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PROYECTO FINAL DE CARRERA DISEÑO DE UN SISTEMA DE SEMBRADO DINÁMICO EN ANDAMIAJES. AUTOR Víctor Torrecilla Chicote DIRECTORES Mauro Malvé – Víctor Alastrué Vera ESPECIALIDAD Mecánica CONVOCATORIA Septiembre 2011 1 ÍNDICE CAPÍTULO 1. Objeto. ....................................................................................................... 5 CAPÍTULO 2. Introducción. .............................................................................................. 9 2.1. Medicina Regenerativa e Ingeniería de tejidos. .................................................................9 2.2. Expectativas de la Medicina Regenerativa y la Ingeniería de Tejidos ................................ 12 2.3. ¿Es necesaria la Medicina Regenerativa? ........................................................................ 13 2.4. Estado del arte ............................................................................................................... 14 2.4.1. Técnicas de sembrado celular .................................................................................................. 14 2.4.2. Biorreactores ................................................................................................................................ 17 2.4.3. Bombas peristálticas ................................................................................................................... 18 2.5. Mercado potencial ......................................................................................................... 20 2.5.1. Posibles aplicaciones del producto .......................................................................................... 20 2.5.2. Características generales del mercado ................................................................................... 21 2.5.3. Potencial y atractivo del mercado de la Ingeniería de Tejidos. ............................................ 24 CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes .................................29 3.1. Introducción y objetivos ................................................................................................. 29 3.2. Materiales y métodos .................................................................................................... 31 3.3. Estudio del desequilibrio durante el proceso de bombeo ................................................ 40 3.3.1. Introducción al ensayo y objetivo .............................................................................................. 40 3.3.2. Realización del ensayo .............................................................................................................. 41 3.3.3. Hipótesis de la causa de mal funcionamiento ........................................................................ 42 3.4. Reajuste del motor de la bomba ..................................................................................... 43 3.5. Estudio de la estabilidad de bombeo en los perfiles de sembrado.................................... 45 3.5.1. Introducción y objetivo del ensayo ........................................................................................... 45 3.5.2. Realización del ensayo. ............................................................................................................. 45 3.3.3. Análisis de los resultados .......................................................................................................... 49 3.3.4. Conclusiones ............................................................................................................................... 52 CAPÍTULO 4. Simulación computacional de paso de flujo por el scaffold. ........................56 4.1. Introducción y objetivo. ................................................................................................. 56 4.1.1. Introducción al TC ....................................................................................................................... 57 4.1.2. Historia de la TC .......................................................................................................................... 58 4.1.3. Principio de funcionamiento ...................................................................................................... 58 4.1.4. Aplicaciones de la TC ................................................................................................................. 60 4.2. Modelado por elementos finitos. .................................................................................... 61 4.2.1. Geometría .................................................................................................................................... 61 4.2.2. Discretización............................................................................................................................... 62 4.2.3. Condiciones de contorno ........................................................................................................... 64 4.4.4. Influencia de la discretización en los perfiles de velocidad .................................................. 65 4.3. Estudio de la variación de presión en el scaffold y la cámara de sembrado. ..................... 69 4.3.1. Caudal Q = 0’1 ml/min ................................................................................................................ 69 4.3.2. Caudal Q = 1 ml/min ................................................................................................................... 72 4.3.3. Caudal Q = 5 ml / min. ................................................................................................................ 75 4.3.4. Resultados. Valores de caídas de presión. ............................................................................. 78 2 4.4. Estudio de la influencia del tamaño del scaffold. ............................................................. 80 4.4.1. Desarrollo de la simulación. ....................................................................................................... 80 4.4.2. Conclusión .................................................................................................................................... 84 CAPÍTULO 5. Conclusiones del proyecto ......................................................................... 87 5.1. Conclusiones generales .................................................................................................. 87 5.1.1. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes. ......................................................... 87 5.1.2. Simulación de paso de flujo por el scaffold. ............................................................................ 87 5.2. Líneas futuras ................................................................................................................ 88 CAPÍTULO 6. Bibliografía ............................................................................................... 91 Capítulo 1: OBJETO 5 CAPÍTULO 1. Objeto. El presente proyecto, que lleva por título “DESARROLLO DE UN SISTEMA DE SEMBRADO DINÁMICO PARA ANDAMIAJES”, ha sido llevado a cabo en colaboración con EBERS Medical Tecnology SL, y se enmarca dentro del proyecto “Nuevos sistemas de Sembrado Dinámico de Andamiajes para el Cultivo Celular en Ingeniería de Tejidos (SEDIAN) de la convocatoria de Proyectos de Ayuda a la Industria de la Ciencia del CDTI llevado a cabo en colaboración entre EBERS y la UZ. El objetivo principal del proyecto consiste en analizar el comportamiento del fluido en un proceso de sembrado dinámico de células en scaffolds para determinar las condiciones más adecuadas para el mismo. Se analizarán parámetros tales como el caudal más adecuado para el sistema de bombeo, o las presiones y condiciones del flujo que se produzcan en el interior de la cámara y el scaffold. El proyecto consta de dos partes: - Parte experimental En esta parte se llevan a cabo simulaciones de bombeo de aire mediante una bomba peristáltica para comprobar el correcto funcionamiento del sistema. - Parte computacional Se realizan simulaciones de paso de flujo a través de la cámara de sembrado mediante el software ANSYS. El objetivo de esto es obtener el ∆P en el scaffold para posteriormente poder calcular propiedades como la permeabilidad del mismo. A continuación se detallan los grupos de tareas realizadas: 1. Adquisición de los conocimientos básicos de sembrado de células en andamiajes. - Introducción a la ingeniería de tejidos. - Búsqueda y análisis de artículos relacionados con el sembrado celular. 2. Diseño de un soporte para el conjunto de tubos y cámara de sembrado. - Diseño de un soporte que nos permita fijar los tubos en posición vertical y realizar la correcta medición del volumen de fluido desplazado en los ensayos. CAPÍTULO 1. Objeto Víctor Torrecilla Chicote 6 3. Ensayos de bombeo - Bombeo con los cabezales MC314 y MC318 Watson Marlow. - Análisis del volumen de fluido bombeado por ciclo. - Análisis del caudal bombeado por revolución. - Evaluación de los datos obtenidos. 4. Simulación de proceso de sembrado - Modelado 3D del scaffold mediante TC. - Diseño CAD de la cámara de perfusión. - Discretización del modelo mediante ANSYS ICEM CFD. - Simulación mediante ANSYS CFX. - Análisis de los resultados obtenidos. Capítulo 2: INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 14 2.4. Estado del arte 2.4.1. Técnicas de sembrado celular Como ya se ha comentado anteriormente, el sembrado de andamiajes para ingeniería de tejidos consiste en la diseminación de células en el volumen de dicho andamiaje (ver Figura 2.1) y constituye el primer paso necesario para llevar a cabo un cultivo celular en tres dimensiones. De hecho, el proceso de sembrado es de gran importancia, ya que es un factor determinante en la correcta formación del tejido cultivado (3). Estudios experimentales muestran que realizar el sembrado celular con altas densidades conlleva la mejor formación de tejido sobre andamiajes 3D en varios tipos de tejido, incluyendo la formación de matriz extracelular cartilaginosa (4), mejor mineralización de hueso (5) y mejoras en las estructuras del tejido cardíaco (6). Por lo tanto, los resultados experimentales observados en gran cantidad de tejidos muestran que el cultivo de tejidos para aplicaciones clínicas requiere que las células se siembren con tanta eficiencia como sea posible. Sin embargo, no basta con conseguir que una gran cantidad de células se adhiera al andamiaje, ya que los datos experimentales han demostrado que la distribución inicial que adquieren las células durante el sembrado es determinante en la formación posterior de tejido (4), (5), (7), (8), lo que indica que el sembrado celular uniforme es la base para el crecimiento tisular uniforme. Sin embargo, el sembrado uniforme de andamiajes 3D es una tarea difícil y tediosa, incluso en el caso de andamiajes de pequeño tamaño, y conseguir una distribución de células uniforme en el volumen del andamiaje constituye, a día de hoy, un desafío. Actualmente se utilizan varias metodologías de sembrado para depositar células sobre andamiajes porosos. Todas ellas tratan de conseguir que las células suspendidas en un fluido en una concentración muy elevada se depositen y adhieran al andamiaje. En una primera división, las técnicas que se utilizan para conseguir este objetivo pueden clasificarse en estáticas y dinámicas. 1. Técnicas de sembrado estáticas. Las técnicas de sembrado estáticas hacen referencia a aquellas metodologías de sembrado en las que el fluido con alta concentración celular se aplica de manera manual o “estática”, en el sentido de que no se imprime movimiento alguno al fluido aparte de la deposición inicial sobre el andamiaje, o bien se basan en la simple inmersión del mismo en el fluido que contiene las células. Las técnicas de sembrado estáticas son, con mucho, las que se utilizan con más frecuencia, a pesar de que varios estudios experimentales han mostrado que tienen una baja eficiencia (5), (7), (8), (9), (10) y que producen distribuciones de sembrado nada homogéneas y, en gran medida, dependientes de la pericia del operario encargado del procedimiento. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 15 Dentro de este tipo de técnicas existen al menos los siguientes tipos: • Sembrado por gravedad, consistente en dejar que las células se depositen sobre el andamiaje por efecto únicamente gravitatorio. • Sembrado por inyección, consistente en que el medio con alta concentración de células se inyecta en el interior del andamiaje, de modo que se facilita la llegada de las células a la zona interna del andamiaje. • Sembrado por aspiración, al contrario que en el sembrado por inyección, las células no se depositan en el interior del andamiaje directamente. En este caso, el fluido con alta concentración celular se introduce desde la zona externa mediante aspiración. 2. Técnicas de sembrado dinámicas Los sistemas dinámicos de sembrado están basados en la aplicación de movimiento al fluido sobre o a través de los andamiajes, de manera que la suspensión de células se vea forzada a pasar una y otra vez sobre los andamiajes, depositándose en ellos las células que contiene. Estos procedimientos presentan eficiencias de sembrado significativamente más altas que los estáticos y, además, las distribuciones celulares que se obtienen suelen ser mucho más homogéneas. Existen distintos esquemas experimentales para realizar el sembrado dinámico de andamiajes. Los más extendidos son los siguientes: • Sembrado por agitación. Fue una de las primeras técnicas de sembrado dinámico que se desarrolló. Consiste en sumergir los andamiajes en el fluido con alta concentración celular, de modo que estos queden suspendidos en el fluido. Seguidamente, se imprime movimiento a través de un agitador, que fuerza al fluido a pasar continuamente alrededor y, ligeramente, a través de los andamiajes (Figura 2.2). Sin embargo, si bien en la superficie de los andamiajes se produce una renovación de medio muy efectiva, la capacidad de esta técnica de hacer pasar las células a través de los andamiajes es limitada, y las corrientes que se generan en el interior del andamiaje son muy escasas, por lo que dependiendo de la tipología del andamiaje, la eficiencia de este sistema de sembrado puede ser muy baja (6), (7) y poco uniforme (12), (13), siendo la densidad celular mucho más alta en la superficie del andamiaje (3). CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 16 Figura 2.2. Representación esquemática del sistema de sembrado por agitación. • Sembrado por perfusión directa: este método de sembrado consiste en forzar el paso del medio que contiene las células a través de los poros de los andamiajes (Figura 2.3). Está basado en el principio de transporte por convección, ya que el fluido con alta concentración celular se hace pasar repetidamente a través de los poros a velocidades lo suficientemente bajas como para permitir que las células se adhieran a las paredes del scaffold hasta producir una distribución celular muy uniforme (8), especialmente en comparación con los sistemas de sembrado manuales y por agitación (9). Figura 2.3. Representación esquemática del sistema de sembrado por perfusión. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 17 Además de su efectividad, este sistema de sembrado por perfusión directa puede aplicarse a una gran variedad de tipos de andamiajes que, a su vez, puede integrarse en un sistema de perfusión que permita realizar el cultivo del tejido tras el proceso de sembrado, como ya se ha realizado para andamiajes vasculares, de cartílago y de tejido cardíaco (16). 2.4.2. Biorreactores Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres modos distintos: • Lote (batch) • Lote alimentado (fed-batch) • Continuo o quimiostato Las funciones del biorreactor son las siguientes: - Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la flotación. - Mantener constante y homogénea la temperatura. - Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes. - El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente sembrado con el microorganismo deseado. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 18 2.4.3. Bombas peristálticas La bomba peristáltica es una bomba de desplazamiento positivo, es decir, tiene una parte de succión y otra de expulsión, por lo que es utilizada para bombear una gran variedad de fluidos. El fluido es transportado por medio de un tubo flexible colocado dentro de una cubierta circular de la bomba; un rotor con un número de rodillos unidos a la circunferencia externa comprimen dicho tubo. Cuando se produce el giro del rotor, el tubo es aplastado continuamente por los rodillos, forzando así al fluido a desplazarse a través del mismo. Entre un paso y otro del rodillo impulsor el tubo recupera su diámetro original generando un vacío que induce el fluido a la bomba. Este proceso es llamado peristalsis y es usado en muchos sistemas biológicos como el aparato digestivo. El mecanismo más común cuenta con dos o tres rodillos que giran en un compartimento circular comprimiendo de forma progresiva una manguera especial flexible. Figura 2.4. Esquema de una bomba peristáltica de tres rodillos. En esta figura se observa que en ningún momento de las fases 1 a 6, los rodillos dejan de presionar el tubo en al menos un punto. Esto es importante ya que si en algún momento los rodillos dejan de ejercer presión sobre el conducto, el fluido podría retroceder. El sentido de rotación del motor determina la dirección del flujo, por lo tanto, la bomba peristáltica es un dispositivo de bombeo reversible. Las bombas peristálticas son ideales para dosificar de manera controlada fluidos o pastas, los cuales son aplicados en un determinado momento o de manera continuada en ciertos procesos. Ventajas. Debido a que la única parte de la bomba que entra en contacto con el fluido que es bombeado, es el interior del tubo, las superficies internas de la bomba son fáciles de esterilizar y limpiar. Además, puesto que no hay partes móviles en contacto con el líquido, las bombas peristálticas son baratas de fabricar. Su carencia de válvulas, CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 19 de sellos y de arandelas, y el uso de mangueras o tubos, hace que tengan un mantenimiento relativamente de bajo costo comparado a otros tipos de bombas. Dispositivo de seguridad para las bombas peristálticas. Debido a que la bomba peristáltica es de desplazamiento positivo, al bombearse contra una válvula cerrada o al cerrarla con la bomba en funcionamiento, o bien, cuando existan pérdidas de carga excesivas en la descarga, se puede romper la manguera interna de la bomba debido a la sobrepresión. Para evitar esto, es importante que todas las instalaciones que cuenten con bombas peristálticas, tengan un dispositivo de parada o desvío de caudal (bypass), que alerte cuando la bomba supere la presión límite. Este dispositivo puede ser: - Presostato (regulador de presión) - Válvula de seguridad - Limitador de par Clasificación de las bombas peristálticas Las bombas peristálticas se fabrican según las necesidades específicas de su aplicación, en diferentes combinaciones de tubos flexibles, rodillos y demás elementos. - Bombas peristálticas de alta presión: Pueden operar con hasta 16 bar, usualmente usan zapatas. Cuentan con cubiertas con lubricante para evitar la abrasión del exterior del tubo de la bomba y ayudar a la disipación del calor. - Bombas peristálticas de baja presión: Generalmente tienen cubiertas secas y usan rodillos, además de tuberías no reforzadas. Este tipo de bomba, algunas veces es llamada “bomba de tubo” o “bomba de tubería”. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 20 2.5. Mercado potencial 2.5.1. Posibles aplicaciones del producto En caso de que los estudios que van a realizarse proporcionen los resultados esperados, EBERS dispondrá de los medios necesarios para transformar dichos resultados en un producto comercial, concretamente un sistema completo de sembrado de células sobre andamiajes por perfusión. Una parte importante de este sistema se trata de la cámara de sembrado, cuya finalidad será el permitir obtener una distribución de células homogénea en todo el volumen del andamiaje con una elevada eficiencia, para lo que serán de vital importancia los resultados obtenidos de las investigaciones que se llevarán a cabo durante el desarrollo de este proyecto. Además, se tendrán en cuenta otros factores en el diseño de la cámara definitiva. Uno de los más importantes será la de adaptar dicha cámara de cultivo de manera que pueda utilizarse en combinación con el biorreactor TEB1000, que EBERS comercializa en la actualidad, así como con otros sistemas de cultivo ya existentes en el mercado. De esta manera, la empresa dispondrá de productos complementarios que le proporcionarán una considerable ventaja comercial respecto a sus competidores. Las cámaras de cultivo y biorreactores que se comercializan en la actualidad son muy pocas ya que el sembrado estático es, todavía, el más utilizado con mucha diferencia. Las cámaras que se utilizan para sembrado dinámico han sido generalmente diseñadas para otras aplicaciones (cultivo) y, por tanto, no proporcionan resultados óptimos. Además, suelen estar específicamente diseñadas para un tipo de sistema, lo que las convierte en sistemas rígidos, poco configurables y, en definitiva, de usabilidad reducida. Por lo tanto, el producto final supondría un considerable avance respecto a los que se distribuyen actualmente en el mercado. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 21 2.5.2. Características generales del mercado EBERS dirige sus productos al mercado de la investigación en Ingeniería de Tejidos. Sus clientes son, por lo tanto, grupos de investigación públicos (hospitales, universidades, institutos, etc.) y privados (compañías farmacéuticas, biotecnológicas, etc.) centrados en la Ingeniería de Tejidos. Se trata de un mercado con un gran potencial de crecimiento, al que todavía pocas empresas destinan sus productos. Sin embargo, este mercado dispone de un enorme potencial de crecimiento, dada la enorme cantidad de beneficios que promete a la aplicación generalizada de las técnicas que investigan. A continuación, se comentan los rasgos más relevantes de los principales mercados a los que EBERS dirige sus productos: • Mercado español Al igual que el resto de países de la Unión Europea, la inversión en investigación en Ingeniería de Tejidos ha aumentado considerablemente en los últimos años. Aunque muy lejos de los países más desarrollados, existen en España numerosos grupos de investigación que realizan labores de investigación en Medicina Regenerativa, de los cuales más de cincuenta se dedican específicamente a la Ingeniería de Tejidos. Dada su proliferación, incluso han comenzado a aparecer redes que agrupan dichos grupos como, por ejemplo, la Red TerCel, de terapia celular, que agrupa a una treintena de ellos. Del mismo modo, algunas comunidades autónomas han creado centros específicamente orientados a esta disciplina, como el Centro de medicina Regenerativa de Barcelona (CMBR) y el Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), lo que garantiza la apuesta del sector público español por la Medicina Regenerativa. El sector privado, sin embargo, no ha experimentado un crecimiento significativo y todavía son escasas las compañías que operan en este campo. Entre ellas destaca Histocell, empresa vasca cuya principal área de actividad es el desarrollo de productos de ingeniería tisular. • Mercado europeo La UE ha proporcionado un gran impulso a la Medicina Regenerativa en los últimos años, aunque el desarrollo de esta disciplina ha sido distinto en los diferentes estados de la Unión. Alemania, probablemente el país más avanzado, ha invertido una gran cantidad de fondos y ha establecido una red de grandes centros de investigación en Medicina Regenerativa. Asimismo, los gobiernos de Inglaterra y Holanda han creado nuevos centros y redes de investigación en Ingeniería de Tejidos dotadas de cuantiosos fondos para realizar investigación en este campo. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 22 Además, merece la pena destacar que ya en 2001 existían 436 empresas relacionadas con la Ingeniería de Tejidos en la UE, el 40% de las cuales estaban radicadas en la propia Alemania y el Reino Unido. En cuanto a su actividad, las británicas se han especializado en la aplicación de las tecnologías existentes, mientras que las alemanas se centran en la especialización en tecnologías y aplicaciones (24). • Mercado estadounidense Los Estados Unidos encabezan la lista de países en cuanto a investigación en Medicina Regenerativa. Existen multitud de centros de investigación relacionados con esta disciplina, se estima que alrededor de 5.000, regulados por las distintas Agencias Públicas. El gasto que estas agencias dedican a la investigación en este campo es, por tanto, difícil de calcular, aunque se estima que sólo el Nacional Institute of Health (NIH) invirtió más de 600 millones de dólares en 2007 a lo que hay que sumar las contribuciones de la Nacional Science Foundation (NSF), el Department of Defense (DOD) o el National Institute of Standards and Technology (NIST), de las que no se disponen cifras de inversión. A esto hay que sumar las iniciativas propias de los estados que han creado centros de Medicina Regenerativa (California, Connecticut, Illinois, Maryland, New Jersey, New York y Wisconsin). Figura 2.5. Distribución geográfica de la inversión industrial en Ingeniería de Tejidos. Datos en miles de millones de dólares. En cuanto al tejido empresarial, aproximadamente el 55% de las empresas de Ingeniería de Tejidos están radicadas en Estados Unidos. Además, dichas empresas encabezan la inversión en Medicina Regenerativa, suponiendo aproximadamente el 75% del total, véase Figura 8. Por ello, Estados Unidos supone el mercado de expansión natural para los productos de EBERS. CAPÍTULO 2. Introducción Víctor Torrecilla Chicote 23 • Mercado asiático El mercado asiático dispone de mayor potencial de crecimiento que ninguno de los anteriores. Sin embargo, su situación actual es de retraso, especialmente en comparación con el estadounidense y el europeo. La excepción a este hecho es Japón, que tiene un plan para invertir 831 millones de dólares en un plan de salud, cuyo objetivo principal será la investigación en Medicina Regenerativa y Terapia Celular (25). En una situación algo más primaria se encuentra China que, por su parte, ha comprometido ya 1.000 millones de dólares con objeto de establecer las bases de la investigación en Ingeniería de Tejidos (26). Singapur figura como otro de los posibles campos de expansión natural para los productos de EBERS; recientemente ha sido creado en este país el complejo Biopolis, dedicado a la investigación en ciencias de la vida, que ya ha sido origen de algunos avances notables en Ingeniería de Tejidos. En los próximos años se espera que otras potencias asiáticas, como India, se vayan introduciendo en el campo de la medicina regenerativa progresivamente. SEGMENTACIÓN DEL MERCADO Se ha segmentado el mercado atendiendo a un doble criterio (Figura 2.5): - Geográfico, distinguiendo entre el mercado europeo, asiático y norteamericano. - Destino del producto: investigación o aplicación clínica. Figura 2.6. Segmentación del mercado El criterio de segmentación geográfico es esencial, ya que condiciona la estrategia de distribución a seguir. Dada la gran extensión y dispersión del mercado conjunto al que nos dirigimos, hemos decidido utilizar distintos canales de distribución en función del segmento. Tal y como se explicará en detalle más adelante, la distribución en el mercado europeo la lleva a cabo directamente EBERS, mientras que en Asia y Norteamérica se realizará a través de partners locales, con una estructura comercial ya establecida y mejor conocimiento de su mercado. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 30 Figura 3.1. Esquema del circuito de sembrado Al finalizar cada ensayo de bombeo, se analizan los valores de caudal utilizado y el volumen de fluido desplazado en cada dirección, comprobando si existen desequilibrios en el sistema y, en el caso de que así sea, se determina la causa de los mismos para corregirlo. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 31 3.2. Materiales y métodos Una vez instalado y operativo el biorreactor donde se llevará a cabo el sembrado de células, se realizarán los ensayos de bombeo en condiciones lo más similares posibles a las condiciones de trabajo. El parámetro que ejerce mayor influencia en los ensayos es la velocidad del fluido a su paso por la cámara, ya que de ella depende la probabilidad de que las células se queden adheridas al scaffold tras pasar a través del mismo. Tras analizar otros ensayos similares realizados con anterioridad en el campo de la Ingeniería de Tejidos (21), (23), se tomó 5mm/s como la velocidad adecuada para el fluido en la cámara de sembrado. La cámara utilizada para los ensayos tiene un diámetro de 4mm por lo que el caudal que necesitamos se calcula con la siguiente fórmula: v D vSQ × × =×= 4 2 π Donde S es la sección de la cámara a la entrada cuyo diámetro se expresa en mm, y v la velocidad del fluido en esa sección, expresado en mm/s. Tras sustituir los valores y realizar el cambio de unidades necesario para obtener el caudal en ml/min, obtenemos lo siguiente: Q s mm 3 83,62= = min 769,3 ml - FLUIDO DEL ENSAYO El fluido utilizado para las pruebas fue 7ml de agua. Para las pruebas de bombeo a realizar, no es necesario disponer de la disolución de células ya que lo único que nos interesa es medir los parámetros obtenidos en mediante el bombeo de aire con la bomba peristáltica. Elegimos el agua como fluido a hacer pasar por la cámara de sembrado porque sus propiedades son muy similares a las del medio de cultivo que contendrá a las células en el proceso de sembrado dinámico. Para un correcto funcionamiento del proceso de sembrado, se debe evitar que el aire llegue a la cámara donde se encuentra el scaffold ya que si el aire llega a esta zona, las probabilidades de que las células se adhieran correctamente al scaffold disminuyen notablemente. Por lo tanto, en cada ciclo de bombeo se hizo pasar por el scaffold sólo una parte del fluido, dejando siempre 1,5 ml restantes como medida de seguridad de forma que en el caso de que se sucediesen desequilibrios, el aire no llegase a la cámara de sembrado. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 32 Nótese que, como se ha comentado anteriormente, al iniciarse el primer ciclo de bombeo, la cantidad de fluido que hay a cada lado de la cámara, es la misma. Por lo tanto, la duración del primer intervalo de bombeo será la mitad con respecto a los siguientes. En concordancia con esto, se programó la bomba para que hiciera pasar a través del scaffold 2 ml de fluido en el primer intervalo y 4ml en los posteriores. - SEMBRADO POR PERFUSIÓN DIRECTA Se utilizó la perfusión directa como método de sembrado celular. Se trata de un sistema de sembrado dinámico que consiste en hacer pasar el fluido por el scaffold alternativamente en una y otra dirección. La principal ventaja de este método frente a otros métodos estáticos es que se consigue un reparto celular uniforme y homogéneo en el scaffold (8). Además, este método permite integrar el sistema de sembrado de células con el sistema de cultivo que se realizará a continuación. Gracias a esto, no hace falta manipular el scaffold entre las fases de sembrado y cultivo, reduciendo así las posibilidades de contaminación de las células. - BOMBA PERISTÁLTICA Para los ensayos realizados, se utilizaron dos cabezales de bomba de distintas características del fabricante Watson-Marlow. A continuación se detallan las propiedades de cada uno de los dos modelos utilizados: - Watson Marlow 314D  El cabezal de la bomba consta de 4 rodillos.  Un único canal de carga.  Caudal máximo: 2 l/min.  Permite usar 7 diámetros de tubo distintos.  Posibilidad de colocar hasta 6 cabezales en una misma unidad. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 33 Figura 3.2. Cabezal Watson-Marlow 314D - Watson Marlow 308MC  Cabezal de bomba provisto de 8 rodillos para mayor precisión.  Disponible con 3 o 5 canales de carga.  Permite acoplar varios cabezales para alcanzar 15 canales.  Cada canal es independiente, es posible retirar uno sin afectar al resto. Figura 3.3. Cabezal Watson-Marlow 318MC CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 34 - TUBOS TYGON Los tubos que se colocan en el cabezal de la bomba requieren una resistencia muy alta para evitar el desgaste al ser continuamente aplastados por los rodillos de la bomba. Los tubos Tygon son tubos flexibles, blandos y tienen buena resistencia a la corrosión por productos químicos y a la compresión, por lo que son muy adecuados para utilizarlos con bombas peristálticas de bajo rendimiento como la utilizada en los ensayos. Se utilizaron tubos de distintos diámetros en función del cabezal: Cabezal de bomba Diámetro tubo [mm] 314D 0,8 1,6 MC318 0,88 1,52 Figura 3.4. Tubos de silicona y tubos Tygon - TUBOS DE SILICONA Para la parte del circuito que no entra en contacto con los rodillos del cabezal de la bomba, no es necesaria la utilización tubos de alta resistencia como la que ofrecen los tubos Tygon. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 35 Así pues, se utilizaron tubos de silicona como reservorios para el fluido a bombear y conectores de distintas características para unir estos tubos a la cámara de sembrado y a los tubos Tygon de la bomba. Los tubos de silicona utilizados en los distintos ensayos son de diámetro 6,4mm y 4,8mm - CONECTORES LUER El sistema LUER es un sistema de conexión estandarizado para evitar fugas entre un macho y el acoplamiento hembra correspondiente en instrumentos médicos y de laboratorio tales como tubos, jeringuillas, agujas hipodérmicas o llaves de paso. Este tipo de conexión, recibe el nombre del médico alemán Hermann Wülfing Luer, que lo inventó en el siglo XIX. Hay dos variedades de conexión Luer: - Luer Lock: la parte hembra del conector tiene unas pestañas que se atornillan al macho. - Luer Slip: el ajuste se consigue por fricción de las dos partes. Figura 3.5. Conectores tipo LUER CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 36 - BIORREACTOR DE FLUJO: TEB1000 El cultivo celular para la ingeniería de tejidos ha de desarrollarse en unas condiciones ambientales particularmente exigentes, ya que es necesario controlar una gran cantidad de variables que afectan decisivamente al proceso de crecimiento y expansión celular como, por ejemplo, temperatura, el PH del medio de cultivo, la concentración de nutrientes o la aplicación de estímulos mecánicos sobre el andamiaje y/o las células entre otros. A fin de facilitar este proceso y el control de algunas de las variables que intervienen en el proceso de cultivo celular, EBERS comercializa el biorreactor de flujo TEB1000 (figura 3.7) Figura 3.6. Biorreactor TEB 1000 Dicho biorreactor, destinado por completo al mercado de la investigación, permite controlar las variables que intervienen en el cultivo de las células, mejorando considerablemente la entrega de nutrientes y la eliminación de las sustancias de desecho en comparación con un cultivo estático. Para ello, se sirve de un sistema de control de flujo de medio de cultivo, que permite prescribir unas condiciones de cultivo especificando parámetros como el caudal o la velocidad del fluido así como especificar el modo en que las células van a ser estimuladas por la acción del propio flujo. Las principales ventajas del biorreactor TEB 1000 frente a otros equipos del mercado son las siguientes: CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 37  Versatilidad El equipo es completamente modular, de tal modo que al biorreactor TEB1000 se le pueden acoplar distintas cámaras de cultivo, cada una de ellas válida para una aplicación específica. EBERS comercializa varios diseños de cámaras de cultivo, pero existe la posibilidad de que el usuario utilice sus propias cámaras de cultivo con el TEB1000.  Control automático de la estimación celular El equipo dispone de un sistema electrónico para el control del flujo de medio cultivo que permite regular de forma prefijada y automática el grado de estimulación mecánica aplicado sobre las células del cultivo.  Equipo completo. La principal ventaja del biorreactor EBERS con respecto a otros equipos de características similares disponibles en el mercado reside en la integración total de todos componentes necesarios para crear las condiciones aptas para el desarrollo celular. Gracias a esta característica, no es necesario utilizar ningún o muy escaso equipamiento adicional para desarrollar los cultivos, lo que resulta en experimentos más limpios, baratos y fáciles de desarrollar. Dicha integración se obtiene gracias a la Master Unit TEB1000, que constituye en núcleo del biorreactor EBERS. Esta unidad incluye toda la maquinaria y los elementos de control para proporcionar un ambiente de control apropiado, incluyendo: - Sistema de bombeo de medio de cultivo - Control de temperatura - Control de la concentración de CO2 - Control de la concentración de O2 Por tanto, una vez que las condiciones de cultivo están ya garantizadas, sólo es necesario utilizar una cámara de cultivo y material accesorio, como tubos o reservorios para medio de cultivo, para completar todo lo necesario para el desarrollo de cultivos celulares en Ingeniería de Tejidos.  Coste El coste inicial del TEB 1000 es, de por sí, inferior al de otros equipos equivalentes del mercado. Además, su diseño versátil y modular permite ampliar el rango de aplicaciones del equipo en un futuro a un coste reducido. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 38  Panel de control El biorreactor incluye un sistema de control integrado mediante pantalla táctil donde configurar todos los parámetros necesarios del proceso de sembrado. Esta particularidad lo hace muy sencillo de manejar para el usuario. Figura 3.7. Pantalla de control táctil - CÁMARA DE CULTIVO (P3D-6) La cámara donde se aloja el scaffold en el proceso de sembrado se ha fabricado con polipropileno mediante moldeo por inyección. Al tratarse de la parte del circuito donde va a alojarse el scaffold, y por tanto, donde se va a realizar todo el proceso de sembrado y cultivo celular, se requiere que esté correctamente esterilizada para evitar contaminar el proceso de sembrado de células. Las cámaras P3D han sido diseñadas específicamente para el sembrado y cultivo de células en scaffolds. La cámara está formada por dos partes (macho y hembra) entre las cuales se aloja el scaffold, impidiendo el movimiento de éste. La fijación de la cámara es regulable, de forma que el usuario pueda alojar en ella scaffolds de distintos diámetros y alturas. Características: - Conexiones de tipo LUER Estas conexiones facilitan el acoplamiento de la cámara con los tubos que conforman el circuito de sembrado CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 39 - Material transparente La trasparencia del plástico utilizado, permite monitorizar visualmente el proceso. - No hay superficies perpendiculares La cámara se ha fabricado minimizando las superficies perpendiculares a la dirección del flujo. Esto facilita el paso del fluido y evita que las células se depositen en las paredes de la cámara. - Fácil introducción / extracción del scaffold La apertura y cierre de la cámara se ha simplificado para evitar posibles daños en el scaffold durante la inserción o extracción del mismo. Figura 3.8. Cámara de cultivo P3D-6 CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 46 - sentido de giro - caudal programado - tiempo programado - tubo utilizado - volumen de fluido desplazado - caudal medido (en función de ese volumen y las revoluciones por minuto del giro del cabezal de la bomba). Con la diferencia entre caudal teórico y caudal medido, calculamos el porcentaje de error para cada semi-ciclo de bombeo. CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 47 Tabla 3.4. Resultados del ensayo de bombeo Dirección de giro [Derecha/Izquierda] Caudal programado [ml/min] Tiempo programado [min] Tubo bomba [mm] Volumen [ml] Caudal [ml/min] %Error Rpm bomba Izquierda 0,6 210 1,52 1,447644672 0,411652513 31,39124777 4,615384615 Derecha 0,6 210 1,52 1,682886931 0,478546047 20,24232554 4,615384615 Izquierda 0,6 210 1,52 1,46574023 0,41679817 30,53363837 4,615384615 Derecha 0,6 210 1,52 1,610504698 0,457963421 23,67276315 4,615384615 Izquierda 0,6 210 1,52 1,447644672 0,411652513 31,39124777 4,615384615 Derecha 0,6 210 1,52 1,664791373 0,47340039 21,09993494 4,615384615 Izquierda 0,6 210 1,52 1,447644672 0,411652513 31,39124777 4,615384615 Derecha 0,6 210 1,52 1,610504698 0,457963421 23,67276315 4,615384615 Izquierda 0,6 210 1,52 1,483835789 0,421943826 29,67602897 4,615384615 Derecha 0,6 210 1,52 1,610504698 0,457963421 23,67276315 4,615384615 Izquierda 1,3 92 1,52 1,501931347 0,958679583 26,25541667 10 Derecha 1,3 92 1,52 1,574313581 1,004881009 22,70146084 10 Izquierda 1,3 92 1,52 1,46574023 0,93557887 28,03239458 10 Derecha 1,3 92 1,52 1,592409139 1,016431365 21,81297189 10 Izquierda 1,3 92 1,52 1,501931347 0,958679583 26,25541667 10 Derecha 1,3 92 1,52 1,592409139 1,016431365 21,81297189 10 Izquierda 1,3 92 1,52 1,483835789 0,947129227 27,14390562 10 Derecha 1,3 92 1,52 1,610504698 1,027981722 20,92448293 10 Izquierda 1,3 92 1,52 1,483835789 0,947129227 27,14390562 10 Derecha 1,3 92 1,52 1,592409139 1,016431365 21,81297189 10 Izquierda 2,6 46 1,52 1,429549114 1,864629279 28,28348928 20 Derecha 2,6 46 1,52 1,610504698 2,100658301 19,20544995 20 Izquierda 2,6 46 1,52 1,46574023 1,911835083 26,46788142 20 Derecha 2,6 46 1,52 1,610504698 2,100658301 19,20544995 20 Izquierda 2,6 46 1,52 1,483835789 1,935437985 25,56007748 20 Derecha 2,6 46 1,52 1,592409139 2,077055399 20,11325389 20 Izquierda 2,6 46 1,52 1,46574023 1,911835083 26,46788142 20 Derecha 2,6 46 1,52 1,610504698 2,100658301 19,20544995 20 Izquierda 2,6 46 1,52 1,501931347 1,959040888 24,65227355 20 Derecha 2,6 46 1,52 1,610504698 2,100658301 19,20544995 20 Izquierda 6,5 46 1,52 3,239104954 4,224919505 35,00123839 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,528633888 4,602565941 29,19129322 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,329582746 4,342934016 33,18563052 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,61911168 4,720580452 27,37568535 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,420060538 4,460948527 31,37002266 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,637207238 4,744183354 27,01256378 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,456251654 4,508154332 30,64377951 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,655302797 4,767786257 26,6494422 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,492442771 4,555360136 29,91753636 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,655302797 4,767786257 26,6494422 50 CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 48 Tabla 3.4. Resultados del ensayo de bombeo (cont.) Dirección de giro [Derecha/Izquierda] Caudal programado [ml/min] Tiempo programado [min] Tubo bomba [mm] Volumen [ml] Caudal [ml/min] %Error Rpm bomba Izquierda 6,5 46 1,52 3,474347213 4,531757234 30,28065794 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,691493914 4,814992061 25,92319906 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,492442771 4,555360136 29,91753636 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,709589472 4,838594963 25,56007748 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,474347213 4,531757234 30,28065794 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,691493914 4,814992061 25,92319906 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,474347213 4,531757234 30,28065794 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,691493914 4,814992061 25,92319906 50 Izquierda 6,5 46 1,52 3,51053833 4,578963039 29,55441479 50 Derecha 6,5 46 1,52 3,709589472 4,838594963 25,56007748 50 Izquierda 1,65 73 2,79 1,755269165 1,385738814 16,01582944 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,773364723 1,400024781 15,15001324 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,791460282 1,414310749 14,28419705 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,773364723 1,400024781 15,15001324 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,447644672 1,142877373 30,73470469 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,393357997 1,100019471 33,33215326 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,375262438 1,085733504 34,19796945 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,375262438 1,085733504 34,19796945 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,393357997 1,100019471 33,33215326 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,393357997 1,100019471 33,33215326 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,302880205 1,028589635 37,66123422 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,302880205 1,028589635 37,66123422 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,302880205 1,028589635 37,66123422 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Izquierda 1,65 73 2,79 1,320975763 1,042875603 36,79541803 5 Derecha 1,65 73 2,79 1,302880205 1,028589635 37,66123422 5 Izquierda 3,3 36 2,79 1,375262438 2,171467008 34,19796945 10 Derecha 3,3 36 2,79 1,302880205 2,057179271 37,66123422 10 Izquierda 3,3 36 2,79 1,35716688 2,142895074 35,06378565 10 Derecha 3,3 36 2,79 1,302880205 2,057179271 37,66123422 10 Izquierda 3,3 36 2,79 1,339071322 2,114323139 35,92960184 10 Derecha 3,3 36 2,79 1,302880205 2,057179271 37,66123422 10 Izquierda 3,3 36 2,79 1,35716688 2,142895074 35,06378565 10 Derecha 3,3 36 2,79 1,302880205 2,057179271 37,66123422 10 Izquierda 3,3 36 2,79 1,35716688 2,142895074 35,06378565 10 Derecha 3,3 36 2,79 1,302880205 2,057179271 37,66123422 10 CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 49 3.3.3. Análisis de los resultados A la vista de los resultados mostrados en la Tabla 3.4, se aprecia que existe un porcentaje de error entre el caudal dado por el fabricante de la bomba para el bombeo con líquido, y el obtenido en las pruebas bombeando aire. Este porcentaje de error oscila siempre entre el 30% y el 40%. También se puede ver claramente que existe cierta diferencia entre el volumen de fluido bombeado en una dirección y en otra, siendo siempre superior el caudal bombeado en sentido horario. Este dato confirma los resultados obtenidos en la tabla 3.4 del apartado anterior. Por lo tanto, se asume que existe tendencia al desequilibrio del sistema. Debido a esta diferencia entre los bombeos en sentido horario y anti-horario, se decidió evaluar el error obtenido en las mediciones de caudal separando los datos obtenidos según la dirección del flujo. Los dos parámetros que pueden influir en mayor medida en la diferencia entre caudal teórico de la bomba, y el obtenido experimentalmente para bombeo de aire, son el diámetro del tubo de la bomba y el caudal programado. Así pues, a partir de las tablas anteriores se realizan representaciones gráficas del valor de error calculado en función del sentido de bombeo, el valor de caudal programado en cada ensayo y el diámetro del tubo utilizado en la bomba. Representaciones en sentido horario Gráfica 3.1. Porcentaje de error en función del caudal programado. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 01234567 % Error Caudal programado % Error % Error CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 50 Gráfica 3.2. Porcentaje de error en función del diámetro del tubo Tal y como se ve en las gráficas 3.1 y 3.2, los valores de error obtenidos en los ensayos, se encuentran más agrupados si los analizamos respecto al diámetro de tubo de la bomba que si lo hacemos respecto al valor de caudal programado, donde se muestran registros más dispersos e impredecibles. En el caso de utilizar un tubo de 1,52 mm de diámetro, el error de caudal oscila entre un 20% y un 30% aproximadamente. Este porcentaje aumenta hasta valores en torno al 30% y 40% con el tubo más grande (2,79 mm de diámetro) aunque se observa como en algún ensayo se han obtenido caudales que sólo difieren en un 15% respecto al teórico. Esto se debe a que al ser un tubo más grande, influye en mayor medida la colocación del mismo en el cabezal de la bomba. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 % Error Tubo bomba % Error % Error CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 51 Representaciones en sentido anti-horario Gráfica 3.3. % Error en función del caudal programado. Gráfica 3.4. % Error en función del diámetro del tubo Como ya sucedía en los resultados correspondientes al sentido horario, en las gráficas 3.3 y 3.4, los valores de error obtenidos en los ensayos se encuentran más agrupados si los analizamos respecto al diámetro de tubo de la bomba que si lo hacemos respecto al valor de caudal programado, donde se muestran registros más dispersos e impredecibles. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 02468 % Error Caudal programado % Error % Error 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 % Error Tubo bomba % Error % Error CAPÍTULO 3. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes Víctor Torrecilla Chicote 52 Para los ensayos en los que se utilizó un tubo de 1,52 mm de diámetro, el error de caudal oscila entre un 25% y un 35% aproximadamente. Este porcentaje aumenta hasta valores en torno al 35% cuando el tubo utilizado es el de 2.79 mm de diámetro. 3.3.4. Conclusiones A pesar del reajuste que se realizó tras los ensayos anteriores (apartado 3.2), siguen apareciendo desequilibrios en el sistema. Estos desequilibrios, producidos por pequeñas diferencias de flujo entre un sentido y otro de bombeo, no afectan al proceso de sembrado, pero pueden acumularse y hacer que en algún momento sólo pase aire a través del scaffold en lugar del medio de sembrado. Para solucionar esto se introdujo una nueva herramienta (Figura 3.10) en la pantalla de control táctil del biorreactor, de forma que el usuario pueda corregir en el acto el desequilibrio que observe que se está produciendo en su proceso de bombeo. De esta forma, si el usuario observa que se produce desequilibrio en cualquiera de los dos sentidos de bombeo, indica la dirección en la que se está produciendo y el porcentaje de volumen de fluido que se bombea de más en esa dirección y el sistema realiza el ajuste necesario para compensar ese desequilibrio. Figura 3.10. Herramienta de control del desequilibrio. Capítulo 4: SIMULACIÓN COMPUTACIONAL DE PASO DE FLUJO POR EL SCAFFOLD 62 4.2.2. Discretización El volumen que se malla a continuación, corresponde al espacio que va a ocupar el fluido en movimiento al pasar a través de la cámara de sembrado, así que se utiliza una malla cuyos elementos son tetraedros ya que es el único tipo de elemento que nos permite realizar el correcto mallado de una geometría compleja como son los poros del scaffold. Una vez obtenido el volumen del scaffold en formato stl a partir del TC, se importa la geometría al programa Ansys ICEM v.10. Figura 4.8. Geometría de la cámara de sembrado y scaffold Con toda la geometría definida, se deben establecer familias de elementos para posteriormente poder establecer distintas condiciones de contorno en esos elementos como serán la condición de no deslizamiento en las paredes, o las velocidades de entrada y salida del flujo en los extremos. Así, creamos las siguientes familias de elementos (Figura 4.7): - Inlet: superficie de entrada a la cámara - Outlet: superficie de salida de la cámara - Wall: contorno correspondiente a toda la cámara de sembrado, la pared de ésta. - Scaffold: pared del elemento scaffold. - Body: punto establecido para definir el volumen de mallado. 63 El scaffold se debe situar correctamente alineado en el interior de la cámara, es importante que todo el volumen del scaffold esté situado en el interior de la cámara, ya que en caso contrario, se podrían producir errores al crear la malla. Ansys ICEM ofrece la posibilidad de emplear diferentes tipologías de elementos para realizar el mallado del dominio. De este modo, es capaz de poder adaptar el mallado a cualquier contorno de los sólidos que limitan el dominio. La característica principal que diferencia a los distintos elementos es el número de nodos con el que resuelven las ecuaciones dentro de su volumen de control. A mayor número de nodos por elemento, más precisa será su resolución interna, sin embargo también aumentan los requisitos computacionales de la malla. Los distintos tipos de elementos que se pueden utilizar varían desde los 8 hasta los 4 nodos: hexaedros, prismas, pirámides o tetraedros. A pesar de la mayor precisión que proporcionan los elementos con mayor número de nodos, debido a la compleja geometría del scaffold sólo se pueden utilizar elementos tetraédricos para la creación de malla. A continuación, se realizaron varias mallas de distinto número de elementos para posteriormente llevar a cabo una comparativa los perfiles de velocidad obtenidos con las distintas mallas utilizadas. De este modo, se analizará la sensibilidad de la solución en función del tamaño de elemento de las mismas. El objetivo de este estudio es, por tanto, obtener una malla cuya precisión de cálculo sea la adecuada para, posteriormente, realizar los cálculos restantes con ella. Se realizan 3 mallas distintas especificando el tamaño de cada elemento según la posición que ocupe. Las características de las distintas mallas se pueden ver en la siguiente tabla. Tabla 4.1. Tamaños de referencia de cada elemento según la familia a la que pertenecen. Nº Elementos 3 mm. 1,7 mm. 1 mm. Inlet 0,3 0,5 0,5 Outlet 0,3 0,5 0,5 Curvas 0,2 0,5 0,5 Pared 0,5 1 1 Scaffold 0,05 0,1 0,3 Tamaños de elemento 64 Figura 4.9. Malla del conjunto cámara – scaffold 4.2.3. Condiciones de contorno Tras crear y refinar adecuadamente la malla en ICEM, se exporta en formato “Nastran” conservando los elementos de volumen y de áreas (prescindimos de elementos lineales). Este fichero se importa en ANSYS CFX donde se establece el dominio donde se va a producir el flujo y éste se define como laminar y estacionario. En primer lugar, es necesario definir el agua como fluido seleccionado para el dominio. El fluido que se utilizará en las simulaciones será agua, ya que sus propiedades se asemejan mucho a las del medio de cultivo. A continuación, se definen las condiciones de contorno necesarias: - Condición de no deslizamiento Para garantizar que el flujo tenga velocidad nula en las paredes, se define la condición de “no deslizamiento” tanto en las paredes de la cámara de sembrado como en el scaffold. - Velocidad normal a la entrada y a la salida del dominio Se realizarán tres simulaciones con distintos valores de caudal pertenecientes al rango de caudales que se utilizarán para realizar el sembrado celular: 0’1, 1 y 5 ml/min 65 Teniendo en cuenta estos caudales y que el diámetro del tubo a la entrada y salida es 4 mm, las velocidades en esas zonas son las siguientes: Tabla 4.2. Velocidad normal en entrada y salida (A = 4mm) Figura 4.10. Condiciones de contorno de entrada y salida. Con el dominio definido y las condiciones de contorno establecidas, se procede a realizar la simulación del flujo. Esta tarea, requerirá mayor o menor tiempo de procesado en función del tipo de malla realizada en el apartado anterior y de las tolerancias asignadas al proceso de cálculo. 4.4.4. Influencia de la discretización en los perfiles de velocidad Tras realizar el mallado del volumen de fluido, se exportó el proyecto al programa ANSYS CFX para realizar la simulación del paso del flujo a través de la cámara y así obtener el perfil de velocidad del fluido tras hacerlo pasar a través del scaffold. Para realizar la simulación, se impuso un caudal de 1 mililitro por minuto y condición de no deslizamiento en las paredes del dominio. Caudal (ml/min) Velocidad (mm/s) 0'1 0'132695 1 1'32695 5 6,63146 66 La recta donde se analizaron los perfiles de velocidad de las distintas simulaciones, se situó a una distancia equivalente a dos veces el espesor del scaffold, esta distancia está considerada como suficiente para evitar las perturbaciones que puedan darse en el flujo a causa del paso por el scaffold. En la siguiente gráfica, se muestran los perfiles de velocidad de las tres mallas distintas. Cada perfil se ha conformado con 20 puntos de muestreo a lo largo de los 4,5 mm de diámetro de la cámara. Gráfica 4.1. Perfiles de velocidad En esta gráfica se aprecia un problema en lo resultados, y es que la velocidad en los extremos del tubo debería resultar nula ya que se trata de un flujo laminar. Al crear el dominio donde se evalúa el flujo, se especificaron las condiciones de contorno como velocidad a la entrada del tubo y condición de no deslizamiento en las paredes (tanto en las paredes de los tubos como en las del scaffold). Sin embargo, con las mallas menos refinadas no se alcanza el valor de velocidad nula en la pared. El motivo al que se asocia el defecto citado, es que el programa evalúa los valores de velocidad en el nodo de la malla más cercano a la pared, en lugar de hacerlo en la pared misma. Este efecto se ve acrecentado en las mallas con menor número de elementos y mayor tamaño de estos elementos en la zona de las paredes, 67 reduciéndose cuando se trata de mallas de más elementos y de tamaño más pequeño como se aprecia en malla de 3 millones. En la figura 4.11 se muestra una representación gráfica de la velocidad medida en la sección utilizada para obtener los perfiles de velocidad mostrados anteriormente. Se puede apreciar como varía desde el valor de velocidad nula en la pared, hasta el valor máximo de velocidad de 2 mm/s aproximadamente que se dan en la zona central del plano de corte. Figura 4.11. Representación gráfica de la velocidad en el plano de corte En cuanto a la medida obtenida de la velocidad máxima en el centro del tubo, tenemos los siguientes resultados según las distintas mallas: - Malla 3 millones de elementos: V Max = 1,99168 mm/s - Malla 1,7 millones de elementos: V Max = 1,97462 mm/s - Malla 1 millón de elementos: V Max = 1,96232 mm/s En este aspecto, las mallas de 3 y 1,7 millones de elementos tienen valores muy cercanos entre sí, siendo ligeramente superior la velocidad máxima en la malla de 1,7 millones. La malla más pequeña es la que da un valor de velocidad inferior. Estas diferencias, expresadas de forma porcentual, son mínimas, se tiene lo siguiente: - La malla de 1.7 mill. da un valor de velocidad 0,85% inferior al de la malla de 3 millones. - La malla de 1 mill. da un valor de velocidad 0.62% inferior al de la malla de 1,7 millones. 68 - La malla de 1 mill. da un valor de velocidad 1.47% inferior al de la malla de 3 millones. Las variaciones de velocidades máximas dadas en las mallas de 1,7 millones y 1 millón de elementos, respecto a la dada en la malla de 3 millones de elementos, son próximas al 1%. En este punto de refinamiento de malla, se considera que reducir aún más el tamaño de elemento deja de tener influencia en los resultados numéricos que obtengamos. Por lo tanto, cualquiera de las tres mallas realizadas, se considera apta para realizar las simulaciones. Sin embargo, en la gráfica 4.1 se puede observar cómo en la malla de 3 millones de elementos, el defecto de aproximación al valor 0 de velocidad en la pared de la cámara prácticamente no aparece (la velocidad obtenida en la pared con esta malla es 1 x 10 -2 mm/s) mientras que en las mallas de menor número de elementos, ese efecto se aprecia ligeramente. Por este motivo, y teniendo en cuenta que las diferencias en cuanto al tiempo de cálculo computacional requerido son escasas, se elige la malla de 3 millones de elementos como la idónea para realizar las simulaciones de flujo. 69 4.3. Estudio de la variación de presión en el scaffold y la cámara de sembrado. A continuación, se van a analizar las variaciones de presión que se dan tanto en las superficies de entrada-salida de la cámara como en las paredes del scaffold. Dado que la cámara de sembrado admite la posibilidad de utilizar scaffolds de tamaño variable desde 5 hasta 7 mm, para estas simulaciones utilizaremos un scaffold de tamaño intermedio, de 6 mm de diámetro. El objetivo de estas simulaciones es determinar cómo varía la presión tanto en el scaffold como en la cámara de sembrado en función del caudal de lujo utilizado. El rango de caudales a analizar varía desde 0’1 ml/min hasta 5 ml/min, por lo que se toman tres medidas distintas para posteriormente realizar una interpolación y prever las caídas de presión para todas las medidas de caudal. 4.3.1. Caudal Q = 0’1 ml/min En primer lugar se va a tomar una medida de caída de presiones con el valor de caudal mínimo al que se va a trabajar. Variación de presión en el scaffold Tras realizar la simulación, se representa gráficamente el perfil de presiones en las paredes del scaffold. Como se puede ver en las figuras 4.12 y 4.13, las presiones mínimas y máximas se registran en la parte del scaffold correspondiente a la zona central ya que es por ahí por donde entra o sale el flujo a través del tubo, las paredes que están en contacto con la cámara de sembrado, registran unas presiones intermedias y considerablemente uniformes. La presión máxima que se registra en la cara de entrada del flujo es: 2.907 x 10 -2 Pa. Y la presión mínima registrada en la cara de salida del flujo es: -2.566 x 10 -2 Pa. Es decir, la caída de presión que se da en las paredes del scaffold es: 5.473 x 10 -2 Pa. 70 Figura 4.12. Representación gráfica de presiones a la entrada del scaffold para Q = 0’1 ml/min Figura 4.13. Representación gráfica de presiones a la salida del scaffold para Q = 0’1 ml/min 71 Variación de presión en la entrada-salida de la cámara. También se va a analizar la variación de presión que se da en la entrada y salida de la cámara, así que creamos una superficie INLET en la entrada y OUTLET en la salida, para representar gráficamente la medida de presión en esas zonas. Figura 4.14. Representación gráfica de presiones a la entrada y salida de la cámara de sembrado Los valores de presión en estas superficies varían muy ligeramente, tanto que esa variación no queda representada con la escala de presiones dada (Figura 4.14) Por lo tanto, se creó una línea coincidente con el diámetro para tomar distintos valores de presión en los puntos que conforman dicha línea, de esta manera obtenemos el valor máximo de presión a la entrada de la cámara. La presión máxima a la entrada de la cámara de sembrado es 2.66 x 10 -2 Pa mientras que la presión a la salida de la cámara de sembrado: -2.32 x 10 -2 Pa. Por lo que la caída de presión entre la entrada y salida de la cámara de: 4.98 x 10 -2 Pa. 78 4.3.4. Resultados. Valores de caídas de presión. Como se ha visto en el apartado anterior, las caídas de presión varían de forma lineal con la velocidad del flujo. En la siguiente tabla se realiza una interpolación lineal a partir de los valores obtenidos mediante las simulaciones realizadas para determinar el valor de caída de presión para distintos valores de caudal. Las filas sombreadas en gris representan los datos de partida obtenidos mediante la simulación por CFX mientras que el resto de datos se han obtenido mediante interpolación. SCAFFOLD CÁMARA SEMBRADO Q [ml/min] P entrada [Pa] P salida [Pa] ΔP [Pa] P entrada [Pa] P salida [Pa] ΔP [Pa] 0,1 0,02907 -0,02566 0,05473 0,0266 -0,0232 0,0498 0,28 0,08177598 -0,07246792 0,1542439 0,07532436 -0,0653818 0,14070616 0,46 0,13448196 -0,11927584 0,2537578 0,12360432 -0,1073416 0,23094592 0,64 0,18718794 -0,16608376 0,3532717 0,17188428 -0,1493014 0,32118568 0,82 0,23989392 -0,21289168 0,4527856 0,22016424 -0,1912612 0,41142544 1 0,2926 -0,2597 0,5523 0,268 -0,233 0,501 1,5 0,446525 -0,4029875 0,8495125 0,40825 -0,357 0,76525 2 0,60045 -0,546275 1,146725 0,5485 -0,481 1,0295 2,5 0,754375 -0,6895625 1,4439375 0,68875 -0,605 1,29375 3 0,9083 -0,83285 1,74115 0,829 -0,729 1,558 3,5 1,062225 -0,9761375 2,0383625 0,96925 -0,853 1,82225 4 1,21615 -1,119425 2,335575 1,1095 -0,977 2,0865 4,5 1,370075 -1,2627125 2,6327875 1,24975 -1,101 2,35075 5 1,524 -1,406 2,93 1,39 -1,225 2,615 Tabla 4.3. Presiones obtenidas en función del caudal. A continuación, se representan gráficamente los datos de la tabla 4.3 en dos gráficas distintas. La gráfica 4.2 muestra la variación de presión (∆P) que se da en la cámara y scaffold mientras que la gráfica 4.3 representa la presión máxima y mínima que se da tanto en el scaffold como en la entrada y salida de la cámara de sembrado. 79 Gráfica 4.2. ∆P en función del caudal. Gráfica 4.3. Presiones en función del caudal. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0123456 ΔP [Pa] Caudal [ml/min] Evolución del ΔP en función del caudal ΔP Scaffold ΔP Cámara -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 0123456 Presión [Pa] Caudal [ml/min] Evolución de presiones en función del caudal Pmax Scaffold Pmin Scaffold Pe Cámara Ps Cámara 80 4.4. Estudio de la influencia del tamaño del scaffold. Dado que la cámara de sembrado permite el uso de scaffolds de entre 5 y 7 mm, al utilizar un scaffold de un tamaño inferior al máximo, que no llene por completo el diámetro de la cámara, existirá un volumen libre entre el borde del scaffold y la pared de la cámara por donde puede circular el flujo sin que las células se depositen correctamente en el scaffold. Si el flujo que sale a esa zona no atraviesa de un lado a otro de la cámara sino que permanece ahí de forma residual, es posible que las células no lleguen a adherirse al scaffold en ningún momento Con estas simulaciones se verá si utilizar un tamaño de scaffold grande que ocupe toda la cámara de sembrado o utilizar uno de diámetro inferior, influye notablemente en el comportamiento del flujo. Para ello se van a evaluar las velocidades y presiones obtenidas en esta nueva simulación comparándolas con las obtenidas anteriormente. Para esta comparativa, utilizaremos las condiciones de contorno indicadas en la sección 4.2.3 mientras que el caudal utilizado será de 1 ml/min. 4.4.1. Desarrollo de la simulación. Representación de las líneas de flujo En la figura 4.21 se representa cómo el caudal de 1 ml/min pasa a través de un scaffold de 6 mm de diámetro. Se representan 200 líneas de flujo y, tal y como se puede apreciar, sólo unas pocas de ellas salen por los laterales del scaffold al espacio que queda entre éste y la cámara de sembrado. Además, las líneas de flujo que salen al volumen sin scaffold, rápidamente vuelven a pasar a través de él y pasan al otro lado de la cámara de sembrado. Es decir, no se produce ningún flujo residual entre el scaffold y las paredes de la cámara de sembrado. Este análisis depende en gran medida del número de líneas de flujo representadas y de la zona seleccionada de inicio de las mismas, por lo tanto se trata de un análisis únicamente cualitativo que no nos permite sacar ninguna conclusión definitiva. Sin embargo, nos permite para prever que no habrá grandes diferencias entre utilizar scaffolds de mayor o menor tamaño. 81 Figura 4.21. Líneas de flujo en el paso por la cámara de sembrado. Comparación del perfil de velocidad Los perfiles de velocidad obtenidos en las simulaciones con scaffold de 6 mm y de 7 mm se muestran en la gráfica 4.4. Las mallas utilizadas para esta simulación tienen el mismo tamaño de elemento para cada una de las partes del dominio, sin embargo en la malla del scaffold grande se alcanzan los 4 millones de elementos mientras que la otra es de 3 millones. En la figura 4.22 se muestra un recorte en detalle de la gráfica 4.16 donde se ve cómo las dos curvas son prácticamente coincidentes. Como se ve en la gráfica 4.4, los perfiles de velocidad para distintos tamaños de scaffold son prácticamente iguales, tanto es así que las gráficas del perfil de velocidad de cada caso se superponen completamente mostrándose sólo una de las curvas. Las velocidades máximas que se dan en cada uno de los casos son las siguientes: - Scaffold 6 mm diámetro: Vmax = 1,99168 mm/s - Scaffold 7 mm diámetro: Vmax = 1,99121 mm/s 82 Gráfica 4.4. Perfiles de velocidad para distintos tamaños de scaffold. Figura 4.22. Detalle de la gráfica de velocidades. 83 Comparación de variaciones de presión en el scaffold. Las variaciones de los valores de presión entre los scaffolds de 6 y 7 mm se muestran a continuación. Figura 4.23. Representación de presiones en el scaffold. Como se muestra en la figura 4.23, las presiones en el scaffold de 7 mm de diámetro varían entre 3.92 x 10 -1 y -3.778 x 10 -1 Pa. En el apartado 4.3.2 (Figuras 4.14 y 4.15) se analizaba la variación de presiones que se dan en un scaffold de 6 mm de diámetro al hacer pasar un flujo de 1 ml/min de caudal a través de él. Los valores de presión que se obtuvieron fueron 3.150 x 10 -1 y 3.008 x 10 -1 Pa como máximo y mínimo respectivamente, son similares a los obtenidos en esta nueva simulación con un scaffold más grande. 84 4.4.2. Conclusión Como se ha visto en el apartado 4.6.2 los valores de velocidad del flujo tras pasar por el scaffold, son similares independientemente del tamaño del scaffold utilizado entre los valores analizados. En lo referente a la presión, los valores máximos y mínimos obtenidos en la simulación con el scaffold de 7 mm de diámetro, son ligeramente superiores respecto a los que obtuvimos con el scaffold de 6 mm. Sin embargo la distribución de presiones por toda la superficie es similar en ambos casos. Tras analizar los resultados y observar que no se encuentran diferencias notables entre los valores de velocidad y las presiones obtenidas, se concluye que pequeñas variaciones en las dimensiones del scaffold no tienen apenas influencia en el comportamiento del flujo a su paso por la cámara de sembrado. Capítulo 5: CONCLUSIONES DEL PROYECTO 87 CAPÍTULO 5. Conclusiones del proyecto 5.1. Conclusiones generales 5.1.1. Diseño de un sistema de sembrado para andamiajes. Los primeros ensayos dieron como resultado desequilibrios muy pronunciados e irregulares en el flujo, se observó que el motivo que causaba estos desequilibrios era un desajuste en el giro del motor al que va acoplada la bomba peristáltica que colocamos en el biorreactor de flujo TEB1000. Mediante una reprogramación del autómata que regula el giro del motor, se ha corregido el desajuste en el giro de la bomba A pesar de las correcciones realizadas, siguen apareciendo desequilibrios debidos a la acumulación de pequeñas variaciones del volumen de fluído bombeado en un sentido y otro en los ciclos de bombeo de larga duración. Estos pequeños desequilibrios son progresivos y suelen aparecer siempre en la misma dirección de bombeo. Como solución al problema se ha creado una herramienta en el panel de control del biorreactor que permite al usuario indicar el porcentaje de desequilibrio que está observando en su ensayo y la dirección en la que se está produciendo para que el sistema corrija esta desviación. 5.1.2. Simulación de paso de flujo por el scaffold. Los resultados obtenidos en este ensayo, nos permiten observar que la ∆P que se da en el scaffold varía linealmente en función del caudal de flujo introducido. A partir de estos valores de caída de presión, será posible calcular propiedades del scaffold como la permeabilidad. Las cámaras de sembrado utilizadas (P3D-6), permiten la utilización de scaffolds de distintos diámetros. Las simulaciones realizadas nos permiten observar que para las pequeñas variaciones de diámetros del scaffold que se utilizan en estas cámaras de sembrado, no se aprecian diferencias importantes en el flujo.