p o easoma en
el e ec o an ip oli e a i o de ambos compues os. En el apa ado 1.5 se ha mencionado
la capacidad del au ano in de inhibi a las enzimas deubiqui inasas asociadas a la
subunidad 19S del p o easoma47, de o ma simila a lo desc i o po Chen e al.32 con una
se ie de nue os de i ados de pla a. Sin emba go, ambién se ha desc i o que exis en
de i ados de o o capaces de inhibi a la subunidad 20S del p o easoma31,48. Po an o,
se decidió analiza la ac i idad quimo ipsina del p o easoma, que se co esponde con
su capacidad p o eolí ica, as 24h de incubación con ambos complejos (Figu a 79).
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
259
Figu a 79. E ec o de 24h de incubación de los complejos 7a y 8a sob e la ac i idad quimo ipsina
(subunidad 20S) del p o easoma de células Caco-2. *p<0,05 s con ol nega i o.
De acue do con la Figu a 79, puede obse a se que el a amien o con el complejo
de o o 7a induce un descenso signi ica i o en la capacidad p o eolí ica del p o easoma,
lo que se co esponde con una inhibición de su unción no mal. Po consiguien e, es e
de i ado pa ece ac ua como un compues o mul i a ge capaz de inhibi an o a la T xR
como a la subunidad 20S del p o easoma. Po el con a io, al a a el cul i o con su
análogo de pla a no solo no se obse a un descenso en la ac i idad p o easa de es e
o gánulo, sino que incluso se ap ecia un aumen o signi ica i o (p<0,05) de la misma.
Es e inc emen o en la ac i idad del p o easoma pod ía causa a su ez el aumen o en la
ac i idad de la GR p e iamen e mos ado en la Figu a 77B, pues o que se ha ecogido
que la ac i idad p o easomal pod ía es a di ec amen e elacionada con el es a us edox
de la célula y causa un aumen o en los ni eles de exp esión de la glu a ión educ asa
en e o as enzimas an ioxidan es49. La Figu a 79 pe mi e, además, desca a que el
de i ado de pla a cause su e ec o an i umo al a a és del bloqueo de la subunidad 20S
del p o easoma. Es os esul ados conco da ían con los p e iamen e ob enidos po Chen
e al.32, según los cuales los complejos de pla a pa ecen sen i una mayo a inidad po
las deubiqui inasas asociadas al p o easoma que po la subunidad 20S. Po lo an o,
sigue sin ene se cla a la diana e apéu ica con la que in e acciona el complejo de pla a
pa a causa el descenso en la iabilidad celula obse ado.
A con inuación, se es udió la capacidad de ambos complejos de induci apop osis en
el cul i o de células Caco-2. Inicialmen e, el iempo de incubación se ijó en 24h, aunque
no se ob u o ningún esul ado ap eciable con el complejo de pla a 8a. Se pod ía habe
op ado po aumen a la concen ación a añadi , de o ma simila a como se había hecho
pa a medi la ac i idad T xR y GR, aunque en es e caso se p e i ió inc emen a el iempo
de incubación has a las 48h (Figu a 80). El mo i o as es a decisión ue, p ecisamen e,
los cambios obse ados al aumen a la concen ación del complejo en cuan o a su e ec o
sob e las enzimas edox. Aumen a la concen ación de un á maco pa a de e mina su
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
260
a inidad po una p o eína es una ap oximación compa able a ealiza un ensayo con
enzimas ecombinan es. Es deci , es una mane a de “ o za ” una in e acción pa a
ob ene no an o una idea del mecanismo de acción del complejo en conc e o que se
es á ensayando, sino de o os de i ados que compa an cie as ca ac e ís icas con él. En
es e sen ido, debe ene se en cuen a que la a inidad de los complejos de pla a po la
io edoxina puede se limi ada, pe o no se puede nega su exis encia. No obs an e, al
dobla la can idad de compues o que se añade al medio de cul i o pod ían ob ene se,
de igual mane a, esul ados “ o zados” al bloquea se enzimas y ías que no lo ha ían de
a a se el cul i o con el IC50 del compues o. Teniendo en cuen a que el ipo de mue e
celula puede se de e minan e a la ho a de escoge el umo que mejo esponda a un
a amien o conc e o (po ejemplo, un á maco capaz de induci nec op osis se ía
adecuado pa a un umo esis en e a la apop osis), nos pa eció a iesgada la posibilidad
de al e a es os esul ados. Po ello, se aumen ó el iempo de exposición, ya que en
casos an e io es es a es a egia había dado buenos esul ados ( e Capí ulo 3, pág. 217;
Figu a 72A).
Figu a 80. Es udio de las poblaciones apop ó icas y nec ó icas en un cul i o de células Caco-2
indi e enciadas as 48h de a amien o con A) DMSO (con ol nega i o); B) 7a (IC50); C) complejo
8a (IC50).
Los esul ados ob enidos mues an que ambos compues os inducen un aumen o de
la población apop ó ica as 48h de incubación. En el caso del complejo de o o 7a (Figu a
80B), se obse a un aumen o de 4,4 eces en el po cen aje de células en apop osis
emp ana, y de 7 eces en el de apop osis a día, mien as que el complejo de pla a 8a
(Figu a 80C) induce un aumen o de 7,7 eces en el po cen aje de células en apop osis
emp ana y de 3,6 eces en el de apop osis a día. Según se apun aba an e io men e, el
complejo de pla a pod ía a da más iempo que su homólogo de o o en induci la
mue e del cul i o celula , lo que pa ece co obo a el hecho de que 7a cause un
aumen o en la población de células en apop osis a días mien as que 8a hace lo p opio
en las que se encuen an oda ía en una ase emp ana de es a clase de mue e. Po
o a pa e, ninguno de los complejos indujo cambios signi ica i os en la población
nec ó ica. Po lo an o, los esul ados mos ados en la Figu a 80 sugie en que ambos
compues os inducen la mue e po apop osis as 48h de incubación. Pa a con i ma lo,
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
267
Figu a 84. Mecanismo de acción del complejo [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) sob e células Caco-2.
Po o a pa e, se ha compa ado el e ec o de sus i ui un á omo de o o po un á omo
de pla a en el cen o me álico de un po encial agen e an i umo al. En es e caso
conc e o, se ha ob enido un e ec o an ip oli e a i o mayo pa a el de i ado de o o que
pa a el de pla a en é minos de IC50, y además se ha obse ado que el p ime o posee
una mayo capacidad p o-apop ó ica que el segundo. Po lo an o, se ha concluido que
el de i ado de o o ensayado posee un mayo in e és como po encial quimio e apéu ico
que su análogo de pla a. Sin emba go, dados los esul ados ob enidos no puede nega se
el po encial de los de i ados de pla a como complejos an icance ígenos. A pesa de no
habe se iden i icado su diana o dianas e apéu icas, los esul ados p elimina es sugie en
que, al induci apop osis independien e de ROS, su impac o sob e los ejidos sanos
pod ía se bajo. Po lo an o, pa ece que es e complejo cumple el c i e io de selec i idad
que es equisi o imp escindible pa a los agen es quimio e apéu icos del u u o. De
acue do con la li e a u a cien í ica p e ia, la mi ocond ia y/o las deubiqui inasas
asociadas a la subunidad 19S del p o easoma pod ían se sus dianas e apéu icas más
p obables, aunque se án necesa ios u u os ensayos pa a pode con i ma lo.
Resul a in e esan e, además, el hecho de que los de i ados de o o(I) y pla a(I)
pod ían no compa i dianas e apéu icas, de acue do con los da os aquí mos ados.
Es o pod ía se de g an ele ancia en cuan o a que los complejos de pla a(I) pod ían se
u ilizados como quimio e apia de segunda elección en caso de que el umo desa ollase
esis encia a la e apia con o o(I), y ice e sa. Po o o lado, es e abajo pone de
mani ies o la necesidad de alida los esul ados ob enidos al ealiza ensayos de
ac i idad enzimá ica u ilizando p o eínas ecombinan es sob e modelos celula es,
pues o que pod ían ob ene se conclusiones poco ace adas. En es e sen ido, se ha
p opues o a la io edoxina educ asa como una posible diana e apéu ica de los
de i ados de pla a, y si bien nues os da os sugie en que, en e ec o, los complejos de
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
268
pla a(I) pueden llega a inhibi la acción de dicha enzima, es necesa io aumen a la
concen ación del mismo pa a pode obse a es e e ec o en un ensayo sob e un cul i o
celula . Po lo an o, se ía ecomendable epe i odo ensayo ealizado en un en o no
acelula sob e un modelo umo al an es de da los po álidos, lo que pone el oco sob e
la impo ancia de los equipos de in es igación mul idisciplina es pa a un adecuado
a ance de la in es igación biomédica.
CAPÍTULO 4: Complejos de o o(I) y pla a(I) con ligandos de i ados de 2-anilinopi idina
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275
276
283
CONCLUSIONS
284
CONCLUSIONS
285
On his Thesis, he an i umo al capaci y o se e al gold(I) de i a i es p e iously
syn he hized in Ino ganic Chemis y depa men o he Uni e si y o Za agoza has been
e alua ed owa ds Caco-2 cell line as a model o colo ec al cance . Acco ding o
p eclinical da a ob ained, he main goal p oposed a he beginning - which consis ed on
inding a sa e and mo e e icien al e na i e o cispla in- can be conside ed ul illed.
Upon concomi an analysis o IC50 alues and Selec i i y Index, ce ain complexes
highligh among all o hem, which a e [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), 3a-d se ies
([Au(L2a-d)PPh3]) coo dined o ligands de i ed om 3-hyd oxy la one uni s, specially
[Au(L2b)PPh3] (3b), [Au(L2c)PTA] (4c), which also con ains a molecule de i ed om 3-
hyd oxy la one, and [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) coo dina ed o a molecule de i ed om 2-
anilinopi idine, acco ding o bo h sa e y and e icacy pa ame e s. [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a)
migh be included in his ca ego y as well, gi en ha , al hough i s Selec i i y Index has
no been calcula ed, a model o gas oin es inal ba ie (di e en ia ed Caco-2 cells)
showed no changes in cell iabili y upon ea men wi h IC50 alue o his de i a i e
compa ed o nega i e con ol, which migh be indica i e o umo selec i i y as well as
clinical e icacy. Ne e heless, a se ies o no el gold(I) de i a i es ha migh display a
p omising clinical u u e has been iden i ied.
The choise o he app opia e ligands has an undeniable he on he he apeu ic e ec
o he esul an molecule. A clea example is ound on chap e 1 when compa ing he
bioac i i y o complexes [Au(C≡CPh)(PTA)] (1a) and [Au(C≡C-2-NC5H4)(PTA)] (2a), since
he addi ion o a single ni ogen a om on he alkynyl skele on esul s on di e ences
ega ding he a ini y owa d hio edoxin educ ase, as well as he ype o cell dea h
induced. The ex a ni ogen acili a es in e ac ion be ween molecules o [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)], hus he capaci y o in e ac ing wi h hio edoxin educ ase showed by
complex [Au(C≡CPh)(PTA)] is los . This ac is esponsible o he mechanism o acon
exe ed by complex 2a, since he o ma ion o such complexes agg ega es on
mi ochond ia leads o mi ochond ial ailu e and, as a consequence, o nec op o ic cell
dea h, whe eas complex 1a igge ed in insic apop osis as usual o gold(I) de i a i es,
a mechanism o ac ion ha sha es wi h au ano in among o he s.
Simila ly, he elec ion o 3-hyd oxy la one uni as ligand has shown o be an
in e es ing s a egy in o de o lead complexes o molecula a ge s by which gold(I)
de i a i es usually display ew o e en no a ac ion, such as cyclooxygenase enzyme,
as shown on chap e h ee. Two de i a i es ha e been iden i ied as cyclooxygenase
inhibi o s: [Au(L2b)PPh3] (3b) and [Au(L2c)PTA] (4c), which a e able o inhibi iso o mms
2 and 1 espec i ely. The molecule de i ed om 3-hyd oxy la one migh be esponsible
o he a ini y o [Au(L2c)PTA] (4c) o he edox enzyme glu a hione educ ase as well,
gi en ha gold complexes do no in e ac wi h his enzyme due o is lack o he
selenenocys eine aminoacid. On he o he hand, bo h complexes a e able o inhibi he
mos usual molecula a ge o gold de i a i es, he enzyme hio edoxin educ ase,
which sugges s ha he me allic cen e is as ele an as he ligands in ega ds o
CONCLUSIONS
286
mechanism o ac ion o he esul an complex. This capaci y o in e ac ing wi h mo e
han one biomolecule a once showed by hese complexes, u n hem in o mul i a ge
complexes, which mus be aken in o conside a ion o u u e s udies gi en he
ele ance o his kind o d ugs on chemo he apy. Las ly, i mus be ca e ully conside ed
ha , despi e bo h complexes a e able o igge apop osis, complex [Au(L2c)PTA] (4c)
showed a slowe p o-apop o ic e c han complex [Au(L2b)PPh3] (3b), p obably because
o an ac i a ion o cy op o ec i e au ophagy. In ligh o his, he combina ion o his
complex wi h an au ophagy inhibi o migh inc ease i s he apeu ic e ec .
The e o e, he choice o he ligand will s ongly in luence he an i umo e ec o he
complexes, hus becoming hemsel es mo e app opia e o he ea men o conc e e
sub ypes o cance . E.g. [Au(L2b)PPh3] (3b) migh be mo e use ul agains hose umo s
displaying an o e exp ession o cyclooxygenase-2, whe eas complex [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)] (2a) migh be o g ea in e es o he ea men o apop osis- esis an
cance . Consequen ly, c ea ing mul idisciplina y eams ha collabo a e close on each
s age o he p ojec s, om complex syn hesis o analysis o i s an i umo e ec , mus be
a p io i y on he de elopmen o no el chemo he apeu ic d ugs.
On he o he hand, he de elopmen o a no el d ug cock ail con aining [Au(C≡C-2-
NC5H4)(PTA)] (2a) and acidic polyphenols om he osehip o he wild plan Rosa canina
has p o ed ha , as well as was p e iously obse ed when combining cispla in and
se e al plan ex ac s, he he apeu ic e ec o gold(I) de i a i es migh be imp o ed
wi h he concomi an addi ion o plan ex ac s. The addi i e pha macological
in e ac ion be ween bo h agen s sugges s a way o inc ease he an ip oli e a i e e ec
o he me allod ug ins ead by inc easing i s concen a ion; wich migh be bene icial in
o de o educe side e ec s de i ed by d ug acummula ion. The plan ex ac does no
po en ia e he mechanism o ac ion o he me allod ug i sel , ins ead, he combina ion
blocks nec op osis igge ed by he gold de i a i e upon au ophagy ac i a ion in o de
o main ain cellula in eg i y. In adi ion, since mi ochond ia a e qui e damaged due o
ea men , lysosomes a e a ec ed as well and he au ophagic lux emains uncomple e,
hus igge ing apop osis cell dea h. Ne e heless, esul s ob ained so a a e en e elly
p eclinical, and assays on animal models mus be pe o med o alida e hem.
Despi e he p oposed hesis was ini ially ocused on he de elopmen o no el
chemo he apeu ic agen s o he ea men o colo ec al cance , some o he de i a i es
was es ed owa ds u he cance models. This analysis allowed us o s udy hei
selec i i y owa ds colo ec al cance . As an example, complex [Au(L2b)PPh3] (3b)
s udied on chap e 3, showed wice an ip oli e a i e e ec on Caco-2 cell line han on
an hepa oca cinoma model, and a 9- old inc ease on MCF-7 cell line (b eas
adenoca cinoma) compa ed o Caco-2 cell line, wich sugge s ha migh be selec i e
owa d a colo ec al cance sub ype whose molecula p o ile was close o he one o
Caco-2 cells. No only likely colo ec al cance -selec i e complexes ha e been iden i ied:
CONCLUSIONS
287
complex [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) displayed g ea an ip oli e a i e e ec owa ds wo
b eas cance models (MMCF-7 and MDA-MB-231 cell lines). These da a show up he
ele ance o e alua ing he e ec o he complexes owa d a panel o di e en cance
models despi e he main pu pose is inding a chemo he apeu ic agen agains a e y
speci ic cance ype, since unexpec ed bu in e es ing esul s migh be ob ained.
This ac is closely ela ed wi h he cu en idea o d ug epu posing, which pleads
wi h gi ing a second chance o d ugs as no el he apeu ic op ion o diseases o he han
he ones hey we e ini ially designed o . In his espec , on chap e 3 he an ibac e ial
po en ial o se ies 5a-d ([Au(L2a-d)(IMe)] and 6a-d ([Au(L2a-d)(IP )]) has been s udied
owa ds a panel o G am posi i e and G am nega i e bac e ia. Despi e ha hese
complexes we e ini ially syn he hized as chemo he apeu ic agen s, hei ela i ely low
an ip oli e a i e capaci y in compa ison o hei phosphine gold(I) homologues migh
ha e supposed hei de ini i e disca d as d ugs. Howe e , upon e alua ing hei
an ibac e ial e ec hey ha e ecei ed a second oppo uni y. Again, he choice o he
app opia e ligands is p o ed o be ele an , so ha he p esence o phosphines (se ies
3a-d and 4a-d) leads o a high cy o oxici y owa d he e alua ed cance cell models,
whe eas he eplacemen o phosphines by ca benes esul s on a educ ion in his
cy o oxici y in bene i o hei an ibac e ial p ope ies. I is o g ea in e es he capaci y
o complex [Au(L2b)(IMe)] (5b) o inhibi no only G am posi i e bac e ia g owing, which
is common o gold(I) de i a i es, bu also G am nega i e. This inding sugges s i migh
inhibi he usual molecula a ge o an ibac e ial gold(I) complexes, edox enzyme
hio edoxin educ ase, and also display ce ain a ini y o o he bac e ial p o eins.
Fu he s udies will be needed in o de o ully cha ac e ize he an ibac e ial e ec o
complex [Au(L2b)(IMe)] (5b).
In he las chap e , he eplacemen o gold(I) by sil e (I) has been analyzed in e ms
o he an i umo p ope ies. Acco ding o he ob ained da a, he gold complex
[Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) displays a 2.5- old inc ease in IC50 compa ed o sil e (I)
coun e pa [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a); besides, he gold(I) de i a i e displays a 10- old
inc ease in Selec i i y Index, which is o g ea ele ance. Taken oge he , hese esul s
sugges ha , in his speci ic case, he gold complex [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) migh be a
mo e adequa e he apeu ic op ion han [Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) o he managemen o
colo ec al cance . On he o he side, bo h complexes do no sha e molecula a ge s,
since complex [Au(L1)(PPh3)](T O) (7a) igge s ROS-dependen apop osis media ed by
inhibi ion o hio edoxin educ ase and 20S p o easome, whe eas complex
[Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) induces ROS-independen apop osis; molecula a ge s o his
de i a i e ha e no been ye iden i ied, al hough he ob ained da a sugges ha
mi ochond ia dis up ion migh be in ol ed. This migh be indica i e o a lack o c oss-
esis ance be ween bo h gold(I) and sil e (I) complexes, which sugges s
[Ag(T O)(L1)(PPh3)] (8a) could be used as back-up ea men o he managemen o
umo esis an o gold-con aining d ugs. Finally, he ac i a ion o ex insic apop osis
CONCLUSIONS
288
pa hway igge ed by gold(I) de i a i es has been men ioned in his chap e . The
capaci y o his ype o chemo he apeu ic agen s o igge ing ex insic apop osis has
been poo ly s udied ye , and migh be an in e es ing knowledge ield o explo e in a nea
u u e. Simila ly, he sil e de i a i e showed he capaci y o ac i a ing caspase 8, which
sugges s i migh igge ex insic apop osis as well.
In summa y, gold(I) complexes migh be a s ong al e na i e o he cu en pla inum-
based d ugs o colo ec al cance ea men . This doc o al hesis p o es ha he e a e
s ill nume ous unknowns o sol e ega ding o he an i umo p ope ies o hese
molecules, gi en ha i has been iden i ied molecula a ge s ha ha e no been
conside ed ye , and also al e na i e cell dea h pa hways ha e been obse ed in
esponse o ea men s. Resea ch on his knowledge ield mus pu sue, ans e ing
hese p eclinical s udies o 3D and/o animal models in o de o ad ance in he sea ch
o a no el e ec i e and selec i e d ug o eplace he cu en he apeu ic s a egies.
CONCLUSIONS
289