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Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 1 TERAPIA FOTODINÁMICA ANTIMICROBIANA USANDO AZUL DE 1,9-DIMETIL-METILENO COMO FOTOSENSIBILIZANTE FRENTE A CANDIDA SPP. David Royo Diez Master de investigación en medicina, Facultad de Medicina Curso 2011/12 Trabajo fin de master Instituto de Ciencias de la Salud Hospital Miguel Servet Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 2 INDICE: -Título…..…………………………………………………………………………..1 -Indice………………………………………………………………………............2 -Introducción……………………………………………………………………….3 -Objetivos…………………………………………………………………………..7 -Material y Métodos………….……………………………………………... …….8 Cepas de estudio y condiciones de crecimiento…………….……………...8 Reactivos………………………………….………………………....……..8 Instrumentación…………………….………………………………. ……..9 Condiciones de trabajo para la TFDA……………………………………...10 Protocolo de la TFDA……………………………………………………...11 Preparación de la siembra de cada germen……………………….. .11 Preparación de las suspensiones de cada levadura………………....12 Preparación del medio de cultivo…………………………………..12 Preparación de las disoluciones madre del fotosensibilizante……. .12 Preparación de las muestras para la irradiación…………………... .13 Proceso de irradiación……………………………………………...13 Siembra de pocillos en placas SDAC………………………...….....13 Realización de las titulaciones control……………………….…….14 Recuento de unidades formadoras de colonias.……………….……14 Experimentos del estudio…………………….…………………….14 Experimentos de localización intracelular del DMM-B en levaduras……..15 -Resultados………………………………………………………………………....21 Efecto fototóxico del DMM-B en Candida spp. en función del tiempo de incubación ……………………………………………………………………….. ..21 Efecto fototóxico del DMM-B en Candida spp con curvas de concentraciones …………………………………………………………………....21 Efecto de los inhibidores de las distintas especies reactivas del oxígeno en el efecto fototóxico del en Candida spp ……………………………………………..30 Localización celular de DMM-B en Candida spp…………………………35 Discusión…………………………………………………………………………. 37 Conclusiones………………………………………………………………………39 Bibliografía……………………………………………………………………….. 39 Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 3 1.-INTRODUCCIÓN: 1.-Infecciones cutáneas: Este tipo de infecciones son muy frecuentes especialmente las causadas por bacterias y hongos. El uso indiscriminado de antibióticos ha producido el incremento de aislados bacterianos multi-resistentes, que en nuestro país, para Staphylococcus aureus resistente a meticilina suponen hasta el 25,3% del total. ( http://ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS- Net/database/Pages/table_reports.aspx). Las micosis, infecciones producidas por hongos, causan la mayoría de las infecciones producidas en la piel siendo uno de los hongos más prevalentes las levaduras. Candida spp son un tipo de levaduras causantes de infecciones que pueden ser especialmente graves en pacientes inmunodeprimidos. (VIH, trasplantados, en tratamiento con corticosteroides y pacientes oncológicos). El número de infecciones fúngicas se está incrementando en las últimas tres décadas, en realidad presentan un crecimiento exponencial. Esto se debe a una combinación entre un incremento de personas susceptibles y una escasez de fármacos antifúngicos. Candida spp, en concreto Candida albicans, causan mayores problemas ya que son habitantes comunes de la boca, faringe, tracto digestivo, piel y uñas. Estas levaduras necesitan de algún factor desequilibrante para convertirse en patógenas (1). El mecanismo por el cual causan lesiones superficiales de la mucosa es afectando a los transportadores de membrana. Además este tipo de infecciones puede verse asociada a otras dermatosis como la psoriasis o la dermatitis atópica(2,3). En la actualidad, existen una gran cantidad de antifúngicos disponibles en el mercado. El fármaco de elección depende de la especie que provoca la infección; si esta es producida por C.albicans, es muy susceptible a la mayoría de los agentes antifúngicos. El patrón de C. tropicalis y C. parasilopsis es bastante similar, con una mayor concentración inhibitoria mínima (CIM) para el fluconazol mientras que C. krusei es más resistente al fluconazol y la flucitosina(4). La etapa conocida como “era antibiótica”, que comenzó hace más de 50 años con la comercialización de la penicilina, se está agotando debido a que tanto la comercialización como la investigación de nuevos antimicrobianos se está viendo ralentizada en las últimas décadas, por lo que es necesario la investigación en terapias alternativas (5) para combatir a los agentes infecciosos (6); creemos que es necesario anticiparse para que no ocurra lo mismo con los hongos. 2.-Terapia fotodinámica: La terapia fotodinámica(TFD) es uno de los tratamientos alternativos en las infecciones sobre el cual se está investigando en mayor profundidad en los últimos años. Este tratamiento se ha utilizado primeramente frente al cáncer, en concreto como tratamiento frente a tumores sólidos, y posteriormente se investiga como terapia contra las infecciones fúngicas. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 4 La TFD se basa en la utilización de una sustancia conocida como fotosensibilizante (FS) que al combinarla con luz visible de adecuada longitud de onda y en presencia de oxígeno se producen especies reactivas de oxígeno (ROS). La especie reactiva de oxígeno que se forma depende de la vía metabólica por la cual funciona el FS (7). Estas ROS producen la muerte específica de las células tumorales por diferentes métodos; apoptosis, necrosis, autofagia o una combinación de ellas(6) preservado los tejidos sanos circundantes. La producción de una u otra vía de muerte celular depende fundamentalmente del FS utilizado, de su localización intracelular y de las estructuras celulares que resulten dañadas(11). Existen 2 vías principales por las cuáles actúan los FS: la primera de ellas (Tipo 1), implica la producción del radical superóxido e hidroxilo. La segunda vía (Tipo II) es aquella que implica la producción del oxígeno singlete el cual es capaz de dañar directamente al material biológico (6). Estas dos vías provocan diversos efectos como la inactivación de enzimas y otras proteínas o la peroxidación de lípidos provocando la lisis de membranas celulares, lisosomas y mitocondrias(8). En dermatología la TFD se ha demostrado especialmente útil debido a la accesibilidad de las lesiones cutáneas tanto a la aplicación de FS tópicos como a la administración de luz. El FS más utilizado ha sido un precursor porfirínico, el ácido aminolevulínico (ALA) y su derivado el aminolevulinato de metilo (MAL), inductores ambos de la fotosensibilización endógena de las células mediante el acúmulo intracelular de protoporfirina IX (PpIX) (9,10). La destrucción celular se puede producir mediante apoptosis, necrosis o autofagia lo que dependerá, fundamentalmente del FS utilizado, de su localización intracelular y de las estructuras celulares que resulten dañadas(11). Además del daño directo celular de la TFD, ésta induce una respuesta vascular, inmunológica y de la matriz extracelular que intervienen en su efectividad final y en su excelente resultado cosmético (12). La TFD también se utiliza en la actualidad con éxito en el acné (13). La TFD antimicrobiana (TFDA) tiene sus orígenes en los experimentos realizados por Paul Ehrlich a finales del siglo XIX; este consiguió demostrar la capacidad biocida que presentaban algunos colorantes especiales como la anilina o el azul de metileno. Realmente el padre de la TFDA fué Oscar Raab; quien documento el proceso de fotooxidación biológica sobre paramecios con el naranja de acridina (6). En la actualidad la TFD se está utilizando también como tratamiento antimicrobiano debido principalmente al incremento de microorganismos resistentes a los antibióticos (14) siendo este tema un campo emergente de investigación. Existen diversos estudios que han ensayado esta terapia frente a infecciones producidas por bacterias, hongos, virus y parásitos (15,16). Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 5 La TFDA ofrece numerosas ventajas frentes a los tratamientos tradicionales: 1.-Amplio espectro de acción, ya que un FS puede actuar de forma simultánea frente a bacterias, hongos, virus y parásitos. 2.- Gran eficacia independiente del patrón de resistencia antibiótica lo que hace que pueda ser útil para cepas patógenas multi-resistentes a antibióticos clásicos. 3.- Este tipo de tratamiento permite la reducción de la población patógena produciendo un daño muy reducido al tejido huésped. 4.-La inactivación de los microorganismos por medio de los FSs es un mecanismo multidiana. 5.- Disponibilidad de liberación del FS a la zona infectada de forma específica. 6.-Presenta compatibilidad con cualquier tratamiento de antibióticos que se utilizan en la actualidad. Por otro lado, los FSs idóneos para utilizar en la TFDA deben ser fármacos que posean las siguientes propiedades: 1.- Absorción elevada en la parte roja del espectro lumínico (> 600nm) para asegurar una mayor penetración de la luz en la piel y así poder tratar infecciones internas. 2.-Rendimiento cuántico de formación de estado triplete elevado, así como un tiempo de vida de este estado triplete suficientemente largo para ser capaz de producir oxígeno singlete o cualquier otra especie reactiva de oxígeno 3.- Energía del estado triplete mayor de 94 kJ/mol. 4.-Elevada especificidad para asociarse a los microorganismos patógenos, 5.-Mínima toxicidad en ausencia de luz. 6.-Rápida eliminación del cuerpo para minimizar posibles efectos secundarios. 7.-Pureza química y de síntesis versátil y económica. (http://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/14_Capitul o_14.pdf) Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 6 Los FSs se pueden clasificar en tres grandes grupos: 1.-Compuestos sintéticos no-porfirínicos, como los colorantes fenotiazínicos, entre los que se incluye el azul de metileno y derivados como el azul de dimetilmetileno, el cual va a ser motivo de este estudio. 2.- Moléculas macrocíclicas como las ftalocianinas y las porfirinas. 3.-Fotosensibilizantes naturales, entre los que se encuentra la hipericina, entre otros (17). De todos ellos, es el azul de metileno el que por el momento se está desarrollando más activamente para la TFDA (18). De hecho, ya se ha comercializado un dispositivo con este FS para el tratamiento de infecciones dentarias (FotoSan). Por dicha razón, consideramos que debe ser considerado como el FS de referencia a la hora estudiar la capacidad antimicrobiana de cualquier nuevo FS. El principal reto de la TFD antimicrobiana es encontrar la ventana terapéutica in vivo donde las bacterias y los hongos sean destruidos sin efectos citotóxicos en los tejidos sanos circundantes. En general, se puede conseguir la erradicación de los patógenos en condiciones de una irradiación menor (40-100 mW/cm2) que la utilizada en los procesos cancerosos, y lo que es más importante, con tiempos de incubación más cortos. Esto garantiza una alta selectividad en comparación con los principales tejidos y células huéspedes de la piel, queratinocitos y fibroblastos, así como en las células de la respuesta inmunitaria anti-infecciosa, neutrófilos y linfocitos. Sin embargo, los estudios que han investigado el efecto de la TFDA sobre células cutáneas son escasos (24). En la actualidad la TFD no tiene ninguna aplicación clínica antimicrobiana aprobada y su utilización es anecdótica. Así, en los últimos años se han publicado casos aislados de diversas infecciones dermatológicas tratadas empíricamente mediante TFD con ALA o MAL con prometedores resultados: onicomicosis, tiñas de piel lampiña (19), candidiasis (12), úlceras y tumores con sobreinfección bacteriana (20,21), micobacterias (22), parásitos (23) e incluso ácaros (21). Todo ello apunta a que la TFDA puede tener un prometedor futuro en el tratamiento de las infecciones de la piel. Los microorganismos tienen grandes diferencias en cuanto a estructura celular y organización, lo que obviamente influye en la interacción de los FS añadidos de forma exógena con los constituyentes celulares, determinando la eficiencia y el mecanismo del proceso de fotoinactivación (25). Por ello son de gran interés, los estudios comparativos de eficacia entre diferentes FS en distintos agentes infecciosos (bacterias y hongos) que ayuden a establecer su uso preferente en unas infecciones cutáneas frente a otras (15). Es decir, estudios que nos permitan seleccionar qué FS funciona mejor en cada una de las infecciones de la piel, sean bacterianas o fúngicas. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 7 3.-Fotosensibilizante:Azul de 1,9-Dimetil-metileno (DMM-B): En este estudio se va a utilizar como fotosensibilizante el DMM-B; este es un potente FS, derivado del azul de metileno, que pertenece a una nueva generación de drogas para realizar TFDA. Es un compuesto aromático heterocíclico con la siguiente formula molecular; C16, H18, N3, S, Cl. (http://www.sigmaaldrich.com/large/structureimages/59/mfcd19686959.png) Esta sustancia ha sido utilizada como FS en terapia fotodinámica antimicrobiana contra algunas bacterias resistentes(26,27,28 ) como por ejemplo Acinetobacter baumanii. Sus características son: -Pico de absorción máximo: 649nm. -Peso molecular: 416,05 -Punto de fusión: 250ºC. . (http://www.sigmaaldrich.com/large/structureimages/59/mfcd19686959.png) 2.-OBJETIVOS DEL ESTUDIO: Objetivo principal: Evaluar la eficacia de la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDA) in vitro frente a Candida spp, tanto sensibles como resistentes a antifúngicos utilizando como FS el azul de 1,9-dimetil-metileno (DMM-B). Objetivos secundarios: - Determinar los parámetros óptimos, tiempo de incubación , dosis de irradiación y concentración del DMMB, para obtener un efecto fungicida. -Evaluar qué ROS intervienen en la muerte de las distintas cepas y especies de Candida en el proceso de TFD con DMMB. -Estudio de la localización celular del DMM-B en las Candidas spp. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 8 3.-MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1.-Cepas de estudio y condiciones de crecimiento: Las cepas que se han utilizado en este estudio son las siguientes: Cepas no resistentes: -Candida albicans (ATCC 10231) -Candida krusei (ATCC 6258) Cepas colección Americana -Candida parasilopsis (ATCC 22019) - Candida albicans (CETC 1001) Cepa colección Española Cepas resistentes: -Candida albicans (456325H) -Candida albicans (AZN-9635) -Candida albicans (AM07/0267) -Candida glabrata (ANZ16-46) -Candida glabrata (YFJ002-658) -Candida rugosa (YFJ002-29) Todas las cepas del estudio crecen bajo condiciones aeróbias utilizando como medio de cultivo agar-dextrosa-Sabouraud con cloranfenicol a la temperatura de 35ºC y en oscuridad. 3.2.-Reactivos: -Fotosensibilizante: El fotosenbilizante utilizado en este estudio es el azul de dimetil-metileno (DMM-B) obtenido de la colección Aldrich (Gillingham UK). -Inhibidores: -Azida (NaNO3)(80mM). -Catalasa (1880U/ml) -Superóxido Dismutasa (SOD) (2000U/ml) Cepas resistentes a azoles Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 9 Reactivos secundarios: -Agua destilada y desionizada. -Sabouraud dextrose agar (SDA)CM0041 OXOID (Lot. 893003). -Alcohol etílico a 70º (Lot C046) -Etanol absoluto EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur (MERK) (Lot 40225360131114). -Dimetil-sulfoxido (DMSO)(Lot 30H0608). -Tampón PBS (Lot P31098IT964153). -Cloranfenicol (Lot 58F-0357). -Mitotracker green de Invitrogen (Molecular Probes). -Cell tracker green de Invitrogen (Molecular Probes). -DAPI de Invitrogen (Molecular Probes). 3.3.-Instrumentación: Los instrumentos utilizados en este estudio son los descritos a continuación; -Lámpara roja de emisión 632nm (±10nm) y una potencia de emisión de 1,7mV/cm2. La lámpara debe estar a 5cm de la muestra a irradiar. Para administrar una fluencia de 18J/cm2 el tiempo de irradiación será de 15 minutos y para una fluencia de 37J/cm2 de 30 minutos. (Imagen 1) -Espectrofotómetro con escala McFarland (McF) DINKO; una medida de 0,5McF equivale a un millón de bacterias/levaduras por ml y una medida de 4McF equivale a 10 millones de bacterias/levaduras por ml. (Imagen 5) -Placas de cultivo STERILIN; donde se realizan las diferentes siembras de muestras. (Imagen 2) -Asa de siembra metálica; usada para realizar las siembras. (Imagen 3) -Campana de flujo laminar Telstar BIO II A; lugar donde se tiene que realizar la mayor parte del trabajo para evitar contaminaciones. (Imagen 4) -Microscopio confocal espectral Leica TCS SP2 AOBS; (Imagen 6) usado para la localización celular y Microscopio confocal compacto Olympus FV10i Oil Typeambos (Imagen 7) de la Unidad de Microscopia e Imagen del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud.(para los estudios de localización del FS) Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 16 PROTOCOLO 1: COALESCENCIA DEL DMM-B CON CELL-TRACKER GREEN: Se realizará en tres tubos eppendorffs diferentes: 1) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green (5 M). 2) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green + DMM-B (ambos a 5 M). 3) Cepa D.O.= 0,5 McF. Los tres tubos seguirán el mismo procedimiento de actuación (excepto la adición de los fluoróforos) y todo el proceso se llevará a cabo en la mayor oscuridad posible: -Tubo 1: Volumen de 500 L donde habrá una concentración de cell tracker green de 10 M : 1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de cell tracker green + 495 L del medio Sabouraud caldo (SC) previamente calentado a 37ºC. Se utiliza como disolvente el medio SC previamente preparado (4gr de glucosa + 1gr de peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada). Después se filtra por un filtro de 0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a 37ºC antes de mezclarlo con el fluoróforo. Sobre esos 500 l de medio se añaden 500 l de una suspensión de germen 0,5McF de densidad óptica, con lo que se llega a un volumen final de 1000 l (la suspensión del germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC). Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green obteniendo una concentración final de 5 M. Tubo 2: Necesitamos una concentración de 5 M de DMM-B y 5 M de cell tracker green, pero los tiempos de incubación son diferentes, asi que: 1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L (cell tracker green) Sobre esos 500 l de medio se adicionan 450 l de la suspensión del germen 0,5 McF, con lo que se llega a un volumen de 950 l (la suspensión de levaduras se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC). Con esta adición no hemos diluido exactamente a la mitad la concentración del cell tracker green a 5 M como deseábamos, pero es debido a que los 50 l que faltan serán de DMM-B 100 M que serán añadidos después de la incubación: 100 M x V = 1000 l x 5 M => V= 50 l de la disolución original de DMM-B. Tubo 3: 500 l de la suspensión 0,5McF del germen preparada con SDAC y 500 l de medio SC precalentado a 37ºC. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 17 Incubación: Los tres tubos se incuban a 35ºC durante 40 minutos. Al acabar ese tiempo se saca el tubo 2 y se le añaden los 50 l de la disolución 100 M de DMM-B con lo que se obtienen 1000 l donde las concentraciones de los fluoróforos se encuentran ya ajustadas como se indicaba. Se vuelve a meter el tubo 2 a 35ºC y se deja otros 5 min con los tubos 1 y 3 que no se habían sacado de la estufa. Cumplidos esos 5 min se sacan los tres tubos y se centrifugan 5 min a 10.000rpm. Se extrae el sobrenadante y se resuspende el pellet en otros 1000 l de SC precalentado a 37ºC. Se incuba otros 30 min a 35ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Lavados: Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de SC precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y nos quedamos con 40 l de pellet. Toma de muestra y montaje: Se resuspende el pellet utilizando vortex. Se toman 10 l del pellet y se depositan en un tubo limpio. En un porta se extiende una capa de polilisina y se deja secar al aire unos minutos. Sobre el porta con polilisina se posiciona el tubo con los 10 l del pellet y por medio de una centrífuga se extiende y se “deposita” la muestra sobre la capa de polilisina. Se realiza un lavado con suero fisiológico sobre el porta y se vuelve a centrifugar. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 18 Una vez se encuentre seco tomamos un cubre redondo y aplicamos sobre él 5 l de moviol. Pegamos el porta con el cubre por el lado donde fue aplicado el moviol (glicerol si no hay). Se deja extender 5 minutos. Se aplica esmalte de uñas por todo el contorno del cubre. PROTOCOLO 2: LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DEL DMM-B CON CELLTRACKER GREEN, MITOTRACKER Y DAPI. Se realizará en dos tubos eppendorffs diferentes: 1) Cepa D.O.= 0,5 McF + mitotracker + DMM-B + DAPI (todos a 5 M). 2) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green + DMM-B + DAPI (todos a 5 M). Los dos tubos seguirán el mismo procedimiento de actuación y todo el proceso tendrá lugar en la mayor oscuridad posible. Tubo 1: 500 L donde tendremos una concentración de mitotracker de 10 M: La disolución original de mitotracker es de 1000 M: 1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de mitotracker Se dispone asimismo de sendas disoluciones de DMM-B y de DAPI 1000 M, con lo que se realizará el mismo paso para su dilución con lo cual, se utilizan 5 L de cada una de ellas; los 500 L se completan con 485 L de disolución de análisis. 5 L mitotracker 1000 M + 5 L DAPI 1000 M + 5 L DMM-B 1000 M + 485 L disolución para análisis = 500 L La disolución para el análisis utilizada resulta ser medio SC previamente preparado (4gr de glucosa + 1gr de peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada. Después se filtra por un filtro de 0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a 37ºC antes de mezclarlo con el fluoróforo). Se observa que el primer paso es la dilución de los fluoróforos hasta 10 M teniendo en cuenta que la otra mitad de la disolución de análisis será, precisamente la suspensión de germen preparada. Sobre esos 500 L de medio se vierten otros 500 L de una suspensión de germen 0,5McF de densidad óptica, con lo que se llega a un volumen de 1000 l (la suspensión del germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC). Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 19 Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green obteniendo una concentración final de 5 M. Tubo 2: se dispondrá de un volumen de 500 L donde tendremos una concentración de cell tracker green de 10 M: La disolución original de celltracker green es de 1000 M: 1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de cell tracker green Se dispone asimismo de sendas disoluciones de DMM-B y de DAPI 1000 M, con lo que se realizará el mismo paso para su dilución con lo cual, se utilizan 5 L de cada una de ellas; los 500 L se completan con 485 L de disolución de análisis. 5 L mitotracker 1000 M + 5 L DAPI 1000 M + 5 L DMM-B 1000 M + 485 L disolución para análisis = 500 L La disolución de análisis utilizada resulta ser medio SC previamente preparado (4gr de glucosa + 1gr de peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada. Después se filtra por un filtro de 0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a 37ºC antes de mezclarlo con el fluoróforo). Se observa que el primer paso es la dilución de los fluoróforos hasta 10 M teniendo en cuenta que la otra mitad de la disolución de análisis será, precisamente la suspensión de germen preparada. Sobre esos 500 L de medio se vierten otros 500 L de una suspensión de germen 0,5McF de densidad óptica, con lo que se llega a un volumen de 1000 l (la suspensión del germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC). Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green obteniendo una concentración final de 5 M. Incubación: Los tres tubos se incuban a 35ºC durante 40 minutos. Al acabar ese tiempo se saca el tubo nº2 y se le añaden los 50 l de la disolución 100 M de DMM-B con lo que se obtienen 1000 l donde las concentraciones de los fluoróforos se encuentran ya ajustadas como se indicaba. Se vuelve a meter el tubo nº2 a 35ºC y se deja otros 5 min con los tubos 1 y 3 que no se habían sacado de la estufa. Cumplidos esos 5 min se sacan los tres tubos y se centrifugan 5 min a 10.000rpm. Se extrae el sobrenadante y se resuspende el pellet en otros 1000 l de SC precalentado a 37ºC. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 20 Se incuba otros 30 min a 35ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Lavados: Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de SC precalentado a 37ºC. Se centrifuga 5 min a 10.000rpm. Se descarta el sobrenadante y nos quedamos con 40 l de pellet. Toma de muestra y montaje: Se resuspende el pellet utilizando vortex. Se toman 10 l del pellet y se depositan en un tubo limpio. En un porta se extiende una capa de polilisina y se deja secar al aire unos minutos. Sobre el porta con polilisina se posiciona el tubo con los 10 l del pellet y por medio de una centrífuga se extiende y se “deposita” la muestra sobre la capa de polilisina. Se realiza un lavado con suero fisiológico sobre el porta y se vuelve a centrifugar. Una vez se encuentre seco tomamos un cubre redondo y aplicamos sobre él 5 l de moviol. Pegamos el porta con el cubre por el lado donde fue aplicado el moviol (glicerol si no hay) y se deja extender 5 minutos. Se aplica esmalte de uñas por todo el contorno del cubre. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 21 4.-RESULTADOS: 1º.-Efecto fototóxico del DMMB en Candida spp. en función del tiempo de incubación: de los resultados de la curva de tiempos de incubación se puede determinar que el tiempo mínimo que necesita el FS (DMM-B) para penetrar en el interior de las lavaduras es de 15 minutos. Se han realizado experimentos en los que se utiliza una levadura en concreto (C.albicans (ATCC 10231)), una concentración fija de FS (1,25µM), unas condiciones determinadas (18 J/cm2 y capacidad de reducir 3 unidades logarítmicas) y 4 tiempos de incubación (0,15,30 y 60 minutos) observando que la TFD es más eficaz cuando el tiempo de incubación previo a la irradiación es de al menos 15 minutos; es decir, comparando las CFU/ml en el experimento con un tiempo de incubación igual a 0 minutos y el experimento con un tiempo de incubación igual a 15 minutos se observa como existe menor número de CFU/ml con un tiempo de incubación igual a t=15minutos y a tiempos superiores (30 y 60 minutos) no mejoran este resultado. En los experimentos posteriores siempre se utilizará 15 minutos como tiempo de incubación óptimo del DMM-B previo a la irradiación. 2º.- Efecto fototóxico del DMMB en Candida spp con curvas de concentraciones: En los experimentos realizados con las curvas de concentraciones de DMM-B se obtuvieron los siguientes resultados ( hay que tener en cuenta que NF es no fungicida y F es fungicida): -Sobre C.albicans ATCC 10231; para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentración de 2,5 deDMM-B para reducir 3 unidades logarítmicas con respecto al inóculo inicial y una concentración de 20µM para reducir 6 unidades logarítmicas. Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas. Para reducir 3 unidades logarítmicas: 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 2.5 99.9920% 4.02 NF 5 100% 7.2 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 0,3125 99.2% 1,97 NF 0,625 99.7% 2,42 NF 1,25 99.8% 2,64 NF 2,5 99.9% 3,95 F Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 22 Para reducir 6 unidades logarítmicas: C.albicans ATCC (3und. log.) 0 1 2 3 0 2 4 6 818 J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) C.albicnas ATCC (6und. log.) 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 818 J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) -Respecto a la cepa de C.albicans CETC 1001; para un fluencia de 18 J/cm2 y reducir 3 unid. Log. se necesita una concentración de DMM-B de 1,25 y para reducir 6 und. Log el inóculo inicial se precisa de una concentración de 20µM de DMM-B. Para una fluencia de 37J/cm2 y reducir 3 unidades logarítmicas se necesita 1,25µM de DMM-B y para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial se precisa 5µM de DMM-B. Para reducir 3 unidades logarítmicas: 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 10 99.9997% 5.95 NF 20 100% 7.2 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc Log (final CFU/ml fungicidad 0,625 99.7% 2.54 NF 1,25 99.9% 3.78 F 2,5 100% 6.19 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 0,3125 99.4% 2.19 NF 0,625 99.7% 2.48 NF 1,25 99.9% 3.71 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 0.625 99.8% 2.89 NF 1.25 99.9% 5.23 F Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 23 Para reducir 6 unidades logarítmicas: C.albicans CETC (3 und. log.) 0.5 1.0 1.5 -2 0 2 4 6 818 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) C. albicans CETC (6 und. log.) 510 15 20 25 -2 0 2 4 6 8 10 18J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) -Respecto a la cepa de C.parasilopsis ATCC 22019: para una fluencia de 18J/cm2 se necesita de una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 und. Log. y 20µM para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial. Para una fluencia de 37 J/cm2 se necesita una concentración de FS de 0,625µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 10µM para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial. Para reducir 3 unidades logarítmicas: Para reducir 6 unidades logarítmicas: 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 1.25 99.9610% 3.4 NF 2.5 99.9867% 5.94 NF 5 99.9999% 7.16 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicid ad 0 0 0 NF 10 99.9998% 5.85 NF 20 100% 7.22 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 0,3125 99.1% 1.93 NF 0,625 99.8% 2.27 NF 1,25 99.9% 3.34 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 0,3125 99.8% 2.46 NF 0,625 99.9% 3.49 F 1,25 100% 6.06 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 2.5 99.9976% 4.63 NF 5 99.9989% 5.24 NF 10 100% 7.01 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 10 99.9610% 4.85 NF 20 100% 7.01 F Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 24 C.parasilopsis ATCC (6 und. log.) 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) -Respecto a C.krusei ATCC 6258; para una fluencia de 18J/cm2 se necesita una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 80µM para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial. Para una fluencia de 37J/cm2 se necesita una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3unidades logarítmicas y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial. Para reducir 3 unidades logarítmicas: Para reducir 6 unidades logarítmicas: 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 0.625 99.3% 2.808 NF 1.25 99.7% 3.198 F 2.5 99.9% 4.268 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 0.625 99.8% 2.798 NF 1.25 99.9% 4.378 F 2.5 99.9% 6.955 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 20 99.9870% 4.12 NF 40 99.9989% 5.52 NF 80 100% 6.99 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 2.5 99.9843% 3.35 NF 5 99.9999% 6.12 F 10 100% 6.99 F C. parasilopsis ATCC (3 und. log.) 0.0 0.5 1.0 1.5 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 25 C.krusei ATCC (6 und. log.) 020 40 60 80 100 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) -Respecto a C.albicans 456325H; para una fluencia de 18J/cm2 se necesita una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas el incúlo inicial. Para una fluencia de 37J/cm2 se necesita una concentración de DMM-B de 0,625µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 1,25 para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial. Para reducir 3 unidades logarítmicas: Para reducir 6 unidades logarítmicas: C.albicans 456325H (6 und. log.) 0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 0.625 99.7% 2.73 NF 1.25 99.9% 4.19 F 2.5 99.9% 5.48 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 0.16 99.7% 2.85 NF 0.3125 99.7% 2.94 NF 0.625 99.9% 3.36 F 1.25 100% 6.48 F 18J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad 0 0 0 NF 2.5 99.9934% 4.66 NF 5 99.9999% 6.01 F 10 100% 7.34 F 20 100% 7.34 F 37J/cm2 [DMM- B] (µM) % inhibición Reducc. log. (CFU/ml fungicidad 0 0 0 NF 0.3125 99.9600% 3.51 NF 0.625 99.9700% 3.52 NF 1.25 99.9999% 6.08 F C.krusei ATCC (3 und. log.) 1 2 3 -2 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) C. albicans 456325H (3 und. log.) 0 1 2 3 0 2 4 6 818J/cm2 37 J/cm2 [DMM-B] Log10(CFU/ml) Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 32 CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C. parasilopsis (ATCC) 1.25 Catalasa 0,12% C.parasilopsis (ATCC) 1.25 SOD 0,17% C.parasilopsis (ATCC) 1.25 Azida sódica 40,27% C. parasilopsis (ATCC) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 20 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C. krusei (ATCC) 5 Catalasa 0,26% C. krusei (ATCC) 5 SOD 0% C. krusei (ATCC) 5 Azida sódica 2,12% C. albicans (CETC) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 20 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 33 C. krusei (ATCC) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C. albicans (456325H) 2.5 Catalasa 2,85% C. albicans (456325H) 2.5 SOD 1,49% C. albicans (456325H) 2.5 Azida sódica 66,88% C. albicans (456325H) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0 2 4 6 8 10 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C.albicans(AZN9635) 2.5 Catalasa 1,91% C.albicans(AZN9635) 2.5 SOD 0,47% C.albicans(AZN9635) 2.5 Azida sódica 59,06% Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 34 C. albicans (AZN-9635) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0 1 2 3 4 5 30 40 50 60 70 80 90 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C.albicans(AM0710267) 1.25 Catalasa 0,08% C.albicans(AM0710267) 1.25 SOD 0,25% C.albicans(AM0710267) 1.25 Azida sódica 66,92% C. albicans (AM071-0267) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0 1 30 40 50 60 70 80 90 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C.glabrata(AZN16-56) 5 Catalasa 0,25% C.glabrata(AZN16-56) 5 SOD 0,89% C.glabrata(AZN16-56) 5 Azida sódica 40,15% Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 35 C.glabrata (AZN16-56) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0 1 2 3 20 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C.glabrata(YFJ002-658) 10 Catalasa 2,27% C.glabrata(YFJ002-658) 10 SOD 0,01% C.glabrata(YFJ002-658) 10 Azida sódica 70,04% C.glabrata (YFJ002-658) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0 1 2 3 4 5 20 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia CEPA [DMM-B] fung.(µM) INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 Catalasa 0,09% C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 SOD 0,06% C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 Azida sódica 78,41% Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 36 C.rugosa (YFJ002-29) CATALASA SOD AZIDA SODICA 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 20 40 60 80 100 Inhibidores %Superviviencia A partir de las gráficas y tablas obtenidas de los experimentos con inhibidores se observa como el oxígeno singlete es la especie reactiva que más contribuye a la mortalidad inducida por la TF con DMM-B en todas las especies de Candida excepto para C.krusei que no conoce cual es el mecanismo por el que funciona. 4º.- Localización celular de DMMB en Candida spp: Por último, los experimentos de localización celular del DMM-B mediante microscopía confocal de fluorescencia para las diferentes especies de Candida spp: 1.-Unión de DMM-B a C.krusei ATCC 6258: Se observa en la primera foto la levaduras por microscopía óptica y en las otras dos imágenes la levadura al añadir el DMM-B observándose como el FS penetra en el interior de las levaduras. 2.-Demostración de la entrada del DMM-B en C. krusei ATCC 6258 por coalescencia con cell-tracker green: Microscopía óptica CK + DMM-B CK+ DMM-B CK en microscopía optica CK + DMM- B CK + DMM-B + CTG Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 37 En la primera imagen se observa la levadura en microscopía óptica, la segunda imagen es la levadura con el FS y la última es la levadura con el FS y el marcador del citoplasma observándose como el FS se encuentra en el interior del citoplasma de las levduras. 3.-Desmostración de la no entrada del DMM-B en el interior del núcleo de las levaduras por la no co-localización con DAPI: La primera imagen es la levadura con el FS y el marcador citoplasmático, la segunda imagen se muestra la levadura con el FS y el marcador nuclear observándose como el FS no se encuentra en el interior del núcleo y en la tercera imagen se observa la levadura con el FS y los dos marcadores observándose como el FS se localiza en el citoplasma pero no parece penetrar en el interior del núcleo. Mediante estas fotos se observa como el DMM-B penetra en el interior de las levaduras (C.krusei en este caso pero es igual para todas especies de Candida) aunque parece no colocalizarse con DAPI, marcador del núcleo. DISCUSIÓN: La TFDA utilizando DMM-B como FS, tiene un efecto fungicida para todas las cepas de Candida, utilizando una incubación previa a la irradiación de tan solo 15 minutos, aunque cada una de ellas necesita una concentración determinada de FS. No obstante cabe destacar los siguientes aspectos: -Respecto a las fluencias, cabe destacar que se necesita una menor cantidad de FS cuando se irradia con la mayor fluencia utilizada, 37 J/cm2. Aunque existen algunas excepciones como es el caso de la C.krusei que para reducir 3 unidades logarítmicas necesita la misma concentración de DMM-B para 18 y 37J/cm2. Estas diferencias se pueden deber a las diferencias entre cepas en los procesos de captación/unión/metabolización del DMM-B. CK + CTG + DMM- B CK + DMM-B + DAPI CK+DMMB+DAPI+C TG Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 38 - El presente estudio demuestra que la concentración de FS utilizada depende de la densidad de germen; cuanto mayor sea el número de levaduras que se quieran eliminar mayor será la cantidad de FS que se necesite para ello. -Respecto a la comparación entre cepas sensibles y resistentes cabe decir que no existe grandes diferencias entre ambos tipos de cepas, incluso necesitan menor cantidad de FS las cepas resistentes en la mayoría de los casos. De esto se deduce el potencial de la TFDA con DMM-B en el tratamiento de las candidiasis resistentes. No obstante, en algunos estudios se ha demostrado que C.glabrata presenta una menor sensibilidad a la fotoinactivación que C.albicans (5). Esto se atribuye al fenómeno de co-adhesión, lo que puede limitar el área de contacto entre células de C.glabrata y el DMM-B. Aunque existen otros estudios en los que se considera C.albicans la cepa más sensible (4). Otro factor que hay que tener en cuenta es el estado fisiológico de las cepas ya que puede influir en la respuesta de las levaduras a la TFD (6). En cuanto a la comparación entre diferentes FSs, cabe destacar que el DMM-B es más eficaz que otros como la hipericina por lo parece tener mejores cualidades para ser usado como fotosensibilizante en la TFDA (1). Se observa como para BAM-SIPC es necesario 5-15 minutos (12), para el azul de toluidina O se necesita 5 minutos (13), 3h. para el ALA (12) y 15 minutos cuando se utiliza el DMM-B Otro factor muy importante a considerar en esta terapia es el tiempo de incubación. En este estudio además de demostrar que el DMM-B es eficaz como tratamiento fungicida, observamos que se adhiere rápidamente a la levadura, siendo el tiempo de incubación fundamental para la TFDA, dependiendo principalmente de la estructura del FS. Nuestro trabajo demuestra que la especie reactiva de oxígeno que más contribuye a la muerte de Candida spp por la TFDA con DMM-B es el oxígeno singlete, siendo este radical libre el más comunicado como responsable de la muerte fotodinámica(7). Por lo que lo más probable es que sea la reacción tipo II la predominante en el proceso fotodinámica de daño directo del material biológico(6). En cuanto a la localización celular, con los experimentos realizados se puede observar como el DMM-B penetra en las levaduras aunque no podamos precisar en qué orgánulos se localiza; solo se puede demostrar que no penetra en el núcleo ya que no es capaz de atravesar la membrana nuclear; a partir de estos experimentos y técnicas utilizadas de localización celular solo se puede decir que el DMM-B sufre una diseminación intraceluar salvo en el núcleo lo que hace que exista una doble ventaja: -La TFDA con DMM-B podría tener múltiples dianas celulares, ya que se localiza de una forma difusa en el interior de la célula, lo que minimiza la posibilidad de aparición de resistencias. -El DMM-B no penetra en el núcleo por lo que se evitan las mutaciones en el DNA.,lo que también contribuye a impedir el desarrollo de resistencias. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 39 Una de las limitaciones de nuestro estudio con microscopía de fluorescencia es que los fluoróforos utilizados son válidos para células eucariotas animales. Las levaduras son células eucariotas pero poseen una complejidad menor con respecto a las células animales. Todos estos marcadores funcionaron satisfactoriamente excepto el mitotracker, que en la mayoría de los casos no solo se encontró en las mitocondrias, sino que se diseminó por todo el citoplasma celular. En cuanto a los estudios futuros de localización celular, se debería intentar determinar exactamente donde se localiza la mayoría del FS en función del tipo de germen y cepa estudiada y en función del tiempo de contacto con el FS. Estos estudios serán realizados por medio del uso de otros fluoróforos diferentes que sean capaces de marcar otras estructuras celulares, así como de los ya utilizados pero optimizando su concentración para que se aumente su selectividad en los orgánulos a estudiar. Si bien nuestro trabajo demuestra la eficacia in vitro de la TFD con DMMB en Candida spp aporta información nueva interesante, quedan muchas variables por modificar, las cuales pueden hacer la TFD más eficaz y eficiente. Por ejemplo, modificar la temperatura, ya que el calor puede potenciar el efecto de la TFD, modificar el vehículo del DMM-B, controlar los cambios en el pH entre otros. Otro aspecto importante para el futuro es trasladar la TF in vitro a in-vivo. Por ello, nuestro grupo, en colaboración con la Unidad de Valoración Funcional del Instituto de Ciencias de la Salud (ICS) y la Prof. Maite Verde de la Facultad de Veterinaria, está preparando el protocolo para testar éste y otros FSs en infecciones cutáneas inducidas en animales de experimentación infectados. En nuestro proyecto futuro, está realizar experimentos de sinergias, es decir, buscar procedimientos para potenciar la TFD, como la combinación de dos FSs de diferente naturaleza de forma simultánea. De esta forma, se podría mejorar la TFDA haciéndola más eficaz. CONCLUSIONES: 1.-La terapia fotodinámica antimicrobiana con DMMB es eficaz y fungicida in vitro frente a levaduras del tipo Candida spp, causantes de diferentes infecciones cutáneas y mucosas. 2.-El tiempo óptimo de incubación previo a la irradiación debe ser al menos de 15 minutos. 3. Las cepas y especies de Candidaresistentes a azoles son susceptibles in vitro a la TFD con DMMB sin diferencias respecto a las cepas sensibles a azoles. Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro” Página 40 4.- El oxígeno singlete es la especie reactiva que más contribuye al efecto fototóxico fungicida del DMMB en las distintas especies de Candida. 5.- El FS azul de 1,9-dimetilmetileno (DMM-B) es capaz de penetrar en las células de levaduras y difundir por su interior pero sin atravesar la membrana nuclear. BIBLIOGRAFÍA: 1.-Prates RA, Kato IT, Ribeiro MS, Tegos GP and Hamblin MR. Influence of multidruge fflux systems on methylene blue-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans. J. Antimicrob Chemother 2011 Jul;66(7):1525-32. Epub 2011 Apr 26. 2.- Darabi K, Hostetler SG, Bechtel MA, Zirwas M. The role of Malassezia in atopic dermatitis affecting the head and neck of adults. J Am Acad Dermatol. 2009;60:125-36. 3.- Tomi NS, Kränke B, Aberer E. 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