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Trabajo Fin de Máster ELIMINACIÓN DE ENTEROCOCOS Y PSEUDOMONAS EN AGUAS DE SALIDA DE DEPURADORA MEDIANTE PROCESOS DE COAGULACIÓN-FLOCULACIÓN Y FOTOFENTON Realizado por: María Morales Gonzalo Directora: Mª Peña Ormad Melero Máster en Introducción a la Investigación en Ingeniería Química y del Medio Ambiente Departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medio Ambiente Escuela de Ingeniería y Arquitectura. Universidad de Zaragoza Septiembre 2011 2 3 AGRADECIMIENTOS Me gustaría dar las gracias a… A mis padres por su cariño, confianza y apoyo incondicional. A José por su paciencia y comprensión en todos los aspectos desde el primer momento. A Peña por haberme dado la oportunidad de realizar este proyecto y por su ayuda y disposición. A Jorge por su inestimable ayuda en el día a día en el laboratorio y por los buenos momentos compartidos. A Nati por su colaboración en el día a día. A mis compañeros de laboratorio por toda su ayuda y apoyo. A MICINN-FEDER por la financiación de esta investigación a través del proyecto "Regeneración de aguas depuradas mediante procesos de oxidación avanzada (CTM2008-01876/TECNO)". 4 5 ELIMINACIÓN DE ENTEROCOCOS Y PSEUDOMONAS EN AGUAS DE SALIDA DE DE DEPURADORA MEDIANTE PROCESOS DE COGULACIÓNFLOCULACIÓN Y FOTOFENTON RESUMEN El aumento de la población actual implica un incremento en la demanda de agua, esto ligado a la disminución que se está produciendo en los recursos hídricos provoca una necesidad de reutilizar el agua antes de su retorno al cauce hidráulico como una solución para aumentar los recursos existentes. La regeneración del agua de salida de una Estación de Depuración de Aguas Residuales (EDAR) tiene lugar en la Estación Regeneradora de Aguas Residuales (ERAR). Es el Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre, el que establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas. Uno de los contaminantes más importantes presente en todo tipo de aguas son los agentes biológicos, como es el caso de las bacterias patógenas. Estas son un gran riesgo para el hombre ya que causan enfermedades de origen hídrico que pueden desembocar en epidemias, por lo que es necesario el control microbiológico del agua. En este trabajo se analizan dos tipos de bacterias que se emplean como indicadores de contaminación fecal, las Pseudomonas Aeruginosas y los Enterococos. El objetivo principal de este trabajo es evaluar la aplicación del proceso avanzado de oxidación (PAO) FotoFenton y el de coagulación-floculación-decantación sobre la desinfección de aguas, más concretamente en la eliminación de Enterococos y Pseudomonas. El proceso FotoFenton se basa en la generación de radicales hidroxilo (OH · ) en presencia de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) e iones ferroso (Fe +2 ) en condiciones de pH ácido y temperaturas moderadas. La acción de desinfección se aumenta significativamente al introducir radiación UV-Visible dando lugar al proceso FotoFenton. Por otro lado, la coagulación-floculación-decantación tiene como objetivo la eliminación de los sólidos en suspensión presentes, la reducción de la turbidez y el color, llevando a cabo la clarificación del agua. Se estudia el efecto de la dosis de la sal férrica utilizada, el tiempo de radiación, el pH del medio así como el orden de los procesos de coagulación-floculación-decantación y FotoFenton. Además se compara el efecto de estos procesos sobre los dos diferentes tipos de bacterias, los Enterococos Gram-positivos y las Pseudomonas Aeruginosas Gram-negativas. El tratamiento más efectivo, en términos de desinfección, corresponde a aquel en el que se realiza en primer lugar el proceso de coagulación-floculación-decantación seguido del FotoFenton con una dosis de Fe 3+ inicial de 15 mg/l, 25 mg/l de H 2 O 2 , 120 minutos de radiación solar artificial y pH 5. Con estas condiciones de operación se consigue eliminar: 4,6 unidades logarítmicas de Enterococos, 5 unidades logarítmicas de Pseudomonas, 91% de sólidos en suspensión y 96% de turbidez. La eliminación de Pseudomonas se produce a una velocidad superior que la de Enterococos, las constantes cinéticas obtenidas en el estudio cinético son aproximadamente un 50% superiores para el caso de las Pseudomonas. De los tres reactivos empleados, FeCl 3 , H 2 O 2 y HCl, es el HCl el que supone un mayor coste ya que se añade en gran cantidad para alcanzar pH 5. Si el tratamiento se realiza a pH 7 también se eliminan parte de las bacterias del medio y la cantidad de HCl a añadir es muy inferior. Si el uso que se le va a dar al agua tratada es, por ejemplo, agrícola o recreativo; realizar el tratamiento a pH 7 produce una desinfección adecuada para tal fin y el coste final del tratamiento se ve altamente disminuido. 6 7 Índice 1. Introducción y objetivos ....................................................................................................... 9 2. Regeneración del agua ....................................................................................................... 11 2.1. Marco legislativo ......................................................................................................... 11 2.2. Características del agua de salida de EDARs ............................................................... 11 2.3. Estación regeneradora de aguas residuales (ERAR) .................................................... 12 2.4. Eliminación de materia particulada en regeneración de aguas .................................. 13 2.5. Desinfección en regeneración de aguas...................................................................... 13 2.5.1. Tratamientos convencionales ............................................................................. 13 2.5.2. Procesos avanzados de oxidación: FotoFenton .................................................. 14 2.5.3. Modelo cinético de desinfección ........................................................................ 16 3. Procedimiento experimental .............................................................................................. 17 3.1. Descripción planta piloto y preparación de las muestras ........................................... 17 3.2. Metodología analítica.................................................................................................. 18 3.2.1. Parámetros físico-químicos ................................................................................. 18 3.2.2. Parámetros microbiológicos................................................................................ 19 3.3. Tratamientos de desinfección a escala de laboratorio ............................................... 20 3.3.1. Ensayos de referencia ......................................................................................... 21 3.3.2. Ensayos FotoFenton ............................................................................................ 21 3.3.3. Ensayos combinados: CFD y FotoFenton ............................................................ 22 4. Resultados y discusión ........................................................................................................ 23 4.1. Ensayos de referencia ................................................................................................. 23 4.2. Ensayos FotoFenton .................................................................................................... 23 4.2.1. Estudio de la influencia de la dosis de Fe 3+ ......................................................... 23 4.2.2. Estudio de la influencia del tiempo de radiación artificial .................................. 24 4.2.3. Estudio de la interacción entre la dosis de Fe 3+ y el tiempo de radiación ........... 25 4.3. Ensayos combinados: CFD y FotoFenton .................................................................... 25 4.3.1. Estudio de la influencia del orden de los procesos, CFD y FotoFenton .............. 25 4.3.2. Estudio de la influencia del pH del medio ........................................................... 27 4.3.3. Estudio de la influencia de la luz artificial y ambiental en desinfección ............. 28 4.3.4. Análisis estadístico de la influencia de variables en la desinfección ................... 28 4.4. Estudio cinético de desinfección ................................................................................. 31 4.4.1. Efecto del Fe 3+ ..................................................................................................... 32 4.4.2. Efecto del pH ....................................................................................................... 33 4.5. Estudio económico ...................................................................................................... 34 5. Conclusiones ....................................................................................................................... 37 6. Bibliografía .......................................................................................................................... 39 8 ANEXOS ....................................................................................................................................... 43 Anexo I: Requisitos de calidad para aguas regeneradas ............................................................. 47 Anexo II: Microbiología de las aguas ........................................................................................... 53 Anexo III: Metodología analítica ................................................................................................. 61 Anexo IV: Metodología microbiológica ....................................................................................... 65 Anexo V: Equipos ......................................................................................................................... 71 Anexo VI: Resultados CFD ........................................................................................................... 79 Anexo VII: Resultados desinfección ............................................................................................ 83 1. Introducción y objetivos 9 1. Introducción y objetivos El agua es un bien escaso y valioso; utilizarla de forma racional es una obligación de todos los ciudadanos para asegurar a las próximas generaciones un mundo habitable. La mayor parte del agua que se consume se dedica a la agricultura, 79,5%. El resto, un 20%, se usa en las industrias y en los hogares. La repercusión social con respecto al uso del agua ha cambiado en los últimos años. Actualmente la población mundial es consciente de que el agua es un bien escaso, y por lo tanto mediante su reutilización se permite el incremento de recursos disponibles y se minimiza el impacto de su disposición ambiental. El aumento de la población implica un incremento en la demanda de agua, lo que ligado a la disminución que se está produciendo en los recursos hídricos provoca una necesidad de reutilizar el agua antes de su retorno al cauce hidráulico como una solución para aumentar los recursos existentes. En el año 2009 se regeneraron 530 hm 3 de 3.500 hm 3 de agua que se depuran al año (Iglesias, 2005). Las aguas que se reutilizan son aguas que ya han sido sometidas a un tratamiento de depuración en las Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales (EDAR). Posteriormente se les somete a un tratamiento adicional o complementario que permite adecuar su calidad al uso al que vaya a destinarse. Este tratamiento tiene lugar en unas instalaciones denominadas Estaciones Regeneradoras de Aguas Residuales (ERAR), la calidad final del agua regenerada debe cumplir lo establecido en el Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre, por el que se establece el régimen jurídico de la reutilización de las aguas depuradas (B.O.E., 2007). Los agentes biológicos, más concretamente las bacterias patógenas, son contaminantes muy importantes presentes en todo tipo de aguas, también en el agua depurada. Estos microorganismos son un gran riesgo para el hombre ya que son causantes de enfermedades de origen hídrico que pueden desembocar en epidemias, por lo que es necesario el control microbiológico del agua. El microorganismo de referencia más empleado es la Eschericia Coli que se usa como indicador de contaminación fecal. Los microorganismos indicadores son aquellos que tienen un comportamiento similar a los patógenos (concentración y reacción frente a factores ambientales y barreras artificiales), pero son más rápidos, económicos y fáciles de identificar. Una vez se ha evidenciado la presencia de grupos indicadores, se puede inferir que los patógenos se encuentran presentes en la misma concentración y que su comportamiento frente a diferentes factores como pH, temperatura, presencia de nutrientes, tiempo de retención hidráulica o sistemas de desinfección es similar a la del indicador . Asimismo; otros indicadores de contaminación fecal, también muy importantes, son los Enterococcus sp, los Clostridium Perfringens, las Pseudomonas o los patógenos humanos que de igual forma se encuentran presentes en el agua (Arce, 2006). La contaminación microbiológica se tiene en cuenta en el RD 1620/2007 a través del control de la bacteria E. coli. Para combatirla es fundamental llevar a cabo un proceso de desinfección. El grado de desinfección de un agua depende fundamentalmente de la cantidad de materia orgánica y de la materia en suspensión presente (Lanao et al, 2007). El desinfectante más común y el más efectivo es el cloro. Sin embargo, la creciente preocupación por la generación de subproductos cancerígenos, como los trihalometanos, generados a partir de la reacción entre el cloro y la materia orgánica presente de forma natural en el agua (sustancias húmicas), está provocando su sustitución paulatina por otros agentes desinfectantes (Bueno, 1997). Con el fin de minimizar el consumo humano de estos contaminantes se han desarrollado los procesos avanzados de oxidación (PAOs). En estos procesos se emplean distintos tipos de reactivos, pero en todos ellos se generan los radicales hidroxilo (OH · ), capaces de mineralizar los contaminantes (Glaze, 1997). Entre estos se encuentra el proceso FotoFenton, el cual es objeto de estudio en este trabajo. 2. Regeneración del agua 16 a la UV-C que es la responsable de los daños en el ADN celular, mientras que las UV-A y la UV-B son absorbidas por los cromóforos celulares pudiendo resultar letales así como mutagénicas (Malato et al, 2009) (Figura 2.3.). Figura 2.3. Daños de la radiación UV sobre las células 2.5.3. Modelo cinético de desinfección Un modelo cinético de desinfección es una idealización simplificada de un proceso complejo en que participan diferentes fenómenos químicos, biológicos e hidráulicos. Con él se consigue obtener una expresión matemática que facilita el diseño adecuado de un sistema de desinfección. Existen distintos modelos cinéticos de desinfección pero, para simplificar, en este trabajo se limitan a dos: Chick y Chick-Watson. El modelo cinético de Chick (1908), un modelo lineal y simple, supone que la concentración del desinfectante no se ve alterada significativamente durante el transcurso de la desinfección al encontrarse este en gran exceso, y por lo tanto la reacción podía ser de primer orden (Lambert et al, 1999; Regalado, 2008).               [Ec. 5] Siendo N o la concentración inicial de microorganismos y N t la concentración de microorganismos presentes en un tiempo t. El modelo cinético de Chick fue modificado por Watson dando lugar al modelo Chick- Watson. Watson pensaba que era posible incorporar el efecto de la concentración de desinfectante sobre la velocidad de reacción. Pensó que existía una relación estequiométrica entre los reactivos, es decir entre el número de microorganismo y el número de moléculas de desinfectante necesarias para inactivarlos (Lambert et al, 1999; Regalado, 2008). La velocidad de reacción viene dada por la siguiente ecuación de orden distinto de uno:                  [Ec. 6] Siendo C la concentración inicial de desinfectante y n la relación estequiométrica entre los reactivos. 3. Procedimiento experimental 3.1. Descripción planta piloto Para la realización de los experimentos de regeneración del agua depurada se necesita agua de sa lida de depuradora. Conseguirla tiempo , por lo que se instaló en el laboratorio del grupo de Calidad y Tratamiento de Aguas del departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medioambiente una planta piloto de lodos activos como la que se puede ver en la F biológico y un decantador, con un volumen sistema de aireación y agitación que suministra el oxigeno necesario a las bacterias encargadas de la depuración, además de homog de síntesis celular aeróbicas se pueden expresar de forma genérica, como se puede ver a continuación: Materia orgánica + O El reactor es alimentado por agua residual continuación pasa a un decantador donde se separa el fango biológico del agua. Parte de este se extrae del sistema y se recircula al reactor para mantener una concentración de microorganismos adecuada en él, 3.500 mg/l . El agua clarificada rebosa en el decantador y se recoge en una garrafa. El agua sintética de trabajo se prepara con agua destilada y los reactivos presentes en obtenidos en la Directiva 82/243/ Tabla 3.1. Composición del agua sintética que alimenta la planta piloto de lodos activos Reactivo Glucosa Peptona de mg/l de agua 200 La Tabla 3.2. muestra las características salida de la planta piloto. Si estos datos se comparan con los que presenta un agua a la salida de una EDAR real según la bibliografía consultada (Tabla 2.1 similares. 3. Procedimiento experimental 17 Procedimiento experimental Descripción planta piloto y preparación de las muestras Para la realización de los experimentos de regeneración del agua depurada se necesita lida de depuradora. Conseguirla diariamente supondría un elevado consumo de , por lo que se instaló en el laboratorio del grupo de Calidad y Tratamiento de Aguas del departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medioambiente una planta piloto de como la que se puede ver en la F igura 3.1. La planta consta de un reactor con un volumen de 3 l y 2 l respectivamente . El reactor tiene un sistema de aireación y agitación que suministra el oxigeno necesario a las bacterias encargadas de la depuración, además de homog eneizar los fangos activados. Las reacciones de oxidación y de síntesis celular aeróbicas se pueden expresar de forma genérica, como se puede ver a Materia orgánica + O 2 + nutrientes→CO 2 + NH 3 + células + otros productos El reactor es alimentado por agua residual sintética de caudal aproximado continuación pasa a un decantador donde se separa el fango biológico del agua. Parte de este se extrae del sistema y se recircula al reactor para mantener una concentración de microorganismos adecuada en él, obtenidos de una EDAR real, aproximadamente en . El agua clarificada rebosa en el decantador y se recoge en una garrafa. El agua sintética de trabajo se prepara con agua destilada y los reactivos presentes en obtenidos en la Directiva 82/243/ CEE (DOCE, 1982). Composición del agua sintética que alimenta la planta piloto de lodos activos Peptona de carne Extracto de carne Urea CO(NH 2 ) 2 NaCl 160 110 30 muestra las características microbiológicas y físicoquímicas Si estos datos se comparan con los que presenta un agua a la salida de una EDAR real según la bibliografía consultada (Tabla 2.1 . ) se observa que ambos son muy Figura 3 .1. Planta piloto de lodos activos Procedimiento experimental y preparación de las muestras Para la realización de los experimentos de regeneración del agua depurada se necesita elevado consumo de , por lo que se instaló en el laboratorio del grupo de Calidad y Tratamiento de Aguas del departamento de Ingeniería Química y Tecnologías del Medioambiente una planta piloto de consta de un reactor . El reactor tiene un sistema de aireación y agitación que suministra el oxigeno necesario a las bacterias encargadas Las reacciones de oxidación y de síntesis celular aeróbicas se pueden expresar de forma genérica, como se puede ver a + células + otros productos sintética de caudal aproximado 1 l/h. A continuación pasa a un decantador donde se separa el fango biológico del agua. Parte de este se extrae del sistema y se recircula al reactor para mantener una concentración de aproximadamente en tre 3.000 - . El agua clarificada rebosa en el decantador y se recoge en una garrafa. El agua sintética de trabajo se prepara con agua destilada y los reactivos presentes en la Tabla 3.1. Composición del agua sintética que alimenta la planta piloto de lodos activos NaCl CaCl 2 ·2H 2 O 7 4 químicas del agua de Si estos datos se comparan con los que presenta un agua a la salida ) se observa que ambos son muy 3. Procedimiento experimental 18 Tabla 3.2. Características microbiológicas y físico-químicas del agua de salida de la planta piloto Parámetros Agua de salida de la planta piloto Enterococos (UFC/100ml) 4,83·10 3 - 2,05·10 5 Pseudomonas (UFC/100ml) 1,67·10 5 - 2,83·10 7 Sólidos en suspensión (mg/l) 28 – 35 Turbidez (NTU) 80 – 300 pH 7 – 8 El agua de salida de la planta piloto es congelada por lo que gran parte de los microorganismos mueren debido a las extremas temperaturas, en consecuencia se considera necesario aumentar de manera artificial esa población para poder apreciar la reducción a lo largo de los experimentos realizados. A este proceso se le denomina fortificación de la muestra y es similar para ambas bacterias. La muestra fortificada contiene una población bacteriana de aproximadamente 10 5 -10 7 UFC/100ml de cada una de las bacterias. La fortificación se lleva a cabo a partir de la cepa madre de cada bacteria que se mantiene congelada para su conservación. Para poder disponer de cultivo bacteriano joven, se descongela la cepa madre y se realiza una siembra en superficie en agar nutritivo. Estas placas se incuban en la estufa a una temperatura de 35 ºC ± 2 durante 24h-48h ± 2 para el caso de los Enterococos, y durante 48h ± 2 para las Pseudomonas. Una vez incubadas, se prepara una suspensión bacteriana concentrada transfiriendo colonias a un tubo con suero fisiológico, NaCl 0.9%, el cual ha sido previamente esterilizado en el autoclave. El número de colonias a transferir se calcula en relación a la turbidez que presenta esta suspensión. Conocida la turbidez necesaria de la suspensión bacteriana concentrada, se procede a añadir dicha suspensión al agua a tratar (Anexo IV). 3.2. Metodología analítica 3.2.1. Parámetros físico-químicos La Tabla 3.3. muestra los parámetros físico-químicos utilizados en la caracterización de las muestras, la metodología analítica y la instrumentación usada (Anexo III). Tabla 3.3. Parámetros físico-químicos analizados en el agua Parámetro Instrumento Marca Modelo Error Método normalizado pH y temperatura pH-metro Crison GLP 21 ≤0.02 pH ≤ 0,3ºC 4500 - HB Standard Methods Turbidez Turbidímetro Hanna LP 2000 0,2 NTU ISO 7027 Internacional Standards Sólidos en suspensión Fotómetro multiparamétrico Ha ch Lange DR 2800 - 2540D Standard Methods Conductividad Conductímetro Crison Basic 30 ≤0.5ºC UNE - EN 27888:1994 Fe Fotómetro multiparamétrico Hanna HI 83099 0,01mg/l 315B, Phenantrolina Method, EPA 3. Procedimiento experimental 19 3.2.2. Parámetros microbiológicos Equipos La Tabla 3.4. muestra los equipos utilizados durante la experimentación microbiológica (Anexo V). Tabla 3.4. Equipos utilizados durante el proceso de experimentación Instrumento Función Marca Modelo Estufas de cultivo Cultivo bacteriológico J.P. Selecta INCUDIGIT 36 L Autoclave 1 Esterilización del material J.P Selecta 437 - P Microscopio óptico Pruebas de confirmación bacteriológicas Zeiss Axiostar Plus Equipo de filtración por membranas Análisis microbiológico de grandes volúmenes Millipore Sistema Microfil Cámara solar Tratamiento Foto Fenton Atlas Suntest CPS+/XLS Cabina de flujo laminar Esterilización del material Cruma 670 - FL 1 Todo el material de vidrio y los medios de cultivos son esterilizados en el autoclave a 121ºC y a 1 bar de presión durante 15 minutos. Medios de cultivo Los medios de cultivo empleados se muestran en la Tabla 3.5. Un medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, células o incluso pequeñas plantas. Según qué se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. La composición y la preparación de los medios de cultivo citados se detallan en el Anexo IV. Tabla 3.5. Medios de cultivo empleados en la experimentación Medio de cultivo Marca Selectivo Tiempo incubación (h) Temperatura incubación (ºC) Agar Nutritivo Scharlau R ecuperación de todo tipo de microorganismos En función del microorganismo En función del microorganismo A gar base Slanetz & Bartley Scharlau Enterococcus sp. 24h-48h ± 4h 35ºC ± 2,0 Agar Centrimide Scharlau Pseudomonas Aeruginosas 48h ± 4h 35ºC ± 2,0 Métodos de siembra Los métodos de siembra que se utilizan son los mismos para las dos bacterias, cambiando únicamente el medio de cultivo y las condiciones de incubación (Tabla 3.5.). Los métodos de siembra son el método de filtración de membrana, para los casos en los que la población bacteriana no sea muy elevada, y el método de siembra en superficie, cuando esta población sea mayor. Estos métodos de siembra, se detallan en mayor profundidad en el Anexo IV. Recuento de colonias Tras la siembra y el proceso de incubación se procede al recuento de las colonias supervivientes de cada bacteria presentes en las placas para poder cuantificar la eficacia de los distintos procesos estudiados. Para el caso de los Enterococos, el método utilizado está descrito en la Norma Española UNE-EN ISO 7899:2 “Detección y recuento de Enterococos intestinales”. Las colonias se presentan de color granate, cóncavas y brillantes, tal y como se aprecia en la Figura 3.2. En el caso de las Pseudomonas, el método utilizado está descrito en la Norma Española UNE- EN ISO colonias son de color amarillo claro, cóncavas y brillante Los métodos de recuento en placa son indirectos, ya que se basan en el recuento de colonias en la superficie de la placa, y no en el número real de bacterias. que comprenden un número de colonias entre 30 y 300 UFC después de la incu asume que cada bacteria viable forma una colonia individual. Las unidades en las que se expresa el resultado son UFC (unidades formadoras de colonias). Como la legislación está dada en UFC/10 0 ml, ya que se considera 100 ml calcular el resultado obtenido en dichas unidades, aunque el vo ml. Hay que destacar que por cada muestra se suelen filtrar varios volúmenes distintos de la misma e incluso diluciones, porque con frecuenc impide un recuento adecuad o Una vez obtenidos los recuentos bacterianos para los distintos experimentos, calcula el grado de eliminación de bacterias para así determinar la eficacia del método utilizado. Esta eliminación se define de la siguiente forma:  ó     Siendo: N t : P oblación de bacterias existente en el instante N o : P oblación inicial de bacterias 3.3. Tratamientos de desinfección a escala de laboratorio Para una mejor comprensión referencia, ensayos FotoFenton y ensayos combinados de CDF y todo el material que se utiliza durante excepción del material que se suministra estéril, el material de vidrio debe ser esterilizado conforme a las instrucciones dadas en la N inicio de la reacción del proceso FotoFenton tiempo cero del tratamiento. se utiliza la cámara solar de la marca Atlas y modelo detalla en el Anexo VI. En este trabajo se analiza con medio, el tiempo de exposición a la 3. Procedimiento experimental 21 previo al FotoFenton. Por lo que, de forma complementaria, se lleva a cabo un análisis estadístico de los resultados obtenidos con los ensayos combinados indicados en la Tabla 3.6; con el programa informático Statgraphics. Con este análisis se puede obtener las variables más influyentes, así como las interacciones entre ellas. Tabla 3.6. Datos del análisis estadístico Variables Valores pH 5 – 7 Tiempo luz artificial (min) 30 - 210 CFD previa Si - No 3.3.1. Ensayos de referencia Los ensayos de referencia realizados consisten en estudiar la influencia de dos variables de forma independiente en el proceso FotoFenton, el uso único del H 2 O 2 y el de la radiación solar artificial. La Tabla 3.7. muestra las condiciones de operación de los ensayos de referencia realizados, todos ellos por triplicado (Anexo VII). Tabla 3.7. Condiciones de operación de los experimentos de referencia Exp. Fe 3+ FotoFenton (mg/l) H 2 O 2 (mg/l) Radiación t (minutos) pH Referencia 1 - 25 Oscuridad 30, 60, 90, 120, 165,210 5 2 - - Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 3.3.2. Ensayos FotoFenton En la Tabla 3.8. se muestran los experimentos realizados del proceso FotoFenton cuyo objetivo es analizar la influencia de la dosis de Fe 3+ , del tiempo de exposición a la luz solar artificial y la interacción entre ambos en la eliminación de Enterococos y Pseudomonas. Todos los ensayos se realizan por triplicado (Anexo VII). El pH juega un papel clave en la eficacia de las reacciones FotoFenton. Para lograr la máxima eficacia en estos tratamientos es preciso tener un pH ácido, pero a ese pH es imposible cuantificar el efecto del tratamiento sobre la desinfección puesto que las bacterias no sobreviven a valores de pH tan bajos (Carlberg, 2005). Por eso se emplea el pH mínimo a partir del cual no se ven afectados los microorganismos, pH 5 (Louwen, 2010). Tabla 3.8. Condiciones de operación de los experimentos FotoFenton Exp. Fe 3+ FotoFenton (mg/l) H 2 O 2 (mg/l) Radiación t (minutos) pH FotoFenton 1 1,5 25 Artificial 30 5 2 2 25 Artificial 30 5 3 3 25 Artificial 30 5 4 4 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 5 5 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 6 10 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 7 15 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 3. Procedimiento experimental 22 3.3.3. Ensayos combinados: CFD y FotoFenton Ensayos de precipitación química (CFD) El proceso de CFD, se realiza antes o después del FotoFenton en los ensayos combinados. El objetivo de estos ensayos es determinar la influencia de este proceso en la desinfección, así como el efecto de su realización como etapa previa o posterior al FotoFenton en la eliminación de Enterococos, Pseudomonas, sólidos en suspensión y turbidez. En la CFD se utiliza como coagulante el FeCl 3 . Los pHs estudiados son 5 y 7 los cuales se alcanzan con Ca(OH) 2 o HCl, respectivamente. Se ha seleccionado pH 5 al ser el adecuado para el proceso FotoFenton y pH 7 por ser el pH natural del agua de salida de depuradora y el óptimo para la CFD (Morales, 2010). Las características de los reactivos empleados se muestran en la Tabla 3.9. Tabla 3.9. Características de los reactivos empleados en la CFD Reactivo Marca comercial Concentración de la disolución FeCl 3 Cinca S.A. 30% Ca(OH) 2 Panreac Lechada de cal HCl Hermanos Adiego 30% La dosis de Fe 3+ empleada son 15 mg/l (Morales, 2010), tanto si el proceso es previo o posterior al FotoFenton. Tras la CFD la cantidad de hierro presente en el medio es de aproximadamente 0,4 mg/l (Anexo VI), si la cantidad a analizar es superior a esta es necesario añadirlo de forma adicional. La muestra de agua se coloca en el equipo Jar-Test, de la marca comercial SBS, y se le somete al proceso de CFD indicado en la Tabla 3.10. Tabla3.10. Parámetros operacionales del proceso coagulación - floculación Proceso Tiempo (min) Velocidad (r.p.m) Coagulación 3 200 Floculación 15 40 Decantación 30 - Ensayos combinados En la Tabla 3.11. se muestran los experimentos combinados de los procesos de CFD y FotoFenton cuyo objetivo es analizar la influencia del orden de estas etapas, del pH de trabajo, de la dosis de Fe 3+ y del tiempo de exposición a la luz artificial o ambiente en la eliminación de Enterococos y Pseudomonas. Todos los ensayos se realizan por triplicado (Anexo VII). Tabla 3.11. Condiciones de operación de los experimentos combinados Exp. Fe 3+ DFD (mg/l) Fe 3+ FotoFenton (mg/l) H 2 O 2 (mg/l) Radiación t (minutos) pH CFD + FotoFenton 1 15 0,4 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 2 15 0,4 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 7 3 15 5 25 Ambiente 30, 60, 90, 120, 165,210 5 4 15 0,4 25 Ambiente 30, 60, 90, 120, 165,210 5 FotoFenton + CFD 5 15 15 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 5 6 15 15 25 Artificial 30, 60, 90, 120, 165,210 7 4. Resultados y discusión 23 4. Resultados y discusión 4.1. Ensayos de referencia En las Figuras 4.1. y 4.2. se muestran los resultados obtenidos tras someter a la muestra a los ensayos de referencia: el único uso del H 2 O 2 y el de la radiación solar artificial, respectivamente, utilizando las siguientes condiciones de operación: − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial = 30, 60, 90, 120, 165, 210 minutos − pH = 5 Se observa en la Figura 4.1. que el único uso del H 2 O 2 no tiene ningún efecto en la desinfección del medio, 0,1 unidades logarítmicas (Ec. 7) para el caso de los Enterococos y 0,4 para las Pseudomonas. En la Figura 4.2. se ve que el efecto de la radiación artificial es superior al del H 2 O 2 e incrementa cuando aumenta el tiempo de exposición. Para 210 minutos se consigue eliminar 1,5 unidades logarítmicas de Enterococos y 1,8 de Pseudomonas, un efecto significativo pero no comparable con otros desinfectantes (EPA, 1999). El uso independiente del H 2 O 2 y de la radiación solar artificial produce una mayor eliminación para el caso de la E. coli. en condiciones de operación similares. Aun así es necesario un tiempo de exposición superior al de otros PAOs (Ricón y Pulgarin, 2006). Esto es cierto si el tratamiento se realiza a pH ácido (~5), si es a pH natural (7 - 8) estas condiciones no son efectivas (Moncayo-Lasso et al, 2009). La eliminación de Pseudomonas es superior a la de Enterococos en las diferentes situaciones estudiadas. Este contraste se debe a que son bacterias con diferencias es su pared celular, las Pseudomonas son Gram-Negativas y los Enterococos Gram-Positivos. Según se ha comentado en el apartado 2.2., las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular, relativamente fácil de destruir; mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared celular es mucho más gruesa por lo que su destrucción resulta más compleja (EPA, 1999). El uso de otros PAOs como el del O 3 , O 3 +H 2 O 2 o O 3 +TiO 2 ; producen una eliminación de Enterococos mucho mayor para tiempos de exposición muy bajos (Regalado, 2008). 4.2. Ensayos FotoFenton 4.2.1. Estudio de la influencia de la dosis de Fe 3+ La Figura 4.3. muestra los resultados obtenidos tras someter a la muestra a tratamiento FotoFenton, utilizando las siguientes condiciones: Figura 4.2. Eliminación de Enterococos y Pseudomonas en función del tiempo con luz artificial y pH 5 Figura 4.1. Eliminación de Enterococos y Pseudomonas en función del tiempo con 25mg/l de H 2 O 2 y pH 5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 60 90 120 165 210 log (Nt/No) Tiempo (minutos) H2O2 Enterococos Pseudomonas -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 60 90 120 165 210 log (Nt/No) Tiempo (minutos) Radiación solar artificial Enterococos Pseudomonas 4. Resultados y discusión 24 − [Fe 3+ ]= 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15 mg/l − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial = 30 minutos − pH = 5 Se puede observar (Figura 4.3.) que al incrementar la dosis de Fe 3+ aumenta el poder de desinfección de 1,5 a 5 mg/l, disminuyendo a partir de este valor hasta 15 mg/l. Este hecho podría deberse a que mayores cantidades de Fe 3+ suponen un incremento de color en el agua a tratar lo que da lugar a una dispersión de la luz incidente. En consecuencia, se considera la dosis de 5 mg/l de Fe 3+ como la más efectiva en el tratamiento FotoFenton al conseguir una reducción de 0,4 y 1,3 unidades logarítmicas en Enterococos y Pseudomonas, respectivamente. Este grado de eliminación es muy inferior al logrado por otros desinfectantes (EPA, 1999). En los procesos Fenton y FotoFenton existe una relación Fe 3+ o 2+ /H 2 O 2 en la que se produce un máximo en la destrucción del compuesto, si se aumenta la dosis de Fe 3+ o 2+ o se disminuye la eliminación se reduce (Blanco, 2009). 4.2.2. Estudio de la influencia del tiempo de radiación artificial La Figura 4.4. muestra los resultados obtenidos tras someter a la muestra a tratamiento FotoFenton, utilizando las siguientes condiciones: − [Fe 3+ ]= 5 mg/l − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial = 30, 60, 90, 120, 165, 210 minutos − pH = 5 Se puede observar, en la Figura 4.4., que al aumentar el tiempo de exposición a la radiación solar artificial la desinfección se ve altamente incrementada. Con estas condiciones de operación, un tiempo de 210 minutos es el más efectivo en la inactivación bacteriana. Además, en el caso de los Enterococos, hasta ese tiempo no se consigue una eliminación de Enterococos importante, 2,32 unidades logarítmicas. La eliminación de Pseudomonas es más elevada en todos los casos, para un tiempo de 210 minutos la eliminación es de 3,6 unidades logarítmicas. Este grado de eliminación es equiparable a otros agentes bactericidas (EPA, 1999), por lo que la desinfección es relevante. En condiciones de operación análogas, la eliminación de la E. coli es superior. Al aumentarse el tiempo de exposición de luz solar artificial esta bacteria se inactiva más rápidamente (Ricón y Pulgarin, 2006). Figura 4.3. Eliminación de Enterococos y Pseudomonas en función de la dosis de Fe 3+ , con 25mg/l de H 2 O 2 , 30 min de radiación artificial y pH 5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,4 1,5 2 3 4 5 10 15 log (Nt/No) mg/l Fe3+ Efecto de la concentración de Fe3+ Enterococos Pseudomonas 4. Resultados y discusión 25 4.2.3. Estudio de la interacción entre la dosis de Fe 3+ y el tiempo de radiación En las Figuras 4.5. y 4.6. se muestran los resultados obtenidos tras someter a la muestra al tratamiento FotoFenton, utilizando las siguientes condiciones de operación: − [Fe 3+ ]= 5, 10, 15 mg/l − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial = 30, 60, 90, 120, 165, 210 minutos − pH = 5 Las Figuras 4.5. y 4.6. muestran, como en los casos anteriores, que un incremento en la dosis de Fe 3+ de 5 a 15 mg/l supone un descenso en la desinfección y que mayores tiempos de exposición de luz artificial supone un aumento de esta. Una dosis de 5 mg/l de Fe 3+ y 210 minutos de luz artificial son las variables que dan lugar a una mayor desinfección, 2,32 unidades logarítmicas para los Enterococos y 3,6 para las Pseudomonas. Estas, como ya se ha comentado, se eliminan más fácilmente que los Enterococos al ser Gram-positivas. 4.3. Ensayos combinados: CFD y FotoFenton 4.3.1. Estudio de la influencia del orden de los procesos, CFD y FotoFenton Las Figuras 4.7. y 4.8. representan los resultados obtenidos tras someter a la muestra a un tratamiento combinado, FotoFenton y CFD y a la inversa. Las condiciones de operación utilizadas son: − [Fe 3+ ] i = 15 mg/l -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 60 90 120 165 210 log (Nt/No) Tiempo (minutos) Efecto del tiempo Enterococos Pseudomonas Figura 4.4. Eliminación de Enterococos y Pseudomonas en función del tiempo de radiación artificial, con 25mg/l de H 2 O 2 , 5ppm de Fe 3+ y pH 5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 30 60 90 120 165 210 log (Nt/No) Tiempo (minutos) Enterococos Fe3+ 15mg/l Fe3+ 10mg/l Fe3+ 5mg/l Figura 4.5. Eliminación de Enterococos en función del tiempo de radiación artificial a distintas dosis de Fe 3+ , con 25mg/l de H 2 O 2 y pH 5 -4 -3 -2 -1 0 30 60 90 120 165 210 log (Nt/No) Tiempo (minutos) Pseudomonas Fe3+ 15mg/l Fe3+ 10mg/l Fe3+ 5mg/l Figura 4.6. Eliminación Pseudomonas en función del tiempo de radiación artificial a distintas dosis de Fe 3+ , con 25mg/l de H 2 O 2 y pH 5 4. Resultados y discusión 32 Suponiendo que la relación entre log(N o /N t ) y el tiempo de reacción es linear, la velocidad de desactivación de los microorganismos es de primer orden (n=1) y los valores de k ap se obtienen de las pendientes de las representaciones de log(N o /N t ) us t. En este estudio cinético se analiza el efecto de la dosis de Fe 3+ en el proceso FotoFenton del tratamiento combinado, CFD y FotoFenton; además del pH del medio en este tratamiento, sobre la velocidad de eliminación de Enterococos y Pseudomonas. 4.4.1. Efecto del Fe 3+ Las Figuras 4.18. y 4.19. muestran la cinética de degradación para ambas bacterias cuando la muestra es sometida al tratamiento FotoFenton utilizando las siguientes condiciones de operación: − [Fe 3+ ]= 0,4, 5, 10, 15 mg/l − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial = 30, 60, 90, 120, 165, 210 minutos − pH = 5 En las Figuras 4.18. y 4.19. se observa que al aumentar la dosis de Fe 3+ entre 0,4 y 15 mg/l la k ap decrece, es decir, la velocidad de eliminación de los microorganismo disminuye. La degradación de estos bacterias posee un ajuste adecuado para un modelo cinético de orden 1 (R > 0,8 y R > 0,9). La velocidad de eliminación es máxima para 0,4 mg/l de Fe 3+ , la dosis resultante tras la realización del proceso de CFD con 15 mg/l de Fe 3+ . La Tabla 4.3. muestra las distintas k ap así como el ajuste lineal (R) para cada microorganismo a las diferentes dosis de Fe 3+ . Tabla 4.3. Valores de las constantes cinéticas y del coeficiente de regresión lineal en función del [Fe 3+ ] Fe 3+ ( mg/l ) 0,4 5 10 15 Microorganismo Ente. Pseudo. Ente. Pseudo. Ente. Pseudo. Ente. Pseudo. k ap (min - 1 ) 0,019 0,028 0,010 0,014 0,007 0,013 0,007 0,011 R 0,814 0,964 0,767 0,983 0,937 0,895 0,860 0,958 Los valores numéricos de las constantes cinéticas (k ap ) son muy similares a los encontrados en bibliografía para el proceso del FotoFenton (Liou et al, 2003, 2004; Rodríguez et al, 2005; Thiruvenkatachari et al, 2007). La Figura 4.20. muestra claramente como al incrementarse la dosis de Fe 3+ la velocidad de degradación disminuye. La concentración de 0,4 mg/l de Fe 3+ es suficiente para la efectividad del proceso FotoFenton. Si se incrementa la cantidad de hierro el color del agua a tratar se intensifica y difracta la luz que se le irradia disminuyendo el efecto de la desinfección. 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 150 200 250 log (No/Nt) Tiempo (minutos) Pseudomonas 0,4mg/l Fe3+ 5mg/l Fe3+ 10mg/l Fe3+ 15mg/l Fe3+ 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 150 200 250 log (No/Nt) Tiempo (minutos) Enterococos 0,4mg/l Fe3+ 5mg/l Fe3+ 10mg/l Fe3+ 15mg/l Fe3+ Figura 4.18. Ajuste lineal de los datos experimentales de inactivación de Enterococos: 25mg/l H 2 O 2 , pH 5 y distintas dosis de Fe 3+ Figura 4.19. Ajuste lineal de los datos experimentales de inactivación de Pseudomonas: 25mg/l H 2 O 2 , pH 5 y distintas dosis de Fe 3+ 4. Resultados y discusión 33 4.4.2. Efecto del pH Las Figuras 4.21. y 4.22. muestran la cinética de degradación de ambas bacterias cuando la muestra es sometida al tratamiento combinado CFD y FotoFenton utilizando las siguientes condiciones de operación: − [Fe 3+ ] i = 15 mg/l − [H 2 O 2 ]= 25 mg/l − Tiempo de luz artificial y ambiente = 30, 60, 90, 120, 165, 210 minutos − pH = 5 y 7 Las Figuras 4.21. y 4.22. muestran que al aumentar el pH del medio la k ap decrece. La velocidad de eliminación es máxima para pH 5, al ser un mejor pH para este proceso un pH ácido. La degradación de estos microorganismos posee un ajuste adecuado para un modelo cinético de orden 1 (R > 0,9 y R > 0,8). La Tabla 4.4. muestra las distintas k ap así como el ajuste lineal para cada microorganismo a los dos pH estudiados. Los valores numéricos de las k ap son análogos a los encontrados en la bibliografía consultada (Sun et al, 2007). Tabla 4.4. Valores de las constantes cinéticas y del coeficiente de regresión lineal en función del pH pH 5 7 Microorganismo Ente rococos Pseudo monas Enterococos Pseudomonas k ap (min - 1 ) 0,0 19 0,0 28 0,0 17 0,0 26 R 0,814 0,964 0,838 0,903 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 150 200 250 log (No/Nt) Tiempo (minutos) Enterococos pH 7 pH 5 0 1 2 3 4 5 6 0 50 100 150 200 250 log (No/Nt) Tiempo (minutos) Pseudomonas pH 7 pH 5 y = -0,001x + 0,031 R² = 0,877 y = -0,0004x + 0,0167 R² = 0,9556 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0 5 10 15 Kap (min-1) [Fe3+] (mg/l) Enterococos Pseudomonas Figura 4.20. Efecto de [Fe 3+ ] en k ap Figura 4.21. Ajuste lineal de datos experimentales de eliminación de Enterococos: 25mg/l H 2 O 2 , 15 mg/l Fe i 3+ y pH 5 o 7 Figura 4.22. Ajuste lineal de datos experimentales de eliminación de Pseudomonas: 25mg/l H 2 O 2 , 15 mg/l Fe i 3+ y pH 5 o 7 4.5. Estudio económico Un análisis de costes de un tratamiento a escala real supondría tener en cuenta varios aspectos como son el capital inicial, depende de las condiciones de operación, el tipo de sistema adoptado, reactor y del tipo de efluente a tratar. En este trabajo s olo se L os tres reactivos implicados en el tratamiento (HCl) para disminuir el pH hasta 5 Tabla Reactivo Cantidad Coste reactivo FeCl 3 15 mg/l H2O H 2 O 2 25 mg/l H2O HCl 8 l HCl /m 3H2O FeCl 3 0,11  ()9:;  -< =1 ()9:; 10 ;  ()9: ; H 2 O 2 2510 @A  -< <  -<< HCl 8  -9:  -< ; =1 -< ; 10 ;  -< ; =1  1  - La Figura 4.23 . muestra claramente que el reactivo más influyente en el coste del tratamiento es el HCl. La cantidad necesaria a añadir para disminuir el pH hasta 5 es muy elevada, po r eso el gran coste derivado de lo que no supone un valor elevado debido a la pequeña cantidad empleada su coste es mu Figura 4.2 4. Resultados y discusión 34 Estudio económico Un análisis de costes de un tratamiento a escala real supondría tener en cuenta varios capital inicial, los costes de operación y mantenimiento, depende de las condiciones de operación, el tipo de sistema adoptado, la configuración del reactor y del tipo de efluente a tratar. olo se van a considerar los costes rela tivos a los reactivos empleados. os tres reactivos implicados en el tratamiento son: FeCl 3 , H 2 O 2 y el acondicionante del para disminuir el pH hasta 5 . La Tabla 4.5. muestra las características de estos reactivos. Tabla 4.5. Características de los reactivos empleados Coste reactivo (€/kg) Densidad (kg/l) Pureza Empresa suministradora 0,110 1,440 30% Cinca S.A., Zaragoza 0,21 - 40% FMC Foret, Zaragoza 0,03 1,18 99% Hermanos Adiego, 15 mg/l = 0,11 ml FeCl3 /l H2O ; =1,44  ()9:;  ()9:; =0,11 €  ()9:; 1,7410 @F €  -<  < =100 0,3 =0,21 €  -<< 1,5710 @F €  -< 0,0157 €  -< ; - < =1,18  -9:  -9: =0,03 €  -9: 2,8310 @H €  -<  . muestra claramente que el reactivo más influyente en el coste del tratamiento es el HCl. La cantidad necesaria a añadir para disminuir el pH hasta 5 es muy r eso el gran coste derivado de él. El FeCl 3 es un reactivo relativamente barato por un valor elevado . El H 2 O 2 es el reactivo más caro de los empleados, pero debido a la pequeña cantidad empleada su coste es mu y bajo. 5% 5% 90% Costes reactivos FeCl3 H2O2 HCl Figura 4.2 3 . Influencia del coste de los tres reactivos Resultados y discusión Un análisis de costes de un tratamiento a escala real supondría tener en cuenta varios costes de operación y mantenimiento, etc.; todo lo cual la configuración del tivos a los reactivos empleados. el acondicionante del pH . La Tabla 4.5. muestra las características de estos reactivos. Empresa suministradora Cinca S.A., Zaragoza FMC Foret, Zaragoza Hermanos Adiego, Zaragoza  0,0174 €/ ; € / ;  0,283 €/ ; . muestra claramente que el reactivo más influyente en el coste del tratamiento es el HCl. La cantidad necesaria a añadir para disminuir el pH hasta 5 es muy es un reactivo relativamente barato por es el reactivo más caro de los empleados, pero 4. Resultados y discusión 35 Por lo tanto, es necesario hacer hincapié en la cantidad de HCl necesaria a añadir al ser el reactivo que supone un mayor coste ya que se añade en gran cantidad para alcanzar pH 5. En el apartado 4.3.2. se ha concluido que pH 5 es más efectivo que pH 7 en la desinfección. Sin embargo, a pH 7 también se eliminan parte de las bacterias del medio y la cantidad de HCl a añadir es muy inferior (Tabla 4.6.). No siempre es necesario realizar una desinfección intensiva, esta depende del uso posterior del agua tratada. Si por ejemplo el agua se va a utilizar para uso agrícola o recreativo en el que esta puede contener altas concentraciones de bacterias (Anexo I), realizar el tratamiento a pH 7 produciría una desinfección adecuada para este fin y el coste final del tratamiento se vería altamente reducido (Tabla 4.6). También se podría estudiar la desinfección producida por el tratamiento seleccionado a un pH intermedio, pH 6, pero se puede comprobar en la Tabla 4.6. que el coste no se vería prácticamente modificado de realizarlo a pH 5. Tabla 4.6. Cantidad y coste de la adición del HCl en función del pH pH Cantidad ml HCl /l H2O Coste HCl (€/m 3 ) Influencia del coste del HCl en el coste total del tratamiento Coste Total (€/m 3 ) 5 8 0,283 89,8 % 0,316 6 6 0,212 86,5% 0,245 7 2 0,071 68,3% 0,104 36 5. Conclusiones 37 5. Conclusiones Las principales conclusiones obtenidas tras la realización de este trabajo son las siguientes: • Las aguas de salida de EDARs contienen, en general, concentraciones elevadas de microorganismos. Se detectan con frecuencia bacterias de origen fecal como Escherichia Coli o Enterococcus Faecalis así como Clostridium, Salmonella y Pseudomona Aeruginosa. Por ello, se han seleccionado los Enterococos y las Pseudomonas como bacterias a estudiar este trabajo. El microorganismo más estudiado es la Escherichia Coli por lo que su comportamiento es muy conocido. Los Enterococos también han sido ampliamente investigados, no siendo este el caso de las Pseudomonas. Este trabajo supone un punto de partida para el análisis de las Pseudomonas en materia de desinfección mediante tratamientos FotoFenton. • La eliminación de Pseudomonas es superior a la de Enterococos en las diferentes situaciones estudiadas. Este contraste se debe a que son bacterias con diferencias es su pared celular, las Pseudomonas son Gram-Negativas y los Enterococos Gram-Positivos. Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular, relativamente fácil de destruir; mientras que las bacterias Grampositivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared celular es mucho más gruesa por lo que su destrucción resulta más compleja. • La diferencia en la eliminación entre ambas bacterias es mayor a elevados tiempos de exposición a la luz solar artificial y es aproximadamente de una unidad logarítmica. • Las características físico-químicas del agua utilizada afectan a la desinfección obtenida a través de parámetros como la turbidez o los sólidos en suspensión. • El proceso de coagulación-floculación-decantación como única etapa del proceso no desinfecta y tratando el agua exclusivamente con el proceso FotoFenton la eliminación de bacterias es elevada. Sin embargo, si tras la coagulación-floculación-decantación se realiza el proceso FotoFenton, la desinfección producida se ve altamente incrementada debido a que el agua se encuentra más limpia y la radiación incide sin obstáculos en todo el volumen. • La cantidad de hierro presente en el agua tras la realización del proceso de coagulaciónfloculación- decantación con 15 mg/l de Fe 3+ y pH 5 es aproximadamente de 0,4 mg/l. Esta cantidad es suficiente para la realización posterior del tratamiento FotoFenton, es la que da lugar a una mayor desinfección. Mayores cantidades de Fe 3+ suponen un incremento de color en el agua a tratar lo que da lugar a una dispersión de la luz incidente. • El tratamiento más efectivo, en términos de desinfección, corresponde a aquel en el que se realiza en primer lugar el proceso de coagulación-floculación-decantación seguido del FotoFenton con una dosis de Fe 3+ inicial de 15 mg/l, 25 mg/l de H 2 O 2 , 120 minutos de radiación solar artificial y pH 5. Con estas condiciones de operación se consigue eliminar: 4,6 unidades logarítmicas de Enterococos, 5 unidades logarítmicas de Pseudomonas, 91% de sólidos en suspensión y 96% de turbidez. Este tratamiento consigue unas desinfecciones muy similares e incluso superiores a las de otros desinfectantes que se usan comúnmente como es el caso del cloro o la radiación UV. 5. Conclusiones 38 • Los parámetros más influyentes del tratamiento seleccionado como el más efectivo en la desinfección son: el tiempo de exposición a la radiación solar artificial, la realización previa o no del proceso de coagulación-floculación-decantación así como la interacción entre ambas. Un mayor tiempo de radiación siempre es favorable en términos de desinfección haya o no coagulación-floculación-decantación previa. La realización de este proceso antes del FotoFenton favorece la eliminación de microorganismos, sean elevados o no los tiempos de radiación. El uso simultáneo de altos tiempos de radiación y del proceso de coagulación-floculación-decantación previo, favorece especialmente esta desinfección. • El uso de la radiación solar artificial en el proceso FotoFenton ocasiona una mejor desinfección que si se emplea luz ambiental. La radiación ultravioleta favorece la formación de los radicales hidroxilo y superoxido. Las células contienen cromóforos intracelulares que absorben la radiación UV-A y UV-B, lo que en presencia de oxigeno resulta toxico para la célula pues favorece la generación de especies reactivas de oxigeno, aumentando la desinfección. En este trabajo hasta 120 minutos de exposición a la radiación artificial no se consiguen desinfecciones importantes empleando 15 mg/l Fe 3+ , 25 mg/l de H 2 O 2 , pH 5 y coagulación-floculación-decantación previa al FotoFenton. • El único uso del H 2 O 2 no tiene ningún efecto en la desinfección del medio, el de la radiación solar artificial es ligeramente superior y se ve incrementado con el tiempo de exposición. El H 2 O 2 necesita de la radiación para poder producir radicales hidroxilo, principales causantes de la desinfección. • Al ajustar la cinética de inactivación con el modelo de Chick-Watson las regresiones obtenidas no son muy elevadas debido a las suposiciones iniciales consideradas. Las constantes cinéticas obtenidas, k ap , son muy similares a los valores bibliográficos consultados en situaciones análogas. Al aumentar la dosis de Fe 3+ entre 0,4 y 15 mg/l o aumentar el pH de 5 a 7, la velocidad de eliminación de los microorganismo disminuye. La eliminación de Pseudomonas se produce a una velocidad superior que la de Enterococos, las constantes cinéticas obtenidas son aproximadamente un 50% superiores para el caso de las Pseudomonas. • La supervivencia de las bacterias está muy condicionada por el pH del medio en el que se encuentran. Para valores de pH por debajo de 5, la muerte celular tiene lugar en un breve espacio de tiempo por lo que hay que trabajar a valores de pH iguales o superiores a 5 para que sea posible cuantificar el efecto del tratamiento efectuado. • Realizar el tratamiento seleccionado a pH 5 da lugar a una desinfección mucho mayor que a pH 7 ya que el proceso FotoFenton necesita de un pH ácido para una mayor formación de OH · . Debido a que es necesario añadir gran cantidad de HCl para alcanzar pH 5, este reactivo es el más influyente en el coste del tratamiento. Sin embargo, utilizar un pH 7 también elimina parte de las bacterias del medio y la cantidad de HCl a añadir es muy inferior. Si el uso que se le va a dar al agua tratada es, por ejemplo, agrícola o recreativo; realizar el tratamiento a pH 7 produce una desinfección adecuada para tal fin y el coste final del tratamiento se ve altamente reducido. 6. Bibliografía 39 6. Bibliografía • Al-Hayek, N.; Doré, M.; “Oxidation of organic compounds by Fenton’s reagent: possibilities and limits”. Environment Technology Letters, 6 (1) (1985) 37-50. • Arce; O.; “Indicadores biológicos de calidad del agua”. Universidad Mayor de San Simón (2006). • B.O.E.; 2007. Real Decreto 1620/2007 de 7 de diciembre, por el que se establece el régimen jurídico de la reutilización de aguas depuradas. BOE nº 294 de 08.12.2007. • Barb, W., Baxendale, J., George, P., “Reactions of ferrous and ferric ions with hydrogen peroxide .1. The ferrous ion reaction”. Transactions of the Faraday Society 47 (1951) 462 – 500. • Barb, W., Baxendale, J., George, P., “Reactions of ferrous and ferric ions with hydrogen peroxide .2. The ferrous ion reaction”. 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AnexoI: Requisitos de calidad para aguas regeneradas 48 AnexoI: Requisitos de calidad para aguas regeneradas 49 50 51 ANEXO II Microbiología de las aguas 52 AnexoII: Microbiología de las aguas 53 Anexo II: Microbiología de las aguas Las características biológicas y microbiológicas del agua vienen regidas por la población de microorganismos acuáticos que alberga y que afectan de un modo muy importante a su calidad. Algunos de estos microorganismos pueden dañar de forma más o menos grave la salud humana, tanto por sí mismos como mediante la producción de toxinas durante su ciclo vital, dando lugar a las denominadas enfermedades de transmisión hídrica. Éstas tienen una incidencia especialmente acusada en los países en vías de desarrollo, e incluso cada vez más frecuentemente en los desarrollados. En los países en vías de desarrollo se estima que el 80% de las enfermedades y más de un tercio de las muertes están asociadas a la utilización y consumo de aguas contaminadas (Guimaraes et al, 2001). Las enfermedades de transmisión hídrica componen un grupo importante de enfermedades que suelen aparecer en brotes epidémicos, algunos de ellos de graves consecuencias para amplios grupos poblacionales, y cuya común particularidad es que se transmiten a través de aguas contaminadas por distintos agentes biológicos (microorganismos patógenos) y se manifiestan por cuadros importantes de diarreas agudas. La forma más peligrosa de contaminación de agua es la que se produce, a través de la transmisión fecal-oral, mediante la cual un microorganismo patógeno eliminado en las heces humanas o de animales contamina el medio acuático y luego es ingerido. En términos globales se estima que las enfermedades transmitidas por el agua son responsables de más de 2 millones de muertes anuales, en especial en niños menores de 5 años. Esto equivale a un choque de 20 aviones por día y representa un 15% de todas las muertes en el grupo de edad mencionado (Tortor et al, 1993). Los microorganismos patógenos se transmiten sobre todo por la ingestión del agua que los contenga, aunque también se pueden transmitir por contacto con personas o animales infectados, o por exposición a aerosoles ricos en estos patógenos. Por otro lado, el contenido microbiológico de un agua puede afectar al desarrollo posterior de olores y sabores en esa agua, incluso después de su correcta potabilización. Los microorganismos más numerosos que pueden albergar las diferentes masas de agua existentes en nuestro planeta se pueden clasificar en bacterias, protozoos y virus (EPA 1999). Bacterias Las bacterias son microorganismos procariotas, en general de menor tamaño que los organismos eucariotas, pero mayores que los virus. En función de la naturaleza y tipo de pared celular se pueden agrupar en tres grandes divisiones: micoplasmas, que no sintetizan una pared celular y sólo tienen membrana celular; bacterias Gram-positivas, que sintetizan una pared celular de una capa; bacterias Gram-negativas, que poseen una pared celular con al menos dos capas estructuralmente distintas. Los micoplasmas son organismos deformables y frágiles, debido a la ausencia de pared celular. Suelen ser contaminantes habituales de cultivos de tejidos, además de haberse encontrado en otros medios libres (aguas). Sus células pueden ser redondeadas o alargadas e irregulares, o bien filamentosas. Pueden ser móviles o inmóviles. Son los microorganismos más pequeños observables al microscopio óptico. AnexoII: Microbiología de las aguas 54 Las bacterias Gram-positivas pueden ser aerobias o anaerobias. También se pueden diferenciar según la forma que presentan: pueden ser esféricas (cocos) o alargadas (bacilos). En algunos casos forman endosporas resistentes al calor, la radiación y los agentes tóxicos. Por otro lado, muchas bacterias Gram-positivas unicelulares pueden ser inmóviles o bien móviles mediante flagelos. Las bacterias Gram-negativas son un grupo muy diverso de microorganismos, algunos de los cuales tienen flagelos para moverse, en diferente número y morfología, bien insertados en una zona determinada de la superficie celular (flagelación polar) o distribuidos por toda la pared celular (flagelación perítrica). Para clasificar las bacterias en Gram-positivas y Gram-negativas, se usa un tipo de tinción especial, la tinción de Gram, que sirve para poner de manifiesto la estructura de la pared celular del individuo. La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Gram-positivas y Gram-negativas. El procedimiento completo llevado a cabo en la realización de una tinción de Gram puede observarse en la Figura II.1., así como los cambios de color producidos en las bacterias según su clasificación. En primer lugar se realiza un frotis de un cultivo de las bacterias a estudiar en un porta. Cuando la muestra está seca se prosigue con la tinción. El primer colorante usado es el denominado colorante primario, violeta de genciana, el cual imparte su color a todas las células. Tras un minuto, se lava el porta con agua destilada y se añade yodo. Este compuesto da a todas las bacterias un color violeta oscuro. Tras otro minuto, se vuelve a lavar el porta y se añade un agente decolorante el cual únicamente elimina el color violeta de las células Gramnegativas. Este decolorante puede ser alcohol o una mezcla alcohol-acetona. En este punto de la tinción, las bacterias Gram-positivas siguen siendo violetas mientras que las Gram-negativas son incoloras y por consiguiente son invisibles al microscopio. Por último, se elimina el alcohol con agua y se añade safranina, un colorante denominado de contraste. Se lava el porta y se seca. El motivo de la adición de este último colorante es conseguir que las bacterias Gramnegativas sean visibles al microscopio, tomando un tono rosado. Las bacterias Gram-positivas por su parte conservarán el color violeta que ya tenían (Figura II.2). Figura II.1. Procedimiento y cambios de color en la tinción de Gram AnexoII: Microbiología de las aguas 55 La diferencia principal de los dos tipos de bacterias es que las Gram-negativas se decoloran con alcohol, mientras que las Gram-positivas no lo hacen. Esto se debe a que en las bacterias Gram-positivas la red de peptidoglucanos (disacáridos y aminoácidos) origina varias capas superpuestas, es gruesa y homogénea y no hay membrana externa; mientras que en las bacterias Gram-negativas hay una única capa de peptiglucanos sobre la que se dispone una membrana externa constituida por una capa de fosfolípidos y otra de glicolípidos, asociados a polisacáridos, que se proyectan hacia el exterior. Por tanto, al ser la capa de peptiglucanos más delgada en las bacterias Gram-negativas, el complejo de gran tamaño formado por el violeta de genciana y el yodo (complejo CV-I) se elimina sin problemas ya que el alcohol altera la capa externa de lipopolisacáridos. Protozoos Se trata de un grupo variado de células eucariotas, típicamente móviles y no fotosintéticas. Se pueden considerar cuatro grupos principales de protozoos: flagelados, flagelados ameboides, ciliados y parásitos. Este último grupo tiene especial incidencia en patogenicidad de aguas destinadas al consumo humano. Dos ejemplos importantes son Cryptosordium parvum y Giardia lamblia. Virus Microorganismos acelulares ubicados en la frontera entre la vida y el mundo inorgánico (materia inerte). No son capaces de vivir ni reproducirse si no es parasitando células a las que ocasiona su destrucción. Están compuestos por el virión (integrado por ácido nucleico ADN o ARN) y una cápside proteica. Su tamaño es extremadamente pequeño, oscilando entre las 20 milimicras y las 300 milimicras. Su descubrimiento se puso de manifiesto dado que eran tan pequeños que atravesaban los filtros que retenían las bacterias. Los virus se clasifican atendiendo al tipo de ácido nucleico que los conforma y a su morfología, la cual responde a tres formas principales: simetría icosaédrica, helicoidal y compleja. Figura II.2. Tinción de Gram AnexoII: Microbiología de las aguas 56 Muchas especies de virus se transmiten vía aguas naturales, ríos, arroyos, lagos y embalses. En concreto, los virus acuáticos suelen ser parásitos de organismos superiores, de organismos o microorganismos típicamente encontrados en aguas. A diferencia de las bacterias, los virus son siempre nocivos y provocan enfermedades a todo organismo al que atacan. Enfermedades tan comunes como la gripe, el catarro, el sarampión o la viruela, son debidas a virus. Indicadores microbiológicos de contaminación fecal Escherichia coli Pertenece al grupo de los coliformes que se definen como bacterias aeróbicas o anaeróbicas facultativas, Gram-negativas, que no crean endosporas, con forma de bacilo y que fermentan la lactosa formando gas a las 48 horas de ser cultivadas en caldo lactosado a 35ºC. Es uno de los habitantes más comunes del tracto intestinal humano y animal, y el más estudiado en microbiología. De hecho, la concentración de esta bacteria en las heces de origen humano y animal es muy elevada, del orden de 109 por gramo (OMS, 1995). Esta bacteria es una herramienta importante en la investigación biológica básica. En 1895 se propuso una prueba E.coli para determinar la potabilidad del agua de bebida (Gesche et al., 2003). No suele ser un organismo patógeno pero puede causar infecciones urinarias y ciertas cepas segregan enterotoxinas que producen diarreas y en ocasiones enfermedades muy graves transmitidas por los alimentos. Clostridium perfringens El género Clostridium se define como bacteria Gram-positiva, de forma bacilar y anaerobia estricta, aunque puede resistir concentraciones más o menos fuertes de oxígeno. Todos los Clostridium forman una espora, circular u oval, a menudo deformante. El hecho de formar esporas es lo que les confiere una mayor resistencia ante las condiciones adversas del medio, como la resistencia al calor y a varias sustancias químicas. Pueden ser móviles (debido a la presencia de cilios perítricos) o inmóviles. Las enfermedades relacionadas con esta bacteria son el tétanos, el botulismo y la gangrena gaseosa. Estas bacterias también son causa frecuente de diarrea transmitida por los alimentos. Enterococcus sp. El género Enterococcus está formado por bacterias esféricas u ovoides (cocos), que se encuentran aisladas, formando pares (diplococos) o cadenas cortas. Son Gram-positivos, no formadores de esporas, catalasa negativos e inmóviles, y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales. Son organismos facultativos anaerobios, por lo que sobreviven bien en ausencia de oxígeno. Son causantes en la mayoría de los casos de infecciones endógenas, entre ellas, infección del tracto urinario, endocarditis infecciosa, diverticulitis, meningitis, bacteremias e infecciones intrahospitalarias asociadas a procedimientos como instalación de catéteres vasculares, urinarios y neuroquirúrgicos entre otros. En cuanto al género Enterococcus como indicador de contaminación fecal, se ha demostrado que es un indicador muy útil debido a su gran abundancia en las heces y a su gran AnexoII: Microbiología de las aguas 57 capacidad de supervivencia en el medio. La posibilidad de indicar la fuente de contaminación mediante la identificación de estas especies ha llevado a debate si los Enterococos deberían ser considerados indicadores de contaminación fecal más fiables que E.coli (Meier et al, 1997). Finalmente, los resultados indican que realmente son un indicador más estable que E.coli y que los coliformes fecales. Además son un indicador conservador bajo condiciones de agua salobre. Pseudomona Aeruginosa Las Pseudomonas Aeruginosas son una bacteria Gram-negativa, aeróbica, con motilidad unipolar. Es un patógeno oportunista en humanos y también en plantas. P. Aeruginosa es a menudo identificada, de modo preliminar, por su apariencia perlada y olor a uvas in vitro. Esta bacteria es capaz de crecer en combustibles como queroseno o gasóleo, ya que es un microorganismo capaz de nutrirse a partir de hidrocarburos, causando estragos de corrosión microbiana, y creando una gelatina oscura que a veces se identifica inadecuadamente con un alga. Puede causar enfermedades respiratorias graves, como la neumonía. 64 Anexo IV: Metodología microbiológica 65 Anexo IV: Metodología microbiológica Medios de cultivo Un medio de cultivo es un material nutritivo artificial preparado para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio. Algunas de las bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren medios especiales. A la hora de cultivar una bacteria determinada el medio de cultivo tiene que satisfacer una serie de criterios. Debe contener los nutrientes adecuados para la bacteria específica que se desea desarrollar. También debe contener humedad suficiente, un pH ajustado y una concentración conveniente de oxígeno. El medio en el que se siembra debe ser estéril, es decir, en un principio no debe tener bacterias viables, de modo que el cultivo tenga sólo las bacterias que se agreguen al medio. Por último, el medio de cultivo sembrado debe incubarse a la temperatura adecuada. Se dispone de una amplia variedad de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias en el laboratorio. Casi todos esos medios están deshidratados y sólo precisan el agregado de agua y un proceso de esterilización (Tortor et al, 1993). Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio sólido se agrega un agente solidificante como el agar. Es un polisacárido complejo proveniente de un alga marina. Posee algunas propiedades muy importantes que lo convierten en valioso para la microbiología. Pocos microorganismos pueden degradarlo, de modo que permanece en estado sólido. Se licúa a una temperatura de alrededor de 100ºC. Para el uso en laboratorio se mantiene en baños de agua a 50ºC. En el estudio llevado a cabo se han utilizado tres tipos de medios de cultivo diferentes, por un lado se utiliza agar nutritivo que permite el crecimiento de cualquier tipo de bacteria y por otro lado se han utilizado agares selectivos tanto para Pseudomonas como para Enterococos. Agar nutritivo Este tipo de agar se utiliza para obtener grandes números de colonias de un determinado tipo de bacteria, a partir de las cuales se procederá a fortificar o dopar las muestras de agua con las que se va a trabajar. Su composición es la que aparece en la Tabla IV.1. Tabla IV.1. Composición del agar nutritivo Ingrediente Cantidad ( g/l ) Peptona (proteína parcialmente digerida) 5,0 Extracto de carne 3,0 Cloruro de sodio 8,0 Agar 15,0 Para preparar este agar se añaden 23 gramos del agar deshidratado por cada litro de agua destilada. Se lleva a ebullición y tras esto se esteriliza mediante el autoclave. Después se vierte la cantidad adecuada en las placas Petri dispuestas para el posterior cultivo de bacterias. Se han de incubar entre 24 y 48 horas a una temperatura de 35ºC ± 2,0 ºC. Anexo IV: Metodología microbiológica 66 Agar Centrimide Este agar es selectivo de Pseudomonas y por lo tanto tiene inhibido el crecimiento de otras bacterias. La composición de este agar es la que figura en la Tabla IV.2. Tabla IV.2. Composición del agar Centrimide Ingrediente Cantidad (gramos/litro) Peptona 20,0 Cloruro de magnesio 1,4 Sulfato de potasio 10,0 Bromuro de cetilmetil amonio 0,3 Agar 15,0 Para preparar este medio de cultivo es preciso diluir 46,7 gramos del medio deshidratado en un litro de agua que contenga 10 ml de glicerina y llevarlo a ebullición. Tras someterlo al proceso de esterilización en el autoclave se vierte el medio fundido en placas Petri y una vez solidificado se conservan en la nevera hasta su utilización. Agar Slanetz & Bartley Al igual que el medio anterior, se trata de un medio selectivo, aunque en este caso es selectivo para Enterococos. Su composición es la mostrada en la Tabla IV.3. Tabla IV.3. Composición del agar Slanetz & Bartley Ing r ediente Cantidad (gramos/ litro) Triptosa 20,0 Extracto de levadura 5,0 Glucosa 2,0 Hidrogenofosfato de dipotasio 4,0 Azida de sodio 0,4 Agar 12,0 Métodos de siembra En el presente trabajo se han utilizado dos métodos de siembra distintos. Por un lado se han realizado siembras en superficie, y por otro, se ha utilizado el método de filtración en membrana. Método de siembra en superficie Este método de siembra se utiliza tanto en el caso de agar nutritivo, como cuando se espera una alta concentración de bacterias suspendidas en el agua tratada y por tanto se han de realizar diluciones seriadas como se explica en el siguiente epígrafe. En el caso del agar nutritivo hablaremos de dos formas de siembra dependiendo de cómo se realice la distribución de la cepa madre sobre la placa. Podemos hablar de siembra por agotamiento (Figura IV.1) o de siembra en estría (Figura IV.2). Anexo IV: Metodología microbiológica 67 Para los otros dos tipos de agar, cuando se hable de siembra en superficie, se refiere a una siembra consistente en extender con ayuda de un asa de Drigalski estéril una cantidad determinada de muestra sobre la superficie del medio solidificado contenido en una placa Petri de 90 mm de diámetro. Método de la dilución seriada Pese a que la legislación vigente (Real Decreto 140/2003) recomienda un volumen de filtración de 100 mL, en muchos casos esto no es posible. La gran variabilidad de concentraciones de bacterias que presentan las muestras hace necesario trabajar con cantidades más pequeñas e incluso con diluciones que permitan un recuento adecuado puesto que en el método de filtración de membrana sólo serán válidas las placas que contengan entre 15 y 150 colonias, mientras que en el caso de siembra en superficie, este número puede variar entre 30 y 300. Esta técnica se conoce como dilución seriada. La Figura IV.3. muestra cómo proceder con esta técnica. Método de filtración en membrana Este método es un método normalizado que se utiliza cuando las concentraciones esperadas de bacterias son pequeñas. Se utiliza un equipo para filtración en membrana (Millipore) y filtros de membrana estériles de 0,45μm de tamaño nominal de poro (Millipore). Se filtra un volumen de muestra adecuado, y se coloca el filtro de membrana en el medio selectivo. La norma que rige este método de filtración es la UNE-EN ISO 16266:2008 para Pseudomonas y la UNE-EN ISO 7899-2 en el caso de Enterococos. Figura IV.1. Siembra por agotamiento Figura IV.2. Siembra en estría Figura IV.3. Técnica de dilución serieada 68 69 ANEXO V Equipos 70 AnexoV: Equipos 71 Anexo V: Equipos Cámara solar Como fuente de radiación UV/VIS se utiliza una cámara solar ATLAS SUNTEST CPS+/XLS+. Esta cámara es un instrumento equipado con una lámpara de xenon utilizado para iluminación y envejecimiento de materiales que puede emplearse como simulador de luz solar natural y que además incluye sistema de agitación, filtro de cuarzo de filtración e irradiación UV, luz visible, control de temperatura, etc. Para su manejo, cuenta con un sistema de medición y regulación de la intensidad de irradiación programable. La irradiación del equipo oscila entre 250 y 785 W/m 2 con una longitud de onda de 300 a 800 nm. En la Figura V.1. se muestra la cámara solar utilizada y en la Tabla V.1. se muestran las características técnicas de esta cámara solar. Se utiliza un filtro de “vidrio de ventana” de manera que se irradian las muestras con una longitud de onda de 320 a 800 nm, de forma que se simula la radiación solar que alcanza la superficie terrestre y además se limitan las longitudes de onda a aquellas que no son letales para las células. En la Figura V.2. se presentan los espectros de absorción de la lámpara de xenon utilizada en la cámara solar. Figura V.1. Cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS+ Figura V.2. Radiometría de la luz solar y la lámpara de xenón con y sin filtro de ventana a) Sin filtro de ventana. b) Con filtro de “vidrio de ventana” AnexoV: Equipos 72 Tabla V.1. Características técnicas de la cámara solar Atlas Suntest CPS+/XLS+ Tensión de la red Conexión de la cámara 200 V – 240 V ± 10%, 50/60 Hz Conexión del sistema de inundación 200 V – 240 V ± 10%, 50/60 Hz Conexión del grupo frigorífico 230 V/50 Hz Consumo nominal Sin sistema de inundación 2.1 KVA Potencia de la lámpara de xenon Máximo 1.5 KW Intensidad de la corriente del equipo Máximo 4.5 A Intensidad de inundación Máximo 8 A Consumo nominal del refrigerador 2.2 KW Características radiotécnicas Distancia entre eje de la lámpara y nivel de muestras 230 mm Superficie destinada a la muestra 500 cm2 Temperatura estándar de cuerpo negro a nivel de muestras Hasta 100 ºC ± 10% Intensidad de irradiación regulable de forma continua para la gama de longitudes de onda por debajo de los 800 nm en el sistema de filtros máximo UV 250 W/m 2 – 765 W/m 2 ± 10% Equipo de filtración por membranas En los casos en los que se precisa realizar la siembra por filtración, se recurre a un equipo compuesto por una rampa de filtración con la cual se filtra a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 45 μm utilizando un embudo estéril (Figura V.3.). En primer lugar, se procede a la limpieza de la rampa de filtración que puede llevarse a cabo mediante el uso de alcohol o con la aplicación directa de una llama, con lo que se logrará tener condiciones estériles para trabajar. Una vez limpio, se sitúa un filtro de membrana sobre la rampa de filtración y a continuación se coloca el embudo estéril. Ahora ya está preparado para verter la muestra a filtrar en el embudo, la cual se hará pasar a través del filtro haciendo vacío (Figura V.4). Figura V.3. Equipo de filtración por membrana AnexoV: Equipos 73 Cuando toda la muestra ha pasado a través del filtro de membrana, se desecha el filtrado y con ayuda de unas pinzas previamente esterilizadas, se toma el filtro de membrana teniendo precaución de no cogerlo por la zona atravesada por el filtrado, y se deposita sobre una placa Petri preparada para el crecimiento de los microorganismos de interés. Estufas de cultivo Las estufas de cultivo utilizadas son de la marca J.P Selecta modelo Incudigit (Figura V.5). Se caracterizan por ser estufas a convección natural pudiendo regularse la temperatura así como el tiempo, siendo la lectura de ambos parámetros digital. La resolución es de 0,1ºC. Las temperaturas pueden regularse entre +5ºC hasta +80ºC, siendo la estabilidad alcanzada de ± 0,5ºC y la homogeneidad de ±2% a la temperatura de trabajo. Por su parte el error de consigna cometido será de un ±2% a la temperatura de trabajo. Al tratarse de una estufa para cultivo bacteriológico, posee una puerta interior de cristal templado que favorece la estabilidad de la temperatura en la estufa, evitando oscilaciones que podrían afectar a los cultivos. Figura V.4. Filtración Figura V.5. Estufa de cultivo Incudigit 80 81 ANEXO VII Resultados Desinfección 82 AnexoVII: Resultados desinfección 83 Anexo VII: Resultados desinfección Ensayos de referencia H 2 O 2 Tabla VII.1. Resultados de desinfección empleando 25 mg/l de H 2 O 2 Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 -0,09 -0,43 2 -0,07 -0,38 60 1 -0,03 -0,43 2 - -0,38 90 1 -0,07 -0,43 2 -0,1 -0,38 120 1 -0,098 -0,43 2 -0,11 -0,38 165 1 -0,13 -0,43 2 -0,13 -0,38 210 1 -0,13 -0,43 2 -0,16 -0,38 Luz artificial Tabla VII.2. Resultados de desinfección empleando luz artificial Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 -0,2 -0,4 2 -0,32 -0,3 60 1 -0,45 -0,6 2 -0,34 -0,67 90 1 -0,4 -1,2 2 -0,47 -1,14 120 1 -0,5 -1,49 2 -0,52 -1,07 165 1 -0,85 -1,89 2 -1,1 -1,76 210 1 -1,5 -2,05 2 -1,34 -1,87 AnexoVII: Resultados desinfección 84 Ensayos FotoFenton Efecto de la dosis de Fe 3+ para 30 minutos de radiación artificial Tabla VII.3. Resultados de desinfección (FF) empleando 30min de radiación artificial y diferentes dosis de Fe 3+ Enterococos Pseudomonas [Fe 3+ ] (mg/l) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 1,5 1 -0,32 -0,78 2 -0,03 - 3 -0,15 - 2 1 -0,25 -2,6 2 -0,32 -0,65 3 -0,28 -0,53 3 1 -0,27 -0,54 2 -0,33 -2,3 3 - -0,82 4 1 -0,36 -1,1 2 -0,34 -1,07 3 - - 5 1 - -0,85 2 -0,4 -1 3 -0,36 -1,3 10 1 -0,3 -0,66 2 -0,36 - 3 -0,34 - 15 1 -0,2 -0,6 2 -0,16 - 3 -0,22 - AnexoVII: Resultados desinfección 85 Efecto del tiempo de radiación artificial con 5 mg/l de Fe 3+ Tabla VII.4. Resultados de desinfección (FF) empleando 5 mg/l de Fe 3+ y distintos tiempos de radiación artificial Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 -0,25 -1,45 2 - -1,65 3 -0,3 -1,69 60 1 -0,44 -1,8 2 - -2,7 3 -0,45 - 90 1 -0,48 -2 2 -0,54 -2,18 3 -0,48 -3 120 1 -0,4 -2,4 2 -0,56 -2,52 3 -0,34 -2,72 165 1 -1 -2,78 2 -1,15 -2,7 3 - -3 210 1 -2,32 -3,3 2 -3,5 -3,18 3 - -3,6 Efecto del tiempo de radiación artificial con 10 mg/l de Fe 3+ Tabla VII.5. Resultados de desinfección (FF) empleando 10 mg/l de Fe 3+ y distintos tiempos de radiación artificial Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 -0,3 -0,66 2 -0,36 - 3 -0,34 - 60 1 -0,3 - 2 -0,27 -0,62 3 -0,29 - 90 1 -0,45 -1,16 2 -0,53 -1,6 3 -0,44 - 120 1 -0,8 -2,3 2 -0,94 - 3 - - 165 1 -1,08 -2,5 2 -1,73 -4 3 -1,32 -3,4 210 1 -1,7 -3,4 2 -2,5 -3,5 3 -1,7 -3,7 AnexoVII: Resultados desinfección 86 Efecto del tiempo de radiación artificial con 15 mg/l de Fe 3+ Tabla VII.6. Resultados de desinfección (FF) empleando 15 mg/l de Fe 3+ y distintos tiempos de radiación artificial Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 -0,2 -0,6 2 -0,16 - 3 -0,22 - 60 1 -0,25 - 2 -0,22 -0,62 3 -0,25 - 90 1 -0,3 -0,9 2 -0,33 -1,08 3 -0,25 - 120 1 -0,6 -1,6 2 -0,66 -1,54 3 - -1,34 165 1 -0,8 -1,9 2 -0,6 -2 3 -0,88 -1,6 210 1 -1,68 -2,6 2 -1,2 -3 3 -1,7 -1,87 AnexoVII: Resultados desinfección 87 Ensayos Combinados CFD + FotoFenton: 15 mg/l Fe i3+ y pH 7 Tabla VII.7. Resultados de desinfección (CFD+FF) empleando 15 mg/l de Fe 3+ , distintos tiempos de radiación artificial y pH 7 Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) CFD 1 -0,16 -0,15 2 -0,07 -0,16 3 -0,2 -0,2 30 1 -0,23 -0,74 2 -0,39 -1,13 3 -0,32 - 60 1 -0,6 -1,95 2 -0,64 -1,79 3 -0,73 90 1 -3 -3,3 2 -3,32 -3,15 3 -2,9 -3,86 120 1 -3,86 -3,8 2 -3,4 -3,15 3 -3,87 - 165 1 -4,63 -3,8 2 -4,67 -4 3 -4,78 - 210 1 -5,8 -4,3 2 -5,32 -4,09 3 -5,49 - AnexoVII: Resultados desinfección 88 CFD + FotoFenton: 15 mg/l Fe i3+ y pH 5 Tabla VII.8. Resultados de desinfección (CFD+FF) empleando 15 mg/l de Fe 3+ , distintos tiempos de radiación artificial y pH 5 Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) CFD 1 -1,37 -1,5 2 -1,5 -1,45 30 1 -1,85 -1,73 2 -1,85 -1,81 60 1 -1,94 -2,9 2 -1,22 -3 90 1 -3,24 -4,04 2 -3,34 -4,34 120 1 -4,64 -5,04 2 -4,46 -5,04 165 1 -5,24 -5,04 2 -5,07 -4,74 210 1 -5,7 -5,34 2 -5,59 -5,26 FotoFenton + CFD: 15 mg/l Fe i3+ y pH 7 Tabla VII.9. Resultados de desinfección (FF+CFD) empleando 15 mg/l de Fe 3+ , distintos tiempos de radiación artificial y pH 7 Enterococos Pseudomonas Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 - -0,3 CFD -0,5 -0,8 2 -0,1 -0,6 -0,6 -0,8 60 1 -0,07 -0,6 CFD -0,6 -0,99 2 -0,15 -0,56 -0,27 -0,86 90 1 -0,16 -0,6 CFD -0,88 -1,1 2 -0,12 -0,66 -0,76 -1,05 120 1 -0,23 -0,8 CFD -0,87 -1,4 2 -0,17 -0,67 -0,95 -1,47 165 1 -0,9 -1,2 CFD -1,02 -1,56 2 -0,6 -1,01 -1,23 -1,8 210 1 -0,92 -1,8 CFD -1,8 -2,04 2 -0,98 - -1,6 -2,6 AnexoVII: Resultados desinfección 89 FotoFenton + CFD: 15 mg/l Fe i3+ y pH 5 Tabla VII.10. Resultados de desinfección (FF+CFD) empleando 15 mg/l de Fe 3+ , distintos tiempos de radiación artificial y pH 5 Enterococos Pseudomonas Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) 30 1 - -1 CFD -1,3 -1,08 2 -0,12 -0,98 -1,1 -1,09 60 1 -0,07 -1,05 CFD -1,21 -2,52 2 -0,25 -1,39 -0,27 -1,41 90 1 -0,12 -0,85 CFD -1,4 -1,88 2 -0,02 -1,03 -1,65 -1,6 120 1 -0,33 -1,44 CFD -1,4 -2 2 -0,17 -1,12 -1,48 -3,3 165 1 -1,12 -1,59 CFD -2,4 -2,08 2 -1,04 - -2,1 -2,5 210 1 -1,02 -2,2 CFD -2 -3 2 -1,2 -2,15 -2,2 -3,4 CFD + FotoFenton: 15 mg/l Fe i3+ , pH 5 y luz ambiental Tabla VII.11. Resultados de desinfección (CFD+FF) empleando 15 mg/l de Fe 3+ , distintos tiempos de luz ambiental y pH 5 Enterococos Pseudomonas Tiempo (min) Reactor Log (Nt/N0) Log (Nt/N0) CFD 1 -0,19 -0,2 2 -0,2 -0,175 3 -0,191 -0,188 30 1 -0,2 -0,3 2 -0,176 -0,25 3 -0,22 -0,32 60 1 -0,147 -0,5 2 -0,168 -0,44 3 -0,187 - 90 1 -0,183 -0,6 2 -0,162 - 3 -0,45 -0,66 120 1 -0,65 -0,8 2 -0,67 -0,6 3 -0,65 - 165 1 -0,95 -0,8 2 -0,93 -1,01 3 -0,96 -1,2 210 1 -1,002 -1,5 2 -1,008 -1,35 3 -0,958 -1,36