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Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es Trabajo Fin de Máster Relación estructura función en FAD sintetasas de origen procariótico Autor/es Silvia Baquedano Coarasa Director/es Milagros Medina Trullenque Ana Serrano Esteban Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza 2012 Relación estructura función en FAD Sintetasas de origen procariótico Silvia Baquedano Coarasa Máster en Biología Molecular y Celular Universidad de Zaragoza 2012 FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR PROYECTO MÁSTER RELACIÓN ESTRUCTURA FUNCIÓN EN FAD SINTETASAS DE ORIGEN PROCARIÓTICO Memoria presentada por SILVIA BAQUEDANO COARASA bajo la dirección de la Dra. MILAGROS MEDINA TRULLENQUE Y la Dra. ANA SERRANO ESTEBAN MÁSTER EN BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR ZARAGOZA, JUNIO DE 2012 Las Dras. Milagros Medina Trullenque, Catedrática del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza, Ana Serrano Esteban, investigador del citado Departamento, CERTIFICAN: Que el Proyecto Máster “ RELACIÓN ESTRUCTURA FUNCIÓN EN FAD SINTETASAS DE ORIGEN PROCARIÓTICO” ha sido realizado por la licenciada Silvia Baquedano bajo su dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular y en el Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos, Universidad de Zaragoza, y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para ser defendido y optar al Título de Máster en Investigación en Biología Molecular y Celular por la Universidad de Zaragoza. Zaragoza, Junio 2012 Fdo: Dr. MILAGROS MEDINA Fdo: Dr. Ana Serrano Dr Milagros Medina Facultad de Ciencias 50009-Zaragoza Tel (34)-976762476 Fax (34)-976762123 email: mmedina©unizar.es Índice CAPÍTULO 1: Introducción Introducción 5 1. FLAVINAS Y FLAVOPROTEÍNAS 1.1. Historia En 1879 Wynter Blyth, aisló del suero de leche de vaca un pigmento amarillo al que llamó “lactocromo”. Más tarde se aislaron otros pigmentos similares que fueron identificados como un componente de la vitamina B, la vitamina B2. Tras su síntesis química se pasó a denominar Riboflavina (RF), por su color amarillo (en latin flavus) y la cadena lateral de ribitil. Otto Warburg aisló de levaduras la primera flavoproteína que catalizaba la oxidación del NADPH a partir de oxígeno. Esta proteína tenía como cofactor un derivado de la RF, conocido como Riboflavina 5’fosfato o Mononucleótido de Flavina (FMN), que tenía un grupo fosfato en la cadena de ribitil de la RF. Más tarde, Hans Krebs encontró otra flavoproteína, la D-aminoácido oxidasa, con otra flavina como cofactor, el Dinucleótido de Flavina y Adenina (FAD), derivado de la condensación de FMN y AMP. Desde entonces fue demostrada la necesidad de la RF como precursor de los cofactores enzimáticos. 1.2. Estructura Las flavinas son compuestos heterocíclicos que tienen en común un anillo de isoaloxacina, que les otorga las propiedades redox. Las flavinas que se encuentran en la naturaleza son derivados del lumicromo o 7,8-dimetil-isoaloxacina, y las más relevantes son la RF o vitamina B2 (7,8-dimetil-10-(1’-D-ribitil) isoaloxacina), y sus derivados FMN y FAD (Figura 1.1.). Figura 1.1. Derivados del anillo de isoalozacina. En rojo aparecen las formas biológicamente relevantes. Silvia Baquedano Coarasa 6 1.3. Función Excepcionalmente, las flavinas pueden actuar como coenzimas de una familia de óxido-reductasas, que catalizan la reducción de RF, FMN y FAD por NAD(P)H (Fieschi, et al., 1995). Sin embargo, la principal función de las flavinas es la de actuar como grupos prostéticos de un gran número de proteínas de óxido-reducción conocidas como flavoproteínas. Estas flavoproteínas están implicadas en numerosos procesos biológicos como el metabolismo aeróbico, el desarrollo embrionario (Murty, et al., 1982), la transducción de señales en la muerte celular programada (Susin, et al., 1999), o la regulación de relojes biológicos (Ishikawa, et al., 1999). También participan en procesos dependientes de la luz, como la fotosíntesis (Zanetti, et al., 1991) o la reparación del DNA (Jorns, et al., 1987). Dado el gran número de flavoproteínas y flavoenzimas implicadas en el metabolismo celular en todos los organismos, la deficiencia de flavinas impediría el ensamblaje de numerosas holoproteínas esenciales para la célula, causando la acumulación de las correspondientes apoproteínas, incapaces de realizar sus funciones, e induciendo alteraciones metabólicas relacionadas con estados fisiológicos o patológicos (Serrano, et al., 2012a). 1.4. Propiedades redox La principal propiedad de las flavinas es la capacidad de experimentar reacciones de óxido-reducción. De forma general, el anillo de isoaloxacina es la parte de la molécula que participa en los procesos de reducción, pudiendo acoplar en flavoproteínas procesos de óxido-reducción de dos electrones con procesos de transferencia de un único electrón. El resto de la cadena sólo tiene función estructural. El anillo de isoaloxacina en flavoproteínas puede presentarse en tres estados de reducción: la forma oxidada o quinona, la forma semiquinona o reducida por un único electrón, y la forma hidroquinona o reducida por dos electrones (Müller, 1991). Además, cada estado de reducción puede encontrarse en forma catiónica, aniónica o neutra según el pH. Introducción 7 1.5. Propiedades espectroscópicas 1.5.1. Absorción UV-Visible El espectro de absorción de las flavinas es diferente para los distintos estados de oxidación debido a la distinta distribución electrónica en el anillo de isoaloxacina. El espectro de las flavinas oxidadas presenta tres máximos de absorción a longitudes de onda mayores de 250 nm, en torno a 265, 370 (banda II) y 445 nm (banda I) (Figura 1.2.). Aunque la forma general del espectro está muy poco influída por el sustituyente en N10, la intensidad de las bandas y la posición del máximo de la banda I difieren en el caso del FAD (450 nm) debido a la formación de un complejo entre los anillos de isoaloxacina y adenina (Weber, 1950; van den Berg, et al., 2002). Figura 1.2. Espectros de absorción en el UV-Visible de RF, FMN y FAD en fosfato sódico 20 mM, pH 7.0. La interacción de las flavinas con la proteína genera cambios tanto en la intensidad como en la posición de los máximos, que reflejan las propieades de cada entorno proteico. 1.5.2. Fluorescencia Las flavinas son uno de los grupos fluorescentes principales en proteínas, junto con los aminoácidos aromáticos. Mientras que las flavinas reducidas tienen una fluorescencia muy baja, en su estado oxidado presentan un alto rendimiento cuántico de fluorescencia (Sun, et al., 1972) y un máximo de emisión a 525 nm. El FAD presenta un rendimiento cuántico unas 10 veces menor que el de la RF y el FMN, debido a la formación del complejo (no fluorescente) entre los anillos de isoaloxacina y adenina, que se encuentra en equilibrio con la forma abierta. La unión de las flavinas a una enzima produce un cambio en la fluorescencia, que puede desaparecer o no, dependiendo de cómo se une el cofactor a la proteína. Silvia Baquedano Coarasa 8 2. SÍNTESIS DE FMN Y FAD Las flavinas biológicamente activas, FMN y FAD, se sintetizan in vivo a partir de RF. Las plantas, hongos y ciertos microorganismos son capaces de sintetizar la RF a partir de una molécula de GTP y dos de ribulosa 5-fosfato. En el caso de los animales superiores la RF es una vitamina (vitamina B2), no pueden sintetizarla y deben obtenerla de la dieta. En cualquier caso, todos los organismos tienen que convertir la RF en FMN y FAD mediante dos reacciones secuenciales (Figura 1.3.). En primer lugar, la RF se transforma en FMN mediante una actvidad RF quinasa (RFK, ATP:riboflavina 5’fosfotransferasa, EC 2.7.1.26). Posteriormente, el FMN es transformado en FAD a través de una actividad ATP:FMN adenililtransferasa (FMNAT, EC 2.7.7.2). Figura 1.3. Reacciones secuenciales para la obtención de los derivados FMN y FAD. Estas dos actividades se encuentran de forma general en enzimas independientes en los organismos eucariotas mientras que en bacterias, ambas funciones están codificadas por el mismo gen, ribF, que produce una única enzima bifuncional, a la que se ha dado el nombre de FAD sintetasa (FADS) (Manstein, et al., 1986). 2.1. La Riboflavina Quinasa/FMN Adenililtransferasa bifuncional Las FADS bifuncionales con actividad RFK y FMNAT han sido clonadas y caracterizadas a partir de diferentes bacterias (Kearney, et al., 1979; Mayhew, et al., 1980; Manstein, et al., 1986; Efimov, et al., 1998; Mack, et al., 1998; Grill, et al., 2008). Es una enzima ubicua en este tipo de organismos. La primera estructura disponible de una FADS bifuncional fue la de Thermotoga marítima (TmFADS), tanto libre como en complejo con algunos ligandos (Wang, et al., 2003; Wang, et al., 2005). El análisis secuencial de la familia de las FADS procariotas indicó la existencia de dos dominios (Frago, et al., 2008): un dominio C-terminal que tiene homología con Introducción 9 las RFK eucariotas, y que se propone que está implicado en la fosforilación de la RF (Wang, et al., 2005); y un dominio N-terminal con plegamiento tipo Rossmann que no tiene homología con las FMNAT eucariotas sino que es similar a la familia de las NT (Rossmann, et al., 1974), al que se le atribuye la actividad FMNAT (Krupa, et al., 2003). El hecho de que sean enzimas esenciales en microorganismos, junto con las diferencias detectadas con respecto a las enzimas monofuncionales eucariotas convierten a la FADS en una potencial diana terapéutica. La inhibición de esta enzima en organismos procariotas patógenos con un fármaco inocuo para la homóloga en eucariotas, podría resultar útil para el tratamiento de enfermedades producidas por bacterias patógenas. 2.1.1. FADS bifuncional de Corynebacterium ammoniagenes (CaFADS) La CaFADS fue purificada y caracterizada por primera vez en el año 1986. Se trata de un único polipéptido de 338 aminoácidos, con un peso molecular de 38 kDa y un punto isoeléctrico de 4.6 (Manstein, et al., 1986) que posee las actividades RFK y FMNAT, además de una actividad FAD hidrolasa (síntesis de FMN y ATP a partir de FAD y PPi), ya que la reacción de adenililación es reversible (Figura 1.3). Todas las actividades son dependientes de Mg2+, aunque se ha descrito que la concentración óptima para llevar a cabo la reacción RFK in vitro es 0.75 mM mientras que para la reacción FMNAT es 10 mM (Manstein, et al., 1986; Hagihara, et al., 1995). 2.1.1.1. Mecanismo catalítico Las dos etapas catalíticas de la FADS implican la unión de dos moléculas de ATP, una de RF y una de FMN como sustratos y la liberación de una molécula de ADP, una de PPi, una de FMN y una de FAD como productos. En la fosforilación de la RF se ha propuesto que la RF se une a la proteína antes de la unión del ATP y que el ADP es liberado en primer lugar, seguido del FMN. En el proceso de adenililación, se ha propuesto que el FMN se une después del ATP y que el PPi es liberado antes que el FAD (Efimov, et al., 1998) (Figura 1.4.). Figura 1.4. Mecanismo secuencial ordenado de las dos etapas catalíticas de CaFADS. Silvia Baquedano Coarasa 10 Estudios termodinámicos de unión a ligandos han confirmado que la CaFADS tiene un sitio de unión a adenina y un sitio de unión a flavina en cada módulo, y han mostrado que los sustratos modulan tanto la organización estructural de los sitios catalíticos como la afinidad por el resto de los ligandos (Frago, et al., 2009). 2.1.1.2. Estructura Recientemente se ha resuelto la estructura de la CaFADS (Herguedas, et al., 2010). Los 186 primeros aminoácidos constituyen el dominio N-terminal con actividad FMNAT, y los residuos 187-338 constituyen el dominio C-terminal, con actividad RFK. La CaFADS presenta los dos módulos dispuestos en una estructura alargada de unos 70 Å (Figura 1.5.). Figura 1.5. Estructura global de CaFADS con el dominio N-terminal en verde y el C-terminal en naranja. El módulo FMNAT situado en la zona N-terminal presenta un plegamiento de unión a nucleótido α/β tipo Rossmann que consiste en una lámina β paralela alabeada con 6 hebras β (β1n-β6n) y cinco hélices α (α1n-α5n) distribuidas a ambos lados de la lámina. Las dos primeras hebras β están separadas por tres residuos (7-10) que forman una hélice 310. El dominio FMNAT termina en un pequeño subdominio formado por una horquilla β (β7n y β8n) y dos hélices α cortas. No presenta homología con las enzimas eucariotas, y las principales diferencias con las enzimas de la superfamilia NT se encuentran en la primera hebra β, ausente en el resto de estructuras; en los bucles L1n, L4n, L6n y L8n, y en el subdominio formado por la horquilla β y las dos hélices α cortas (α6n y α7n). El módulo RFK se pliega formando un dominio globular de unos 25 Å de diámetro que contiene un barril β con 6 hebras antiparalelas (β1c-β6c), una larga Introducción 11 hélice final (α1c), y siete bucles que conectan los elementos de estructura secundaria. El barril β central interacciona con la hélice α por tres puentes salinos e interacciones hidrofóbicas. Las principales diferencias con respecto a las RFK monofuncionales están en los bucles que conectan la estructura secundaria. Por otro lado, en la zona de interacción entre los dos módulos se producen puentes de hidrógeno y contactos hidrófobos que dan rigidez a la interfase. 2.1.1.3. Unión de los ligandos El módulo FMNAT presenta una cavidad abierta, con una superficie de potencial electrostático que está cargada positivamente (Figura 1.6.). Cadenas laterales de residuos de histidina y arginina conforman la parte central de esta cavidad, en la que se propone que se estabiliza la unión de los grupos fosfato de los ligandos (ATP, FMN, PPi y FAD). En general, los residuos V23, F24, H28, H31, H57, N125, R161, S164 y R168, que forman parte de las dos regiones consenso 19-32 y 162-174 altamente conservadas en la superfamilia NT, están relacionados con la unión del ATP y la estabilización de los fosfatos (Krupa, et al., 2003; Frago, et al., 2008; Herguedas, et al., 2010) Figura 1.6. A) Superficie de potencial electrostático del módulo FMNAT. El color rojo son cargas negativas y el azul positivas. B) Sitio activo del módulo FMNAT donde se ha modelado el AMP (azul), el FMN (morado) y el PPi (naranja) (Frago, et al., 2008; Herguedas, et al., 2010). A partir de la superposición de estructuras de RFK en complejo con varios ligandos, y basándose en la homología secuencial de las familias RFK y FADS bifuncional se ha propuesto un modelo para la unión del FMN y ADP-Mg2+ en el sitio activo del módulo RFK de CaFADS (Herguedas, et al., 2010) (Figura 1.7.). Según este modelo, el sitio activo del módulo RFK estaría localizado en la parte externa del barril β, en la parte más alejada de la región de interacción entre los dos módulos, donde se observa una cavidad abierta con superficie de potencial electrostático negativo en la Objetivos 19 1. ANTECEDENTES Las características moleculares diferenciales descritas hasta la fecha entre las enzimas encargadas de la síntesis de FMN y FAD en eucariotas y procariotas han convertido a la FADS bacteriana en una potencial diana para el tratamiento de enfermedades causadas por patógenos. La información estructural y mecanística disponible de estas enzimas es todavía limitada, pero la obtención de su estructura tridimensional ha permitido identificar los posibles sitios de interacción de sus sustratos y proponer una estructura oligomérica que podría estar implicada en la homeostasis de las flavinas en el interior celular. 2. OBJETIVOS El objetivo fundamental de este proyecto máster es aportar pruebas sobre la posible relevancia de la forma oligomérica de CaFADS, constituida por un dímero de trímeros, en la actividad de la proteína, y verificar el papel particular de los residuos R66, K202, E203, D298 y E301 tanto en la localización de los sustratos en los centros activos como en la estabilización de la estructura oligomérica. Para alcanzar este objetivo general se ha planteado llevar a cabo la caracterización de los mutantes de la FADS de Corynebacterium ammoniagenes (CaFADS) R66A, R66E, K202A, E203A, D298A, D298E, E301A, y E301K, incluyendo la consecución de los siguientes objetivos parciales: - Confirmar el correcto plegamiento de los mutantes producidos. - Determinar cuantitativamente si las mutaciones introducidas tienen algún efecto en las actividades RFK y FMNAT. - Determinar si las mutaciones introducidas modifican la capacidad de la proteína de unir sus diferentes ligandos. - Determinar si las mutaciones introducidas modifican los parámetros termodinámicos de la unión con los ligandos. CAPÍTULO 3: Materiales y métodos Materiales y métodos 23 1. CULTIVO, SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Las células de E. Coli previamente transformadas con el plásmido pET28a que contiene la CaFADS nativa (WT) y un gen de resistencia a kanamicina se cultivaron en medio de cultivo LB con 30 µg/ml de kanamicina. En el momento de crecimiento exponencial se indujo la expresión de la proteína con IPTG a concentración 1 mM. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de rotura y se sonicaron. El sobrenadante obtenido de la centrifugación fue purificado siguiendo el procedimiento descrito previamente (Frago, et al., 2008), que consta de una primera etapa de fraccionamiento con sulfato amónico, una etapa de separación por cromatografía de hidrofobicidad en fenil-sefarosa, y una cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-celulosa. En estas condiciones la proteína se purifica como una mezcla de monómero y otras especies oligoméricas. Estas especies diferentes se separaron en una columna de exclusión molecular HiPrepTM 26/60 SephacrylTM S-200 HR utilizando como fase móvil PIPES 20 mM, MgCl2 10 mM, pH 7.0. Todas las variantes mutadas de la CaFADS habían sido obtenidas previamente por el mismo procedimiento por Sonia Arilla, miembro del grupo. 2. TÉCNICAS DE CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS 2.1. Caracterización espectroscópica 2.1.1. Espectroscopia de absorción en el UV-Visible Se registraron los espectros de absorción en la región UV-Visible de los distintos mutantes de CaFADS entre 250 y 700 nm en PIPES 20 mM, pH 7.0 y MgCl2 10 mM con objeto de comprobar la integridad de las proteínas purificadas y para la cuantificación de las mismas. Se utilizó un espectrofotómetro Cary 100, cubetas de cuarzo de 1 cm de paso de luz y las medidas se realizaron con una velocidad de barrido de 300 nm/min. La cuantificación de las proteínas se realizó siguiendo la ley de Lambert-Beer: lcA   donde A es la absorbancia a una determinada longitud de onda, ε el coeficiente de extinción molar de la proteína a dicha longitud de onda, c la concentración de la Ec. 1 Silvia Baquedano Coarasa 24 muestra y l la longitud del paso de luz. Como coeficiente de extinción molar se utilizó el valor calculado previamente para la WT, ε = 27.5 mM-1 cm-1, a la longitud de onda del máximo, λ = 278 nm, para todos los casos, ya que las mutaciones realizadas no implican residuos aromáticos. 2.1.2. Dicroísmo circular Los espectros de dicroísmo circular fueron registrados a 25ºC en un espectropolarímetro Chirascan (Applied Photosystem Ltd.) con el fin de comprobar el correcto plegamiento de las proteínas mutadas y que dichas variantes no presentan cambios estructurales importantes respecto a la proteína WT. Los espectros correspondientes a la región del UV lejano proporcionan información acerca de la estructura secundaria, y fueron registrados entre 190 y 260 nm, utilizando una cubeta de cuarzo con paso de luz de 0.1 cm y con una concentración de proteína de ~ 5 μM en PIPES 5 mM, pH 7.0 y MgCl2 10 mM. Los espectros de la región del UV cercano, que permiten comprobar cambios en la estructura terciaria, se registraron entre 260 y 320 nm, con cubetas de cuarzo de 0.4 cm de paso de luz, y una concentración de proteína de ~ 20 µM en PIPES 20 mM, pH 7.0 y MgCl2 10 mM. El tiempo de medida en cada punto fue de 10 segundos en el caso del UV lejano y de 16 segundos para el UV cercano y la resolución fue en ambos casos de 0.5 nm. Los espectros fueron corregidos con la señal correspondiente al tampón de trabajo y la señal de dicroísmo circular obtenida se expresó como elipticidad molar por residuo (MRE, [θ]mr):      110  Nlc mr   donde θ es la señal obtenida (mdeg), c es la concentración de proteína (M), l es el paso de luz de la cubeta (cm), y N es el número de residuos de la proteína. 2.1.3. Determinación de los espectros diferenciales del complejo CaFADS: flavina Cuando las flavinas interaccionan con la CaFADS se produce una perturbación en su espectro de absorción en el visible que permite el estudio de dicha interacción mediante espectroscopia diferencial. Para los distintos mutantes se obtuvieron los espectros diferenciales de los complejos para una concentración de flavina saturante, en ausencia y en presencia de ADP. El equipo utilizado fue un espectrofotómetro Cary 100 de doble haz, y se emplearon cubetas de cuarzo de paso de luz de 1 cm. En un experimento típico, la cubeta de muestra contiene 700 μl de CaFADS a concentración de ~ 5 μM mientras que la de referencia tiene 700 μl de tampón. Se realizan adiciones Ec. 2 Materiales y métodos 25 sucesivas sobre ambas cubetas del mismo volumen de ligando hasta observar que los espectros diferenciales no cambian. En el caso de las medidas en presencia de ADP, ambas cubetas contienen ADP en concentración saturante ~ 450 μM. 2.2. Medidas cinéticas en estado estacionario 2.2.1. Análisis cuantitativo de la actividad RFK de la CaFADS mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) La actividad RFK de los mutantes de CaFADS se analizó de forma cuantitativa midiendo la RF consumida durante la reacción, calculada como la suma del FMN y FAD formados. La actividad se cuantificó mediante la separación de las flavinas producidas durante la reacción por HPLC. Se utilizó un equipo de HPLC Alliance (Waters) conectado a un inyector automático 2707 Autosampler (Waters) y a un detector de fluorescencia 2475 Multi-Wavelength Detector (Waters). Las condiciones cromatográficas utilizadas se recogen en la siguiente tabla: Tabla 3.1. Condiciones cromatográficas para la separación de flavinas mediante HPLC. Fase estacionaria HSS T3 (4.6x150 mm, 3.5 m, Waters) a Fase móvil metanol 40% en acetato de amonio 5mM, pH 6.0 Método Isocrático Flujo 1 ml/min Sistema de detección fluorescencia: ex = 470 nm; em= 530 nm (Ganancia 10) a La columna va precedida de una pre-columna (4.6 x 20 mm, 3.5  m, Waters) del mismo material, con el fin de alargar su vida media. En estas condiciones las flavinas se separaron en 6 min con tiempos de retención 2.2 para el FAD, 3.4 para el FMN y 5.5 min para la RF. Figura 3.1. Separación cromatográfica de FAD, FMN y RF por HPLC en las condiciones de laTabla 3.1. Silvia Baquedano Coarasa 26 Para la cuantificación de FMN y FAD se realizaron dos rectas de calibrado con disoluciones patrón de FMN y FAD de concentración conocida y se representó para cada una de ellas el área del pico obtenido frente a la concentración de la solución patrón. 0 1 2 3 4 5 0.0 2.0x108 4.0x108 6.0x108 8.0x108 1.0x109 1.2x109 [Flavina] (µM) Área del pico FAD FMN Figura 3.2. Rectas de calibrado para FAD y FMN en las condiciones recogidas en la Tabla 3.1. Las mezclas de reacción contenían RF (0 - 33 μM), ATP (0 - 400 μM) y MgCl2 (0.8 mM) en PIPES 20mM, pH 7.0, en un volumen final de 500 μl y se preincubaron a 25ºC. La reacción se inició por adición de enzima a una concentración final de 20 nM y se incubó durante 1 min a 25ºC. Seguidamente se detuvo la reacción por calentamiento a 100 ºC durante 5 min y se eliminó la enzima de la mezcla de reacción mediante centrifugación. Se inyectaron 20 μl de cada muestra en la columna HSS T3 para separar las flavinas de la mezcla y se calcularon las concentraciones de FMN y FAD a partir de las áreas de los picos, y haciendo uso de las rectas de calibrado obtenidas en las mismas condiciones. Se sumaron las concentraciones de FMN y FAD obtenidas para cada reacción y se dividió el resultado por la concentración de enzima en el ensayo, obteniendo de este modo la actividad enzimática. Las cinéticas se realizaron a concentración saturante de RF, variando la concentración de ATP y viceversa. La reacción medida a concentración fija de RF y distintas concentraciones de ATP sigue el modelo de Michaelis-Menten, por lo que los parámetros cinéticos se obtuvieron ajustando los datos de la curva de saturación experimental a la ecuación de Michaelis-Menten:       AK AV v m  max 0 Ec. 3 Materiales y métodos 27 donde v0 es la velocidad en cada punto, Vmax es la velocidad máxima, Km representa la concentración de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la velocidad máxima, y [A] es la concentración de sustrato. Sin embargo, la reacción a concentración constante de ATP y distintas concentraciones de RF no presenta una dependencia hiperbólica, sino que se produce una inhibición por sustrato, de modo que a altas concentraciones, la velocidad de reacción disminuye. Por ello, en este caso, los parámetros cinéticos se obtuvieron mediante el ajuste de los datos experimentales a la ecuación general de inhibición del sustrato:                          i mK A AK AV vmax 0 donde Ki es la constante de disociación del complejo enzima:inhibidor. 2.2.2. Análisis cuantitativo de la actividad FMNAT de la CaFADS mediante fluorescencia molecular Se llevaron a cabo medidas a lo largo del tiempo de muestras que contenían FMN (0 - 8 µM), ATP (0 - 400 µM), y MgCl2 (10 mM) en PIPES 20 mM, pH 7.0, en un volumen final de 1 ml y se preincubaron a 25ºC. La reacción se inició por adición de enzima a una concentración final de 40 nM en el caso de la WT y de 60 - 75 nM en el caso de los mutantes. Las medidas fueron realizadas en un espectrofluorímetro Cary Eclipse a 25ºC durante 30 segundos, con una longitud de onda de excitación y emisión de 420 y 530 nm, respectivamente. La fluorescencia del FAD y el FMN fue calibrada individualmente utilizando disoluciones de concentración conocida. Bajo las condiciones experimentales, la constante de fluorescencia del FAD (KFAD) era unas 10 veces menor que la del FMN (KFMN). La velocidad de formación de FAD (v0) fue calculada a partir de la disminución de la fluorescencia en el tiempo (F/t) aplicando la ecuación:   0 FMN FAD F t K K      Los datos cinéticos obtenidos para un sustrato a concentraciones saturantes del segundo sustrato fueron interpretados con el modelo cinético de Michaelis-Menten (Ec. 3), lo que permitió obtener los valores de kcat y Km con errores de un ±10%. Ec. 4 Ec. 5 Silvia Baquedano Coarasa 34 diferenciales similares, se observan desplazamientos en la posición de los picos y diferencias en su intensidad (Figura 4.2.). Este hecho sugiere pequeños cambios en el entorno dieléctrico de los anillos de isoaloxacina de las flavinas cuando se unen a las distintas variantes de CaFADS. La unión de RF, FMN y FAD a los complejos preformados de CaFADS:ADP produce, de forma general, un incremento en la magnitud de la variación de absorbancia inducida por la unión del ligando de casi el doble, con máximos y mínimos mejor definidos (Figura 4.2.). Este hecho se ha asociado a la aparición del segundo sitio de unión a FMN, situado en el dominio C-terminal o RFK, bajo esas condiciones (Frago, et al., 2009). Figura 4.2. Espectros diferenciales obtenidos por titulación a saturación de las variantes de CaFADS libres (izquierda) y sus complejos CaFADS:ADP (derecha) con RF (A y B), FAD (C y D) y FMN (E y F). La CaFADS WT se muestra en negro, R66A en rojo, R66E en morado, K202A en amarillo, E203A en amarillo oscuro, D298A en azul, D298E en verde, E301A en rosa y E301K en azul claro. Resultados 35 En conjunto estas medidas indican que las variantes estudiadas son, en principio, capaces de interaccionar con los ligandos flavínicos. 2. PARÁMETROS CINÉTICOS DE LAS VARIANTES DE CaFADS 2.1. Actividad RFK de los mutantes de CaFADS La actividad RFK de las variantes de CaFADS se determinó siguiendo la evolución de RF en la suma de FMN y FAD a concentración 0.8 mM de MgCl2 para minimizar la actividad FMNAT correspondiente a la conversión de FMN en FAD. Al determinar la actividad RFK a saturación de ATP, se observó en todos los casos una disminución de la actividad a concentraciones de RF superiores a 2 - 3 μM (Figura 4.3.), lo que sugiere una inhibición por exceso de sustrato. Los datos experimentales se ajustaron a la ecuación general para un mecanismo cinético con inhibición por sustrato (Ec. 4), permitiendo, en la mayoría de los casos, obtener los valores de kcat, KmRF y Ki (Tabla 4.1.). En general, para la mayoría de los mutantes de CaFADS se observó una potente inhibición a concentraciones de RF incluso menores que para el caso de la proteína WT. En algunas de las variantes, este hecho imposibilitó el ajuste realista de los datos experimentales a la ecuación, impidiendo determinar el valor de parámetros cinéticos del proceso ya que Ki es mayor que KmRF. Al determinar la actividad RFK a la concentración de RF a la cual se tiene la máxima actividad variando la concentración de ATP no se observó inhibición por sustrato (Figura 4.3.). Por tanto, estos datos experimentales fueron ajustados a la ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 3), obteniendo los valores de kcat y KmATP. Figura 4.3. Cinética en estado estacionario de la actividad RFK a concentración saturante de ATP (A) y a concentración saturante de RF (B), de CaFADS WT (negro), R66A (rojo), R66E (morado), K202A (amarillo), E203A (amarillo oscuro), D298A (azul), D298E (verde), E301A (rosa) y E301K (azul claro). Silvia Baquedano Coarasa 36 La Tabla 4.1. recoge los parámetros cinéticos de la actividad RFK obtenidos para la CaFADS WT y las formas mutadas, tanto a concentración de ATP saturante como a la concentración de RF a la que se obtiene la máxima kcat. Tabla 4.1. Parámetros cinéticos en estado estacionario para la actividad RFK (RF → FMN (+FAD)) de las variantes de CaFADS. Los datos se han obtenido a 25ºC, en PIPES 20 mM, pH 7.0, 0.8 mM MgCl2. [ATP] saturante [RF] de la máxima kcat appkcat (min-1) KmRF (µM) Ki (µM) kcat / KmRF (min-1 µM-1) appkcat (min-1) KmATP (µM) kcat / KmATP (min-1 µM-1) WT 104.6 0.62 20.1 168.7 126.2 66.9 1.9 R66A -- -- -- -- 10.9 87.0 0.13 R66E 42.1 0.89 8.2 47.3 23.8 21.5 1.1 K202A 63.8 0.74 19.4 86.2 34.5 52.7 0.66 E203A 115.8 1.2 4.5 99.8 50.1 89.2 0.56 D298A 78.4 0.66 8.7 118.9 32.2 26.6 1.2 D298E -- -- -- -- 20.9 64.9 0.32 E301A 53.0 0.16 18.0 331.1 36.7 30.9 1.2 E301K -- -- -- -- 59.9 59.3 1.0 * En los mutantes R66A, D298E y E301K no fue posible determinar los parámetros cinéticos debido a la elevada inhibición por sustrato producida, que tiene lugar a concentraciones de RF menores que para la WT. En la reacción a concentración saturante de ATP se observa por lo general una disminución significativa en los valores de kcat (entre 1.5 y 2.5 veces) de las formas mutadas con respecto a la WT y a E203A CaFADS. Los valores de KmRF son del mismo orden en todas las variantes, destacando solo un incremento de este parámetro en 2 veces para el mutante E203A, y una disminución en unas 5 veces para E301A. En general, esto resulta en un gran incremento en la eficiencia catalítica para la variante E301A con respecto a la proteína WT, mientras que la mayoría de los mutantes son menos eficientes (particularmente R66E, con aproximadamente la cuarta parte de eficiencia). Los parámetros obtenidos a concentración fija de RF en función de la concentración de ATP indican valores de kcat para las distintas variantes entre 2 y 10 veces menores que para la WT, siendo E301K y E203A las variantes donde este parámetro disminuye menos. Los mutantes R66E, D298A y E301A presentan un valor de KmATP de unas 2 - 3 veces menor que la WT, mientras que el resto de variantes mantienen valores similares. Debido fundamentalmente a las disminuciones descritas Resultados 37 en los valores de kcat, todos los mutantes presentan una menor eficiencia catalítica, siendo el descenso más significativo para los mutantes K202A, E203A, y, particularmente, para R66A y D298E, variantes que además muestran una alta inhibición por sustrato en la titulación con RF a saturación de ATP. 2.2. Actividad FMNAT de los mutantes de CaFADS Ninguna de las variantes de CaFADS mostró inhibición por sustrato cuando se determinó su actividad FMNAT tanto a concentración saturante de FMN como de ATP (Figura 4.4.). Por tanto, los datos experimentales se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 3), obteniendo los valores de kcat, KmATP y KmFMN que se recogen en la Tabla 4.2. Los valores de kcat obtenidos en la reacción a concentración saturante de ATP y en la reacción a concentración saturante de FMN, fueron en todos los casos muy similares entre ellos, como se podía esperar, por lo que los datos de kcat presentados corresponden al valor medio entre ambos. Figura 4.4. Cinética en estado estacionario de la actividad FMNAT a concentración saturante de ATP (A) y a concentración saturante de FMN (B), de CaFADS WT (negro), R66A (rojo), R66E (morado), K202A (amarillo), E203A (amarillo oscuro), D298A (azul), D298E (verde), E301A (rosa) y E301K (azul claro). Los parámetros cinéticos kcat, KmFMN y KmATP correspondientes a la conversión del FMN en FAD (actividad FMNAT) para la CaFADS WT fueron 13.5 min-1, 5.9 µM, y 37.1 µM, respectivamente (Tabla 4.2), lo que supone una ligera disminución en la actividad de la proteína a 25ºC con respecto a datos anteriores a 37ºC (Serrano, et al., 2012b). Las mutaciones estudiadas presentaron una actividad FMNAT de entre 1.5 y 6 veces menor que la WT. Cabe destacar que los valores de KmFMN obtenidos para todos los mutantes son bastante menores (entre 2 y 15 veces) que el valor de la WT. Además, las variantes de CaFADS estudiadas presentan también un valor ligeramente inferior de KmATP que el Silvia Baquedano Coarasa 38 de la proteína WT, particularmente R66A, K202A, E203A, D298E, y E301K (entre 2.5 y 3.5 veces) (Tabla 4.2.). Tabla 4.2. Parámetros cinéticos en estado estacionario para la actividad FMNAT de las variantes de CaFADS. Los datos se han obtenido a 25ºC, en PIPES 20 mM, pH 7.0, 0.8 mM MgCl2. kcat (min-1) KmFMN (µM) KmATP (µM) kcat / KmFMN (min-1 µM-1) kcat / KmATP (min-1 µM-1) WT 13.5 6.0 37.1 2.25 0.36 R66A 8.5 0.69 15.8 12.3 0.54 R66E 4.5 0.38 31.1 11.8 0.14 K202A 2.3 2.9 12.1 0.80 0.19 E203A 3.2 0.70 10.8 4.6 0.30 D298A 6.1 1.2 20.7 5.2 0.30 D298E 3.3 0.95 10.4 3.5 0.31 E301A 6.9 0.42 19.7 16.4 0.35 E301K 6.3 0.85 15.3 7.4 0.41 * Los valores de kcat mostrados corresponden al valor medio de los valores de kcat obtenidos para concentración de ATP saturante y para concentración de FMN saturante. El cociente kcat / KmFMN indica que las variantes de CaFADS son algo más eficientes que la WT, particularmente R66A, R66E y E301A (entre 5 y 7 veces), como consecuencia de sus bajos valores de KmFMN. Sin embargo, la eficiencia catalítica de K202A es 3 veces menor que la de la forma WT como consecuencia de una notable disminución en kcat y un valor de KmFMN mayor que en el resto de variantes. 3. Parámetros de interacción de las variantes de CaFADS con sus diferentes ligandos Se analizaron los parámetros de interacción de las distintas formas de CaFADS con RF, FAD, FMN y ATP mediante ITC en PIPES 20 mM, pH 7.0 y MgCl2 10 mM, obteniendo los perfiles que se muestran en la Figura 4.5. El análisis de la interacción de RF, FAD y FMN con la CaFADS WT mostró un único sitio de unión para FAD y FMN, con valores de Kd de 0.8 y 7.8 µM, respectivamente. En el caso de la titulación con RF se encontraron dos sitios de unión con un valor mayor de Kd (KdRF= 24.1 µM), (Tabla 4.3.). Resultados 39 Figura 4.5. Titulaciones calorimétricas para la interacción entre la variante R66A de CaFADS y FAD (A), FMN (B), RF (C) y ATP (D) en PIPES 20 mM, pH 7.0. y MgCl2 10 mM. En las partes superiores se muestran los termogramas de la interacción de R66A y la forma WT (en el interior). La parte inferior de las figuras muestra las isotermas de unión con los calores de reacción integrados para R66A (curva negra) y WT (curva gris). Silvia Baquedano Coarasa 40 Tabla 4.3. Parámetros de interacción de la CaFADS WT y los mutantes con RF, FAD, FMN, ATP y FMN en presencia de ADP obtenidos por ITC. Datos a 25ºC en PIPES 20 mM, pH 7.0, y 10 mM MgCl2. KdRF (µM) KdFAD (µM) KdFMN (µM) KdATP (µM) WT 24.1* 0.78 7.8 26.0* R66A 45.6* 1.9 66.2 148.5* R66E 4.4 30.2 89.0 227.8* K202A 31.4* 6.4 12.2 64.5* E203A 10.3 61.8 7.2 43.4* D298A 5.3* 3.0 18.8 32.9* D298E 17.9* 3.7 19.1 46.2* E301A 58.0* 2.4 5.9 60.7* E301K 142.9* 2.9 13.6 60.2* * Estos valores de Kd corresponden al valor medio de los valores de Kd de los dos sitios de unión detectados (Kd,av). De igual modo, las variantes de CaFADS producidas presentan un único sitio de unión para el FAD y el FMN y dos sitios para la RF, salvo los mutantes R66E y E203A que pierden uno de los sitios de unión para este último ligando. Además, los mutantes muestran algunas diferencias en los valores de las constantes de disociación respecto a la WT (Tabla 4.3.). En concreto, para la unión de RF, se observa un aumento en el valor de Kd,av de 2.5 veces para E301A y de 6 veces para E301K con respecto a la WT, mientras que este parámetro disminuye significativamente para los mutantes R66E, D298A y E203A (que presentan valores 6, 4 y 2 veces menores que la WT, respectivamente). La unión del FAD es, en todas las variantes de CaFADS, más débil que en la forma WT, pero particularmente para los mutantes R66E y E203A, que presentan una afinidad por este ligando 30 y 60 veces menor, respectivamente, que la enzima WT. Por su parte, la unión de FMN a las distintas variantes también es en general más débil que en la proteína WT, con la excepción de los mutantes E203A y E301A. El efecto es particularmente significativo para los mutantes R66A y R66E, con valores de Kd de 9 y 11 veces superior al valor de la forma WT, respectivamente. Las titulaciones permitieron también determinar los componentes entrópico y entálpico de las interacciones (Figura 4.6.). La unión de RF, FAD y FMN a la CaFADS WT está dirigida por el componente entálpico con una contribución entrópica desfavorable, aunque en la unión de la RF ambas componentes son notablemente inferiores en magnitud. Este último efecto ha sido relacionado con la menor polaridad Resultados 41 de la RF respecto a FAD y FMN. Las mutaciones introducidas en la CaFADS producen también variaciones en las contribuciones de los componentes entrópico y entálpico. Figura 4.6. Contribuciones termodinámicas de la interacción de las variantes de CaFADS con RF (A), FAD (B), FMN (C) y ATP (D). La energía libre de Gibbs (ΔG), la entalpía (ΔH), y la entropía (-TΔS) se representan en barras azules, verdes y rojas, respectivamente. La estequiometría de la interacción viene indicada como N. En general, la unión de la RF a las variantes de CaFADS está dirigida tanto por el componente entrópico, que en estos casos se vuelve ligeramente favorable, como por el componente entálpico que se hace menos favorable que en la WT. La excepción a este comportamiento se produce solamente en el caso de los mutantes E301A y E301K, que presentan una contribución entálpica más favorable a la unión, mientras el componente entrópico se vuelve notablemente desfavorable. Concretamente, cabe destacar la magnitud de ambas contribuciones en el caso del mutante E301K, mucho mayores que en el resto de variantes y que no llegan a compensarse, resultando en un valor de ΔG algo menor. Como se ha mencionado ya antes, la unión de FAD está ligeramente menos favorecida en las formas mutadas respecto a la proteína WT, estando el proceso dirigido entálpicamente con un factor entrópico desfavorable. En general las mutaciones aumentan la magnitud de ambas contribuciones con respecto a la WT, excepto en los mutantes E301A y E301K, donde ambas contribuciones disminuyen en magnitud. Por último, la unión de FMN en las formas mutadas de CaFADS está dirigida entálpicamente con oposición del factor entrópico, siendo ambas contribuciones de menor magnitud que para la WT. Silvia Baquedano Coarasa 42 La interacción del ATP con la CaFADS mostró dos sitios de unión en todas las variantes, con un valor de Kd,avATP de 26.0 µM para la WT y valores algo mayores para las formas mutadas, sobre todo en R66A y R66E, donde el valor de Kd,avATP es unas 5 y 10 veces mayor, respectivamente, sugiriendo que las mutaciones reducen la afinidad por ATP (Tabla 4.3.). Esta unión está dirigida entálpicamente con la oposición de un factor entrópico en todas las variantes de CaFADS. La magnitud de ambas contribuciones aumenta en todos los mutantes respecto a la WT (excepto en E203A y D298A que presentan contribuciones similares a la WT) siendo estas diferencias más significativas en los mutantes R66A, R66E y K202A. El análisis de la interacción de FMN con complejos de CaFADS:ADP mostró dos sitios de unión en el caso de la WT, con valores de Kd de 0.04 y 0.90 µM, respectivamente, resultando la unión favorecida tanto por el componente entálpico como por el entrópico. El estudio de esta interacción con los mutantes de CaFADS produjo unos perfiles calorimétricos con dos sitios de unión aparentes, pero que no se ajustaron al modelo de sitios independientes utilizado para el ajuste de los datos de la WT, y que podrían corresponder a un modelo de unión diferente en el que ambos sitios podrían presentar cooperatividad. Esto puede sugerir cambios en la interacción con FMN en presencia de ADP que deberán ser tenidos en cuenta en estudios posteriores. CAPÍTULO 5: Discusión CAPÍTULO 6: Conclusiones Conclusiones 53 - Se han analizado los parámetros de unión de los ligandos y las actividades RFK y FMNAT de variantes mutadas de CaFADS en los residuos R66, K202, E203, D298 y E301, que están localizados en la interfase entre los dominios N- y C-terminal de cada dos monómeros que forman cada uno de los dos trímeros que se ha propuesto que pueden participar en la formación del oligómero de CaFADS. Concretamente se han caracterizado las variantes R66A, R66E, K202A, E203A, D298A, D298E, E301A, E301K. - Todos los mutantes se pliegan, en una estructura tridimensional similar a la de la proteína WT, y mantienen la capacidad de unión de los ligandos, al menos en un sitio de unión. - El residuo R66 es crítico para la actividad RFK y la unión de los ligandos. Además podría colaborar junto con E268 como base catalítica en la actividad RFK. - Los residuos K202 y E203 juegan un papel fundamental en la unión de los ligandos y en la actividad FMNAT, lo que indica que influyen en la conformación del bucle L8n del módulo FMNAT. - El residuo D298 es relevante para las actividades tanto RFK como FMNAT, y es menos crítico para la interacción de la proteína con sus ligandos. - El residuo E301 juega un papel fundamental en la unión de los ligandos en el sitio FMNAT de CaFADS. - La influencia de la sustitución de residuos de un módulo en la actividad del otro módulo apoya la hipótesis de que la forma oligomérica de CaFADS, en la que cada sitio activo estaría formado por residuos de su propio módulo y por residuos del otro módulo del protómero contiguo, juega un papel relevante durante la catálisis. CAPÍTULO 7: Bibliografía Bibliografía 57 Efimov, I., Kuusk, V., Zhang, X. and McIntire, W. S. (1998). 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