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PREPARACION Y CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE HIDROGELES DE QUITOSANO PARA SOPORTE DE CÉLULAS DE CARTÍLAGO PROYECTO DE FIN DE CARRERA Especialidad: Química Industrial Autor: Javier Abadía Piquero Tutores: Dr. Fernando Navarro Gómez Dr. Ignacio Ochoa Garrido Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 2 Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 3 Índice 1.-Introducción y Objetivos...........……….……………………………………………6 Antecedentes 2.- Métodos de obtención de quitina y quitosano……………………………………..8 2.1.- Obtención de quitina…………………………….………………………….8 2.1.1.- Acondicionamiento de la materia prima……………………..10 2.1.2.- Desproteinización………...………………………………….10 2.1.3.- Desmineralización………..………………………………….10 2.1.4.- Decoloración……………..…………………………………..10 2.2.- Obtención de quitosano…………….…………………………………….11 2.2.1.- Obtención de quitosano de langosta común…….……….…..11 3.- Caracterización del quitosano y quitina….……….…………………………...…13 3.1.- Determinar el grado de acetilación\desacetilación………..…………...13 4.- Propiedades del quitosano………….…………………………………………..…14 4.1.- Grado de acetilación ………….…………………………………….…14 4.2.- Peso molecular y viscosidad……….……………………………...……14 4.3.- Solubilidad……………………………………………………..……….15 4.4.- Biodegradabilidad……………………………………………...……….15 5.- Aplicaciones del quitosano……………...…………………………………...…….16 5.1.- Aplicaciones biomédicas……………………………………………….16 Parte experimental 6.- Proceso de obtención de hidrogeles de quitosano………..………………………17 6.1.- Introducción…………………………………………………………...17 6.2.- Preparación de las disoluciones de quitosano…………………….…...18 6.3.- Neutralización de la disoluciones de quitosano…………..…………...21 Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 4 6.3.1.- Neutralización con NaOH acuoso………….………………..22 6.3.2.- Neutralización con NH 3 gaseoso…………….………………23 6.3.3.- Neutralización con glicerofosfato disódico….………………24 6.4.- Endurecimiento……………………………………………………..…...27 6.5.- Lavado…………...………………………………………………………28 6.6.- Esterilización…………………………………………………………….30 6.7.- Materiales………………………………………………………………..30 7.- Proceso de caracterización de los hidrogeles de quitosano obtenidos……….…31 7.1.- Introducción…………..…………………………………………………31 7.2.- Descripción de los experimentos mecánicos…………..………………..32 7.3.- Tratamiento de datos mecánicos…………………..…………………….34 7.4.- Discusión de los resultados de los ensayos mecánicos…...…………..…40 8.- Ensayo de cultivo celular en los hidrogeles de quitosano obtenidos……………45 8.1.- Introducción………………..……………………………………………45 8.2.- Preparación de los hidrogeles para el cultivo de células………..………45 10.- Conclusiones………………………………………………..……………….…....47 11.- Bibliografía………………………………..…………………………………..….49 Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 5 Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 6 1.- INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La quitina se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, tanto en el reino animal como en el vegetal. De hecho es el segundo polímero natural más abundante, sólo superado por la celulosa, por lo que constituye un importante recurso renovable. Se argumenta que la quitina natural posee un grado de acetilación, DA, de 0,66, es decir, que una de cada tres de sus unidades se encuentran desacetiladas. Queda definido así el DA como la fracción del total de unidades glucosídicas que están acetiladas. A veces la composición se reporta en términos del grado de desacetilación, DD (DD = 1 – DA). En ocasiones estos valores se dan en tanto por ciento. Figura 1.2 Representación esquemática de las cadenas de (a) celulosa; (b) quitina totalmente acetilada y (c) quitosano totalmente desacetilada. La similitud estructural entre ellas resulta evidente . El quitosano es un polisacárido lineal que se obtiene por desacetilación extensiva de la quitina y está compuesto por dos tipos de unidades estructurales (N-acetil-D- glucosamina y la D-glucosamina) distribuidas de manera aleatoria a lo largo de la cadena. Estas unidades se encuentran unidas entre sí por enlaces del tipo β(1→4) glicosídicos. En la Figura 1.2 se muestra la estructura de una quitosano totalmente desacetilada. Sin embargo, resulta muy difícil desacetilar totalmente la quitina, y lo que usualmente se conoce como quitosano es una familia de quitinas con diferente grado de desacetilación, generalmente superior a 0,45. En este proyecto se estudia los distintos métodos de gelificación de hidrogeles de quitosano para adaptarlos como soporte de células en aspectos relacionados con la ingeniería de tejidos del cartílago. Deben ser estables a corto plazo pero biodegradables a largo plazo en un medio fisiológico. Además, deben ser fácilmente manipulables y presentar ciertas características físicas en el medio fisiológico que permitan o favorezcan la aplicación de estos en la ingeniería de tejidos, con la particularidad de que sus hidrogeles son un buen sustrato alimenticio y son consumidos rápidamente durante el desarrollo de las células cultivadas. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 7 En la formación del hidrogel de quitosano se estudian distintas fases: disolución de quitosano en un medio ácido, neutralización con distintos agentes básicos (Amoniaco, NaOH y glicerofosfato), lavado para alcanzar pH neutro (condición para el cultivo) y endurecimiento tanto térmico como químico. Todo ello en condiciones para obtener geles estériles. El quitosano utilizado en este PFC se encuentra en estado sólido por lo tanto se debe disolver para poder gelificarlo después. Se utilizaron dos ácidos: uno fuerte (HCl) y otro débil (acido acético), como era de esperar la disolución fue más rápida en el caso del HCl. En ambos casos se calentó suavemente durante un tiempo corto para facilitar su disolución. Se pudo constatar visualmente que la degradación de las cadenas de quitosano es más acentuada en el caso de la disolución con HCl. La neutralización en el caso de NH 3 y NaOH fue a temperatura ambiente, en estos casos la gelificación fue en el momento de neutralizar y luego se lavó para obtener los geles a pH neutro. En cambio la neutralización con glicerofosfato no produjo su gelificación ya que debía ser calentado para que gelificara. Según varios artículos [1] la temperatura de gelificación es 37-39ºC aunque se puede observar que en este proyecto la temperatura de gelificación no era menor de 70 ºC, esto es debido a que nuestro quitosano tenía un grado de desacetilación entre 75%-85%, y en la bibliografía utilizaba quitosano de grado de desacetilación del 95%. Para ajustar el pH neutro de los geles neutralizados con glicerofosfato se utilizo un pHmetro y un baño de hielo para impedir que gelificara. Al formar tampón el glicerofosfato (es una base débil) en la disolución, el trabajo de ajustar el pH era lento y pesado. El lavado sólo se llevó a cabo con los geles neutralizados con amoniaco y sosa caústica, Los geles formados tenían un pH básico, se conseguía alcanzar el pH neutro cambiando el agua destilada de lavado cada vez que se saturaba. Esto se comprobaba con un papel tornasol y cuando alcanzaba un pH muy básico (12-14) se volvía a cambiar el agua de lavado. El endurecimiento surgió debido a la necesidad de obtener geles con mayor resistencia mecánica (rigidez), se estudio dos métodos: uno térmico y otro químico. El tratamiento térmico consistió en introducir el gel ya neutralizado en un baño con agua destilada a 100ºC durante 1 o 2 horas, sin conseguir aumentar significativamente sus propiedades mecánicas. El tratamiento químico se llevó a cabo en un baño de sosa al 20% durante 30 minutos a 1 hora. Este tratamiento resultó efectivo para endurecer considerablemente su rigidez como se muestra en el desarrollo del proyecto. La esterilización se consiguió lavando los geles en condiciones estériles, ya que antes al tener un pH tan básico, no permitía que se desarrollara cualquier contaminante biológico (gérmenes, suciedad...). Una vez disueltos, neutralizados, lavados y endurecidos (en los casos que se endureció) los geles estaban preparados para caracterizarlos por medio de un ensayo de compresión en una maquina Instron. Para ello de cada gel formado se obtuvo como mínimo 6 muestras, de las que se calculó el promedio con su error típico y desviación estándar de los módulos de tensión. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 8 Con los resultados obtenidos de la máquina Instron se determinaba el modulo inicial además de otros datos relevantes por medio de un tratamiento matemático. En nuestro PFC el valor buscado de módulo inicial era de 0,4 Mega pascales, a lo largo del proyecto se determinó que daban un valor inferior al requerido, incluso cuando se endurecía por medios térmicos (calentando a 100ºC durante 1-2 horas) o químicos (baño de NaOH al 20% durante 1 hora). Por último se hizo un experimento tentativo de cultivo de células en el que se depositaron para estudiar su desarrollo. El resultado fue que se desarrollaron menos del 10% de las células depositadas, aunque el pH fuese neutro. OBJETIVOS El objetivo de este PFC es estudiar los procesos de gelificación de los hidrogeles de quitosano y su aplicación en la ingeniería de tejidos. Para que puedan aplicarse deben cumplir una serie de requisitos como de un pH =7 y una resistencia a la tensión (rigidez) de 400 kilo pascales (0,4 Mega pascales) en el modulo inicial. Estos hidrogeles biocompatibles, deberán de ser estables a corto plazo pero biodegradables a largo plazo en un medio fisiológico. Estudiamos distintas concentraciones de quitosano y diferentes neutralizantes, en un esfuerzo para encontrar las condiciones más idóneas en la preparación de hidrogeles. Además se intenta conocer cómo afecta a su caracterización mecánica, consistencia y degradación, así como el efecto del almacenamiento. En definitiva un principio de estudio para la futura aplicación del quitosano en la ingeniería de cartílago. ANTECEDENTES 2.- MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE QUITINA Y QUITOSANO 2.1.- OBTENCIÓN DE QUITINA La quitina comercial se extrae a partir de desechos de crustáceos de la industria pesquera, siendo las principales fuentes los caparazones de cangrejo, camarón, langostino y langosta. Las técnicas de extracción reportadas son muy variadas, pues dependen en gran medida de las características de la fuente, ya que como se aprecia en la Tabla 1.1, la composición del material de partida varía notablemente de una especie a otra. La mayor parte de las técnicas desarrolladas descansan en procesos químicos de hidrólisis de la proteína y la remoción de la materia inorgánica. Algunos incluyen un paso de decoloración de la quitina extraída, mediante una extracción con solvente o la Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 9 oxidación de los pigmentos remanentes. Estos métodos utilizan generalmente grandes cantidades de agua y energía, y con frecuencia dan lugar a desechos corrosivos. En la actualidad se investigan tratamientos enzimáticos como una alternativa prometedora. A tal efecto se han reportado procesos que utilizan extractos enzimáticos o enzimas aisladas y fermentaciones microbiológicas, pero aún sin la eficiencia de los métodos químicos, fundamentalmente en lo que respecta a la eliminación del material inorgánico [4]. Tabla 1.1 Composición química de algunas fuentes de materia prima para la obtención de quitina/quitosano [2]. [3] En general los procesos de obtención de quitina se realizan mediante los siguientes pasos consecutivos: acondicionamiento de la materia prima, extracción de la proteína (desproteinización), eliminación de las impurezas inorgánicas (desmineralización), y decoloración de la quitina obtenida. A continuación se brindará una breve información sobre cada uno de estos procesos. Una descripción más detallada de los procesos de obtención de quitina y de quitosano se puede encontrar en la bibliografía [5-7]. Foto 1.1.- Fases en la obtención de quitina y quitosano. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 16 5.- APLICACIONES DEL QUITOSANO Por sus naturalezas catiónica en soluciones ácidas, que le confiere propiedades únicas relativas a otros polisacáridos, la industria del quitosano y algunos de sus derivados se han estimulado internacionalmente, encontrándose un amplio universo de aplicaciones. 5.1.- APLICACIONES BIOMÉDICAS. Este biomaterial ha sido ensayado para múltiples aplicaciones biomédicas, facilitando el proceso de cicatrización en heridas, lesiones por quemaduras y la recuperación de lesiones cutáneas crónicas; sus efectos han sido asociados con la activación de macrófagos, estimulación de fibroblastos activación mitogénica y facilitación de adhesión intercelular. Es esta aplicación la que se va a desarrollar en este proyecto. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 17 PARTE EXPERIMENTAL 6.- PROCESO DE OBTENCION DE HIDROGELES DE QUITOSANO 6.1.- INTRODUCCIÓN. En este proyecto se pretende obtener hidrogeles de quitosano aptos para ser empleados como soporte de células en aspectos relacionados con la ingeniería de tejidos del cartílago. Estos hidrogeles biocompatibles, deberán de ser estables a corto plazo pero biodegradables a largo plazo en un medio fisiológico. Por este motivo empleamos quitosano como matriz polimérica de los hidrogeles. Además, deben ser fácilmente manipulables y presentar ciertas características físicas en el medio fisiológico que permitan o favorezcan la aplicación de estos en la ingeniería de tejidos. Obviamente, existen varias matrices poliméricas muy comunes, que presentan todas estas características, como por ejemplo, colágeno o agarosa. Sin embargo, a diferencia del quitosano, sus hidrogeles son un buen sustrato alimenticio y son consumidos rápidamente durante el desarrollo de las células cultivadas. Durante el desarrollo de este proyecto fin de carrera (PFC) estudiaremos distintas concentraciones de quitosano y diferentes procesos de gelificación, en un esfuerzo por optimizar las condiciones para la preparación de dichos hidrogeles. Por consiguiente, estudiamos distintas concentraciones de quitosano y diferentes procesos de gelificación, en un esfuerzo por encontrar las condiciones más idóneas para la preparación de dichos hidrogeles. El proceso utilizado en el PFC para la obtención de este tipo de hidrogeles, consiste en neutralizar disoluciones acuosas ácidas de quitosano de diferentes concentraciones. Esta neutralización produce la gelificación de estas disoluciones acuosas, pues el quitosano no es soluble en agua a pHs neutros o básicos. Por consiguiente, en este PFC se estudian principalmente: 1º.- el efecto de diferentes concentraciones de quitosano y 2º.- el efecto de distintos agentes neutralizantes en la preparación de hidrogeles con unas características que permitan aplicaciones futuras en aspectos relacionados con la ingeniería de tejidos del cartílago. Para optimizar el rango de concentraciones de quitosano que conduce a la obtención de los hidrogeles más adecuados se procedió de la siguiente manera: En primer lugar se emplearon concentraciones de quitosano muy diferentes (1, 2, 3, 4 y 5%) para establecer un rango de concentraciones más estrecho (1 – 2%) que después se estudio más detenidamente, empleando concentraciones más similares (1, 1.25, 1.50, 1.75 y 2%) hasta encontrar un estrecho rango óptimo para la obtención de hidrogeles con las características deseadas. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 18 Cada una de las disoluciones de diferente concentración de quitosano fue neutralizada con tres agentes neutralizantes distintos, para determinar no solo un estrecho rango de concentraciones óptimo sino también el agente neutralizante más adecuado. Según el agente neutralizante empleado, la formación del hidrogel se produce bien a temperatura ambiente o a temperaturas más elevadas. Para la obtención de hidrogeles a temperatura ambiente empleamos como agentes neutralizantes: 1.- disoluciones de NaOH 0.1 – 1 M que producen la rápida gelificación de las disoluciones de quitosano a pHs > 7. 2.- amoniaco gaseoso en muy bajas concentraciones que produce una gelificación mucho más lenta pero también más homogénea que en el caso anterior 1. Los subproductos de estas dos neutralizaciones 1 y 2, exceso de NaOH y NH 4 OH y pequeñas cantidades de NaCl y NH 4 Cl, respectivamente, se eliminan eficazmente en el proceso de lavado de los hidrogeles. Cuando se utiliza glicerofosfato disódico como agente neutralizante, la formación del hidrogel no se produce a temperatura ambiente al alcanzar pH neutro o fisiológico, sino que es necesario calentar la disolución acuosa neutralizada para que se produzca su gelificación. Un ejemplo ideal, sería conseguir disoluciones neutralizadas que gelificasen simplemente al calentarlas hasta la temperatura corporal humana de 37ºC. Afortunadamente, los subproductos de la neutralización, principalmente cantidades apreciables de ácido glicerofosfórico, no alteran significativamente el medio fisiológico y por tanto no afectan al cultivo de células, ya que los hidrogeles obtenidos con glicerofosfato no se someten a ningún proceso de lavado o purificación. 6.2.- PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES DE QUITOSANO. El quitosano es el derivado principal de la quitina, que puede ser obtenido mediante un proceso químico sencillo de desacetilación. Bajo este término se agrupa una familia de co-polímeros que se diferencian principalmente en el grado de desacetilación y en el peso molecular. En este PFC emplearemos siempre quitosanos de pesos moleculares medios y con grados de desacetilación > 75%. La quitina está compuesto por amino azúcares unidos entre sí por enlaces glicosídicos β(1→4) formando una cadena lineal de unidades de N-acetil-2-amino-2-desoxi-D- glucosa algunas de las cuales se encuentran desacetiladas El quitosano es un polisacárido lineal que se obtiene por desacetilación extensiva de la quitina y está compuesto por dos tipos de unidades estructurales distribuidas de manera aleatoria a lo largo de la cadena, la N-acetil-D-glucosamina y la D-glucosamina, las cuales se encuentran unidas entre sí por enlaces del tipo β(1→4) glicosídicos. Universidad de Zaragoza La desacetilación de la quitina para producir quitosano se produce medi del enlace amida de sus grupos acetamido. El quitosano no es soluble en agua a pHs neutros o básicos pHs ácidos, debido a que sus grupos amino ( correspondientes (–NH 3+ ). soluble en ácidos acuosos diluidos, tales como acético o ácido clorhídrico dilui Normalmente, en este PFC , 0.5% o en ácido clorhídrico 0.1M. ácido pues durante la realización de este PFC pudimos comprobar experimentalmente que producen una degradación significativa de las cadenas de quitosano (disminución de su peso molecular). A pesar de utiliz ar en este PFC quitosanos de pesos moleculares medios, las disoluciones obtenidas presentan viscosidades elevadas, siendo particularmente altas a partir de concentraciones > 2%. temperaturas moderadas 40ºC obtener disoluciones que se conservan totalmente homogéneas durante varias horas a 5ºC (tiempos o temperaturas de conservación más elevadas producen disminuciones significativas del peso molecular 5%) la agitación magnética puede resultar imposible (60-80ºC), por lo que en estos casos empleamos agitación mecánica. viscosidades tan elevadas, la preparaci puede resultar tediosa y no Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 La desacetilación de la quitina para producir quitosano se produce medi del enlace amida de sus grupos acetamido. es soluble en agua a pHs neutros o básicos , pero sí que se disuelve a debido a que sus grupos amino ( –NH 2 ) forman las sales de amonio A concentraciones moderadas (< 6%), resulta fácilmente soluble en ácidos acuosos diluidos, tales como acético o ácido clorhídrico dilui , disolvemos el quitosano (1 - 5%) en ácido acético 0.5% o en ácido clorhídrico 0.1M. Es importante evitar concentraciones mayores de ácido pues durante la realización de este PFC pudimos comprobar experimentalmente que producen una degradación significativa de las cadenas de quitosano (disminución ar en este PFC quitosanos de pesos moleculares medios, las disoluciones obtenidas presentan viscosidades elevadas, siendo particularmente altas a partir de concentraciones > 2%. Para concentraciones de quitosano de hasta el 3% temperaturas moderadas 40ºC - 60ºC , la agitación magnética resulta eficaz obtener disoluciones que se conservan totalmente homogéneas durante varias horas a (tiempos o temperaturas de conservación más elevadas producen disminuciones significativas del peso molecular del quitosano). Para las mayores concentraciones la agitación magnética puede resultar imposible , incluso a temperaturas elevadas por lo que en estos casos empleamos agitación mecánica. viscosidades tan elevadas, la preparaci ón de las disoluciones más concentradas (5%) puede resultar tediosa y no sueñen resultar completamente homogéneas. Septiembre 2010 19 La desacetilación de la quitina para producir quitosano se produce medi ante la hidrólisis que se disuelve a forman las sales de amonio moderadas (< 6%), resulta fácilmente soluble en ácidos acuosos diluidos, tales como acético o ácido clorhídrico dilui dos. en ácido acético acuoso al Es importante evitar concentraciones mayores de ácido pues durante la realización de este PFC pudimos comprobar experimentalmente que producen una degradación significativa de las cadenas de quitosano (disminución ar en este PFC quitosanos de pesos moleculares medios, las disoluciones obtenidas presentan viscosidades elevadas, siendo particularmente altas a Para concentraciones de quitosano de hasta el 3% a , la agitación magnética resulta eficaz permitiendo obtener disoluciones que se conservan totalmente homogéneas durante varias horas a (tiempos o temperaturas de conservación más elevadas producen disminuciones concentraciones (4- incluso a temperaturas elevadas por lo que en estos casos empleamos agitación mecánica. Debido a las ón de las disoluciones más concentradas (5%) completamente homogéneas. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 20 La siguiente fotografía muestra disoluciones recién preparadas de quitosano (de peso molecular medio) al 1% en ácido acético del 0.5% y en ácido clorhídrico 0.1M, obtenidas con agitación magnética a 40ºC -60ºC y después enfriadas a temperatura ambiente 25ºC. Para acelerar el proceso de disolución del quitosano en ácido acético 0.5% o en ácido clorhídrico 0.1 M, empleamos temperaturas moderadas 40ºC - 60ºC para obtener disoluciones totalmente homogéneas en tiempos cortos de 5 – 15 minutos. En estas condiciones, las cadenas de quitosano no se degradan apreciablemente, incluso si estas disoluciones se guardan varias horas en frigorífico a 5ºC (< 24h). Condiciones más drásticas de disolución (tiempos o temperaturas mayores o concentraciones de acido más elevadas) o el almacenamiento prolongado de las disoluciones, conducen a la degradación de las cadenas quitosano. La disminución de su peso molecular en estas condiciones resulta muy evidente, debido a que la disminución de la viscosidad de las disoluciones se aprecia fácilmente a simple vista. Como puede observarse en la siguiente fotografía de cuatro disoluciones de quitosano del 1% al 1.75% en ácido clorhídrico 0.1 M a 25ºC, las disoluciones preparadas en estas condiciones moderadas, resultan incoloras y totalmente transparentes y homogéneas, hasta concentraciones de quitosano del 2%. A concentraciones > 2%, su opacidad y viscosidad aumentan con la concentración, llegando a presentar un aspecto similar a un gel opaco-lechoso, tal y como puede observarse en la siguiente fotografía de una disolución de quitosano al 4% en ácido clorhídrico 0.1M a 25ºC. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 21 En esta misma fotografía puede observarse claramente, que la disolución presenta coloración marrón claro. Esto es debido a que el quitosano comercial lo empleamos tal y como se recibe sin ser sometido a ningún proceso de purificación. La purificación de quitosano puede resultar muy tediosa si el laboratorio no dispone de técnicas especiales como liofilización. Las disoluciones de quitosano de concentraciones muy distintas presentan diferencias muy notables a simple vista. En particular, las concentraciones extremas presentan un aspecto poco idóneo para la obtención de hidrogeles con las características requeridas, bien por su baja viscosidad y excesiva dilución (concentraciones < 1%) o su elevada viscosidad y falta de homogeneidad (concentraciones > 2-3%). De hecho, las de < 1% no gelifican o producen geles muy débiles que pierden fácilmente su cohesión resultando imposibles de manipular. Mientras que las de > 2-3% generan hidrogeles que mecánicamente se parecen a elastómeros resistentes, similares a gomas de caucho (como el caucho de una tetina de cuentagotas) Por el contrario, en las disoluciones de quitosano de concentraciones parecidas (entre el 1 y el 2%) aunque pueden apreciarse diferencias de viscosidad, resultan muy similares y prácticamente todas generan hidrogeles casi idóneos, con cualquiera de los tres agentes neutralizantes empleados en este PFC. 6.3.-NEUTRALIZACIÓN DE LAS DISOLUCIONES DE QUITOSANO. La neutralización de las disoluciones ácidas de quitosano se realiza con tres bases o agentes neutralizantes acuosos, dos bases fuertes: NaOH y NH 4 OH (realmente se emplea amoniaco gas que al disolverse en la disolución acuosa genera NH 4 OH) y una sal básica, glicerofosfato disódico. Las dos primeras bases se emplean en exceso, por lo que el hidrogel obtenido es fuertemente básico y debe de someterse a un proceso de lavado hasta que alcanza pH 7. En el caso del glicerofosfato, la sal básica se añade hasta conseguir que la disolución de quitosano presente pH 7. En este caso, la gelificación se Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 22 produce al elevar la temperatura de la disolución neutralizada y el hidrogel obtenido se emplea como tal, sin proceso de lavado. Con NaOH y NH 3 , la neutralización se realiza a temperatura ambiente y en reposo absoluto. Sin agitación, la velocidad de neutralización viene determinada principalmente, por la velocidad de difusión de la base en la disolución de quitosano. A medida que las capas exteriores de la disolución de quitosano se neutralizan se produce su gelificación. La difusión de los iones básicos a través del hidrogel resulta más lenta que en la disolución acuosa. . Por consiguiente, la neutralización y gelificación de las capas internas de la disolución de quitosano podría producirse más lentamente que la gelificación de las capas externas. Sin embargo, hemos podido constatar experimentalmente que ocurre justamente lo contrario, tal y como se explica más adelante. La lentitud del proceso resulta particularmente patente, cuando se emplea NH 3 . Esto es debido, a que antes del lento proceso de difusión en la disolución y gel de quitosano, las moléculas de NH 3 deben de difundir desde la fase gaseosa a la disolución acuosa a través de la interfase. El proceso resulta muy lento, ya que se emplean como fuente de NH 3 pequeñas cantidades (50 - 100 mL) de disoluciones de NH 4 OH muy diluidas 0.1 – 1 M. En el caso del glicerofosfato, la neutralización se lleva a cabo con agitación vigorosa, resultando relativamente rápida a bajas temperaturas (10ºC), ya que temperaturas más elevadas favorecen la gelificación. 6.3.1.- Neutralización con NaOH acuoso. La neutralización con NaOH es evidente e inmediata, pero únicamente permite obtener hidrogeles homogéneos de pequeño tamaño. Por ejemplo, es muy conveniente para gelificar pequeñas gotas o hilos de disolución de quitosano. Normalmente, se realiza a temperatura ambiente utilizando disoluciones de NaOH 0.1 - 1M. La neutralización se realiza poniendo cuidadosamente en contacto la disolución de quitosano con la de NaOH. Como la densidad de ambas disoluciones es similar, estas tienden a mezclarse desordenadamente, produciendo hidrogeles poco uniformes y de geometrías no deseadas. Únicamente, cuando se emplean pequeños volúmenes de disolución de quitosano como gotas, lentejas o hilos, la gelificación se produce uniformemente, conservándose la geometría. Como el espesor de estos objetos es pequeño, la gelificación es uniforme e inmediata y la eliminación del exceso de NaOH de estos pequeños geles se produce también rápidamente. En nuestro caso, introducimos la disolución de quitosano en los pequeños pocillos de unos 2-3 cm de diámetro de una placa petri de poliestireno (PS) y sumergimos esta placa lenta y cuidadosamente en la disolución de NaOH (100mL). En algunas ocasiones la disolución de quitosano queda adherida al PS permaneciendo sumergida sin perder la forma. En estas raras ocasiones la gelificación se produce uniformemente para obtener geles cilíndricos de 2-3 cm de diámetro y unos 0.5 cm de espesor. Pero generalmente, en la mayor parte de los casos la disolución de quitosano tiende mezclarse con la de Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 23 NaOH produciendo geles poco homogéneos y uniformes, difíciles de manipular sin que se rompan en fragmentos poco útiles para su caracterización. La siguiente figura muestra la gelificación de una disolución de quitosano al 1% en HCl 0.1M contenida en los pocillos de una placa petri de PS sumergida en una disolución de NaOH 1M a 25ºC. Puede observarse que la mayor parte de los geles son muy poco cilíndricos y uniformes. Únicamente, el de la esquina inferior derecha resultó suficientemente homogéneo, uniforme y manipulable como para permitir su estudio y caracterización. 6.3.2.- Neutralización con NH 3 gaseoso. Aunque muy lenta, la neutralización con gas amoniaco resulta muy conveniente y práctica, pues es sencilla y permite obtener fácilmente hidrogeles homogéneos y resistentes con cualquier forma geométrica. Se realiza colocando en un desecador cerrado a 25ºC dos vasos separados conteniendo; el uno la disolución de quitosano y el otro 50 - 100 mL de NH 4 OH 0.1 - 1 M. Cuanto menor es la concentración de NH 4 OH más lenta es la neutralización, pero más homogéneo resulta el hidrogel obtenido. Sin embargo, la gelificación/ neutralización con NH 4 OH 0.1M resulta tan lenta que no parece muy práctica. Generalmente, la más empleada en este PFC, es la que emplea NH 4 OH 1M. El proceso de neutralización parece controlado por la velocidad de disolución del amoniaco en la disolución de quitosano más que por la velocidad de su difusión a través del gel. En cualquier caso, la velocidad de neutralización es muy pequeña y la gelificación total de la disolución de quitosano puede tardar varios días. El exceso de amoniaco se elimina lavando el gel libre con abundante agua destilada. La velocidad de lavado es también muy pequeña y por consiguiente, la completa neutralización del hidrogel de quitosano puede tardar desde 12h a 3 o 4 días. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 24 La siguiente fotografía muestra una disolución de quitosano al 4% en HCl 0.1M a 25ºC, antes de ser neutralizada-gelificada. Puede observarse que no es completamente transparente ni homogénea. Las siguientes fotografías muestran la misma disolución de la fotografía anterior después de permanecer durante 72 y 96h a 25ºC, en un recipiente cerrado conteniendo un vaso con 100 mL NH 4 OH 0.1M. Puede observarse que después de 72 h aproximadamente el 40% de la disolución ha gelificado, mientras que después de 96h la gelificación es completa. Este resultado sugiere que la velocidad de disolución del NH 3 en la disolución de quitosano es más lenta que su difusión a través del hidrogel. Finalmente, el gel obtenido pudo desmoldearse, para obtener un cilindro gomoso con una apariencia y propiedades mecánicas similares a un tapón de caucho de una botella. 6.3.3.- Neutralización con glicerofosfato disódico. Los tres agentes neutralizantes empleados en este PFC se añaden a las disoluciones de quitosano con gran exceso estequiométrico. Sin embargo, el glicerofosfato disódico es el único agente que se añade en exceso hasta alcanzar pH neutro, mientras que los otros dos (NaOH y NH 3 ) se añaden en exceso alcanzando pH elevados = 14. Esto es debido a que el glicerofosfato disódico es una sal de acido débil (ácido glicerofosfórico) y base fuerte (NaOH) y por consiguiente, al disolverse en la disolución ácida de quitosano forma una disolución tampón que regula el pH. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 25 Esto quiere decir, que es necesario añadir grandes cantidades de glicerofosfato disódico para obtener pequeños incrementos de pH. En consecuencia, se suele añadir en pequeñas porciones en estado sólido o en disoluciones muy concentradas, para no incrementar excesivamente el volumen final de la disolución neutralizada. Esto permite emplear disoluciones diluidas de quitosano que son poco viscosas y muy homogéneas. También, el glicerofosfato disódico es el único agente neutralizante que genera disoluciones neutralizadas que gelifican al elevar su temperatura y en particular a T > 25ºC. Además, como la gelificación es reversible, los geles se licuan al ser enfriados y en particular en el frigorífico a 5 - 10ºC. Por consiguiente, la neutralización de las disoluciones de quitosano con glicerofosfato disódico se realiza a bajas temperaturas (10ºC), para evitar los grandes aumentos de viscosidad que se producen cuando la disolución neutralizada comienza a gelificar. Normalmente, un vaso de precipitados conteniendo la disolución de quitosano, un agitador, un termómetro y la sonda de un pHmetro, se introduce en un baño de hielo y se le van añadiendo pequeñas porciones de glicerofosfato disódico manteniendo la T = 10ºC y con agitación magnética. La neutralización llega a ser tediosa pues la adición de glicerofosfato disódico genera calor pero tan apenas modifica el pH de la disolución. Desafortunadamente, justo cuando el pH de la disolución se aproxima a 7, la disolución tampón formada es menos efectiva regulando el pH y entonces, puede resultar difícil ajustar el pH = 7. La tabla siguiente muestra las cantidades de glicerofosfato disódico necesarias para ajustar el pH de algunas de las disoluciones de quitosano a 10ºC. % De Quitosano Disolucion 0,1 N (ml) Masa quitosano (mg) pH inicial Masa Glicerofosfato (g) Disolucion Glicerofosfato (ml) Concentracion Glicerofosfato (g/ml) pH final 1% 50 ml 500 mg 1,9 6,5 g 7 ml 0,928 6,78 2% 50 ml 1000 mg 2,07 4,25 g 5 ml 0,85 6,9 2% 50 ml 1000 mg 2,13 7,0 g 9 ml 0,777 7,05 2% 50 ml 1000 mg 2,05 5,5 g 6 ml 0,916 6,95 1,50% 50 ml 750 mg 1,56 7,0 g 10 ml 0,7 6,95 1,75% 50 ml 872,5 mg 1,83 5,0 g 6,25 ml 0,8 6,92 Una vez ajustado el pH entre 6.90 y 7.05 a 10ºC, la disolución se vierte en pequeños moldes (normalmente placas petri de vidrio) que se tapan y se colocan en una estufa para calentarlas a temperatura constante. La temperatura se aumenta en incrementos de 10ºC y se mantiene constante durante 10 minutos. En nuestro caso, las disoluciones comienzan a perder su transparencia (indicando que están gelificando) entre 50 – 60ºC pero los hidrogeles únicamente se pueden manipular sin romperse a T > 60ºC. Puesto que la gelificación es reversible, la consistencia mecánica de las disoluciones gelificadas se pierde al disminuir su temperatura, aunque su transparencia original solo se recupera a la temperatura del frigorífico a 5 - 10ºC. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 32 El estudio de las propiedades mecánicas de los cuatro primeros grupos permitió determinar la concentración de quitosano (del 1 al 5%) y el agente neutralizante/gelificante más adecuado (NH 3 0.1 M o NH 3 1M o glicerofosfato disódico). Estos fueron 2% quitosano y NH 3 1 M, respectivamente. Ninguno de los geles estudiados presento suficiente resistencia mecánica para el cultivo celular de cartílago, el resto de los estudios mecánicos se realizó sobre el gel 2% quitosano y NH 3 1 M sometido a diferentes procesos de reblandecimiento (degradación) o endurecimiento (con calor y/o NaOH 20%). El estudio del 5º grupo da una idea de la degradación del gel 2% quitosano y NH 3 1 M, durante su almacenamiento en el frigorífico a 5ºC. Finalmente, el estudio mecánico de los dos últimos grupos 6º y 7º, trata de determinar si podrían prepararse geles con suficiente resistencia, sometiendo a los geles más robustos mecánicamente a procesos de endurecimiento drásticos (100ºC y NaOH 20%). 7.2.- DESCRIPCIÓN DE LOS EXPERIMENTOS MECANICOS. Cada uno de los geles seleccionado para su estudio mecánico, se corta en pequeñas muestras idénticas de tamaño y forma. Cada una de estas muestras se ensaya a compresión en una máquina de ensayos uniaxiales electromecánica INSTRON MicroTester 5548. Esta máquina de ensayos posee una precisión de 0.0001 N en fuerza y 0.001 mm en desplazamiento. El ensayo de compresión no confinada fue realizado con control en desplazamiento a 0.01mm/s hasta alcanzar un máximo de 4,9 N. La célula de carga empleada es de 5N. Las muestras estaban sumergidas en un tampón salino a 37ºC para garantizar sus niveles de hidratación. Estos experimentos de compresión nos permiten obtener datos de carga/desplazamiento que se pueden transformar a tensión/deformación. Con las curvas de tensión/deformación, podemos obtener las propiedades mecánicas (módulos de Young y tangentes) de los diferentes geles. Cada conjunto de geles se repitió como mínimo 6 veces. Los resultados se muestran como la media aritmética +/- la desviación estándar y el error típico de los distintos módulos relacionados con la rigidez de los geles. Estudiamos 3 intervalos: inicial, al 10% de deformación y al 20% de deformación. • El inicial, correspondiente al módulo de Young • La pendiente al 10% de deformación, correspondiente al módulo tangente al 10% • La pendiente al 20% de deformación, correspondiente al módulo tangente al 20% Estos son los intervalos más interesantes para las posibles aplicaciones futuras de los geles en aspectos relacionados con la ingeniería de tejidos del cartílago. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 33 La fotografía siguiente muestra la máquina de ensayos INSTRON empleada en este PFC para la caracterización de nuestros hidrogeles, en el momento de la realización de uno de los ensayos de compresión. La siguiente fotografía muestra el tamaño y forma de las muestras estudiadas, preparadas a partir de un gel cilíndrico (3cm diámetro y 0.5 cm espesor) de 2% quitosano y NH 3 1M. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 34 La siguiente fotografía se observa una muestra de gel obtenida con un sacabocados en un pocillo de una placa de PS en agua destilada antes del ensayo mecánico. 7.3.- TRATAMIENTO DE DATOS MECANICOS Cada ensayo mecánico, de cada una de las muestras de los geles en la maquina INSTRON, produce un archivo de datos en formato (.csv) que es compatible con EXCEL. En este archivo, están todos los datos de cada muestra de gel, que son necesarios para los cálculos (diámetro, espesor) y los datos obtenidos durante el ensayo: tiempo (sg), extensión (mm), carga (N), carga de compresión (N), carga por compresión (mm/mm), deformación real (mm/mm) y esfuerzo de compresión (Mpa). Además, también se obtiene un archivo (.pdf) que nos sirve como informe gráfico del ensayo, pues contiene todos los datos de las variables del experimento y una grafica con la curva de Carga (N) vs Extensión (mm). Como un ejemplo, se muestra la siguiente tabla procedente del archivo de datos (.csv) correspondiente a un ensayo de una de las muestras del gel 1.75% quitosano / NH 3 1M. Este archivo viene codificado como (17908_170908_3). Más adelante se explica el significado detallado de cada código. La tabla muestra el peso y dimensiones de la muestra y el tiempo (sg), extensión (mm), carga (N), carga de compresión (N), carga por compresión (mm/mm), deformación real (mm/mm) y esfuerzo de compresión (Mpa) del ensayo. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 35 Entradas de texto : Nombre Ensayo GEL_QUIT_17908_170908_3 Entradas de texto : Peso Seco Entradas de texto : Peso Húmedo Entradas numéricas : Diámetro Seco 0.00000 Entradas numéricas : Espesor Seco 0.00000 Dimensión : Diámetro Húmedo 700.000 mm Dimensión : Espesor Húmedo 10.000.000 mm Dimensión : Área 0.38485 cm^2 Entradas de texto : Tipo ensayo Tiempo Extensión Carga Carga de compresión Deformación por compresión Deformación real Esfuerzo de compresión (sec) (mm) (N) (N) (mm/mm) (mm/mm) (MPa) 0.00000 452.852 0.00036 -0.00036 0.00000 0.00000 -0.00001 0.00180 452.852 0.00036 -0.00036 0.00000 0.00000 -0.00001 0.10000 452.835 0.00028 -0.00028 0.00000 0.00000 -0.00001 0.20000 452.723 0.00028 -0.00028 0.00001 0.00001 -0.00001 0.30000 452.588 0.00025 -0.00025 0.00003 0.00003 -0.00001 0.40000 452.476 0.00023 -0.00023 0.00004 0.00004 -0.00001 0.50000 452.374 0.00021 -0.00021 0.00005 0.00005 -0.00001 0.60000 452.273 0.00017 -0.00017 0.00006 0.00006 0.00000 0.70000 452.172 0.00015 -0.00015 0.00007 0.00007 0.00000 0.80000 452.072 0.00010 -0.00010 0.00008 0.00008 0.00000 0.90000 451.973 0.00011 -0.00011 0.00009 0.00009 0.00000 100.000 451.871 0.00009 -0.00009 0.00010 0.00010 0.00000 110.000 451.772 0.00008 -0.00008 0.00011 0.00011 0.00000 120.000 451.672 0.00007 -0.00007 0.00012 0.00012 0.00000 130.000 451.571 0.00007 -0.00007 0.00013 0.00013 0.00000 140.000 451.472 0.00006 -0.00006 0.00014 0.00014 0.00000 150.000 451.371 0.00001 -0.00001 0.00015 0.00015 0.00000 160.000 451.270 0.00000 0.00000 0.00016 0.00016 0.00000 170.000 451.169 0.00000 0.00000 0.00017 0.00017 0.00000 180.000 451.070 -0.00003 0.00003 0.00018 0.00018 0.00000 190.000 450.970 -0.00002 0.00002 0.00019 0.00019 0.00000 200.000 450.871 -0.00006 0.00006 0.00020 0.00020 0.00000 210.000 450.770 -0.00007 0.00007 0.00021 0.00021 0.00000 220.000 450.670 -0.00008 0.00008 0.00022 0.00022 0.00000 230.000 450.572 -0.00014 0.00014 0.00023 0.00023 0.00000 240.000 450.474 -0.00015 0.00015 0.00024 0.00024 0.00000 250.000 450.373 -0.00015 0.00015 0.00025 0.00025 0.00000 260.000 450.274 -0.00014 0.00014 0.00026 0.00026 0.00000 270.000 450.172 -0.00020 0.00020 0.00027 0.00027 0.00001 280.000 450.070 -0.00019 0.00019 0.00028 0.00028 0.00001 290.000 449.971 -0.00020 0.00020 0.00029 0.00029 0.00001 300.000 449.871 -0.00020 0.00020 0.00030 0.00030 0.00001 310.000 449.769 -0.00019 0.00019 0.00031 0.00031 0.00001 320.000 449.668 -0.00020 0.00020 0.00032 0.00032 0.00001 330.000 449.569 -0.00018 0.00018 0.00033 0.00033 0.00000 340.000 449.469 -0.00016 0.00016 0.00034 0.00034 0.00000 350.000 449.369 -0.00013 0.00013 0.00035 0.00035 0.00000 360.000 449.270 -0.00009 0.00009 0.00036 0.00036 0.00000 370.000 449.170 -0.00008 0.00008 0.00037 0.00037 0.00000 380.000 449.070 -0.00008 0.00008 0.00038 0.00038 0.00000 390.000 448.971 -0.00009 0.00009 0.00039 0.00039 0.00000 400.000 448.873 -0.00013 0.00013 0.00040 0.00040 0.00000 410.000 448.774 -0.00011 0.00011 0.00041 0.00041 0.00000 420.000 448.675 -0.00015 0.00015 0.00042 0.00042 0.00000 430.000 448.574 -0.00017 0.00017 0.00043 0.00044 0.00000 440.000 448.471 -0.00016 0.00016 0.00045 0.00045 0.00000 450.000 448.372 -0.00019 0.00019 0.00046 0.00046 0.00000 460.000 448.272 -0.00020 0.00020 0.00047 0.00047 0.00001 470.000 448.171 -0.00023 0.00023 0.00048 0.00048 0.00001 480.000 448.070 -0.00023 0.00023 0.00049 0.00049 0.00001 490.000 447.969 -0.00025 0.00025 0.00050 0.00050 0.00001 500.000 447.870 -0.00027 0.00027 0.00051 0.00051 0.00001 510.000 447.768 -0.00030 0.00030 0.00052 0.00052 0.00001 520.000 447.669 -0.00027 0.00027 0.00053 0.00053 0.00001 530.000 447.569 -0.00032 0.00032 0.00054 0.00054 0.00001 540.000 447.468 -0.00029 0.00029 0.00055 0.00055 0.00001 550.000 447.370 -0.00036 0.00036 0.00056 0.00056 0.00001 560.000 447.270 -0.00036 0.00036 0.00057 0.00057 0.00001 570.000 447.172 -0.00035 0.00035 0.00058 0.00058 0.00001 580.000 447.071 -0.00039 0.00039 0.00059 0.00059 0.00001 590.000 446.971 -0.00042 0.00042 0.00060 0.00060 0.00001 600.000 446.872 -0.00043 0.00043 0.00061 0.00061 0.00001 610.000 446.772 -0.00043 0.00043 0.00062 0.00062 0.00001 620.000 446.673 -0.00045 0.00045 0.00063 0.00063 0.00001 630.000 446.573 -0.00045 0.00045 0.00064 0.00064 0.00001 640.000 446.473 -0.00049 0.00049 0.00065 0.00065 0.00001 650.000 446.373 -0.00049 0.00049 0.00066 0.00066 0.00001 660.000 446.272 -0.00054 0.00054 0.00067 0.00067 0.00001 670.000 446.171 -0.00054 0.00054 0.00068 0.00068 0.00001 680.000 446.070 -0.00052 0.00052 0.00069 0.00069 0.00001 690.000 445.969 -0.00057 0.00057 0.00070 0.00070 0.00001 700.000 445.868 -0.00055 0.00055 0.00071 0.00071 0.00001 710.000 445.769 -0.00060 0.00060 0.00072 0.00072 0.00002 720.000 445.670 -0.00060 0.00060 0.00073 0.00073 0.00002 730.000 445.572 -0.00060 0.00060 0.00074 0.00074 0.00002 740.000 445.471 -0.00066 0.00066 0.00075 0.00075 0.00002 750.000 445.372 -0.00064 0.00064 0.00076 0.00076 0.00002 Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 36 En primer lugar se renombra cada archivo uno a uno para no perder ninguna información y definir cada experimento del gel. Después, el archivo rawdata (archivo origen del aparato) se guarda en formato de Excel, para poder tratar los datos. En este archivo Excel, se borran los datos de compresión negativos, ya que significa que el cabezal no ha entrado en contacto aún con el gel. Estos datos son de aproximación de los platos de compresión a la muestra y no ejercen ninguna fuerza de compresión, por eso son negativos. Con el archivo Excel sin datos nulos, se abre otro archivo Excel con los datos fijos de cada experimento (diámetro, área) y con el dato variable (el espesor). De los datos respecto al tiempo solo se aprovechan: la carga (N) y extensión (mm). Los siguientes datos (desplazamiento, deformación, lambda, sigma) se obtienen por tratamiento matemático de los datos iníciales: El desplazamiento se obtiene de la diferencia entre la extensión en ese punto menos la extensión inicial. La deformación es igual al desplazamiento dividido entre el espesor, lambda se obtiene sumando uno a la deformación y sigma (tensión) es igual a la carga dividido por el área de la muestra. La representación grafica que se lleva a cabo es Sigma vs Lambda. Su objetivo es obtener la pendiente de la curva en 3 puntos que se consideran de interés para definir las propiedades mecánicas del gel: al inicio de la grafica (en la mayoría de los casos se hizo otra grafica de Sigma vs Lambda en la parte inicial para obtener mejores datos de pendientes iníciales), al 10% y al 20% de deformación. Además se obtuvieron otros datos interesantes de la parte final de la curvas de tensión deformación, como la deformación a 4,5 N de carga y la tensión al 25% de deformación. Que se estudie la pendiente en esos 3 puntos iníciales (inicial, 10%, 20%) es debido a que a niveles bajos de deformación estamos en el rango lineal del material y no tenemos interferencias de los platos de compresión empleados en los ensayos. Además, estos son los valores de deformación máximos a los cuales podría trabajar el gel en el caso de ser empleado en Ingeniería de tejidos de cartílago. Como continuación del ejemplo anterior, se muestra el siguiente archivo de datos (.pdf), correspondiente a un ensayo de una de las muestras del gel 1.75% quitosano / NH 3 1M. Este archivo viene codificado como (17908_170908_3). La tabla muestra carga (N), extensión (mm), desplazamiento (adimensional), deformación (mm -1 ), lambda (mm -1 ), y sigma (N\mm 2 ) del ensayo. También, aparecen tabulados el peso y dimensiones iniciales y finales de la muestra y la deformación a 4,5 N de carga y la tensión al 25% de deformación. El Módulo de Young aparece como inicial, al 10% y 20% de deformación. Las figura superior de la tabla de datos, muestra la dependencia de Sigma vs Lambda en todo el intervalo del ensayo. Mientras que la inferior muestra la dependencia en la parte inicial del ensayo. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 37 Extensión Carga (mm) (N) Inicial 4,51169 10% 20% Inicial 4,51169 0 0 0 1 0 Final 0 Módulo de Young 0,00095048 0,00154064 0,0008 4,51169 0 0 0 1 0 Inicial 10 456 908 4,5107 0,00003 0,00099 0,00021943 1,00021943 3,8217E-07 Final 4,5097 0,00002 0,00199 0,00044108 1,00044108 2,5478E-07 Inicial 78,50 Tensión a 25% de def 0,00029096 Mpa 4,50871 0,00006 0,00298 0,00066051 1,00066051 7,6433E-07 Final 0,00 4,5077 0,00007 0,00399 0,00088437 1,00088437 8,9172E-07 Inicial 0,0184 Def a 4,5 N 84,7347668 % 4,5067 0,00008 0,00499 0,00110602 1,00110602 1,0191E-06 Final 0,0199 4,50572 0,00014 0,00597 0,00132323 1,00132323 1,7834E-06 4,50474 0,00015 0,00695 0,00154044 1,00154044 1,9108E-06 4,50373 0,00015 0,00796 0,00176431 1,00176431 1,9108E-06 4,50274 0,00014 0,00895 0,00198374 1,00198374 1,7834E-06 4,50172 0,0002 0,00997 0,00220981 1,00220981 2,5478E-06 4,5007 0,00019 0,01099 0,00243589 1,00243589 2,4204E-06 4,49971 0,0002 0,01198 0,00265532 1,00265532 2,5478E-06 4,49871 0,0002 0,01298 0,00287697 1,00287697 2,5478E-06 4,49769 0,00019 0,014 0,00310305 1,00310305 2,4204E-06 4,49668 0,0002 0,01501 0,00332691 1,00332691 2,5478E-06 4,49569 0,00018 0,016 0,00354634 1,00354634 2,293E-06 4,49469 0,00016 0,017 0,00376799 1,00376799 2,0382E-06 4,49369 0,00013 0,018 0,00398964 1,00398964 1,6561E-06 4,4927 0,00009 0,01899 0,00420907 1,00420907 1,1465E-06 4,4917 0,00008 0,01999 0,00443071 1,00443071 1,0191E-06 4,4907 0,00008 0,02099 0,00465236 1,00465236 1,0191E-06 4,48971 0,00009 0,02198 0,00487179 1,00487179 1,1465E-06 4,48873 0,00013 0,02296 0,005089 1,005089 1,6561E-06 4,48774 0,00011 0,02395 0,00530843 1,00530843 1,4013E-06 4,48675 0,00015 0,02494 0,00552786 1,00552786 1,9108E-06 4,48574 0,00017 0,02595 0,00575172 1,00575172 2,1656E-06 4,48471 0,00016 0,02698 0,00598002 1,00598002 2,0382E-06 4,48372 0,00019 0,02797 0,00619945 1,00619945 2,4204E-06 4,48272 0,0002 0,02897 0,0064211 1,0064211 2,5478E-06 4,48171 0,00023 0,02998 0,00664496 1,00664496 2,9299E-06 4,4807 0,00023 0,03099 0,00686882 1,00686882 2,9299E-06 4,47969 0,00025 0,032 0,00709269 1,00709269 3,1847E-06 4,4787 0,00027 0,03299 0,00731212 1,00731212 3,4395E-06 4,47768 0,0003 0,03401 0,0075382 1,0075382 3,8217E-06 4,47669 0,00027 0,035 0,00775763 1,00775763 3,4395E-06 4,47569 0,00032 0,036 0,00797927 1,00797927 4,0764E-06 4,47468 0,00029 0,03701 0,00820313 1,00820313 3,6943E-06 4,4737 0,00036 0,03799 0,00842035 1,00842035 4,586E-06 4,4727 0,00036 0,03899 0,00864199 1,00864199 4,586E-06 4,47172 0,00035 0,03997 0,00885921 1,00885921 4,4586E-06 4,47071 0,00039 0,04098 0,00908307 1,00908307 4,9682E-06 4,46971 0,00042 0,04198 0,00930472 1,00930472 5,3503E-06 4,46872 0,00043 0,04297 0,00952415 1,00952415 5,4777E-06 4,46772 0,00043 0,04397 0,00974579 1,00974579 5,4777E-06 4,46673 0,00045 0,04496 0,00996522 1,00996522 5,7325E-06 4,46573 0,00045 0,04596 0,01018687 1,01018687 5,7325E-06 4,46473 0,00049 0,04696 0,01040852 1,01040852 6,242E-06 4,46373 0,00049 0,04796 0,01063016 1,01063016 6,242E-06 4,46272 0,00054 0,04897 0,01085403 1,01085403 6,879E-06 4,46171 0,00054 0,04998 0,01107789 1,01107789 6,879E-06 4,4607 0,00052 0,05099 0,01130175 1,01130175 6,6242E-06 4,45969 0,00057 0,052 0,01152561 1,01152561 7,2611E-06 4,45868 0,00055 0,05301 0,01174948 1,01174948 7,0064E-06 4,45769 0,0006 0,054 0,01196891 1,01196891 7,6433E-06 4,4567 0,0006 0,05499 0,01218834 1,01218834 7,6433E-06 4,45572 0,0006 0,05597 0,01240555 1,01240555 7,6433E-06 4,45471 0,00066 0,05698 0,01262941 1,01262941 8,4076E-06 4,45372 0,00064 0,05797 0,01284884 1,01284884 8,1529E-06 4,45272 0,00066 0,05897 0,01307049 1,01307049 8,4076E-06 4,45171 0,00068 0,05998 0,01329435 1,01329435 8,6624E-06 4,45071 0,00069 0,06098 0,013516 1,013516 8,7898E-06 4,4497 0,0007 0,06199 0,01373986 1,01373986 8,9172E-06 4,4487 0,00073 0,06299 0,01396151 1,01396151 9,2994E-06 4,44771 0,00074 0,06398 0,01418094 1,01418094 9,4268E-06 4,4467 0,00076 0,06499 0,0144048 1,0144048 9,6815E-06 4,44569 0,0008 0,066 0,01462866 1,01462866 1,0191E-05 4,44469 0,0008 0,067 0,01485031 1,01485031 1,0191E-05 4,44369 0,0008 0,068 0,01507196 1,01507196 1,0191E-05 4,44269 0,00086 0,069 0,0152936 1,0152936 1,0955E-05 4,44168 0,00083 0,07001 0,01551747 1,01551747 1,0573E-05 4,4407 0,00086 0,07099 0,01573468 1,01573468 1,0955E-05 4,43971 0,00084 0,07198 0,01595411 1,01595411 1,0701E-05 4,43872 0,00089 0,07297 0,01617354 1,01617354 1,1338E-05 4,43771 0,00087 0,07398 0,0163974 1,0163974 1,1083E-05 4,43672 0,00087 0,07497 0,01661683 1,01661683 1,1083E-05 4,43572 0,00087 0,07597 0,01683848 1,01683848 1,1083E-05 4,43472 0,00088 0,07697 0,01706013 1,01706013 1,121E-05 4,43371 0,00094 0,07798 0,01728399 1,01728399 1,1975E-05 4,43268 0,00091 0,07901 0,01751228 1,01751228 1,1592E-05 4,43171 0,00095 0,07998 0,01772728 1,01772728 1,2102E-05 4,43071 0,00095 0,08098 0,01794893 1,01794893 1,2102E-05 4,4297 0,00094 0,08199 0,01817279 1,01817279 1,1975E-05 4,42869 0,00099 0,083 0,01839665 1,01839665 1,2611E-05 4,42769 0,00098 0,084 0,0186183 1,0186183 1,2484E-05 4,42669 0,00095 0,085 0,01883995 1,01883995 1,2102E-05 4,42569 0,00106 0,086 0,01906159 1,01906159 1,3503E-05 4,4247 0,00106 0,08699 0,01928102 1,01928102 1,3503E-05 4,42371 0,00107 0,08798 0,01950045 1,01950045 1,3631E-05 4,42273 0,00109 0,08896 0,01971767 1,01971767 1,3885E-05 4,42173 0,00105 0,08996 0,01993931 1,01993931 1,3376E-05 4,42073 0,00106 0,09096 0,02016096 1,02016096 1,3503E-05 4,41973 0,00109 0,09196 0,02038261 1,02038261 1,3885E-05 4,41874 0,00109 0,09295 0,02060204 1,02060204 1,3885E-05 4,4177 0,00113 0,09399 0,02083255 1,02083255 1,4395E-05 4,41671 0,00114 0,09498 0,02105198 1,02105198 1,4522E-05 4,41572 0,00116 0,09597 0,02127141 1,02127141 1,4777E-05 4,41471 0,00117 0,09698 0,02149527 1,02149527 1,4904E-05 4,41371 0,00113 0,09798 0,02171692 1,02171692 1,4395E-05 4,41271 0,00121 0,09898 0,02193856 1,02193856 1,5414E-05 4,41169 0,00121 0,1 0,02216464 1,02216464 1,5414E-05 4,41069 0,00123 0,101 0,02238629 1,02238629 1,5669E-05 4,40969 0,00125 0,102 0,02260794 1,02260794 1,5924E-05 Diametro (mm) Área (mm^2) Peso (gr) Desplazamie nto Deformación Sigma Espesor (mm) Lambda -0,01 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Sigma Lambda GEL_QUIT_17908_170908_3 y = 0,000x - 0,000 R² = 0,997 -0,00001 0 0,00001 0,00002 0,00003 0,00004 0,00005 0,00006 0,00007 0,00008 0,00009 1 1,05 1,1 1,15 Sigma Lambda GEL_QUIT_17908_170908_3 Una vez obtenidos los datos de cada ensayo, renombrarlos, tratar los datos y graficarlos, el siguiente paso fue crear un archivo Excel con todos los experimentos de de cada grupo de geles estudiados (una página Excel para cada gel que abarca de 6 a 8 ensayos Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 38 por muestra de gel). En estas páginas se muestran los datos de cada experimento (modulo de Young inicial, al 10% y 20% de deformación, la deformación a 4,5 N de carga y la tensión al 25% de deformación) y también el promedio, desviación estándar y error típico de los diferentes módulos obtenidos en las 3 partes de estudio (inicial, 10% y 20%). Después de obtener los promedios de los diferentes módulos de cada gel, se agrupan todos los geles con sus resultados en la última parte del libro Excel. Los resultados tabulados son los siguientes: módulo de Young, módulo tangente al 10% y al 20%, con su promedio, desviación estándar y error típico de cada grupo de geles. Como ejemplo, la siguiente tabla muestra los datos del archivo Excel de los 6 ensayos realizados durante la caracterización del gel 5% quitosano / NH 3 1M. Pueden verse los valores del modulo de Young inicial, al 10% y 20% de deformación, de la deformación a 4,5 N de carga, de la tensión al 25% de deformación y del promedio, desviación estándar y error de los diferentes módulos. GEL_QUIT_17408_110908_1 0,1 0,2 Pendiente i 10% 20% Pendiente i Módulo de Young 0,03079073 0,05533362 0,0114 Promedio 0,02415512 0,04563814 0,01026667 Desv Stand 0,00568034 0,00679838 0,00432188 Tensión a 25% de def 0,00929389 Mpa Error tipico 0,00231899 0,00277543 0,0017644 Def a 4,5 N 50,7443885 % GEL_QUIT_17408_110908_2 Quitosano 5% 0,1 0,2 Pendiente i Agente Neutralizador NH3 1 M Módulo de Young 0,01650097 0,044597 0,0063 Tensión a 25% de def 0,0065772 Mpa Def a 4,5 N 51,3622616 % GEL_QUIT_17408_110908_3 0,1 0,2 Pendiente i Módulo de Young 0,02246605 0,05119231 0,0068 Tensión a 25% de def 0,00781376 Mpa Def a 4,5 N 50,7983579 % GEL_QUIT_17408_110908_4 0,1 0,2 Pendiente i Módulo de Young 0,03102332 0,0459165 0,0178 Tensión a 25% de def 0,00899083 Mpa Def a 4,5 N 53,3293651 % GEL_QUIT_17408_110908_5 0,1 0,2 Pendiente i Módulo de Young 0,02220517 0,03812767 0,0078 Tensión a 25% de def 0,00676892 Mpa Def a 4,5 N 57,2450671 % GEL_QUIT_17408_110908_6 0,1 0,2 Pendiente i Módulo de Young 0,02194451 0,03866175 0,0115 Tensión a 25% de def 0,00663236 Mpa Def a 4,5 N 56,0251709 % Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 39 La siguiente tabla muestra los valores (Mpa) de los promedios de los diferentes módulos de cada gel estudiado. En particular aparecen tabulados los siguientes: módulo de Young (Pendiente inicial), módulo tangente al 10% y al 20%, con su promedio, desviación estándar y error típico de cada grupo de geles. Promedio Desv Error P inicial 10% 20% P inicial 10% 20% P inicial 10% 20% 16908 0,00188571 0,00324794 0,00476369 0,00138852 0,00229109 0,00332487 0,00062097 0,00102461 0,00148693 17008 0,00322 0,00545428 0,01061254 0,00063797 0,0016115 0,00402291 0,00028531 0,00072068 0,0017991 17108 0,00148 0,00169096 0,00234549 0,00038987 0,00044897 0,00071439 0,00017436 0,00020079 0,00031948 17208 0,00275 0,00357199 0,0061051 0,00050892 0,00056855 0,00110744 0,00020777 0,00023211 0,00045211 17308 0,00235 0,00308582 0,00477121 0,00054681 0,00048943 0,00066179 0,00022323 0,00019981 0,00027017 17408 0,01026667 0,02415512 0,04563814 0,00432188 0,00568034 0,00679838 0,0017644 0,00231899 0,00277543 17508 0,012 0,02539543 0,03034526 0,00700179 0,00489941 0,00561353 0,00313129 0,00219108 0,00251045 17608 0,00116 0,00121323 0,0016952 0,00019494 0,0005139 0,0006122 7,3679E-05 0,00019424 0,00023139 17708 0,00566667 0,00868046 0,01642543 0,00345871 0,00260733 0,00183629 0,00141201 0,00106444 0,00074966 17808 0,02743333 0,02496421 0,03984214 0,02535963 0,00692777 0,00938123 0,01035302 0,00282825 0,00382987 17908 0,00076667 0,00090815 0,00139248 0,00015055 0,00013141 0,00024333 6,1464E-05 5,3646E-05 9,9338E-05 18008 0,00076667 0,0008715 0,00132104 0,00010328 0,00011161 0,00021316 4,2164E-05 4,5564E-05 8,7023E-05 18108 0,00188571 0,00240293 0,00363066 0,00041404 0,00038838 0,0005749 0,00015649 0,0001468 0,00021729 18208 0,00065 0,00068688 0,00103349 0,00028107 0,00025175 0,00038562 0,00011475 0,00010278 0,00015743 18308 0,00055 0,00063993 0,00099922 0,00010488 0,00010872 0,00024803 4,2817E-05 4,4383E-05 0,00010126 18408 0,00088333 0,00105577 0,00150287 0,0001472 0,00017443 0,00013911 6,0093E-05 7,1212E-05 5,679E-05 18508 0,00046667 0,00046564 0,00077059 8,165E-05 0,00014717 0,00014524 3,3333E-05 6,0082E-05 5,9293E-05 18608 0,00198333 0,00241005 0,00372418 0,00055648 0,00067021 0,00097648 0,00022718 0,00027361 0,00039865 El significado de los códigos asignados a los geles es el siguiente: Codigos de Geles 16908 : Gel del 1.75% de quitosano neutralizado con glicerofosfato disódico y gelificado a 73ºC. El ensayo se realizo a 10ºC. 17008: Gel del 2% de quitosano neutralizado con glicerofosfato disódico y gelificado a 73ºC. El ensayo se realizo a 10ºC. 17108: Gel del 1.5% de quitosano neutralizado con glicerofosfato disódico y gelificado a 73ºC. El ensayo se realizo a 10ºC. 17208 : Gel del 2% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 0.1 M endurecido con NaOH al 20%. 17308 :Gel del 3% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M endurecido con agua destilada a 100 ºC. 17408 ::Gel del 5% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M endurecido con agua destilada a 100 ºC. 17508 :Gel del 2% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M endurecido con NaOH al 20%. 17608 ::Gel del 2% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M envejecido 4 dias en el frigorifico. 17708 : Gel del 3% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 0.1 M 17808 : Gel del 5% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 17908 :Gel del 1,75% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18008 :Gel del 1,6% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18108 : Gel del 2% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18208:Gel del 1% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18308 :Gel de l1,25% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. Q1.25% 1M R 18408:Gel del 1,75% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18508:Gel del 1,5% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. 18608 : Gel del 4% de quitosano neutralizado\gelificado con amoniaco 1 M. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 40 7.4.- DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS ENSAYOS MECÁNICOS. Todos los resultados obtenidos en los estudios mecánicos se adjuntan en el CD de este PFC en la carpeta ANEXO y con un resumen en una hoja EXCEL. Debido al elevado espacio que ocupan no se presentan en papel impreso. Para la discusión emplearemos la última tabla resumen de resultados del apartado anterior. En esta última tabla del apartado anterior, se muestran los valores (Mpa) de los promedios de los diferentes módulos de cada gel estudiado. En particular: el módulo de Young (pendiente inicial) y módulo tangente al 10% y al 20% para cada grupo de geles. En dicha tabla, puede apreciarse que todos los geles estudiados presentan una modulo inicial, uno o varios órdenes de magnitud inferior a la necesaria para el cultivo celular de cartílago, que es 0.4 Mpa. Los tres máximos valores obtenidos son aproximadamente 0.0274, 0.012 y 0.0102 Mpa, correspondientes a los geles 17808, 17508 y 17408, respectivamente. El primero de estos dos geles contiene 5% de quitosano / NH 3 1M y el tercero, es el mismo gel sometido a endurecimiento térmico que consiste en calentarlo sumergido en agua destilada durante 10 minutos a 100ºC. El segundo contiene 2% de quitosano / NH 3 1M sometido a endurecimiento termoquímico que consiste en calentarlo sumergido en NaOH 20% durante 10 minutos a 100ºC. El valor máximo corresponde al gel con la mayor concentración de quitosano 5%. Sin embargo, el tratamiento térmico de este gel no aumenta este valor sino que lo reduce considerablemente. Este resultado, indica que este tratamiento térmico no es efectivo como endurecedor de estos geles (que más bien son precipitados gelatinosos) que contienen concentraciones de quitosano elevadas. Sin embargo, el endurecimiento termoquímico aplicado al gel de concentración moderada de quitosano 2%, resulta muy efectivo y de hecho produce el segundo gel que presenta mayor modulo inicial. Como era previsible, los menores valores de pendiente inicial (entre 0.00046 y 0.00088 Mpa) corresponden a los geles de menor concentración de quitosano (entre 1 y 1.75%) / NH 3 1M, sin ser sometidos a ningún proceso de endurecimiento. Por el contrario, geles neutralizados con glicerofosfato disódico de concentraciones de quitosano similares, 1.5 y 1.75%, muestran valores un orden de magnitud superiores 0.0014 y 0.0018, respectivamente. Este resultado indica que el glicerofosfato disódico es un agente neutralizante más conveniente que el NH 3 1M. Desafortunadamente, el proceso de gelificación cuando se emplea glicerofosfato disódico, implica elevadas temperaturas incompatibles con el cultivo celular. La siguiente figura muestra la dependencia de los módulos promedio (inicial, 10 y 20%) (valores Mpa de la última tabla de la sección anterior) con el % quitosano, para geles del 1 a 5% de quitosano / NH 3 1M. Puede observarse, que hasta el 4% de quitosano los módulos son muy parecidos y que a partir del 4% se produce un aumento exponencial de los módulos. Este tendencia, puede explicarse si tenemos en cuenta que los geles con concentraciones de quitosano tan elevadas > 4%, se consideran más precipitados gelatinosos que geles propiamente dichos y su comportamiento mecánico suele ser considerablemente diferente del característico de un gel. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 41 En esta misma figura, puede apreciarse que existe un máximo muy discreto a 2% de quitosano. Este resultado señala al gel 2% de quitosano / NH 3 1M como uno de los más interesantes. De hecho, muchos de los resultados de los estudios mecánicos que discutiremos a continuación, se obtuvieron con este gel (preparado con diferentes neutralizantes y/o procesos de endurecimiento). La siguiente figura muestra la dependencia de los módulos promedio (inicial, 10 y 20%) (valores Mpa de la última tabla de la sección anterior) con el % quitosano, para geles del 1 al 2% de quitosano / NH 3 1M. Puede observarse, que hasta el 2% de quitosano los valores de los módulos son parecidos y muy bajos aproximadamente dos órdenes de magnitud inferiores al ideal de 0.4 Mpa. Sin embargo, para el 2% estos valores aumentan aproximadamente un orden de magnitud. 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0123456 Modulo (Mpascales) % Quitosano Quitosano NH3 1M 1%-5% Pendiente inicial 10% 20% Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 48 similares al caucho común. Su valor de resistencia mecánica es más de un orden de magnitud superior a los correspondientes geles no endurecidos. • Los geles neutralizados con glicerofosfato disódico muestran valores de resistencia mecánica aproximadamente un orden de magnitud superior a los neutralizados con NH 3 1M. El glicerofosfato disódico podría resultar un agente neutralizante más conveniente que el NH 3 1M, de no ser por las elevadas temperaturas de su proceso de gelificación • La neutralización con NH3 0.1 M es demasiado lenta para resultar practica, a pesar de que conduce a la obtención de geles más homogéneos y resistentes que la de NH3 1 M. • Ninguno de los geles estudiados presento suficiente resistencia mecánica para el cultivo celular de cartílago. Universidad de Zaragoza Septiembre 2010 49 10.- BIBLIOGRAFIA 1. Jaepyoung Cho, Marie-Claude Heuzey, Andre Begin, Pierre J. 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