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Proyecto Fin de Carrera APLICACIÓN DE LA BACTERIA VIBRIO FISCHERI EN LA MEDIDA DE LA TOXICIDAD EN AGUAS Realizado por: Dirigido por: Eduardo Reinado Lansac Rosa Mosteo Abad Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Escuela de Ingeniería y Arquitectura Universidad de Zaragoza Septiembre 2011 APLICACIÓN DE LA BACTERIA VIBRIO FISCHERI EN LA MEDIDA DE LA TOXICIDAD EN AGUAS RESUMEN La investigación en ecotoxicología con diferentes especies de bacterias luminiscentes ocupa un importante lugar en la evaluación de los contaminantes del agua en ciertos ecosistemas. Sus características genéticas, fisiológicas, nutricionales y funcionales han sido evaluadas comparando los cambios que se producen en estos organismos, fundamentalmente en presencia de agentes tóxicos. Ello ha dado lugar a la existencia de protocolos normalizados con bacterias luminiscentes para ensayos de toxicidad. La investigación desarrollada en este PFC tiene como objetivo principal la puesta en marcha de un método de análisis de toxicidad en aguas mediante el uso de bacterias luminiscentes, como la Vibrio Fischeri. Como objetivo secundario del trabajo se procede al control de la toxicidad en muestras acuosas de distintos orígenes que se someten a tratamientos de mejora de calidad del agua. Los métodos existentes para analizar toxicidad en aguas son variados pero todos ellos tienen la problemática de trabajar con bacterias que son sensibles a muchos factores. Dentro de las técnicas existentes, la utilización de la bacteria Vibrio Fischeri para analizar la toxicidad de aguas es recomendable, ya que el estudio realizado en este proyecto final de carrera muestra que el método analítico puesto en marcha es bastante repetitivo medianate el control del blanco. La utilización de la bacteria Vibrio Fischeri en el análisis de toxicidad de muestras reales es apta, así como para el control de la evolución de la toxicidad en muestras tratadas mediante distintos procesos. El inconveniente principal es el coste económico de las bacterias. INDICE DE LA MEMORIA 1-ALCANCE Y OBJETIVOS DEL PFC 1 2-CONTROL DE TOXICIDAD EN AGUAS 2 2.1-Introducción 2 2.2-Parámetros de control 4 2.3-Metodología Analítica 7 2.4-Legislación Aplicable 10 3-CONTAMINACION DE LAS AGUAS POR SUSTANCIAS PELIGROSAS 13 3.1-Introducción 13 3.2-Los Plaguicidas 15 3.2.1-Clasificación 15 3.2.2-Presencia de plaguicidas en aguas 19 3.3-Tratamientos avanzados de degradación de plaguicidas 22 4-PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 26 4.1-Muestras objeto de estudio 26 4.1.1-Aguas superficiales 26 4.1.2-Aguas residuales urbanas depuradas 26 4.1.3-Fortificación de las muestras 28 4.2-Metodología Analítica 31 4.2.1-Análisis de toxicidad mediante test de bioluminiscencia 31 4.3-Descripción de los tratamientos aplicados a las muestras 42 4.3.1-Materiales y reactivos 42 4.3.2-Experimentación con procesos de oxidación avanzada 44 5-RESULTADOS 45 5.1-Puesta en marca del equipo 45 5.1.1-Preparación del patrón 45 5.1.2-Acondicionamiento del patrón y de muestras 46 5.1.3-Blanco 47 5.1.4-Acondicionamiento de las bacterias Vibrio Fischeri 47 5.1.5-Método operativo con Isopropanol y H 2 O 2 (puesta en marcha) 48 5.2-Análisis de toxicidad en muestras reales 58 5.3-Comparativa entre muestras iniciales Fortificadas y muestras tratadas 64 6-CONCLUSIONES 65 7-BIBLIOGRAFIA 66 8- ANEXOS 8.1. Anexo I. Orden MAM 85/2008. 8.2. Anexo II. Propiedades y estructura química de los plaguicidas estudiados. 1-Alcance y Objetivos del PFC 1 1. ALCANCE Y OBJETIVOS DEL PFC La evaluación de la toxicidad de agentes químicos es una necesidad considerada a nivel internacional. En numerosos contextos legales y socio-políticos se contempla el fomento de la investigación mediante el uso de alternativas a la experimentación animal. El uso de estos métodos está ampliamente aceptado por la comunidad científica aunque es preciso la normalización y validación de los métodos para tener plena utilidad en investigación básica y aplicada. La investigación en ecotoxicología con diferentes especies de bacterias luminiscentes ocupa un importante lugar en la evaluación de los contaminantes del agua en ciertos ecosistemas. Sus características genéticas, fisiológicas, nutricionales y funcionales han sido evaluadas comparando los cambios que se producen en estos organismos, fundamentalmente en presencia de agentes tóxicos. Ello ha dado lugar a la existencia de protocolos normalizados con bacterias luminiscentes para ensayos de toxicidad. La investigación desarrollada en este PFC tiene como objetivo principal la puesta en marcha de un método de análisis de toxicidad en aguas mediante el uso de bacterias luminiscentes, como la Vibrio Fischeri. Como objetivo secundario del trabajo se procede al control de la toxicidad en muestras acuosas de distintos orígenes que se someten a tratamientos de mejora de calidad del agua. El presente proyecto se ha realizado en el grupo de investigación de “Calidad y Tratamiento de Aguas” perteneciente al departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente de la Universidad de Zaragoza. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Regeneración de aguas mediante procesos de oxidación avanzada” (CTM2008-01876/TECNO) financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación y los fondos FEDER de la Unión Europea. 2-Control de Toxicidad en Aguas 2 2. CONTROL DE TOXICIDAD EN AGUAS 2.1 INTRODUCCION Los análisis convencionales sobre toxicidad son efectuados de manera estática, es decir, incorporando el agente tóxico en el medio en el que viven estos organismos y comprobando posteriormente el porcentaje de inmovilización en relación al número total de bacterias luminiscentes empleadas. Los ensayos de toxicidad han sido empleados para diversos fines, que incluyen: -Constatación de la aptitud de las condiciones ambientales para el desarrollo de las determinadas formas de vida acuática. -Establecimiento de las concentraciones aceptables de los diferentes parámetros convencionales en las aguas receptoras (oxígeno disuelto, turbidez, pH, temperatura). -Estudio de la influencia de los parámetros de calidad de las aguas residuales para múltiples variedades de especies de peces marinos y de agua dulce. -Establecimiento de la sensibilidad relativa de un conjunto de organismos acuáticos a los efluentes y a los contaminantes habituales. -Determinación del nivel de tratamiento de las aguas residuales necesario para alcanzar los límites establecidos por la legislación relativa al control de la contaminación de aguas. -Determinación de la efectividad de los procesos de tratamientos de aguas residuales. -Establecimiento de los límites autorizados de descarga de efluentes. -Determinación del cumplimiento de la legislación relativa a la conservación de la calidad del agua. Estos ensayos proporcionan resultados útiles para la protección de la salud pública y de la vida acuática frente al impacto causado por la descarga de contaminantes a las aguas superficiales. 2-Control de Toxicidad en Aguas 3 Durante las últimas décadas, las medidas de control de la contaminación se circunscribían, principalmente, a los contaminantes convencionales identificados como causantes de la degradación de la calidad del agua (materiales responsables de la demanda de oxígeno, sólidos en suspensión, etc.). Recientemente, se ha prestado mayor atención al control de las substancias tóxicas, especialmente a aquellas presentes en los vertidos de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Las sustancias peligrosas son sustancias tóxicas, dan positivo en ensayos de toxicidad son persistentes (no se degradan) y/o bioacumulables (se acumulan a lo largo de la cadena trófica). Se pueden distinguir dos tipos generales:  Orgánicas: Compuestos organohalogenados, DDT, PCBs, Dioxinas. Y compuestos no organohalogenados.  Inorgánicas: Metales, aniones, ácidos o bases fuertes, gases, etc. La toxicidad es una medida usada para medir el grado tóxico o venenoso de algunos elementos. La toxicidad puede referirse al efecto de esta sobre un organismo completo, como un ser humano, una bacteria o incluso una planta, o a una subestructura. La toxicidad que experimentan los organismos tras los ensayos puede ser de dos tipos:  Toxicidad aguda: efecto adverso (letal o subletal) inducido sobre los organismos de ensayo en prueba durante un periodo de exposición del material de ensayo, usualmente de pocos días. Esta toxicidad es suficientemente alta como para producir una respuesta rápida en los organismos (48 a 96 horas) y no implica necesariamente la muerte.  Toxicidad crónica: efectos tóxicos a largo plazo, que pueden mantenerse en alrededor de la décima parte de la vida media de la especie. Están relacionados con cambios en el metabolismo, crecimiento o capacidad de supervivencia (muerte y reducción de la capacidad reproductora). 2-Control de Toxicidad en Aguas 4 Para evaluar el daño que pueden producir estas sustancias peligrosas en los seres vivos se han desarrollado los denominados test de toxicidad que tienen en cuenta que la toxicidad es función de la concentración del contaminante y del tiempo de exposición al que está sometido el ser vivo al tóxico. 2.2 PARAMETROS DE CONTROL Los parámetros de caracterización de sustancias peligrosas se dividen en dos grandes grupos: 1. Parámetros individuales: expresados en mg/L o µg/L. 2. Parámetros globales: De entre los cuales destacan, la EC50, LD50, LC50, NEANO, CENO, MCEO.  Concentración efectiva (EC50): Concentración del efluente que produce efectos negativos en el 50% de la población de ensayo. Se obtiene a partir de ensayos con bacterias tales como Vibrio fischeri, Daphnia magna y también con algas.  Dosis letal (LD50): Es la dosis de una sustancia ó radiación que resulta mortal para la mitad de un conjunto de animales del ensayo. Obtenida a partir del ensayo con conejos, ratas.  Concentración letal (LC50): Concentración del efluente que produce la muerte del 50% de la población del ensayo. Obtenida a partir del ensayo con cangrejos, peces.  NEANO (nivel de efectos agudos no observados): mayor concentración del efluente para la cual la mortalidad registrada es del 10% o menor. 2-Control de Toxicidad en Aguas 5  CENO (concentración de efectos no observables): mayor concentración continuada medida de un efluente para la cual no se observa reacción crónica alguna de las especies ensayadas.  MCEO (menor concentración que produce efectos observables): se define como la menor concentración del efluente para la que puede observarse algún efecto sobre la especie ensayada. Se determina con técnicas de análisis de varianzas. Para emplear y utilizar los resultados de los ensayos de toxicidad se emplean las unidades de toxicidad (UT), que son las que se utilizan como criterio base:  Unidad tóxica aguda (UT a ): inversa de la dilución del efluente que causa la respuesta aguda al finalizar el periodo de exposición de la especie. Se puede calcular mediante la siguiente ecuación (ec. 1): UT a = 100/CL 50 [1]  Unidad tóxica crónica (UT c ): inversa de la dilución del efluente para la cual no se observa respuesta alguna en ninguno de los organismos al final del periodo de exposición crónica o continúa. Se puede calcular mediante la siguiente ecuación (ec. 2): UT c = 100/CENO [2] Una vez determinados todos los parámetros anteriores, se definen los criterios de calidad de las aguas, que establecen normas y limitaciones en la presencia de agentes tóxicos, para de esta forma asegurar la protección de los usos específicos del agua. Los criterios actuales sobre el control de la calidad del agua intentan proteger las aguas por un lado, de la toxicidad aguda y, por otro de la toxicidad crónica. 2-Control de Toxicidad en Aguas 12 (expresada como partes por uno) que provoca una inhibición del 50% (CE50). Como se observa en la tabla 2.1 una dilución 1/30 de la muestra vertida al alcantarillado que produce el 50% de inhibición corresponde con el límite de concentración instantánea máxima permitida. 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 13 3. CONTAMINACION DE LAS AGUAS POR SUSTANCIAS PELIGROSAS 3.1 INTRODUCCION La primera Directiva Europea (Directiva 76/464/CEE) a tener en cuenta en materia de contaminación causada por determinadas sustancias peligrosas vertidas en el medio acuático de la Comunidad estableció una primera lista, denominada lista I, que incluye determinadas sustancias individuales escogidas principalmente por su toxicidad, persistencia y bioacumulación, con excepción de las biológicamente inofensivas o que se transforman rápidamente en sustancias biológicamente inofensivas, así como una segunda lista, denominada lista II, que incluye sustancias que tienen un efecto perjudicial sobre el medio acuático que sin embargo pueda limitarse a una determinada zona según las características de las aguas receptoras y su localización, que todo vertido de dichas sustancias debería someterse a autorización previa que fije las normas de emisión. Esta Directiva se aplica a las aguas interiores superficiales, aguas marinas territoriales, aguas interiores del litoral y a las aguas subterráneas. A continuación se indican las sustancias o grupos de sustancias incluidas en esta Directiva: Lista I  Compuestos organohalogenados y sustancias individuales que pueden dar origen a compuestos de esta clase en el medio acuático.  Compuestos organofosfóricos.  Compuestos organoestánicos. 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 14  Sustancias en las que esté demostrado su poder cancerígeno en el medio acuático o transmitido por medio de este.  Mercurio y compuestos de mercurio.  Cadmio y compuestos de cadmio.  Aceites minerales persistentes e hidrocarburos de origen petrolífero persistentes.  Materias sintéticas persistentes que puedan flotar, permanecer en suspensión o hundirse y causar perjuicio a cualquier utilización de aguas. Lista II  Metaloides y los metales siguientes y sus compuestos: Zinc, cobre, níquel, cromo, plomo, selenio, arsénico, antimonio, molibdeno, titanio, estaño, bario, berilio, boro, uranio, vanadio, cobalto, talio, teluro, plata.  Biocidas y sus derivados que no figuren en la lista I.  Sustancias que no tengan efectos perjudiciales para el sabor y/o el olor de los productos de consumo humano obtenidos del medio acuático, así como los compuestos que puedan dar origen a sustancias de esta clase en las aguas.  Compuestos organosilícicos tóxicos o persistentes y sustancias que puedan dar origen a compuestos de esta clase en las aguas, excluidos los biológicamente inofensivos o que dentro del agua se transforman rápidamente en sustancias inofensivas. 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 15  Compuestos inorgánicos de fósforo y fósforo elemental.  Aceites minerales no persistentes e hidrocarburos de origen petrolífero no persistentes.  Cianuros y fluoruros.  Sustancias que influyan desfavorablemente en el balance de oxígeno, en particular las siguientes: Amoniaco, nitritos. Como se puede observar en las listas I y II de la Directiva 76/464/CEE existen gran variedad de contaminantes que pueden estar presentes en las aguas, estos contaminantes pueden ser peligrosos en ciertos valores por lo que es necesario tener un control exhaustivo de ellos. Por lo tanto, hay numerosos decretos, directivas, etc. que los controlan. 3.2 LOS PLAGUICIDAS Las sustancias peligrosas seleccionadas en este trabajo de investigación para analizar su toxicidad en aguas son ciertos plaguicidas. A continuación se muestra la clasificación de estas sustancias en función de diversos criterios. 3.2.1 CLASIFICACION Los plaguicidas se clasifican atendiendo a varios criterios:  Según su actividad biológica.  Según su naturaleza química.  Según su toxicidad. 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 16 A continuación se describen dichas clasificaciones: Clasificación según actividad biológica: Según su efecto sobre distintos seres vivos los plaguicidas se pueden clasificar principalmente en:  Insecticidas: son tóxicos para los insectos.  Herbicidas: atacan las malas hierbas.  Acaricidas: son tóxicos para los ácaros.  Fungicidas: son tóxicos para los hongos.  Nematicidas: son tóxicos para los nematodos (gusanos parásitos del hombre).  Rodenticidas: causan la muerte a roedores.  Avicidas: causan la muerte a aves.  Molusquicidas: eliminan los moluscos.  Bactericidas: inhiben el crecimiento de microorganismos. Clasificación según naturaleza química: Según la estructura química de los plaguicidas, éstos pueden ser principalmente clasificados en: 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 17  Organoclorados: son compuestos que contienen átomos de cloro en su molécula y son muy utilizados contra insectos actuando sobre su sistema nervioso.  Organofosforados: son ésteres o amidas derivadas del ácido fosfórico, tiofosfórico, ditiofosfórico, fosfónico y fosfínico. Su mayor actividad es como insecticida, aunque también poseen actividad herbicida, fungicida y nematicida. Su acción se basa en la inhibición de la acetilcolinesterasa, enzima que se encuentra en el sistema nervioso de los insectos.  Carbamatos: son derivados del ácido carbámico, tiocarbámico y ditiocarbámico. Presentan su mayor actividad como insecticidas y herbicidas y su acción también se basa en la inhibición de la acetilcolinesterasa.  Derivados de la urea y tiourea: Su mayor actividad es como herbicidas. Actúan inhibiendo la reacción de Hill y, por tanto, impidiendo el proceso normal de fotosíntesis.  Compuestos heterocíclicos: Su mayor actividad es como herbicidas. Su acción se basa en el bloqueo de la fotosíntesis reduciendo la fijación de CO 2 e inhibiendo la síntesis de glucosa.  Compuestos inorgánicos: son moléculas inorgánicas que principalmente contienen cobre, azufre y mercurio. Clasificación según toxicidad: Esta clasificación se realiza según la toxicidad relativa de los plaguicidas (LD50), dosis letal media, que se corresponde con la cantidad de plaguicida capaz de causar la muerte 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 18 al 50% de los individuos que constituyen el lote del ensayo. Según este valor, los plaguicidas se pueden clasificar en:  Supertóxicos: LD50 < 5 mg/kg.  Extremadamente tóxicos: LD50 5-50 mg/kg.  Muy tóxicos: LD50 50-500 mg/kg.  Moderadamente tóxicos: LD50 500-5000 mg/kg.  Ligeramente tóxicos: LD50 5-15 g/kg.  Prácticamente no tóxicos: LD50 > 15 g/kg Tabla 3.2. Clasificación de los plaguicidas estudiados. Plaguicida Actividad Biológica Naturaleza Química Toxicidad Alacloro Herbicida Organoclorado Moderadamente tóxico Aldrin Insecticida Organoclorado Muy toxico Ametrina Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Atrazina Herbicida Organoclorado Moderadamente tóxico Clorpirifos Insecticida Organoclorado Muy toxico Clorfenvinfos Insecticida Organoclorado Extremadamente tóxico pp´-DDD Insecticida Organoclorado Moderadamente tóxico pp´-DDE Insecticida Organoclorado Moderadamente tóxico op´-DDT Insecticida Organoclorado Muy toxico pp´-DDT Insecticida Organoclorado Muy toxico Desetilaatrazina Herbicida Organoclorado Moderadamente tóxico 3,4-Dicloroanilina Herbicida Organoclorado Moderadamente tóxico 4,4-Diclorobenzofenona Acaricida Organoclorado Moderadamente tóxico Dicofol Acaricida Organoclorado Moderadamente tóxico Dieldrin Insecticida Organoclorado Extremadamente tóxico Dimetoato Insecticida Organoclorado Muy toxico Diuron Herbicida Derivado de la Urea Moderadamente tóxico α-Endosulfan Insecticida Organoclorado Muy toxico Endosulfan-sulfato Insecticida Organoclorado Muy toxico Endrin Insecticida Organoclorado Extremadamente tóxico 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 19 Tabla 3.2. Continuación. α-HCH Insecticida Organoclorado Muy toxico β -HCH Insecticida Organoclorado Moderadamente tóxico χ-HCH Insecticida Organoclorado Muy toxico δ-HCH Insecticida Organoclorado Moderadamente tóxico Heptacloro Insecticida Organoclorado Muy toxico Heptacloro epoxi A Insecticida Organoclorado Muy toxico Heptacloro epoxi B Insecticida Organoclorado Muy toxico Hexaclorobenceno Fungicida Organoclorado Muy toxico Isodrín Insecticida Organoclorado Extremadamente tóxico 4-IsopropilAnilina Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Isoproturón Herbicida Derivado de la Urea Moderadamente tóxico Metolacloro Herbicida Organoclorado Moderadamente tóxico Metoxicloro Insecticida Organoclorado Ligeramente tóxico Molinato Herbicida Carbamato Muy toxico Paration metil Acaricida/Insecticida Organoclorado Extremadamente tóxico Paration etil Acaricida/Insecticida Organofosforado Extremadamente tóxico Prometón Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Prometrina Herbicida Compuesto heterocíclico Ligeramente tóxico Propazina Herbicida Compuesto heterocíclico Ligeramente tóxico Simazina Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Terbutilazina Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Terbutrina Herbicida Compuesto heterocíclico Moderadamente tóxico Tetradifón Acaricida/Insecticida Organoclorado Ligeramente tóxico Trifluralina Herbicida Compuesto heterocíclico Ligeramente tóxico En el Anexo II de la memoria se muestran las propiedades y estructura química de los plaguicidas estudiados. 3.2.2 PRESENCIA DE PLAGUICIDAS EN AGUAS De especial interés es la presencia de plaguicidas en aguas superficiales y en aguas residuales depuradas debido al uso final de estas aguas. Las aguas superficiales son una fuente importante de aguas de abastecimiento humano y las aguas residuales urbanas pueden ser utilizadas para muchos usos según su calidad tal y como marca el Real 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 20 Decreto 1620/2007 por el que se establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. 3.2.2.1 AGUAS SUPERFICIALES La presencia de plaguicidas en aguas superficiales se debe principalmente a contaminación difusa debido a su uso en jardinería, agricultura etc. que se vierten de manera incontrolada. Las prácticas más contaminantes son:  Fertilización, en especial con abonos nitrogenados.  Control de plagas, enfermedades y malezas, con productos aplicados directamente al suelo.  Labranza del suelo.  Riego como precursor de erosión y potenciador de la contaminación difusa.  Manejo del ganado. 3.2.2.2 AGUAS RESIDUALES URBANAS DEPURADAS En general, la composición de las aguas de salida de las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDARs) depende fundamentalmente de los aportes industriales al vertido urbano y del tipo de tratamiento al que han sido sometidas en la EDAR correspondiente. A pesar de ello, se puede decir que en general, estas aguas se caracterizan por:  La presencia de altas concentraciones de sólidos en suspensión. 3-Contaminación de las Aguas por Sustancias Peligrosas 21  Elevada turbidez.  La presencia de gran variedad de gérmenes patógenos. Es el factor de riesgo más importante asociado la reutilización del agua. Supone la exposición del hombre a agentes biológicos como son bacterias patógenas, helmintos, protozoos o virus entéricos.  La presencia de contaminantes inorgánicos, como cloruros, nitrógeno y fósforo (en concentración variable según proceda de instalaciones con o sin eliminación de nutrientes) y en algunos casos de metales pesados, no eliminados en el tratamiento de depuración y cuya concentración depende en gran medida de la componente industrial que tenga el vertido urbano.  La presencia de materia orgánica. Dentro de este grupo genérico, se distingue: -Materia orgánica No Peligrosa: Formada mayoritariamente por compuestos que no han sido degradados en las instalaciones de depuración, bien por que son refractarios al tratamiento o bien porque no se han alcanzado rendimientos del 100%; se trata de sustancias orgánicas como los ácidos carbóxilicos, ésteres, proteínas, hidratos de carbono, aminoácidos, alcoholes polihidroxilados, etc. -Materia orgánica Peligrosa: sustancias persistentes que no han sido eliminadas en el tratamiento de depuración, que si bien están presentes en una muy baja concentración, pueden resultar un problema ambiental y sanitario. Dentro de este grupo se encuentran los plaguicidas. 4-Procedimiento Experimental 28 Tabla 4.1. Dosis de los distintos reactivos añadidos para simular un agua de características similares a la de entrada de una EDAR. Directiva 82/243/CEE. Reactivo Concentración (mg/L) Peptona de carne 116 Extracto de carne 110 Urea 30 Glucosa 200 NaCl 7 K 2 HPO 4 28 CaCl 2 2H 2 O 4 MgSO 4 7H 2 O 2 4.1.3 FORTIFICACION DE LAS MUESTRAS: Las muestras utilizadas en este proyecto fin de carrera se fortifican con plaguicidas con el objeto de poder determinar de manera más precisa su evolución en los tratamientos aplicados así como para la puesta en marcha del análisis de toxicidad. Fortificación aguas superficiales El agua superficial proveniente del Canal es fortificada con una mezcla de 44 plaguicidas. Los plaguicidas se han seleccionado teniendo en cuenta cuales son aquellos que están presentes en la cuenca del Ebro como consecuencia de la actividad agrícola. Las concentraciones seleccionadas se basan en estudios previos realizados en el grupo de investigación “Calidad y Tratamiento de las aguas”. En la tabla 4.2 se muestran las diferentes concentraciones utilizadas para la fortificación. 4-Procedimiento Experimental 29 Tabla 4.2. Concentraciones de los plaguicidas presentes en las muestras fortificadas. Plaguicida Concentración (ng/L) Alacloro 505 Aldrin 512 Ametrina 501 Atrazina 551 Clorpirifos 520 Clorfenvinfos 492 pp´-DDD 510 pp´-DDE 480 op´-DDT 482 pp´-DDT 482 Desetilaatrazina 593 3,4-Dicloroanilina 658 4,4-Diclorobenzofenona 519 Dicofol 568 Dieldrin 508 Dimetoato 608 Diuron 501 α-Endosulfan 475 Endosulfan-sulfato 483 Endrin 486 α-HCH 511 β -HCH 519 χ-HCH 521 δ-HCH 504 Heptacloro 491 Heptacloro epoxi A 495 Heptacloro epoxi B 487 Hexaclorobenceno 503 Isodrín 516 4-IsopropilAnilina 512 Isoproturón 521 Metolacloro 524 Metoxicloro 519 Molinato 551 Paration metil 508 4-Procedimiento Experimental 30 Tabla 4.2. Continuación. Paration etil 507 Prometón 492 Prometrina 489 Propazina 508 Simazina 554 Terbutilazina 514 Terbutrina 514 Tetradifón 493 Trifluralina 566 La suma de las concentraciones de todos los plaguicidas corresponde con la concentración final de estos contaminantes peligrosos y es igual a 22.7 µg/L. Fortificación aguas residuales urbanas depuradas El agua de salida de la planta piloto no contiene sustancias peligrosas. El agua de salida de una EDAR real puede contener sustancias peligrosas. Por ello, las muestras sintéticas obtenidas se fortifican con plaguicidas. Las concentraciones elegidas para fortificar las muestras sintéticas garantizan su presencia antes del tratamiento y así se puede estudiar la toxicidad producida en el agua. Los plaguicidas añadidos son seleccionados como consecuencia de estudios de caracterización de aguas de salida de Edar realizados en el grupo de investigación “Calidad y Tratamiento de las aguas”. Los plaguicidas son: 3,4-dicloroanilina, terbutilazina, metolacloro, clorpirifos, dimetoato, terbutrina, simazina, clorfenvinfos e isoproturo; cada uno de ellos se fortifica con 0.5 µg/L. Las características de todas estas sustancias peligrosas se encuentran en el Anexo II. 4-Procedimiento Experimental 31 4.2 METODOLOGIA ANALITICA 4.2.1 ANALISIS DE TOXICIDAD MEDIANTE TEST DE BIOLUMINISCENCIA 4.2.1.1 MATERIALES Y REACTIVOS Los reactivos son los siguientes:  Bacterias Vibrio Fischeri LCK 480.  Solución salina de NaCl al 2% de Dr Lange.  Solución salina de NaCl al 7.5% Dr Lange.  Dicromato potásico sólido puro de PANREAC. Algunos de los reactivos tienen un coste elevado (como es el caso de las bacterias) y por lo tanto se debe rentabilizar su uso. Tanto las bacterias, la solución salina de NaCl al 7.5% y 2% son proporcionadas por Hach-Lange. Los materiales que se utilizan son:  Micropipetas y puntas de plástico, tanto estériles (a utilizar con las bacterias) como no estériles.  Tubos de ensayo adecuados para Lumistox 300.  Matraces aforados. 4-Procedimiento Experimental 32 4.2.1.2 DESCRIPCION DEL EQUIPO LUMISTOX 300 El lumistox 300 es un equipo de medición concebido a su vez como unidad de medida y análisis para el test de bacterias luminosas. En combinación con el incubador lumistherm cumple los requisitos técnicos exigidos por la norma internacional ISO DIS 11348 sobre la determinación de la inhibición de la bacteria Vibrio Fischeri en muestras acuosas. Además es posible realizar con este equipo test de bacterias luminosas destinados al análisis de funcionamiento, así como el test crónico lumis-24-tox (LCK480). El lumistox 300 dispone, igual que un ordenador, de un sistema operativo propio. Al conectar el equipo, éste arranca igual que un ordenador mediante un disquete que contiene todos los datos y programas necesarios para su funcionamiento. En la figura 4.2 se muestra una fotografía del lumistox 300 y del lumitherm. Figura 4.2. Lumistox 300 y lumistherm (bloque incubador) para el análisis de toxicidad. Mediante una función fotométrica incorporada y una rutina de medición y análisis, el lumistox 300 reconoce los diversos efectos del color en los test de bacterias luminosas, y los tiene en cuenta a la hora de calcular los resultados del test. La función fotométrica permite además realizar una estimación previa de la influencia del color, permitiendo determinar, así mismo, la extinción (como OD = densidad óptica) de las suspensiones 4-Procedimiento Experimental 33 bacteriológicas para valorar inhibiciones de crecimiento en el test de bacterias luminosas lumis-24-tox (LCK480). Antes de realizar cualquier test de bacterias luminosas, el lumistox 300 comprueba la funcionalidad de todo el trayecto de medición mediante un control automático de referencias. En la figura 4.3 se muestra un esquema del equipo y las partes que lo componen. Figura 4.3. Descripción de los componentes del Lumistox 300. 1 Toma de tierra. 2 Conector de red con fusible. 3 Pantalla de cristal líquido 4 Teclado numérico 4-Procedimiento Experimental 34 5 Conector serie 9 polos. 6 Conector paralelo 25 polos. 7 Disquetera de 3,5’’. 8 Placa de características. 9 Pozo para cubetas. F1-F4 Teclas de función. 4.2.1.3 PROCEDIMIENTO DE TRABAJO CON EL LUMISTOX 300 Para el uso adecuado del equipo y el análisis de toxicidad es necesario seguir los pasos que se indican a continuación: 1. Encender la impresora o el PC. 2. Introducir el disquete del sistema en el lumistox 300. 3. Poner en marcha el equipo lumistox 300. 4. Conectar el bloque incubador lumistherm. 5. Esperar 30 minutos de “tiempo de calentamiento”. 6. Durante el tiempo de calentamiento: -Seleccionar el test de bacterias luminosas y preparar las bacterias según las instrucciones del ensayo. -Añadir NaCl a la muestra y controlar los valores de pH . -Si fuera necesario, fabricar una serie de diluciones de la muestra. 7. Conectar la corrección automática de color, si fuera preciso. 4-Procedimiento Experimental 35 8. Seleccionar en el lumistox 300 el modo de análisis deseado (Valor GL, EC ó IREL) o el test a emplear (por ejemplo LCK480, test de bacterias utilizado en esta investigación). 9. Introducir las preconfiguraciones necesarias en el lumistox 300. 10. Ejecutar el ensayo según las prescripciones e instrucciones de menú del lumistox 300. 11. Leer el resultado. 12. Cerrar la cámara de medida. 4.2.1.4 DETERMINACION DE LA EC50 El valor EC indica la concentración de una muestra que provoca un 50% de inhibición en el test de bacterias luminosas. El lumistox 300 sólo será capaz de calcular un valor de EC, si éste se encuentra dentro de las concentraciones para las que se midieron inhibiciones del 10 al 90% en el test. 4.2.1.5 DETERMINACION DE LA INTENSIDAD LUMINOSA RELATIVA IREL En este modo de análisis, que es el que se utiliza en esta investigación para la determinación del % de inhibición de las Vibrio Fischeri, el lumistox 300 realiza la función de luminómetro para la determinación de la intensidad luminosa de las muestras. El máximo de emisión de la muestra a medir deberá situarse alrededor de los 480 nm. 4-Procedimiento Experimental 36 Seleccionar en el 3er nivel del menú principal el modo de análisis <Irel> Medir la muestra. Aparece el valor de la intensidad luminosa. Para determinar el valor de EC en el test de bacterias luminosas se requiere tres o más etapas diluidas de una muestra. A continuación se explica el procedimiento de dilución utilizado.  Serie de dilución geométrica La muestra se diluye sucesivamente por el factor 2. Se forma así una serie de diluciones de la muestra: muestra sin diluir 1:2 1:4 1:8 1:16 etc muestra diluida Durante el test de bacterias luminosas se mezcla una parte de la muestra con una parte igual de las bacterias luminosas en suspensión. A las diluciones del test se añade así otra dilución más de las muestras diluidas descritas antes. 4-Procedimiento Experimental 37 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 etc diluciones en el test Se colocan las cubetas de medición lumistox necesarias en la fila A del lumistherm (Figura 4.4). En el lumistherm, se pueden llegar a colocar 8 cubetas de medición de 10 disponibles, las dos sobrantes se reservan para la solución de control y para el patrón. Figura 4.4. Ilustración de la serie de dilución geométrica. 4-Procedimiento Experimental 44 4.3.2 EXPERIMENTACION CON PROCESOS DE OXIDACION AVANZADA Antes de realizar el experimento fotocatalítico es necesario ajustar el pH de la muestra a pH básico mediante la adición de NaOH. Seguidamente, se añaden los reactivos correspondientes en cada caso y se introduce la muestra en la cámara solar con agitación durante el tiempo de tratamiento. Posteriormente la muestra se deja reposar, con ello se consigue que decante el TiO2. Las condiciones de trabajo seleccionadas son 1g/L de TiO 2 , H 2 O 2 10nM y 30 minutos de tratamiento. Estas condiciones se seleccionan en base a estudios previos realizados en el grupo de investigación “Calidad y Tratamiento de las aguas” de la Universidad de Zaragoza. Los tratamientos que se van a aplicar para los dos tipos de agua son: procesos de UV/TiO 2 y procesos de UV/TiO 2 /H 2 O 2 . 5-Resultados 45 5. RESULTADOS En este capítulo se muestran tanto los resultados de la puesta en marcha del método como los análisis de toxicidad de muestras acuosas. 5.1 PUESTA EN MARCHA DEL EQUIPO En la puesta en marcha del equipo se siguieron los siguientes pasos: 5.1.1 P REPARACIÓN DEL PATRÓN . Antes de comenzar con el ensayo, y con el fin de llevar a cabo las mediciones correctamente, se tiene que preparar un patrón. Hach-Lange recomienda una serie de patrones y el rango de % de inhibición en el que se debe de situar el patrón experimental para que el ensayo sea correcto. Se utiliza un patrón de Dicromato de Potasio (K 2 Cr 2 O 7 ) de 4 mg/L cuyo rango marcado por Hach-Lange es de 20-80% de inhibición. Se parte de K 2 Cr 2 O 7 sólido puro y se prepara una disolución de 8000 mg/L. 8000 mg/L x 50x10 -3 L = 400 mg  Se toma 0.4 g de K 2 Cr 2 O 7 a enrasar con agua destilada en un matraz aforado de 50mL. A partir de la disolución de 8000 mg/L se prepara una de 8 mg/L, 8 mg/L x 50x10 -3 L = 8000 mg/L x V 2  V 2 = 50µL enrasando con agua destilada en un matraz aforado de 50mL. 5-Resultados 46 Se prepara una disolución de 8 ppm de dicromato potásico pero en realidad se va a medir el % de inhibición de una de 4 ppm de dicromato potásico ya que durante el ensayo se produce una dilución del 50% del patrón y del blanco. El patrón debe prepararse nuevamente cada semana. Ejemplo de medición de una solución patrón: Tabla 5.1. Ejemplo de medición de un patrón. Muestra Posición en el Lumistherm Io I15 fk Ict % Inhibición Patrón Replica 1 (B1) 1796 1376 1,10 1974 30,3 Replica 2 (C1) 1592 1288 1,10 1750 26,4 El resultado del análisis del patrón que muestra la tabla 5.1 generó una inhibición del 28%, tal y como indica el manual para el buen funcionamiento del equipo. 5.1.2 A CONDICIONAMIENTO DEL PATRÓN Y DE LAS MUESTRAS . Para que las bacterias sobrevivan tienen que tener un medio salino (2% de NaCl), por lo que el patrón se debe salar. A la disolución de 8 ppm de dicromato que se tiene en un matraz aforado de 50mL, se calcula el volumen de NaCl al 2% a añadir: 50mL x 0.02 = 1mL de NaCl al 2% Hach-Lange suministra NaCl al 7.5%, por lo tanto el volumen a añadir es: (1 x 100)/ 7.5 = 13.3 mL de NaCl al 7.5% A las muestras también se les debe añadir NaCl al 2%. 5-Resultados 47 5.1.3 B LANCO . En lo que respecta al blanco, no es necesaria su preparación ya que Hach-Lange proporciona NaCl al 2% exclusivamente para el uso como blanco. 5.1.4 A CONDICIONAMIENTO DE LAS BACTERIAS V IBRIO F ISCHERI . El lumistox 300 consta de 10 celdillas, 8 para muestras a analizar, otra para el blanco y otra para el patrón. Al lado de estas existen dos celdas de diámetro más grande que se utilizan para atemperar las bacterias y el líquido de dilución. El líquido de dilución procedente del congelador se introduce en una de las celdas grandes del aparato cuando el lumistox 300 tiene el sensor de temperatura en verde (ha alcanzado una temperatura de aproximadamente 15ºC). (Ver Figura 5.1). Se deja atemperar durante 15 minutos. A continuación, se sacan las bacterias del congelador y se dejan durante 2 minutos en la otra celda de diámetro más grande del Lumistox 300. Figura 5.1. Lumistherm. Se añade a las bacterias 0.5 mL de líquido de dilución. Se pipetean con punta estéril las bacterias junto con esos 0.5 mL que se han añadido unas 3 o 4 veces con el fin de activarlas, hasta que se forme una suspensión perfecta, manteniendo luego el vial al menos 10 minutos en el aparato para atemperar. 5-Resultados 48 Se pasan las bacterias (vial pequeño) al vial grande del liquido de dilución, pipeteando varias veces su contenido y se homogeniza volteando varias veces suavemente. En la figura 5.2 se observan los viales de las bacterias y del líquido de dilución. Figura 5.2. Bacterias y líquido de dilución. 5.1.5 M ÉTODO OPERATIVO CON I SOPROPANOL Y H 2 O 2 ( PUESTA EN MARCHA ). En la puesta en marcha del Lumistox 300, en primer lugar se procedió a calcular el porcentaje de inhibición con el Lumistox 300 utilizando ispropanol (PANREAC 99.8% en peso) y agua oxigenada (PANREAC 30% en volumen) como sustancia modelo. Se seleccionó este alcohol y este peróxido para la puesta en marcha del equipo debido a que son desinfectantes típicos, utilizados para destruir microorganismos. Se utilizó como blanco NaCl al 2% , con un 2% de concentración salina en todas las muestras. El pH de todas las muestras comprendía entre 6-8. El procedimiento seguido fue el de una serie de diluciones de forma geométrica como el explicado en apartado 4.2.1.5 del capítulo “Procedimiento Experimental”. Se realizaron ensayos realizando diluciones de las sustancias modelo (isopropanol y peróxido de hidrógeno) para la puesta en marcha del equipo. A continuación se muestran los resultados de los ensayos realizados. 5-Resultados 49 ENSAYO 1 UTILIZANDO ISOPROPANOL COMO SUSTANCIA MODELO. Para este ensayo se selecciona la sustancia modelo al 50%. En la fila A del lumistherm se coloca: -En la columna 1: 3 mL de solución salina de NaCl al 2% que será el blanco. -En la columna 2: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 3: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 4: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 5: 3 mL de la muestra problema. Se realizan las diluciones del isopropanol de acuerdo a lo descrito en el apartado 4.2.1.5. El resultado final es el siguiente: -En la celdilla 1 hay 3 mL de solución salina que será el blanco. -En la celdilla 2 hay 3 mL de solución de patrón de dicromato de potasio. -En la celdilla 2 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 6.25%. -En la celdilla 3 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 12.5%. -En la celdilla 4 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 25%. -En la celdilla 5 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 50%. Se procede a la medición de la luminiscencia tal y como se describe en el apartado 4.2.1.5. Los resultados obtenidos son los siguientes: 5-Resultados 50 Tabla 5.2. % Inhibición de Isopropanol a diferentes concentraciones. Muestra Posición Io I 15 fk Ict =fk medio*Io % Inhibición= (Ict-I 15 )*100/Ict % Inhibición media Blanco Replica 1 (B1) 41,6 38,9 0,93 40,352 3,60 -0,33 Replica 2 (C1) 105,8 107,0 1,01 102,626 -4,26 Patrón Replica 1 (B2) 1495,0 1076,0 1450,15 25,80 25,75 Replica 2 (C2) 1418,0 1022,0 1375,46 25,70 6,25 % Isopropanol Replica 1 (B2) 38,9 18,0 37,733 52,30 48,25 Replica 2 (C2) 111,8 60,5 108,446 44,21 12,5% Isopropanol Replica 1 (B3) 57,5 10,4 55,775 81,35 81,15 Replica 2 (C3) 115,8 21,4 112,326 80,95 25% Isopropanol Replica 1 (B4) 87 14,1 84,39 83,29 85,72 Replica 2 (C4) 132,3 15,2 128,331 88,16 50% Isopropanol Replica 1 (B5) 65,8 3,0 63,826 95,30 87,75 Replica 2 (C5) 70,8 13,6 68,676 80,20 fk medio 0,97 5-Resultados 51 Los resultados reflejados en la tabla 5.2 muestran una buena estabilidad del equipo como refleja el blanco y el patrón. Por otro lado, de las muestras estudiadas, diluciones de isopropanol del 50, 25, 12.5 y 6.25% muestran inhibiciones del 88, 86, 81 y 43% respectivamente. Por lo tanto una concentración de 48.75 g/L produce una inhibición de del 50% aproximadamente. Por lo tanto la EC50 es igual a 49000 mg/L. Si comparamos con el límite que aparece en el Decreto 78/2004 sobre toxicidad (Dilución 1/15 ó dilución 1/30 que produce el 50% de inhibición) cabe destacar que esta sustancia es poco toxica en el agua. ENSAYO 2 UTILIZANDO ISOPROPANOL COMO SUSTANCIA MODELO EN OTRAS CONCENTRACIONES. Para este ensayo se selecciona la sustancia modelo diluida al 0.11%, con una concentración inicial de 858 mg/L. En la fila A del lumistherm se coloca: -En la columna 1: 3 mL de solución salina de NaCl al 2% que será el blanco. -En la columna 2: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 3: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 4: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 5: 3 mL de la muestra problema. Se realizan las diluciones del isopropanol de acuerdo a lo descrito en el apartado 4.2.1.5. El resultado final es el siguiente: -En la celdilla 1 hay 3 mL de solución salina que será el blanco. -En la celdilla 2 hay 3 mL de solución de patrón de dicromato de potasio. -En la celdilla 2 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 0.027%. -En la celdilla 3 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 0.055%. -En la celdilla 4 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 0.08%. -En la celdilla 5 hay 1.5 mL de muestra de isopropanol al 0.11%. Se procede a la medición de la luminiscencia tal y como se describe en el apartado 4.2.1.5. Los resultados obtenidos son los siguientes: 5-Resultados 52 Tabla 5.3. % de Inhibición de Isopropanol a diferentes concentraciones. Muestra Posición Io I 15 fk Ict =fk medio*Io % inhibición= (Ict-I 15 )*100/Ict % Inhibición media Blanco Replica 1 (B1) 121,2 117,5 0,97 121,2 3,05 0,18 Replica 2 (C1) 111,2 114,2 1,03 111,2 -2,70 0,027% Isopropanol Replica 1 (B3) 137,2 122,1 137,2 11,01 9,83 Replica 2 (C3) 119,1 108,8 119,1 8,65 0,055% Isopropanol Replica 1 (B4) 112,8 101,2 112,8 10,28 11,39 Replica 2 (C4) 130,5 114,2 130,5 12,49 0,08 % Isopropanol Replica 1 (B5) 170,1 147,5 170,1 13,29 16,05 Replica 2 (C5) 170,6 138,5 170,6 18,82 0,11% Isopropanol Replica 1 (B6) 143,6 119,1 143,6 17,06 19,34 Replica 2 (C6) 140,6 110,2 140,6 21,62 fk medio 1,0 5-Resultados 53 Los resultados reflejados en la tabla 5.3 muestran una buena estabilidad del equipo como refleja el blanco, no se realizó la medición del patrón ya que se realizaron los ensayos de la tabla 5.2 y 5.3 seguidos. Por otro lado, de las muestras estudiadas, diluciones de isopropanol del 0.11, 0.08, 0.055, 0.027% muestran inhibiciones del 10, 11, 16 y 19% respectivamente. Conforme menor dilución de la muestra, mayor porcentaje de inhibición, siendo por tanto más tóxica. ENSAYO 3 UTILIZANDO PEROXIDO DE HIDROGENO COMO SUSTANCIA MODELO. Para este ensayo se utiliza peróxido de hidrógeno al 30% de pureza (Panreac). Se llevan a cabo tres diluciones, al 50% (dilución final del 15%), al 25% (dilución final del 7.5%) y al 12.5% (dilución final del 3.75%). En la fila A del lumistherm se coloca: -En la columna 1: 3 mL de solución salina de NaCl al 2% que será el blanco. -En la columna 2: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 3: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 4: 1.5 mL de solución salina de NaCl al 2% -En la columna 5: 3 mL de la muestra problema. Se realizan las diluciones del peróxido de acuerdo a lo descrito en el apartado 4.2.1.5. El resultado final es el siguiente: -En la celdilla 1 hay 3 mL de solución salina que será el blanco. -En la celdilla 2 hay 3 mL de solución de patrón de dicromato de potasio. -En la celdilla 2 hay 1.5 mL de muestra de H 2 O 2 diluido al 12.5% (dilución final del 3,75%). -En la celdilla 3 hay 1.5 mL de muestra de H 2 O 2 diluido al 25% (dilución final del 7,5%). -En la celdilla 4 hay 1.5 mL de muestra de H 2 O 2 diluido al 50% (dilución final del 15%). -En la celdilla 5 hay 1.5 mL de muestra de H 2 O 2 sin diluir (dilución en botella del 30%). Se procede a la medición de la luminiscencia tal y como se describe en el apartado 4.2.1.5. Los resultados obtenidos son los siguientes: 5-Resultados 60 Figura 5.2. Tabla a modo de ejemplo para el cálculo del % de Inhibición de una muestra de agua. Donde: I 0 es el valor de luminiscencia emitido a tiempo 0. I 15 es el valor de luminiscencia emitido a los 15 minutos. Itk/I0k son el valor de luminiscencia inicial y final de la soluciones de control Fk es el factor de corrección. Ict es la intensidad inicial de la solución, corregida por el factor de corrección. % inhibición es el porcentaje de inhibición de la luminiscencia después de un periodo de incubación, t. Aguas superficiales En la tabla 5.6 se recogen los valores de toxicidad obtenidos en las muestras iniciales y en las muestras tratadas mediante procesos UV/TiO 2 . 5-Resultados 61 Tabla 5.6. Toxicidad de las muestras de agua superficial. Posición I o I 15 fk Ict =fk medio*Io % inhibición= (Ict-I 15 )*100/Ict % Inhibicion media Blanco Replica 1 (B1) 1518 1475 0,97 1472,46 -0,17 0,8 Replica 2 (C1) 1494 1475 0,99 1449,18 -1,78 Patrón Replica 1 (B2) 1463 882,3 1419,11 37,83 37 Replica 2 (C2) 1522 959,2 1476,34 35,03 Inicial fortificada con plaguicidas Replica 1 (B3) 1475 989,8 1430,75 30,82 31 Replica 2 (C3) 1446 974,2 1402,62 30,54 UV/TiO 2 Replica 1 (B4) 1528 1117 1482,16 24,64 22 Replica 2 (C4) 1468 1166 1423,96 18,12 UV/TiO2/H 2 O 2 Replica 1 (B5) 1524 43,96 1478,28 97,03 97 Replica 2 (C5) 1502 43,45 1456,94 97,02 fk medio 0,97 5-Resultados 62 Se observa que la muestra inicial de agua presenta un 31% de inhibición, por lo que principalmente los plaguicidas presentes producen una inhibición del 31%. La concentración total de plaguicidas presente en la muestra es de 22.7µg/L. Al tratar esta agua con el proceso UV/TiO 2 la muestra es menos tóxica puesto que baja el porcentaje de inhibición reduciendose la toxicidad en un 29%. Esto se debe a la degradación de los plaguicidas mediante esta técnica. Por otro lado, al utilizar el proceso UV/TiO 2 /H 2 O 2 , se deduce que el peróxido de hidrógeno hace aumentar la toxicidad de la muestra ya que se produce un aumento considerable de porcentaje de inhibición. Como ya se conoce, el peróxido de hidrógeno es un desifectante por lo que produce una inhibición casi total de las bacterias Vibrio Fischeri. El análisis se volvió a realizar eliminando previamente el H 2 O 2 y se obtuvo un % de inhibición del 71%, por lo que se puede decir que el peróxido produce toxicidad que interfiere en el ensayo. Aguas de salida de depuradora En este ensayo se procedió de manera similar que con las muestras de “aguas superficiales”, los resultados se muestran en la tabla 5.7, dicha tabla no contiene datos del análisis del blanco y del patrón ya que los ensayos se llevaron a cabo en una misma tanda (los análisis de los dos tipos de aguas en una misma tanda), aunque se expresen los resultados en distintas tablas. 5-Resultados 63 Tabla 5.6. Toxicidad de las muestras de agua de salida de depuradora. Posición I o I 15 fk Ict =fk medio*Io % inhibición= (Ict-I 15 )*100/Ict % Inhibicion media Inicial fortificada con plaguicidas Replica 1 (B6) 2156 1344 0,97 2091,32 35,73 36 Replica 2 (C6) 2267 1387 0,99 2198,99 36,93 UV/TiO 2 Replica 1 (B7) 2180 1390 2114,60 34,27 24 Replica 2 (C7) 2122 1767 2058,34 14,15 UV/TiO2/H 2 O 2 Replica 1 (B8) 1422 7,62 1379,34 99,45 99 Replica 2 (C8) 2165 30,53 2100,05 98,55 fk medio 0,97 5-Resultados 64 Como se observa en la tabla 5.7, el agua de salida de depuradora produce una toxicidad en el agua (medida como % inhibición) del 36%. Por otro lado, la muestra que ha sido sometida al proceso UV/TiO 2 presenta una toxicidad del 24%, por lo que la disminución de toxicidad es apreciable. En el caso de la muestra tratada con mediante UV/TiO 2 /H 2 O 2 e igual que sucedía con la muestra superficial, la inhibición es total, como consecuencia de la presencia del H 2 O 2 . Esta muestra se volvió a analizar eliminando previamente el H 2 O 2 y el resultado obtenido fue del 82%, por lo que ocurre como en el caso de las aguas superficiales, el peróxido de hidrógeno produce una toxicidad en la muestra que interfiere en la medida. 5.3 COMPARATIVA ENTRE MUESTRAS INCIALES FORTIFICADAS Y MUESTRAS TRATADAS En cuanto a las muestras iniciales fortificadas, cabe destacar que el porcentaje de inhibición de las aguas de salida de depuradora es más elevado que el de las superficiales, la diferencia no es muy considerable, pero podemos encontrar una razon de este aumento. En las aguas de salida de depuradora puede existir un mayor número de elementos tóxicos, sin tener en cuenta la fortificación con plaguicidas, que no pueden ser depurados por las tecnicas convencionales de depuración que existen en la actualidad, haciendo que la toxicidad aumente. En cuanto a las muestras tratadas, se observa que utilizando el proceso UV/TiO 2 la toxicidad disminuye en ambos tipos de muestras, también se ve que utilizando el proceso UV/TiO 2 /H 2 O 2 el peróxido hace que el % de inhibición aumente y por tanto la toxicidad. También se observa que si inhibimos el peróxido antes de realizar el análisis la toxicidad el porcentaje de inhibición disminuye, por lo que se concluye que el peróxido es una interferencia en la medida de la toxicidad. 6-Conclusiones 65 6. CONCLUSIONES Las conclusiones extraídas del trabajo realizado en este PFC se resumen a continuación: -Los métodos existentes para analizar toxicidad en aguas son variados pero todos ellos tienen la problemática de trabajar con bacterias que son sensibles a muchos factores. -Dentro de las técnicas existentes, la utilización de la bacteria Vibrio Fischeri para analizar la toxicidad de aguas es recomendable, ya que el estudio realizado en este proyecto final de carrera muestra que el método analítico puesto en marcha es bastante repetitivo medianate el control del blanco. -La puesta en marcha con desifectantes como el isopropanol y el peróxido de hidrógeno indicó una buena repetitividad de los ensayos. -La utilización de la bacteria Vibrio Fischeri en el análisis de toxicidad de muestras reales es apta, así como para el control de la evolución de la toxicidad en muestras tratadas mediante distintos procesos. El inconveniente principal es el coste económico de las bacterias. -La aplicación del proceso UV/TiO 2 tanto a muestras del canal como a muestras de agua de salida de EDAR produce una disminución de la toxicidad. En el caso del proceso UV/TiO 2 /H 2 O 2 es necesario eliminar la interferencia del peróxido para poder obtener el valor real de toxicidad. 7-Bibliografía 66 7. BIBLIOGRAFIA  Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21st Edition. American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA) & Water Environment Federation (WEF), 2005.  Decreto 38/2004 del 24 de Febrero del Gobierno de Aragón, por el que se aprueba el Reglamento de los vertidos de aguas residuales a las redes municipales de alcantarillado. (BOA Nº 30).  Directiva 2006/60/CE de la Comisión de 7 de Julio de 2006 que modifica los anexos de la Directiva 90/642/CEE. (BOE Nº 83).  Directiva 76/464/CEE del Consejo, de 4 de mayo de 1976, relativa a la contaminación causada por determinadas sustancias peligrosas vertidas en el medio acuático de la Comunidad.  Decreto 1620/2007 del 7 de Diciembre, por el que se establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. (BOE Nº 294).  Directiva 82/243/CEE del Consejo, de 31 de marzo de 1982, que modifica la Directiva 73/405/CEE referente a la aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros relativas a los métodos de control de la biodegradabilidad de los tensoactivos aniónicos. 7-Bibliografía 67  Orden MAM 85/2008, de 16 de enero, por la que se establecen los criterios técnicos para la valoración de los daños al dominio público hidráulico y las normas sobre toma de muestras y análisis de vertidos de aguas residuales. (BOE Nº 25).  Lumistox 300. Manual de usuario. DR LANGE. Abril 1998 a partir de la versión 2.21. BDA318.  Ingeniería de aguas residuales: tratamiento, vertido y reutilización / Metcalf and Eddy ; McGraw-Hill, D.L. 2000.  Miguel Salcedo, Natividad. “Estudio de la eliminación de plaguicidas presentes habitualmente en aguas de la cuenca del Ebro mediante procesos de oxidación avanzada”. Tesis Doctoral. Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente, Universidad de Zaragoza. 2010.  Miguel Salcedo, Natividad. “Eliminación de plaguicidas de aguas naturales mediante procesos de oxidación avanzada con dióxido de titanio”. Proyecto Fin de Carrera. Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente, Universidad de Zaragoza, 2006.  López Martín, Andrea. “Aplicación de procesos convencionales en la regeneración de aguas depuradas: Eliminación de contaminantes peligrosos”. Proyecto Fin de Carrera. Universidad de Zaragoza, 2010. 7-Bibliografía 68  Luzón Gil, Jorge. “Influencia del proceso de oxidación en el tratamiento de aguas de abastecimiento”. Proyecto Fin de Carrera. Universidad de Zaragoza, 2010.  Norma ISO/DIS 11348. Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio Fischeri (Luminescent bacteria test).  Oppenländer, T. Photochemical Purification of Water and Air. Wiley-VCH. ISBN 3-527-30563-7, Germany (2003).  Parsons, S. Advanced Oxidation Processes for Water and Wastewater treatment. IWA. ISBN: 1843390175 (2004). Páginas Web www.aragob.es : Página web del Gobierno de Aragón. www.mma.com : Página web del Ministerio de Medio Ambiente. www.epa.gov : Página web de la Agencia de Protección del Medio Ambiente de Estados Unidos. www.miliarium.com : Página web de Ingeniería Civil y Medio Ambiente. www.drlange.com : Página web del sumistrador del equipo Lumistox 300. http://webbook.nist.gov/ : Página web de química del NIST. ANEXO I ORDEN MAM 85/2008 __________________________________________ 5244 Martes 29 enero 2008 BOE núm. 25 ANEXO I Valores de los parámetros por defecto de la valoración de daños Tabla 1: Coeficiente de circunstancias especiales (KBxB) para extracciones ilegales de agua Tipo de extracción Estado cuantitativo KBXB Caudal extraído ilegalmente menor del 50% del caudal medio estimado circulante por el cauce durante el periodo de la infracción. El caudal aguas abajo de la extracción no es inferior que el caudal ecológico. 1,0 Caudal extraído ilegalmente superior al 50% del caudal medio estimado circulante por el cauce durante el periodo de la infracción. El caudal aguas abajo de la extracción no es inferior que el caudal ecológico. 1,2 Aguas superficiales Caudales circulantes inmediatamente aguas abajo de la extracción menores al caudal ecológico 2,0 Sin efectos notables en el medio y/o en los niveles de otros pozos del mismo acuífero 1,0 Aguas subterráneas Acuíferos declarados sobreexplotados y masas de agua subterránea en riesgo de no cumplir los objetivos medioambientales. 2,0 Ambos tipos Situación declarada de sequía. 2,0 Tabla 2: Coeficiente de circunstancias especiales (KBxB) para el resto de infracciones Comunidad vegetal afectada KBXB Abedulares 2,0 Adelfares 1,6 Alamedas 1,8 Alisedas 2,0 Alocares 1,6 Avellanedas 2,0 Choperas 1,4 Fresnedas 1,8 Hayedos, robledales, melojares y encinares 1,8 Loreras 2,0 Mimbreras 1,6 Olmedas 1,8 Comunidad vegetal afectada KBXB Saucedas 1,6 Tarayales 1,8 Resto de ecosistemas 1,2 La infracción no ha dañado a la comunidad vegetal 1,0 Tabla 3 : Valores del coeficiente de reversibilidad (KBRVB ) Tiempo de reversibilidad KBRVB 0 - 1 año 1,0 1 - 5 años 1,4 > 5 años 1,8 Irreversible 2,0 Tabla 4: Valores del coeficiente de sensibilidad del medio receptor (KBSB) Valor de KBSB Clasificación del medio receptorTF 1 FT Infracciones capitulo II Infracciones capitulo III Reservas naturales fluviales Zonas declaradas de protección especial 2,0 Zonas sensiblesTF 2 FT Aguas destinadas a la producción de agua potable Perímetros de protecciónTF 3 FT Aguas subterráneas 3,0 Aguas aptas para la vida de los salmónidos 2 Zonas aptas para el baño 1,5 1,8 Zonas aptas para la vida de los ciprínidos Zonas aptas para la cría de moluscos 1,2 1,3 Sin clasificación 1,0 1,0 T1T Estas definiciones se refieren a los conceptos regulados en el Real Decreto 927/1988 y en su aplicación se tendrán en cuenta los objetivos que, para cada horizonte temporal, los planes hidrológicos de cuenca hayan establecido para cada medio receptor. La aplicación de los coeficientes se extiende a las zonas de influencia que contengan los planes hidrológicos siempre que estén efectivamente delimitadas (BOE de 28 de julio de 2006). T2T Zonas sensibles declaradas oficialmente en la Resolución de 10 de julio de 2006, de la Secretaría General para el Territorio y la Biodiversidad (BOE de 28 de julio de 2006) T3T Perímetros contemplados en el artículo 56.3 del texto refundido de la Ley de Aguas. BOE núm. 25 Martes 29 enero 2008 5245 ANEXO II Dotaciones de vertido en litros por habitante y día, según la población abastecida y el nivel de actividad comercial Población abastecida (habitantes) Actividad Comercial Alta Actividad Comercial Media Actividad Comercial Baja < 10.000 220 L/hab·d 190 L/hab·d 170 L/hab·d 10.000 - 50.000 240 L/hab·d 220 L/hab·d 190 L/hab·d 50.000 - 250.000 280 L/hab·d 250 L/hab·d 220 L/hab·d > 250.000 3/30 L/hab·d 300 L/hab·d 260 L/hab·d ANEXO III Valores de referencia de los parámetros de contaminación Si un vertido no dispone de autorización o si un contaminante carece del valor límite de emisión en la autorización de vertido el vertido está prohibido y su valor límite de emisión es cero (a. 245.2 del Reglamento del Dominio Público Hidráulico). En consecuencia el valor de referencia debería ser cero (Vr = 0) y el cálculo del coeficiente U resultaría indeterminado (U = Vm / Vr). Como paliativo en este caso, y sólo a los efectos del cálculo de Vr, el límite de emisión del parámetro se asimilará al valor de la norma de calidad ambiental u objetivo de calidad que el respectivo plan hidrológico de cuenca haya establecido para su respeto en el correspondiente medio receptor. En ausencia de dicho valor para el parámetro, se aplicará el límite de referencia de las tablas adjuntas, que corresponden a estimaciones generales de normas de calidad ambiental y objetivos de calidad. Grupo A: sustancias peligrosas Grupo A CAS Vr (mg/l) ITF 4 FT II PreTF 5 FT II PriTF 6 FT 1,1,1-Tricloroetano 71-55-6 0,1 x 1,2 dicloroetano 107-06-2 0,01 x x Alacloro 15972-60-8 0,0003 x Aldrín 309-00-2 0,00001 x Antraceno 120-12-7 0,0001 x Arsénico 7440-38-2 0,05 x Atrazina 1912-24-9 0,001 x x Benceno 71-43-2 0,03 x x Benzo(a)pireno 50-32-8 0,00005 x Benzo(b)fluoranteno 205-99-2 0,00003 x Benzo(g,h,i)perileno 191-24-2 0,000002 x Benzo(k)fluoroanteno 207-08-9 0,00003 x CB10-13B -cloroalcanos 85535-84-8 0,0004 x Cadmio 7440-43-9 0,005 x x T4T Lista I: Sustancias contenidas en la Orden de 12 de noviembre de 1988. T5T Lista II preferente: sustancias contenidas en el RD 995/2000, de 2 de junio, por el que se fijan objetivos de calidad para determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Público Hidráulico. T6T Lista II prioritaria: sustancias contenidas en la Decisión Nº 2455/2001/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 20 de noviembre de 2001 por la que se aprueba la lista de sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas, y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE. 5246 Martes 29 enero 2008 BOE núm. 25 Grupo A CAS Vr (mg/l) ITF 4 FT II PreTF 5 FT II PriTF 6 FT Cianuros totales 74-90-8 0,04 x Clorobenceno 108-90-7 0,02 x Clorofenvinfos 470-90-6 0,0001 x Cloropirifos 2921-88-2 0,00003 x Cobre 7440-50-8 0,005 x Cromo 7440-47-3 0,05 x Di(2-etilhexil)ftalato 117-81-7 0,0013 x DiclorobencenoTF 7 FT 25321-22-6 0,02 x DDT y metabolitosTF 8 FT No aplicable 0,000025 x Diclorometano 75-09-2 0,02 x Dieldrín 60-57-1 0,00001 x Pentabromodifenil éter 32534-81-9 0,0000005 x Diurón 330-54-1 0,0002 x Endosulfán 115-29-7 0,000005 x Endrín 72-20-8 0,000005 x Etilbenceno 100-41-4 0,03 x Fluoranteno 206-44-0 0,0001 x Fluoruros 16984-48-8 1,7 x Hexaclorobenceno 118-74-1 0,00003 x x Hexaclorobutadieno 87-68-3 0,0001 x x Hexaclorociclohexano 608-73-1 0,0001 x x Indeno(1,2,3-cd)pireno 193-39-5 0,000002 x Isodrín 465-73-6 0,000005 x Isoproturón 34123-59-6 0,0003 x Lindano 58-89-9 0,0001 x Mercurio 7439-97-6 0,001 x x Metolacloro 51218-45-2 0,001 x Naftaleno 91-20-3 0,005 x x Níquel 7440-02-0 0,05 x x Nonilfenoles 25154-52-3 0,0003 x Octilfenoles 1806-26-4 0,0001 x Pentaclorobenceno 608-93-5 0,000007 x Pentaclorofenol 87-86-5 0,002 x x Percloroetileno 127-18-4 0,01 x Plomo 7439-92-1 0,05 x x Selenio 7782-49-2 0,001 x Simazina 122-34-9 0,001 x x Terbutilazina 5915-41-3 0,001 x Tetracloruro de Carbono 56-23-5 0,012 x Tolueno 108-88-3 0,05 x Tributilestaño 36643-28-4 0,00002 x Triclorobencenos 12002-48-1 0,0004 x x T7T Suma de los isómeros orto, meta y para diclorobenceno. T8T Suma de los isómeros p,p´-DDT + o,p´-DDT + p,p´-DDE + p,p´-DDD. BOE núm. 25 Martes 29 enero 2008 5247 Grupo A CAS Vr (mg/l) ITF4FT II PreTF5FT II PriTF 6FT Tricloroetileno 79-01-6 0,01 x Cloroformo 67-66-3 0,012 x Trifluralina 1582-09-8 0,00003 x XilenoTF 9 FT 1330-20-7 0,03 x Zinc total 7440-66-6 0,03 x Grupo B: contaminantes Grupo B CAS Vr (mg/l) Amonio total 14798-03-9 1 Bario 7440-39-3 1 Berilio 7440-41-7 1 Boro 7440-42-8 1 Cloro total 7782-50-5 0,005 Cobalto 7440-48-4 1 Índice de fenoles no aplicable 0,1 Fósforo total 14265-44-2 0,4 Fosfatos 14265-44-2 0,7 Hidrocarburos método IR no aplicable 1 Hierro 7439-89-6 2 Manganeso 7439-96-5 1 Magnesio 7439-95-4 1 Nitratos 14797-55-8 50 Nitritos 14797-65-0 0,03 Nitrógeno Kjeldahl no aplicable 3 Nitrógeno total no aplicable 3 Tensoactivos aniónicos no aplicable 0,5 Toxicidad en UT no aplicable 1 Vanadio 7440-62-2 1 Biocidas y productos fitosanitarios no aplicable 0,001 Contaminantes del Anexo II del Reglamento del Dominio Público Hidráulico, no definidos ni en el grupo A ni C no aplicable Grupo C: otros contaminantes Grupo C unidades Vr Incremento de temperatura del agua ºC T del medio 3ºC Ph Unidades de pH 5,5-9 Conductividad eléctrica a 20ºC μS/cm 1000 Cloruros mg/L 200 Sulfatos mg/L 250 Color mg Pt /L 200 Sólidos en suspensión mg/L 25 T9T Suma de los isómeros orto-, meta- y para-xileno. 5248 Martes 29 enero 2008 BOE núm. 25 Grupo C unidades Vr Demanda bioquímica de oxígeno (DBOB5B a 20ºC) sin nitrificación. mg/L 7 Demanda química de oxígeno mg/L 30 Coliformes fecales UFC/100 ml 20000 Coliformes totales 37 ºC UFC/100 ml 50000 Enterovirus PFU/10 ml 0 Estreptococos fecales UFC/100 ml 10000 Salmonelas En 1L Ausencia Otros parámetros microbiológicos ANEXO IV Determinación de la toxicidad A) La Toxicidad de una muestra se mide mediante los ensayos de toxicidad aguda sobre peces, daphnia y algas realizados conforme a las siguientes normas: Test de toxicidad aguda en peces. Ensayo CEE C.1., OCDE 203 Test de inmovilidad de Daphnia magna. Ensayo CEE C.2., OCDE 202 Test de inhibición del crecimiento de algas. Ensayo CEE C.3., OCDE 201 B) La Toxicidad se expresa en unidades de toxicidad (UT) y se calcula de acuerdo con la siguiente expresión: Toxicidad (UT) = 100 / CL(E)50 Siendo CL(E)50 la concentración letal/efectiva media que corresponde a la proporción de vertido que origina la mortalidad o inhibición de la movilidad del 50% de los individuos expuestos (en el caso de peces y daphnias respectivamente) o la inhibición de un 50% en el crecimiento de las algas. C) En cada muestra deben realizarse los tres ensayos de toxicidad indicados en el párrafo A). D) El valor Vm de la muestra es el mayor valor de Toxicidad obtenida, expresada en UT, de los 3 ensayos realizados. El valor de Vr para vertidos autorizados, corresponderá a la Toxicidad calculada para una muestra preconstituida, en la que se incluyan el conjunto de contaminantes recogidos en la autorización de vertido, a las máximas concentraciones autorizadas. El valor de Vr para los vertidos no autorizados se recoge en la tabla del Anexo 3. ANEXO V Coste de referencia (ß) expresado en euros por tonelada (€/t) según el tipo de residuo en estado líquido o lodo vertido Si un residuo puede catalogarse en varios tipos, se tomará el coste de referencia (ß) más elevado. Tipo de residuo (€/t) Residuos clasificados como peligrosos en estado líquido Lixiviados de vertederos de residuos peligrosos Lodos clasificados como peligrosos 1000 BOE núm. 25 Martes 29 enero 2008 5249 Tipo de residuo (€/t) Residuos no peligrosos en estado líquido que contienen sustancias del Grupo A o B enumeradas en el Anexo 3 de esta Orden Lixiviados de vertederos de residuos urbanos Lodos no peligrosos con sustancias del Grupo A o B enumeradas en el Anexo 3 de esta Orden 400 Purines o estiércol líquido procedente del ganado Residuos líquidos de la industria alimentaria como alpechines de almazaras, etc. Otros residuos líquidos con alto contenido en materia orgánica Lixiviados de vertederos de materiales inertes Lodos residuales de estaciones de depuración que traten aguas residuales domésticas, urbanas o de composición similar 150 Otros residuos líquidos no catalogados en ninguno de los tipos anteriores Valor más aproximado según la composición del residuo 5250 Martes 29 enero 2008 BOE núm. 25 BOE núm. 25 Martes 29 enero 2008 5251 5252 Martes 29 enero 2008 BOE núm. 25 BOE núm. 25 Martes 29 enero 2008 5253  DESETILATRAZINA Nombre: 6-cloro-N4-isopropil-1,3,5-triazina-2,4-diamina Fórmula: C 9 H 16 ClN 5 Masa molecular: 229,7 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 118 – 119 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  3,4-DICLOROANILINA Nombre: 3,4-dicloroanilina Fórmula: (C 6 H 3 )Cl 2 (NH 2 ) Masa molecular: 162,0 Forma: sólido cristalino Color: gris oscuro hasta negro Olor: no disponible Punto de fusión: 72 – 74 ºC Punto de ebullición: 272 ºC Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  4,4’-DICLOROBENZOFENONA Nombre: 4,4’-diclorobenzofenona Fórmula: C 13 H 8 Cl 2 O Masa molecular: 251,1 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: inoloro Punto de fusión: 146 – 148 ºC Punto de ebullición: 353 ºC Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en ºC): N/A Solubilidad (g/l en ºC): N/A Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  DICOFOL Nombre: 2,2,2-tricloro-1,1-bis(4-clorofenil)etanol Fórmula: (ClC 6 H 4 ) 2 C(OH)CCl 3 Masa molecular: 370,5 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 78,5 – 79,5 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (20 ºC): 1,45 g/cm 3 Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en 25 ºC): 0,0008 Solubilidad (g/l en 25 ºC): en acetona 400 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 595 – 578 mg/kg  DIELDRIN Nombre: 1,2,3,4,10,10-hexacloro-6,7-epoxi-1,4,4a,5,6,7,8,8a-octahidro-endo-1,4-hexo- 5,8-dimetanonaftaleno Fórmula: C 12 H 8 Cl 6 O Masa molecular: 381,0 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: penetrante-picante Punto de fusión: 176 ºC Punto de ebullición: Densidad (20 ºC): 1,75 g/cm3 Presión de vapor (20 ºC): 1·10-6 mbar Solubilidad en agua (g/l en 20 ºC): < 0,000 Solubilidad (g/l en 20 ºC): en acetona 220 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 40 – 87 mg/kg  DIMETOATO Nombre: O,O-dimetil(S-metilcarbamil)metilfosforoditioato Fórmula: CH 3 NHCOCH 2 SPS(OCH 3 ) 2 Masa molecular: 229,0 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: hedor Punto de fusión: 49ºC Punto de ebullición: 117 ºC Densidad (20 ºC): 1,281 g/cm3 Presión de vapor (25 ºC): 1,1 mPa Solubilidad en agua (g/l en 21 ºC): 25 Solubilidad (g/l en 25 ºC): en metanol 800 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 291 – 325 mg/kg  DIURON Nombre: 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilurea Fórmula: C 9 H 10 Cl 2 N 2 O Masa molecular: 233,2 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 158- 159 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (20 ºC): 1,148 g/cm3 Presión de vapor (50 ºC): 0,41 mPa Solubilidad en agua (g/l en 25 ºC): 0,042 Solubilidad (g/l en 27 ºC): en acetona 53 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 3400 mg/kg  α-ENDOSULFAN Nombre:(1,4,5,6,7,7-hexacloro-8,9,10-trinorborn-5-en-2,3-xilenobismetileno)sulfito, isómero alfa. Fórmula: C 9 H 6 Cl 6 O 3 S Masa molecular: 406,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: penetrante-picante Punto de fusión: 109 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en 22 ºC): 0,0003 Solubilidad (g/l en ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 76 mg/kg  ENDOSULFAN-SULFATO Nombre: 1,4,5,6,7,7-hexacloro-hexahidro-metano-benzodioxatiepin-dioxido Fórmula: C 9 H 6 Cl 6 O 4 S Masa molecular: 422,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 182 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en ºC): N/A Solubilidad (g/l en ºC): N/A Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  ENDRIN Nombre:(1R,4S,4aS,5S,7R,8R,8aR)-1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,6,7,8,8a- octahidro-6,7-epoxi-1,4:5,8-dimetil Fórmula: C 12 H 8 Cl 6 O Masa molecular: 380,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 226 – 230 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (20 ºC): 1,64 g/cm 3 Presión de vapor (20 ºC): 20 mPa Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en 20 ºC): en benzol 140 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 5 – 45 mg/kg  α-HCH Nombre: 1a,2a,3a,4β,5a,6β-hexaclorociclohexano, isómero alfa Fórmula: C 6 H 6 Cl 6 Masa molecular: 290,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 159 – 160 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (20 ºC): 2,5·10 -5 Solubilidad en agua (g/l en 20 ºC): 0,01 Solubilidad (g/l en 20 ºC): en metanol 23 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 500 mg/kg  β-HCH Nombre: 1a,2β,3a,4β,5a,6β-hexaclorociclohexano, isómero beta Fórmula: C 6 H 6 Cl 6 Masa molecular: 290,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: penetrante-picante Punto de fusión: 312 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (20 ºC): 2,8·10 -7 mPa Solubilidad en agua (g/l en 20 ºC): 0,0002 Solubilidad (g/l en 20 ºC): en metanol 16 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 600 mg/kg  χ-HCH Nombre: 1a,2a,3a,4β,5a,6β-hexaclorociclohexano, isómero gamma Fórmula: C 6 H 6 Cl 6 Masa molecular: 290,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: penetrante-picante Punto de fusión: 112 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (20 ºC): 5,6 mPa Solubilidad en agua (g/l en 20 ºC): 0,007 Solubilidad (g/l en 20 ºC): en acetona 50 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 88 – 270 mg/kg  δ-HCH Nombre: 1a,2a,3a,4β,5a,6β-hexaclorociclohexano, isómero delta Fórmula: C 6 H 6 Cl 6 Masa molecular: 290,9 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 138 - 139 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (20 ºC): 1,75 E -5 Solubilidad en agua (g/L en 20 ºC): 0,01 Solubilidad (g/L en 20 ºC): en metanol 273 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 1000 mg/kg  HEPTACLORO Nombre: 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metanoindeno Fórmula: C 10 H 5 Cl 7 Masa molecular: 373,3 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: semejante al alcanfor Punto de fusión: 95 – 96 ºC Punto de ebullición: 117 – 126 ºC Densidad (25 ºC): 1,65 – 1,67 g/cm 3 Presión de vapor (25 ºC): 53 mPa Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en 25 ºC): en etanol 62,5 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 147 – 220 mg/kg  HEPTACLORO EPOXI A Nombre: 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metanoindeno (endo) Fórmula: C 10 H 5 Cl 7 O Masa molecular: 389,31 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 84 - 87 ºC Punto de ebullición: N/A ºC Densidad (25 ºC): N/A g/cm 3 Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/L en ºC): Solubilidad (g/L en 25 ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  HEPTACLORO EPOXI B Nombre: 1,4,5,6,7,8,8-heptacloro-3a,4,7,7a-tetrahidro-4,7-metanoindeno (exo) Fórmula: C 10 H 5 Cl 7 O Masa molecular: 389,31 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 164 ºC Punto de ebullición: N/A ºC Densidad (25 ºC): N/A g/cm 3 Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/L en ºC): Solubilidad (g/L en 25 ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 62 mg/kg  HEXACLOROBENCENO Nombre: Hexaclorobenceno Fórmula: C 6 Cl 6 Masa molecular: 284.8 Forma: sólido cristalino Color: incoloro-blanco Olor: Punto de fusión: 231 ºC Punto de ebullición: 323-326 ºC Densidad (25 ºC): 2.04 g/cm 3 Presión de vapor (114 ºC): 0.113 kPa Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en 25 ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: mg/kg  ISODRÍN Nombre:1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-endo,endo-1,4,5,8-dimetano- naftalina Fórmula: C 12 H 8 Cl 6 Masa molecular: 364,9 Forma: sólido cristalino Color: gris amarillado hasta pardusco Olor: no disponible Punto de fusión: 240 – 242 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (ºC): N/A Solubilidad en agua (g/l en ºC): Solubilidad (g/l en ºC): Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: 7 – 15 mg/kg  4-ISOPROPILANILINA Nombre: 4-(1-metiletil)-bencenamina Fórmula: C 9 H 13 N Masa molecular: 135,21 Forma: líquida Color: gris oscuro hasta negro Olor: no disponible Punto de fusión: ºC Punto de ebullición: 226-227 ºC Densidad (20 ºC): 0,977 g/cm 3 Presión de vapor (20 ºC): N/A Solubilidad en agua (g/L en 20 ºC): N/A Solubilidad (g/L en 20 ºC): N/A Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: N/A  TETRADIFON Nombre: 4-clorofenil-2,4,5-triclorofenilsulfon Fórmula: (C 6 H 2 Cl 3 )OSO(C 6 H 4 Cl) Masa molecular: 356,0 Forma: sólido cristalino Color: incoloro Olor: no disponible Punto de fusión: 148 – 149 ºC Punto de ebullición: N/A Densidad (20 ºC): 1,515 g/cm 3 Presión de vapor (20 ºC): 0,001 mPa Solubilidad en agua (g/l en 10 ºC): 0,0000 Solubilidad (g/l en 25 ºC): en cloroformo 225 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: > 14700 mg/kg  TRIFLURALINA Nombre: a,a,a-trifluoro-2,6-dinitro-N,N-dipropil-p-toluidino Fórmula: C 13 H 16 F 3 N 3 O 4 Masa molecular: 335,3 Forma: sólido cristalino Color: anaranjado Olor: no disponible Punto de fusión: 48,5 – 49 ºC Punto de ebullición: 96 – 97 ºC Densidad (ºC): N/A Presión de vapor (25 ºC): 13,7 mPa Solubilidad en agua (g/l en 27 ºC): < 0,001 Solubilidad (g/l en 27 ºC): en xileno 580 Estabilidad: no descomposición térmica con uso adecuado LD50: > 10000 mg/kg