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PROYECTO FINAL DE CARRERA INGENIERÍA TECNICA INDUSTRIAL MECÁNICA CURSO 2011 – 2012. DESARROLLO DE ENCAPSULADOS PARA CHIPS DE MICROFLUÍDICA DEDICADOS AL CULTIVO CELULAR Mirko Antonio Cabrera Arenas JUNIO 2012 Directora: Rosa María Monge Prieto Ponente: Luis J. Fernandez Ledesma DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA MECÁNICA ESCUELA DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA. Con la disculpa de mis hijos siento la necesidad de dedicar este trabajo a las dos Yolanda de mi vida: mi madre y mi esposa. RESUMEN El marco general de este proyecto se sitúa sobre uno mayor cuyo objetivo es el desarrollo de nuevas herramientas de cultivo celular basadas en microtecnologías para la consecución de nuevas vías de ensayo y experimentación que permitan reducir la experimentación con animales y optimizar el desarrollo de nuevos fármacos a través de pruebas de test masivo. De este modo se buscan generar nuevas técnicas para la experimentación “in-vitro” en condiciones lo más parecidas a las “in-vivo”. Estas condiciones “in-vivo” se simulan mediante el desarrollo de chips microfluídicos basados en tecnologías de litografía de SU-8.Estos chips, donde se depositan las células vivas, tienen un tamaño de 1 cm de largo por 1 cm de ancho y con una disposición interna (cámaras, canales, etc.) aún menor (del orden de los 100 micrómetros o inferior). He aquí donde se ha de enmarcar el objetivo del presente trabajo: el desarrollo de una interfaz mecánica que conecte los elementos externos necesarios para la supervivencia de las células (fluidos, nutrientes, oxígeno, etc.) con los microcanales y cámaras que contienen a los organismos vivos. Esto es, diseñar y fabricar unos encapsulados que conecten el entorno macro manipulado por el investigador con las condiciones micro en las que viven las células. 6 Fig. 19 Diseño en Solid Edge de la base del encapsulado. 28 Fig. 20 Detalle del diseño de las guías de alineación. 29 Fig. 21 Guías de alineación en la base. 29 Fig. 22 Primer diseño con bisagras. 30 Fig. 23 Detalle de la bisagra fabricada con el mismo material de prototipado rápido. 31 Fig. 24 Banco de pruebas para los tubos capilares y su mejor adhesión al material de prototipado. 32 Fig. 25 Medidas del agujero óptimo encontrado en el banco de pruebas. 32 Fig. 26 Diseño en Solid Edge del encapsulado con las entradas y salidas para tubo capilar. 33 Fig. 27 Diseño en Solid Edge del encapsulado con las entradas y salidas tipo entrada rápida. 34 Fig. 28 Imágenes de las entradas rápidas rotas y dobladas durante su aplicación real. 34 Fig. 29 Diseño en Solid Edge del encapsulado con las entradas y salidas tipo entrada rápida dentro del cuerpo del encapsulado. 35 Fig. 30 Imagen del último prototipo fabricado. 36 Fig. 31 Imagen de las pinzas sobre el prototipo fabricado. 38 Fig. 32 Diseño inicial del encapsulado de encapsulado. 38 Fig. 33 Diseño e imagen del primer modelo de reservorio. 45 Fig. 34 Modelo final de reservorio. 46 Fig. 35 Piezas de interconexión reemplazando la posición de las electroválvulas. 47 Fig. 36 Piezas en T y tridente. 48 7 8 9 PARTE I MEMORIA 10 11 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN. 1.1. Objetivos generales. El presente proyecto de fin de carrera se enmarca en un proyecto de investigación más general, cuyo objetivo es el desarrollo de nuevas herramientas de cultivo celular basadas en microtecnologías para la consecución de nuevas vías de ensayo y experimentación que permitan reducir el estudio que hace uso de animales y optimizar el desarrollo de nuevos fármacos a través de pruebas de test masivo. De este modo se buscan generar nuevas técnicas para la experimentación “in-vitro” en condiciones lo más parecidas a las “in-vivo”. La preservación de las condiciones mecánicas, bioquímicas y térmicas ha sido ya probada como un factor clave para el estudio de muestras biológicas. El proyecto general se establece pues sobre la hipótesis de que la imitación de las condiciones “invivo” de las células es crucial para su correcto estudio y posterior desarrollo. La mayoría de las células tiende a modificar sus funciones biológicas específicas fuera de su ambiente natural (desdiferenciación, apoptosis, producción nula de tejido o de baja calidad, etc.), siendo por tanto imposible entender correctamente sus propiedades básicas o su reacción a la presencia de ciertos fármacos “in-vivo”. Para cumplir dicho objetivo, este proyecto pretende la integración de tres especialidades industriales diferentes (microtecnología, electrónica y encapsulado) junto con una aplicación biológica para el desarrollo de nuevos dispositivos altamente innovadores capaces de ser rápidamente transferidos a la industria. Esta aproximación biomimética se realizará a través de avanzados métodos de ciencia de los materiales, técnicas de simulación y modelado, ingeniería, biología celular y fisiología animal. Las condiciones “in-vivo” se simulan mediante el desarrollo de chips microfluídicos basados en tecnologías de litografía de SU-8.Este material es un polímero muy viscoso con el que se pueden obtener espesores que oscilan desde 1 micra hasta 300 micras y aun así se puede procesar mediante litografía de contacto. Tienen una capacidad máxima de absorción para valores de longitud de onda de 365ηm. 12 1.2. Objetivo del proyecto. El desarrollo completo del marco global del proyecto general consta de tres partes bien entendidas: desarrollo y fabricación de los chips, diseño de los encapsulados para los chips de microfluídica y configuración del setup fluídico (figuras 1 y 2). Fig. 1 Chip, encapsulado y electrónica de control. En los chips, donde se depositan las células vivas, se mantienen las dimensiones más adecuadas para la supervivencia de las mismas, con un tamaño de 1cm de largo por 1cm de ancho y con una disposición interna (cámaras, canales, etc.) aún menor (del orden de los 100 micrómetros o inferior). Una de las partes a completar en el proyecto global era el desarrollo de los encapsulados para la conexión macro-micro, es decir, a través de estos encapsulados, poder acceder al chip y proporcionarle a las células las condiciones necesarias para su cultivo. He aquí donde se ha de enmarcar el objetivo del presente trabajo: el desarrollo de una interfaz mecánica que conecte los elementos externos necesarios para la supervivencia de las células (fluidos, nutrientes, oxígeno, etc.) con los microcanales y cámaras que contienen a los organismos vivos. Fig. 2 Setup microfluídico. 13 El objetivo final de este proyecto de fin de carrera es diseñar y fabricar piezas que conecten el entorno macro manipulado por el investigador con las condiciones micro en las que viven las células. El setup fluídico (Fig. 2) consta de dos partes: una la mecánica (diseño y fabricación) y otra la electrónica (control de los flujos internos). En este proyecto se desdibujará toda la parte mecánica del setup. Su realización se basará principalmente en la experimentación y en el formato “prueba y error”, formato sobre el que se ha diseñado la evolución de los distintos modelos de encapsulado (tal y como se describen en el Capítulo 3 Evolución de los diseños); esto es, ir optimizando, por medio de una mejora iterativa del producto en la fase de desarrollo, los aspectos estéticos y de compatibilidad con el resto de piezas existentes en el mismo proyecto antes de la obtención del producto final. La fabricación de los encapsulados para los diferentes chips se hará mediante técnicas de prototipado rápido [1]. Este tipo de fabricación se realiza mediante sinterizado de resina y esto permite una mayor repetibilidad y reproducibilidad. Para su diseño se eligió el desarrollo en Solid Edge Student Edition [2] de distribución gratuita. El prototipado rápido es un proceso utilizado para fabricar artículos de plástico, metal o cerámica, también conocido como Additive Technology, ya que su proceso de fabricación consiste en ir añadiendo material capa a capa. Generalmente el prototipado rápido sólo se usa para la fabricación de prototipos. El material que se ha utilizado en la fabricación es el FullCure 720 [3]. Éste es el material original desarrollado para los sistemas de impresión 3D de Objet que incorporan la tecnología PolyJet™. El material FullCure Transparent es un material fotopolímero y acrílico de aspecto transparente que permite construir una amplia gama de modelos rígidos que permiten observar el flujo de líquidos y detalles internos. Cabe señalar que el material de fabricación de estos prototipos (actualmente en análisis en el laboratorio de materiales) no era el más adecuado por sus propiedades pero si por su bajo coste. Así, durante el desarrollo del proyecto, los diversos diseños que más adelante se describen (Capítulo 3 Evolución de los diseños) se fabricaron en este material, surgiendo serios inconvenientes con la solidez del mismo sobretodo al momento de variar el ambiente de trabajo, pues tanto los cambios de temperatura como los de humedad ocasionaban una tendencia a la deformación y/o rotura de las piezas y partes fabricadas. Sin embargo, al estar sujetos a la constante evolución del diseño y estar expuesta a muchos cambios y a probables errores durante la experimentación, la necesidad de velar por la disminución de costes era prioritaria. Por tanto, como ya se ha señalado, su elección se basa en un aspecto básicamente económico. 14 15 CAPÍTULO 2. ACERCAMIENTO AL MARCO GLOBAL DEL PROYECTO. 2.1. Funcionamiento general. Los experimentos a realizar con el sistema que se describe en este proyecto se realizan con células, las cuales precisan de condiciones especiales de temperatura, humedad, oxigeno, etc. Asimismo es necesario un correcto control del caudal que pasa a través del chip donde se alojan y una adecuada configuración de las vías que llevan los fluidos hasta él. El objetivo general del sistema es el de mantener las condiciones adecuadas para la supervivencia de las células contenidas en el chip. Fig. 3 Forma final de los elementos mecánicos que conforman el sistema. Así, el setup fluídico completo (Fig. 5) del sistema a desarrollar consta de un reservorio contenedor del medio con los nutrientes necesarios para las células, de la microbomba impulsora del fluido almacenado en el reservorio, del chip microfluídico y el encapsulado que lo contiene. Se puede encontrar un análisis más detallado del reservorio en el Anexo A.1. 22 Fig. 12 Fase de sembrado de células. Fig. 13 Fase de perfusión. Fase 2: sembrado de células Fase 3: perfusión 23 CAPÍTULO 3. EVOLUCIÓN DE LOS DISEÑOS. 3.1. Estado del arte. La idea inicial para el trabajo es la de tener un elemento que nos aloje el chip protegiéndolo y que conecte a su vez con las diversas partes del circuito sin que existan pérdidas de fluido ni interferencias en su recorrido. Es además una exigencia que el circuito cumpla con ser cerrado herméticamente, pudiendo al mismo tiempo ser observado desde fuera (con microscopio, por ejemplo). En el mercado podían hallarse modelos de encapsulados próximos a los deseables en un primer momento para la aplicación, pero la versatilidad que se presentaba al momento de poder realizar diseños de ‘marca propia’ que se pudiesen modificar según las propias necesidades del proyecto global (actuales o futuras) y sobretodo el valor agregado del conocimiento adquirido durante el desarrollo de los diferentes prototipos inclinó a la decisión de fabricar los encapsulados por cuenta propia. Fig. 14 Encapsulado de IKERLAN [7] próximo a las condiciones deseadas para el diseño del encapsulado requerido. 24 El encapsulado, diseñado con anterioridad y a partir del cual se desarrollaron las posteriores mejoras, consiste en una base y una tapa por separado unidas por medio de tornillos (Fig. 15): la base, que aloja al chip y permite, a través de una abertura inferior, su visualización, imprescindible para el estudio del comportamiento de las células; y la tapa en donde se construyen las vías que conectan con los tubos externos, unidos al encapsulado por medio de conectores rápidos. Fig. 15 Diseño inicial con uso de tornillos y conectores rápidos. En la tapa además se encuentran agujeros diseñados para alojar las juntas tóricas de silicona (o’rings) con las cuales conseguimos el hermetismo del circuito; colocadas a presión, estas arandelas evitan además la fuga de fluido. La presión necesaria entre el chip y el encapsulado la da, inicialmente, una base de pyrex que sirve de asiento a la vez al propio chip. A través de la ventana inferior de la base del encapsulado se ve, con ayuda de un microscopio de mano de Motic [8], el pyrex, el chip y la correcta alineación entre los o’rings alojados en la tapa y los agujeros del chip ubicado en la base (Fig.16). La falta de alineación entre o’rings y agujeros ocasiona obstrucciones que impiden el correcto flujo de nutrientes y, por tanto, un mal funcionamiento del sistema. 25 Fig. 16 Imagen del microcopio [8] y de la correcta alineación entre los o’rings y los agujeros de la base. Este primer modelo cumple con los requisitos iniciales de alojar y proteger al chip, al mismo tiempo que se mantiene el hermetismo, pero es poco práctico en el modo de acceder al chip, al tener que retirar y poner seis tornillos para cada manipulación del mismo o para corregir los errores de alineación. Esta alineación era uno de los problemas iniciales que surgían al momento de hacer coincidir las partes superior e inferior del encapsulado y sobre el cual se ahondará más en el Capítulo 3.3. 3.2. Elementos básicos que componen el encapsulado. 3.2.1. La tapa. Es la parte superior del encapsulado, con las dimensiones adecuadas (Anexos B.1. y B.2.) para coincidir con la base y a su vez alojar las conexiones con los tubos que conducen los fluidos desde el exterior. De geometría simétrica, inicialmente esta tapa estaba diseñada con seis agujeros pasantes para los tornillos de cierre y con otros dos agujeros centrales un poco más grandes diseñados, en un primer momento, para la colocación de guías de alineación entre la tapa y la base. Para la tapa se diseñaron dos posibles configuraciones a utilizar: 3.2.1.1. Con entradas y salidas paralelas. Tal como se ha mencionado, una de las condiciones iniciales de diseño es que el encapsulado sea hermético para evitar la contaminación exterior y para la correcta distribución de los fluidos. El acceso a las cámaras del interior del chip debe de ejecutarse de un modo automático, por medio de la electrónica adecuada. Es por este motivo que tanto las 26 entradas como las salidas deben estar conectadas de modo permanente a sistemas de control (electroválvulas) que gobiernen los flujos que circulan a través del chip, de modo que el personal investigador elija, por medio de ellas, los canales adecuados para cada experimento seleccionando las electroválvulas según correspondan. Con esta intención se diseñaron entradas y salidas paralelas que conectan directamente con el chip. Estas entradas y salidas guardan simetría, se trata de tres agujeros ubicados en dos caras laterales opuestas y que guardan la distancia adecuada para alojar conectores rápidos unidos a los tubos conductores de fluido (Fig. 17). Por dentro el conducto disminuye de diámetro pues el caudal que debe llegar al chip es muy pequeño. Asimismo se ha tenido en cuenta, con el fin de evitar posibles turbulencias, que el diseño contenga la menor cantidad posible de codos. Fig. 17 Diseño en Solid Edge de la tapa del encapsulado utilizando tres entradas y tres salidas horizontales “paralelas”. 3.2.1.2. Con entrada para pipeta. Con la finalidad de realizar el sembrado de las células de una forma más rápida, sencilla y eficiente durante la experimentación en laboratorio, se ha diseñado también la tapa con una entrada especial para pipeta. Esta entrada tiene la necesidad de ser vertical, por la comodidad de la aplicación de la pipeta en sí y para aprovechar el efecto de la gravedad. Para este caso las entradas y salidas ya no guardan simetría. Tenemos ahora dos agujeros de entrada enfrentados a tres de salida en dos caras laterales opuestas. La distancia sigue siendo la adecuada para 27 los conectores rápidos y los conductos disminuyen de diámetro igual que en caso anterior (Fig. 18). El cambio que encontramos es la entrada especial de pipeta ubicada en la parte superior de la tapa con una medida distinta a la de los conectores rápidos (1,7mm en comparación del resto de agujeros de 2,25mm) y con una profundidad (1mm) adecuada para que la pipeta se mantenga siempre vertical. El cambio de diámetro del conducto también es distinto al resto. Fig. 18 Diseño en Solid Edge de la tapa del encapsulado utilizando dos entradas horizontales y una vertical para pipeta. 3.2.2. La base. Esta pieza, común a las dos configuraciones diseñadas para la tapa, es la correspondiente a la parte inferior del encapsulado. Posee un alojamiento que sirve para la colocación del pyrex y del chip, con una ventana inferior diseñada con la intención de que el investigador pueda ejercer un control visual de los eventos que ocurran dentro (Fig.19). De medidas de 1cm por 1cm, este alojamiento varia únicamente en su altura siendo utilizadas, durante las distintas etapas de desarrollo, alturas de 700µm, 800µm, 900µm y 1mm, dependiendo de la altura del chip. La completan los seis agujeros de los tornillos de cierre y los dos correspondientes a las guías mencionadas en la descripción de la tapa (Capítulo 3.2.1.) 28 Fig. 19 Diseño en Solid Edge de la base del encapsulado. 3.3. Alineación entre los o’rings y los agujeros del chip. El primer problema a resolver ha sido el de la alineación de la base que aloja al chip y la tapa en donde se encuentran los conductos fluídicos. El problema se presentaba al momento de hacer coincidir las juntas tóricas (o’rings) con los agujeros del chip, pues muchas veces las juntas obstruían los agujeros (Fig. 16) ocasionando la interrupción del flujo. Esto conllevaba a una pérdida de tiempo, al tener que separar la tapa de la base (unidas por seis tornillos) y reacomodar el chip para volver a probar. Como ya se ha mencionado, una primera idea sugería la inclusión de guías en los extremos del encapsulado de modo que base y tapa mantuviesen una permanente alineación vertical, pero su aplicación era complicada de manipular (para acceder al chip, por ejemplo). La solución requeriría de un nuevo elemento de diseño de modo que se pensó en guías de alineación para el chip (Fig. 20) en lugar de la idea de alinear todo el conjunto base-tapa. El chip, que sobresale unas micras fuera del agujero diseñado en la base para que los o’rings puedan ejercer presión sobre él, tenía demasiada libertad de movimiento lo que ocasionaba que no siempre estuviera en la misma posición al momento de colocarle las juntas tóricas sobre él. De modo que se diseñaron unos salientes en la base y los correspondientes agujeros en la tapa. Esto nos asegura que base y tapa siempre encajan en una posición correcta con una holgura mínima (la tolerancia entre los salientes y sus respectivos agujeros es de 0,4mm, lo que se puede ver reflejado en los diseños del Anexo B). Además, al colocar los salientes en la base y no al revés, sirven de guías para colocar al chip en una posición única. 29 Fig. 20 Detalle del diseño de las guías de alineación. Este añadido generó una importante mejora cualitativa en cuanto a que la colocación del chip era ahora única y siempre coincidente con las vías conductoras de los fluidos necesarios para la experimentación con células, ganando de este modo en tiempo y manipulación al no tener que verificar esta alineación cada vez que el chip era colocado, pues como ya se ha dicho hay que considerar que hasta este punto, cuando se colocaba o retiraba el chip, era necesario poner o quitar seis tornillos, luego, el hecho de no tener que abrir y cerrar para calibrar esta alineación significaba un gran ahorro de tiempo. Fig. 21 Guías de alineación en la base. En este punto se tiene un encapsulado que cumple con los requisitos de hermetismo, protección y alineación, pero que aún es poco práctico en su manipulación. El uso de seis tornillos para el cierre y apertura del conjunto resulta seguro pero implica un gasto de tiempo con el que se prefiere no contar, es por ello que a partir de este punto se buscan mejoras en cuanto al modo en que se abre y cierra el encapsulado. 30 3.4. Diseño con bisagras. La siguiente idea de mejora, es la de unir la base y la tapa en una de sus aristas y cerrar el encapsulado por medio de pasadores metálicos. Estos pasadores reemplazarán a los tornillos como sistema de cierre y apertura del encapsulado. Para la elección del material de los pasadores a utilizar hay que considerar que el encapsulado, una vez cerrado, es sometido a cambios de temperatura y humedad (autoclave y biorreactor) por lo que dicho material debe estar protegido de la corrosión, en este sentido la mejor elección era el acero inoxidable, para cumplir con las condiciones dadas, por costes y por la facilidad de encontrarlo en el mercado. Fig. 22 Primer diseño con bisagras. Un primer planteamiento se diseñó manteniendo la base y la tapa por separado pero agregando al diseño los agujeros para los pasadores que cumplen el papel de bisagras y eliminando los tornillos del prototipo inicial (Fig. 22). Esto significa un ahorro en material de fabricación, pues el nuevo diseño es de menor volumen en comparación al descrito en el Capítulo 3.1; al tiempo que se añade otra mejora, dado que la apertura y el cierre del encapsulado se realizarían ahora de una manera más práctica. Este diseño, que se acercaba más al modelo deseado, funcionaba bien, pero ocasionaba una disminución de la presión sobre el encapsulado al tener como cierre dos pasadores y ya no seis tornillos. El material a su vez se deformaba en el centro al elevarse la temperatura (condición necesaria para los procesos biológicos a los que se someterían las células) cosa que se notaba menos con los tornillos pues distribuían la presión por todo el encapsulado y no sólo en las aristas, donde se encuentran los pasadores, como ahora. La solución para la deformación del material pasaría a ser analizada para darle solución por otra vía (véase el Capítulo 6 Conclusiones y trabajo futuro). 31 Otro problema era el uso de un pasador metálico como bisagra, pues resulta poco útil y añade un elemento de desgaste para el material con el que es preferible no contar. Fig. 23 Detalle de la bisagra fabricada con el mismo material de prototipado rápido. Esto se solucionó fabricando la bisagra con el mismo material de prototipado rápido (Fig. 23), por lo que se decidió unir ambas piezas (tapa y base) en una sola. El pasador de acero inoxidable se ha de utilizar únicamente para el cierre del encapsulado. Solucionado el problema de la bisagra, aunque con el inconveniente de la deformación del material, se debía ahora enfocar el diseño en solucionar otro inconveniente: disminuir el volumen muerto en los tubos de todo el circuito. 3.5. Tubos capilares. Tal y como se mencionó en el estado del arte (3.1), los fluidos que ingresan al chip a través del encapsulado, lo hacen por medio de conectores rápidos los cuales se unen con tubos al resto del circuito. Estos conectores y tubos, aunque prácticos, ocasionan que el volumen muerto en todo el circuito sea bastante significativo. Se busca pues disminuir el diámetro de todos los tubos del circuito, de modo que en las interconexiones entre reservorio, microbomba y encapsulado disminuyese el problema del volumen muerto. El enfoque se orientó hacia el uso de tubos capilares de 0,3mm de diámetro interno y 0,6mm de diámetro externo. Estos tubos distribuidos por Bola [9] fueron previamente ensayados en bancos de prueba a fin de buscar la forma idónea de pegarlo al encapsulado (el detalle del diseño de este banco de pruebas puede apreciarse en el Anexo B.4). Con el fin de mantener la mayor esterilidad posible, el pegamento a utilizar para unir el tubo capilar al encapsulado fue LOCTITE de uso médico. 38 Fig. 31 Imagen de las pinzas sobre el prototipo fabricado. En ese sentido las soluciones posibles son bastante claras: diseñar un encapsulado de encapsulado en un material no deformable (acero inoxidable, por ejemplo) de modo que se elimine el uso de estas pinzas y se evite la deformación del encapsulado primero o bien desarrollar un diseño más robusto a partir del encapsulado actual. Un prototipo del encapsulado de encapsulado (Fig. 32) se empezó a realizar durante el transcurso del presente proyecto de fin de carrera, pero no llegó a concluirse pues su fabricación debía ser exacta, lo cual conllevaba a una mayor cantidad de pruebas. Al mismo tiempo faltaban de analizarse más opciones que pudiesen solucionar este mismo problema. Fig. 32 Diseño inicial del encapsulado de encapsulado. Otro punto sobre el que se sigue investigando es acerca de las propiedades del material de prototipado. Éste material ofrece las ventajas mencionadas en cuanto a disminución de gastos pero genera problemas en torno a su aplicabilidad en entornos de 39 cambios de temperatura y humedad por ser excesivamente propenso a las deformaciones. Caben señalar otras mejoras posibles que, aunque no forman parte del proyecto en particular que aquí se detalla, forman parte del proyecto global. Estas mejoras serían por ejemplo la inclusión de válvulas en reemplazo del sistema existente con piezas de interconexión manual (Anexo A.2.) con sus respectivos lazos de control, así como la integración de todas las partes dentro de una única plataforma que las contenga. 4.3. Conclusiones personales. Mi participación en el proyecto general me ha permitido conocer de cerca todo un campo de la ciencia para mi desconocido como es el de las aplicaciones microfluídicas en bioingeniería. El desarrollo del diseño y la fabricación de los encapsulados ha ampliado en gran medida mis conocimientos en cuanto a diseño se refiere, a la vez que ha puesto a prueba mi capacidad de inventiva a la hora de resolver los problemas puntuales que se fueron presentando durante el camino. Por último, pero no menos importante, he de agregar que el carácter multidisciplinar de este proyecto (en donde he coincidido durante su ejecución con electrónicos y biólogos) incrementa el valor de los avances logrados al tratarse de un trabajo de coordinación y entendimiento en grupo. 40 41 BIBLIOGRAFÍA. [1]. http://es.wikipedia.org/wiki/Prototipado_r%C3%A1pido [2]. http://www.plm.automation.siemens.com/en_us/products/velocity/forms/solidedge-student.cfm [3]. http://www.skeg.com/FullCure720.pdf [4]. http://www.bartels-mikrotechnik.de/index.php/Micropumps.html [5]. http://www.ebersmedical.com/products/teb1000-bioreactor [6]. http://www.biochemfluidics.com/Products/pinch-Valves.asp [7]. http://www.ikerlan.es/site_preview/index.php [8]. http://www.motic.com/Home.aspx?r=eur&lang=sp [9]. http://www.bola.de/en/home.html 42 43 PARTE II ANEXOS 44 45 ANEXO A. PIEZAS COMPLEMENTARIAS. A.1. Reservorio. Dentro del circuito uno de los elementos a trabajar fue el reservorio el cual servía para el almacenamiento del medio con los nutrientes necesarios para los experimentos con las células. El requisito fundamental de su diseño era el volumen adecuado para mantener el circuito siempre con fluido, esto es, alcanzar un volumen correcto para el funcionamiento del setup completo, sin que este volumen fuese innecesariamente alto pues aumentarlo en demasía entraría en contra de la necesidad de reducir recursos. De una geometría simple, el primer modelo de reservorio era cilíndrico, con una entrada y una salida preparadas para alojar conectores rápidos y separadas por un barrido de 90º, con dos aberturas en la cara superior para la colocación de filtros de partículas en el aire y de oxigeno (Fig. 33). Fig. 33 Diseño e imagen del primer modelo de reservorio. Sin embargo durante el transcurso del trabajo de laboratorio se comprobó que la altura del volumen depositado influía en las mediciones del caudal: a mayor altura el fluido en el sistema se adquiría una mayor velocidad del caudal por efecto de la 46 gravedad. Esto hizo pensar que lo más conveniente era rediseñar el reservorio para que este fuera lo más alargado posible de modo que las variaciones de altura dentro de él fuesen despreciables (esto claro al trabajar en circuito abierto para pruebas de laboratorio, pues el modelo final se deseaba para un circuito cerrado). El modelo final de reservorio era un paralelepípedo de similares características, en cuanto a volumen, que su predecesor cilíndrico, con agujeros para los filtros de aire y oxígeno y cambiando además el tipo de entradas, utilizándose las entradas rápidas descritas en el Capítulo 3.7 (Fig. 34). Fig. 34 Modelo final de reservorio. A.2. Pieza de interconexión. Durante el desarrollo de las diversas pruebas hizo falta una pieza que reemplazara a las válvulas mientras éstas estaban en su fase de calibración y prueba. Se decidió diseñar una pieza a la que se le pudiesen acoplar los conectores rápidos con seis por un lado y tres por el otro, de modo que existiesen tres agujeros pasantes y tres agujeros ciegos (Fig. 35). La microbomba se conecta por el lado de los tres conectores al que interesase, dependiendo del experimento a realizar, y el encapsulado se configuraría igualmente en entradas abiertas o cerradas según se necesitase uniéndose a los puntos adecuados por el lado de los seis conectores. Con esta pieza, que no pertenece al circuito final pues éste está pensado para funcionar con electroválvulas, se controla la entrada de fluido para los diferentes canales de entrada/salida de un modo manual. 47 Fig. 35 Piezas de interconexión reemplazando la posición de las electroválvulas. Este primer diseño también ha cambiado para su uso ya no con conectores rápidos (Fig. 15 en el Capitulo 3.1) sino con entradas rápidas (Capítulo 3.7.) A.3. Pieza en T y en tridente. Otro de los accesorios que hubo de utilizarse para las pruebas fueron las piezas de bifurcación de fluido: una pieza en T (una entrada, dos salidas) y otro en forma de tridente (una entrada, tres salidas) que se pueden ver en la Fig. 36. La primera se pensó con la finalidad de disminuir el caudal que circula a través del chip a fin de lograr alcanzar los valores deseados (entre 1µl y 10µl), esto es, que cumpla el papel de un bypass que redujese el flujo circulante por el chip. La segunda tiene la intención de dividir el flujo para que todos los canales del chip (los tres de entrada y los tres de salida) estén cebados de tal manera que haciendo uso de la pieza de interconexión (Anexo A.2.) y, en un futuro, de las electroválvulas, se defina cuáles entradas o salidas van a usarse. Estas piezas, al igual que el reservorio y la pieza de interconexión, se han modificado para su uso con entradas rápidas (Capítulo 3.7). Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Tapa_pipeta_detalle_interior.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Tapa entrada pipeta: Detalle interior Mirko Cabrera 54 D DETALLE D 1,7 1 2,8 5,5 8,9 0,6 3 ANEXO B.2.1 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Base.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Base de encapsulado Mirko Cabrera 55 F DETALLE F 10 0,4 EDETALLE E 40 33 3 0,4 0,7 O 3,5 O4 3 2 ANEXO B.3. 7,2 8,6 7,2 8,6 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Prueba_capilares.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Banco de pruebas tubos capilares Mirko Cabrera 56 18 2 G 0,4O0,5O0,6O0,5O0,5O0,5O0,4O0,4O0,4O 1O 2 3 2 1 DETALLE G 8 ANEXO B.4. 4 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_tubos_capilares.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Encapsulado con tubos capilares Mirko Cabrera 57 25 65 1818 5 55 5 4,65,2 5,4 4,6 25 7,2 O 3,2 R3,5 O3,2 R3 ,5 R3,5 ANEXO B.5. 5,4 18 O1,7 2 7 2 6 3 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_entradas_rapidas.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Encapsulado con entradas rápidas Mirko Cabrera 58 O3,2 R3, 5 O3,2 R3,5 R3,5 5 5 5 5 25 7,2 5,2 4,6 5,4 4,6 25 4 O 1,6 18 65 18272 18 3,5 6 3 5,5 ANEXO B.6. Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_microfluidico.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Encapsulado microfluídico con entradas y salidas paralelas Mirko Cabrera 59 O 3,2 R3,5 O 4,6 O 1,6 O 3,2 R3,5 R3,5 5 5 5 5 25 5,2 4,6 5,4 4,6 25 18 6 3 65 27218 4 5,5 4,5 4,5 5,5 ANEXO B.7. Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_microfluidico_detalle.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 17/05/12 Solid Edge ST Encapsulado entradas paralelas: Detalle Mirko Cabrera 60 ANEXO B.7.1. H DETALLE H 0,6 0,4 0,7 1 1 2 2VISTA 2-2 VISTA 1-1 IDETALLE I 2,8O 0,6 0,5O 1,6O 4,6O 8,9 3,5 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_microfluidico_2.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Encapsulado microfluídico con entrada para pipeta Mirko Cabrera 61 O 3,2 R3,5 O 1,6 O4,5 R3 ,5 O 3,2 R3,5 5 5 5 5 25 5,2 4,6 5,4 4,6 25 4 5,4 6 4,5 5,5 3 4,5 5,5 O 1,7 1827218 65 ANEXO B.8. Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Encapsulado_microfluidico_2_detalle.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 17/05/12 Solid Edge ST Encapsulado entrada pipeta: Detalle Mirko Cabrera 62 ANEXO B.8.1. 1 1 2 2VISTA 2-2 VISTA 1-1 J DETALLE J K DETALLE K 0,4 0,9 1O 1,7O 2,8O 0,6 0,5O1,6O4,5O 16,1 8,9 3,5 Revisiones Rev Descripción Fecha Aprobado Mirko Dibujado Comprobado Aprobado 1 Aprobado 2 Salvo indicación contraria cotas en milímetros ángulos en grados tolerancias ±0,5 y ±1º Nombre Fecha Siemens PLM Software Título A3 Plano Rev Archivo: Reservorio.dft Escala Peso Hoja 1 de 1 14/05/12 Solid Edge ST Reservorio Mirko Cabrera 63 27,5 20 47,5 27,5 20 15 4020 ANEXO B.9. O 4,6 O 4,6 O 6,2 O 4,4 8,7 8,7 18,1 18,1 22,5 3 12,5 3