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PROYECTOTRABAJO FIN DE CARRERA DESARROLLO DE UN MÉTODO DE REFERENCIA BASADO EN EL MÉTODO ISAS Y ANÁLISIS DE IMÁGENES PARA LA EVALUACIÓN MORFOMÉTRICA DEL ACROSOMA DEL ESPERMATOZOIDE EN LA ESPECIE OVINA. AUTOR: VIRGINIA CASTILLO LALAGUNA ENSEÑANZA: INGENIERÍA TÉCNICA AGRÍCOLA DIRECTOR/ES: JÉSUS YÁNIZ PÉREZ DE ALBÉNIZ FECHA: MAYO 2012 ÍNDICE GENERAL Página 1.-Resumen .……………………………………………………………………….......1 2.-Abstract .……………………………………………………………………………2 3.-Introducción ……………………………………………………………………… 3 4.-Objetivos …………………………………………………………………………. 5 5.-Revisión Bibliográfica ……………………………………………………………..6 5.1.- El espermatozoide …………………………………………………........ 6 5.1.1.-Estructura de los espermatozoides ……………………………...6 5.1.1.1.- Cabeza ………………………………………………. 7 5.1.1.2.-Acrosoma …....…………………………………........ 8 5.1.1.3.-Núcleo ……………………………………………… 10 5.1.1.4.-Flagelo ………………………………………........... 12 5.1.1.5.-Anomalías ………………………………………….. 15 5.1.1.6.-Morfología normal …………………………………. 18 5.1.1.7.-Motilidad de los espermatozoides …………….......... 19 5.1.1.8.-Metabolismo de los espermatozoides ………………. 20 5.2.-Producción y maduración espermática ……….……………………........ 21 5.2.1.-Espermtogénesis …………………………………………….... 21 5.2.2.-Maduración del espermatozoide en el epidídimo ...…………... 23 5.2.3.-Capacitación espermática: reacción acrosómica ..…………... 25 5.3.-Fisiología del espermatozoide ……..………………………………..... 26 5.4.-Composición del semen ……………………………………………….. 27 5.4.1.-El semen .……………………………………………………. 27 5.4.2.-Plasma seminal…………………………………………………27 5.5.-Tecnología de la manipulación…………………………………………... 28 5.5.1.-Obtención del semen………………………………………...... 28 5.5.1.1.-Recogida de semen por vagina artificial ……………. 29 5.5.1.2.-Recogida de semen por estimulo eléctrico ………...... 31 5.5.2.-Factores que afectan a la supervivencia de los espermatozoides.31 5.5.3.-Dilución seminal .…………………………………………….. 34 5.6.-Manejo y evaluación de la calidad seminal ……………………………... 35 5.6.1.-Análisis macroscópico ………………………………………… 36 5.6.1.1.-Color y olor del semen ………………………………. 36 5.6.1.2.-Volumen y concentración …………………………… 36 5.6.2.-Análisis microscópico …………………………………………. 38 5.6.2.1.-Movilidad espermática ……………………………… 38 5.6.2.2.-Movilidad masal …………………………………….. 39 5.6.2.3.-Movilidad individual ………….…………………….. 39 5.6.2.4.-Morfología espermática …….……………………….. 41 5.6.2.5.-Alteraciones morfológicas ….……………………….. 42 5.6.2.6.-Morfometría del espermatozoide …….……………… 44 5.6.2.6.1.-Evaluación morfométrica del acrosoma…… 47 6.-Material y Métodos ……………………………………………………………… 50 6.1.-Reactivos ……………………………………………………………….. 50 6.2.-Recogida, dilución y manipulación del semen …………………………. 50 6.3.-Preparación de las muestras para la evaluación morfométrica …………. 52 6.4.-CASMA ………………………………………………………………... 54 6.5.-Análisis estadístico ……………………………………………………... 55 7.-Resultados …….……….………………………………………………………... 56 8.-Discusión …….………………………………………………………………….. 62 9.-Conclusiones ......………………………………………………………………... 64 10.-Bibliografía ……..………………………………………………………………. 65 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Esquema de las regiones (a) y ultraestructura (b) del espermatozoide de mamífero (Modificado de Fawcett, DW. Tratado de Histología. Interamericana McGraw-Hill, 1989)…………………………………………………………………………………………….. 7 Figura 2. Esquema de la ultraestructura de la cabeza de un espermatozoide de mamífero (Figura 2a: modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger, 1993) y micrografía electrónica de la región del acrosoma (Figura 2b: modificado de Fawcett, DW. Tratado de Histología. Interamericana McGraw-Hill, 1989) …………………………………………………………………………………………………. 10 Figura 3. Estructuras del cuello del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger,1993) ………………...... 13 Figura 4. Estructura del flagelo del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger, 1993) ……………………… 15 Figura 5. Espermatozoides normales y algunas formas anormales de espermatozoides …....... 16 Figura 6: Reacción del acrosoma en el espermatozoide humano. I- Espermatozoide con el acrosoma intacto (no reaccionado). II- Reacción del segmento principal (SP) del acrosoma: fusión de la membrana acrosomal externa (MAE) y la membrana plasmática (MP) en el segmento principal del acrosoma. III- Reacción acrosómica en el segmento ecuatorial (SE). IV- Espermatozoide con reacción acrosómica del segmento principal y ecuatorial. La membrana acrosómica interna se continúa con la membrana plasmática del segmento postecuatorial. (Hafez, 1985) ………………………………………………………………………………….. 26 Figura 7. Vagina artificial ……………………………………………………………………... 30 Figura 8. Operario agachado y tubo recolector erecto ………………………………………... 31 Figura 9. Espermatozoides normales y algunas formas anormales. A-Sin acrosoma (forma común). B- Sin apenas acrosoma. C- Con cabeza piriforme cabeza. D- Con cabeza piriforme moderada. E- Con cabeza piriforme leve. F-Con vacuolas. G-Defectos en la membrana. H- Sin flagelo. I- Reflejo distal. J-Parte media rota. K- Parte media severamente doblada. L- Gota proximal. M- Gota distal. N- Teratoride grave. O-Teratoideo moderado. P-Espermatozoide normal (Barth y col., 1989) …………………………………………………………………….43 Figura 10. Parámetros morfométricos medidos en este estudio. Como parámetros primarios se considerarón: área, perimetro, longitud y anchura, como sencudarios: elipticidad, rugosidad, elongación y regularidad ………………………………………………………………… 45 y 54 Figura 11. Estufa calefactora …………………………………………………………………. 51 Figura 12. Dosis de esperma ya diluido (4ml: 1ml semen - 3 ml diluyente) ………………… 51 Figura 13. Protocolo seguido para la preparación de las muestras ……………………………. 53 Figura 14. Sistema CASA para el análisis espermático compuesto por un microscopio óptico conectado a una platina atemperada, a una cámara de video y a un software de análisis de imágenes por ordenador ………………………………………………………………………. 55 Figura 15. Espermatozoides analizados con el objetivo de 40 aumentos con filtro y lavados, teñidos y fijados con distintos tratamientos. a) tinción de SpermBlue b) tinción de Hemacolor c) lavado con agua destilada d) fijación con glutaraldehído 2% e)fijación con metanol 50% …………………………………………………………………………………………………. 57 Figuras 16. Espermatozoides analizados con el objetivo de 40 aumentos sin filtro y lavados, teñidos y fijados con distintos tratamientos. f) tinción de SpermBlue g) tinción de Hemacolor h) lavado con agua destilada i) fijación con Metanol 50% j) fijación con Glutaraldehído 2% …………………………………………………………………………………………………. 58 Figura 17. Resultados obtenidos para los parámetros primarios a) anchura, b) longitud, c) perímetro y d) área cabeza. Azul: con filtro; Rojo: sin filtro. Letras mayúsculas A- E: diferencias significativas entre métodos. Letras minúsculas a-b: diferencias significativas entre con o sin filtro ……………………………………………….. 60 Figura 18. Resultados obtenidos para el acrosoma. e) porcentaje de acrosoma y f) área de acrosoma. Azul: con filtro; Rojo: sin filtro Letras mayúsculas A- E: diferencias significativas entre métodos. Letras minúsculas a-b: diferencias significativas entre con o sin filtro ……………………………………………….. 61 ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Escala del semen y determinación de la concentración según la apreciación visual ... 37 Tabla 2. Resultados morfométricos de distintos estudios (Gravance y col, 1998, Maroto-Morales y col, 2010, Soler y col, 2005, Buendia y col, 2002, Boersma y col, 2001,Gravance y col, 1999, Gravance y col, 2009, Gravance y col, 1996, Beletti y col, 2005, Gravance y col, 1997, Hidalgo y col, 2006, Marco-Jiménez y col, 2006, Gravence y col, 1995) ……………………………... 46 Tabla 3. Resultados morfométricos de la especie humana (L. Maree y col., 2010, G. van der Horst y col., 2009) …………………………………………………………………………..… 48 Tabla 4. Porcentaje de muerte del espermatozoide antes y después de la reacción acrosómica según el tamaño del acrosoma. Especie humana. (R. Menkveld y col., 2003) ……………….. 48 Tabla 5. Resultados morfométricos de la especie canina (Núñez-Martinez y col., 2006) ……. 49 Tabla 6. Proporción de espermatozoides correctamente analizados por cada método con y sin filtro y en total ………………………………………………………………………………… 59 AGRADECIMIENTOS Al CITA (DGA), ATPSYRA (DGA), y UPRA-Grupo Pastores por su ayuda en la obtención de las dosis seminales utilizadas en este trabajo. Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos IPT- 010000-2010-33 y AGL2011-30353-C02-01). A mi tutor de proyecto, Jesús Yaniz, por ayudarme a hacer este proyecto Fin de Carrera, sin su colaboración y su tiempo no lo hubiera podido terminar. A la Escuela Politécnica Superior de Huesca por dejarme investigar en el laboratorio de Producción Animal y a todos los técnico de laboratorio por sus ayudas. A mi hermana Aroa, por apoyarme en todo y estar siempre ahí. A todos mis amigos, por estar ahí y apoyarme en todo también. 1 1. RESUMEN El objetivo general del proyecto fue desarrollar un nuevo método asistido por ordenador para la evaluación morfométrica del acrosoma espermático en morueco. Los eyaculados se obtuvieron mediante vagina artificial de 10 machos adultos de la raza Rasa Aragonesa. Tras la recogida, se descartaron aquellas muestras con una movilidad menor del 70%. De cada muestra se tomaron cinco alícuotas para realizar los diferentes tratamientos: 1) lavado con agua destilada; 2) fijación y tinción con el kit de Hemacolor 3) fijación y tinción con el kit de Spermblue; 4) fijación con 50% de metanol; y 5) fijación con 2% de glutaraldehído. Cada muestra se analizó por duplicado con el objetivo de 40 aumentos con y sin filtro de contraste de fases. Para cada variante se analizaron 200 espermatozoides. Para la evaluación de los parámetros morfomértricos se utilizó el programa ISAS ® , que permite un análisis computerizado individual para cada espermatozoide. La utilización del filtro de contraste de fases, lejos de mejorar la calidad de las imágenes, provocó la aparición de artefactos, con la presencia de halos alrededor de los espermatozoides. Como consecuencia, la captura de las imágenes no fue tan precisa y el filtro modificó los parámetros morfométricos obtenidos, reduciendo las dimensiones de cabeza y acrosoma. Independientemente de la utilización del filtro, los grupos con peores resultados fueron los fijados con glutaraldehido y metanol, por debajo del 90% de espermatozoides correctamente analizados. En el grupo lavado con agua, la captura se situó en torno al 90%, mientras que la tinción de las muestras con Hemacolor o SpermBlue permitió mejorar la proporción de espermatozoides correctamente analizados. En las muestras fijadas con glutaraldehido o metanol se observó claramente la presencia de artefactos, que pudieron contribuir a una menor precisión en la captura. El tratamiento de las muestras tuvo un efecto significativo sobre todas las medidas morfométricas. Para la mayoría de los parámetros morfométricos primarios (área, perímetro, longitud y anchura de la cabeza) la relación entre tratamientos podría definirse de la siguiente manera: GLUT>HM>MET>SB>Lavado. Las únicas excepciones fueron la anchura de la cabeza (para la que el SB fue mayor que el MET) y la longitud, que fue similar entre el SB y el lavado. El tratamiento también tuvo un efecto claro sobre las dimensiones del acrosoma y la proporción de la cabeza ocupada por el mismo. Para el área del acrosoma la relación entre los distintos tratamientos fue muy parecida a la descrita para los parámetros primarios de la cabeza espermática, excepto que la relación entre el Hemacolor y el metanol se invirtió. Cuando estudiamos la proporción de la cabeza del espermatozoide cubierta por el acrosoma, la relación entre tratamientos fue la siguiente: SB>GLUT>MET>Lavado>HM. En conclusión, se ha desarrollado y estandarizado un nuevo método asistido por ordenador que permite por primera vez el estudio simultáneo de la cabeza y el acrosoma espermáticos en morueco. 2 2. ABSTRACT The overall project objective was to develop a new method for computer-aided morphometric evaluation of sperm acrosome in ram. The ejaculates were obtained by artificial vagina from 10 male adult Rasa Aragonesa. After collection, samples were discarded those with a mobility less than 70%. From each sample aliquots were taken for five different treatments: 1) washing with distilled water, 2) fixation and staining kit Hemacolor 3) fixation and staining kit Spermblue, 4) fixation with 50% methanol; and 5) fixed with 2% glutaraldehyde. Each sample was analyzed in duplicate with the aim of 40 times with and without phase contrast filter. For each variant was analyzed 200 sperm. For the evaluation of the parameters used morfomértricos ISAS ® program, which allows a single computer analysis for each sperm. The use of phase contrast filter, instead of improving the image quality, caused the appearance of artifacts in the presence of halos around the sperm. As a result, the capture of images was not as precise and filter modified the morphometric parameters obtained by reducing the size of the head and acrosome. Regardless of the use of the filter, the groups worst results were fixed with glutaraldehyde and methanol below 90% spermatozoa correctly analyzed. In the washing with water, the catch was about 90%, while the staining of samples with or SpermBlue Hemacolor improved the proportion of correctly analyzed sperm. In the samples fixed with glutaraldehyde or methanol clearly showed the presence of artifacts, which could contribute to reduced accuracy in the capture. The treatment of the samples had a significant effect on all morphometric measurements. For most primary morphometric parameters (area, perimeter, length and width of the head) the relationship between treatments could be defined as follows: GLUT> HM> MET> SB> Washing. The only exceptions were the width of the head (for which the SB was larger than the TEM) and the length, which was similar between the SB and washing. Treatment also had a clear effect on the dimensions of the acrosome and proportion of the head occupied by it. For the area of the acrosome the relationship between the various treatments was very similar to that described for the primary parameters of the sperm head, except that the ratio between the Hemacolor and methanol was reversed. When we study the proportion of the sperm head covered by the acrosome, the relationship between treatments was as follows: SB> GLUT> MET> Laundry> HM. In conclusion, we have developed and standardized a new computerassisted method for the first time allows the simultaneous study of the sperm head and acrosome in ram. 3 3. INTRODUCCIÓN Las tecnologías reproductivas son herramientas fundamentales en la mejora de la eficiencia reproductiva de las ganaderías, ya que permiten mejorar su rentabilidad. La inseminación artificial (IA) es una de las principales tecnologías reproductivas utilizadas en las explotaciones ganaderas. En relación con la IA, el estudio de la calidad seminal, o espermiograma, se considera una herramienta fundamental para la selección de machos y eyaculados para la reproducción. En este proyecto desarrollaremos nuevos métodos para el estudio morfométrico del espermatozoide que pueden ayudar a mejorar la capacidad de predicción del espermiograma. Tradicionalmente la valoración de la calidad del esperma incluye la evaluación de una serie de parámetros macro y microscópicos entre los que se incluyen el volumen eyaculado, la movilidad y morfología espermática. Sin embargo, el valor predictivo de estos parámetros clásicos sobre la fertilidad es más bien escaso, por lo que continuamente se están desarrollando nuevos métodos de análisis de la calidad espermática. La morfología de los espermatozoides ha sido identificada como una característica que puede ser útil en la predicción de la capacidad fecundante. No obstante, la dificultad de conseguir una reproducibilidad satisfactoria tanto intracomo entre técnicos ha hecho difícil su estandarización. Las anormalidades en la cabeza del espermatozoide se han asociado con la pérdida embrionaria temprana (DeJarnette y col., 1992), disminución de la fertilidad y de la calidad del embrión, y menor capacidad para unirse al oocito (Kolt y Handel 1987). La relación entre el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales y la fertilidad ha sido ampliamente descrito en caballos (Jasko y col. 1990), toros (Saake 1970), machos cabríos y moruecos (Chandler y col., 1988) y ciervos (Malo y col., 2005). La mayoría de los estudios sobre morfometría espermática se han centrado en la cabeza del espermatozoide en conjunto. Solo unos pocos estudios han medido también otras partes del espermatozoide, como el acrosoma en hombre (Soler y col., 2003; Falzone y col., 2010) y perro (Nuñez y col., 2005) y la pieza intermedia (Soler y col., 2003). Estas medidas requieren una distinción clara de los límites y un buen contraste entre los de las diferentes partes del espermatozoide, que es difícil de alcanzar en algunas especies. En otras en cambio se han propuesto diversos métodos de tinción para el estudio de la morfología del acrosoma. Sin embargo, estudios previos en nuestro laboratorio indican que estos colorantes no proporcionan un contraste de grises adecuado para el estudio de la morfometría del acrosoma con los sistemas CASMA en estas especies. En este estudio nos centramos en el análisis de la cabeza espermática y del acrosoma, que es un pequeño compartimento situado en el extremo apical de la cabeza del espermatozoide que contiene enzimas hidrolíticas y desempeña una función muy importante en el momento de la fecundación ya que gracias a la reacción acrosómica el espermatozoide puede penetrar en el oocito. El acrosoma es esencial para la función 10 Figura 2. Esquema de la ultraestructura de la cabeza de un espermatozoide de mamífero (Figura 2a: modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger, 1993) y micrografía electrónica de la región del acrosoma (Figura 2b: modificado de Fawcett, DW. Tratado de Histología. Interamericana McGraw-Hill, 1989). 5.1.1.3. Núcleo El núcleo (Figura 2) contiene un número haploide de cromosomas y nucleoproteínas, fundamentalmente protaminas espermáticas, y está envuelto por la membrana nuclear. La cromatina espermática se encuentra altamente compactada, ocupando menos espacio que en las células somáticas, de forma que el empaquetamiento del ADN con las proteínas nucleares es tan estrecho que la transcripción resulta casi imposible. Durante la espermiogénesis, se produce una condensación progresiva de la cromatina que está asociada a modificaciones químicas en el ADN y proteínas nucleares, con una sustitución de las histonas por protaminas, proteínas pequeñas ricas en cisteína. Durante el tránsito epididimario se estabiliza este mecanismo de condensación con el incremento de puentes disulfuro a partir de los grupos tiol de los residuos de cisteína. La condensación de la cromatina disminuye el volumen del núcleo facilitando así la movilidad del espermatozoide y es fundamental para proteger el material genético del gameto masculino durante su exposición a ambientes agresivos como pueda ser la elevada acidez del tracto reproductor femenino. 11 Cuando se ha producido la penetración del ovocito, el espermatozoide debe descondensar su cromatina para formar el pronucleo masculino, reduciendo, como requisito, las uniones disulfuro del núcleo espermático. La capacidad fecundante del espermatozoide dependerá, entre otros factores, de la adecuada sucesión de estos tres eventos: condensación de la cromatina durante la espermatogénesis, estabilización durante la maduración espermática y descondensación dentro del ovocito para su fecundación. Cualquier daño del núcleo, dada su inercia metabólica seria imposible de reparar, lo que llevaría a una caída de la fertilidad (Sakkas y col., 1995). Royere y col. (1988), sugirieron que los procesos de congelación-descongelación del esperma podrían provocar una alteración en la cromatina espermática, que se vería sometida a un estado de “sobrecondensación”, lo cual podría retrasar la descondesación del gameto masculino durante la fertilización y explicar así algunos casos de mortalidad embrionaria temprana cuando se emplea esperma congeladodescongelado. (Pasteur y col., 1991), en estudios realizados antes y después de la fertilización, demostraron la importancia de la condensación y descondensación de la cromatina, de manera que la estabilidad de esta puede revelar la fertilidad del macho en base a la correlación existente entre la alteración en la condensación de la cromatina y el grado de fertilidad. De acuerdo con esto, estos autores sugirieron que el esperma congelado-descongelado y supuestamente “desestabilizado” puede dificultar la transcripción del genoma y ocasionar la muerte prematura del zigoto, lo que podría explicar las bajas tasas de concepción obtenidas en la espermatización manual con dosis de esperma congelado frente a eyaculados diluyoconservados en “fresco”; o a las obtenidas en la fecundación “in vitro” con espermatozoides crioconservados. Gravance y col. (1998), observaron un efecto de la congelación-descongelación sobre las dimensiones de la cabeza de los espermatozoides de morueco, y plantearon la posibilidad de que las diferencias morfométricas observadas pudieran estar relacionadas con una sobrecondensación de la cromatina espermática, sugiriendo, de ser así, la posibilidad de emplear el análisis morfométrico para la detección de anomalías nucleares ocasionadas por dichos procesos. En posición caudal con respecto al acrosoma, hay una capa densa especializada entre la membrana plasmática y la envoltura nuclear, que muestra un patrón característico de su estructura fina diferente entre especies, y que se denomina lámina postacrosómica. Aunque se desconoce su composición química y funcionalidad, se piensa que es una estructura importante ya que, justamente es la se fusiona primero con la membrana del oocito en el momento de la fecundación (Fawcett, 1989). En el borde caudal de la lámina postacrosómica, la membrana plasmática esta firmemente unida a la envoltura nuclear a lo largo de una línea llamada anillo posterior que rodea caudalmente la cabeza del espermatozoide. La envoltura nuclear carece de poros, a 12 excepción de un pliegue que se extiende en la zona posterior del núcleo, próximo al anillo posterior, donde estos son abundantes. Se interpreta este receso como una porción sobrante de la envoltura nuclear que resulta de la disminución del volumen del núcleo durante la condensación de la cromatina en la espermiogénesis. La envoltura nuclear que se extiende por detrás del núcleo de nuevo esta desprovista de poros y con sus membranas estrechamente aplicadas una a otra. En esta zona, reviste la fosa de implantación, lugar donde el flagelo se une a la cabeza. 5.1.1.4. Flagelo El flagelo o cola comprende cuatro regiones principales: el cuello, la pieza intermedia y los segmentos principal y terminal. El cuello es la región del espermatozoide que une la cabeza con el flagelo (Figuras 2 y 3). Es una zona frágil y estructuralmente compleja en la que se diferencia la pieza de conexión y algunas mitocondrias. Inmediatamente detrás de la cabeza se encuentra la pieza de conexión que estructuralmente se compone de capítulo, columnas segmentadas, placa basal y centriolo proximal. El capítulo constituye el borde craneal del flagelo y su forma se adapta a la de la fosa de implantación, ubicada en la base de la cabeza, donde queda adherido a la placa basal. Las columnas estriadas sirven de origen para la formación de las llamadas fibras densas, que en número de nueve, se extienden hasta el final de la pieza principal. El centriolo proximal, orientado transversalmente, se sitúa inmediatamente debajo de la superficie articular del capítulo, entre las columnas segmentadas mayores. Esta estructura es el origen del axonema que se prolonga distalmente en el flagelo. En la región del cuello, fuera de la pieza de conexión, pueden encontrarse una o dos mitocondrias orientadas longitudinalmente. 13 Figura 3. Estructuras del cuello del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger,1993) En la pieza intermedia (Figura 4), continuación del cuello, se dispone como eje del flagelo el axonema, formado por dos microtúbulos centrales rodeados de 9 dobletes de microtúbulos regularmente distribuidos. Esta estructura microtubular, designada ordinariamente con la fórmula 9+2 se prolonga distalmente a lo largo de toda la cola hasta cerca de la punta de la pieza terminal. El axonema queda rodeado de las nueve fibras densas procedentes de cada una de las columnas segmentadas de la pieza de conexión, de forma que cada una de ellas lleva un trayecto longitudinal en relación estrecha con uno de los nueve dobletes del axonema. Se considera que el componente motor del flagelo es el axonema y las fibras densas, debido a su composición de proteínas ricas en cisteína, que presentan grupos sulfhidrilo (-SH) lo que da lugar a la formación de puentes disulfuro (-S-S-) durante la maduración espermática y que podrían conferir propiedades elásticas y facilitar así la propagación del movimiento ondulatorio a través del flagelo (Soler y col., 1994). La pieza intermedia se caracteriza por presentar bajo la membrana plasmática, una vaina de mitocondrias orientadas circularmente y dispuestas helicoidalmente. Esta organización estructural es común en todos los espermatozoides de mamíferos, sin embargo el número de giros que presenta la espiral varía, según las especies, desde unas quince vueltas en los primates hasta unas trescientas en algunos roedores. Las mitocondrias son las encargadas de producir la energía necesaria que requiere el movimiento espermático. Inmediatamente distal a la última vuelta de la vaina mitocondrial se dispone el anillo, que se fija a la membrana para impedir el retroceso de las mitocondrias hacia las zonas distales de la cola. 14 La pieza principal del espermatozoide se va adelgazando progresivamente hasta la pieza terminal (Figura 4). Se compone de una vaina fibrosa que rodea, en el eje central, al axonema y sus fibras densas. Esta vaina presenta dos engrosamientos longitudinales prominentes o columnas que discurren a lo largo de lo que se piensa que es la superficie dorsal y ventral de la pieza principal. Las fibras densas 3 y 8 que rodean al axonema terminan a continuación del anillo de la pieza intermedia, de manera que este queda rodeado por 7 fibras, y los dos huecos dejados por estas son ocupados por las columnas de la vaina. Las columnas longitudinales están conectadas a cada lado por unas estructuras circunferenciales denominadas costillas de la vaina fibrosa. El plano que pasa por ambas columnas longitudinales coincide con el que pasa por el centro de los dos microtúbulos centrales, quedando dividido asimétricamente el flagelo en dos compartimentos, uno que tiene cuatro fibras densas y otro con tres. Esta asimetría de la vaina fibrosa parece estar implicada en la modulación del plano de batida del flagelo espermático (Fawcett, 1989). La pieza terminal es la porción de la cola posterior a la terminación de la vaina fibrosa. Esta contiene únicamente el axonema central cubierto por la membrana plasmática. Externamente a la cabeza y flagelo se dispone la membrana plasmática (Figuras 2 a 4 y 6), que responde al modelo de mosaico fluido (Singer y Nicholson, 1972), compuesta por proteínas integradas en una bicapa de fosfolipídos. En su composición química, además presenta moléculas de colesterol, que juegan un papel determinante como sustancias moduladoras de la fluidez de membrana. Los ácidos grasos y los glicolípidos son poco abundantes. En las membranas espermáticas de mamíferos, la cantidad de proteínas es casi la misma que la de lípidos totales. Una característica únicade la membrana plasmática espermática del espermatozoide es la presencia de dominios, regiones perfectamente definidas en las que varía su composición y función. En los mamíferos los principales dominios se encuentran en la cabeza, en la región acrosomal y en la región postacrosomal (parte posterior de la cabeza y pieza conectiva). La región acrosomal (parte anterior de la cabeza), a su vez se subdivide en tres dominios para los segmentos apical, principal y ecuatorial. Los segmentos apical y principal juntos suelen referirse como “capuchón acrosomal”. 15 Figura 4. Estructura del flagelo del espermatozoide de mamífero (modificado de McKinnon, AO y Voss, JL. Equine Reproduction. Malvern, PA: Lea & Febiger, 1993). 5.1.1.5. Anomalías Se han descrito por diversos investigadores una amplia variedad de anormalidades morfológicas del espermatozoide. En general, cualquier desviación morfológica de la estructura normal del espermatozoide se ha considerando como anormal o anomalía espermática. Dichas aberraciones se llevaron por Williams y Savage (1925, 1927) y por Lagerlöf (1934) como una ayuda valiosa para confirmar el potencial de fertilidad de los moruecos. El interés hacia ellas se extendió pronto a las investigaciones con otras especies, en verracos, toros, caballos sementales y hombres. 16 Figura 5. Espermatozoides normales y algunas formas anormales de espermatozoides. No hay una evidencia experimental clara de relación entre los caracteres morfológicos específicos y la fertilidad. Se debe probablemente, de manera parcial, al grado en que se presentan las células anormales junto con células espermáticas morfológicamente normales y móviles en cantidades adecuadas para una fertilidad “normal”. Sin embargo, se ha asociado una frecuencia elevada de espermatozoides anormales con una fertilidad reducida. Los exámenes morfológicos periódicos del esperma de moruecos aislados son útiles para apreciar las desviaciones de la normalidad que pueden producirse por muy diversas razones. Se ha señalado que la frecuencia de espermatozoides anormales aumenta con las temperaturas extremas tales como la exposición experimental al calor, el aislamiento experimental del escroto y las estaciones calurosas o por la aplicación experimental de frío directamente a los testículos, congelación del escroto y la exposición a los efectos combinados del frío y del viento. Algunas enfermedades, que incluyen la infección de los órganos reproductores, la hipoplasia testicular congénita, la degeneración testicular adquirida y la disfunción del epidídimo, se hallan también relacionadas con una alta frecuencia de células anormales. 17 Se han observado pequeños incrementos en la frecuencia de células espermáticas anormales a medida que los moruecos envejecen. Mediante congelación, se han inducido en los espermatozoides del morueco y de otras especies defectos ultraestructurales y en la cápsula acrosómica. Una serie de investigadores, entre los que se hallan Williams y Savage (1925), Lagerlöf (1934), Blom (1950) y Mercier y Salisbury (1947), señalaron la importancia de las anormalidades primarias de las células espermáticas que parecen consecuencia de una alteración de la espermatogénesis. Las formas de células espermáticas alteradas, que se originan probablemente después de que los espermatozoides abandonen los testículos, se han clasificado como anormalidades secundarias. Más recientemente, Blom (1972) ha sugerido una nueva clasificación en defectos mayores y menores de los espermatozoides: Principales defectos de los espermatozoides Subdesarrollados Formas dobles Defecto espermatozoides nudosos Defecto espermatozoides decapitados (Guernsey) Defecto diadema (“formación bolsa”) Cabeza piriforme Estrechamiento en base Contorno anormal Cabezas anormales pequeñas Cabezas anormales libres Defecto de sacacorchos Otros defectos pieza intermedia Gotitas proximales Defecto de pseudos gotita Colas fuertemente dobladas o arrolladas. 18 Defectos secundarios de los espermatozoides Cabezas estrechas Cabezas pequeñas, normales Cabezas gigantes y cortas y anchas Cabezas libres (normales) Caperuza acrosómicas desprendidas (tinta china) Implantación abaxial Gotitas distales Cola sencillamente doblada o arrollada Cola arrollada terminalmente Otros. Formaciones en medusa; células espermiogénicas, gigantes, prepuciales, leucocitos, eritrocitos. Los defectos mayores se ha demostrado están relacionados con alteraciones de la fertilidad o con un estado anormal del testículo-epidídimo. Ambas se combinan con una alteración total. Los defectos menores parecen ser menos importantes y no suelen coincidir. Serían interesantes únicamente cuando un defecto menor sobrepasa el 10 o el 15%. Desgraciadamente, no es siempre fácil distinguir entre las células espermáticas anormales formadas durante la espermatogénesis y las causadas por técnicas inadecuadas de manipulación del semen. Se precisa para tal diferenciación experiencia en la manipulación del semen, en las técnicas de tinción y en el examen del esperma. 5.1.1.6. Morfología normal de la célula espermática y subfertilidad Los moruecos pueden en ocasiones ser subfértiles y sin embargo tener espermatozoides de morfología normal. También pueden reducir la fertilidad del macho algunos otros defectos de los espermatozoides, tales como la aneuploidía, el contenido anormal de genes o alteraciones estructurales. En estudios citogéneticos de moruecos con espermatozoides morfológicamente normales, se han señalado la traslocación cromosómica o la inversión como causas de la disminución de la fertilidad. Henricson y Backström (1964) observaron la duración de la metafase y de la anafase de la primera y segunda divisiones meióticas durante la espermatogénesis y hallaron que variaba significativamente en moruecos subfértiles y estériles comparados con moruecos de fertilidad normal. Supusieron por ello, que una causa de infertilidad podría descansar en un aparato de división defectuoso y que la distribución alterada 19 de los cromosomas podría dar lugar a un contenido anormal de los genes. Ambas anomalías del espermatozoide podrían producir la muerte del cigoto. En los estudios iniciales, se pensó que las diferencias cuantitativas del contenido en DNA de los espermatozoides podrían explicar las diferencias e la fertilidad de moruecos con células espermáticas morfologicamente normales. Estudios posteriores, utilizando otros métodos de análisis, revelaron que, excepto para el espermatozoide diploide, no hay diferencias en el contenido en DNA de los espermatozoides de los moruecos fétiles o infértiles o entre las células morfológicamente normales y anormales. Estos datos y los de Bouters y col. (1967) hacen suponer que las conclusiones contradictorias en relación con el contenido en DNA de los espermatozoides y de la capacidad de fertilización se debían a los diferentes métodos cuantitativos de determinación del DNA. Los núcleos diploides, que pueden identificarse visualmente, tienen aproximadamente el doble de cromatina que se encuentra en los núcleos de los espermatozoides normales; sin embargo, esta anormalidad es bastante rara. Gledhill (1970) ha sugerido que los defectos fisicoquímicos del núcleo de los espermatozoides pueden causar fertilidad reducida. La desoxirribonucleo-proteína (DNP) bioquímicamente inmadura se hallaba asociada con la infertilidad en un morueco con espermatozoides morfológicamente normales. Este defecto puede ser debido a un fallo en la unión de la proteína nuclear al DNA y puede deberse a la condensación de la cromatina durante la espermatogénesis. La condensación nuclear incompleta, que da lugar a cromatina anormal, se halla relacionada con la formación de un aspecto granular atípico de la cromatina nuclear en las cabezas de los espermatozoides de los moruecos infértiles y con cabezas de espermatozoides de forma anormal en el semen de los moruecos fértiles e infértiles. Sin embargo, el DNA en las cabezas de espermatozoides de forma anormal tenía una sensibilidad a la desnaturalización térmica similar al de los espermatozoides de cabezas normales. El estudio del cariotipo podría ser un método valioso para la identificación de animales con anomalías cromosómicas. Tales hallazgos podrían ser especialmente importantes en relación con moruecos de centros de inseminación artificial. 5.1.2. Motilidad de los espermatozoides Un hecho característico de los espermatozoides, que a la vez es prerrequisito para la fertilización, es su motilidad, con lo que la determinación de ésta nos puede proporcionar un medio, relativamente sencillo, para conocer la calidad de semen. Los espermatozoides pueden tener los siguientes tipos de movimientos: Movimiento progresivo hacia adelante Movimiento circular o rotatorio Movimiento oscilatorio o convulsivo sin progreso ni cambio de posición 26 Figura 6: Reacción del acrosoma en el espermatozoide humano. I- Espermatozoide con el acrosoma intacto (no reaccionado). II- Reacción del segmento principal (SP) del acrosoma: fusión de la membrana acrosomal externa (MAE) y la membrana plasmática (MP) en el segmento principal del acrosoma. III- Reacción acrosómica en el segmento ecuatorial (SE). IV- Espermatozoide con reacción acrosómica del segmento principal y ecuatorial. La membrana acrosómica interna se continúa con la membrana plasmática del segmento postecuatorial. (Hafez, 1985). 5.3. Fisiología del espermatozoide Las funciones del espermatozoide son: 1) Aportar la dotación paterna de cromosomas. 2) Iniciar la división celular del óvulo. El logro de estos objetivos se realiza en varias fases: a) Inseminación: colocación de los espermatozoides en el aparato genital de la hembra. b) Movimiento o traslación de los espermatozoides a los oviductos. c) Penetración de la pared celular del óvulo por un espermatozoide. d) Pérdida del cuerpo y cola del espermatozoide. e) Unión de los gametos masculino y femenino, formando el huevo o cigoto. 27 La supervivencia de los espermatozoides dentro del aparato genital femenino del ovino, no pasa de las 36-48 horas, existiendo variaciones considerables en los diversos tramos del mismo. Las contracciones uterinas, mediante la hormona oxitocina secretada por la hipófisis, influyen notablemente en el transporte de los espermatozoides a través del tracto genital femenino, tardando escasos minutos (10 a 20 aproximadamente) a alcanzar los oviductos, lugar donde se llevará a cabo la fertilización, que es la fusión entre un óvulo y un espermatozoide, resultando en una célula denominada embrión o cigoto. 5.4. Composición del semen 5.4.1. El semen Es la suspensión celular líquida que contiene los espermatozoides y las secreciones de los órganos accesorios del aparato reproductor masculino. La porción líquida de dicha suspensión, que se forma durante la eyaculación, se conoce como plasma seminal. 5.4.2. Plasma seminal Se trata de mezcla de líquidos secretados por las glángulas vesiculares, los epidídimos, conductos deferentes y otras glándulas sexuales accesorias. El testículo no contribuye casi nada a la formación del plasma seminal. Este plasma tiene tres funciones principales: 1) actúa como vehículo para los espermatozoides, transportándolos desde el sistema reproductor del macho, durante la eyaculación. 2) sirve de activador a los espermatozoides, previamente no móviles 3) proporciona un medio rico en nutrientes, tamponado, que colabora en mantener la supervivencia de los espermatozoides después de depositarse éstos en el aparato genital de la hembra. El plasma seminal de los moruecos es un líquido opaco o claro, aunque el semen puede ser de color blanco o cremoso debido a su alta concentración en espermatozoides. El principal componente del plasma seminal es el agua (75%), aunque también aparecen sustancias orgánicas e inorgánicas que sirven de protectores y nutrientes de los espermatozoides, normalmente es un líquido isotónico y neutro. 28 Al contrario que otros cuerpos fluidos, la presión osmótica del semen se mantiene más por los componentes orgánicos que por los iones inorgánicos, aunque existen cantidades considerables de sodio, potasio y cloro. Las principales sustancias orgánicas presentes en el semen de morueco son fructuosa, sorbitol, inositol, ácido cítrico, glicerilfosforilcolina, fosfolípidos, prostaglandinas y proteínas. La fructosa es el azúcar más fácilmente metabolizable y proporciona la mayor fuente de energía a los espermatozoides del semen. El pH del plasma seminal se mantiene muy próximo a 7.0 por un complejo sistema amortiguador. El plasma seminal tamponado protege a los espermatozoides de los cambios bruscos de pH que deteriorarían la supervivencia de las células espermáticas. 5.5. Tecnología de la manipulación espermática 5.5.1. Obtención del semen Existen dos métodos para recoger el semen, denominados como el de vagina artificial y el de la estimulación eléctrica. Es preferido el primero de los citados dada su rapidez y limpieza, no es estresante para el semental y proporciona un semen recolectado de mejor calidad. Por el sistema de la vagina artificial se puede recoger semen, varias veces al día. La estimulación eléctrica se debe usar cuando se precise recoger semen de un macho que no es posible entrenarlo a la vagina artificial; tiene, este método, el inconveniente de producir malestar en el macho, no se pueden hacer frecuentes recogidas de semen, que, por otra parte, se contamina fácilmente, con orina, durante la recogida. El semen obtenido, por este método, presenta mayor volumen, pero menor concentración, que cuando se obtiene por vagina artificial. Sin embargo, la estimulación eléctrica es útil para testar la fertilidad de gran número de machos, incluyéndose los moruecos de recelas intervenidos quirúrgicamente. La recogida del semen es el almacenamiento de los espermatozoides del animal a la salida de su aparato reproductor, salida que es provocada con métodos no naturales. Todos los métodos para estimular la salida del semen, deben cumplir unos requisitos: 1. Garantizar la calidad del semen. 2. No provocar daños en el macho. 3. Ser de fácil aplicación y de bajo coste. 4. Debe evitar que los espermatozoides se contaminen o se estresen. 29 5.5.1.1. Recogida de semen por vagina artificial La vagina artificial es una imitación de la vagina de la oveja, que proporciona el estímulo térmico (temperatura) y mecánico (presión) para la erección del pene del macho y que son, igualmente, necesarios para producir la eyaculación. La vagina artificial utilizada para mardanos es similar a la usada para los toros. Consiste de una caperuza externa (de 20 x 5.5 cm) fabricada con goma fuerte, plástico u otro material sintético que tenga buenas propiedades aislantes, y un conducto interno fabricado de goma o material sintético apropiado (Figura 7). El tamaño de la vagina artificial está en relación con la longitud del pene. El conducto interno suele tener unos 2-3 cm más que la caperuza externa con el fin de poderse plegar sobre ésta, sujetándolo con sendas bandas de goma, para formar una especie de depósito estanco para el agua. El conducto, por otra parte, debe ser ligeramente elástico y montarse sobre la caperuza de tal forma que se forme un tubo de superficie lisa, sin arrugas. En todo momento habrá que asegurarse que la tubuladura interna esté en buen estado y no tenga fisuras. La vagina deberá estar limpia, seca y estéril; una misma vagina, sin limpiar, no se debe utilizar para distintas recogidas de semen. Después de cada uso se debe lavar, enjuagar con agua destilada y secarla profundamente; si se pasa, por el interior, una delgada película de alcohol al 70%, en agua destilada, se secará, luego, mejor. A continuación se llena la mitad del depósito con agua a 48-50º, a través del tampón colocado en el lateral y con ayuda de un embudo o jeringa de 100 ml (el calor del agua contribuirá a evaporar el alcohol). Si se llena demasiado de agua, se saldrá, cuando se deje la vagina en posición vertical. Evitar, en todo momento, que el agua penetre en el tubo interno ya que puede ser la causa de mortandad de los espermatozoides. Uno de los extremos del conducto interno se debe lubricar ligeramente con vaselina, en una extensión de no más de 3 cm, utilizando una varilla de plástico o vidrio. En el otro extremo se debe colocar el tubo de vidrio estéril y calibrado, para recoger el semen, insertándolo 1,5-2,0 cm. Mientras se coloca el tubo se debe insuflar aire, por el extremo abierto, y luego se cierra, todo ello con el fin de que el tubo quede perfectamente acoplado. La insuflación debe ser de tal magnitud que ejerza presión pero que permita una fácil penetración del pene. La temperatura de la vagina artificial, inmediatamente antes de recoger el semen, deberá ser de 42-45ºC, lo que se puede controlar mediante la inserción de un termómetro limpio. Si la vagina se encuentra demasiado fría, se debe rellenar con agua más caliente, que la que se utilizó con anterioridad. Con el fin de evitar el shock por frío, de los espermatozoides, los vidrios de recogida se deben calentar a 30-37ºC. En los climas fríos, donde sea difícil mantener la temperatura de la vagina a 42-45ºC, puede calentarse, durante un corto tiempo, en una estufa de cultivo a 37ºC antes de añadir el agua. Sin embargo, la exposición prolongada, a estas temperaturas, producirá cierto deterioro del tubo interior. 30 El semen se debe recoger en un ambiente libre de polvo. Antes de la recogida de semen, se debe limpiar, cuidadosamente, el prepucio del macho, para evitar cualquier contaminación de aquél. La hembra maniquí se debe sujetar a lo que se llama potro. El operario, en posición de agachado o en cuclillas, se coloca en el lado derecho y coloca la vagina artificial en el flanco de ese lado, sujetándolo con la mano derecha, de tal forma que el extremo abierto quede mirando hacia el macho y abajo, con un ángulo de unos 45º. La espita de la vagina artificial debe dirigirse hacia abajo, para evitar su contacto con el macho. El tubo recolector debe mantenerse firme y caliente sujetándolo, parcialmente, con la mano (Figura 8). Cuando el semental se monte, el pene erecto se debe dirigir al extremo abierto de la vagina artificial. Es importante que la vagina se aplique lo más pronto posible después que el semental se haya montado. El pene se debe dirigir hacia la parte superior de la vagina y ésta se retirará en el momento que el macho desmonte. Los movimientos vigorosos hacia arriba y hacia adelante significan que se ha producido la eyaculación. Se debe dejar que el macho retire el pene de la vagina antes de intentar retirar ésta. Inmediatamente después de la recogida la vagina artificial se cambia de posición, quedando el tubo de vidrio en la parte inferior, a la vez que se sujeta éste con la mano. Se quita la presión al abrir la espita, teniendo la precaución de que no salpique agua cerca del tubo de recogida de semen. Luego se quita el polvo, se etiqueta, se tapa y se coloca en un baño a 30ºC. La frecuencia con la que se puede colectar el semen depende de la edad, de la condición, ya que hay machos que eyaculan muy rápidamente y otros que son más retardados, y del temperamento del animal. Los moruecos pueden montar y eyacular 10-15 veces o más, al día. Con tal frecuencia, el volumen y concentración del semen (y consecuentemente el número de espermatozoides por eyaculado) disminuye con los sucesivos eyaculados. Sin embargo, un régimen de 3-5 recogidas diarias, durante períodos de 4-5 días, separados por 2-3 días de descanso, no reducirá sensiblemente la cantidad y calidad del semen. Figura 7. Vagina artificial 31 Figura 8. Operario agachado y tubo recolector erecto. 5.5.1.2. Recogida de semen por estímulo eléctrico Existen diferentes tipos de estimuladores eléctricos, los más corrientes son los que tienen un electrodo bipolar para el recto. Existen variaciones según el método de recogida, especie, estado fisiológico del macho, raza, edad, tamaño corporal, alimentación y regimen sexual al que se le somete al macho. (Derivaux, 1982; Memon y col., 1981; Pérez, 1996). 5.5.2. Factores que afectan a la supervivencia de los espermatozoides El semen, que a la hora de la recogida, puede ser de buena calidad se deteriora con facilidad. El semen del carnero y del macho cabrío es muy sensible a los cambios ambientales y a otras circunstancias, por lo que es aconsejable el tomar medidas precautorias cuando se manejan muestras de semen. Los factores que pueden afectar a la supervivencia de los espermatozoides son los siguientes: TEMPERATURA: La temperatura del semen en el momento de la eyaculación, es próxima a la del cuerpo (37,5º). La exposición del semen a temperaturas superiores a la indicada aumente el ritmo metabólico, se agotan las reservas de energía y decrece 32 la vida media del espermatozoide. Temperaturas superiores a los 45ºC matan a los espermatozoides. La disminución de la temperatura reduce el metabolismo de los espermatozoides, pero una bajada súbita de la temperatura, particularmente por debajo de 10ºC, producirá una pérdida irreversible de su viabilidad. La motilidad no se recupera al calentar de nuevo el semen, con lo que de esa forma se pierde definitivamente la capacidad fecundante de aquel semen. Este fenómeno se llama shock de frío y puede suceder como consecuencia de una exposición accidental al aire frío o al utilizar material de vidrio frío a la hora de recolectar el semen o al visionarlo al microscopio. También se pondrá especial cuidado, cuando se diluya el semen, de que el diluyente esté a la misma temperatura que esté el semen. El enfriamiento lento del semen 2-5ºC no es fatal. La reducción del metabolismo, a esta temperatura, contribuye a prolongar la viabilidad de los espermatozoides. Al calentar de nuevo las muestras se restaura la motilidad y los espermatozoides permanecen fértiles. LUZ: La luz solar directa es muy perjudicial para el semen. Una exposición corta a la luz solar puede reducir la viabilidad de los espermatozoides y si esa exposición se prolonga a 30-40 minutos pueden morir. Consecuentemente, es aconsejable evitar la exposición directa del semen a la luz solar con lo que las operaciones de recogida y manejo del semen se deben hacer en interiores y lejos de los rayos de luz que puedan penetrar por las ventanas. Asimismo, es conveniente evitar exposiciones del semen a la luz fluorescente intensa o a la radiación ultravioleta. CONTACTO CON METAL: El contacto con metal, de cualquier tipo, es peligroso para los espermatozoides; por esta razón, sólo se debe utilizar material de vidrio o equipos de materiales sintéticos inertes cuando se trate de recoger, diluir, conservare, incluso, practicar la inseminación CONTACTO CON AGUA: El agua reduce la presión osmótica del plasma seminal con lo que puede matar a los espermatozoides. Por tanto, el agua se comporta como un peligroso agente espermicida, con lo que nunca deberá ponerse en contacto el semen con el agua. Antes de usarlo, todo el material, incluida la vagina artificial y los tubos colectores de semen, deberá secarse con esmero. Se pondrá especial atención cuando se deje el semen en el baño de agua, para que no salpique nada de agua al semen. Se recomienda el uso del agua bidestilada con agentes pirógenos. El agua de uso corriente es muy dañina (residuos minerales). IMPUREZAS Y BACTERIAS: Las bacterias, el polvo, los pelos, la orina y otros contaminantes que puedan estar contenidos en el semen reducirán, e incluso matarán, la viabilidad de los espermatozoides. La contaminación del semen ocurre con más frecuencia durante la recogida y puede evitarse mediante lavado, a fondo, del prepucio del macho antes de manejarlo. Después de recogido el semen se protegerá 33 de los contaminantes del aire cubriéndolo con una hoja de papel de aluminio o un vidrio de reloj. Se debe poner especial cuidado de proteger al semen contra las moscas y otros insectos. Los sprays antiparasitarios o antisépticos no se deben utilizar cerca de donde esté el semen ya que son muy peligrosos para los espermatozoides y pueden persistir mucho tiempo en el ambiente. La proliferación de microbios en el semen se puede controlar por la adición de antibióticos al diluyente. DESINFECTANTES: Los desinfectantes y antisépticos son muy peligrosos para los espermatozoides, por lo que se evitará su uso. Para esterilizar el material se puede utilizar alcohol al 70%, en agua, si bien deberá secarse cuidadosamente antes de usarlo. Para el material de vidrio se debe utilizar la esterilización mediante calor seco EXPOSICIÓN PROLONGADA AL AIRE: El oxígeno del aire incrementa, notablemente, la actividad metabólica de los espermatozoides con lo que se acumula ácido láctico en el semen. Ese ácido puede reducir el pH del semen por debajo de óptimo, esto es pH 7.0, con lo que la viabilidad de los espermatozoides se reducirá notablemente. El semen, una vez recogido, deberá usarse, de inmediato, ya sea para la inseminación o la conservación. CAPACIDAD TAMPONANTE DEL DILUYENTE: El medio que se utilice para diluir el semen debe tener suficiente capacidad amortiguadora para mantener el pH óptimo. Las desviaciones del pH, bien sea hacia la alcalinidad (por encima de 7.0) o la acidez (por debajo de 7.0), disminuirán la viabilidad de los espermatozoides. Los diluyentes de semen, más recomendados, contienen tampones; esto es, sustancias capaces de mantener el medio cercano al pH óptimo de los espermatozoides. PRESIÓN OSMÓTICA DEL DILUYENTE: Los componentes (solutos) disueltos en el medio y que rodeen al espermatozoide pueden ejercer cierta presión sobre la membrana celular. Esta fenómeno se conoce como presión osmótica y aumenta según la concentración de solutos en el medio. Los medios en los que la concentración de solutos es equivalente a la del interior de la célula se dice que son isotónicos. Los medios que tienen concentraciones más bajas de solutos son hipotónicos y los que tienen más solutos son hipertónicos. Tanto los hipo como los hipertónicos son peligrosos para los espermatozoides; sólo hay un estrecho margen de tonicidad sobre el que puede variar el diluyente sin que se afecten los espermatozoides. En efecto, éstos permanecen más móviles en medios isotónicos. 34 5.5.3. Dilución seminal El semen recogido deberemos diluirlo y conservarlo hasta su procesado en el laboratorio, esto permitirá aumentar el volumen espermático y reducir la concentración para un análisis más sencillo y práctico, además el espermatozoide estará en un medio favorable para su supervivencia. Los medios de dilución han de cumplir estos requisitos: - Que el medio tenga presión osmótica isotónica con el espermatozoide y que se mantenga. Si esto no ocurriera, habría lisis o arrugamiento del espermatozoide. - Que el pH del medio no se modifique, es decir, el diluyente debe tampón. Esto es sobre todo importante en el toro y el morueco (pH 6.8-7). - Que el medio diluyente lleve sustancias que permitan la protección adicional del espermatozoide. - Que el medio favorezca la vitalidad y longevidad del espermatozoide. - Que el medio sea estéril, libre de sustancias químicas, bacterias, virus,..., que dañasen directamente al espermatozoide (en este caso se ha utilizado como diluyente leche de vaca UHT a la que se le han añadido antibióticos). - Que el medio permita la esterilización fácil de los utensilios. - Que el medio sea fácil de preparar, rápido y que sea económico. Los medios más comúnmente utilizados son: 1) Yema de huevo. Si lleva elementos fosfatados, mejor, pues esto alargara la vida del espermatozoide. La lecitina protege contra los cambios bruscos de temperatura. 2) Leches naturales (diluyente utilizado en este estudio) o en polvo. 3) Glicerol, en caso de congelar, que ayudara a conservar al espermatozoide, pues la congelación sería amorfa, no cristalina, lo cual dañaría al espermatozoide. Normalmente pueden usarse en el diluyente ciertas sales como permanganato potásico. Conviene así poner el diluyente a la temperatura del esperma a la hora de añadirlo para no tener un shock térmico en el espermatozoide. Cada aplicación se hará de forma lenta sobre el esperma, para que la mezcla con el diluyente sea perfecta. 35 5.6. Manejo y evaluación de la calidad seminal El análisis del semen tiene por objeto valorar la calidad de un eyaculado, y la funcionalidad del macho como reproductor. Actualmente, existen múltiples técnicas de laboratorio para la determinación de la calidad seminal, no siendo aconsejable la utilización de un solo análisis para valorar la viabilidad del semen (Hafez, 1987; Maxwell y Evaus, 1990; Boixo, 1994). El método definitivo en la valoración de la capacidad fecundante del semen es el nacimiento de un nuevo individuo. Sin embargo, el tiempo y dinero requerido para ello hacen que los ensayos de fertilidad en campo mediante la cubrición de hembras no sean frecuentemente utilizados, tratando de desarrollar métodos alternativos “in vitro” que se correlacionen con la fertilidad. La necesidad de utilización de diferentes técnicas en la valoración de la calidad de un eyaculado se debe a la falta de existencia de una sola prueba que determine su fecundidad, debido en gran parte, a que el espermatozoide es una célula altamente especializada y con una función biológica compleja, influenciada por multitud de factores externos “in vitro” (tratamientos seguidos en el laboratorio para su capacitación, conservación, ... ) o “in vivo” (cambios en el medio a lo largo de su paso por el tracto reproductor de la hembra). El volumen promedio del eyaculado del carnero es de 1 ml (0,7 ml a 3 ml) y su concentración varía entre 2.000 y 6.000 millones de espermatozoides/ml. El estudio seminal requiere: -Un examen macroscópico: aspecto, olor, viscosidad, volumen y pH. Estos parámetros son importantes, y sus anomalías deben comunicarse, independientemente de la calidad de otros parámetros seminales. - Un examen microscópico: concentración espermática, porcentaje de células móviles y con movilidad progresiva, porcentaje de espermatozoides con morfología normal, aglutinación y presencia de otros elementos celulares, considerándose como parámetros básicos e imprescindibles en la valoración de la fertilidad natural del macho. Una vez fijados estos parámetros, debemos establecer qué límites son los que vamos a aceptar como normales. 42 5.6.2.5. Alteraciones morfológicas Algunas de las morfoanomalías de los espermatozoides son de origen genético, es el caso de la globozoospermia, patología que impide la formación de las estructuras acrosomales de la cabeza del espermatozoide (Check y col., 1993); y la presencia de espermatozoides acéfalos o con uniones anormales entre la cabeza y el cuello, como consecuencia de alteraciones en la espermiogénesis. Chemes y col. (1999) indicaron su posible origen genético por el fenotipo característico de la patología y por su incidencia entre varones de la misma familia. Previamente, otros autores ya habían descrito este tipo de alteración en la especie bovina y en otras especies animales (Bloom y Birch, 1970; Chemes y col., 1987; Baccetti y col., 1989). Baccetti y col. (2002) demostraron que la teratozoospermia severa era concomitante con patologías andrológicas tales como el varicocele, criptorquidia e infecciones seminales, y observaron que la mayoría de las alteraciones genéticas estaban relacionadas con problemas de consanguinidad. Muchas de ellas conllevan esterilidad en los machos y parecen ser debidas a mutaciones autonómicas recesivas: “síndrome de deficiencia de los brazos de dineína” (Edwards y col., 1989; Walter y col., 1990), “síndrome del flagelo atrofiado” (Chemes y col,. 1998), “cabeza redonda” (Check y col., 1993), “miniacrosoma” (Baccetti y col., 1991) y “acéfalos” (Chemes y col., 1999). Estas alteraciones afectan a orgánulos del flagelo, a la conexión entre la cabeza y la pieza intermedia, vaina de fibras, túbulos del axonema, fibras accesorias y estructuras acrosomales. Como consecuencia, los espermatozoides son inmóviles o muestran una movilidad alterada. En otras ocasiones, las alteraciones morfológicas son consecuencia de distintas situaciones patológicas como la hiperprolactinemia (Laszcynska y col., 1992), así como por el efecto negativo de algunos agentes externos: plomo ambiental (Kaur y Prashad, 1994), 2,4-diclorofenoxacético (Garabrant y Philbert, 2002) y en general, a todos compuestos tóxicos para el sistema reproductor. Las morfoanomalías se pueden clasificar en diversas categorías: - Forma o tamaño de la cabeza: grande, pequeña, alargada, redonda, amorfa, vacuolaza, de alfiler y dobles cabezas. - Defectos del cuello o pieza intermedia: incluye ausencia de flagelos, angulados, gruesos y vacuolados. - Defectos del flagelo: cortos, múltiples, rotos, angulados, en horquilla y enrollados. Además se incluyen todas las posibles combinaciones (OMS, 1999). Los espermatozoides morfológicamente anormales, a menudo presentan múltiples defectos. Para informar de este tipo de alteraciones sin priorizar las de la cabeza sobre las de la pieza intermedia, ni éstas sobre las del flagelo, durante los últimos 43 años se viene empleando el índice de teratozoospermia que se define como: el número de anomalías dividido por el número de espermatozoides anormales. Este índice se utiliza como predictor de la función espermática in vivo e in Vitro. Un eyaculado de morueco se considera normal cuando el porcentaje de formas anormales es inferior al 15% (Abraham, 1987; Maxwell y Evans, 1990). Existen variaciones en la morfología espermática debido al estrés, factor individual, temperatura, estación del año, etc. (Smith y Sherman, 1994). Diversos investigadores han descrito una amplia variedad de anormalidades morfológicas del espermatozoide (Figura 9). En general, cualquier desviación morfológica de la estructura normal del espermatozoide se ha considerando como anormal o anomalía espermática. Dichas conclusiones confirman el potencial de fertilidad de los moruecos (Williams y Savage, 1925; Lagerlöf, 1934). Figura 9. Espermatozoides normales y algunas formas anormales. A-Sin acrosoma (forma común). B- Sin apenas acrosoma. C- Con cabeza piriforme cabeza. D- Con cabeza piriforme moderada. E- Con cabeza piriforme leve. F- Con vacuolas. G-Defectos en la membrana. H- Sin flagelo. I- Reflejo distal. J- Parte media rota. K- Parte media severamente doblada. L- Gota proximal. M- Gota distal. N- Teratoride grave. O-Teratoideo moderado. P-Espermatozoide normal (Barth y col., 1989). 44 5.6.2.6. Morfometría del espermatozoide Los primeros analizadores computerizados de morfología espermática (CASMA) aparecieron en el mercado en los años noventa del pasado siglo. Uno de ellos, el Sperm-Class Analyser® (SCA), resultó útil en el análisis morfológico de las muestras de semen humano, tanto de la cabeza como de la pieza intermedia. Los sistemas ASMA analizan de forma objetiva una serie de parámetros morfométricos que pueden ser usados para definir un espermatozoide con morfología “normal” de forma equivalente a como lo haría un técnico especializado. No obstante, la mayor ventaja de estos instrumentos no es la sustitución de los técnicos, sino el hecho de que aportan parámetros métricos objetivos que pueden reflejar de forma mucho más interesante la realidad de la muestra seminal que la valoración subjetiva de lo que consideramos un espermatozoide normal (Katz y col., 1986). Anteriormente al desarrollo de estos sistemas, la morfología espermática se determinaba mediante la observación al microscopio de las muestras previamente teñidas o fijadas. Un incremento de las anormalidades morfológicas de los espermatozoides de un eyaculado está asociado en humanos (Kruger y col., 1988), caballos (Jasko y col., 1990), machos cabríos (Chandler y col., 1988), toros (Saake y col., 1970) y ciervos (Malo y col., 2005) con una disminución de las tasas de fertilidad. Además en los toros, se relaciona con variaciones estacionales de la fertilidad (Sekoni y col., 1987) y con problemas hereditarios de infertilidad (Hafez y col., 1987). La morfología defectuosa de los espermatozoides también se ha asociado con pérdida embrionaria temprana (DeJarnette y col., 1992) y reducida capacidad para encontrar el ovocito (Kolt y col., 1987). Sin embargo, en numerosas ocasiones no se ha encontrado una relación clara entre “normalidad” morfológica de la muestra espermática y fertilidad. Esta falta de relación entre ambos parámetros se ha atribuido a los resultados tan variables que se obtienen de la evaluación subjetiva empleada para la clasificación de la morfología espermática (Davis y col., 1995). Con objeto de reducir la subjetividad de este tipo de evaluaciones se desarrollaron, como ha quedado referido anteriormente, los sistemas CASMA o ASMA. Estos sistemas han sido aplicados para analizar de manera eficaz la morfometría de la cabeza espermática en hombre y caballo (Davis y col., 1993; Kruger y col., 1996), macho cabrío, conejo, rata, toro y morueco (Gravance y col., 1994, 1995, 1996 y 1998; Sancho y col., 1998) y cerdo (Hirai y col., 2001). Para ello, se han tenido que estandarizar previamente las condiciones de uso de los sistemas para las referidas especies. Además, en algunas de ellas, como la humana (Kruger y col., 1993), la equina (Casey y col., 1997) y la porcina (Hirai y col., 2001), se han encontrado relaciones significativas entre los valores de las dimensiones espermáticas, determinados por el sistema ASMA y las tasas de fertilidad. Esto ha permitido en estas especies establecer las medidas de los espermatozoides “normales” y “anormales” en base a la 45 fertilidad de los donantes de los mismos. Por tanto, los sistemas ASMA son capaces de diferenciar las medidas espermáticas normales de los espermatozoides procedentes de machos fértiles, de las procedentes de machos subfértiles o estériles. Esto les ha permitido convertirse en una metodología de evaluación muy interesante de cara a poder predecir la capacidad fecundante in vivo de las dosis seminales. En el análisis morfométrico, los parámetros que se suelen medir en la cabeza del espermatozoide son el área (µm 2 ), el perímetro (µm), la anchura (µm), la longitud (µm), porcentaje de acrosoma y área de acrosoma (µm 2 ). Además, con estas medidas se obtienen otras cuatro medidas derivadas de éstas que también son de interés para este tipo de análisis, y son la elipticidad (L / W), rugosidad (4πA/P2), elongación ((L - W) / (L + W)), y regularidad (πLW / 4A). Estas medidas están explicadas en la figura 10. Figura 10. Parámetros morfométricos medidos en este estudio. Como parámetros primarios se considerarón: área, perimetro, longitud y anchura, como sencudarios: elipticidad, rugosidad, elongación y regularidad. A continuación se muestra una recopilación de los resultados morfométricos obtenidos en diversos estudios (Tabla 2), con sus correspondientes tratamientos. Como puede apreciarse, diversos factores pueden condicionar los resultados obtenidos, tales como el método de fijación y tinción, el objetivo empleado, el software, etc. En los trabajos publicados hasta la fecha existe una gran amplitud en los resultados obtenidos en los diferentes parámetros morfométricos del espermatozoide de morueco y de otras especies. 46 Tabla 2. Resultados morfométricos de distintos estudios. Especie Autor Tinción AREA (µm2) PERIMETRO (µm) ANCHURA (µm) LONGITUD (µm) Morueco Gravance y col, 1998 MGZIN(HHRB) 29.050 24.310 4.790 8.060 HH 28.120 22.080 4.650 7.890 Maroto- Morales y col, 2010 Hemacolor 35.020 2.680 4.790 8.900 Ciervo Soler y col, 2005 Hemacolor 32.570 22.830 4.700 8.200 HH 30.670 22.200 4.510 8.040 Diff-Quik 28.380 21.110 4.420 7.670 Alpaca Buendia y col, 2002 Hemacolor 15.950 15.110 3.620 6.100 Toro Boersma y col, 2001 PAP 35.500 25.100 4.700 9.100 PAP+ 35.000 24.800 4.700 9.000 FAR 40.200 26.600 5.100 9.600 HEM 35.100 24.900 4.700 9.100 SPER 39.300 26.700 5.100 9.900 MGZIN 34.700 25.200 4.700 9.000 Gravance y col, 1999 HH+Rbengala 29.450 23.800 4.460 8.720 Gravance y col, 2009 MGZIN (Fresco) 29.660 23.970 4.550 8.670 (Descongelado) 29.130 23.120 4.390 8.450 Gravance y col, 1996 HH/GZINmod( 27.300 25.360 4.400 8.650 HH+rosa bengala) Beletti y col, 2005 Azul toluidina 32.900 22.300 4.600 8.900 Cabra Gravance y col, 1997 HH (Fresco) 19.670 18.620 3.770 7.000 (Descongelado) 20.570 18.830 3.870 7.130 Hidalgo y col, 2006 Diff-Quik 29.020 22.200 4.160 8.470 Hemacolor 28.310 22.210 4.030 8.380 HH 25.030 20.620 3.710 8.030 Marco- Jiménez y col, 2006 Hoescht 333 (Fresco) 23.890 20.810 3.480 8.160 (Refrigerado) 23.590 20.770 3.490 8.010 (Descongelado) 23.440 20.630 3.420 8.000 Gravence y col, 1995 HH 22.820 20.150 3.800 7.690 47 5.6.2.6.1. Evaluación morfométrica del acrosoma El acrosoma es esencial para la función espermática. Para completar el proceso natural de la fecundación, los espermatozoides deben tener movilidad, capacitarse y desarrollar la reacción acrosómica para atravesar la zona pelúcida. El estudio de la morfometría del acrosoma puede tener una relevancia funcional. Liu y Baker (1988) y Menkveld y col. (1996) demostraron que la morfología normal del acrosoma se correlaciona significativamente con la unión del espermatozoide a la zona pelúcida, mientras que Franken y col. (1997) demostraron que existe una fuerte relación entre la morfología espermática normal y la capacidad de inducir la reacción acrosómica. En humana se ha demostrado que existe una relación entre el tamaño del acrosoma y la funcionalidad, observando que los espermatozoides con acrosomas pequeños tenían más probabilidad de morir y de perder el acrosoma de manera no fisiológica (Menkveld y col., 2003). También en nuestra especie, el porcentaje de espermatozoides con tamaños del acrosoma normal (40–70% del área total de la cabeza), se ha correlacionado con la probabilidad de fecundación (El-Ghobashy y West, 2003). La evaluación de la morfometría del acrosoma require una tinción diferencial de los espermatozoides, solamente conseguida de manera que permita el análisis morfométrico en algunas especies, como la humana y canina. Una técnica de tinción debe causar el menor cambio a las dimensiones y forma de los espermatozoides; a fin de evaluar de forma fiable las características morfométricas. Diversas técnicas han sido empleadas en el estudio sobre la morfometría del acrosoma en humano como: SpermBlue ®, Papanicolaou, Rapidiff (Menkveld y col., 2003, Maree y col., 2010;), y Multi ZSC (Lampiao y col., 2006). En animales hay algún estudio sobre la morfometría del acrosoma en perro (Nuñez –Martinez y col., 2006). En las tablas 3, 4 y 5 se muestran los resultados morfométricos del acrosoma obtenidos en estos estudios. Sin embargo en otras especies de animales domésticos, como la ovina, no es posible realizar el análisis morfométrico del acrosoma utilizando las técnicas actuales. Los resultados de estos estudios muestran que el tamaño acrosomal refleja la capacidad funcional del espermatozoide y por lo tanto el potencial de fertilidad. Además, los espermatozoides con acrosomas pequeños son más susceptibles a la muerte celular. 48 Tabla 3. Resultados morfométricos de la especie humana. Tamaño del acrosoma Muerte del espermatozoide antes de la reacción acrosómica (%) Muerte del espermatozoide después de la reacción acrosómica (%) Pequeño (> 40%) 78,3+13,8 79,1+12,9 Normal (40-70%) 43,5+6,8 43,8+8,1 Grande (< 70%) 40,4+18,1 44,4+16,3 Tabla 4. Porcentaje de muerte del espermatozoide antes y después de la reacción acrosómica según el tamaño del acrosoma. Especie humana. (R. Menkveld y col., 2003). L. Maree y col., 2010 G. van der Horst y col., 2009 Tratamiento Papanicolaou Rapidiff SpermBlue Fresco SpermBlue Nº muestras semen 24 24 24 5 10 Longitud (µm) 4,28+0,27 5,17+0,27 4,73+0,27 4,79+0,26 4,71+0,25 Anchura (µm) 2,65+0,19 3,12+0,21 2,75+0,24 2,82+0,23 2,78+0,23 Área (µm 2 ) 9,26+0,99 12,87+1,19 10,47+1,21 - 10,50+1,11 Perímetro (µm) 11,83+0,69 14,33+0,75 12,99+0,80 - 12,98+0,77 Elipticidad 1,63+0,11 1,68+0,10 1,75+0,13 1,73+0,12 1,72+0,12 Elongación 0,23+0,03 0,25+0,03 0,27+0,03 0,26+0,03 0,26+0,03 Rugosidad 0,83+0,02 0,79+0,02 0,78+0,03 - 0,78+0,02 Regularidad 0,96+0,01 0,98+0,01 0,97+0,02 - 0,98+0,20 % Acrosoma 32,76+7,43 23,73+7,97 46,29+8,63 - 50,67+6,71 49 Parámetros Resultados Nº total espermatozoides analizados Longitud (µm) 5,2-5,7 2359 Anchura (µm) 3,3-3,6 Área (µm 2 ) 14,5-16,6 Perímetro (µm) 15,1-16,5 Área Acrosoma (%) 50,5-64,1 Parámetros Resultados Nº total espermatozoides analizados Longitud (µm) 5,2-5,7 2359 Anchura (µm) 3,3-3,6 Área (µm2) 14,5-16,6 Perímetro (µm) 15,1-16,5 Área Acrosoma (%) 50,5-64,1 Tabla 5. Resultados morfométricos de la especie canina (Núñez-Martinez y col., 2006). 50 6. MATERIAL Y MÉTODOS 6.1. Reactivos A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos utilizados se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.), y los diluyentes se prepararon con agua Milli-Q (Millipore Ibérica SA, Barcelona, España). 6.2. Recogida, dilución y manipulación seminal Los eyaculados se obtuvieron a partir de una vagina artificial, de 10 machos diferentes de rasa aragonesa, gracias al Centro Nacional de Selección y Reproducción Animal (ATP-SYRA) de Movera (Zaragoza), y se procesaron inmediatamente después de la licuefacción. De cada muestra se analizó la concentración, el porcentaje de células con morfología normal y de cada grado de movilidad. Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme al Reglamento de Protección Animal Español RD223/1988, que se ajusta al Reglamento de la Unión Europea 86/609. El semen se recogió mediante una vagina artificial de 10 machos adultos Rasa Aragonesa en un tiempo de menos de 30 minutos, estabulados en el un manejo regular de extracciones seminales. Como paso previo a la recogida del semen, se procedió a atemperar todo el material, que sirvió para recoger los eyaculados de los moruecos para evitar el choque térmico. Este atemperado se realizó mediante el almacenamiento de los materiales en una cámara a 37ºC (Figura 11). 51 Figura 11. Estufa calefactora Tras la recogida, el semen se diluyó con leche de vaca, (UHT) (0,7% de grasa) y con antibióticos (Penicilina-Streptomicina SIGMA 100x 10 µl/ml) a razón de 1: 3 partes de semen/diluyente, respectivamente (Figura 12). Éste se había sumergido previamente en un baño maría a unos 30 ºC para evitar el choque térmico. Figura 12. Dosis de esperma ya diluido (4ml: 1ml semen - 3 ml diluyente) 58 f g h i j Figuras 16. Espermatozoides analizados con el objetivo de 40 aumentos sin filtro y lavados, teñidos y fijados con distintos tratamientos. f) tinción de SpermBlue g) tinción de Hemacolor h) lavado con agua destilada i) fijación con Metanol 50% j) fijación con Glutaraldehído 2%. 59 En la siguiente tabla se muestra el número de espermatozoides correctamente analizados para cada tratamiento. Independientemente de la utilización del filtro, los grupos con peores resultados fueron los fijados con glutaraldehido y metanol, por debajo del 90% de espermatozoides correctamente analizados. En el grupo lavado con agua, la captura se situó en torno al 90%, mientras que la tinción de las muestras con Hemacolor o SpermBlue permitió mejorar la proporción de espermatozoides correctamente analizados. En las muestras fijadas con glutaraldehido o metanol se observa claramente la presencia de artefactos (Figura 15 apartado d y e, Figura 16 apartado i y j), que han podido contribuir a una menor precisión en la captura Nº ANALIZADOS CON FILTRO Nº ANALIZADOS SIN FILTRO LAV 92,15% 89,00% SB 96,10% 97,45% HM 97,05% 89,95% GLUT 78,30% 83,55% MET 81,30% 87,40% TOTALES 88,98% 89,47% Tabla 6. Proporción de espermatozoides correctamente analizados por cada método con y sin filtro y en total. El tratamiento de las muestras tuvo un efecto significativo sobre todas las medidas morfométricas, tal y como se aprecia en las figuras 17 y 18. Para la mayoría de los parámetros morfométricos primarios (área, perímetro, longitud y anchura de la cabeza) la relación entre tratamientos podría definirse de la siguiente manera: GLUT>HM>MET>SB>Lavado (Figura 17). Las únicas excepciones fueron la anchura de la cabeza (para la que el SB fue mayor que el MET) y la longitud, que fue similar entre el SB y el lavado. 60 Aa Bb Ca Da Ea Ab Ba Cb Db Eb 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 LAV SB HM GLUT MET ANCHURA (µm) Aa Aa Ba Ca Da Ab Ab Bb Cb Da 8,4 8,6 8,8 9 9,2 LAV SB HM GLUT MET LONGITUD (µm) Aa Ba Ca Da Eb Ab Bb Cb Db Ea 22,5 23 23,5 24 24,5 LAV SB HM GLUT MET PERÍMETRO (µm) Aa Ba Ca Da Ea Ab Bb Cb Db Eb 30 31 32 33 34 35 36 37 LAV SB HM GLUT MET ÁREA CABEZA (µm 2 ) a b c d Figura 17. Resultados obtenidos para los parámetros primarios a) anchura, b) longitud, c) perímetro y d) área cabeza. Azul: con filtro; Rojo: sin filtro. Letras mayúsculas A- E: diferencias significativas entre métodos. Letras minúsculas a-b: diferencias significativas entre con o sin filtro. 61 Aa Ba Ca Da Ea Ab Bb Cb Db Eb 60 61 62 63 64 65 66 67 LAV SB HM GLUT MET ACROSOMA (%) Aa Ba Ca Da Ea Ab Bb Cb Da Eb 20 20,5 21 21,5 22 22,5 23 23,5 LAV SB HM GLUT MET ÁREA ACROSOMA (µm 2 ) e f Figura 18. Resultados obtenidos para el acrosoma. e) porcentaje de acrosoma y f) área de acrosoma. Azul: con filtro; Rojo: sin filtro Letras mayúsculas A- E: diferencias significativas entre métodos. Letras minúsculas a-b: diferencias significativas entre con o sin filtro. El tratamiento también tuvo un efecto claro sobre las dimensiones del acrosoma y la proporción de la cabeza ocupada por el mismo (Figura 18). Para el área del acrosoma la relación entre los distintos métodos fue muy parecida a la descrita para los parámetros primarios de la cabeza espermática, excepto que la relación entre el Hemacolor y el metanol se invirtió. Cuando estudiamos la proporción de la cabeza del espermatozoide cubierta por el acrosoma, la relación entre tratamientos fue la siguiente: SB>GLUT>MET>Lavado>HM. 62 8. DISCUSIÓN En el presente trabajo se ha desarrollado y estandarizado un nuevo método asistido por ordenador (CASMA) que permite por primera vez el estudio simultáneo de la cabeza y el acrosoma espermáticos en morueco. Los sistemas de análisis de la morfometría espermática asistida por ordenador (CASMA o ASMA, computer assisted sperm morphometry analysis); (Davis y col., 1992; Kruger y col., 1993) se desarrollaron para reducir la subjetividad de la evaluación de la morfología espermática. Se ha demostrado en algunos estudios que existen relaciones entre las dimensiones de la cabeza espermática evaluada mediante sistemas CASMA y la fertilidad en caballos (Casey y col., 1997), toros (Sailer y col., 1996; Ostenmeier y col., 2001) y verracos (Hirai y col., 2001), aunque en otros trabajos esta relación no era tan clara (Gravance y col., 2009; Marco-Jiménez y col., 2006). Los métodos clásicos de tinción y análisis CASMA solamente han permitido evaluar la morfometría del acrosoma en unas pocas especies, como la humana (Soler y col., 2003; Falzone y col., 2010) y la canina (Nuñez y col., 2005). Estas medidas requieren una distinción clara de los límites y un buen contraste entre los de las diferentes partes del espermatozoide, que es difícil de alcanzar en algunas especies, como la ovina. Sin embargo, el acrosoma es esencial para la función espermática. Para completar el proceso natural de la fecundación, los espermatozoides deben tener movilidad, capacitarse y desarrollar la reacción acrosómica para atravesar la zona pelúcida. Por lo tanto, el estudio de la morfometría del acrosoma puede tener relevancia funcional Liu y Baker (1988) y Menkveld y col. (1996) demostraron que la morfología normal del acrosoma se correlaciona significativamente con la unión del espermatozoide a la zona pelúcida, mientras que Franken y col. (1997) demostraron que existe una fuerte relación entre la morfología espermática normal y la capacidad de inducir la reacción acrosómica. En la especie humana se ha demostrado que existe una relación entre el tamaño del acrosoma y la funcionalidad, observando que los espermatozoides con acrosomas pequeños tenían más probabilidad de morir y de perder el acrosoma de manera no fisiológica (Menkveld y col., 2003). También en nuestra especie, el porcentaje de espermatozoides con tamaños del acrosoma normal (40–70% del área total de la cabeza), se ha correlacionado con la probabilidad de fecundación (El-Ghobashy y West, 2003). Para conseguir realizar una evaluación morfométrica del acrosoma espermático en morueco, en este trabajo hemos seguido un doble enfoque. Por un lado se ha modificado la óptica del microscopio buscando aumentar el contraste entre la cabeza y el acrosoma. Por otro lado se han comparado diferentes tratamientos sobre las muestras con el mismo objetivo. De los resultados se concluye que la modificación de la óptica permite capturar el acrosoma con bastante eficiencia en frotis lavados con agua destilada. La fijación con glutaraldehido o metanol empeoró los resultados 63 de captura, posiblemente debido a la mayor presencia de artefactos, que pudieron contribuir a una menor precisión en la captura. La tinción con Hemacolor y Spermblue permitió mejorar la proporción de espermatozoides correctamente analizados, por lo que lo óptimo sería combinar la modificación de la óptica del microscopio y uno de estos dos tratamientos. Los principales limitantes de los sistemas CASMA son que requieren mucho tiempo y que los resultados son variables en función de numerosos factores. Entre los factores de variación tenemos la preparación de las muestras, la fijación y tinción de los espermatozoides, los ajustes del programa informático de análisis, etc. (Davis y Gravance, 1993; Holt y col., 1994; Gravance y Lewis, 1995; Gravance y col., 1995, 1998; Sancho y col., 1998; Boersma y col., 1999, 2001; Verstegen y col., 2002, Hidalgo y col., 2005, Yániz y col., 2012). Para reducir esta variabilidad, se han hecho algunos esfuerzos de estandarización de la metodología en algunas especies (Gravance y col., 1998; García Herreros y col., 2006; Maroto Morales y col., 2009). Al igual que en el resto de medidas morfométricas de la cabeza del espermatozoide, el tratamiento tuvo en el presente trabajo un efecto importante sobre las dimensiones del acrosoma y la proporción de la cabeza ocupada por el mismo. En conclusión, en este Trabajo Fin de Carrera se ha desarrollado y estandarizado un nuevo método asistido por ordenador que permite por primera vez el estudio simultáneo de la cabeza y el acrosoma espermáticos en morueco. Este método abre nuevas posibilidades para la realización de estudios funcionales, y para la selección de machos y eyaculados en inseminación artificial. 64 9. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos en este estudio, expuestos en este documento, se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Se ha desarrollado y estandarizado un método, basado en la modificación de la óptica del microscopio y en tratamientos sobre las muestras, que permite por primera vez el estudio de la morfometría de la cabeza y el acrosoma espermáticos en la especie ovina. 2. . La utilización del filtro de contraste de fases, lejos de mejorar la calidad de las imágenes, provocó la aparición de artefactos, con la presencia de halos alrededor de los espermatozoides. Como consecuencia, la captura de las imágenes no fue tan precisa y el filtro modificó los parámetros morfométricos obtenidos, reduciendo las dimensiones de cabeza y acrosoma. 3. Independientemente de la utilización del filtro, los grupos con peores resultados fueron los fijados con glutaraldehido y metanol, por debajo del 90% de espermatozoides correctamente analizados. En el grupo lavado con agua, la captura se situó en torno al 90%, mientras que la tinción de las muestras con Hemacolor o SpermBlue permitió mejorar la proporción de espermatozoides correctamente analizados. 4. El tratamiento de las muestras tuvo un efecto significativo sobre todas las medidas morfométricas. Para la mayoría de los parámetros morfométricos primarios (área, perímetro, longitud y anchura de la cabeza) la relación entre tratamientos podría definirse de la siguiente manera: GLUT>HM>MET>SB>Lavado. Las únicas excepciones fueron la anchura de la cabeza (para la que el SB fue mayor que el MET) y la longitud que fue similar entre el SB y el lavado 5. El tratamiento también tuvo un efecto claro sobre las dimensiones del acrosoma y la proporción de la cabeza ocupada por el mismo. Para el área del acrosoma la relación entre los distintos tratamientos fue muy parecida a la descrita para los parámetros primarios de la cabeza espermática, excepto que la relación entre el Hemacolor y el metanol se invirtió. 6. Cuando estudiamos la proporción de la cabeza del espermatozoide cubierta por el acrosoma, la relación entre tratamientos fue la siguiente: SB>GLUT>MET>Lavado>HM. 65 10. BIBLIOGRAFÍA Abraham, A., Agranz, A. (1987). Caprinotecnia, II: 1571-665. Álvarez, J. (2003). Análisis integrado de morfología y movilidad espermática humana con el uso del sperm class analyzer. Departamento de biología funcional y antropología física. Universidad de Valencia. Amann, RP., Hay, SR, Hammersted, RH. Yield characteristics, motility and cAMP content of sperm isolated from seven regions of ram epididymis. Biol. Reprod. 27, (1982) 723-733. Amelar RD, Dubin L, Schoenfeld C. Sperm motility. Fertil Steril. 1980 Sep;34(3):197- 215. 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