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0 1. Introducción 1.1. Estabilidad termodinámica de las proteínas Las proteínas son las encargadas de llevar a cabo un gran diversidad de funciones en lo seres vivos, pero solamente serán capaces de realizarlas si adoptan la conformación adecuada. Conocer como es su estabilidad y como poder aumentarla, tiene gran interés desde varios puntos de vista (Ayuso, S. 2012).  Biológico (conocimiento de la Biología molecular).  Industrial (es común la utilización de enzimas que no trabajan en condiciones fisiológicas)  Biomédico (numerosas enfermedades están causadas por proteínas mal plegadas). La estabilidad conformacional de una proteína, se define como el cambio de energía libre de la reacción (ΔG), Figura 1: Para muchas proteínas, esta reacción de plegamiento es reversible y, además, sólo comprende los dos estados anteriormente vistos en la figua 1. En condiciones fisiológicas el plegamiento de las proteínas es termodinámicamente favorable, ΔG del plegamiento será negativa, ec.1.1. ec.1.1. Durante la reacciones de plegamiento o de desplegamiento se forman o rompen, cientos de interacciones covalentes, puede esperarse que aparezcan conformaciones transitorias que posean algunas de las interacciones presentes en el estado de partida pero que no posean una energía tan elevada como la del estado desplegado. Estas serán llamadas intermediarios, son más estables respecto a las especies que inmediatamente preceden o a las siguientes en la reacción. (Bueno, 2006). Las principales interacciones que contribuyen a la estabilidad de una proteína son: Figura 1: Variación de Energía entre: Estado Nativo (plegado) y Desnaturalizado (desplegado) 1  Puente de Hidrógeno.  Fuerzas de Van der Waals.  Interacciones con residuos aromáticos.  Interacciones electrostásticas.  Puentes disulfuro. 1.2. Intermediarios de equilibrio El plegamiento de las proteínas de mayor tamaño es más complejo y la aparición de barreras de energía en su paisaje energético determina la acumulación transitoria de intermediarios de plegamiento, que en algunos casos son productivos y en otros constituyen vías muertas de la reacción (Roder et al., 2006). Muchas proteínas presentan equilibrios de cierta complejidad, en los que podrían aparecer uno o más intermediarios. En el caso de la Flavodoxina de Anabaena, presenta un intermediario en desnaturalización térmica. Como estos intermediarios suelen carecer de actividad biológica, puede considerarse la estructura del estado activo biológicamente (nativo), como la suma de dos contribuciones (Sancho et al., 2002): Término relevante: el cual es el encargado de salvaguardar su actividad biológica, corresponderá a la diferencia de energía libre entre estado nativo y el intermediario. Término residual: estabilidad del intermediario no funcional. Corresponde a la energía libre asociada al equilibrio entre el intermediario y el estado desplegado. El efecto de una mutación estabilizante en un proceso de dos estados es obvio, la estabilización de la estructura plegada y activa con respecto de la población desplegada. En cambio, cuando se trata de proteínas con especies intermediarias, conlleva que una estabilización producida de manera global pueda distribuirse entre las distintas transiciones (N-I e I-D) (Sancho et al., 2002). En la práctica podemos seguir estos efectos causados por los cambios introducidos calculando la diferencia entre las estabilidades relevantes y residuales de la proteína de referencia menos el mutante (GNIGNI(ref)-GNI(mut) y GIDGID(ref)- GID(mut)) (Campos et al., 2004). Mientras más se acerquen las temperaturas de ambas transiciones producto del aumento del GNI comparado con el GID, más se desestabilizará el intermediario desapareciendo como especie en equilibrio. 2 De esta manera, una modificación dirigida hacia la transición nativo-intermediario, provocará una modificación en la estabilidad del estado nativo, llamada estabilidad relevante. Sin embargo, si la modificación esta dirigida hacia la transición intermediario-desplegado, producirá una modificación en la estabilidad referida al término residual. 1.3. Flavodoxina como modelo de estudio Los estudios realizados se han basado en el uso de flavodoxina de Anabaena PCC7119, proteína cuya estabilidad y plegamiento se han analizado ampliamente en nuestro laboratorio, y servirán de base para los datos obtenidos y para conclusiones sacadas de ellos. Las flavodoxinas son proteínas de pequeño tamaño 14-23 kDa, que actúan como transportadores de electrones. Contiene un cofactor FMN, está unido de manera no covalente, el cual es necesario para sus propiedades redox (Simondsen et al., 1980). 1.3.1 Función Las flavodoxinas son proteínas tipo α/β que tienen como función el transporte de electrones y presentan como grupo redox una molécula de FMN unida no covalentemente (Simondsen et al., 1980). El papel fisiológico de la flavodoxina es el transporte de electrones entre el fotosistema I (PSI) y la enzima ferredoxina-NADP+ reductasa (FNR) durante la fotosíntesis (figura 2). En condiciones normales, este papel es llevado a cabo por la ferredoxina; sin embargo, en ciertas cianobacterias y algas eucariotas, bajo condiciones de carencia de Fe, la flavodoxina la remplaza en su papel de transportador de electrones entre el PSI y la FNR (Fillat et al., 1988). Figura 2: Esquema del transporte fotosintético de electrones y de su distribución en la membrana tilacoide. Los complejos descriptos son: PSII, Fotosistema II:CIT, Complejo de citocromos b6/F; PSI, Fotosistema I; CF0-CF1, ATPsitetasa; PQ, Plastoquinona; PC, Plastocianina; FD, Ferredoxina; FNR, Ferredoxina-NADPoxidorreductasa. Las flechas indican el sentido en que se producen el transporte de electrones y el bombeo de protones. 3 1.3.2. Estructura La flavodoxina es una proteína tipo α/β (Figura 3) (Jon López-Llano et al., 2004a), está construida por una lámina β de 5 hebras paralelas, con 5 hélices α empaquetadas a ambos lados. Los residuos 4- 9, 30-36, 48-45, 81-89 y 115-117/141-143 forman las cinco hebras. La quinta hebra, contiene un bucle entre los residuos 117 y 141 en el que se muestra una pequeña lámina de tres hebras entre los aminoácidos 120 y 138. Los residuos que forman las hélices son: 13-26, 40-46, 70-76, 100-110 y 149-168 (Bueno, 2006). El FMN (Figura 4), responsable de su función se encuentra fijado en el sitio activo. Esta región tienen una movilidad, la cual le da una plasticidad pudiendo permitir la entrada o salida del cofactor. La proteína se pliega perfectamente en ausencia del cofactor (forma apo) con una estructura prácticamente idéntica a la proteína con el FMN unido (Genzor et al., 1996b). Las flavodoxinas pueden dividirse en dos grupos, las flavodoxinas de cadena larga tienen 20aminoácidos adicionales y su estructura tridimensional muestra que este bucle interactúa estrechamente con el bucle en el que esta la tirosina que se une al FMN. La función de este bucle no es clara, aunque muchas flavodoxinas lo presentan (López-Llano et al., 2004a; López-Llano et al., 2004b). La flavodoxina de Anabaena PCC7119 pertenece a la familia de las flavodoxinas de cadena larga. Figura 3: Holoflavodoxina de Anabaena, en la representación se puede ver: FMN (azul), los lazos que llevan los residuos Trp57 y Tyr94 (bucles de color naranja, residuos en verde) y el característico bucle largo de las flavodoxinas de cadena larga (en rojo). Figura 4: Cofactor de la holoflavodoxina, FMN. El cual esta compuestos por un anillo de isoloxacina (negro), cadena ribitilo (verde) y un grupo fosfato (rojo). 4 1.3.3. Estabilidad La desnaturalización térmica de la flavodoxina de Anabaena PCC7119 presenta un intermediario, se sigue por diferentes técnicas espectroscópicas obteniendo cuatro gráficas no superponibles, (dicroísmo circular en el lejano, cercano, absorbancia y fluorescencia). Sin embargo, la desnaturalización química no presenta intermediario, el proceso se seguirá por emisión de fluorescencia a distintas concentraciones de urea. 1.4. Diseño mutaciones Se va utilizar un diseño racional de mutantes en la Apoflavodoxina de Anabaena, para conseguir un aumento racional de la proteína modelo. El objetivo de este estudio es profundizar en el conocimiento sobre la estabilidad de la apoflavodoxina de Anabaena PCC 7119. Se analizaran la WT y 7 mutantes en este trabajo, los cuales fueron diseñados basándose en estudios anteriores (Bueno, 2006). La apofladoxina de Anabaena como se ha introducido anteriormente presenta un intermediario térmico (figura 5) (Ayuso-Tejedor et., al 2010). El intermediario térmico mantiene una parte común al estado nativo (color negro) y otra que se encuentra desnaturalizada (color rosa). Como se ha explicado anteriormente según donde vayan dirigidas las mutaciones, afectarán a la estabilidad relevante o residual de la proteína. Mutaciones dirigidas a la zona común al estado nativo (color negro), provocarán modificaciones en la estabilidad residual; mientras que mutaciones dirigidas a la zona ya desnaturalizada en el intermediario térmico (color rosa), provocarán modificaciones en la estabilidad relevante. Figura 5: A la izquierda se ve la estructura de la apoflavodoxina de Anabaena en el estado nativo, obtenida por rayos X y depositada en el pdb con el código 1FTG. La figura de la derecha corresponde al intermediario térmico obtenida por R.M.N y depositada en el pdb con el código 2KQU. 5 Se usaron dos proteínas de partidas, WT y una proteína mutante con 3 mutaciones (E20K/E72K/D126K/I92A), obtenida anteriormente en el departamento. Gracias a las estructuras resueltas, tanto de la apoflavodoxina (1FTG) como del intermediario térmico de esta (2KQU), se podrán ver de manera más clara el lugar de las mutaciones y si afectarán a la estabilidad relevante o residual. Para la realización de estas figuras se usó el programa PyMOL. Mutantes basados en la apoflavodoxina de Anabaena WT: 1.4.1. I59A (figura6) Se produce el cambio de Isoleucina por Alanina en el aminoácido 59. Cambio de un residuo apolar de cadena larga por uno apolar de cadena corta en la superficie de la proteína. La mutación se encuentra en la parte desestructura del intermediario, lo cual conllevará una variación en la estabilidad relevante. 1.4.2. D100N (figura 7) Se produce el cambio de Aspártico por Asparragina en el aminoácido 100. Cambio de un residuo ácido por uno polar, con la consiguiente descarga de un puente de H. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, con lo cual conllevará una variación en la estabilidad relevante. Figura 6: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario a la derecha, del mutante I59A. En azul la mutación introducida. Figura 7: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario, a la derecha, del mutante D100N. En azul la mutación introducida. 6 1.4.3. A142V (figura 8) Se produce el cambio de Alanina por Valina en el aminoácido 142. Cambio de un residuo apolar de cadena corta por otro apolar pero de cadena más larga, corresponde al relleno de una cavidad. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, con lo cual conllevará una variación en la estabilidad relevante. 1.4.4. En el caso de la utilización del 3M (E20K/E72K/D126K) (figura 9) como proteína de partida, las mutaciones a analizar serán: Se producen 3 mutaciones  E20K: Se produce el cambio de Ácido Glutámico por una Lisina en el aminoácido 20. Cambio de un residuo ácido por otro básico, produciendo un cambio de carga. La mutación se encuentra en la parte estructurada del intermediario, con lo cual conllevará una variación en la estabilidad residual.  E72K: Se produce el cambio de Ácido Glutámico por una Lisina en el aminoácido 72. Cambio de un residuo ácido por otro básico, produciendo un cambio de carga. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, con lo cual conllevará una variación en la estabilidad relevante. Figura 9: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario a la derecha, del mutante E20K/E72K/D126K. Marcado en negro las mutaciones introducidas. Figura 8: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario a la derecha, del mutante A142V. En azul la mutación introducida. 7  D126K: Se produce el cambio de Ácido Aspártico por una Lisina en el aminoácido 126. Cambio de un residuo ácido por otro básico, produciendo un cambio de carga. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, con lo cual conllevará una variación en la estabilidad relevante. 1.4.5. E20K/E72K/D126K/G87V (figura 10) Se produce un cambio de Glicina por Valina en el aminoácido 87, partiendo como modelo para la mutagénesis del triple mutante (3M) (E20K/E72K/D126K). Cambio de un residuo apolar por otro apolar pero de mayor tamaño, corresponde al relleno de una cavidad. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, lo que conllevará una variación en la estabilidad relevante. 1.4.6. E20K/E72K/D126K/D100N (figura 11) Se produce un cambio de Ácido Aspártico por Asparragina en el aminoácido 100, partiendo como modelo para la mutagénesis del triple mutante (3M) (E20K/E72K/D126K). Cambio de un residuo ácido por uno polar, con la consiguiente descarga de un puente de H. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, lo que conllevará una variación en la estabilidad relevante. Figura 10: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario a la derecha, del mutante E20K/E72K/D126K/G87V. Los residuos negros corresponden a las mutaciones del triple mutante E20K/E72K/D126K (3M), y en azul a la mutación G87V. Figura 11: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el interediario a la derecha, del mutante E20K/E72K/D126K/D100N. Los residuos negros corresponden a las mutaciones del triple mutante E20K/E72K/D126K (3M), y en azul a la mutación D100N. 8 1.4.7. E20K/E72K/D126K/A142V (figura 12) Se produce un cambio de Alanina por Valina en el aminoácido 142, partiendo como modelo para la mutagénesis del triple mutante (3M) (E20K/E72K/D126K). Cambio de un residuo apolar de cadena corta por otro apolar pero de cadena más larga, corresponde al relleno de una cavidad. La mutación se encuentra en la parte desestructurada del intermediario, lo que conllevará una variación en la estabilidad relevante. Figura 12: Representación sobre la WT. Sobre el estado nativo a la izquierda, y sobre el intermediario a la derecha, del mutante E20K/E72K/D126K/A142V. Los residuos negros corresponden a las mutaciones del triple mutante E20K/E72K/D126K (3M), y en azul a la mutación A142V. 15 3.3.2. Purificación de flavodoxina El protocolo usado para la purificación de los mutantes utilizados, es una pequeña variación del utilizado para la flavodoxina silvestre (Fillat et al., 1991). El bajo punto isoeléctrico de la flavodoxina (pI=3.8) hace que esté cargada a pH neutro y, por lo tanto, permite la utilización de intercambiadores aniónicos débiles como la DEAE-celulosa en su purificación (M. Bueno, 2006). En todo momento se intenta que la temperatura de trabajo sea de 4ºC o muy próxima a ella. 3.3.2.1. Obtención de extracto crudo Los pellets obtenidos en el paso anterior se resuspenden en 10 volúmenes de TRIS-Venenoso 50mM (Tris-HCl 50mM, pH 8, EDTA 100 μM, β-mercaptoetanol 100 μM) por cada gramo de células, ayudándose de una pipeta de plástico, según vaya tomando una consistencia líquida pasarlo a un vaso de precipitados, el cual debe estar dentro de una cubeta con hielo (durante el proceso de purificación se hará todo de manera refrigerada para evitar el deterioro de las proteínas). La lisis celular se realiza por sonicación (figura 15), (sonicador DRH UP200 DR Hielsher), el cual dará la lisis por ciclos de ultrasonidos. Se realizan de 8 a 10 ciclos de 45 segundos al 70% de potencia con descansos de 30 segundos entre ciclo y ciclo. La muestra se mantiene en todo momento en hielo para evitar su calentamiento y por consiguiente su deterioro. Los restos celulares se eliminarán por centrifugación en frío utilizando una centrífuga AvantiTM J-25 (figura 16), siguiendo el programa: 4˚C, 18000 rpm, 30 minutos y usando un rotor JA.25.50, se desecha el precipitado, donde quedarán restos celulares. En el sobrenadante esta entre otros compuestos citoplasmáticos estará nuestra proteína de estudio, llamándose esta mezcla extracto crudo. Figura 15: Proceso de sonicación, sonicador DRH UP200 DR Hielsher. Figura 16: Centrifuga AvnantiTM J-25. 16 3.3.2.2. Precipitación con sulfato de amonio El extracto crudo obtenido es tratado con sulfato de amonio molido con el fin de conseguir la precipitación de proteínas y restos celulares no deseados. La adición se realiza lentamente para evitar que se produzcan una acidificación no homogénea y pueda dañar la proteína, se agrega sulfato de amonio molido hasta una saturación del 60% (36.1 gramos por cada 100ml de extracto crudo). La adición se hará en frío (el vaso debe estar dentro de una cubeta con hielo), con agitación y en oscuridad (cubierto de papel de plata) (figura 17). Se deja reposar en estas condiciones durante 30 minutos para conseguir una precipitación satisfactoria. En esta etapa se eliminan muchos restos celulares así como una gran cantidad de proteínas. Centrifugar en frío a 4°C, 18000rpm y 30 minutos (rotor JA 25.50). Se elimina el precipitado, el cual contendrá todavía restos celulares y alguna proteína; en el sobrenadante se encontrará la proteína de estudio (flavodoxina). El sobrenadante obtenido se pondrá en un vaso cubierto de papel de plata, con un pequeño testigo para que cuando se adicione a la columna se vea por dónde va el nivel. 3.3.2.3. Cromatografía de intercambio iónico en gradiente reverso de sulfato de amonio El sobrenadante obtenido de la precipitación con sulfato de amonio al 60%, se carga en una columna de DEAE-celulosa (figura 18); previamente equilibrada. El equilibrado se realiza pasando 200-300ml de Tris-HCl 50mM pH 8 y posteriormente 3 volúmenes (450ml) de TRIS-HCl 50mM pH 8 con sulfato amónico al 60%. Se realiza en la cámara fría y aquí es donde se adicionará también el sobrenadante obtenido en la precipitación con sulfato de amonio. Terminado este paso se lava la columna con 3 volúmenes (450 ml) de tampón Tris-HCl 50 mM con sulfato amónico al 60%. Figura 17: Proceso de precipitación con sulfato de amonio. Figura 18: Columnas de DEAE-celulosa (ya equilibradas) cargando el sobrenadante obtenido de la precipitación del extracto crudo con sulfato de amonio. Sistema montado en la cámara fría para mantener la temperatura de 4ºC. 17 3.3.2.4. Purificación medidante FPLCTM Con la concentración de sal utilizada la flavodoxina se quedará retenida en la columna, eluyendo de esta manera otras proteínas. Para conseguir eluir nuestra proteína ahora fijada en la columna, se hará un gradiente reverso de sulfato amónico (60% al 0%). Este gradiente reverso se realiza con la ayuda del sistema de ÄKTA prime (figura 19) pudiendo recoger de forma automatizada fracciones de 6.5 ml. Bien ayudados por el cromatograma (figura 20) cuando aparezca el pico de absorbancia UV-Vis, como por la característica coloración naranja que presenta la holoflavodoxina de Anabaena debido a su unión al cofactor FMN. Todas las disoluciones utilizadas en el AKTA deberán estar previamente desgasificadas, utilizando un equipo de vacío (figura 21), evitando de esta manera la entrada de impurezas y burbujas en el equipo. Figura 20: Cromatograma del primer paso de purificación cromatográfica de la flavodoxina de Anabaena. El color azul representa la absorbancia en el UV-VIS a 280nm y en color verde el gradiente aplicado. Disoluciones purificadas y desgasificadas: 1ª cromatografía TRIS-HCl 50mM pH 8 con sulfato mónico al 60% Tris 50mM pH 8 2ª cromatografía Tris 50mM pH 8 TRIS-NaCl 0.5M Agua milliQ (lavado del equipo) Figura 19: ÄKTA prime Figura 20: Equipo de vacío. Figura 21: Equipo de vacío. 18 3.3.2.5. Diálisis Las fracciones recogidas se dializarán 3 veces con TRIS-HCl 50mM pH 8 en frío y oscuridad (figura 23), cada 3-4 horas cambiar la diálisis. 3.3.2.6. Cromatografía en intercambio iónico en gradiente de cloruro de sodio La muestra dializada se carga en una segunda columna de DEAE-Celulosa equilibrada previamente con 450ml (3 volúmenes) de TRIS-HCl 50mM pH 8, se lava la columna con 3 volúmenes del mismo tampón (TRIS-HCl 50mM pH 8). La proteína se eluye con un gradiente salino de 0-0.5M de cloruro de sodio en el tampón de trabajo. Este gradiente reverso se realiza con la ayuda del sistema de ÄKTAprime (figura 19) pudiendo recoger de forma automatizada fracciones de 6.5 ml. Bien ayudados por el cromatograma (figura 20) cuando aparezca el pico de absorbancia UV-Vis, como por la característica coloración naranja que presenta la holoflavodoxina de Anabaena debido a su unión al cofactor FMN. . 3.3.2.7. Diálisis Las fracciones obtenidas se dializarán en TRIS-HCl 50mM pH 8 al igual que en el caso anterior 3 veces en frío y oscuridad (figura 23), cambiando cada 3-4 horas. La muestra se prepara en alícuotas y se conserva a -20°C. Figura 23: Proceso de Diálisis. Figura 22: Cromatograma del segundo paso de purificación cromatográfica de la flavodoxina de Anabaena. El color azul representa la absorbancia en el UV-VIS a 280nm y en color verde el gradiente aplicado. 19 3.3.3. Obtención apoflavodoxina La realización de todas las pruebas de caracterización espectroscópica así como los estudios de estabilidad, se llevaron a cabo usando la proteína en su forma apo (sin estar unida al FMN). En el proceso de obtención de la flavodoxina, se obtiene en su forma holo (unida al FMN). De esta manera las apoproteínas utilizadas en este trabajo se obtuvieron a partir de las holoproteínas correspondientes por precipitación con ácido tricloroacético (Edmondsn et al., 1971). Para cada ml de muestra se añaden 11µl de DTT 100mM y 101µl de TCA al 33% El TCA provoca la disociación del cofactor y como consecuencia su precipitación en medio ácido, y el DTT evita la formación de dímeros. Se produce una suspensión que deberá ser centrifugada en frío durante 5 minutos a 5000 rpm, el precipitado obtenido se resuspende en una solución fría de TCA al 3% y DTT 1mM volviendo a centrifugar en las mismas condiciones. Se repetirá tanta veces como haga falta hasta que el precipitado sea completamente blanco, esto será indicativo de que ha soltado todo el cofactor. La proteína precipitada se resuspende en MOPS 1M pH 7, para neutralizar el medio ácido. El resuspendido se dializa en centricones (Amicon® Ultra-15 de Millipore) con MOPS 50mM pH 7 las veces necesarias hasta que la proteína este a una concentración de 400-700mM. Los ciclos de centrifugación fueron de 3 a 5 minutos a 4000 rpm. La proteína se alicuota y almacena a -20ºC. 3.3.4. Electroforesis desnaturalizante: Phast System La comprobación de la pureza de las proteínas purificadas se realiza haciendo una electroforesis desnaturalizante (SDS) en gel de poliacrilamida (PhastGelTM Gradient 8-25). La electroforesis se lleva a cabo en el equipo Phast System (figura 24). La separación de las proteínas se realiza en función de su tamaño molecular, las proteínas pequeñas migraran de forma más rápida y las de mayor tamaño lo harán de forma más lenta. Para la visualización se usa tinción con Azul de Coomassie; la aparición de una única banda, de peso molecular esperado, es indicativa de una alta pureza. Figura 24: Phast System. 20 3.4. Caracterización Espectroscópica Las flavodoxinas han sido caracterizadas espectroscópicamente mediante sus espectros de absorción en el UV-visible, de emisión de fluorescencia y de dicroísmo circular en el UV-lejano y en el UV-cercano. Los coeficientes de extinción de las apoproteínas mutantes no se han determinado de manera experimental ya que las tirosinas y triptófanos no se encuentran mutados en ninguno de ellos. Se trabajará con el coeficiente de la apoproteína WT que a 280nm es de 34.1±0.5 cm-1·mM-1 (Genzor et al., 1996a). 3.4.1. Absorbancia UV-VIS El espectro de Absorbancia de las proteínas presenta picos característicos comunes, y en ocasiones, otros picos de máxima absorción correspondiente a cofactores, o moléculas unidas a la proteína analizada. En las proteínas los enlaces peptídicos absorben a longitudes de onda cercanas a los 200nm, los anillos aromáticos en la zona de 280nm. Los cofactores unidos a las proteínas también pueden presentar picos característicos que absorben entre los 400-700 nm. Los espectros de absorción UV-VIS fueron registrados utilizando el espectrofotómetro Cary 100 Bio (figura 25), realizando barridos entre 200-800nm. El tampón utilizado fue MOPS 50mM, pH 7.0. Una característica importante de la absorbancia es su proporcionalidad con la concentración de compuesto; sigue la ley de Lambert-Beer (ec.3.4.1.1). En este estudio, se ha utilizado esta propiedad para calcular la concentración de las muestras de apoflavodoxina, y además, como comprobación de la eliminación del cofactor FMN. ec.3.4.1.1. Figura 25: Espectrofotómetro Cary 100 Bio. 21 La pureza y concentración de los mutantes analizados se ha determinado tomando como referencia los datos espectroscópicos de la flavodoxina recombinante WT. (ε274=34.1mM-1). 3.4.2. Emisión de Fluorescencia El fenómeno de emisión de fluorescencia consiste en la liberación, mediante la emisión de fotones de energía ligeramente inferior a la energía luminosa previamente absorbida por una molécula. Por ello, la longitud de onda de emisión de fluorescencia es mayor a la de absorción. Los fluoróforos de las proteínas son los residuos aromáticos y algunos cofactores, (trabajamos con la proteína en forma apo, con los cual los únicos fluoróforos serán los aminoácidos aromáticos). El triptófano aporta normalmente la mayor parte de la señal de fluorescencia de las proteínas y presenta un máximo de emisión de fluorescencia a 355 nm en estado libre, mientras que en una proteína aparece a valores menores que dependerá del entorno en el que se encuentre. Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron con una resolución de 1 nm en el espectrofluorímetro termostatizado Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (figura 26), utilizando una cubeta cuadrangular de 1 cm de paso de luz. En el caso de los espectros de emisión en el UV, se registro la señal de 300 a 400 nm a una velocidad de barrido de 50 nm.s-1; habiendo excitado previamente a 280 nm. Las muestras fueron preparadas a una concentración de proteína de 2µM en MOPS 50 mM pH 7.0. 3.4.3. Espectros de Dicroísmo Circular La actividad óptica de las proteínas es también de gran utilidad. Un cromóforo muy interesante que aparece en todas las proteínas es el enlace peptídico. Aunque el enlace peptídico por si no es una estructura quiral (con actividad óptica o capacidad de absorber de modo distinto luz polarizada a la derecha o la izquierda), la intereacción entre grupos peptídicos adyacentes dispuestos en Figura 26: Espectrofluorímetro termostatizado Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer 22 determinadas orientaciones determina que las proteínas presenten actividad óptica (C. Gómez- Moreno, J. Sancho, 2003), de igual manera ocurre con los aminoácidos aromáticos; el entorno que ocupan es el responsable de esa actividad óptica. Esta diferencia de absorción es lo que se llama dicroísmo circular (DC). En las proteínas lo aminoácidos aromáticos y la cadena peptídica producen una rotación óptica y un espectro de DC (S. Ayuso, 2012). Se utilizó un espectropolarímetro Chirascan de Applied Photophysics (figura 27). Las condiciones para el dicroísmo circular UV en el cercano y en el lejano fueron diferentes. 3.4.3.1. UV lejano En la región 180-250nm, presentan señal los enlaces peptídicos, por lo que se puede utilizar para conocer el contenido de hélices α y láminas β de una muestra proteica. La concentración de apoflavodoxina utilizada fue de 20µM en MOPS 5mM y NaCl 15mM final. Las cubetas usadas fueron de anchura de 1mm, con una resolución de 0.5nm a una velocidad de 20nm·min-1 y en un rango de longitud de onda entre 200nm-250nm. La señal experimental se obtiene en grados de elipticidad (θ) y ha de transformarse en elipticidad molar por residuo, ec.3.4.3.1.1. ec.3.4.3.1.1. [ ] ( ) ( ) Figura 27: Espectropolarímetro Chirascan Applied Photophysics 23 Donde θ es la señal experimental obtenida, c es la concentración en M, l es la anchura de la cubeta en centímetros y N es el número de aminoácidos de la proteína. 3.4.3.2. UV cercano En la región 250-310 nm, presentan señal los aminoácidos aromáticos, y depende considerablemente de la estructura terciaria de la proteína. La concentración de apoflavodoxina utilizada fue de 20µM en MOPS 5mM pH 7.0. Las cubetas usadas fueron de anchura de 0.4 cm, con una resolución de 0.5 nm a una velocidad de 20nm·min-1 y en un rango de longitud de onda entre 250nm-310nm. La señal experimental se obtiene en grados de elipticidad (θ) y ha de transformarse en elupticidad molar, ec.3.4.3.2.1. ec.3.4.3.2.1. [ ] ( ) ( ) Donde θ es la señal experimental obtenida, c es la concentración en M, l es la anchura de la cubeta en centímetros y N es el número de aminoácidos de la proteína. 3.5. Estabilidad conformacional 3.5.1. Desnaturalización química Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición de urea) provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que estos solutos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas (C. Gómez- Moreno, J. Sancho, 2003). El procedimiento consiste en seguir a diferentes concentraciones de urea la emisión de fluorescencia de los triptófanos y las tirosinas de la proteína, aprovechando que presentan diferente rendimiento cuántico en el estado nativo y en el estado desnaturalizado (M. Bueno, 2006). En esta proteína en concreto, la emisión de fluorescencia del estado nativo es mayor que la del desnaturalizado (Genzor et al., 1996a). 24 3.5.2. Preparación de disoluciones de urea Se preparan disoluciones a distinta concentraciones de urea (tabla 1) (para poder seguir la transición entre el estado nativo y desplegado) por pesada en balanza analítica y enrasadas en matraces aforados de 25ml con H2O milli-Q. [Urea]final [Urea]real g Urea/25 ml 0 0,2 0 0,22 0 0,33033 0,4 0,44 0,66066 0,6 0,66 0,99099 0,8 0,88 1,32132 1 1,1 1,65165 1,2 1,32 1,98198 1,4 1,54 2,31231 1,6 1,76 2,64264 1,8 1,98 2,97297 2 2,2 3,3033 2,2 2,42 3,63363 2,4 2,64 3,96396 2,6 2,86 4,29429 2,8 3,08 4,62462 3 3,3 4,95495 3,2 3,52 5,28528 3,4 3,74 5,61561 3,6 3,96 5,94594 3,8 4,18 6,27627 4 4,4 6,6066 4,2 4,62 6,93693 4,4 4,84 7,26726 4,6 5,06 7,59759 4,8 5,28 7,92792 5 5,5 8,25825 5,2 5,72 8,58858 5,4 5,94 8,91891 5,6 6,16 9,24924 5,8 6,38 9,57957 6 6,6 9,9099 6,2 6,82 10,24023 6,4 7,04 10,57056 6,6 7,26 10,90089 6,8 7,48 11,23122 7 7,7 11,56155 7,2 7,92 11,89188 Tabla 1: Preparación de las distintas disoluciones de Urea. 31 figura 33. Tanto las muestras como los buffer se desgasificaron utilizando un desgasificador ThermoVac MicroCalTM (figura 34), evitando de esta manera la entrada de burbujas al equipo que nos darían como consecuencia lecturas erróneas. La desnaturalización térmica de las apoflavodoxinas se realizó en condiciones de concentración de proteína 40µM en MOPS 50 mM pH 7, con una velocidad de barrido de 1 ºC/min y en rampa de temperatura de 10-100ºC. 3.6.4. Análisis de datos obtenidos por calorimetría diferencial de barrido (DSC) Los datos obtenidos por esta técnica se analizaron preliminarmente sin ser necesario un ajuste fino para saber si las proteínas propuestas (mutantes 3M+D100N y 3M+A142V) se ajustaban a un modelo de una sola transición, es decir, un desplegamiento basado en dos estados (nativodesnaturalizado). Se restará la línea base correspondiente al Buffer MOPS 50mM pH 7, se normalizará por concentración (las disoluciones de muestra se prepararon a 40µM) y por último se restará la contribución química. Se obtendrá un termograma (figura 32) del cual se obtendrán los datos: Tm, ΔHcal (calor requerido para desnaturalizar 1 molécula de proteína) y ΔCp. Con estos datos se calculará la Entalpía de van´t Hoff (ec.3.6.4.1) ec.3.6.4.1. El cociente entre ΔHVH y ΔHcal nos dará la información del proceso de desplegamiento que sufre nuestra proteína. Siendo: un proceso de dos estados cuando el cociente sea igual 1, un proceso con presencia de intermediario cuando el cociente sea <1 y reflejando una asociación en el estado nativo cuando el cociente sea >1. Figura 33: Microcalorímetro diferencial de barrido VP-DSC Microalorimeter, MicroCalTM Figura 34: Desgasificador ThermoVac MicroCalTM 32 4. Resultados Con el objetivo de profundizar en el conocimiento sobre estrategias para conseguir la estabilización de las proteínas, se procedió a sintetizar dos grupos de mutantes que se diferencian en la proteína de partida. Un primer grupo fue realizado sobre la proteína WT, el segundo grupo de mutantes fueron obtenidos a partir de uno ya existente en nuestro departamento que contiene 3 mutaciones (3M (E20K/E72K/D126K). Este triple mutante es mucho más estable que la proteína WT (Bueno, 2006). 4.1. Obtención de mutantes de la apoflavodoxina de Anabaena PCC 7119. Con los plásmidos que contenían los genes mutados correspondientes a cada mutante se transformaron células BL21 de E. coli, fueron cultivadas de las cuales se purificaron las proteínas mutadas. Estas se obtienen en su forma holo: complejo de la apoflavodoxina con el FMN. El FMN se eliminó según el procedimiento habitual obteniéndose las apoflavodoxinas mutadas. Podemos señalar que durante el proceso de purificación todos los mutantes se comportaron de forma similar a la proteína silvestre con ligeros retrasos en la fase de elución manteniendo el color naranja, típico de la presencia del FMN unido a la flavodoxina, con la excepción de los mutante D100N (figura 35) y E20K/E72K/D126K/G87V (figura 36), los cuales no presentaron color. El mutante E20K/E72K/D126K/D100N durante el lavado con el tampón de sulfato de amonio en la cromatografía de intercambio iónico en gradiente reverso de sulfato de amonio en lugar de Figura 36: Primer paso de la transformación de holo a apoflavodoxina, a la izquierda el mutante E20K/E72K/D126K/G87V, el cual no presenta la coloración debida al FMN. A la derecha el mutante E20K/E72K/D126K/D100N, el cual presenta la coloración característica. Figura 35: Mutante D100N cargado en la columna de DEAE-celulosa, no presenta la coloración característica de las holoflavodoxinas debida a su unión al cofactor FMN. 33 quedarse retenido a la columna, se empezó a eluir de esta una solución naranja, recogiendo lo eluido en este paso y lo obtenido durante el gradiente para ver si se trataba de la misma proteína o era FMN libre que eluia con algún compuesto. Se realizó una electroforesis desnaturalizante de ambas muestras como comprobación (figura 37). Para asegurarse de que ambas muestras correspondían a la misma proteína, se mandaron alícuotas de ambas a la empresa Matrix Science (http://www.matrixscience.com), obteniendo resultados de espectroscopía de masas a través de tripsinado; concluyendo que se trataba de la misma proteína (Flavodoxina de Anabaena PC 7119.) Datos referentes a la alícuota recogida durante el lavado de la columna: Nominal mass (Mr): 19009; Calculated pI value: 4.17 NCBI BLAST search of FLAV_ANASO against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Nostoc sp. PCC 7119 Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P Sequence Coverage: 27% Matched peptides shown in Bold Red 1 MSKKIGLFYG TQTGKTESVA EIIRDEFGND VVTLHDVSQA EVTDLNDYQY 51 LIIGCPTWNI GELQSDWEGL YSELDDVDFN GKLVAYFGTG DQIGYADNFQ 101 DAIGILEEKI SQRGGKTVGY WSTDGYDFND SKALRNGKFV GLALDEDNQS 151 DLTDDRIKSW VAQLKSEFGL Start - End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Sequence 5 - 15 1184.5875 1183.5802 1183.6237 -0.0435 0 K.IGLFYGTQTGK.T (No match) 5 - 15 1184.5875 1183.5802 1183.6237 -0.0435 0 K.IGLFYGTQTGK.T (Ions score 81) 136 - 156 2322.0110 2321.0037 2321.0771 -0.0734 1 R.NGKFVGLALDEDNQSDLTDDR.I (No match) 136 - 156 2322.0110 2321.0037 2321.0771 -0.0734 1 R.NGKFVGLALDEDNQSDLTDDR.I (Ions score 11) 139 - 156 2022.8575 2021.8502 2021.9178 -0.0676 0 K.FVGLALDEDNQSDLTDDR.I (No match) 139 - 156 2022.8575 2021.8502 2021.9178 -0.0676 0 K.FVGLALDEDNQSDLTDDR.I (Ions score 134) 139 - 158 2264.0278 2263.0205 2263.0968 -0.0763 1 K.FVGLALDEDNQSDLTDDRIK.S (No match) 139 - 158 2264.0278 2263.0205 2263.0968 -0.0763 1 K.FVGLALDEDNQSDLTDDRIK.S (Ions score 110) 159 - 170 1364.6713 1363.6640 1363.7136 -0.0496 1 K.SWVAQLKSEFGL.- (No match) 159 - 170 1364.6713 1363.6640 1363.7136 -0.0496 1 K.SWVAQLKSEFGL.- (Ions score 69) Figura 37: Gel desnaturalizante donde de izquierda a derecha se puede ver: 1)WT, 2)Marcador de peso Molecular, 3) y 4) Fracción eluida con el tampón de lavado, 5) y 6) Fracciones recogidas después de la cromatografía de intercambio iónico en gradiente reverso de sulfato de amonio. 1 2 3 4 5 6 34 Datos referentes a la alícuota recogida durante el lavado de la columna: Nominal mass (Mr): 19009; Calculated pI value: 4.17 NCBI BLAST search of FLAV_ANASO against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Nostoc sp. PCC 7119 Fixed modifications: Carbamidomethyl (C) Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P Sequence Coverage: 27% Matched peptides shown in Bold Red 1 MSKKIGLFYG TQTGKTESVA EIIRDEFGND VVTLHDVSQA EVTDLNDYQY 51 LIIGCPTWNI GELQSDWEGL YSELDDVDFN GKLVAYFGTG DQIGYADNFQ 101 DAIGILEEKI SQRGGKTVGY WSTDGYDFND SKALRNGKFV GLALDEDNQS 151 DLTDDRIKSW VAQLKSEFGL Start - End Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Sequence 5 - 15 1184.5916 1183.5843 1183.6237 -0.0394 0 K.IGLFYGTQTGK.T (No match) 5 - 15 1184.5916 1183.5843 1183.6237 -0.0394 0 K.IGLFYGTQTGK.T (Ions score 72) 136 - 156 2322.0188 2321.0115 2321.0771 -0.0656 1 R.NGKFVGLALDEDNQSDLTDDR.I (Ions score 11) 139 - 156 2022.8680 2021.8607 2021.9178 -0.0571 0 K.FVGLALDEDNQSDLTDDR.I (No match) 139 - 156 2022.8680 2021.8607 2021.9178 -0.0571 0 K.FVGLALDEDNQSDLTDDR.I (Ions score 81) 139 - 158 2264.0330 2263.0257 2263.0968 -0.0711 1 K.FVGLALDEDNQSDLTDDRIK.S (No match) 139 - 158 2264.0330 2263.0257 2263.0968 -0.0711 1 K.FVGLALDEDNQSDLTDDRIK.S (Ions score 102) 159 - 170 1364.6749 1363.6676 1363.7136 -0.0460 1 K.SWVAQLKSEFGL.- (No match) 159 - 170 1364.6749 1363.6676 1363.7136 -0.0460 1 K.SWVAQLKSEFGL.- (Ions score 91) Esto nos indica que habría un mal empaquetado de la columna, con el consiguiente eluido de la proteína cuando se realizó el lavado con el tampón sulfato de amonio. Una vez obtenidas las proteínas, se determinó el grado de pureza mediante electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida, obteniéndose en cada caso una única banda a la altura esperada comparada con la apoflavodoxina silvestre de Anabaena PCC 7119 usada como control (figura 38). 4.2. Caracterización Espectroscópica Se han obtenido espectros de absorbancia UV-Visible, emisión de fluorescencia y dicroísmo circular en el UV-cercano y lejano, para realizar una caracterización espectroscópica de los mutantes 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 38: Gel de poliacrilamida (PhastGelTM Gradient 8-25. Donde puede verse en los carriles: 1. WT, 2. I59A, 3. D100N, 4. A142V, 5. E20K/E72K/D126K (3M), 6. E20K/E72K/D126K/G87V, 7. E20K/E72K/D126K/D100N, 8. E20K/E72K/D126K/A142V. 35 de apoflavodoxina. Con estas técnicas podemos tener información relacionada con la integridad estructural de los mutantes. 4.2.1. Absorbancia UV-VIS Esta caracterización espectroscópica se realizó al concluir el paso de Holo a Apo-flavodoxina, para poder calcular su concentración. A partir de los espectros (figura 39) se determinó la concentración de cada mutante a 280nm (Genzor et al., 1996a) basándose en el coeficiente de extinción de la apoflavodoxina silvestre a esa longitud de onda (34.10.5 cm-1.mM-1). 300 400 500 600 700 0,0 0,2 Absorbancia Longitud de Onda (nm) WT I59A D100N A142V 3M 3M+D100N 3M+G87V 3M+A142V Se ve como se encuentran en la forma apoflavodoxina, ya que no presentan absorción en la zona donde se une el FMN a las proteína (figura 40). Figura 39: Espectros de Absorbancia de los mutantes estudiados al final del proceso de purificación Figura 40: Espectro de absorbancia de la holoflavodoxina, se ven los picos característicos correspondientes al FMN, ausentes en el espectro de la apoflavodoxina. 36 4.2.2. Dicroísmo circular en el cercano En la región del ultravioleta cercano, los cromóforos más importantes son los grupos aromáticos de las cadenas laterales de triptófano, tirosina, y fenilalanina. Ya que la asimetría en estos grupos químicos, se debe exclusivamente a su entorno y como los residuos aromáticos se encuentran distribuidos en toda la macromolécula, los espectros en esta región son un reflejo de la conformación global de la proteína. Además las señales en esta región son extremadamente sensibles a los cambios en la conformación (C. Gómez-Moreno, J. Sancho, 2003). Si miramos con detalle el espectro de dicroísmo circular en el cerno a 25ºC (figura 41) vemos una gran similitud entre la mayoría de las muestras, lo cual quiere decir que no ha habido un cambio de estructura, hay una similitud estructural. 3M +A142V 3M + D100N 3M+ G87V A142V I59A D100N 3M WT 250 260 270 280 290 300 310 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitus de onda (nm) Se registró de igual manera el espectro de las apoflavodoxinas a una temperatura de 90ºC, donde se puede observar como la estructura terciaria se ha perdido debido a la desnaturalización sufrida como consecuencia de estas condiciones de temperatura (figura 42). Figura 41: Espectros de dicroísmo circular en el cercano (DCC), 25 C en MOPS 50 mM. pH 7.0 con una concentración de proteína de 20µM. 37 250 260 270 280 290 300 310 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 D100N WT 3M I59A A142V 3M + G87V 3M + D100N 3M + A142V M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitus de onda (nm) 4.2.3. Dicroísmo circular en el lejano Los espectros de dicroísmo en la región del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí. La asimetría de estos cromóforos se debe al arreglo espacial de la cadena principal de la proteína, por lo cual, las señales de dicroísmo circular se pueden interpretar en términos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir, del porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformación estructural (hélices α, hojas β, giros y otros tipos estructurales). Si miramos los espectros (figura 43) obtenido de las diferentes muestras vemos al igual que en el caso anterior una gran similitud entre ellas, con lo cual no ha ocurrido una modificación estructural como resultado de las mutaciones. Los mutantes mostraron la misma forma en los espectros comparados con las proteínas de partida lo que sugiere la conservación de la estructura e interacciones entre sus residuos. Figura 42: Espectros de dicroísmo circular en el cercano (DCC), 90 C en MOPS 50 mM. pH 7.0 con una concentración de proteína de 20µM. 38 200 210 220 230 240 250 260 -30000 -20000 -10000 0 10000 20000 M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitud de onda (nm) WT I59A D100N A142V 3M 3M + G87V 3M+D100N 3M+A142V Se registró de igual manera el espectro de las apoflavodoxinas a una temperatura de 90ºC, donde se puede observar como la estructura terciaria se ha perdido debido a la desnaturalización sufrida como consecuencia de estas condiciones de temperatura (figura 44). 210 220 230 240 250 260 -30000 -25000 -20000 -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 20000 25000 M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitud de onda (nm) WT I59A D100N A142V 3M 3M+G87V 3M+D100N 3M+A142V Figura 43: Espectros de dicroísmo circular en el lejano (DCL), 25 C en MOPS 5 mM. NaCl 15mM pH 7.0 con una concentración de proteína de 20µM. Figura 44: Espectros de dicroísmo circular en el lejano (DCL), 95 C en MOPS 5 mM. NaCl 15mM pH 7.0 con una concentración de proteína de 20µM. 39 4.2.4. Emisión de fluorescencia El triptófano aporta normalmente la mayor parte de la señal de fluorescencia de las proteínas y presenta un máximo de emisión de fluorescencia ≈ 355 nm en el estado libre, mientras que en una proteína aparece a valores menores, dependerá del entorno en el que encuentre. Los espectros obtenidos para las proteínas diseñadas se pueden ver en la figura 45. Se registró de igual manera el espectro de las apoflavodoxinas a una temperatura de 90ºC (figura 46), donde se puede observar como la estructura terciaria se ha perdido debido a la desnaturalización sufrida como consecuencia de estas condiciones de temperatura, puede verse de manera muy clara en la tabla 2. WT I59A D100N A142V 3M 3M+G87V 3M+D100N 3M+A142V λmax. 25ºC (nm) 336 337 338 337 335 339 337 336 λmax. 90ºC(nm) 354 356 354 353 353 352 353 353 300 320 340 360 380 400 0 100 200 300 400 500 600 700 WT D100N I59A A142V 3M 3M+G87V 3M+D100N 3M+A142V Intensidad (a,u) Longitud de onda (nm) Figura 45: Espectros de emisión de fluorescencia. 2µM de proteína, 50mM MOPS pH 7, 25ºC. Tabla 2: Longitudes de onda donde la emisión de fluorescencia es máxima a 25ºC y a 90ºC. 40 4.3. Desnaturalización Química por Urea. La estabilidad de las 8 proteínas fue analizada mediante desnaturalización en equilibrio con urea. Las proteínas se agrupan claramente en dos, dependiendo de la proteína de partida para su diseño, se representaran por un lado todas las proteínas (figura 47) y por otro lado las proteínas basadas en triple mutante (figura 48). Las gráficas del ajuste de cada uno de los mutantes así como el de sus replicas, pueden verse en el apéndice. Si la curva se encuentra desplazada hacia la derecha corresponderá con mutaciones estabilizantes, mientras que si se desplaza hacia la izquierda serán desestabilizantes. -1 012345678 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 WT I59A D100N A142V 3M 3M+G87V 3M+D100N 3M+A142V S. Normalizada [Urea] 300 320 340 360 380 400 100 200 300 400 500 600 700 WT I59A D100N A142V 3M 3M+G87V 3M+D100N 3M+A142V Intensidad (a.u) Longitud de onda (nm) Figura 46: Espectros de emisión de fluorescencia. 2µM de proteína, 50mM MOPS pH 7, 90ºC. Figura 47: Curvas de desnaturalización con Urea. Análisis para mutantes respecto a WT. Las condiciones de ensayo se encuentran descritas en Materiales y Métodos. 47 4.4.2. Ajuste a un modelo de 2 estados Se observaron proteínas que o no se ajustan a un modelo de 3 estados (3M+A142V) o lo hacían dejando muy poca separación entre las Tm (3M+D100N). Para ver si las mutaciones introducidas habían conseguido la obtención de una flavodoxina mutante en la que ya no se poblara el estado intermediario, se realizó un Test de dos estados. Para poder comprobar que la mutación diseñada cumple los requisitos adecuados, se debe realizar un test de dos estados como comprobación. Este test de 2 estados consiste en:  Análisis por técnicas espectroscópicas, las curvas serán superponibles. o (DCC, DCL, Absorbancia y Fluorescencia).  Calorimetría diferencial de barrido. Para que una proteína se ajuste a un modelo de 2 estados debe cumplir: Superposición de curvas obtenidas con distintas técnicas espectroscópicas (es una condición necesaria pero no suficiente) y transición de dos estados implica total cooperatividad (ausencia de otros estados parcialmente plegados, intermediarios). 4.4.2.1. Análisis mediante Técnicas Espectroscópicas Dado que se obtiene, para la misma proteína, cada una de las curvas se obtiene por técnicas espectroscópicas diferentes, han de ser normalizadas para equiparar el peso de cada una de ellas en el ajuste global (para obtener parámetros comunes que caractericen el proceso de desplegamineto) y facilitar así su análisis obteniendo amplitudes aparentes de aproximadamente 1. Se usará como proteína de referencia el 3M ya que en esta están basadas ambas proteínas sobre este triple mutante. Las técnicas espectroscópicas fueron analizadas mediante un ajuste global a un modelo de 2 estados usando el programa Origin. (Figura 54). 280 300 320 340 360 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 DCC Abs DCL Flu S. Normalizada Temperatura 280 300 320 340 360 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 DCC Abs DCL Flu S. Normalizada Temperatura Figura 54: Curvas de desnaturalización térmica seguida por DC lejano (DCL), DC cercano (DCC), absorbancia (Abs) y fluorescencia (Flu) correspondiente a las proteínas 3M+D100N y 3M+A142V. Los ajustes son representados por líneas continuas y son el resultado de un ajuste global de 2 estados. Cada curva fue obtenida como se describe en Materiales y Métodos. 3M+D100N 3M+A142V 48 Cuando un proceso de desnaturalización se ajusta a un modelo de 2 estados, se produce un solapamiento de las curvas espectroscópicas obtenidas condición necesaria pero no suficiente. Con el ajuste realizado usando el programa Orgin se obtuvieron los datos reflejados en la tabla 6. Proteína Técnica Tm1 (K) ΔH1 (Kcal/mol) Tm2 (K) ΔH2 (Kcal/mol) ΔGTotal (Kcal/mol) 3M Espectroscopia 323,2±0,08 37,47±0,46 340,1±0,05 69,70±0,91 --- 3M+D100N Espectroscopia --- --- 340,77±0,21 57,41±1,16 -0,113±0,013 3M+A142V Espectroscopia --- --- 340,90±0,24 52,36±0,97 -0,94±0,02 a)ΔGNI y ΔGIU fue calculado siguiendo la ecuación ( ) (como T usaremos 323.2) y los errores como ( ) (√( ) ( ( ) ( ) ) ) ΔΔGNI fue calculado por la y los errores como √( ) ( ) b) ΔΔGNU fue calculado siguiendo la ecuación y los errores como √( ) ( ) 4.4.2.2.Análisis mediante Calorimetría Diferencial de Barrido Los datos obtenidos por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de las proteínas 3M, 3M+D100N y 3M+A142V están reflejados en la tabla 7. Proteína Tm aparente (K) ΔHcal (cal/mol) Cpmax (cal/K·mol) ΔHVH (cal/mol) ΔHVH/ ΔHcal 3M 341,35 72.800 4350 55340 0.76 3M+D100N 341,75 77.800 6170 73600 0.95 3M+A142V 342,6 70.800 5560 73.300 1.04 Tabla 6: Valores obtenidos por técnicas espectroscópicas del mutante 3M (ajusta a un modelo de 3 estados) y de los mutantes 3M+D100N y 2M+A142V (ajustados a un modelo de 2 estados). Tabla 7: Valores obtenidos por calorimetría diferencial de barrido de los mutantes 3M, 3M+D100N y 3M+A142V. 49 5. Discusión Los resultados presentados en este trabajo fin de Máster están de acuerdo con los objetivos concretos planteados, como también a nivel de objetivos a largo plazo del grupo. 5.1. Cultivo y purificación Se sobre expresaron, cultivaron y purificaron todos las proteínas referidas en este trabajo, un total de 8, la WT y 7 mutantes. Cabe destacar el comportamiento anómalo de coloración presentado por dos mutantes: D100N (figura 35) y E20K/E72K/D126K/G87V (figura 36). Esta falta de coloración independientemente de hacer más complicada su purificación (no presentan una coloración que se pueda usar como referencia), nos indica que no unen o lo hace en una pequeña proporción el cofactor FMN; con lo cual aunque nos aportarán luz sobre su estabilidad y el diseño de mutaciones racionales, no podría hacerse con ellos un estudio posterior de unión al cofactor o de actividad biológica, si se hubiera conseguido con estas mutaciones despoblar el intermediario térmico. Las proteínas estudiadas se obtuvieron con un alto grado de pureza tras el proceso de purificación como indica la figura 38 (obtención de una única banda para cada una de ellas) y en la forma apoflavodoxina como se puede ver en la figura 39 (no aparecen los picos de absorción característicos del FMN en ninguno de los espectros de absorción). 5.2. Caracterización Espectroscópica 5.2.1. Espectros de absorbancia UV-Visible Los espectros de absorbancia además de ser útiles para conocer la concentración de nuestras proteínas de estudio y comprobar que están en la forma apoflavodoxina, sirven como un método sencillo de detección de casos de agregación proteica. Si miramos detenidamente los espectros de absorción obtenidos (figura 39), se observa como a partir de 320nm su espectro es completamente plano para todas las proteínas excepto para el mutante D100N; no habrá problemas de agregación. En el caso del mutante D100N so observa que cuando se aproxima a longitudes de onda más pequeñas deja de ser plana y asciende, debido a la dispersión de la luz que provocan las partículas de agregados. Para calcular su concentración y no sobrestimar excesivamente la concentración, debemos sustraer la línea base. 50 Si medimos cualquier propiedad cuyo valor no dependa de la concentración de muestra (cualquier propiedad de las denominadas intensivas: coeficientes de extinción, temperatura de desnaturalización…). Como la estabilidad conformacional es una propiedad molecular que no depende, en principio, de la concentración de proteína (cada molécula se desnaturaliza sin mediación de las otras moléculas de proteína de la solución) se deberá obtener siempre la misma temperatura media de desnaturalización. Si fuera destinada a hacer cristalización o análisis de RMN habría sido descartada (C. Gómez-Moreno, J. Sancho, 2003). Todos los experimentos realizados en este trabajo se han hecho por duplicado, obteniendo para cada una de ellas valores reproducibles, debido a esto se realizó tanto el análisis conformacional como espectroscópico del mutante D100N (datos mostrados en resultados) pese al espectro de absorción registrado. 5.2.2. Espectros de dicroísmo circular en el cercano Los espectros de dicroísmo circular en el cercano a 25ºC (figura 41) nos dan una idea de cómo es su estructura terciaria, hay una gran similitud entre ellos, con la excepción de los mutantes A142V y D100N, denotando con esto que presentan una conformación terciaria similar. En el caso del mutante A142V se ve como se invierte el tamaño de los picos comprado con la WT y el resto de mutantes, el pico de la izquierda es de mayor altura que el de la derecha (figura 55). Respecto al mutante D100N se ve como presenta mas bien una meseta en la zona entre 280-300nm (figura 56), dándonos una información al igual que en caso anterior de que ambos mutantes presentan una estructura terciaria diferente a la proteína modelo. 250 260 270 280 290 300 310 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitud de onda WT A142V 250 260 270 280 290 300 310 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 M.R.E (deg·cm2·dmol-1) Longitud de onda WT D100N Figura 55: Esprecto de dicroísmo circular en el cercano del mutante A142V y la WT a 25ºC en MOPS 50mM pH 7 con una concentración de proteína de 20µM. Figura 56: Esprecto de dicroísmo circular en el cercano del mutante D100N y la WT a 25ºC en MOPS 50mM pH 7 con una concentración de proteína de 20µM. 51 Los espectros de dicroísmo circular en el cercano a 90ºC (figura 42) nos demuestran que a una temperatura de 90ºC las proteínas no presentan una estructura terciaria, se encuentran desnaturalizadas todas ellas. 5.2.3. Espectros de dicroísmo circular en el lejano Los espectros de dicroísmo circular en el lejano a 25ºC (figura 43) nos muestran una gran similitud en todo ellos, observando el mismo esquema en todos con un mínimo entorno a 200nm; como consecuencia todos tendrán una similar estructura secundaria. Los espectros de dicroísmo circular en el lejano a 90ºC (figura 44) nos demuestran que a una temperatura de 90ºC las proteínas no presentan una estructura secundaria, se encuentran desnaturalizadas todas ellas presentando un mismo patrón. 5.2.4. Espectros de emisión de fluorescencia La emisión de fluorescencia nos da una idea de si una proteína presenta una conformación compacta o esencialmente desplegada. Los espectros de emisión de fluorescencia a 25ºC (figura 45) presentan un comportamiento similar, con unos valores de λmax similares entre ellos (tabla 1), aunque con algunas diferencias en la anchura de los picos, esto denota que el entorno que ocupan los aminoácidos aromáticos no es exactamente igual en todas ellas. Los espectros de emisión de fluorescencia a 90ºC (figura 46) nos demuestran que a una temperatura de 90ºC las proteínas no presentan una estructura secundaria, se encuentran desnaturalizadas todas ellas presentando un mismo patrón. Presentan una conformación desplegada ya que lo valores de λmax se desplazan al rango entre 350-355nm (tabla 1); esto se debe a que los aminoácidos aromáticos están completamente expuestos al solvente y no formando parte de una conformación compacta. 5.3. Desnaturalización Química por Urea El estudio conformacional mediante desnaturalización química por Urea, presenta un proceso que se ajusta a un modelo de 2 estados a diferencia de la desnaturalización térmica que se ajusta a un modelo de 3 estados debido a la existencia de un intermediario térmico. La apoflavodoxina en concreto presenta una emisión de fluorescencia del estado nativo mayor a la del estado desnaturalizado (Genzor et al., 1996a). 52 Se hicieron comparaciones de todos los mutantes frente a la WT, con el fin de saber como variaba la estabilidad del proceso con respecto a ella. Con estas comparaciones se puede sacar información de cómo actúan las mutaciones de los mutantes simple (llevan una sola mutación) pero no se puede saber cual es el comportamiento de los cuádruples, ya que hay 4 mutaciones comparada con la WT y lo que se verá es como el conjunto de todas ellas afecta a la estabilidad (figura 47 y tabla 3). Para poder saber como afecta la cuarta mutación introducida sobre la base del triple mutante, se realiza una comparación frente a este, de esta manera si que sabré como afecta esa mutación de manera individual (figura 48 y tabla 4). Las comparaciones se realizan mirando las ΔΔG (ec.5.3.1), comparando la variación de Energía libre de Gibbs entre el mutante y la WT o proteína de referencia. Valores negativos nos indicarán una estabilización, mientras que valores positivos nos indicarán una desestabilización del proceso. ec.5.3.1. ( ) ( ) ( ) ( ) Comparaciones frente a la WT: o Mutante I59A estabiliza, la mutación I59A es estabilizante. o Mutante D100N desestabiliza, la mutación D100N es desestabilizante. o Mutante A142V desestabiliza, la mutación A142V es desestabilizante. o Mutante E20K/E72K/D126K o 3M estabiliza, el conjunto de mutaciones son estabilizantes. o Mutante 3M+G87V estabiliza, el conjunto de mutaciones son estabilizantes. o Mutante 3M+D100N estabiliza, el conjunto de mutaciones son estabilizantes. o Mutante 3M+A142V estabiliza, el conjunto de mutaciones son estabilizantes. Cabe destacar que las mutaciones que desestabilizan el proceso, son las mismas que presentaban un comportamiento diferente en los espectros de dicroísmo circular en el cercano a 25ºC (figuras 55 y 56). Comparaciones frente al 3M (E20K/E72K/D126K): o Mutante 3M+G87V desestabiliza, la mutación G87V es desestabilizante o Mutante 3M+D100N desestabiliza, la mutación D100N es desestabilizante o Mutante 3M+A142V desestabiliza, la mutación A142V es desestabilizante En esta comparación se ve el efecto concreto de la nueva mutación introducida sobre el entorno del triple mutante, puede ser desestabilizante comparada frente a este, pero el conjunto de las 4 mutaciones puede ser estabilizante frente a la WT. 53 5.4. Desnaturalización Térmica 5.4.1. Ajuste a un modelo de 3 estados Como anteriormente se ha comentado, la flavodoxina de Anabaena presenta un intermediario térmico (Irún et al., 2001), por lo que su desnaturalización sigue un proceso de 3 estados. El objetivo que se plantea el grupo a largo plazo es la obtención de una flavodoxina mutante en la que ya no se pueble el intermediario. Se ha realizado un análisis y ajuste global de las curvas de desnaturalización térmica obtenidas por cuatro técnicas espectroscópicas diferentes para las 8 proteínas de estudio, ajustándose a un modelo de 3 estado solo 7 de ellas. Se trabajo de manera similar a lo realizado con la desnaturalización térmica, se hizo una comparación de todas frente a la WT para ver como el conjunto de las mutaciones que portaban afectaban a la estabilidad del proceso, y para poder saber como afecta la cuarta mutación introducida sobre la base del triple mutante, se realizó una comparación frente a este, de esta manera se sabrá como afecta esa mutación de manera individual a la estabilidad del proceso. Comparaciones frente a la WT (tabla 4 y figura 52): o Mutante I59A: estabilidad residual, relevante y total estabilizadas. La primera Tm se ha desplazado notablemente a temperaturas mayores y la segunda Tm apenas ha variado, disminuyendo así el rango de temperatura donde puebla el intermediario térmico. o Mutante D100N: estabilidad residual, relevante y total desestabilizadas. La primera Tm se ha desplazado a temperaturas menores y la segunda Tm apenas ha variado, aumentando así el rango de temperatura donde puebla el intermediario térmico. o Mutante A142V: estabilidad residual, relevante y total desestabilizadas. La primera Tm se ha desplazado considerablemente a temperaturas menores y la segunda Tm apenas ha variado, aumentando así el rango de temperatura donde puebla el intermediario térmico. o Mutante E20K/E72K/D126K o 3M: el conjunto de mutaciones afectan a la estabilidad residual, relevante y total estabilizándolas. La primera Tm se ha desplazado notablemente a temperaturas mayores así como la segunda, esto provoca una aumento en el salto entre una transición y otra (diferencia entre las Tm de 10.44 para la WT y 16.9 para el triple mutante). Debido a que se produce un estabilización en los términos residual y relevante y se produce un aumento en el salto entre un transición y otra, se eligió este mutante como modelo para probar nuevas mutaciones y poder conseguir así la desaparición de la población del intermediario térmico. 54 o Mutante 3M+G87V: el conjunto de mutaciones afectan a la estabilidad residual, relevante y total estabilizándolas. La primera Tm se ha desplazado notablemente a temperaturas mayores así como la segunda, pero a diferencia del mutante 3M se disminuye el salto entre una transición y otra (diferencia entre las Tm de 10.44 para la WT y 9.92 para el cuádruple mutante). Se ha producido una estabilización tanto de cada transición como del global pero con una disminución del rango de temperatura donde puebla el intermediario térmico. o Mutante 3M+D100N: el conjunto de mutaciones afectan a la estabilidad residual, relevante y total estabilizándolas. La primera Tm se ha desplazado notablemente a temperaturas mayores así como la segunda, pero a diferencia del mutante 3M se disminuye el salto entre una transición y otra (diferencia entre las Tm de 10.44 para la WT y 2.84 para el cuádruple mutante). Se ha producido una estabilización tanto de cada transición como del global pero con una disminución del rango de temperatura donde puebla el intermediario térmico. o Mutante 3M+A142V: no se ajusto a un modelo de 3 estados. Cabe destacar que las mutaciones que desestabilizan el proceso, son las mismas que presentaban un comportamiento diferente en los espectros de Dicroísmo circular en el cercano a 25ºC (figuras 55 y 56), así como una desestabilización del proceso de desnaturalización química por Urea (figura 47 y tabla3). 5.4.2 Ajuste a un modelo de 2 estados Se observaron proteínas que o no se ajusta han a un modelo de 3 estados (3M+A142V) o lo hacían dejando muy poca separación entre las Tm (3M+D100N). Para ver si las mutaciones introducidas habían conseguido la obtención de una flavodoxina mutante en la que ya no se poblara el estado intermediario, se realizó un ajuste a un modelo de 2 estados. En este caso la comparación se realizo exclusivamente frente al 3M, tomando este como referencia. 5.4.2.1. Ajuste mediante Técnicas Espectroscópicas Se ve como en el mutante 3M+A142V se produce un solapamiento de las 4 curvas espectroscópicas, indicativo de un ajuste a un modelo de 2 estados (figura 54). En cambio el mutante 3M+D100N sufre una solapamiento peor, cabe destacar la curva correspondiente al dicroísmo circular en el cercano, esta diferencia radica en la pendiente de la curva aunque al final de ella se puede ver como se produce el solapamiento. Las Tm fueron muy similares en ambos mutantes y al 3M, mientras que las ΔH de ambos mutantes fueron muy similares aunque menores a la del 3M. 55 El solapamiento de las curvas espectroscópicas es una condición necesaria a cumplir pero no suficiente, por esta razón se llevo a cabo un estudio mediante calorimetría diferencial de barrido. 5.4.2.2. Ajuste mediante Calorimetría Diferencial de Barrido Como pudo verse en el aparto de resultados, se realizó el análisis del mutante 3M (usado como proteína de referencia) así como de los mutantes 3M+D100N y 3M+A142V (proteínas sospechas de seguir un proceso de 2 estados). Se obtuvieron los parámetros de ΔHcal, Tm y ΔCpmax, calculando con ellos la entalpía de van´t Hoff (tabla 7). El cociente entre ΔHVH y ΔHcal nos dará la información del proceso de desplegamiento que sufre nuestra proteína; siendo: un proceso de dos estados cuando el cociente sea igual 1, un proceso con presencia de intermediario cuando el cociente sea <1 y reflejando una asociación en el estado nativo cuando el cociente sea >1. o Mutante 3M: se obtuvo una razón de 0.76 indicándonos como era de esperar, que sigue un modelo de 3 estados. Este resultado está en concordancia con lo obtenido mediante técnicas espectroscópicas. o Mutante 3M+D100N: se obtuvo una razón de 0.95 dándonos una información dudosa de si se ajusta a un modelo de 2 o 3 estados; como ocurría por técnicas espectroscópicas ya que unas conjunto de curvas se ajustaban a un modelo de 3 estados dando una diferencia entre Tm de 2.84 y cuando se hizo la replica de todas ellas no convergían en el ajuste y si lo hacían en un modelo de 2 ambos juegos de curvas. o Mutante 3M+A142V: se obtuvo una razón de 1.04 dándonos una información de que se trata de una proteína que se ajusta a un modelo de 2 estados. Este hecho justifica que mediantes técnicas espectroscópicas solo se ajuste a un modelo de 2 estados. Para no poner en duda que el mutante 3M+D100N no siga un modelo de 2 estados de manera tan clara a como lo hace el mutante 3M+A142V, y se trate de una información inconcluyente se realiza la siguiente discusión. Si se aplica un error del 5% a cada una de las entalpías (ΔHVH y ΔHcal) estaríamos en un rango del 10% de error en la razón obtenida entre ellas. El mutante 3M+D100N estaría en el rango [0.855-1.045] y el mutante 3M+A142V [0.94-0.114]. La flavodoxina de Anabaena se comporta como un monómero (Bueno. M, 2006), de esta manera no se ajustarían los valores mayores a 1 a esta característica de monómero. Si observamos el rango que presenta la razón entre ΔHVH y ΔHcal no cabe duda de que el mutante 3M+A142 sigue un modelo de 2 estados (0.94-1), mientras que el mutante 3M+D100N no es concluyente podría seguir un modelo de 2 estados o de 3 (0.855-1). 56 6. Conclusiones Con los resultados obtenidos a lo largo del trabajo fin de máster podemos llegar a las siguientes conclusiones: o Los mutantes D100N y 3M+G87V pierden su capacidad de unión al cofactor y como consecuencia su actividad biológica. o Todos los mutantes presentan una estructura secundaria similar. La estructura terciaria, también es similar con la excepción de los mutantes D100N y A142V. o Los mutantes I59A, 3M, 3M+G87V, 3M+D100N y 3M+A142V estabilizan el proceso de desnaturalización química con urea respecto a la WT, mientras que los mutantes D100N y A142V lo desestabilizan. o El mutante 3M+A142V no se ajusta a un modelo de 3 estados en el proceso de desnaturalización térmica seguido por cuatro técnicas espectroscópicas. Todos los demás mutantes analizados si se ajustan a un modelo de 3 estados. o Los mutantes I59A, E20K/E72K/D126K o 3M, 3M+G87V y 3M+D100N estabilizan la estabilidad residual, relevante y total del proceso de desnaturalización térmica, mientras que los mutantes D100N y A142V lo desestabilizan. o La información obtenida por calorimetría diferencial de barrido y técnicas espectroscópicas para el mutante 3M+D100N no es concluyente, pudiendo ajustarse un modelo de 2 estados o de 3. o El mutante 3M+A142V sigue un modelo de 2 estados, cumpliendo así los objetivos a largo plazo del grupo.