Repositorio Institucional de Documentos

PROYECTOTRABAJO FIN DE CARRERA EFECTO DEL DILUYENTE SEMINAL SOBRE LA DINÁMICA DE FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO Y OTROS PARÁMETROS DE CALIDAD SEMINAL EN MORUECO AUTOR: ENSEÑANZA: DIRECTOR/ES: FECHA: VÍCTOR VAL SANTOLARIA INGENIERO AGRÓNOMO JESÚS YÁNIZ PÉREZ DE ALBÉNIZ ABRIL DE 2012 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Índice. ÍNDICE GENERAL. 1. RESUMEN .................................................................................................... 1 1.1. RESUMEN EN CASTELLANO .......................................................... 1 1.2. RESUMEN EN INGLÉS ...................................................................... 2 2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 3 3. OBJETIVOS ................................................................................................. 6 4. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 7 4.1. EL SEMEN ............................................................................................ 7 4.1.1. El plasma seminal .......................................................................... 7 4.2. EL ESPERMATOZOIDE EN MAMÍFEROS.................................... 8 4.2.1. Morfología del espermatozoide .................................................. 8 4.2.1.1. La cabeza del espermatozoide ............................................... 9 4.2.1.2. El flagelo del espermatozoide ............................................... 11 4.2.2. Producción y maduración espermática ..................................... 12 4.2.2.1. Espermatogénesis .................................................................. 13 4.2.2.2. Maduración del espermatozoide en el epidídimo ................. 14 4.2.3. El ADN del espermatozoide en los mamíferos ......................... 14 4.2.3.1. Diferencias con las células somáticas. ................................. 14 4.2.3.2. La remodelación de la cromatina ......................................... . 18 4.2.3.3. La fragmentación del ADN del espermatozoide .................. . 21 4.2.3.4. Posibles daños en el ADN del espermatozoide..................... 24 4.2.4. Fisiología del espermatozoide .................................................... 25 4.3. TECNOLOGIA DE LA MANIPULACIÓN ESPERMÁTICA ........ 26 4.3.1. Inseminación artificial ................................................................ 26 4.3.1.1. Ventajas de la inseminación artificial .................................. 26 4.3.1.2. Desventajas de la inseminación artificial ............................ 29 4.3.1.3. Beneficio económico del uso de la inseminación artificial . 30 4.3.2. Obtención del semen ................................................................... 30 4.3.2.1. La vagina artificial ................................................................ 30 4.3.2.2. Factores que pueden alterar o dañar a los espermatozoides 31 4.3.3. Dilución del semen ...................................................................... 31 4.3.3.1. Diluyente seminal .................................................................. 32 4.3.3.2. Funciones del diluyente ........................................................ 33 4.3.3.3. Diluyentes empleados ............................................................ 34 4.3.4. Valoración espermática o espermiograma ............................... 35 4.3.4.1. Métodos clásicos .................................................................... 36 4.3.4.2. Otros métodos de evaluación de la calidad seminal ............ 39 4.3.4.3. La evaluación de la fragmentación del ADN del espermatozoide ...................................................................... 50 5. MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................... 60 5.1. PREPARACIÓN DE LOS DILUYENTES ......................................... 60 5.2. RECOGIDA, DILUCIÓN Y PREPARACIÓN DEL SEMEN .......... 61 Índice. 5.3. EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE MOVILIDAD MEDIANTE UN SISTEMA DE ANÁLISIS COMPUTERIZADO (CASA) ................................................................................................... 65 5.4. EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE MEMBRANA MEDIANTE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y ANÁLISIS DE IMAGEN ...................................................................... 69 5.5. ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN ESPERMÁTICO MEDIANTE EL TEST SCD .................................. 70 5.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................. 71 6. RESULTADOS ............................................................................................. 73 7. DISCUSIÓN .................................................................................................. 80 8. CONCLUSIONES ........................................................................................ 85 9. AGRADECIMIENTOS ............................................................................... 86 10. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 87 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de las regiones (a) y ultraestructura (b) del espermatozoide de mamífero (Modificado de Fawcett, DW. Tratado de Histología. Interamericana McGraw-Hill, 1989 .................................................. 9 Figura 2. Esquema de la ultraestructura de la cabeza de un espermatozoide de mamífero (Figura 2a: modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea y Febiger, 1993) y micrografía electrónica de la región del acrosoma (Figura 2b: modificado de Fawcett, DW. Tratado de Histología. Interamericana McGraw-Hill, 1989)............................................ 10 Figura 3. Estructuras del cuello del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea y Febiger, 1993) ...................................................................................................... 11 Figura 4. Estructura del flagelo del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea y Febiger,1993). ...................................................................................................... 12 Figura 5. Niveles de empaquetamiento de la cromatina de las células somáticas y los espermatozoides. Extraído de Ward (1993) y De Jonge y Barratt (2006)The Sperm Cell, modificado a partir del modelo de Sotolongo y col. (2003). ............................................................................................................ 17 Figura 6. Modelo hipotético de la eliminación de los superenrollamientos durante la espermiogénesis. (Boissonneault, 2002). ............................................ 20 Figura 7. Sistema CASA para el análisis espermático compuesto por un microscopio de contraste de fase conectado a una pletina atemperada, a una cámara de video y a un software de análisis de imágenes por ordenador. ......... 46 Índice. Figura 8. Terminología estándar de algunos parámetros de movilidad evaluados mediante el sistema CASA. .................................................................. 48/67 Figura 9. Microscopio de fluorescencia conectado a una cámara fotográfica para el análisis de la integridad de membrana. ................................................... 50 Figura 10. Visualización de la integridad del ADN mediante el ensayo de cometas. Los espermatozoides que presentan ADN fragmentado muestran un claro desplazamiento de los fragmentos de ADN al ser sometidos a la acción de un campo eléctrico. .......................................................................................... 54 Figura 11. Visualización de la integridad del ADN mediante el método SCD combinado con DBD-FISH en humano. a) Los halos de dispersión de la cromatina muestran espermatozoides con su ADN íntegro (núcleos 1,2,5,6) mientras que los que no presentan halo o este es de tamaño reducido, contienen ADN fragmentado (núcleos 3, 4). Tinción DAPI. b) Representa el mismo campo que la figura a) tras DBD-FISH. Tan solo los espermatozoides etiquetados como 3 y 4 muestran una clara señal de hibridación, es decir, con roturas del ADN. ............................................................................................ 57 Figura 12. Estufa a 37ºC para atemperado del material de recogida seminal. .. 61 Figura 13. Machos usados para la recogida de eyaculados. ............................... 62 Figura 14. Vagina artificial. ................................................................................ 63 Figura 15 Momento de la recogida del eyaculado. ............................................. 63 Figura 16. Momento de la dilución de los eyaculados. ....................................... 64 Figura 17. Cámara a 15ºC para transporte de las muestras. .............................. 64 Figura18. Captura de pantalla del programa CASA (ISAS, PROISER®, Valencia, España) de un campo de una muestra de semen de morueco, capturado utilizando un microscopio Olympus BX40 (Olympus Optical co., Tokyo, Japón) para el análisis de los parámetros de movilidad espermática. .... 68 Figura 19. Hoja de datos generada por el sistema CASA. .................................. 68 Figura 20. Imagen de una muestra con espermatozoides marcados mediante fluorescencia bajo un microscopio de epifluorescencia (DM4500B Leica, Alemania), los verdes marcados con naranja de acridina (AO) corresponden con espermatozoides viables, los rojos marcados con ioduro de propido (PI) corresponden con espermatozoides con daño en la membrana. .......................... 69 Figura 21. Imagen de una muestra con espermatozoides analizados con el test SCD. El espermatozoide de la parte superior de la imagen no presenta ADN fragmentado y muestra un halo de dispersión pequeño, compacto e intensamente teñido. El espermatozoide de la parte inferior presenta ADN Índice. fragmentado y muestra halo de difusión de la cromatina muy grande y ligeramente teñido. ............................................................................................... 70 Figura 22. Efecto de los diferentes diluyentes en la movilidad de los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas. .................................................................................................................... 73 Figura 23. Efecto de los diferentes diluyentes en la cantidad de espermatozoides de morueco con movimiento progresivo durante la incubación hasta las 24 horas. ............................................................................ 74 Figura 24. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas en parámetros cinéticos: a) velocidad curvilínea, b) velocidad rectilínea y c) velocidad media. ................................................................................................................... 75 Figura 25. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas en parámetros de calidad de movimiento: a) índice de linealidad, b) índice de rectitud, c) índice de oscilación y d) amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza. .................. 77 Figura 26. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación hasta las 24 horas en el porcentaje de espermatozoides viables en referencia a la integridad de la membrana de los mismos. ................................................................................................................. 78 Figura 27. Efecto de los diferentes diluyentes en el incide de fragmentación del ADN de los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas. ................................................................................................ 79 Figura 28. Variación del pH en los diferentes diluyentes de semen de morueco durante la incubación hasta las 24 horas. ............................................ 79 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Constituyentes del plasma seminal. ....................................................... 7 Tabla 2. Parámetros de movilidad analizados en el presente proyecto mediante el sistema CASA .................................................................................... 47/66 Resumen. 1 1. RESUMEN. 1.1. RESUMEN EN CASTELLANO. Tradicionalmente la valoración de la calidad del semen como método predictivo de la fertilidad del macho y del eyaculado incluye la evaluación de una serie de parámetros macro y microscópicos entre los que se incluyen el volumen del eyaculado, movimiento o morfología espermática. La fragmentación del ADN de los espermatozoides se considera un nuevo indicador importante de la calidad seminal y la fertilidad. Los valores de fragmentación de la molécula ADN transportada por el espermatozoide y su relación con la fertilidad, es un tema de enorme interés, tanto en humanos como en el resto de las especies, dado el papel implícito que se le otorga al ADN en el momento de producir una descendencia. El objetivo general de este trabajo fue evaluar el efecto del diluyente seminal sobre la dinámica de fragmentación del ADN espermático y otros parámetros de calidad en semen ovino de la raza Rasa Aragonesa, con el objetivo final de avanzar en el diseño de diluyentes más eficaces. El semen se recogió mediante una vagina artificial de los segundos eyaculados de seis machos adultos de la Rasa Aragonesa. Se tomaron 100 μl de semen de cada macho y se añadió a cada uno de los 8 diluyentes preparados el día anterior: basados en citrato, fosfato, TES, HEPES, MOPS, TRIS, leche e INRA96. Las muestras se incubaron a 37ºC pretendiendo emular las condiciones del aparato genital de la hembra y acelerar los procesos de degradación espermática. Se realizaron estudios de los parámetros de movilidad, integridad de membrana y fragmentación del ADN espermático a las 0, 3, 6 y 24 horas de incubación. Para la evaluación de los parámetros de movilidad se utilizó un sistema de análisis computerizado (CASA). El análisis de la integridad de membrana se realizó mediante microscopía de fluorescencia. La dinámica de fragmentación del ADN espermático se estudió mediante el test SCD. El estudio estadístico de las variables obtenidas se realizó mediante el paquete estadístico SPSS. El nivel de significación estadística se fijó en P <0,05. Los diluyentes basados en tampones del grupo zwiterion (TES, MOPS y HEPES) son los que obtuvieron mejores resultados globales de movilidad, integridad de membrana, viabilidad espermática y fragmentación del ADN hasta las 24h de incubación a 37ºC. Los diluyentes basados en la leche o sus componentes (Leche e INRA) presentaron un aumento claro de la fragmentación del ADN espermático a partir de las 6h de incubación, posiblemente asociado a un menor pH del medio. El TRIS provocó una alteración de las variables relacionadas con la calidad del movimiento, y el citrato y fosfato presentaron unos malos resultados de movilidad durante la incubación. Sin embargo, estos tres últimos diluyentes presentaron porcentajes reducidos de fragmentación del ADN espermático hasta las 24h. Resumen. 2 1.2. RESUMEN EN INGLÉS. Traditionally the sperm quality assessment as a predictive method of the potential fertility of the male ejaculate includes the macro-and microscopic parameters evaluation which include ejaculate volume, motility, or sperm morphology. Sperm DNA fragmentation is considered a new important semen quality and a fertility indicator. The fragmentation values of the sperm DNA molecule and its relation with fertility has a great interest, both in humans and in other species. The overall objective of this study was to evaluate the effect of various diluents on the sperm DNA fragmentation dynamics and other semen quality parameters in Rasa Aragonesa rams, with the ultimate goal of advancing the design of more effective diluents. Second ejaculates from six adult males were collected using an artificial vagina. A 100 μl sample from each male and was added to each of the 8 extenders prepared the day before: citrate, phosphate, TES, MOPS, HEPES and TRIS-based diluents, milk and INRA96. The samples were incubated at 37ºC to emulate the female genital tract conditions and accelerate the sperm degradation process. Studies were made of the parameters of motility, membrane integrity and sperm DNA fragmentation at 0, 24 and 48 hours. For sperm motility assessment a computerized analysis system (CASA) was used. Analysis of membrane integrity was performed by fluorescence microscopy. The dynamics of sperm DNA fragmentation was studied by the SCD test. The statistical analysis of the obtained variables was performed using SPSS. The level of statistical significance was set at P <0.05. From the results obtained in the study were drawn the following conclusions: The group of zwitterionic compounds, MOPS, TES and HEPES obtained the best overall results in motility, membrane integrity, sperm viability and DNA fragmentation up to 24 hours of incubation at 37º C. Sperm DNA fragmentation clearly increase after 6h of incubation in milk-based diluents (milk and INRA), possibly associated to the lower pH of the medium. TRIS-based diluent caused dramatic changes in the kinetic parameters of sperm during incubation and citrate and phosphate showed poor results of motility during incubation. However, these last three diluents had low sperm DNA fragmentation percentages until 24h. Introducción. 3 2. INTRODUCCIÓN. La inseminación artificial (IA), junto con la utilización de tests de progenie precisos, juega un papel importante en la mejora genética del ovino (Evans y Maxwell, 1987). La IA permite fragmentar cada eyaculado en más de una dosis seminal, posibilitando obtener un mayor rendimiento de cada macho, pasando de aproximadamente 30 ovejas cubiertas al año con monta natural a más de 1.000 mediante inseminación artificial con semen refrigerado (Maxwell, 1984). Por ello, la IA es la principal técnica en el desarrollo de todos los Esquemas de Selección Ovina, incluidos los desarrollados en Aragón. Una vez que el Esquema de Selección ha alcanzado un nivel de mejora de un determinado carácter, la difusión de la misma se convierte en un objetivo prioritario. Tal es el caso, por ejemplo, del Esquema de Selección desarrollado por UPRA-Carnes Oviaragón, cuyo principal objetivo es el aumento de la prolificidad de la raza Rasa Aragonesa. En la actualidad, en ganado ovino se utiliza principalmente la inseminación exocervical con semen refrigerado, asociada normalmente a un programa de mejora genética. La inadecuada conservación del semen y la dificultad para pasar el cuello del útero durante la inseminación artificial son los principales obstáculos para el uso extensivo de semen refrigerado en los programas de inseminación artificial en ovino. La deposición exocervical del semen conservado a 15ºC por menos de 8 horas, sigue siendo la técnica de IA que utilizan predominantemente en los países del Mediterráneo. Tradicionalmente la valoración de la calidad del esperma como método predictivo de la fertilidad del macho y del eyaculado incluye la evaluación de una serie de parámetros macro y microscópicos entre los que se incluyen el volumen del eyaculado, movimiento o morfología espermática. Saacke et al (1988, 1994) sugirieron que los factores asociados a la calidad seminal que afectan a la fertilidad pueden ser clasificados en compensables o no compensables. Los factores compensables son sensibles al número de espermatozoides totales inseminados, mientras que los nocompensables no lo son. Conforme aumenta el número de espermatozoides por dosis de inseminación, aumenta la fertilidad hasta que se alcanza una meseta (den Dass, 1992). En este punto, los factores compensables no tienen un efecto adicional en la fertilidad. En la inseminación comercial en ovino se utilizan elevadas concentraciones de espermatozoides por dosis (entre 250 y 400 millones en los países mediterráneos), lo que asegura que se supere la meseta antes comentada. Son por lo tanto los factores no compensables los que pueden contribuir en mayor medida a las diferencias de fertilidad entre los moruecos. Un defecto no compensable de los espermatozoides podría ser aquel en el que un espermatozoide llegase al sitio de fecundación e iniciase el proceso de activación oocitaria, pero no fuera capaz de mantener el desarrollo del cigoto, embrión o feto (Ostenmeier y col., 2001). Tales defectos se han encontrado en espermatozoides de toros que difieren en fertilidad (Eid y col., 1994). Por lo tanto, las causas de factores no compensables podrían ser la cromatina incorrectamente condensada, o el DNA dañado dentro del núcleo del espermatozoide (Ostenmeier y col., 2001). Parece lógico asumir que la transferencia de la molécula del DNA íntegra e intacta desde el espermatozoide al óvulo, es crucial para conseguir una fecundación con ciertas perspectivas de éxito. En este sentido, es bien conocido que la presencia de defectos en el material genético, tales como anomalías en la condensación de la cromatina, en relación con el proceso de la Introducción. 4 maduración del espermatozoide, la integridad de la molécula de DNA asociada con la presencia de roturas tanto de doble cadena como de cadena sencilla del DNA, o la presencia de anomalías cromosómicas, como pueden ser las aneuploidías o las reordenaciones genómicas estructurales, se asocian estrechamente con la infertilidad (Aravindan y col., 1997). Por lo tanto, la fragmentación del ADN de los espermatozoides se considera un indicador importante de la calidad seminal y la fertilidad. El espermatozoide es la célula encargada de transportar el material genético masculino al óvulo. La calidad de la información genética contenida en la molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) transmitida por el espermatozoide es importante para el correcto desarrollo del embrión. Por tanto los valores de fragmentación de la molécula ADN transportada por el espermatozoide y su relación con la fertilidad, es un tema de enorme interés, tanto en humanos como en el resto de las especies, dado el papel implícito que se le otorga al ADN en el momento de producir una descendencia. Sin embargo, el estudio de cuán fragmentado se encuentra el ADN del espermatozoide no es una tarea sencilla debido a que la evolución ha blindado la información genética para ser transportada, haciéndola poco accesible a todo tipo de factores externos que puedan modificarla. Aunque existe mucha información sobre la fragmentación del ADN del espermatozoide a partir de estudios realizados en espermatozoides humanos, los trabajos disponibles en animales son más escasos. Los pocos estudios efectuados en mamíferos apuntan en la misma dirección que los realizados en humanos, un alto nivel de fragmentación parece estar asociado con una fertilidad reducida (Evenson y Jost, 1994; Rybar y col., 2004). En varios trabajos se ha explorado la utilidad de este parámetro en la valoración de la calidad seminal y en la predicción de la fertilidad, de manera que existe una gran variedad de pruebas para estimar la integridad del ADN de los espermatozoides. En el presente trabajo se utiliza la llamada Test de Dispersión de la Cromatina del Espermatozoide (SCD) que está basada en la respuesta diferencial que ofrecen los núcleos espermáticos a la descondensación. Esta técnica, desarrollada inicialmente para espermatozoides humanos, se ha utilizado en este estudio para su utilización en espermatozoides de ovino mediante la técnica desarrollada por Halotech dna®, Ovis- Halomax®. Recientemente se ha propuesto que la incorporación de nuevas técnicas de evaluación de la calidad seminal, entre las que se incluyen la fragmentación del ADN, puede resultar muy útil para mejorar los diluyentes seminales (delValle y col., 2009). A diferencia de otras especies como el porcino o vacuno, en ovino se ha avanzado muy poco en el diseño de diluyentes seminales más eficaces que permitan aumentar la conservación del semen. En esta especie, los componentes biológicos en los diluyentes, como la leche o la yema de huevo no han sido sustituidos de manera eficiente en la utilización práctica de la inseminación artificial. De hecho, la leche desnatada, un complejo y variable componente biológico, es el principal diluyente utilizado para preservar el semen de ovino a 15 ºC para IA en numerosos países, incluido España. La utilización de muestras de semen refrigerado o congelado para su uso posterior en reproducción asistida presenta dos cuellos de botella importantes: la rotura provocada de la temperatura en las muestras de semen, al ser refrigeradas o congeladas, Revisión Bibliográfica. 11 La envoltura nuclear que se extiende por detrás del núcleo reviste la fosa de implantación, lugar donde el flagelo se une a la cabeza. 4.2.1.2. El flagelo del espermatozoide. El flagelo o cola comprende cuatro regiones principales: el cuello, la pieza intermedia, y los segmentos principal y terminal (Figura 1 b). El cuello es la región del espermatozoide que une la cabeza con el flagelo (Figuras 2 y 3). Es una zona frágil y estructuralmente compleja en la que se diferencia la pieza de conexión y algunas mitocondrias. Inmediatamente detrás de la cabeza se encuentra la pieza de conexión que estructuralmente se compone de capítulo, columnas segmentadas, placa basal y centriolo proximal. El capítulo constituye el borde craneal del flagelo y su forma se adapta a la de la fosa de implantación, ubicada en la base de la cabeza, donde queda adherido a la placa basal. Las columnas segmentadas sirven de origen para la formación de las llamadas fibras densas, que en número de nueve, se extienden hasta el final de la pieza principal. El centriolo proximal, orientado transversalmente, se sitúa inmediatamente debajo de la superficie articular del capítulo, entre las columnas segmentadas mayores. Esta estructura es el origen del axonema que se prolonga distalmente en el flagelo. En la región del cuello, fuera de la pieza de conexión, pueden encontrarse una o dos mitocondrias orientadas longitudinalmente. Figura 3. Estructuras del cuello del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea y Febiger, 1993) En la pieza intermedia (Figura 4), continuación del cuello, se dispone como eje del flagelo el axonema, formado por dos microtúbulos centrales rodeados de nueve dobletes de microtúbulos regularmente distribuidos. Esta estructura microtubular, designada ordinariamente con la fórmula 9+2 se prolonga distalmente a lo largo de toda la cola hasta cerca de la punta de la pieza terminal. El axonema queda rodeado de las nueve fibras densas procedentes de cada una de las columnas segmentadas de la pieza de conexión, de forma que cada una de ellas lleva un trayecto longitudinal en relación estrecha con uno de los nueve dobletes del axonema. Se considera que el componente Revisión Bibliográfica. 12 motor del flagelo es el axonema y las fibras densas. La pieza intermedia se caracteriza por presentar bajo la membrana plasmática, una vaina de mitocondrias orientadas circularmente y dispuestas helicoidalmente. Las mitocondrias son las encargadas de producir la energía necesaria que requiere el movimiento espermático. Inmediatamente distal a la última vuelta de la vaina mitocondrial se dispone el anillo, que se fija a la membrana para impedir el retroceso de las mitocondrias hacia las zonas distales de la cola. La pieza principal del espermatozoide va adelgazando progresivamente hasta la pieza terminal (Figura 4). Se compone de una vaina fibrosa que rodea, en el eje central, al axonema y sus fibras densas. La asimetría de la vaina fibrosa parece estar implicada en la modulación del plano de batida del flagelo espermático (Fawcett, 1989). La pieza terminal es la porción de la cola posterior a la terminación de la vaina fibrosa. Esta contiene únicamente el axonema central cubierto por la membrana plasmática (Figura 4). Externamente a la cabeza y flagelo se dispone la membrana plasmática (Figuras 1 a 4), que responde al modelo de mosaico fluido (Singer y Nicholson, 1972), compuesta por proteínas integradas en una bicapa de fosfolipídos. En su composición química, además presenta moléculas de colesterol, que juegan un papel determinante como sustancias moduladoras de la fluidez de membrana. Los ácidos grasos y los glicolípidos son poco abundantes. Figura 4. Estructura del flagelo del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea y Febiger,1993). 4.2.2. Producción y maduración espermática. En el proceso de espermatogénesis las células madre se transforman en espermatozoides, posteriormente se produce una maduración en el epidídimo para adquirir movimiento y capacidad fecundante, y por último, ya en el tracto reproductor femenino, ocurre el proceso de capacitación. Revisión Bibliográfica. 13 4.2.2.1. Espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso por el cual las espermatogonias o células madre se transforman en espermatozoides. Durante las primeras fases del desarrollo embrionario y antes de la diferenciación sexual, las células germinales primordiales migran desde el saco vitelino a las gónadas del embrión, donde se dividen y forman los gonocitos. A partir del periodo fetal, estos se localizan en el interior de los túbulos seminíferos, y poco antes de la pubertad se dividen y diferencian dando lugar a las espermatogonias o células madre. La espermatogénesis comprende una serie de fenómenos de división y diferenciación celular, mediante el cual las espermatogonias ubicadas en la base de los túbulos seminíferos se dividen por mitosis para producir cíclicamente espermatocitos, que por meiosis producirán espermátidas haploides, las cuales se diferenciarán en espermatozoides que se liberan hacia la luz tubular. Se trata de un proceso cíclico que en los pequeños rumiantes tiene una duración aproximada de 49 días (Franca y col., 1999; Folch, 2000). Este proceso requiere la intervención de la testosterona bajo el estímulo de la LH (Hormona Luteinizante), y de la FSH (Hormona Folículo Estimulante). La espermatogénesis se puede dividir en tres fases: espermatocitogénesis (mitosis), meiosis y espermiogénesis. En la primera fase, de división celular, las espermatogonias en el epitelio seminífero, entran en mitosis mediante mecanismos locales de regulación. Las espermatogonias más primitivas proliferan por división mitótica para perpetuarse a sí mismas y dar a la vez origen a varias generaciones sucesivas de espermatogonias. La división de la última generación de espermatogonias da lugar a los espermatocitos primarios. Durante la meiosis, se produce la diferenciación celular originándose a partir de una célula diploide cuatro células haploides, combinando dos divisiones celulares completas con una sola replicación de ADN. Los espermatocitos primarios son los que sufren la primera división meiótica o meiosis reduccional. Durante la profase, se replica el ADN, de manera que los espermatocitos son células tetraploides. Se incrementa la formación de quiasma, así cada célula resultante tiene un genotipo diferente. En la metafase, se disuelve la membrana nuclear y se forma el huso acromático. En la anafase, la mitad del número original de cromosomas emigra hacia cada polo celular. En la telofase, se desenrollan los cromosomas y vuelve a formarse una nueva membrana nuclear. Tras dividirse el citoplasma quedan dos células hijas, los espermatocitos secundarios, unidas por puentes intercelulares. La segunda división meiótica, o meiosis ecuacional, permite que de cada espermatocito secundario se formen dos espermátidas haploides sin replicación del ADN. La espermiogénesis es un proceso de transformación y maduración, en el que ya no se produce división celular, y en el que acontecen una serie de cambios morfológicos que incluyen la formación del acrosoma, desarrollo del flagelo, condensación de la cromatina y reorganización de los orgánulos del citoplasma. Revisión Bibliográfica. 14 4.2.2.2. Maduración del espermatozoide en el epidídimo. Una vez concluida la espermiogénesis, los espermatozoides de los mamíferos están altamente diferenciados, pero, sin embargo, aun no poseen el movimiento adecuado ni la capacidad de fusionarse al oocito; es durante su tránsito y almacenamiento en el epidídimo y posterior transporte a través del tracto reproductor de la hembra donde experimentan una secuencia de cambios morfológicos, bioquímicos y cinemáticos a través de los cuales adquieren su capacidad fecundante (Cooper, 1986). Los espermatozoides de morueco permanecen alrededor de 14 días en el epidídimo en fase de maduración. El cambio morfológico más importante es la migración de la gota citoplasmática de proximal a distal y su posterior eliminación del flagelo. La morfología del núcleo no cambia drásticamente pero si se incrementa la estabilidad de la cromatina espermática. Durante su paso por el epidídimo, los espermatozoides también sufren cambios bioquímicos, las mayores modificaciones se centran en la membrana plasmática (Yanagimachi, 1988). También, la acción de sustancias secretadas por el epitelio epididimario modifica la cubierta glicoproteica. Además la cantidad y composición de los lípidos de la membrana espermática también varia y se da un aumento en la cantidad de colesterol. La cinética de los espermatozoides también se modifica durante su tránsito epididimario. Durante el tránsito epididimal, los espermatozoides adquieren el potencial de movilidad, consecuencia del aumento de los puentes disulfuro de la superficie nuclear y flagelar durante dicho tránsito (Glover y col., 1990). 4.2.3. El ADN del espermatozoide en los mamíferos. El ADN del espermatozoide de los mamíferos está extremadamente condensado, es el ADN eucariótico más condensado, hasta seis veces más que el cromosoma mitótico (Pogany y col., 1981; Braun, 2001). Esta condensación extrema sólo es posible gracias a sus componentes estructurales y a su organización específica. 4.2.3.1. Diferencias con las células somáticas. El núcleo de la células somáticas está organizado en unidades discretas llamadas nucleosomas en las que aproximadamente 200 pares de bases de ADN rodean, dando casi dos vueltas, un octámero de histonas (Olins y col, 1974; Felsenfeld, 1978; Lilley y Pardon, 1979; McGhee y Felsenfeld, 1980). A su vez, series lineales de estos nucleosomas (fibra 10 nm) se enrollan de manera radial en hélices regulares para formar la fibra de 30 nm también llamada solenoide (Finch y Klug, 1976; Bak y col., 1977; Marsden y Laemmli, 1979) (Figura 5 A-C). Sin embargo, y aunque existen algunos casos de espermatozoides empaquetados siguiendo este modelo de nucleosomas (Keichline y Wassarman, 1979; Kharchenko y Nalivaeva, 1979), el espermatozoide de los mamíferos no tiene volumen suficiente para albergar el ADN empaquetado de esta manera (Pogany y col., 1981), por tanto, requiere una organización de la cromatina distinta (Balhorn, 1982). Revisión Bibliográfica. 15 Varios estudios han revelado que el ADN del espermatozoide de la mayoría de los vertebrados está asociado a un tipo de proteínas llamadas protaminas (Balhorn, 1982). Las protaminas son pequeñas proteínas básicas, su tamaño es aproximadamente la mitad que el de las histonas y contienen entre un 55 y 70% de argininas (Coelingh y col., 1969; Bellve y col., 1975; Kawashima y Ando, 1978). Algunos animales presentan varios tipos de protaminas que difieren en la secuencia de aminoácidos, además el número de estas variantes varía de una especie a otra. Los espermatozoides de toro (Coelingh y col., 1972), cerdo (Tobita y col., 1983), oveja (Loir y Lanneau, 1975; Loir y Lanneau, 1978) y rata (Calvin, 1976; Kistler y col., 1976) contienen un solo tipo de protaminas mientras que el ratón tiene dos y los humanos tres (Puwaravutipanich y Panyim, 1975; Calvin, 1976; Sautière y col. 1988). Balhorn en 1982 propone un modelo para la estructura de la cromatina del espermatozoide, en el que detalla cómo se unen las protaminas al ADN y la forma en la que se establecen las interacciones entre las mismas. El modelo describe que las protaminas, en su segmento central rico en argininas, adoptan una estructura extendida que se une al ADN en el surco menor. Esta unión neutraliza las cargas negativas de los grupos fosfato del ADN de manera que la repulsión electrostática desaparece y los complejos ADN-protaminas cercanos pueden aproximarse y unirse de manera estrecha (Feughelman y col., 1955). Para minimizar el volumen, el modelo propone que la parte de las protaminas que no está unida al surco menor de una molécula de ADN, se coloca en el surco mayor de las moléculas de ADN adyacentes. De manera que los surcos menores de una molécula se yuxtaponen con los surcos mayores de la siguiente. Los complejos ADN- protaminas se unen unos a otros lateralmente mediante fuerzas de Van der Waals en una estructura lineal (Figura 5). En este modelo, el ADN no presenta superenrollamiento (Risley y col., 1986; Ward y col., 1989; Ward y Coffey, 1991). En el espermatozoide, el ADN está organizado de manera más compacta que en las células somáticas pero menos enrollado. El modelo propone también la forma en la que se establecerían las interacciones entre las protaminas en algunos mamíferos. Las protaminas se unen por los extremos alrededor del ADN mediante la formación de puentes disulfuro inter e intra protaminas. Cómo se organiza tridimensionalmente esta estructura ha sido también motivo de estudio para muchos investigadores. En las células somáticas la fibra de 30 nm se organiza uniéndose cada 60.000 pares de bases de ADN a una estructura llamada matriz nuclear formando una serie de bucles o asas superenrolladas (Cook y col., 1976; Vogelstein y col., 1980; Pienta y Coffey, 1984) (Figura 5 D-E). Esta estructura permite la organización de la cromatina de manera tridimensional en el núcleo (Nelson y col., 1986) y varía según el tipo celular (Fey y Penman, 1988; Getzenberg y col., 1990). Cada bucle de cromatina representa una unidad de replicación cuyo origen está asociado permanentemente a la matriz (Vogelstein y col., 1980; Buongiorno- Nardelli y col., 1982; Dijkwel y col., 1986; Vaughn y col., 1990). Los bucles de ADN de los espermatozoides difieren de los de las células somáticas en el tamaño, son más pequeños, y en la ausencia de superenrollamiento (Risley y col., 1986; Ward y col., 1989; Ward y Coffey, 1991). El tamaño de los bucles no parece estar relacionado con el contenido haploide del ADN del espermatozoide sino Revisión Bibliográfica. 16 con su función. Se sabe que el ADN del espermatozoide está organizado en bucles unidos a la matriz nuclear, pero no cómo están empaquetados estos bucles en el núcleo. Ward en 1993 propone un modelo de plegamiento de los bucles de ADN en el núcleo del espermatozoide. En este modelo, cada bucle de ADN se estructura de manera circular en anchos círculos concéntricos superpuestos y se pliega en una estructura toroidal de aproximadamente 65 nm de diámetro (Hud y col., 1993; Brewer y col., 1999; Brewer y col., 2003). Estos toroides están conectados por segmentos compuestos por cromatina más sensible a agentes dañinos como la ADNasa I llamados “toroid linkers” o conectores (Sotolongo y col., 2003) (Figura 5 H-K). Los diferentes niveles de empaquetamiento de la cromatina se comparan en la Figura 5 para células somáticas y espermatozoides. En las células somáticas, aproximadamente 200 pares de bases de ADN (A) rodean dando casi dos vueltas, un octámero de histonas formando unas estructuras llamadas nucleosomas (B). A su vez estos nucleosomas se enrollan en hélices regulares de seis nucleosomas por vuelta formando la fibra de 30 nm (C). El ADN en esta fibra con forma de solenoide está unido cada 60 kb a la matriz nuclear formando bucles (D). En las células somáticas, estos bucles, contenidos dentro del núcleo, pueden visualizarse fuera de él mediante la extracción de las histonas (E). En el caso del espermatozoide, las protaminas se unen al ADN neutralizando las cargas negativas del ADN (G). El complejo ADN–protaminas se organiza en círculos concéntricos (H). Los círculos de un bucle se pliegan en una estructura toroidal (I) en la cual los complejos ADN-protaminas están unidos por fuerzas de Van der Waals (I, detalle). Cada toroide representa un bucle de ADN unido a la matriz nuclear (J). Los bucles de ADN de los núcleos espermáticos son más pequeños que los de las células somáticas (E-J). Los toroides están conectados entre sí mediante regiones de cromatina más sensibles a agentes dañinos como la ADNasa I, llamadas “toroid linkers” o conectores (K). La estructura interna de las fibras de ADN-protaminas dentro del toroide, comparada con la de las células somáticas, parece que proporciona una mayor protección frente a agentes dañinos pues la mayoría de las fibras de ADN y protaminas (fibras internas) están dispuestas en el interior del toroide (K). De acuerdo con este modelo, los conectores serían las regiones con más posibilidades de daño de ADN en los espermatozoides maduros. Revisión Bibliográfica. 17 Figura 5. Niveles de empaquetamiento de la cromatina de las células somáticas y los espermatozoides. Extraído de Ward (1993) y De Jonge y Barratt (2006)The Sperm Cell, modificado a partir del modelo de Sotolongo y col. (2003). Revisión Bibliográfica. 18 4.2.3.2. La remodelación de la cromatina. El proceso de remodelación de la cromatina para compactar al máximo la mólecula de ADN dentro del espermatozoide, aunque no se conoce del todo, está bastante documentado. Durante este proceso, las histonas que conforman los nucleosomas en las células somáticas son reemplazadas en primer lugar por proteínas de transición y finalmente por protaminas (Steger y col., 1998; Wouters-Tyrou y col., 1998; Meistrich y col., 2003), de manera que se elimina la organización del ADN de las células somáticas. Las proteínas de transición son un grupo heterogéneo de proteínas básicas. Se sabe poco sobre las funciones específicas de las proteínas de transición. Parece que estas proteínas estabilizan el ADN tras la eliminación de los supenrenrollamientos y promueven la condensación (Levesque y col., 1998). Además, se ha propuesto que también participan en la reparación de las roturas de ADN que se producen durante la espermiogénesis (Caron y col., 2001a; Kierszenbaum, 2001). Las protaminas son proteínas muy básicas de bajo peso molecular que están asociadas al ADN en los núcleos espermáticos maduros. Se han identificado dos tipos de protaminas en varios mamíferos, las protaminas 1 y 2. La protamina 1 es un polipéptido de unos 50 aminoácidos rico en arginina y cisteína. Su secuencia puede dividirse en tres dominos estructurales: la región amino-terminal que se caracteriza por la presencia de serina y treonina en la posición 8. Una región central rica en argininas que se presume que es la que se une al ADN, y una región carboxilo-terminal variable que contiene la mayoría de los aminoácidos hidrofóbicos. La protamina 2 es un poco más grande, entre 54 y 62 aminoácidos, y posee una gran cantidad de residuos de histidina. La zona central está constituida principalmente por varios grupos de 3 ó 4 residuos de arginina mientras que la histidina y la cisteína están localizadas a intervalos irregulares a lo largo de la molécula (Dadoune, 2003). Cómo se produce el reemplazo de histonas por protaminas no está muy claro, pero parece estar asociado a modificaciones en la estructura de la cromatina como la acetilación (Meistrich y col., 1992; Pivot-Pajot y col., 2003), la metilación (Sims y col., 2003), la fosforilación (Prigent y Dimitrov, 2003; Zhang y col., 2004) o la degradación por ubiquitinización (Chen y col., 1998; Baarends y col., 2000; Jason y col., 2002). Se ha propuesto que estas modificaciones definen señales específicas que son reconocidas por determinados factores capaces de modificar la estructura y función de determinados dominios de la cromatina (Jenuwein y Allis, 2001; Govin y col., 2004; Khorasanizadeh, 2004). Las modificaciones más estudiadas son la acetilación y la degradación por ubiquitinización. Se cree que la acetilación facilita la sustitución de las histonas por protaminas y que la ubiquitinización está implicada en la eliminación de las histonas. Además, las histonas somáticas son sustituidas por variantes testiculares, histonas específicas del testículo (Lewis y col., 2003) que se ha visto que están implicadas en determinadas funciones como la descompactación de la cromatina (De Lucia y col., 1994; Khadake y Rao, 1995) o la reparación del ADN (Malik y Henikoff, 2003). Se desconoce el mecanismo molecular de eliminación de los nucleosomas, sin duda los factores anteriormente descritos han de estar involucrados. La eliminación de los nucleosomas genera un gran número de superenrollamientos libres que no están presentes en el espermatozoide maduro, de manera que estos superenrollamientos han Revisión Bibliográfica. 19 de ser eliminados. Esta eliminación de los superenrollamientos se produce mediante la introducción de roturas de cadena sencilla o doble en el ADN. Un solo corte por bucle de ADN no es suficiente para liberar la tensión torsional de éste, ni siquiera si todos los nucleosomas se liberan a la vez (Boissonneault, 2002). Se cree que los superenrollamientos se eliminan gradualmente a medida que los nucleosomas se liberan, y, para que el cambio topológico sea eficiente, se necesita un número considerable de roturas (Figura 6). De hecho, varios estudios detectan numerosos cortes en el ADN durante las fases intermedias de la espermiogénesis (McPherson y Longo, 1993; Sakkas y col., 1995; Smith y Haaf, 1998). Tras la eliminación de los superenrollamientos se necesita un mecanismo eficiente para reparar los cortes producidos en el ADN, pues estas lesiones no se detectan en las etapas finales de la espermatogénesis. Parece que el proceso de condensación iniciado por las proteínas de transición y completado por las protaminas juega un papel importante en la reparación de estas roturas. De hecho, algunos estudios han correlacionado alteraciones en el estado de condensación del ADN de los espermatozoides con altos niveles de fragmentación (Gorczyca y col., 1993; Manicardi y col., 1998; Aoki y col., 2006; Benchaib y col., 2007). Sin embargo, aunque las proteínas básicas nucleares promueven la aproximación de las cadenas de ADN, ni las proteínas de transición ni las protaminas, poseen una actividad ligasa. Además de la topoisomerasa II, se piensa que la ADN ligasa III específica del testículo (ADN ligasa IIIβ) podría participar en la formación de los puentes fosfato del ADN (Mackey y col., 1997; Chew y col., 2000; Caron y col., 2001). En la Figura 6 se representa el modelo hipótetico según Boissonneault (2002) de la eliminación de los superenrollamientos durante la espermiogénesis. En cada bucle de ADN la eliminación de los nucleosomas deja superenrollamientos libres entre los puntos de anclaje del bucle. Los superenrollamientos entre estos puntos son eliminados mediante roturas de ADN de cadena doble o sencilla producidas por un mecanismo desconocido por el momento. La siguiente eliminación de nucleosomas en otras regiones topológicamente constreñidas del bucle deja superenrollamientos libres que son eliminados de manera similar. Finalmente, la deposición de las proteinas de transición y de las protaminas estimula la reparación de las roturas de ADN estabilizando el ADN en una estructura sin superenrollamientos (Boissonneault, 2002). Revisión Bibliográfica. 20 Figura 6. Modelo hipotético de la eliminación de los superenrollamientos durante la espermiogénesis. (Boissonneault, 2002). Revisión Bibliográfica. 27 baja fertilidad que se observa, en ocasiones, utilizando la IA, el número de crías por semental supera con creces al que se obtiene mediante la inseminación natural. Recientemente, se ha despertado mucho interés por los esquemas de cría en núcleo y cooperativas. La estructura de estos esquemas permite una mayor intensidad de la selección que la que obtienen los ganaderos actuando aisladamente (o por ganaderos aislados con rebaños de tamaño comparable que no utilicen la idea de los núcleos). En estos esquemas, el semen procedente de los machos de núcleo de rebaños alcanza a sucesivas generaciones con lo que los genotipos mejorados últimamente alcanzan la producción básica del rebaño. La IA se utiliza para que los genes mejorantes alcancen sus objetivos con mayor rapidez que cuando se utilizan métodos convencionales de producción y, consecuentemente, se reduce el tiempo que se tarda en conseguir los beneficios esperados. Cuanto acabamos de decir se aplica mejor en las grandes ganaderías con estructuras de producción escalonada. Otro uso de la IA es el de cruzar nuevas estirpes o genotipos de animales. Un ejemplo de esto es el uso de sementales de Angora en rebaños de cabras salvajes. Esto se obtiene por cruce de cada generación de hembras con sementales de pura raza Angora. La utilización de sementales mejorantes tiene un campo de aplicación más amplio con la IA que con la inseminación natural. De igual forma, la IA permite un uso más amplio de sementales selectos con el propósito de cambiar el tipo de los animales en un rebaño para acomodarse a los requisitos del mercado. 2. Fácil transporte de material genético. A menudo, los criadores desean introducir “sangre fresca” en sus rebaños y el transportar el semen es mucho más barato que transportar a los sementales y, de esta forma, se evita también el riesgo de extender posibles enfermedades. La IA ha posibilitado la importación de nuevos genes, procedentes de otros continentes, a países que no permiten la entrada de animales vivos. En suma, la IA ha hecho posible el intercambio internacional de semen. La utilización de semen congelado ha facilitado, también la operación de producción cooperativa y el uso de esquemas de sementales de referencia por cuanto los mejores sementales, de esta forma, pueden mantenerse en los centros de reproducción desde los cuales se envía el semen a los dueños de los rebaños. 3. Conservación prolongada del semen. El semen procedente de sementales valiosos se puede conservar para utilizarlo en años venideros, incluso después de muerto aquel. Algunos ganaderos conservan el semen de sus mejores sementales para prevenir el trastorno que ocasionaría una muerte temprana de los mismos. Los bancos de semen se pueden utilizar también para conservar el semen “control” en los programas de selección a largo plazo. En este caso, el semen se conserva para uso futuro, con lo que los animales producidos después de varios años de selección se pueden comparar con los “animales básicos” como monitores de los progresos genéticos. 4. Aumento de la eficacia reproductora. Los moruecos y machos cabríos subfértiles pueden identificarse con facilidad y eliminarlos del grupo de sementales. La inseminación artificial puede asegurar el que se Revisión Bibliográfica. 28 inseminen todas las hembras, evitándose así problemas relacionados con las preferencias macho-hembra que a menudo se manifiestan en algunos estros de hembras. 5. Reducción o eliminación de sementales en la ganadería. Los pequeños ganaderos no precisan mantener sementales en sus explotaciones siempre que puedan obtener el semen de otros lugares. El costo y los inconvenientes de mantener los sementales quedan eliminados. Por otro lado, existen razones de tipo estético ya que en los rebaños de cabras no es necesario mantener a los machos malolientes, sobre todo en aquellos rebaños que estén próximos a zonas urbanas. 6. Prevención y control de enfermedades. La IA elimina el contacto directo entre el macho y la hembra con lo que se controla o previene el propagar enfermedades venéreas u otras enfermedades. Es conveniente advertir que la IA es una medida profiláctica, pero no curativa, de la enfermedad. 7. Utilización de machos incapacitados. En muchas ocasiones machos de estimable valor no pueden ser utilizados para cubrir por sufrir lesiones o por razones de edad. Si su semen es de calidad suficiente con la IA se pueden seguir utilizando. 8. Mantenimiento de registros seguros. La utilización de la IA permite mantener unos registros de reproducción muy seguros. Estos registros se pueden utilizar para aumentar la seguridad de la selección o para eliminar caracteres indeseables en un rebaño. 9. Utilización de reproducción sincronizada o reproducción en época no propicia. En ocasiones los ganaderos desean usar tecnologías que les permitan sincronizar la reproducción de sus hembras. Cuando este proceder se desea practicar en rebaños grandes es necesario usar la IA, por cuanto no es posible mantener suficientes machos para practicar la monta natural. Fuera de la estación reproductora, los programas de cría pueden coincidir con la época del año en que la calidad del semen es baja, problema particularmente importante en el caso de las cabras; en esta especie puede que sea necesario inseminar hembras con semen congelado, recogido en la época reproductora que cuando mejor calidad tiene el semen. 10. Uso de otra tecnología. Cuando las hembras son superovuladas para producir gran cantidad de embriones para ser transferidos, la monta natural no proporciona buenos índices de fertilidad. La inseminación intrauterina mejora los resultados de fecundación; por otra parte, y en cierta medida se puede intentar la predeterminación del sexo de las crías, lo que se puede hacer separando los cromosomas X e Y que portan los espermatozoides. Revisión Bibliográfica. 29 4.3.1.2. Desventajas de la inseminación artificial. 1. Consanguinidad. Cuando la intensidad de la selección es muy alta pueden surgir problemas de consanguinidad. De hecho en la industria lechera, de vacuno, ha sucedido lo contrario. La utilización de IA ha permitido el uso de más machos, sin parentesco (caso opuesto al uso local de machos emparentados), con lo que el nivel de consanguinidad ha descendido. La naturaleza extensiva de las ovejas y las cabras nos asegura el mantenimiento de una gran masa genética con lo que es poco probable que la consanguinidad sea un problema. A pesar de todo, se debe poner especial atención cuando se utilice la IA en rebaños pequeños y/o próximos desde el punto de vista del parentesco. 2. Reproductividad insegura. Cuando se emplee la IA existen dos posibilidades de inseguridad: (i) cuando se utilice semen de sementales individuales y no se haya puesto especial atención a su etiquetado pueden surgir errores accidentales, sobre todo cuando se utilicen simultáneamente varios sementales, y (ii) cuando el valor de los sementales se ha sobrestimado o determinado incorrectamente. Esto nos puede acarrear más pérdidas que ganancias. El uso de sementales con defectos genéticos inapreciables puede producir una rápida propagación de tales efectos. Por ello, es muy importante disponer de buenos registros y consultar a un genetista cualificado si se tiene alguna duda sobre el valor de algunos machos que se usen en programas de IA. 3. Propagación de enfermedades. Si los sementales no han sido controlados en lo que a enfermedades venéreas se refiere la IA puede extender la enfermedad más rápidamente que la inseminación natural. 4. Fertilidad reducida. En comparación con la inseminación natural, la IA puede, bajo ciertas circunstancias, reducir la fertilidad, particularmente cuando no se empleen, apropiadamente, métodos de controlar el estío o en casos de poco cuidado por parte del personal auxiliar o por negligencias cuando se maneje el semen. 5. Costes. Como con cualquier otra tecnología, han de tenerse en cuenta los costes a la hora de utilizar la IA. Entre los costes se incluyen el empleo de los técnicos, equipo, fármacos y hormonas, registros y la compra de semen o selección y mantenimiento de sementales. Como el equipo de inseminación es muy simple y duradero, los costes por inseminación son relativamente bajos. De igual forma los costes de sementales son bajos al utilizarse menor número que cuando se practica la inseminación natural. En definitiva, los mayores costes son por mano de obra, manejo, fármacos y hormonas (en caso de que se utilicen). Revisión Bibliográfica. 30 4.3.1.3. Beneficio económico del uso de la inseminación artificial. Las recompensas del empleo de programas de mejora genética, que incorporen la IA, se pueden medir como ganancias a corto plazo o mejoras a más largo plazo, bien sea en términos de aumentar la prolificidad, calidad de la lana, la producción de leche, la calidad de la carne, etc. Aunque las ganancias a corto plazo nos pueden proporcionar una rápida recuperación de la inversión; a menudo, las ganancias monetarias tangibles solo lo son a más largo plazo. Por otro lado, y también refiriéndonos a largo plazo, los ganaderos que no hayan obtenido beneficios en sus rebaños se encontrarán en desventaja competitiva con aquellos que sí los hayan obtenido. El incremento de eficacia en el método de inseminación en ovino, se ha visto aumentado ahora con el uso de técnicas modernas, mejores métodos de identificación de los sementales de alto valor y utilizando programas de reproducción mejor informatizados; todo ello ha contribuido a hacer a la IA un método económicamente viable para ganaderos que jamás hayan pensado en eso. 4.3.2. Obtención del semen. En la especie ovina, como en la mayoría de las especies domésticas, el método de elección para la obtención de semen es el realizado mediante vagina artificial. Mediante esta técnica, el macho que eyacula desarrolla completamente la cadena de reflejos y la mecánica del coito fisiológico, aunque no exista penetración ni eyaculación en la vagina de una hembra. Los machos seleccionados para la recolección de semen mediante este método deben ser dóciles y estar entrenados. En el caso de los animales no entrenados, indóciles o de baja libido puede recurrirse a la obtención de semen mediante la electroeyaculación. La electroeyaculación está basada en la aplicación rítmica de un estímulo eléctrico por vía transrrectal estimulando el sistema nervioso autónomo y somático, que conduce a la obtención de secreciones de las glándulas accesorios y finalmente a la eyaculación (Cebrían-Pérez y col., 2010). Todos los métodos para estimular la salida del semen deben cumplir unos requisitos: 1. Garantizar la calidad del semen. 2. No provocar daños en el macho. 3. Ser de fácil aplicación y de bajo coste. 4. Debe evitar que los espermatozoides se contaminen o se estresen. 4.3.2.1. La vagina artificial. Lo más normal es el uso de vaginas artificiales, que son receptáculos que simulan el aparato reproductor de la hembra, en las condiciones de presión y temperatura en las que se la encontraría el macho durante la monta. Esta vagina se coloca en el momento en que el macho procede a dar el salto sobre la hembra, de manera que el pene, en vez de introducirse en la hembra, se introduce en la vagina artificial. Revisión Bibliográfica. 31 Ventajas de la vagina artificial: - Obtención de la totalidad del eyaculado. - El esperma está perfecto y sin daño. - Podemos obtener la medida exacta del eyaculado. Inconvenientes de la vagina artificial: - Derivados de la inexperiencia del operario, que puede llevar a hacer daño al animal, con lo que éste se viene abajo. - Animales que no saltan espontáneamente, tardando mucho tiempo. - El semen debe estar el menor tiempo posible en la vagina artificial, se ha de evitar el shock térmico con la temperatura ambiente. 4.3.2.2. Factores que pueden alterar o dañar a los espermatozoides. Los siguientes factores se han de tener muy cuenta durante la obtención y manipulación de las muestras seminales: 1) Oxígeno: provoca excitación en los espermatozoides, que hace que se muevan, con lo que el movimiento los agota, elimina sus reservas y mueren. 2) Temperatura: el espermatozoide sale a una temperatura aproximada de 38,5-42ºC. De ahí para abajo se conserva bien; si bajamos hasta congelación, el aguante depende de la especie. Pero una temperatura de 50ºC para arriba destruye totalmente a los espermatozoides, pues sus estructuras proteicas se coagulan. 3) Acción de sustancias químicas: pueden provocar el llamado shock químico. Estas sustancias pueden estar como residuos en aparatos recolectores, que parece que puedan estar limpios. 4) Luz: la luz intensa, sobre todo el rayo de sol directo, debido al infrarrojo afecta a los espermatozoides. La luz intensa activa al espermatozoide igual que el oxigeno, con lo que se fatiga y muere. 5) pH: un pH alcalino provoca una excitación igual que el oxígeno. Un pH ácido paraliza al espermatozoide. 6) Contenido residual de recipientes: antisépticos, jabones, etc. 7) Características del agua: se recomienda el uso del agua bidestilada con agentes pirógenos. El agua de uso corriente es muy dañina por los residuos minerales. 8) Contaminación bacteriana asociada a una falta de higiene durante la recogida o manipulación del semen. 4.3.3. Dilución del semen. La dilución que se realiza en las muestras de semen para su conservación se hace en un medio que se conoce como diluyente seminal. El semen recogido deberemos Revisión Bibliográfica. 32 diluirlo y conservarlo hasta su procesado en el laboratorio, esto permitirá aumentar el volumen espermático y reducir la concentración para un análisis más sencillo y práctico, además el espermatozoide estará en un medio favorable para su supervivencia. 4.3.3.1. Diluyente seminal. Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias y preservar las características funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado. Gracias al conocimiento de las características y funciones del plasma seminal que forma junto con los espermatozoides al eyaculado, se han podido diseñar los diluyentes para el semen que se utilizan en la inseminación artificial. A pesar de la complejidad del eyaculado, los diluyentes de uso común para el semen están constituidos principalmente por agua, TRIS o citrato de sodio como amortiguadores, azúcar como fuente de energía, glicerol o yema de huevo como protectores del enfriamiento o la congelación y antibióticos. Un diluyente para el semen en fresco ampliamente utilizado, por su fácil adquisición y manejo es la leche de vaca, ya sea entera o descremada, a la que únicamente se le agregan los antibióticos. Actualmente, también se está empezando a utilizar el INRA-96, este diluyente comercial para la conservación de semen, está elaborado a partir de fracciones purificadas de la leche (Vázquez y col., 2010). El plasma seminal suministra los nutrientes necesarios para mantener la elevada actividad metabólica necesaria para el proceso de transporte espermático a través del tracto genital femenino. En el eyaculado, esta actividad metabólica solo puede mantenerse durante un periodo de tiempo muy limitado, como es conocido desde los primeros estudios sobre la conservación del semen porcino (Lewis, 1911). Para poder conservar los espermatozoides durante periodos prolongados es necesario que se reduzca la actividad metabólica de los espermatozoides, mediante la dilución en un medio adecuado y la reducción de la temperatura. Los espermatozoides son muy sensibles al choque por frío, que produce una alteración de la viabilidad espermática. En concreto la composición lipídica de sus membranas parece ser la responsable de esta situación. Así, cuando se reduce la temperatura los movimientos laterales de los fosfolípidos que componen la membrana se ven reducidos y se producen separaciones de fases lipídicas, situación asociada a alteraciones irreversibles de las proteínas de las membranas. Todo hace que se altere la funcionalidad de la membrana espermática y la viabilidad celular se vea comprometida (revisado por White, 1993). Esta susceptibilidad al choque por frío, supone en la práctica que las muestras seminales deban ser conservadas a 15-20º C, ya que una reducción en la temperatura de almacenamiento limita la viabilidad de las muestras seminales (Paulenz y col., 2000). La conservación a estas temperaturas moderadamente reducidas limita la capacidad de almacenamiento de las muestras por una parte porque no puede reducirse el metabolismo celular y por otra parte porque no pueden controlarse las condiciones microbiológicas con la misma efectividad de temperaturas inferiores (5º C). Revisión Bibliográfica. 33 Por otro lado, el efecto de dilución lleva a que determinados compuestos presentes en el plasma seminal estén en muy bajas concentraciones en el semen diluido y alteren la viabilidad espermática, como por ejemplo la adición de albúmina sérica bovina (BSA), ya que se ha demostrado que esta adición estimula la movilidad (Waberski y col., 1989) y mejora las tasas de fertilidad del semen conservado (Waberski y col., 1994) 4.3.3.2. Funciones del diluyente. Para llevar a cabo su misión el diluyente debe aportar los nutrientes necesarios para el mantenimiento metabólico de la célula espermática (glucosa), la protección frente al sock térmico por frío (BSA), controlar el pH del medio (bicarbonato, TRIS, HEPES,…) la presión osmótica (sales NaCl, KCl…) y la inhibición del desarrollo microbiano (antibióticos).Además los medios de dilución han de cumplir estos requisitos: - Que el medio tenga presión osmótica isotónica con el espermatozoide y que se mantenga. Si esto no ocurriera, habría lisis o arrugamiento del espermatozoide. - Que el pH del medio no se modifique, es decir, el diluyente debe ser tampón. Esto es sobre todo importante en el toro y el morueco (pH 6.8-7). - Que el medio diluyente lleve sustancias que permitan la protección adicional del espermatozoide. - Que el medio favorezca la vitalidad y longevidad del espermatozoide. - Que el medio sea estéril, libre de sustancias químicas, bacterias, virus, etc., que dañasen directamente al espermatozoide. - Que el medio permita la esterilización fácil de los utensilios. - Que el medio sea fácil de preparar, rápido y que sea económico. Los tres principales aspectos básicos que un buen diluyente ha de cubrir se desarrollan a continuación: a) Nutrientes. El espermatozoide tiene la capacidad de producir la energía necesaria para mantener su metabolismo celular y generar el movimiento del flagelo, principalmente a través de las vías glicolíticas. Estos procesos se desarrollan en las mitocondrias localizadas en la porción intermedia del espermatozoide. La fuente de energía más frecuentemente utilizada en la composición de los diluyentes es la glucosa, aunque se han usado otras (galactosa, fructosa, ribosa o trehalosa) sin que los resultados hayan superado a la glucosa. Revisión Bibliográfica. 34 b) Regulación del pH. El pH del semen recién eyaculado se encuentra próximo a 7.4 ± 0.2, al igual que otros fluidos orgánicos, y cuando se reduce este pH al mismo tiempo se reduce el metabolismo energético del espermatozoide y su movilidad. El metabolismo glicolítico que desarrolla el espermatozoide (carbohidrato principal es la glucosa) hace que el pH intracelular disminuya y el metabolismo celular quede reducido. El ácido láctico es el principal metabolito de este proceso y ha sido utilizado como índice de calidad seminal (Rigau y col., 1996). La adición de agentes tamponadores ayudan, por tanto a controlar el pH del medio. Entre las soluciones tampón más simples se encuentran el bicarbonato y el citrato (sódico) que presentan una capacidad de tamponar limitada, mientras que otros más complejos (TES, HEPES, MOPS, TRIS) pueden regular el pH en un rango más amplio y no son dependientes de la temperatura (MOPS Y HEPES). El pH de los diluyentes normalmente utilizados oscila entre 6.8 y 7.2, pero hemos de tener en consideración que el pH de estos medios no se estabiliza hasta pasado unos 60-90 minutos del inicio de la dilución en agua y que los distintos diluyentes presentan un diferente patrón de cambio de su pH a lo largo del tiempo (Newth y Levis, 1999). Por lo que se han de tomar las medidas oportunas en el proceso de preparación de los diluyentes antes de su uso, para evitar problemas en el proceso de conservación. c) Regulación osmótica. El espermatozoide ovino presenta una presión osmótica de 290-300 mOsm, y es capaz de tolerar un rango de presiones osmóticas bastante amplio (240-380 mOsm). Diversos estudios han evaluado la tolerancia a diversas presiones osmóticas, llegando a la conclusión que ni la movilidad ni la viabilidad espermática se ve afectada por la presión osmótica en rangos comprendidos entre 250 y 290 mOsm (Fraser y col., 2001), mientras que cuando se reduce por debajo de 200 mOsm se detecta un reducción significativa de la movilidad (Gilmore y col., 1996, Fraser y col., 2001). En cualquier caso, los diluyentes isotónicos (300 mOsm) o ligeramente hipertónicos son los que mejores resultados han dado en condiciones de utilización comercial. Para regular la presión osmótica se utiliza principalmente sales de iones inorgánicos como el cloruro sódico y potásico. 4.3.3.3. Diluyentes empleados. Para la evaluación de la cinética de fragmentación de la cromatina espermática y otros parámetros de calidad seminal, objeto de estudio en el presente proyecto, se trabajó con diluyentes basados en los compuestos: TES, MOPS, HEPES, TRIS, INRA, fosfato, leche y citrato. En un trabajo previo desarrollado por nuestro grupo (Yániz y col., 2011), comparamos el efecto de el efecto del sistema tampón utilizado en el almacenamiento Revisión Bibliográfica. 35 de semen ovino a 15 ºC. Concretamente se estudiaron los diluyentes basados en componentes tampón tales como MOPS, TRIS, TES, HEPES, citrato o fosfato. Se concluyó que los tampones zwitterion (TES, MOPS y HEPES) podrían ser una alternativa aceptable para su inclusión en la composición de diluyentes para el almacenamiento refrigerado semen en ovino. Por otro lado, el TRIS, generalmente incluido en la composición de diluyentes de semen de ovino, en comparación con otros estudios realizados parece causar modificaciones drásticas en los parámetros de calidad del movimiento espermático durante el almacenamiento a 15 ºC. En la evaluación de la calidad seminal se utilizaron dos técnicas principales, la movilidad determinada mediante un sistema CASA y la integridad de membrana. En el presente trabajo fin de carrera utilizaremos además la dinámica de fragmentación del ADN espermático para la comparación de ocho diluyentes seminales con el objetivo final de avanzar en el diseño de diluyentes más eficaces. Por continuar con la línea de investigación marcada por el anterior trabajo realizado se estudiarán los mismos diluyentes, a los que se añadirá para su estudio la leche y el INRA debido a su alta implantación como diluyentes mayoritariamente empleados en ovino. 4.3.4. Valoración espermática o espermiograma. Tradicionalmente la valoración de la calidad del esperma como método predictivo de la fertilidad del macho incluye la evaluación de una serie de parámetros macro y microscópicos entre los que se incluyen el volumen del eyaculado, movimiento o morfología espermática. Aunque en el caso de movimiento espermático, actualmente cada vez son más los laboratorios que emplean sistemas computerizados para su análisis objetivo, las anomalías en la morfología espermática, pese a ser un importante indicador del descenso en la fertilidad tanto en el hombre (Kruger y col.,1988), como en animales (Voss y col.,1981; Chandler y col.,1988; Sekoni y Gustafsson, 1987), de forma rutinaria se siguen evaluando subjetivamente, lo que condiciona el análisis a una serie de variables que dificultan la interpretación adecuada de los resultados dentro y entre laboratorios, haciendo necesario el desarrollo de técnicas objetivas, precisas y repetibles. La introducción de los sistemas automáticos de análisis de la morfometría y movilidad espermática, entre los que se encuentra el CASA, intenta solventar este problema. Si bien originalmente se emplearon para el análisis del espermatozoide humano, actualmente se están desarrollando para su uso en las distintas especies animales, para lo cual resulta imprescindible la estandarización de una serie de variables analíticas que intervienen en el proceso del análisis morfométrico y cinético, como son, la preparación y tinción de las muestras o el número de espermatozoides a analizar. La valoración de la fragmentación del ADN de los espermatozoides es un nuevo parámetro que se considera un indicador importante de la calidad seminal y la fertilidad. Es un tema de enorme interés, tanto en humanos como en el resto de las especies, dado el papel implícito que se le otorga al ADN en el momento de producir una la descendencia. Revisión Bibliográfica. 36 4.3.4.1. Métodos clásicos. La valoración de la calidad del esperma se emplea habitualmente como método predictivo de la fertilidad del macho (Rodríguez y col., 1989; Colembrander y col., 2003) y aunque el mejor sistema para determinarla sería estimar el porcentaje de gestaciones que se obtienen tras realizar la inseminación en un número suficiente de hembras, normalmente se recurre a la evaluación en condiciones de laboratorio de una serie de parámetros seminales relacionados con la fertilidad, ya que el primer método requiere desarrollar ensayos de campo que suponen un gran esfuerzo, que eleva los costes y retrasa considerablemente la obtención de la información. La fecundación es una función biológica compleja, para la cual el espermatozoide es una célula altamente especializada constituida por una serie de compartimentos necesarios para desarrollar su función y que deben ser evaluados. El hecho de que se hayan desarrollado numerosas técnicas de análisis, indica que hasta el momento no se ha encontrado un test único de valoración que permita integrar todos los compartimentos para predecir la fertilidad con cierto rigor. Las técnicas actuales exploran facetas concretas del proceso reproductivo y sólo ofrecen una información parcial del potencial del espermatozoide, aunque al combinar varias pruebas “in vitro” se puede estudiar con mayor amplitud y precisión la viabilidad espermática (Graham y col., 1980). Tradicionalmente la calidad del esperma se viene evaluando a través de una serie de parámetros macro y microscópicos que se integran en una prueba de valoración “in vitro” que podemos denominar espermiograma clásico. A pesar de que la correlación entre estos parámetros y la fertilidad no es definitiva, si ofrecen información valida a cerca de la calidad seminal, ya que si bien una muestra de buena calidad seminal puede no ser siempre fértil, una de baja calidad rara vez lo será (Hidalgo, 2003). Entre los parámetros que se evalúan en el espermiograma clásico se incluye el volumen, movimiento, concentración, morfología y acrosoma. a) Volumen y concentración. El eyaculado del morueco es de escaso volumen (0.7-2 ml) y elevada concentración espermática (2-5 x 109 spz/ml) (Evans y Maxwell, 1987). Este último es un parámetro importante a la hora de valorar la calidad de un eyaculado y preparar las dosis diluyoconservadas, no estando recomendado emplear aquellos cuya concentración sea inferior a 2.5x109 espermatozoides/ml (Evans y Maxwell, 1987, Dorado, 2003). El volumen se determina en el colector de recogida, graduado en milímetros. Su valor es necesario para calcular el número total de espermatozoides eyaculados. La concentración se puede determinar empleando un hemocitómetro, espectrofotómetro, contador de partículas computerizado o fluorometría. La técnica del hemocitómetro permite determinar el número de espermatozoides presentes en una cámara de volumen conocido. Su bajo coste hace de este método uno de los más empleados, sin embargo, presenta una variabilidad entre réplicas relativamente elevada, causada por las diluciones previas o la falta de homogeneidad en la distribución de la muestra en la cámara. Más rápido y de fácil uso es el espectrofotómetro, de tipo indirecto, que relaciona el grado de absorción o dispersión de la luz que provocan los espermatozoides Revisión Bibliográfica. 43 3. Constituyentes del plasma seminal. La funcionalidad del espermatozoide depende en gran medida del medio extracelular en el que éste se encuentra y entre los constituyentes del plasma seminal tiene particular importancia el balance iónico (Crabo y col., 1976). Desde que Loeb en 1915 (citado por Graham y col., 1967) descubriera que en ausencia de calcio extracelular no era posible la fecundación del erizo de mar, se han realizado un gran número de estudios sobre la importancia del contenido iónico en el proceso reproductivo. Los cationes se encuentran en el plasma seminal en forma libre o combinados con proteínas, con unos rangos de variación amplios y diferencias entre las distintas especies (Mann y Lutwak-Mann, 1981). Su medición se realiza de forma sencilla mediante un espectrofotómetro de absorción atómica. Entre los cationes estudiados se encuentran: 3a.- Sodio. Este es el catión que se encuentra en mayor proporción en el medio extracelular del espermatozoide aún cuando se presenta en una proporción mucho menor que en el medio sanguíneo. Se conoce muy poco del mecanismo por medio del cual interviene en los diferentes procesos espermáticos (Fraser, 1995), aunque junto con el potasio tiene una gran importancia en el proceso de regulación de la movilidad espermática (Gatti y col., 1993). 3b.- Potasio. La secreción de las glándulas vesiculares porcinas es muy rica en potasio lo que permite equilibrar los altos contenidos en aniones (fundamentalmente citrato). Su función en el proceso de capacitación espermática parece no ser fundamental (Fraser, 1995). Sin embargo, las concentraciones de potasio en el tracto reproductivo de los mamíferos, tanto en el femenino (oviducto y útero) como en el masculino (epidídimo) son muy altas comparadas con los valores sanguíneos (12-25 mM frente a 3-6 mM). Se ha demostrado en experiencias con ratones que es necesaria al menos una pequeña concentración de potasio para que se pueda producir la fecundación (Fraser, 1995), así mismo, Lee y col. (1996) demuestran que es necesaria una concentración extracelular de potasio para que se produzca la penetración de los ovocitos en un sistema FIV con ovocitos porcinos madurados in vitro. 3c.- Calcio. El ion calcio juega un papel fundamental en el proceso de la fecundación de la mayoría de los animales tanto vertebrados como invertebrados (Yanagimachi, 1981). Interviene de forma fundamental en el proceso de capacitación y reacción acrosómica y es necesario que se presente un adecuado nivel de calcio extracelular para que se produzca la hiperactivación de la movilidad (Fraser y cols., 1995). 3d.- Magnesio. El magnesio se encuentra en mayores concentraciones en el interior del espermatozoide que en el plasma seminal (Mann y Lutwak-Mann, 1981). Aunque se conoce muy poco de su función, participa como activador de la acrosina e incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina (Parrish y Polakoski, 1981). 3e.- Zinc. La función fisiológica del zinc en el plasma seminal no está totalmente aclarada, aunque se conoce su actividad en la estabilización de la cromatina, en las propiedades mecánicas de las fibras accesorias y en la movilidad del espermatozoide, así como en la regulación de la actividad de ciertas enzimas como la fosfatasa ácida y Revisión Bibliográfica. 44 alcalina (Iyer y col., 1988). En el ganado vacuno se ha encontrado una relación inversa entre el contenido en zinc en el plasma seminal y la fertilidad (Swarup y Sekhon, 1976). En cuanto a la relación entre los constituyentes químicos del plasma seminal y la fertilidad, Jeyendran y col. (1989) ponen de manifiesto una baja correlación en la especie humana, con unos niveles insuficientes para servir como factor predictivo de la fecundación. f) Evaluación computerizada de la movilidad espermática mediante sistemas CASA. Muchos investigadores del área de producción animal están tratando de diseñar el análisis seminal ideal, que valore adecuadamente y prediga la fertilidad de una muestra seminal. Así, el análisis de semen ideal será aquel que de forma sencilla y eficaz permita conocer de manera predictiva la capacidad fecundante de un eyaculado concreto. Según Graham (1996), las cualidades que deben tener los espermatozoides de un eyaculado fecundante son: movilidad progresiva, morfología normal, metabolismo enérgico activo, capacidad para desarrollar una movilidad hiperactivada, integridad funcional y estructural de la membrana, integridad de los enzimas relacionados con la fecundación, capacidad de penetración y de transmisión del material genético. Sin embargo este análisis integral es muy difícil de desarrollar, debido a la enorme complejidad inherente a la función espermática (Amann y Hammerstedt, 1993; Graham 1996; Caiza de la Cueva, 1997). Esta complejidad eleva a la evidencia el hecho de que el análisis clásico basado en el estudio de la movilidad, la concentración, la viabilidad, las anomalías morfológicas y el estado del acrosoma no permiten evaluar todas las características funcionales espermáticas, sobreestimado o subestimado así el potencial fecundante de una muestra (Butler y Roberts, 1975; Graham y col., 1980; Saacke y col., 1980; Pace y col., 1981). Los espermatozoides de mamíferos adquieren la capacidad de movimiento durante su paso por el epidídimo. La movilidad flagelar es estimulada mediante la eyaculación, modulándose mediante el transito a través del tracto reproductivo de la hembra (Davis y Siemmers, 1995). El tránsito de los espermatozoides a través del tracto genital femenino implica cambios secuenciales importantes en los patrones de movilidad espermática. Estos cambios reflejan variaciones en la actividad metabólica de los espermatozoides, puesto que la movilidad es la principal causa del consumo energético espermático (Roldán, 1998). Por lo tanto, en un eyaculado fértil deberá existir un porcentaje significativo de espermatozoides capaces de llevar a cabo estos cambios de movilidad. Así la profundización en los estudios sobre el control de la movilidad es importante para llevar a cabo un buen diagnóstico sobre la capacidad fecundante del eyaculado (Katz y Overstreet, 1980). Hasta hace pocos años, el estudio de la movilidad espermática se hacía exclusivamente mediante métodos semicuantitativos. Estos métodos evalúan el porcentaje de espermatozoides móviles, así como el tipo de movimiento que presentaba la media de una población espermática (Vázquez y col., 1997). Estas medidas ofrecen una descripción general de la movilidad espermática, pero la exactitud y precisión están limitadas por las condiciones del sistema de medida y por la destreza del observador Revisión Bibliográfica. 45 (Deibel y col., 1976). A pesar de ello la valoración subjetiva de la movilidad por personas experimentadas es de gran valor, debido a que la información se presenta de forma inmediata al tiempo que es un método económico y fácil en su ejecución (Davis y Siemers, 1995). Por éste motivo el análisis de movilidad “de visu” en granjas es el método más usado hoy en día para la evaluación de la movilidad. No obstante hay que ser consciente de que la subjetividad del método puede llevar a la obtención de resultados dispares para una misma muestra (Vázquez y col., 1997). Los primeros intentos de objetivizar el movimiento espermático se basaron en exposiciones fotográficas múltiples o en video-micrografías. Estos métodos son tediosos, largos y costosos, por lo que hoy en día no son de elección (Boyers y col., 1989). Sin embargo, la aparición de los sistemas informatizados de digitalización de imágenes abrieron un nuevo campo en el estudio de la movilidad de los espermatozoides. Estos sistemas denominados genéricamente CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) han automatizado y simplificado el proceso. El análisis computerizado de la movilidad fue propuesto hace tres décadas y es usado actualmente en centros de investigaciones en andrología y en centros de reproducción asistida. Las imágenes obtenidas permiten evaluar varios parámetros, incluyendo concentración, morfología y movimiento espermático. El CASA establece de una manera efectiva medidas cuantitativas del movimiento individual de los espermatozoides (Mortimer, 2000). Con éste tipo de análisis se espera obtener medidas correctas de la movilidad espermática que proporcionen información precisa acerca del estado funcional del axonema y de las membranas espermáticas. Cuando el análisis se hace en condiciones óptimas, las medidas detalladas de la movilidad proporcionan información predictiva sobre la función espermática (Davis y Siemers, 1995). Sin embargo hay que tener en cuenta que la exactitud de los valores obtenidos por técnicas cinemáticas está limitada por factores técnicos y biológicos que posteriormente se mencionaran. De éste modo la interpretación de los datos es dependiente del conocimiento que tengamos de las condiciones del análisis (Mortimer, 2000 y 2002). Los sistemas automáticos de medición de imágenes se basan en la captura sucesiva de espermatozoides en movimiento procedentes de un microscopio. Estas imágenes se digitalizan identificando las células espermáticas que contiene la primera imagen. Luego se procede al seguimiento de estas células en imágenes sucesivas y al establecimiento de trayectorias definitivas. Las trayectorias se procesan matemáticamente, obteniendo así unos resultados numéricos precisos (Krause, 1995). Los parámetros determinados para cada espermatozoide son la velocidad del movimiento en base a varios descriptores, la trayectoria que realiza la cabeza del espermatozoide y la frecuencia de los cambios de dirección que ésta realiza (Serres, 1984). Los descriptores del movimiento espermático obtenidos en el CASA han sido descritos por Boyers y col. (1989). Actualmente, también existen en el mercado varios tipos de CASA que capturan el movimiento espermático y lo analizan tanto a tiempo real como de manera diferida, aportando un gran volumen de información. De una manera global, este último sistema consta de un microscopio de contraste de fase conectado a una platina atemperada que permite mantener las muestras a 37ºC, una cámara de video de alta resolución conectada a una pantalla de televisión y un software de análisis de imágenes por ordenador. (Figura 7) Revisión Bibliográfica. 46 Figura 7. Sistema CASA para el análisis espermático compuesto por un microscopio de contraste de fase conectado a una pletina atemperada, a una cámara de video y a un software de análisis de imágenes por ordenador. El análisis de la movilidad mediante CASA se hace al capturar las imágenes con espermatozoides en movimiento previamente diluidos en un medio adecuado y en el microscopio a 100-200 aumentos. Tras la captura, la información es guardada hasta su análisis. Una vez realizado el análisis la información obtenida es transferida a un procesador matemático que fragmenta la movilidad espermática en diversos descriptores de la movilidad individual que caracterizan la linealidad, la angularidad del movimiento espermático y del desplazamiento de la cabeza del espermatozoide. Por describir un ejemplo el sistema CASA diseñado por Proiser (Valencia) utilizado en este proyecto describe hasta 22 parámetros de movilidad y la captura de las imágenes se basa en el análisis de 25 imágenes fotografiadas en alta resolución (768 x 576), digitalizadas y tomadas en un tiempo de 1 segundo por muestra (Tabla 2). Se han comparado datos usando diferentes sistemas disponibles en el mercado y se ha demostrado que no hay muchas diferencias en los resultados (Verstengen y col., 2002). En cambio, se han encontrado grandes diferencias entre los operadores y la metodología de preparación de las muestras a analizar (Verstengen y col., 2002). Revisión Bibliográfica. 47 Parámetro Unidad Definición VCL (Velocidad curvilínea) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria real en función del tiempo. VSL (Velocidad rectilínea) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide en el primer punto y el último de su trayectoria. VAP (Velocidad media) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria media. LIN ( Índice de linealidad) % Relación porcentual entre VSL y VCL. STR ( Índice de rectitud) % Relación porcentual entre VSL y VAP. WOB ( Índice de oscilación) % Relación porcentual entre VAP y VCL. ALH (Amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza del espermatozoide) μm/s Desplazamiento medio efectuado por la cabeza del espermatozoide en su trayectoria curvilínea de un lado a otro de la trayectoria media o lineal. % de espermatozoides móviles % Cantidad de espermatozoides móviles respecto al total % de espermatozoides progresivos % Cantidad de espermatozoides respecto al total de móviles que tienen un movimiento progresivo. Tabla 2. Parámetros de movilidad analizados en el presente proyecto mediante el sistema CASA. Revisión Bibliográfica. 48 Figura 8. Terminología estándar de algunos parámetros de movilidad evaluados mediante el sistema CASA. g) Evaluación de la integridad de membrana. La membrana plasmática, o plasmalema, es esencial para la función de los espermatozoides. Esta delicada e inestable capa proporciona protección física a la célula, actúa como una barrera selectiva para el paso de sustancias, y desempeña un papel fundamental en las interacciones con otras células, como las células epiteliales en el tracto genital de la hembra y los oocitos. Muchos de los métodos que se utilizan actualmente para evaluar el estado de la membrana plasmática se basan en el aumento de la permeabilidad de las membranas de los espermatozoides dañados a las diferentes sustancias. Estos procedimientos ampliamente utilizados son la medición de la permeabilidad de la membrana al agua en Revisión Bibliográfica. 49 una solución hiposmótica (prueba de hinchamiento osmótico, HOST), a los tintes de color (eosina método Nigrosin), o a sondas fluorescentes (Hoescht o yoduro de propidio, PI, solo o combinado con fluorocromos permeables o CFDA SYBR). Técnicas complementarias han sido usadas para aumentar la precisión y la viabilidad de las medidas de la integridad de membrana de los espermatozoides. Entre estas, la citometría de flujo o la fluorimetría sirven para evaluar la integridad de la membrana de un gran número de espermatozoides teñidos con fluorocromos en un período relativamente corto de tiempo. Un reciente sistema de análisis de semen desarrollado con ayuda de un ordenador (CASA; SpermVision, Minitub, Alemania) permite la evaluación automatizada de la integridad de membrana de los espermatozoides situados en un campo de la muestra al microscopio. Los métodos basados en el marcado con fluorocromos de los espermatozoides para evaluar la integridad de la membrana, a través de microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o fluorometría (Alm y col, 2001; Garner y Johnson, 1995; Garner y col, 1986), están sustituyendo progresivamente a las metodologías clásicas basadas en microscopía luminosa. Esto ocurre porque además de los resultados más homogéneos obtenidos entre los diferentes ensayos experimentales, son compatibles con la automatización (Yaniz y col., 2012). Estos métodos son vistos como avances importantes en la evaluación de la calidad del esperma. Sin embargo, considerando que no todos los laboratorios de análisis de esperma tienen un citómetro de flujo, un fluorímetro o están adaptados a los nuevos Sistema CASA, Yániz y col. (2008) desarrollaron un novedoso y simple método de evaluación de la integridad de la membrana de los espermatozoides de morueco en la que un microscopio de fluorescencia y un ordenador con software de código abierto son las piezas principales del equipo necesario. En este caso, la microscopía de contraste negativo de fases, combinado con un emisor de fluorocromo como el ioduro de propidio (PI), bajo microscopía de fluorescencia, se utiliza para determinar el número de espermatozoides totales y con la membrana dañada en un campo dado. Un estudio posterior de Yaniz y col. (2012) constituye un paso más allá, mejora los fundamentos de la metodología anterior. Por un lado disminuye el tiempo de incubación de los espermatozoides necesario para el marcado utilizando una sonda de doble ADN fluorescente (Naranja de acridina (AO) / ioduro de propidio (PI)). Por otro lado, en combinación con el software libre Image J, permite contar automáticamente en el porcentaje de daño de membrana si la necesidad del contraste de fases. El uso específico de AO se seleccionó debido al pequeño tamaño de la molécula, en comparación con otros fluorocromos de ADN tales como los de la familia Brand Synergy. Esto facilita la rápida interacción con la molécula de ADN por difusión rápida a través de la membrana celular, evitando los tiempos de incubación relativamente largos que pueden causar daño iatrogénico indeseado en los espermatozoides. Este es el método que se va a utilizar en el presente proyecto para el análisis de la integridad de membrana. Revisión Bibliográfica. 50 Figura 9. Microscopio de fluorescencia conectado a una cámara fotográfica para el análisis de la integridad de membrana. 4.3.4.3. La evaluación de la fragmentación del ADN del espermatozoide. Los valores de fragmentación de la molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) transportada por el espermatozoide y su relación con la fertilidad, es un tema de enorme interés, tanto en humanos como en el resto de las especies, dado el papel implícito que se le otorga al ADN en el momento de producir una descendencia que, dentro de unos límites, represente el acervo genético de los genomas parentales. Sin embargo, el estudio de cuán fragmentado se encuentra el ADN del espermatozoide no es una tarea sencilla debido a que la evolución ha blindado la información genética para ser transportada, haciéndola poco accesible a todo tipo de factores externos que puedan modificar el sentido real del mensaje que se intenta transmitir. Existen dos estrategias diferentes para estudiar la fragmentación del DNA espermático. La primera, incluye aquellas metodologías encaminadas a marcar las roturas, tanto de cadena sencilla como de cadena doble, que se registran de forma natural o fortuita en la molécula de DNA. Dentro de este grupo, podríamos incluir el uso de procesos enzimáticos para la incorporación in situ de nucleótidos marcados, tales como la Terminal dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) o la In Situ Nick Translation (ISNT). Dado que las roturas del DNA incrementan la susceptibilidad del DNA a la desnaturalización, al iniciarse esta a partir de los extremos de la rotura, la segunda estrategia incluye aquellas tecnologías que miden la distinta capacidad de la cromatina y en particular del DNA, para desnaturalizarse frente a determinados tratamientos. En este grupo se incluyen técnicas tales como el Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA), el DNA Breakage Detection-Fluorescence In Situ Hybridization (DBD-FISH), una Revisión Bibliográfica. 51 metodología que utiliza la hibridación in situ de ácidos nucleicos, el ensayo cometa bajo condiciones desnaturalizantes, o la prueba Sperm Chromatin Dispersion (SCD). Adicionalmente, existen otras pruebas para el análisis del estado de la cromatina en el espermatozoide que comentaremos con menor detalle debido a que no son tan utilizadas, o bien en algunos casos, son controvertidas. a) Ensayo SCSA. La técnica SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay ) se basa en el principio de que la cromatina anormal presenta una mayor susceptibilidad in situ a desnaturalizarse parcialmente (Evenson y Jost, 1994). El grado de desnaturalización resultante tras un tratamiento ácido se determina midiendo el cambio metacromático del fluorocromo naranja de acridina de fluorescencia verde a fluorescencia roja (Darzynkiewicz y col., 1975; Evenson y col., 1980). Este proceso se basa en la susceptibilidad que presentan los extremos rotos del ADN, tanto sean SSB o DSB, a producir ADN de cadena sencilla utilizando como punto de partida las roturas. La desnaturalización se realiza de forma controlada enfrentando el ADN a una solución ácida. Este proceso sólo desnaturaliza de forma parcial el ADN fragmentado y deja intacta la molécula que mantenga una configuración de ADN en doble cadena. Posteriormente, se utiliza un colorante con características metacromáticas, como el naranja de acridina, para la tinción. Este colorante tiene la capacidad de emitir fluorescencia en el rojo anaranjado al interaccionar con ADN de cadena sencilla (el procedente de la desnaturalización controlada), mientras que la emisión es en verde cuando el ADN permanece intacto. La discriminación entre ambas emisiones se realiza con citometría de flujo El cociente de la fluorescencia roja y la fluorescencia roja más la verde permite calcular el índice de fragmentación de ADN (DFI, DNA Fragmentation Index) de una muestra. En esta prueba, el DFI es una medida de la cantidad de cromatina de un espermatozoide que puede ser desnaturalizada por tratamiento ácido. La técnica fue desarrollada por Evenson y col. hace ahora casi 25 años, se viene considerando como el referente para el análisis de la fragmentación del DNA en el espermatozoide. Su aplicación está relativamente extendida en humanos y también ofrece buenos resultados en animales utilizados para explotación ganadera, tales como ganado porcino y bovino. Esta técnica es la más aceptada para establecer correlaciones entre fragmentación de DNA y fertilidad de un individuo. El inconveniente que tiene esta tecnología es que no es accesible a la mayoría de los laboratorios, ya que al fundamentarse en la utilización de la citometría de flujo, restringe su uso además tiene que estandarizarse muy bien, tanto en los parámetros de desnaturalización del ADN y las concentraciones y tiempos de tinción, como en el calibrado del citómetro. La presunta objetividad derivada del uso del citómetro está condicionada en parte por las condiciones de discriminación introducidas por el técnico que lo maneja. En el caso de los animales, la técnica SCSA queda relegada al estudio de algunos aspectos en investigación de carácter básico. A pesar de estos problemas, debido a la amplia experiencia con la técnica, el SCSA es quizás la metodología más aceptada por la comunidad científica para establecer correlaciones entre fragmentación de ADN y fertilidad de un individuo. Revisión Bibliográfica. 52 b) Ensayo TUNEL. Otra estrategia para visualizar el daño producido en el ADN de los espermatozoides y que se basa en introducir nucleótidos modificados en ciertos sitios de rotura del ADN: el ensayo TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl transferase-mediated deoxyUridine triphosphate-Nick End Labeling ). Deriva del campo de la biología molecular aplicada a la biología celular y permiten visualizar la incorporación de nucleótidos marcados en los extremos de las roturas existentes en el ADN, bien sean de cadena simple o doble. La reacción se cataliza, in situ, mediante la acción de una transferasa terminal llamada Deoxynucleotidyl Transferase (TdT). Se detectan roturas de ADN de cadena sencilla y doble en una reacción enzimática catalizada por la transferasa terminal (Gavrieli y col., 1992; Gorczyca y col., 1993) que une nucleótidos (dUTP) modificados al grupo hidroxilo libre del extremo 3´. Estas enzimas incorporan nucleótidos modificados con biotina o digoxigenina, en el extremo 3'-OH de la cadena afectada. Sólo las roturas con un extremos 3'-OH libre podrán ser susceptibles de ser marcadas. Otros tipos de extremos modificados químicamente no pueden servir de sustratos para las polimerasas. Posteriormente, los nucleótidos modificados se detectarán tras una reacción con un anticuerpo conjugado con un fluorocromo como molécula trazadora. Cuantas más roturas tenga el ADN mayor será la incorporación de nucleótidos. La cuantificación de los nucleótidos incorporados puede realizarse microscópicamente o mediante citometría de flujo. La técnica de TUNEL ha tenido una buena aceptación en el estudio de los procesos apoptóticos en células no germinales, dado que es versátil, está comercializado en kit y los resultados pueden ser interpretados mediante microscopía de fluorescencia o bien bajo citometría de flujo. El mayor problema que tiene la técnica es que existen niveles de marcaje intermedios e irregulares, o niveles basales variables, que pueden inducir a cierta confusión. Básicamente esto se debe a que el material que se utiliza viene precedido por un proceso de fijación de la cromatina que puede dificultar el acceso de las enzimas limitando su capacidad para introducir nucleótidos modificados o haciéndolo de forma irregular. Su uso queda restringido al campo de la investigación y no se ha expandido en la rutina ya que además requiere un equipo sofisticado para su análisis y personal especializado. c) Ensayo In Situ Nick Translation. El ensayo de In situ Nick Translation (ISNT) es básicamente una técnica de concepción similar al TUNEL ya que permite cuantificar el grado de daño que se produce en el DNA evaluando tras la incorporación de moléculas de dUTP modificado con botina o digoxigenina, o bien marcado directamente el DNA con un fluorocromo conjugado con un nucleótido modificado, tras utilizar la enzima DNA polimerasa I. La mayor diferencia con el TUNEL radica en que, en este caso, existe una actividad enzimática exonucleasa y la incorporación de nucleótidos es mayor por utilizar la cadena de DNA complementaria como molde. Cuantifica la incorporación de nucleótidos (dUTPs) modificados a las roturas de ADN de cadena sencilla en una reacción catalizada por una ADN polimerasa I Revisión Bibliográfica. 59 cromatina, siendo también una prueba de maduración-condensación nuclear. De nuevo, una de las limitaciones más importantes de esta técnica es la subjetividad del observador a la hora de establecer los grupos de clasificación. No obstante, algunos estudios la muestran como una prueba de elección frente a la naranja de acridina, o derivados de la toluidina, para el análisis de la maduración nuclear del espermatozoide. Material y Métodos. 60 5. MATERIAL Y MÉTODOS. 5.1. PREPARACIÓN DE LOS DILUYENTES. Previo paso a la recogida del semen, el día anterior en el laboratorio de la Escuela Politécnica Superior de Huesca, se procedió a preparar los diluyentes en los que el día de recogida se diluyó la muestra. A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), y las diluciones se prepararon utilizando agua Mili-Q (Millipore Ibérica, SA, Barcelona, España). Se prepararon ocho diluyentes diferentes de los que su composición es la siguiente: - Diluyente citrato: Disolución de citrato 80.6 mM ajustada a pH 7 con una disolución 1M de ácido cítrico, 55.6 mM de glucosa, 0.8% de BSA y 0.1% de PVA. - Diluyente TRIS: Disolución de TRIS 250 mM ajustada a pH 7 con una disolución 1M de ácido cítrico, 55.6 mM de glucosa, 0.8 % BSA y 0.1 % de PVA. - Diluyente TES: Disolución de TES 80 mM ajustada a pH 7 con una disolución 1M de NaOH, 55.6 mM de glucosa, 0.8% de BSA y 0.1% de PVA. - Diluyente HEPES: Disolución de HEPES 125 mM ajustada a pH 7 con una disolución 1M de NaOH, 55.6 mM de glucosa, 0.8% de BSA y 0.1% de PVA. - Diluyente MOPS: Disolución de MOPS 125 mM ajustada a pH 7 con una disolución 1M de NaOH, 55.6 mM de glucosa, 0.8% de BSA y 0.1% de PVA. - Diluyente fosfato: Disolución de Na2HPO4.2H2O 80 mM ajustada a pH 7 con una disolución 220 mM de Na2HPO4.H2O, 55.6 mM de glucosa y un 0.8% de BSA y un 1% de PVA. - Diluyente leche: Leche UHT desnatada (0,7% grasa). - Diluyente INRA: Diluyente INRA 96 (IMV Technologies, Tours, INRA, Francia), un diluyente de semen elaborado a partir de fracciones purificadas de la leche. A todos los diluyentes citados anteriormente, excepto al INRA96 se les añadió 2000 IU/ml de penicilina y 0.4 mg/ml de estreptomicina. Excepto para la leche y el INRA96, la osmolaridad se ajustó a 290 mosmol mediante la adición de de NaCl y posteriormente se esterilizaron mediante filtración. Material y Métodos. 61 Una vez preparados todos los diluyentes, se añadieron 200 µl de cada uno en criotubos para su transporte. El día de la recogida de muestras, para su transporte hasta el C.I.T.A., en Zaragoza, se sumergieron en un baño maría sobre unos 30ºC para que conservaran su temperatura hasta el momento de la adición del semen. También se prepararon ocho tubos con cada diluyente, que se mantuvieron a 15ºC hasta el día siguiente, para realizar el ajuste de la concentración. 5.2. RECOGIDA, DILUCIÓN Y PREPARACIÓN DEL SEMEN. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el reglamento de Protección Animal Español RD223/1988, que cumple con el Reglamento de la Unión Europea 86/609. Las muestras de semen se tomaron en el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA) en Zaragoza. Se utilizaron seis moruecos adultos de la raza Rasa Aragonesa especialmente entrenados por los cuidadores la recogida de los eyaculados mediante vagina artificial. Se realizaron cuatro réplicas, siendo los días de recogida los siguientes: ENSAYO 1 06/06/2011 ENSAYO 2 15/06/2011 ENSAYO 3 22/06/2011 ENSAYO 4 07/07/2011 En cada réplica se obtuvieron seis eyaculados, de los que posteriormente se seleccionaron en el laboratorio los tres de mayor calidad. Como primer paso previo a la recogida del semen, se procedió a atemperar todo el material, previamente esterilizado, que va a servir para recoger los eyaculados de los moruecos; mediante la introducción en una estufa a 37ºC. Figura 12. Estufa a 37ºC para atemperado del material de recogida seminal. Material y Métodos. 62 Todo el material fue perfectamente esterilizado y atemperado para que los eyaculados no se encontraran con un medio contaminado o frío, que puede ser causante de una disminución de la viabilidad de la muestra al producir la muerte a los espermatozoides por agentes espermicidas o por choque térmico, respectivamente. El semen se recogió mediante una vagina artificial de seis machos de la raza Rasa Aragonesa situados en el C.I.T.A. de Zaragoza. Estos machos se alimentaron mediante una dieta estándar y siguieron un manejo regular de extracciones seminales. Figura 13. Machos usados para la recogida de eyaculados. La vagina artificial trata de imitar la vagina de la oveja además de servir para recoger las muestras de una manera limpia, rápida y fácil. Esta vagina consta de tres partes fundamentales: un embudo de plástico blando, un tubo de PVC rodeado por una cámara neumática y una vaina de protección térmica. Por el extremo más estrecho del embudo se coloca un tubo de ensayo donde se recoge el eyaculado, y por su extremo más ancho va acoplado el tubo de PVC rodeado de una cámara neumática que permite alojar en su interior agua caliente a presión. Este tubo relleno de agua es el hace las veces de la vagina de la oveja y estimula al macho para eyacular. Todo este sistema va cubierto por una vaina de protección térmica que evita las pérdidas de temperatura de la vagina previamente atemperada. La cámara de la vagina artificial se llenó con agua a 48ºC y de aire para conseguir la presión necesaria. Material y Métodos. 63 Figura 14. Vagina artificial. Los primeros eyaculados fueron desechados. Después se recogieron los segundos eyaculados, de mayor calidad, que son los que se utilizaron. Tras anotar el volumen de eyaculado e inmediatamente después de haber sido recogida la muestra, se procedió a añadirlo a los diluyentes preparados el día anterior. Para ello se tomaron 100 μl de semen de cada macho y se añadió a cada uno de los 8 diluyentes diferentes. Figura 15 Momento de la recogida del eyaculado. Tras la adición del semen a los diluyentes, se colocaron las muestras en una cámara para su transporte hasta Huesca, manteniendo en todo momento a una temperatura de 15ºC. Material y Métodos. 64 Figura 16. Momento de la dilución de los eyaculados. Figura 17. Cámara a 15ºC para transporte de las muestras. Una vez en laboratorio de producción animal de la EPS de Huesca se procedió a evaluar la concentración de los eyaculados de cada macho utilizando una cámara de recuento y el programa CASA. A continuación a cada muestra se le añadió su propio diluyente en cantidad necesaria para conseguir una concentración espermática de 800 millones de espermatozoides por mililitro. Una vez ajustada la concentración las muestras se introdujeron en una estufa a 37ºC. El análisis de las muestras se realizó en el laboratorio del departamento de Producción Animal de la Escuela Politécnica Superior de Huesca (EPSH). Las muestras recogidas se analizaron a las 0, 3, 6 y 24 horas tras la recepción en el laboratorio. Material y Métodos. 65 Resumiendo, en total se analizaron 12 eyaculados diferentes, cada uno de los cuales se dividió en 8 alícuotas diluidas en los diluyentes antes descritos hasta una concentración de 800 millones de espermatozoides por mililitro. Las muestras fueron analizadas el mismo día de la recogida, a las 0, 3, y 6 horas tras su recepción en el laboratorio y al día siguiente a las 24 horas. Cada muestra se evaluó mediante el método SCD para la fragmentación de ADN, un sistema computerizado de análisis (CASA) para los parámetros de movilidad y bajo un microscopio de fluorescencia y posterior análisis de imagen para la integridad de la membrana, tal y como se describe a continuación. Los análisis movilidad y de integridad de membrana se realizaron a las horas indicadas, mientras que para los análisis de la fragmentación del ADN se congelaron alícuotas de las muestras a – 80ºC en los diferentes tiempos para realizar el análisis más adelante. 5.3. EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE MOVILIDAD MEDIANTE UN SISTEMA DE ANALISIS COMPUTERIZADO (CASA). Para evaluar la movilidad espermática se diluyeron las muestras en el mismo medio utilizado para su dilución hasta conseguir una concentración espermática de 50 millones de espermatozoides por mililitro. Para ello se tomaron 20µl de la muestra con 800 millones de espermatozoide por mililitro y se añadieron a 480 µl de diluyente a 37ºC. Se colocaron 5µl de esta nueva muestra sobre un portaobjetos atemperado a 37ºC previamente sobre la pletina del microscopio que también esta atemperada y se cubrió rápidamente con un cubreobjetos de 22x22 mm. Se capturaron 10 campos de cada muestra, mediante el sistema computerizado para el análisis espermático (CASA, ISAS, PROISER®, Valencia, España) utilizando un microscopio Olympus BX40 (Olympus Optical co., Tokyo, Japón) equipado con una platina que mantiene la temperatura a 37ºC, un objetivo de contraste de fase negativo 10X y una cámara de video digital de Buxtler. Los parámetros establecidos fueron: tamaño de célula (min/max), 14/70 µm2; velocidad curvilínea mínima (VCL) 10 µm-1; conectividad, 14; y número mínimo de puntos/ trayectoria, 5. Las variables del semen registradas fueron cinéticas: porcentaje de espermatozoides móviles (%), porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva (%), velocidad rectilínea (VSL, µm/s), velocidad curvilínea (VCL, µm/s), velocidad media (VAP, µm/s); y medidas de calidad del movimiento: índice de linealidad (LIN=VSL/VCL), índice de rectitud (STR=VSL/VAP), índice de oscilación (WOB=VAP/VCL), y amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH, µm). Material y Métodos. 66 Parámetro Unidad Definición VCL (Velocidad curvilínea) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria real en función del tiempo. VSL (Velocidad rectilínea) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide en el primer punto y el último de su trayectoria. VAP (Velocidad media) μm/s Distancia recorrida por el espermatozoide a lo largo de su trayectoria media. LIN ( Índice de linealidad) % Relación porcentual entre VSL y VCL. STR ( Índice de rectitud) % Relación porcentual entre VSL y VAP. WOB ( Índice de oscilación) % Relación porcentual entre VAP y VCL. ALH (Amplitud media del desplazamiento lateral de la cabeza del espermatozoide) μm/s Desplazamiento medio efectuado por la cabeza del espermatozoide en su trayectoria curvilínea de un lado a otro de la trayectoria media o lineal. % de espermatozoides móviles % Cantidad de espermatozoides móviles respecto al total % de espermatozoides progresivos % Cantidad de espermatozoides respecto al total de móviles que tienen un movimiento progresivo. Tabla 2. Parámetros de movilidad analizados en el presente proyecto mediante el sistema CASA. Material y Métodos. 67 Figura 8. Terminología estándar de algunos parámetros de movilidad evaluados mediante el sistema CASA. Material y Métodos. 68 Figura18. Captura de pantalla del programa CASA (ISAS, PROISER®, Valencia, España) de un campo de una muestra de semen de morueco, capturado utilizando un microscopio Olympus BX40 (Olympus Optical co., Tokyo, Japón) para el análisis de los parámetros de movilidad espermática. Cuando se capturaron los 10 campos se obtuvo una base de datos donde a cada espermatozoide se le describe detalladamente con cada uno de los parámetros anteriormente señalados. Figura 19. Hoja de datos generada por el sistema CASA. Resultados. 75 Figura 24. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas en parámetros cinéticos: a) velocidad curvilínea, b) velocidad rectilínea y c) velocidad media. 0 50 100 150 200 0 3 6 24 μm/s Tiempo (Horas) VCL Leche Inra Tris Citrato Mops Tes Hepes Fosfato 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 3 6 24 μm/s Tiempo (Horas) VSL Leche Inra Tris Citrato Mops Tes Hepes Fosfato 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 3 6 24 μm/s Tiempo (Horas) VAP Leche Inra Tris Citrato Mops Tes Hepes Fosfato a) b) c) Resultados. 76 El efecto del diluyente empleado sobre las variables de calidad de movimiento se muestra en la figura 25. De nuevo los diluyentes formulados con los compuestos zwiterion obtuvieron los mejores resultados y además constantes a lo largo de todo el estudio, salvo para la ALH (Fig. 25d) donde se vio incluso una tendencia a la disminución en la amplitud de batida de la cabeza. A las 3h y 6h el diluyente TRIS fue el que presentó los peores resultados en todos los parámetros de calidad. El resto de diluyentes mostraron valores similares. A las 24h la leche descendió en LIN (Fig. 25a), STR (Fig. 25b) y WOB (Fig. 25c), con la misma tendencia que en los anteriores parámetros, y presentó los peores resultados junto a TRIS. En cambio INRA no presentó diferencias significativas con los diluyentes del grupo zwiterion, salvo en ALH. Así, a las 24h el INRA y el TRIS presentaron la mayor amplitud de batida de la cabeza (Fig. 25d). El grupo Fosfato y Citrato se comportaron bien en todos estos parámetros hasta las 6h, mientras tenían espermatozoides móviles. Resultados. 77 Figura 25. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas en parámetros de calidad de movimiento: a) índice de linealidad, b) índice de rectitud, c) índice de oscilación y d) amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza. a) b) c) d) 0 20 40 60 80 100 0 3 6 24 % (VSL/VCL) Tiempo (Horas) LIN 0 20 40 60 80 100 0 3 6 24 % (VCL/VAP) Tiempo (Horas) STR 0 20 40 60 80 100 0 3 6 24 % (VAP/VCL) Tiempo (Horas) WOB 0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 24 μm/s Tiempo (Horas) ALH Resultados. 78 La figura 26 muestra el efecto de los diferentes diluyentes sobre el porcentaje de espermatozoides con la membrana intacta (viables). A las 3 y 6h, las muestras diluidas en fosfato fueron las que obtuvieron la menor proporción de espermatozoides viables, mostrando diferencias significativas con la leche, el diluyente que obtuvo los valores más altos. A las 6h, el citrato también fue significativamente menor que la leche, mientras que en el resto de diluyentes las diferencias no alcanzaron la significación al presentar valores intermedios. Los diluyentes que mostraron mayores descensos de viabilidad entre las 6 y las 24h fueron la leche, el INRA y el fosfato. Estos dos últimos grupos se distanciaron claramente del resto a las 24h de incubación, con resultados muy inferiores de viabilidad, mientras que las muestras diluidas en leche no se diferenciaron del resto de grupos en ese tiempo. Los diluyentes del grupo zwiterion y el TRIS mantuvieron valores constantes de espermatozoides viables hasta las 6h, mostrando un descenso entre las 6 y 24h aunque menos intenso que en el resto de diluyentes. Figura 26. Efecto de los diferentes diluyentes en los espermatozoides de morueco durante la incubación hasta las 24 horas en el porcentaje de espermatozoides viables en referencia a la integridad de la membrana de los mismos. En figura 27 se muestra la dinámica de fragmentación del ADN espermático (expresada como un índice de fragmentación o DFI) durante la incubación a 37ºC. A las 0 y 3h no se observaron diferencias significativas de fragmentación entre los diferentes diluyentes. A las 6h la fragmentación del ADN espermático fue mayor en el semen diluido en leche (11% de media) que en los diluyentes de formulación simple basados en los diferentes tampones (citrato, fosfato, HEPES, MOPS, TES, y TRIS). Todos los diluyentes mantuvieron valores constantes de fragmentación a lo largo del tiempo de estudio salvo la leche y el INRA, en los que se apreció un aumento significativo entre las 3 y las 24h, por lo que mostraron los mayores índices de fragmentación al final del estudio, aunque el INRA no mostrara diferencias significativas con TES y HEPES. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 3 6 24 % espermatozoides viables Tiempo (Horas) Integridad de Membrana Leche Inra Tris Citrato Mops Tes Hepes Fosfato Resultados. 79 Figura 27. Efecto de los diferentes diluyentes en el incide de fragmentación del ADN de los espermatozoides de morueco durante la incubación a 37ºC hasta las 24 horas. En la figura 28 se muestra la variación del pH en los diferentes diluyentes a lo largo de la incubación a 37ºC. A las 0 h la leche presentó valores algo inferiores al resto, aunque las diferencias no fueron significativas. A las 3h la leche presentó un pH significativamente más bajo que el resto de diluyentes. En el INRA se observó un descenso claro del pH a las 6 y 24h de incubación, de manera que obtuvo valores similares a la leche e inferiores a algunos de los diluyentes a las 6h (MOPS y Fosfato) y a todos los a las 24h. A las 24h todos los diluyentes disminuyeron su pH a excepción del fosfato que mantuvo el pH constante durante las 24h de estudio. Figura 28. Variación del pH en los diferentes diluyentes de semen de morueco durante la incubación hasta las 24 horas. 0 5 10 15 20 25 0 3 6 24 % de fragmentación Tiempo (Horas) DFI Leche INRA TRIS Citrato MOPS TES HEPES Fosfato 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 0 3 6 24 Tiempo (Horas) pH Leche Inra Tris Citrato Mops Tes Hepes Fosfato Discusión. 80 7. DISCUSIÓN. En este estudio hemos comparado el efecto sobre la conservación del semen de morueco de diferentes diluyentes, desde los más simples y con una capacidad tamponante limitada, tales como el citrato y el fosfato, hasta los tampones orgánicos más complejos y no permeables (TES, HEPES, MOPS, TRIS) que pueden controlar el pH en un rango más amplio y no son dependientes de la temperatura (TES, MOPS y HEPES), además de dos diluyentes de composición compleja, la leche y el INRA96. Los resultados muestran que los diluyentes complejos, leche e INRA mostraron una elevada proporción de espermatozoides móviles y viables hasta las 6h, aunque a las 24h se observó un descenso muy brusco en estos parámetros, asociado a una disminución en el pH. El mantenimiento del pH del medio en el que se suspenden los espermatozoides es un aspecto crucial en la conservación de semen. El pH del semen de ovino recién eyaculado es de alrededor de 6,7-6,8 (Moore y col., 1940; Bar-Sagie y col., 1981). Durante el almacenamiento, los espermatozoides y las bacterias contaminantes producen metabolitos que pueden reducir el pH del medio. El pH interno de los espermatozoides está directamente relacionado con el pH del medio (Gatti y col. 1993; Jones y Bavister 2000) y se correlaciona con la movilidad de los espermatozoides (Jones y Bavister 2000). Cuando se reduce el pH, tanto en el metabolismo de los espermatozoides como la movilidad se reduce (Gadea, 2003). El metabolito principal responsable de la disminución en el pH es el ácido láctico producido por el metabolismo glucolítico de los espermatozoides y, por consiguiente, se ha utilizado como un indicador de la calidad del semen (Rigau y col., 1996). La adición de agentes tampón en el diluyente ayuda a controlar el pH del medio, pero hay una importante variación en el rango de amortiguación y la capacidad de estas moléculas, y muchos sistemas tampón tienen un impacto sobre los sistemas biológicos, las actividades de la enzima, los sustratos o los cofactores (Perrin y Dempsey, 1974). Una solución tampón ideal para diluyentes espermatozoides debe tener una alta capacidad de amortiguación en el rango de pH donde los espermatozoides son funcionales y ser independiente de la temperatura, neutro y no tóxico a las células, y no reaccionar con otros componentes del diluyente. Estos dos diluyentes complejos, leche e INRA, fueron los que también presentaron un mayor grado de fragmentación del ADN espermático a partir de las 6h. Esta mayor fragmentación puede asociarse también al descenso observado en el pH. La leche desnatada, un complejo biológico variable, es el principal diluyente utilizado para preservar el semen de ovino a 15ºC para IA en numerosos países, incluido España. El éxito de este diluyente ha sido atribuido a su fracción proteica que puede actuar como un amortiguador frente a los cambios de pH y como agente quelante en contra de cualquier metal pesado presente. También puede proteger parcialmente los espermatozoides durante la reducción de la temperatura de almacenamiento. La leche de vaca ha sido preferible a la leche de otras especies. El INRA96 es un diluyente semisintético que incorpora elementos de la leche y citrato en su composición. Los resultados obtenidos en este estudio desaconsejan la utilización de diluyentes basados en leche, como la propia leche y el INRA, para la conservación del semen de morueco durante largos periodos, ya que presentan una reducida capacidad tamponante, produciéndose un descenso notable de pH que afecta a la mayoría de parámetros de calidad seminal. Sin embargo, estos diluyentes pueden funcionar bien cuando el semen se conserva durante breves intervalos de tiempo, como habitualmente se realiza en ovino. Discusión. 81 Los tampones pertenecientes al grupo zwitterion (MOPS, HEPES, TES) fueron los que obtuvieron mejores resultados de velocidad a partir de las 3h. También se situaron entre los mejores diluyentes en la proporción de espermatozoides móviles, progresivos, viables y no fragmentados, manteniendo una mejor movilidad total que el resto de los diluyentes hasta las 24h, junto con el TRIS, y un mayor porcentaje de espermatozoides progresivos a las 24h. Estos resultados son coincidentes con un trabajo previo de nuestro grupo (Yániz y col., 2011), en el que se evaluó el efecto del sistema tampón sobre la conservación del semen de morueco a 15ºC. A pesar de utilizar temperaturas diferentes, el presente estudio confirma los resultados obtenidos en el anterior, ya que los diluyentes basados en tampones pertenecientes al grupo de los zwitterion (TES, MOPS y HEPES) obtuvieron muy buenos resultados en la mayoría de parámetros de movilidad e integridad de membrana. En el presente trabajo se pretendía emular las condiciones del aparato genital de la hembra y acelerar los procesos de degradación espermática para estudiar la dinámica de fragmentación del ADN espermático utilizando diferentes diluyentes. Por ello se incubaron las muestras a 37ºC, siguiendo una metodología descrita con anterioridad por otros autores (Gosálvez y col, 2006 y 2008). A pesar del interés potencial de los compuestos zwiteriónicos en la conservación del semen en refrigeración o congelación en ovino, relativamente pocos estudios han evaluado sus efectos sobre la calidad del esperma durante el almacenamiento (Upreti y col., 1991; Maxwel y Salomon, 1993). En el estudio de Molinia y col. (1994), en diluyentes para la conservación en congelación, los diluyentes que contenían tampones zwitterion ofrecieron mejores resultados de movilidad, viabilidad e integridad de acrosomas tras la descongelación en ovino, que los que contienen sistemas tampón basados en el TRIS-citrato. Un año después, Upreti y col. (1995), publicaron que el MOPS era mejor que el HEPES para la movilidad espermática durante la incubación a 38 º C, y que una concentración de HEPES a partir de 40 mM disminuían los valores de la movilidad del esperma durante la incubación a 38 º C, mientras que estos efectos no se observaron con MOPS hasta concentraciones de 150 mM . En el presente estudio, sin embargo, las diferencias de movilidad fueron poco relevantes entre los diferentes agentes tamponantes zwitteriónicos evaluados, a pesar de que el HEPES se incluyó a una concentración varias veces superior a 40 mM. Aunque en el presente estudio los resultados que se obtuvieron con HEPES fueron aceptables, el uso de este tampón debe ser cuidadosamente evaluado ya que puede estimular a las células para que produzcan agentes oxidantes (Bowman y col., 1985), y cuando los medios que contienen HEPES están expuestos a la luz, producen peróxido de hidrógeno citotóxico (Zigler y col., 1985; Lepe-Zúñiga y col.1987). Varios autores han descrito los efectos adversos del HEPES sobre varios tipos de células, como los macrófagos (Brune, 1980), condrocitos (Poole y col., 1982), fibroblastos (Verderey y col., 1981), los ovocitos (Morgia y col, 2006) y embriones (Mahadevan y col, 1986; Keskintepe y Brackett, 1996). En nuestro estudio, las condiciones de trabajo con reducida exposición a la luz de los diluyentes pudieron contribuir a que el diluyente basado en HEPES obtuviese buenos resultados. El diluyente basado en el TRIS obtuvo buenos resultados de movilidad total, velocidad curvilínea y fragmentación hasta las 24h. Sin embargo este diluyente presentó los peores índices de calidad de movimiento, al presentar la mayoría de los espermatozoides trayectorias circulares. Los resultados obtenidos en relación al TRIS son también coincidentes con los descritos previamente por nuestro grupo para semen conservado en refrigeración (Yániz y col., 2011). Los resultados de este estudio Discusión. 82 refuerzan la idea de que TRIS puede estar contraindicado para su uso en las formulaciones de los diluyentes de esperma en ovino (Yániz y col, 2011). El diluyente basado en TRIS causa modificaciones drásticas en los parámetros cinéticos de los espermatozoides, que se caracterizan por un aumento del ALH, y una disminución en la VSL y LIN. Cambios similares se han descrito en la hiperactivación de los espermatozoides durante la capacitación (Mortimer y Maxwell, 1999). Un espermatozoide de morueco puede ser considerado en hiperactivación cuando VCL > 250.0 μm s–1, VSL < 100.0 μm s–1, LIN < 30%, and ALHmax ≥ 9.0 μm. (Mortimer y Maxwell, 1999). En promedio, estos requisitos no fueron alcanzados en las muestras diluidas en Tris durante el almacenamiento, pero este tampón induce cambios en la movilidad de los espermatozoides que recuerdan a las observadas durante el proceso de hiperactivación. Inicialmente se publicó que concentraciones de TRIS entre 10 y 50 mM no tenían ningún efecto sobre la movilidad y el metabolismo de los espermatozoides de ovino. Posteriormente, concentraciones más altas de Tris resultaron ser ventajosas en diluyentes para el almacenamiento refrigerado, y en la actualidad, los medios basados en TRIS son ampliamente recomendados para el semen ovino refrigerado (Salomon y Maxwell, 2000). Sin embargo, la elección de un tampón para una aplicación particular debe basarse en sus propiedades de pH óptimo y propiedades biológicas en lugar de su uso histórico. En este sentido, y de acuerdo con Upreti y col., 1995, pensamos que la elección de Tris como diluyente de semen no es lo ideal porque: 1) el pKa de Tris es de 8,1, lo que significa que su capacidad de amortiguación a pH inferior a 7,5 es pobre; 2) sus grupos amino alifáticos son químicamente reactivos, por lo que no es apto para ser utilizado con los sistemas celulares porque es tóxico para muchas células de mamíferos (Good y col., 1966); 3) el TRIS interacciona con iones metálicos (Hanlon y col. 1966), e interfiere en la absorción de calcio en las vesículas de membrana y las células (Alonso y col., 1979; Kwan y Daniel, 1981; Upreti y col., 1995); 4) el tampón TRIS inhibe las enzimas respiratorias en las mitocondrias, aunque esto podría ser reversible (Hayashi y col., 1981), y 5) el pH de una solución basada en TRIS depende de la temperatura. La capacidad de amortiguación depende de la concentración y la proximidad del pH en relación con el pKa del búfer. En concentraciones más bajas de búfer y en valores de pH fuera del pKa, el sistema tampón es más susceptible a los cambios de pH (Chuy y Bell, 2006). Las altas concentraciones de Tris incorporado en los diluyentes de semen pueden tener la ventaja de una mayor capacidad de amortiguación alrededor de pH 7.0, pero las otras desventajas pueden adquirir una mayor relevancia. Los diluyentes basados en citrato y fosfato fueron los que obtuvieron peores resultados de movilidad a partir de las 3h de incubación, mientras que la fragmentación de ADN espermático fue muy baja en ambos diluyentes hasta las 24h. El fosfato también fue el diluyente con resultados más bajos de integridad de membrana a las 6h y, junto con el INRA, a las 24h de incubación. En un estudio anterior de nuestro grupo (Yániz y col, 2011), el tampón fosfato fue el que peor conservó la proporción de espermatozoides móviles y progresivos y la integridad de membrana durante la conservación a 15ºC. Los diluyentes basados en fosfatos se desarrollaron antes de 1940 para la preservación de semen de toro y morueco, y han sido reemplazados por diluyentes basados en citrato, y diluyentes orgánicos que contienen como TRIS (Salomon y Maxwell, 2000). En la actualidad, citrato y TRIS son los sistemas tampón más frecuentes en la composición de los diluyentes semi-sintéticos para el almacenamiento de semen ovino en refrigeración. (Evans y Maxwell, 1987, Maxwell y Discusión. 83 Salomon, 1993; Salomon y Maxwell, 2000; López y col., 1999; Martí y col., 2003; López-Sáez y col., 2000; Paulenz y col., 2002; Paulenz y col., 2003; Yániz y col, 2008). Los efectos del citrato en los espermatozoides pueden ser difíciles de predecir, porque es un sustrato mitocondrial y un quelante con elevada afinidad para los cationes divalentes (Kamp y col., 2007). El citrato por lo tanto podría apoyar la producción de ATP mitocondrial y/o atenuar los efectos de Ca2+, Mg2+, Zn2+, o iones de metales tóxicos. La alta concentración de citrato puede inhibir la fosfofructoquinasa, probablemente el elemento más importante del control glucolítico en el esperma (Travis y col. 2001, Jones y Connor 2004, Kamp y col., 2007). A pesar de la que la permeabilidad de la membrana plasmática de los espermatozoides al citrato es poco clara, el hecho de que las concentraciones extra- e intracelulares están relacionadas con las concentraciones de citrato y que los espermatozoides pierdan citrato intracelular cuando se encuentran en medios de baja concentración en citrato indicaría que el citrato puede ser permeable (Kamp y col. 2007). Por último, el ácido cítrico / citrato de sodio es un sistema de amortiguación simple con una capacidad de amortiguación limitada (Gadea, 2003). Los estudios realizados sobre distintas especies de animales, en lo que se refiere a la fragmentación del ADN en muestras de semen, indican que el valor diagnóstico de este parámetro no se debería obviar (Agarwal y Allamaneni, 2004). Sin embargo, y probablemente debido al bajo número de trabajos realizados en este campo, existen versiones contradictorias sobre la importancia absoluta del parámetro en sí mismo o el peso relativo que se le debe otorgar al confrontarlo con los datos tradicionales que se analizan en un espermiograma normal. Si bien algunos autores consideran la fragmentación del ADN como un marcador independiente de los valores estándar dentro de un espermiograma (Zini y col., 2001; Evenson y col., 2002), otros establecen correlaciones entre diversos parámetros de calidad seminal y los índices de fragmentación (Sun y col., 1997; Giwercmany col., 2003; Sills y col., 2004) e incluso entre la fragmentación y la capacidad de fertilización de los individuos (Evenson y col., 1994; Didion y col., 1999). Los resultados de un estudio de Pérez-Llano y col. (2005) indicaron que el DFI es un parámetro independiente del resto de las características seminales controladas de forma rutinaria. Esto significa que un espermatozoide con movilidad, acrosoma y morfología normales, es decir aparentemente normal, puede tener el ADN fragmentado y, como consecuencia, presentar problemas en la fertilización. Por tanto, el DFI se debería evaluar para ser conjugado con el resto de parámetros y, de esta forma, tomar una decisión sobre la utilidad del eyaculado. La Fragmentación del ADN espermático puede ser retrasada o incluso abolida mediante el uso de diluyentes espermáticos (Pérez-Llano y col., 2006). En este estudio de se evaluaron muestras de esperma de verraco diluido en diluyente comercial ACROMAX. (BPV, SL, Madrid, España) y de semen sin diluir, almacenados a 15ºC durante 21 días. Se demostró que los parámetros de movilidad y calidad del movimiento disminuyen más rápidamente en las muestras de semen no diluido entre el día 0 y 7, en comparación con las muestras de semen diluido que se mantuvieron con una alta calidad hasta el día 11. La principal conclusión de este estudio fue que algunos medios para diluir esperma pueden retrasar parcialmente o evitar la fragmentación del ADN espermático. El hecho de que la fragmentación del ADN de los espermatozoides depende de la estrategia de conservación utilizada y que no era constante, planteaba Discusión. 84 preguntas interesantes acerca de la mejor manera de preservar las muestras de semen y el tiempo óptimo para utilizarlo. El semen diluido se protegió tanto contra los efectos del envejecimiento in vitro como contra de los mecanismos que conducen a la fragmentación del ADN espermático. En el presente estudió se trató de esclarecer cuales podrían ser los diluyentes más adecuados en semen ovino para frenar la fragmentación. Para ello se estudió la dinámica de fragmentación durante la incubación a 37ºC hasta las 24h y se observó que la fragmentación permanece constante a lo largo del periodo de estudio en las diferentes muestras diluidas, salvo en los diluyentes INRA96 y leche, donde la fragmentación se disparaba ya a las 6h de incubación. Según Boe-Hansen y col (2005) al aumentar el tiempo de almacenamiento de semen se reduce la integridad del ADN espermático y esto puede ser detectado en las primeras 24 horas en condiciones experimentales. Se han realizado numerosos trabajos en diferentes especies en los que se incubaron las muestras a 37ºC, en un intento de emular las condiciones biológicas que experimentan los espermatozoides durante el transporte en el tracto femenino tras la inseminación artificial (López-Fernandez y col., 2007 y 2008; Pérez-Llano y col., 2010; Gosálvez y col, 2006; etc.). La presencia de sus propias especies reactivas del oxígeno (ROS) podría desempeñar un papel importante en la inducción de daño de la membrana, que a su vez, puede afectar a la integridad del ADN. Además, la liberación de enzimas proteolíticas activas como las contenidas en el acrosoma, así como la presencia de nucleasas activos de los que participan en el proceso de apoptosis puede dar lugar a daños en el ADN. En conclusión, los resultados de este trabajo indican que los diluyentes basados en tampones del grupo zwiterion son los que obtuvieron mejores resultados globales de movilidad, integridad de membrana, viabilidad espermática y fragmentación del ADN hasta las 24h de incubación a 37ºC. Los diluyentes basados en la leche o sus componentes presentaron un aumento claro de la fragmentación del ADN espermático a partir de las 6h de incubación, asociado un menor pH del medio. El TRIS provocó una alteración de las variables relacionadas con la calidad del movimiento, y el citrato y fosfato presentaron unos malos resultados de movilidad durante la incubación. Sin embargo, estos tres últimos diluyentes presentaron porcentajes reducidos de fragmentación del ADN espermático. Bibliografía. 91 COLAS, G.; TRYER, M.; GUERIN, Y.; AGUER, D. (1980). Fertilizing ability of ram sperm stored in a liquid state during 24 hours. Proceedings of the 9th International Congress on Animal Reproduction and A.I. Madrid, III;; p. 315. COLENBRANDER, B., GADELLA, B. M., AND STOUT, T.A.E., (2003). The predictive value of semen analysis in the evaluation of stallion fertility. Reprod. Dom. Anim. 38:305-311. COLLINS, A.M., WILLIAMS, V., EVANS, J.D. (2004). Sperm storage and antioxidative enzyme expression in the honey bee, Apis mellifera. Insect Molecular Biology, 13, 141-146 COOK, P. R., BRAZELL, I. A. Y JOST, E. (1976). Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA. Journal of Cell Science 22, 303-24. COOPER, T.G. (1986). The epididymis, sperm maduration and fertilisation. Springer Verlag, Heidelberg. COOPER TG (1996). Epididymis and sperm function. Andrologia.;28(suppl1):57–59 CRABO, B.G.; ZIMMERMAN, K.J.; MOORE, R.; THORNBURGH, F.H. (1976) Movement of sodium and potassium into ejaculated boar spermatozoa suspended in seminal plasma and a biological salt solutions. Bioch. Biophys. Acta. 144:875-885 CROSS, N.L., P. MORALES, J.W. OVER, F.W. HANSON (1986). Two simple methods for detecting acrosome-reacted human sperm, Gamete Res. 15: 213-226. DADOUNE, J. P. (2003). Expression of mammalian spermatozoal nucleoproteins. Microscopy Research and Technique 61, 56-75. DARZYNKIEWICZ, Z., TRAGANOS, F., SHARPLESS, T. Y MELAMED, M. R. (1975). Thermal denaturation of DNA in situ as studied by acridine orange staining and automated cytofluorometry. ExperimentalCell Research 90, 411-28. DAVIS, R.O., ROTHMANN, S. AND OVERSTREET, J. (1992) Accuracy and precision of computer-aided sperm analysis in multicentre studies. Fertil. Steril., 57,648–653. DAVIS, R.O., SIEMERS, R.J., (1995). Derivation and reliability of kinematics measures of sperm motion. Reprod. Fertil Dev. 7, 857-869. DEIBEL, F.C., SMITH, J.E. JR, CRABO, B.G., GRAHAM, E.F., (1976). Evaluation of six assays of sperm quality by means of their accuracy, precision and sensitivity in separating known induced levels of damage. In: Proc. 8th Int. Congr. Anim. Reprod. Artif. Insemin. Cracow. pp. 888–891 DE LUCIA, F., FARAONE-MENNELLA, M. R., D'ERME, M., QUESADA, P., CAIAFA, P. Y FARINA, B. (1994).Histone-induced condensation of rat testis chromatin: testis-specific H1t versus somatic H1 variants. Biochemical and Biophysical Research Communications 198, 32-9. Bibliografía. 92 DEL VALLE I, MENDOZA N, CASAO A, CEBRIÁN-PÉREZ JA, PÉREZ R, MUIÑO-BLANCO T. (2010). Significance of non-conventional parameters in the evaluation of cooling-induced damage to ram spermatozoa diluted in three different media. Reprod Domest Anim. Dec;45:260-8. DEN DASS N (1992). Laboratory assessment of semen characteristics. Anim Reprod Sci.;28:87–94. DIDION, B., C. GRAVES. (1986). In vivo capacitation and acrosome reaction of bovine sperm in estrous and diestrous cows. J. Anim. Sci. 62: 1029-1033. DIJKWEL, P. A., WENINK, P. W. Y PODDIGHE, J. (1986). Permanent attachment of replication origins to the nuclear matrix in BHK-cells. Nucleic Acids Research 14, 3241-9. DORADO, J. (2003). Respuesta a la congelación-descongelación del esperma de macho cabrío. Tesis doctoral, Universidad de Córdoba, 165 pp. DRESDNER, R. D. & KATZ, D. F. (1981) Relationships of mammalian sperm motility and morphology to hydrodynamic aspects of cell function. Biol. Reprod. 25, 920–930 EGGERT-KRUSE, W., KO¨HLER, A., ROHR, G. AND RUNNEBAUM, B. (1993) The pH as an important determinant of sperm–mucus interaction. Fertil. Steril., 59, 617–62 EID L.N., LORTON S.P., PARRISH J.J. (2001). Paternal influence on S-phase in the first cell cycle of the bovine embryoBiol Reprod. 1994;51:1232–1237. ENCISO, M., MURIEL, L., FERNÁNDEZ, J. L., GOYANES, V., SEGRELLES, E., MARCOS, M., MONTEJO, J. M.,ARDOY, M., PACHECO, A. Y GOSALVEZ, J. (2006). Infertile men with varicocele show a high relative proportion of sperm cells with intense nuclear damage level, evidenced by the sperm chromatindispersion test. Journal of Andrology 27, 106-11. ERENPREISS J, HLEVICKA S, RAUDA R. (2002). High impact of male infertility in barren couples in Latvia, 1998–2001. Proc Latv Acad Sci. Ser B; 56:48–51 ERICSSON SA, GARNER DL, JOHNSON LA, REDELMAN D, AHMAD K. (1990b): Flow cytometnic evaluation of cryopreserved bovine spermatozoa processed using a new antibiotic combination. Theniogenology 33:121 EVANS, G.; MAXWELL, W.M.C. (1987) Salomon’s artificial insemination of sheep and goats. Sydney: Butterworth Scientific;. 194 EVENSON, D. Y JOST, L. (1994). Sperm chromatin structure assay: DNA denaturability. Methods in Cell Biology 42, 159-76. EVENSON, D. P., DARZYNKIEWICZ, Z. Y MELAMED, M. R. (1980). Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science 210, 1131-3. Bibliografía. 93 EVENSON, D.P., DARZYNKIEWICZ, Z., AND MELAMED, M.R (1982) Simultaneous measurement by flow cytometry of sperm cell viability and mitochondrial membrane potential related to cell motolity. J. Histochem. Cytochem., 30, 279–280. EVENSON D, LARSON K, JOST L, VIRRO M, DEJONGE C, BRANNIAN J. (2002) Relationship between age of man, sperm DNA fragmentation and infertility. April 2002, Seattle Washington. American Society of Andrology FAWCETT, D. W. Y PHILLIPS, D. M. (1969). The fine structure and development of the neck region of the mammalian spermatozoon. Anatomical Record 165, 153-64. FELSENFELD, G. (1978). Chromatin. Nature 271, 115-22. FERNÁNDEZ, J. Y GOSÁLVEZ, J. (2002). Application of FISH to detect DNA damage: DNA breakage detection-FISH(DBD-FISH). Methods in Molecular Biology 203, 203-216. FERNÁNDEZ, J. L., VAZQUEZ-GUNDIN, F., DELGADO, A., GOYANES, V. J., RAMIRO-DIAZ, J., DE LA TORRE, J. Y GOSALVEZ, J. (2000). DNA breakage detection-FISH (DBD-FISH) in human spermatozoa: technical variants evidence different structural features. Mutation Research 453, 77-82. FERNÁNDEZ, J., MURIEL, L., RIVERO, M., GOYANES, V., VAZQUEZ, R., Y ÁLVAREZ, J. (2003). The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. Journal of Andrology 24. 59-66 FERNÁNDEZ, J. L., MURIEL, L., GOYANES, V., SEGRELLES, E., GOSALVEZ, J., ENCISO, M., LAFROMBOISE, M. Y DE JONGE, C. (2005). Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test. Fertility and Sterility 84, 833-42. FEUGHELMAN, M., LANGRIDGE, R., SEEDS, W. E., STOKES, A. R., WILSON, H. R., HOOPER, C. W., WILKINS, M. H., BARCLAY, R. K. Y HAMILTON, L. D. (1955). Molecular structure of deoxyribose nucleicacid and nucleoprotein. Nature 175, 834-8. FEY, E. G. Y PENMAN, S. (1988). Nuclear matrix proteins reflect cell type of origin in cultured human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85, 121-5. FINCH, J. T. Y KLUG, A. (1976). Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 1897-901. FOLCH, J. (2000). Manejo del morueco. XXV Jornadas Científicas SEOC, Producción ovina y caprina, 61-64. FRANCA, L.R., BECKER-SILVA, S.C. AND CHIARINI-GARCÍA, H. (1999). The length of the cycle of seminiferous epithelium in goats (Capra hircus). Tissue and Cell,31(3):274-280. Bibliografía. 94 FRASER, L.R. (1995) Ionic control of sperm function. Reprod. Fertil. Dev. 7:905-925 FRASER L., GORSZCZARUK K., STRZEZEK J., (2001). Relationship between motility and membrane integrity of boar spermatozoa in media varying in osmolality. Reprod. Domest. Anim. 36, 325-329. GARNER, D.L., PINKEL, D., JOHNSON, L.A. & PACE, M.M. (1986) Assessment of spermatozoal function using dual fluorescent staining and flow cytometric analyses. Biol. Reprod. 34, 127-138 GADEA J, RUIZ S, COY P, POTO A, PEINADO B, ROMAR R, CAMPOS I, ZUBILLAGA O. (1998). Fecundación in vitro con semen congelado en la especie porcina. Arch Zootec 47: 299-304.. GADEA, J. (2003) Semen extenders used in the artificial insemination of swine. A review. (Spanish Journal of Agricultural Research 1 (2):17-27 ) GARNER, D.L., CHERYL, A.T., (1999). Organelle-specific probe JC-1 identifies membrane potential differences in the mitochondrial function of bovine sperm. Mol. Reprod. Dev. 53, 222-229. GARNER, D.L. AND L.A. JOHNSON. (1995). Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide. Biology of Reproduction, 53: 276-284 GARNER, D.L., L.A. JOHNSON, S. LAKE, N. CHANEY, D. STEPHENSON, D. PINKEL, AND B.L. GLEDHILL. (1983). Quantification of the X- and Y-chromosome- bearing sperm of domestic animals by flow cytometry. Biol. Reprod. 28:312–21. GATTI, J.; CHEVRIER, C.; PAQUINON, M.; DACHEUX, J., (1993): External ionic conditions, internal pH and motility of ram and boar spermatozoa. J Reprod Fertil 98, 439–449. GAVRIELI, Y., SHERMAN, Y. Y BEN-SASSON, S.A. (1992). Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. The Journal of Cell Biology 119, 493-501. GERFEN R.W., WHITE B.R., COTTA M.A., WHEELER M.B., (1994). Comparison of the semen characteristics of Fengjing, Meishan and Yorkshire boars. Theriogenology 41, 461-469 GETZENBERG, R. H., PIENTA, K. J. Y COFFEY, D. S. (1990). The tissue matrix: cell dynamics and hormone action. Endocrine Reviews 11, 399-417. GILMORE J.A., DU J., TAO J., PETER A.T., CRITSER J.K., (1996). Osmotic properties of boar spermatozoa and their relevance to cryopreservation. J. Reprod. Fertil. 107, 87-95 GIL-GUZMAN, E., OLLERO, M., LOPEZ, M. C., SHARMA, R. K., ALVAREZ, J. G., THOMAS, A. J., JR. Y AGARWAL, A. (2001). Differential production of reactive Bibliografía. 95 oxygen species by subsets of human spermatozoa at different stages of maturation. Human Reproduction 16, 1922-30. GIWERCMAN A, RICHTHOFF J, HJØLLUND H, BONDE JP, JEPSON K, FROHM B, SPANO M (2003) Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters. Fertil Steril 80:1404–1412 GLOVER, T.D., BARRAT, C.L.R., TYLER, J.P.P. AND HENNESSEY, J.F. (1990). Sperm production and its control, En: Human Male Fertility and Semen Analysis, Academic Press, London. GORCZYCA, W., TRAGANOS, F., JESIONOWSKA, H. Y DARZYNKIEWICZ, Z. (1993a). Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells. Experimental Cell Research 207, 202-5. GORCZYCA, W., GONG, J. Y DARZYNKIEWICZ, Z. (1993b). Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Research 53, 945-951. GOSÁLVEZ, J.; VÁZQUEZ-HERNÁNDEZ, J.M. ; MAZARIEGOS, V.; GOSÁLBEZ, A. ; ARROYO, F. y LÓPEZ-FERNÁNDEZ (2006). Fragmentación del ADN espermático y pérdida de calidad seminal en el ganado ovino. C. SEOC. Zamora. GOSÁLVEZ ; CABALLERO, LÓPEZ-FERNÁNDEZB, FERNÁNDEZ Y NÚÑEZ. (2008). Fragmentación del ADN espermático .Revisión. GOVIN, J., CARON, C., LESTRAT, C., ROUSSEAUX, S. Y KHOCHBIN, S. (2004). The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. European Journal of Biochemistry 271, 3459-69. GRAHAM E.F., PACE M.M., (1967). Some biochemical changes in spermatozoa due to freezing. Cryobiology 4, 75-84 GRAHAM, E.F., SCHMEHL, M.K.H., NELSON, D.S. (1980). Problems with laboratory assays. 8th NAAB Tech. Conf. Reprod. & AI, Milwakee, USA, 67-70. GRAHAM, E.F., VAZQUEZ, I.A., SCHMEHL, M.K.L. AND EVENSEN, B.K. (1976). VII th Int. Congr. Anim. Reprod. A.I., Kralow, July, 12-16 ILV:896 GRAHAM, J., KUNZE, E. AND HAMMERSTEDT, R. (1990) Analysis of sperm cell viability, acrosomal integrity, and mitochondrial function using flow cytometry. Biol. Reprod., 43:55-64 GRAHAM JK (1996) Cryopreservation of stallion spermatozoa Reproductive Technology 12 131–14 HAFEZ, E.S.E. (1973) Gamete transport. In Human Reproduction, Conception and Contraception, Ch. 5, pp. 85-118. Eds E. S. E. Hafez & T. N. Evans. Harper & Row, New York Bibliografía. 96 HAFEZ, E.S.E. (1985). Reproducción e inseminación artifical de animales. 7th ed. New York. HAFEZ, E.S.E. (1987). Reproducción e Inseminación Artificial en Animales. Interamericana-McGraw-Hill. México. HAMMITT, D.G.; MARTIN, P.A. (1989) Correlations among assays of porcine semen quality following cryopreservation. Theriogenology 32:369-384. HAMMITT, D.G.; MARTIN, P.A.; CALLANAN, T. (1989) Correlations between heterospermic fertility and assays of porcine seminal quality before and after cryopreservation. Theriogenology 32:385-399. HAYASHI, N; KINEMUCHI, H; KAMIJO, (1981). K. Effect of tris (hydroxymethyl) aminomethane on amine oxidase activity in dog brain, liver and serum and in human placenta. Japan, J. Pharmacol, 31Pags 737-746. HIDALGO, M. (2003). Valoración de La calidad del esperma y su correlación con la fertilidad. I Jornadas de Reproducción Equina, Valencia, España. HOFMANN R, LEHMER A, GURSTER E AND HARTURG R (1992) Adenosine triphosphate and adenosine diphosphate in human semen: correlation with sperm count and motility Urology International 48 391—39 HUANG, T. T., KOSOWER, N. S. Y YANAGIMACHI, R. (1984). Localization of thiol and disulfide groups in guinea pig spermatozoa during maturation and capacitation using bimane fluorescent labels. Biology of Reproduction 31, 797-809. HUD, N. V., ALLEN, M. J., DOWNING, K. H., LEE, J. Y BALHORN, R. (1993). Identification of the elemental packing unit of DNA in mammalian sperm cells by atomic force microscopy. Biochemical and Biophysical Research Communications 193, 1347-54. IYER SK, DARON HH, AULL JL. (1988) Purification and properties of alkaline phosphatase from boar seminal plasma. J Reprod Fertil.;82:657–664 JAGOE, J.R., WASHBROOK, N.P., AND HUDSON, E.A. (1986). Morphometry of spermatozoa using semiautomatic image analysis. J. Clin. Pathol, 39: 1347-1352. JASON, L. J., MOORE, S. C., LEWIS, J. D., LINDSEY, G. Y AUSIO, J. (2002). Histone ubiquitination: a tagging tail unfolds? Bioessays 24, 166-74. JENUWEIN, T. Y ALLIS, C. D. (2001). Translating the histone code. Science 293, 1074-80. JEYENDRAN RS, VAN DER VEN HH, PEREZ-PELAEZ M, CRABO BG, ZANEVELD LJD. (1984). Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J Reprod Fertil, 70:219-228 Bibliografía. 97 JEYENDRAN R.S., VAN DER VEN H.H., ROSECRNAS R., PÉREZ-PELAEZ M., AL-HASANI S., ZANEVELD L.J.D. (1989). Chemical constituents of human seminal plasma: Relationship to fertility. Andrologia 21, 423-428 JONES, R. (2004). Sperm survival versus degradation in the Mammalian epididymis: a hypothesis. Biology of Reproduction 71, 1405-11. JONES AR y CONNOR DE (2004) Control of glycolysis in mature boar spermatozoa: effect of pH in vitro.Reproduction, Fertility, and Development JONES, J.; BAVISTER, B., (2000). Acidification of intracellular pH in bovine spermatozoa suppresses motility and extends viable life. J Androl 21, 616–624. JOHNSON DE, CONFINO E, JEYENDRAN RS. (1996). Glass wool column filtration versus mini-Percoll gradient for processing poor quality semen samples. Fertil Steril 66: 459-62 JI BT, SHU XO, LINET MS, ZHENG W, WACHOLDER S, GAO YT, YING DM AND LIN F (1997) Paternal cigarette smoking and the risk of childhood cancer among offspring of nonsmoking mothers Journal of the National Cancer Institute 89 238-24 JUNEJA, R., GUPTA, I., WALI, A. (1990) Verapamil stimulates Ca2+ Uptake and Ca2+ ATPase in plasma membrane vesicles of guinea pig spermatozoa. Contraception, 41, 419–42 KAMP, G.; SCHMIDT, H.; STYPA, H.; FEIDEN, S.; MAHLING, C.; WEGENER, G. (2007) Regulatory properties of 6-phosphofructokinase and control of glycolysis in boar spermatozoa Reproduction 133 29-40 KAWASHIMA, S. Y ANDO, T. (1978). Deoxyribonucleoproteins of herring sperm nuclei. I. Chemical composition. The Journal of Biochemistry 83, 1117-23. KEICHLINE, L. D. Y WASSARMAN, P. M. (1979). Structure of chromatin in sea urchin embryos, sperm, and adult somatic cells. Biochemistry 18, 214-9. KERR, J., WYLLIE, A. Y CURRIE, A. (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implication in tissue kinetics. British Journal of Cancer 26, 239-57. KESKINTEPE L Y BRACKETT BG. (1996). In vitro developmental competence of in vitro matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media. Biol Reprod 55: 333-339. KHADAKE, J. R. Y RAO, M. R. (1995). DNA- and chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry 34, 15792-801. KHARCHENKO, E. P. Y NALIVAEVA, N. N. (1979). Analysis of structural characteristics of sperm chromatin in amphibians. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology 15, 410-16. Bibliografía. 98 KHORASANIZADEH, S. (2004). The nucleosome: from genomic organization to genomic regulation. Cell 116, 259-72. KIERSZENBAUM, A. L. (2001). Transition nuclear proteins during spermiogenesis: unrepaired DNA breaks not allowed. Molecular Reproduction and Development 58, 357-8. KISTLER, W. S., KEIM, P. S. Y HEINRIKSON, R. L. (1976). Partial structural analysis of the basic chromosomal protein of rat spermatozoa. Biochimica et Biophysica Acta 427, 752-7. KODAMA, H., YAMAGUCHI, R., FUKUDA, J., KASAI, H. Y TANAKA, T. (1997). Increased oxidative deoxyribonucleic acid damage in the spermatozoa of infertile male patients. Fertility and Sterility 68, 519-24. KRAUSE W., (1995). The significance of computer-assisted semen analysis (CASA) for diagnosis in andrology and fertility prognosis. Int. J. Androlog., 18, 32-35 KRUGER, T.F., ACOSTA, A.A., SIMMONS, K.F., SWANSON, R.J, MATTA, J.F., OEHNINGER, S.(1988). Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril, 49(1):112-7. KUSUNOKI, H.; KATO, S.; KANDA, S. (1988). Identification of acrosome reacted goat sperm by a trypan blue-giemsa method. Jpn J Zootech Sci, 59, 235-240 KUSONOKI, H., M. SAKAUE, S. KATO, Y S. KANDA. (1989). Induction of the acrosome reactionin ejaculated goat spermatozoa by preincubation in chemically defined medium. J. Exp. Zool. 249:322-328 LEE, H.T.; LIM, J.G.; CHUNG, B.H.; KIM, N.H.; CHUNG, K.S. (1996) Effects of extracellular potassium concentration on acrosome reaction, polyspermy and pronuclear formation during in vitro fertilization in the pig. 13 th Int. Congr. Anim. Reprod. & A.I.. P8-14. LEPE-ZUNIGA, J.L.; ZIGLER ,J.S.; GERY, I. (1987). Toxicity of light-exposed Hepes media. J. Immunol. Methods 103 (1): 145 LEVESQUE, D., VEILLEUX, S., CARON, N. Y BOISSONNEAULT, G. (1998). Architectural DNA-binding properties of the spermatidal transition proteins 1 and 2. Biochemical and Biophysical Research Communications 252, 602-9. LEWIS, L. L. (1911). The v i t a l i t y o f r eproduc t ive cells. Okla. Agr. Exp. St a r . Bul. No. 96, pp. 3-9 LEWIS, J. D., ABBOTT, D. W. Y AUSIO, J. (2003). A haploid affair: core histone transitions during spermatogenesis. Biochemistry and Cell Biology 81, 131-40. LILLEY, D. M. Y PARDON, J. F. (1979). Structure and function of chromatin. Annual Review of Genetics 13, 197-233. Bibliografía. 99 LIU, D.Y.; BAKER, H.W.G. (1988) Relationships between human sperm acrosin, acrosomes, morphology and fertilization in vitro. Human Reprod. 5:298-303. LOIR, M. Y LANNEAU, M. (1975). An electrophoretic analysis of the basic nuclear proteins of ram spermatids. Experimental Cell Research 92, 509-12. LOIR, M. Y LANNEAU, M. (1978). Transformation of ram spermatid chromatin. Experimental Cell Research 115, 231-43. LOPES, S., JURISICOVA, A., SUN, J. G. Y CASPER, R. F. (1998a). Reactive oxygen species: potential cause for DNA fragmentation in human spermatozoa. Human Reproduction 13, 896-900. LOPES, S., SUN, J. G., JURISICOVA, A., MERIANO, J. Y CASPER, R. F. (1998b). Sperm deoxyribonucleic acid fragmentation is increased in poor-quality semen samples and correlates with failed fertilization in intracytoplasmic sperm injection. Fertility and Sterility 69, 528-32. LOPEZ, A.; SODERQUIST, L.; RODRIGUEZ-MARTINEZ, H., (1999): Sperm viability in ram semen diluted and stored in three different extenders. Acta Vet.Scand. 40 1-9. LÓPEZ-SÁEZ, A.; ORTIZ, N.; GALLEGO, L.; GARDE, J.J (2000). Liquid storage (5ºC) of ram semen in different diluents. Arch Androl;44:155-64. MACKEY, Z. B., RAMOS, W., LEVIN, D. S., WALTER, C. A., MCCARREY, J. R. Y TOMKINSON, A. E. (1997). An alternative splicing event which occurs in mouse pachytene spermatocytes generates a form of DNA ligase III with distinct biochemical properties that may function in meiotic recombination. Molecular and Cellular Biology 17, 989-98. MAHADEVAN, M.M.; FLEETHAM, J.; CHURCH, R.B.; TAYLOR, P.J (1986). Growth of mouse embryos in bicarbonate media buffered by carbon dioxide, HEPES, or phosphate. J In Vitro Fert Embryo Transf;3:304–8 MAIONE, B., PITTOGGI, C., ACHENE, L., LORENZINI, R. Y SPADAFORA, C. (1997). Activation of endogenous nucleases in mature sperm cells upon interaction with exogenous DNA. DNA and Cell Biology 16, 1087-97. MALIK, H. S. Y HENIKOFF, S. (2003). Phylogenomics of the nucleosome. Nature Structural Biology 10, 882-91. MANICARDI, G., BIANCHI, P., PANTANO, S., AZZONI, P., BIZZARO, D., BIANCHI, U. Y SAKKAS, D. (1995). Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility. Biology of Reproduction 52, 864-7. MANICARDI, G., TOMBACCO, A., BIZZARO, D., BIANCHI, P., BIANCHI, U. Y SAKKAS, D. (1998). DNA strand breaks in ejaculated human spermatozoa: comparison Bibliografía. 100 of susceptibility to the nick translation and terminal transferase assay. The Histochemical Journal 30, 33-9. MANICARDI GC, BIANCHI PG, PANTANO S, AZZONI P, BIZZARO D, BIANCHI U, SAKKAS D. (1995). Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility. Biol Reprod.; 52: 864 –867 MANN, T.; LUTWAK-MANN, C. (1981) Male reproductive function and semen. Ed: Springer-Verlag. Berlin Heidelberg New York MARCON, L. Y BOISSONNEAULT, G. (2004). Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. Biology of Reproduction 70, 910-8. MARSDEN, M. P. Y LAEMMLI, U. K. (1979). Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model. Cell 17, 849-58. MARTÍ, J.I.; MARTÍ, E.; CEBRIÁN-PÉREZ, E.; MUIÑO-BLANCO, T. (2003). Survival rate and antioxidant enzyme activity of ram spermatozoa after dilution with different extenders or selection by a dextran swim-up procedure. Theriogenology;60:1025–37 MARTÍNEZ, E., RUIZ, S., ROCA, J., Y VÁZQUEZ, J.M. (1989). Fecundación “in vitro” en los animales de granja. Ed: Secretariado de Publicaciones de la Universidad de Murcia, Murcia. MARUSHIGE, Y. Y MARUSHIGE, K. (1978). Phosphorylation of sperm histone during spermiogenesis in mammals. Biochimica et Biophysica Acta 518, 440-9. MAXWELL, W. (1984). Current problems and future potential of artificial insemination programmes. Reproduction in Sheep (Lindsay, D. y Pearce, D.) Academy of Science and Australian Wool Corporation:, Camberra. Australia. MAXWELL, W.M.C.; SALAMON, S. (1993). Liquid storage of ram semen-a review. Reprod. Fertil. Dev.;5:613–38 MAYER, J. F., JR., CHANG, T. S. Y ZIRKIN, B. R. (1981). Spermatogenesis in the mouse 2. Amino acid incorporation into basic nucleoproteins of mouse spermatids and spermatozoa. Biology of Reproduction 25, 1041-51. MCGHEE, J. D. Y FELSENFELD, G. (1980). Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry 49, 1115-56. MCPHERSON, S. Y LONGO, F. (1992). Localization of DNase I-hypersensitive regions during rat spermatogenesis: stage-dependent patterns and unique sensitivity of elongating spermatids. Molecular Reproduction and Development 31, 268-79. Bibliografía. 107 TOBITA, T., SUZUKI, H., SOMA, K. Y NAKANO, M. (1983). Differential cleavages of disulfide crosslinks of protamines in boar sperm nuclei. Biochimica et Biophysica Acta 748, 461-4. TOMLINSON, M., MOFFAT, O., MANICARDI, G., BIZZARO, D., AFNAN, M. Y SAKKAS, D. (2001). Interrelationships between seminal parameters and sperm nuclear DNA damage before and after density gradient centrifugation: implications for assisted conception. Human Reproduction 16, 2160-2165. TRAVIS AJ, MERDIUSHEV T, VARGAS LA. (2001) Expression and localization of caveolin-1, and the presence of membrane rafts, in mouse and guinea pig spermatozoa. Dev Biol; 240: 599 -610 UPADHAYAYA, M.; HIBBARD, B.M.; WALKER, S.M. (1986) Seminal acid phosphatase in relation to fertility. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 65:49-52 UPRETI, G.C.; OLIVER, J.E..; DUGANZICH, D.M.; MUNDAY, R; SMITH, J.F. (1994). Development of a chemically defined ram semen diluent (RSD-1). UPRETI, G.C.; OLIVER, J.E.; DUGANZICH, D.M.; MUNDAY, R.; SMITH, J.F. (1995). Development of a chemically defined ram semen diluent (RSD-1).Anim Reprod Sci, 37, 143-57 UWLAND, J. (1984) Problems of ovine “in vitro” fertilization. In: Reproduction in sheep, Lindsay, DR and Pearce D.T. (Eds) Cambridge University Press. Cambridge. 310-312. VARNER DD, WARD CR, STOREY BT, KENNEY RM. (1987). Induction and characterization of acrosome reaction of equine spermatozoa. Am J Vet Res. ;48(9):1383–1389 VAUGHN, J. P., DIJKWEL, P. A., MULLENDERS, L. H. Y HAMLIN, J. L. (1990). Replication forks are associated with the nuclear matrix. Nucleic Acids Research 18, 1965-9. VÁZQUEZ JM, MARTÍNEZ E, ROCA J, COY P, RUIZ S. (1992). Use of triple stain technique for simultaneous assessment of vitality and acrosomal status in boar spermatozoa. Theriogenology 38:843-852. . VAZQUEZ, J.M.; MARTINEZ, E.; MARTINEZ, P.; ROCA, J. (1997a) Hypoosmotic swelling of boar spermatozoa and its relation to other methods for analysing the sperm membrane. Theriogenology 47:913-922. VÁZQUEZ, J.M., MAZARIEGOS, V., SALVADOR, S., GARRIDO, C., DE LA FUENTE, L.F.(2010). El diluyente INRA96 en la inseminación artificial caprina. Ovigen. Centro de selección y mejora genética de ovino y caprino de Castilla y León. XXXV Congreso de la SEOC.Valladolid. Bibliografía. 108 VERSTENGEN, J.; IGUER-OUADA, M.; ONCLIN, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, v. 57, p. 149 – 179, 2002 VOGELSTEIN, B., PARDOLL, D. M. Y COFFEY, D. S. (1980). Supercoiled loops and eucaryotic DNA replicaton. Cell 22, 79-85. VOSS, J.L., PICKET, B.W. AND SQUIRES, E.L. (1981). Stallion spermatozoal morphology and motility and their relationship to fertility. J. Am. Vet. Med. Assoc, 178, 287-289. WABERSKI D., WEITZE K.F., RATH D., SALLMANN H.P., (1989). Effect of bovine semun albumin and zwitterionic buffers on stored liquid boar semen. Zuchthygiene 24: 128-133 WABERSKI D., MEDING S., DIRKSEN G., (1994). Fertility of long-term stored boar semen: Influence of extenders (Androhep and Kiev), storage time and plasma droplets in the semen. Anim. Reprod. Sci. 36, 145-151. WARD, W. S. (1993). Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa. Biology of Reproduction 48, 1193-201. WARD, W. S. Y COFFEY, D. S. (1991). DNA packaging and organization in mammalian spermatozoa: comparison with somatic cells. Biology of Reproduction 44, 569-74. WARD, W. S., PARTIN, A. W. Y COFFEY, D. S. (1989). DNA loop domains in mammalian spermatozoa. Chromosoma 98, 153-9. WEBER RF, DOHLE GR, ROMIJN JC. (2005). Clinical laboratory evaluation of male subfertility. Adv Clin Chem.;40:317-364 WENG, S., TAYLOR, S., MORSHEDI, M., SCHUFFNER, A., DURAN, E., BEEBE, S. Y OEHNINGER, S. (2002). Caspase activity and apoptotic markers in ejaculated human sperm. Molecular Human Reproduction 8, 984-91. WHITE IG. (1993)Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod Fertil Dev.;5:639–658 WOUTERS-TYROU, D., MARTINAGE, A., CHEVAILLIER, P. Y SAUTIERE, P. (1998). Nuclear basic proteins in spermiogenesis. Biochimie 80, 117-28. WU, X. Q. Y HECHT, N. B. (2000). Mouse testis brain ribonucleic acid-binding protein/translin colocalizes with microtubules and is immunoprecipitated with messenger ribonucleic acids encoding myelin basic protein, alpha calmodulin kinase II, and protamines 1 and 2. Biology of Reproduction 62, 720-5. YANAGIDA, K., YANAGIMACHI, R., PERREAULT, S. D. Y KLEINFELD, R. G. (1991). Thermostability of sperm nuclei assessed by microinjection into hamster oocytes. Biology of Reproduction 44, 440- 7. Bibliografía. 109 YANAGIMACHI, R. (1988). Mammalian fertilization. In: The physiology of reproduction. Ed. E Knobil and JD Neill. Raven Press, New York, (1988) 135-185. YÁNIZ, J.L.; SANTOLARIA, P.; MARCO-AGUADO, M.A.; LÓPEZ-GATIUS, F. (2008). Use of image analysis to assess the plasma membrane integrity of ram spermatozoa in different diluents. YANIZ JL, MATEOS JA, SANTOLARIA P (2011). Zwitterionic buffers preserve ram semen quality more efficiently than TRIS during storage at 15 degrees C. Small Ruminant Research;95: 54-60. YANIZ, J. L., M. J.A., AND P. SANTOLARIA. (2012). TRIS buffer improves fluorescence yield of ram spermatozoa when evaluating membrane integrity. Microscopy Research and Technique In press. YOSSEFI, S., OSCHRY, Y. Y LEWIN, L. M. (1994). Chromatin condensation in hamster sperm: a flow cytometric investigation. Molecular Reproduction and Development 37, 93-8. ZANEVELD, L.J.D. (1976) Sperm enzyme inhibitors as antifertility agents. En: Human semen and fertility regulation in men. Ed: Hafez, E.S.E.. C.V. Mosby Co, St Louis, 570-582 ZHANG, Y., GRIFFIN, K., MONDAL, N. Y PARVIN, J. D. (2004). Phosphorylation of histone H2A inhibits transcription on chromatin templates. Journal of Biological Chemistry 279, 21866-72. ZIGLER, J.S.; LEPE-ZUNIGA, J.L.; VISTICA, B.; GERY, I. (1985). Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol;21:282–7 ZINI A, BIELECKI R, PHANG D, ZENZES MT (2001). Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril.; 75: 674 –677.