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D DI IS SE EÑ ÑO O D DE E U UN N B BI IO OS SE EN NS SO OR R C CO OM MP PE ET TI IT TI IV VO O E EL LE EC CT TR RO OQ QU UÍ ÍM MI IC CO O B BA AS SA AD DO O E EN N L LA A R RE EA AC CC CI IÓ ÓN N D DE E A AF FI IN NI ID DA AD D E EN NT TR RE E E EL L D DE EO OX XI IN NI IV VA AL LE EN NO OL L Y Y S SU U A AN NT TI IC CU UE ER RP PO O P PO OL LI IC CL LO ON NA AL L M MÁ ÁS ST TE ER R E EN N I IN NV VE ES ST TI IG GA AC CI IÓ ÓN N Q QU UÍ ÍM MI IC CA A D DE EP PA AR RT TA AM ME EN NT TO O D DE E Q QU UÍ ÍM MI IC CA A A AN NA AL LÍ ÍT TI IC CA A, , U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD D D DE E Z ZA AR RA AG GO OZ ZA A SUSANA HERNÁNDEZ AGOIZ TRABAJO FIN DE MÁSTER JULIO 2012 Dr. D. Juan Carlos Vidal, Profesor Titular del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Zaragoza y Dra. Dña. Laura Bonel Sanmartín, investigadora de la empresa CAPHER IDI SL (Convenio de colaboración con el grupo de investigación GEAS), CERTIFICAN: Que la memoria titulada “DISEÑO DE UN BIOSENSOR COMPETITIVO ELECTROQUÍMICO BASADO EN LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE EL DEOXINIVALENOL Y SU ANTICUERPO POLICLONAL”, presentada por Dña. Susana Hernández Agoiz, para superar el Máster de Investigación Química, ha sido realizada en el Grupo de Espectroscopía Analítica y Sensores (GEAS) del Departamento de Química Analítica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza bajo su dirección. Zaragoza, 21 de junio de 2012 Fdo. Juan C. Vidal Ibánez Fdo. Laura Bonel Sanmartín Í ÍN ND DI IC CE E ABREVIATURAS RESUMEN Capítulo 1: INTRODUCCIÓN 1.1. MICOTOXINAS 1.1.1. Deoxinivalenol 1.1.2. Toxicidad del deoxinivalenol 1.2. METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA DETERMINACIÓN DE DEOXINIVALENOL 1.2.1 Metodología oficial para la determinación de deoxinivalenol 1.2.2 Biosensores para la determinación de DON 1.2.3 Inmunoensayos para la determinación de DON 1.2.4 Inmunosensores electroquímicos competitivos 1.3. USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS EN INMUNOENSAYO 1.4. APLICACIONES DE LOS ELECTRODOS SERIGRAFIADOS EN LA FABRICACIÓN DE INMUNOSENSORES Capítulo 2: OBJETIVOS Capítulo 3: EXPERIMENTAL 3.1. PROCEDIMIENTO DE CONJUGACIÓN DEL DON-HRP 3.2. ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE pAbDON Y DON-HRP POR RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL (SPR) 3.2.1. Materiales e Instrumentación 3.2.2. Reactivos y tampones 3.2.3. Procedimiento experimental 3.2.4. Resultados y discusión 3.3. ESTUDIO DE LA REACCIÓN COMPETITIVA ENTRE DON-HRP Y DON MEDIANTE ELISA ESPECTROFOTOMÉTRICO (CONVENCIONAL Y CON PARTÍCULAS MAGNÉTICAS) 3.3.1. Materiales e Instrumentación 3.3.2. Reactivos y tampones 3.3.3. Procedimiento experimental 3.3.4. Resultados y discusión 3.4. ESTUDIO DE LA REACCIÓN COMPETITIVA ENTRE DON Y DON-HRP SOBRE pAbDON INMOVILIZADO SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS MEDIANTE TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS 3.4.1. Materiales e Instrumentación 3.4.2. Reactivos y tampones 3.4.3. Procedimiento experimental 3.4.4. Resultados y discusión Capítulo 4: CONCLUSIONES ANEXOS REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS A AB BR RE EV VI IA AT TU UR RA AS S BSA Albúmina Sérica Bovina BSA-FB1 Conjugado BSA-Fumonisina B1 CRA Cronoamperometría DON Deoxinivalenol DON-HRP Conjugado Deoxinivalenol-Peroxidasa DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido eaHRP Peroxidasa funcionalizada con estreptavidina EDC 1-Etil-3-(3-dimetillaminopropil) carbodiimida ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay EA Electrodo auxiliar ER Electrodo de referencia ET Electrodo de trabajo HPLC-MS Cromatografía líquida de alta resolución/Espectrometría de masas HPLC-UV Cromatografía líquida de alta resolución/Ultravioleta- Visible HQ Hidroquinona HRP Peroxidasa de rábano picante HSA Albúmina serica humana GC-ECD Cromatografía de Gases/Detección por captura de electrones LC-MS/MS Cromatografía líquida/Espectrometría de masas MBs Partículas magnéticas MBs-To Partículas magnéticas funcionalizadas con el grupo tosilo MBs-aIgG Partículas magnéticas funcionalizadas con un anticuerpo genérico MBs-COOH Partículas magnéticas funcionalizadas con grupos carboxilo MES Tampón de ácido 2-(N-morfolino etano sulfónico) MIPs Molecularly Imprinted Polymers NHS N-Hidroxisuccinimida pAbDON Anticuerpo policlonal específico para el DON pBQ p-Benzoquinona PBS Tampón fosfato salino PBST Tampón fosfato salino con Tween20 PMPI p-maleimidofenil isocianato SATA N-succinimidil S-acetiltioacetato SPCE Electrodo serigrafiado de carbono SPE Electrodo serigrafiado SPR Resonancia de Plasmón Superficial TMB 3, 3´,5, 5´- tetrametilbencidina VC Voltametría Cíclica R RE ES SU UM ME EN N: : El deoxinivalenol (DON) es una micotoxina producida por el hongo Fusarium, muy abundante en ciertos cereales como el trigo o el maíz y en sus granos procesados como la malta, la cerveza o el pan. Debido a la gran importancia de las micotoxinas en la contaminación de alimentos, la legislación española y europea, ha establecido límites muy estrictos para las concentraciones máximas permitidas de DON en diversos productos alimenticios, oscilando entre 200 y 1750 µg/kg, y la ingesta diaria tolerable es 1 mg/kg de peso corporal (Comisión Reguladora 1126/2007) por lo tanto, es necesario disponer de métodos analíticos cada vez más sensibles, que nos permitan su determinación. Por ello el objetivo principal de este trabajo de investigación fue el desarrollo de un inmunosensor electroquímico competitivo para la determinación de DON en muestras de alimentos. Se han utilizado además diferentes tipos de partículas magnéticas (MBs) como soporte sólido del inmunosensor por las ventajas que esto conlleva (mejoras en lavados y preconcentración de reactivos entre otras). Se ha utilizado la técnica electroquímica de cronoamperometría (CRA) utilizando un salto de potencial entre 0 y -0,25 V para medir la extensión de la reacción enzimática que provoca la HRP con los sustratos de reacción añadidos sobre electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs). Para este estudio nos hemos apoyado también en otras técnicas analíticas, como el SPR con el que se ha confirmado que el anticuerpo es capaz de reconocer de forma selectiva al DON, y el ELISA y ELISA magnético con los que se han optimizado las condiciones de trabajo. 6 Capítulo 1: Introducción de screening que siempre debe ser validado por el método oficial de determinación de DON (HPLC-UV). Pese a los numerosos kits ELISA que hay disponibles, los inmunosensores para la determinación de DON en alimentos no son tan comunes. Entre los inmunosensores más importantes cabe destacar la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (inmunosensor óptico) y los inmunosensores electroquímicos basados en una reacción competitiva. La Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) es una técnica óptica basada en el fenómeno de reflexión total interna dentro de un prisma o de una fibra óptica, recubiertos de una fina película de metal, generalmente de oro. La luz entra en el prisma con un ángulo determinado, el ángulo crítico que produce reflexión total interna [27] y parte de la luz incidente es absorbida por electrones libres en la fina capa de metal sobre la superficie del sensor; por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada disminuye. Figura 4: Esquema de la etapa de interacción antígeno-anticuerpo en SPR En resumen, SPR es un biosensor en tiempo real que monitoriza cambios en la densidad óptica, que se traducen en cambios de masa sobre la superficie de la lámina sensora (chip), por lo que pueden medirse pequeñas variaciones en la masa depositada. Es un sensor muy útil [21] para observar interacciones entre moléculas como por ejemplo entre un antígeno y un anticuerpo. Los ensayos SPR [28] se seleccionan dependiendo de la característica del analito, de la muestra analítica, y de la sensibilidad del instrumento. La detección directa es sólo útil para moléculas con alto peso molecular superior a 10 kDa. Sin embargo, las micotoxinas son compuestos químicos pequeños con masa insuficiente para provocar un cambio mensurable en el índice de refracción, por lo que si se realiza un ensayo directo es recomendable trabajar con la micotoxina conjugada a una molécula de alto peso molecular, por ejemplo una proteína. La inmovilización directa de un conjugado micotoxina–proteína sobre la superficie del chip proporciona una superficie sensora muy estable en comparación con la inmovilización directa de anticuerpos, los cuales son susceptibles de desnaturalización y la degradación [29]. Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 7 Se ha descrito la determinación de DON utilizando el SPR mediante ensayos indirectos, obteniéndose suficiente sensibilidad (µg l-1) [29] para la determinación de DON en muestras de trigo contaminadas. Este método es validado por LC-MS/MS [27] obteniéndose una correlación entre ambos métodos superior al 90%, por lo que se puede asegurar que se trata de un biosensor óptico perfectamente válido para determinaciones de este tipo. Los inmunosensores más comunes en el campo que nos afecta siguen un esquema competitivo. 1.2.4. Inmunosensores electroquímicos competitivos: Un inmunosensor competitivo se basa en la competición del anticuerpo por el analito presente en la muestra y el analito marcado generalmente con una enzima, que es capaz de transformar un sustrato en un producto con propiedades ópticas, electroquímicas, fluorescentes, etc [15]. De esta forma, cuanto mayor es la concentración de analito en la muestra, menor unión se va a producir entre el anticuerpo y el analito marcado enzimáticamente, y en consecuencia se obtendrá una menor señal analítica. En este tipo de inmunosensores, a diferencia que en un esquema tipo sándwich, la señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. La ventaja que presentan es su elevada sensibilidad para concentraciones de analito muy bajas y cercanas al límite de detección. Este trabajo de investigación tiene como objetivo el diseño de un inmunosensor electroquímico competitivo utilizando un esquema directo, [30] para llevar a cabo la determinación de DON en muestras de alimentos (sobre todo en cereales). Los inmunosensores electroquímicos competitivos para DON en muestras de alimentos, a diferencia de los numerosos ensayos ELISA no están muy desarrollados hasta el momento. Se han desarrollado diferentes sensores que utilizan técnicas electroquímicas, como la voltametría cíclica (VC) [31] o la cronoamperometría (CRA) [32] para llevar a cabo las determinaciones. Los resultados obtenidos con los sensores electroquímicos en muestras de alimentos (maíz, trigo, alimentos preparados de origen cereal, etc) demuestran que son unas potentes y novedosas herramientas analíticas para la determinación de DON, manteniendo una alta correlación con los resultados obtenidos con la metodología oficial (HPLC-UV). Debido a la naturaleza compleja de las muestras de alimentos, generalmente aparecen fuertes interferencias de matriz que tienen un efecto negativo en los resultados. Dado que las interferencias electroactivas son relativamente escasas, la detección electroquímica para interacciones de tipo antígeno-anticuerpo, por ejemplo, pueden ser de gran utilidad en los análisis de alimentos dada su complejidad en las matrices [9]. En la mayoría de los casos los anticuerpos y antígenos son incapaces de reaccionar con un par redox, por lo que es necesario incluir en el ensayo un marcado enzimático a alguno de los componentes. En este caso se va a utilizar un conjugado de DON marcado con peroxidasa de 8 Capítulo 1: Introducción rábano picante (HRP). En el inmunosensor se va a llevar a cabo una reacción competitiva entre el DON libre y el conjugado de DON-HRP. Además, esta tecnología se combina con el uso de micropartículas magnéticas modificadas con diferentes grupos funcionales (proteínas, tosilo, carboxilo, etc) como superficie sólida para llevar a cabo las etapas de inmovilización del anticuerpo, etapa de competición y los correspondientes lavados [33]. Con este enfoque, combinando la selectividad de los anticuerpos, la sensibilidad de la detección electroquímica y la posibilidad de concentrar las partículas magnéticas modificadas con los biorreactivos en la superficie del electrodo, aparece una interesante alternativa a los métodos microbiológicos y de inmunoensayo, con notables mejoras en análisis de micotoxinas en alimentos sobre los inmunoensayos clásicos como el ELISA [34]. Las principales ventajas de las detecciones electroquímicas sobre los procedimientos espectrofotométricos incluyen por ejemplo, la capacidad de miniaturización, el bajo coste de la instrumentación, la posibilidad de análisis in situ, la insensibilidad a las muestras turbias, etc [9]. 1.3. USO DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS EN INMUNOENSAYO Las partículas magnéticas (MBs) se han convertido en una de las herramientas más versátiles para ser utilizadas como soporte sólido en inmunoensayo [35]. Se trata [36] de partículas de poliestireno con un núcleo de hierro que le proporciona su condición superparamagnética. Son partículas esféricas de tamaño micrométrico (diámetros 1 - 2,8 µm). Comercialmente existen MBs modificadas con diversos grupos funcionales que pueden utilizarse para la captura de moléculas específicas y actualmente constituye una herramienta muy potente en una gran variedad de aplicaciones analíticas y biotecnológicas relacionadas con la determinación de contaminantes en alimentos [37]. Los anticuerpos pueden unirse a los grupos funcionales de la superficie de las MBs ya sea a través de un enlace covalente, o a través de diferentes funcionalidades (carboxilo, amino, proteínas, epoxi,…). La funcionalización de partículas magnéticas, debido a su excelente compatibilidad con el elemento de biorreconocimiento, su estabilidad en el tiempo y a los protocolos de síntesis perfectamente establecidos, además de la reducción de tamaño (hasta niveles de micro- y nanopartículas) se está convirtiendo en uno de los más importantes modos de trabajo en inmunosensores para micotoxinas [38]. En el tema de estudio que estamos abordando las partículas magnéticas se van a utilizar como superficie sólida sobre la que inmovilizar el elemento de biorreconocimiento, con las ventajas Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 9 que esto conlleva: mejoran notablemente el rendimiento de la reacción inmunológica debido a un aumento de la superficie de biorreconocimiento, y poseen una cinética más rápida ya que las partículas están en suspensión y el analito no tiene que migrar muy lejos durante la transducción. Además, provocan una baja adsorción inespecífica y se minimiza el efecto matriz [14] debido a la alta eficiencia en la separación durante las etapas de lavado por acción de un campo magnético (es capaz de atraer las partículas magnéticas con los biorreactivos inmovilizados sobre las mismas y permite la eliminación del sobrenadante con los reactivos en exceso que no hayan reaccionado) [39]. En el proceso de inmovilización, en primer lugar las partículas magnéticas se preparan para las condiciones de incubación mediante lavados (eliminación de conservantes con tampones apropiados), a continuación se añade el elemento de biorreconocimiento (anticuerpo en este caso), se incuba mediante agitación según el tiempo y temperatura que se aconseje en el protocolo comercial y finalmente se elimina el anticuerpo en exceso con la ayuda de un campo magnético. Los siguientes pasos para llevar a cabo la reacción de competición se llevan a cabo de modo similar, como se muestra en el siguiente esquema: Figura 5: Esquema de trabajo sobre partículas magnéticas funcionalizadas con grupos reactivos 1.4. APLICACIÓN DE LOS ELECTRODOS SERIGRAFIADOS EN LA FABRICACIÓN DE INMUNOSENSORES. Desde principio de los años 90 la tecnología de serigrafiado (screen-printing technology) ha sido muy utilizada en la industria microelectrónica para aplicaciones electroquímicas [40]. Los electrodos serigrafiados (SPEs), son el equivalente miniaturizado de una célula electroquímica tradicional que incluye tres electrodos: electrodo de trabajo (ET), electrodo de referencia (ER) y electrodo auxiliar (EA). Los SPEs se fabrican mediante la impresión de diferentes tipos de tintas conductoras sobre sustratos de cerámica o de plástico. Si la tinta utilizada para el electrodo de trabajo es de carbono se conocen como screen-printed carbon electrodes (SPCEs). En la mayoría de los casos el material del electrodo de trabajo (ET) proviene de tintas con base de carbono (grafito), debido a su bajo coste frente a tintas que contienen partículas metálicas de oro, plata, platino, etc, y a sus buenas propiedades electroquímicas (amplia ventana de electroactividad, velocidad rápida de transferencia de electrones sobre todo con moléculas orgánicas, etc). 10 Capítulo 1: Introducción Figura 6: Electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) El uso de SPCEs permite la producción de electrodos en masa de forma más económica y reproducible [32]. Además debido a su pequeño tamaño, las determinaciones electroanalíticas requieren microvolúmenes (unos 60 µl) para cubrir completamente la superficie de los 3 electrodos, lo que reduce el consumo de reactivos, del orden de diez veces comparado con los métodos ELISA, permitiendo así la miniaturización de la celda electroquímica y del propio sensor. En la bibliografía aparecen varios inmunosensores electroquímicos en los que se utilizan los SPCEs para la determinación de DON o de otros tipos de micotoxinas (aflatoxinas [41] u ocratoxina [42]), pero aun son escasos los inmunosensores electroquímicos que existen para el DON que utilizan los SPCEs como transductor electroquímico. Uno de estos inmunosensores para DON recogidos en la bibliografía se trata de un ensayo realizado sobre una placa típica de un ELISA con detección electroquímica sobre los SPCEs. Se trata de un inmunosensor indirecto en el que se lleva a cabo la inmovilización de un conjugado de DON con albúmina serica humana (HSA) con el que ha sido posible de forma satisfactoria la determinación de la concentración de DON de muestras de trigo y de alimentos de origen cereal [32]. EA ER ET Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 11 C Ca ap pí ít tu ul lo o 2 2: : O OB BJ JE ET TI IV VO OS S El objetivo fundamental de este trabajo de investigación se centra en el estudio de la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y un anticuerpo policlonal selectivo a esta molécula para desarrollar un inmunosensor electroquímico competitivo que permita llevar a cabo la determinación de la concentración de DON en muestras de alimentos contaminados. Teniendo en cuenta este objetivo general, se han formulado los siguientes objetivos más específicos: 1. Estudio de la reacción de afinidad entre el anticuerpo policlonal y el conjugado DON-HRP mediante la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). Mediante la inmovilización del anticuerpo policlonal queremos estudiar su afinidad, selectividad y especificidad hacia la molécula de DON y hacia el conjugado DON-HRP. 2. Optimización de los diferentes parámetros que tienen un papel importante en el desarrollo de un ELISA sobre partículas magnéticas, como por ejemplo concentración de elemento de biorreconocimiento a inmovilizar (anticuerpo policlonal de DON), tiempo y temperatura de inmovilización, tampones usados en las diferentes etapas, tiempo y temperatura de competición, concentración del conjugado (DON-HRP), tiempo de la reacción enzimática, etc. 3. Trasladar las condiciones experimentales optimizadas mediante ELISA al desarrollo de un inmunosensor electroquímico, basado en el mismo esquema de ensayo que el que se ha optimizado mediante la técnica espectrofotométrica ELISA, con los sustratos hidroquinona y peróxido de hidrógeno (HQ y H2O2). Se ha utilizado la técnica electroquímica de cronoamperometría (CRA) para medir la extensión de la reacción enzimática sobre la superficie del electrodo de trabajo. 12 Capítulo 3: Experimental C Ca ap pí ít tu ul lo o 3 3: : E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L 3.1 PROCEDIMIENTO DE CONJUGACIÓN DON-HRP: La síntesis del conjugado enzimático DON-HRP necesario para llevar a cabo la etapa de competición, se llevó a cabo en nuestro laboratorio según el siguiente procedimiento [43]: Las conjugaciones se realizaron en tampón A [K3PO4 (50 mM), NaCl (150 mM) y EDTA (1mM)]. Se preparó a 2 pH diferentes: 7,8 y 6,8. Primero se llevó a cabo la preparación del conjugado SATA-HRP. Para ello 1 mg SATA (N- succinimidil S-acetiltioacetato) fue disuelto en 50 µl DMF y se mezcló con una disolución de HRP (1 mg ml-1) en tampón A (pH 7,8) añadiendo la disolución de SATA sobre la de HRP. Se mantuvo durante 1 h con agitación y se realizó una diálisis extensiva para realizar un cambio del tampón A de pH=7,8 a pH = 6,8. El segundo paso fue la preparación del conjugado DON-PMPI. Se tomó 1 mg de DON y se disolvió en 150 µl de DMSO. A continuación se disolvieron 4,82 mg de PMPI (p-maleimidofenil isocianato) en 160 µl de DMSO. Se realizó la mezcla de ambas disoluciones y se mantuvo con agitación durante 1 h a T ambiente. El conjugado DON-HRP se sintetizó utilizando 130 µl del complejo DON-PMPI y 1ml del complejo SATA-HRP pH= 6,8 sintetizados. Mantener con agitación durante 2 h a T ambiente. Figura 7: Reacciones necesarias en la síntesis de DON-HRP Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 13 El PMPI tiene la función de conjugar los grupos hidroxilo del DON con moléculas que contengan grupos sulfhidrilo. El reactivo SATA se usa para introducir un grupo sulfhidrilo en la enzima HRP, para después reaccionar con los grupos NH2 de las proteínas y otras moléculas a través de su grupo N-hidroxisuccinimida (NHS). Entonces la HRP tiene un grupo sulfhidrilo protegido que puede ser almacenado sin degradarse. El éster activo NHS en el extremo del SATA permite reaccionar con los grupos amino de las proteínas y formar enlaces amida muy estables. Para el conjugado sintetizado se ha calculado un relación molar teórica DON/HRP = 13,48 3.2 ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE AFINIDAD ENTRE pAbDON Y DON-HRP POR RESONANCIA DE PLASMÓN SUPERFICIAL (SPR) Se llevó a cabo el estudio de la reacción de afinidad entre el anticuerpo policlonal y el DON mediante la técnica de Resonancia de Plasmón Superficial (SPR). Se realizó un esquema directo con inmovilización del anticuerpo sobre la superficie del chip, de la misma forma que se ha diseñado el inmunosensor electroquímico. Esta técnica no necesita de etiquetado enzimático para la transducción óptica de la medida. Mediante la técnica SPR se produce un cambio de frecuencia debido al cambio de masa sobre la superficie del chip, por lo tanto, cuando se produce interacción entre el anticuerpo y el DON o el conjugado DON-HRP se observa un aumento de la señal registrada. 3.2.1 Materiales e instrumentación - Biacore T200 (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, England) Figura 8: Instrumento de Resonancia de Plasmón Superficial (Biacore T200) - Chip Serie S CM5 (superficie de oro recubierta de dextrano) Figura 9: Chip Serie S CM5 - Micropipetas 5-50 µl, 50-200 µl y 200-1000 µl (Crison, Barcelona, España) - Agitador tipo Vórtex (Reax-control) 14 Capítulo 3: Experimental 3.2.2 Reactivos y tampones Reactivos de inmunoensayo: - Anticuerpo policlonal selectivo a DON (pAbDON, 1000 mg l-1. D01F-1 lote 1, Antiprot) - Deoxinivalenol, >98 % (Sigma-Aldrich, referencia D0156) - Enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). EC Nº 1.11.1.7 (Sigma-Aldrich) - Conjugado DON-HRP (sintetizado en nuestro laboratorio) - Albúmina serica bovina (BSA) EC Nº 232-936-2 (Sigma-Aldrich) Reactivos de uso general: - 1-Etil-3-(3-dimetillaminopropil)carbodiimida (EDC) - N-hidroxisuccinimida (NHS) - Etanolamina - Agua MilliQ Tampones: - Running Buffer: HBS-EP, pH 7,4, HEPES (10 mM), NaCl (150 mM), EDTA (3 mM), Polysorbate20 (0.005%) - Tampón de inmovilización: Acetato (0,1 M, pH 4). 3.2.3 Procedimiento experimental: - Inmovilización pAbDON sobre la superficie del chip (dextrano) Para llevar a cabo la inmovilización del elemento de biorreconocimiento sobre la superficie del chip fueron necesarias 3 etapas. En primer lugar se activó la superficie de dextrano del chip (método de la carbodiimida) mediante inyección manual de 50 µl de la mezcla EDC (200 mM) + NHS (50 mM). Tras la etapa de activación se inyectó el pAbDON (1 µl en 130 µl tampón de inmovilización) a una velocidad de 10 µl/min durante 600 s. Para finalizar correctamente la inmovilización del pAbDON se llevó a cabo el bloqueo de los sitios libres del chip con 60 µl de etanolamina (1 M pH 8,5) para evitar posibles uniones inespecíficas posteriores. - Estudio de la reacción de afinidad entre el DON y DON-HRP con el anticuerpo policlonal Para llevar a cabo el estudio de la reacción de afinidad entre el DON o DON-HRP con pAbDON fue necesaria la inyección de una disolución de DON para comprobar si existe unión al pAbDON inmovilizado. Para ello se realizaron inyecciones de DON (0 a 2 mg l-1) en Running Buffer. Además también se realizó el estudio con inyecciones de DON-HRP (concentración de DON de 0 a 2 mg l-1) en Running Buffer. Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 15 3.2.4 Resultados y discusión: - Inmovilización de pAbDON: Tras las etapas de inmovilización de pAbDON sobre la superficie de dextrano del chip se obtuvo una señal de 7328,3 RU correspondiente a la correcta inmovilización del anticuerpo. A continuación se adjunta el sensograma de la inmovilización del pAbDON. Figura 10: Sensograma obtenido en el proceso de inmovilización de pAbDON sobre el dextrano del chip CM5 en tampón acetato (0,1 M) pH 4 Una señal de inmovilización de 7328,3 RU es una señal adecuada para el estudio de la reacción de afinidad entre el DON y DON-HRP con el anticuerpo policlonal. - Estudio de la reacción de afinidad entre el DON y DON-HRP con el anticuerpo policlonal En primer lugar se estudió la reacción de afinidad del DON por el anticuerpo inmovilizado sobre la superficie del chip CM5, obteniéndose baja señal para todas las concentraciones de DON estudiadas (RU < 4,5). En principio, puede significar que existe una baja afinidad entre el DON y el anticuerpo policlonal. Estas señales tan bajas también pueden ser debidas [28] al bajo peso molecular del DON (296,32 Da) y por lo tanto que el instrumento no sea capaz de detectar con la suficiente sensibilidad la presencia de esta molécula sobre la superficie del chip, y mucho menos de discernir entre las diferentes concentraciones. Además se llevó a cabo el estudio de la reacción de afinidad de la HRP (PM = 44 kDa) sobre el pAbDON inmovilizado, para evaluar las posibles uniones inespecíficas producidas con el conjugado EDC/NHS pAbDON etanolamina RU = 7328,3 22 Capítulo 3: Experimental 0.468 0.615 0.659 0.588 0.570 0.335 0.215 0.311 0.475 0.313 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.06 0.08 0.1 0.12 0.18 Absorbancia DON-HRP (mg/l) DON (0 mg/l) DON (5 mg/l) Figura 15: Comparativa de resultados de absorbancia obtenidos de las experiencias competitivas, con diferentes concentraciones DON-HRP, 0,06 µg pAbDON y experiencias con y sin DON. Revelado 50 µl TMB 20 minutos a T ambiente, y 50 µl H2SO4 0.5 M. Medida absorbancia 450 nm. Las mayores diferencias en la medida de la absorbancia se obtuvieron al trabajar con concentraciones de DON-HRP de 0,08 mg l-1 y 0,1 mg l-1 con unos porcentajes de disminución de la señal de 65% y 53% respectivamente. En principio no se descartó trabajar con ninguna de las 2 concentraciones de DON-HRP seleccionadas. - Calibrado competitivo de DON: Una vez optimizados los parámetros anteriores que permanecen fijos en el inmunosensor, se realizó un calibrado para concentraciones crecientes de DON en el rango 0 - 0,1 mg l-1, para cada una de las 2 concentraciones de DON-HRP elegidas como óptimas 0,08 mg l-1 y 0,1 mg l-1: Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 23 0.430 0.235 0.112 0.085 0.062 0.555 0.399 0.292 0.141 0.122 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 0.0001 0.01 0.05 0.1 Abs DON (mg/l) DON-HRP (0,08 mg/l) DON-HRP (0,1 mg/l) Figura 16: Resultados de absorbancia obtenidos de los calibrados competitivos, 0,06 µg pAbDON, DON-HRP (0,08 y 0,1mg l-1). Revelado 50 µl TMB 20 minutos a T ambiente, y 50 µl H2SO4 0.5 M. Medida absorbancia 450 nm. Los datos se ajustaron a una curva sigmoidea haciendo uso de la ecuación de los cuatro parámetros logísticos 4PL (ajuste típico en experiencias competitivas de este tipo) : Donde: m1 = mínimo de señal de absorbancia m2= máximo de señal de absorbancia m3 = punto de inflexión (factor EC50) m4 = pendiente del tramo recto El ajuste de los resultados obtenidos en los calibrados anteriores para ambas concentraciones de DON-HRP se muestra en la Figura 17: 24 Capítulo 3: Experimental 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 10-6 10-5 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 [DON-HRP] = 0.08 mg/l [DON-HRP] = 0.1 mg/l Abs [DON] (mg/l) y = m1+(m2-m1)/(1+(x/m3)^m4) ErrorValue 33.623-1.6609m1 1.10250.73613m2 1315889.109m3 0.83930.15468m4 NA0.0016064Chisq NA0.99389R y = m1+(m2-m1)/(1+(x/m3)^m4) ErrorValue 0.0158960.43004m1 0.011470.073001m2 3.8277e-50.00046686m3 0.78079-2.733m4 NA0.00025258Chisq NA0.99864R Figura 17: Ajuste sigmoideo los calibrados competitivos, 0,06 µg pAbDON, DON-HRP (0,08 y 0,1 mg l-1). Revelado 50 µl TMB 20 minutos a T ambiente, y 50 µl H2SO4 0.5 M. Medida absorbancia 450 nm. Los parámetros obtenidos en el ajuste de ambas curvas son: [DON-HRP] mg l-1 Abs max Abs mín Pendiente EC50 (mg l-1) R 0,08 0,430 0,073 -2,733 0,0005 0,9986 0,1 0,736 -1,661 0,155 89,11 0,9939 Tabla 4: Parámetros obtenidos en el ajuste sigmoideo El mejor ajuste sigmoideo se obtuvo para una concentración de DON-HRP de 0,08 mg l-1, consiguiendo un IC50 de 0,0005 mg l-1 y un valor de sensibilidad (pendiente del tramo recto) de 2,733 l mg-1. Por lo tanto, viendo los resultados obtenidos podemos concluir que realizando un calibrado competitivo utilizando 15 µl de MBs-To-pAbDON (0,06 µg pAbDON) y DON-HRP (0,08 mg l-1) para concentraciones de DON (0- 0,1 mg l-1) se alcanza una elevada sensibilidad y se puede determinar una concentración de DON muy baja. Además se observó que para concentraciones de DON mayores, la tendencia seguida se perdía, es decir, la reacción de competición no es posible para concentraciones de DON superiores a 0,1 mg l-1. Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 25 3.4 ESTUDIO DE LA REACCIÓN COMPETITIVA ENTRE DON Y DON-HRP SOBRE pAbDON INMOVILIZADO SOBRE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS MEDIANTE TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS Después del estudio y optimización mediante ELISA espectrofotométrico [44] se trasladaron las condiciones optimizadas para la determinación de DON mediante transducción electroquímica. Se trata de un inmunosensor directo competitivo que se resume en: MBs-pAbDON-(DON/DON-HRP) Una vez que todas las reacciones se han llevado a cabo de forma semejante a las reacciones descritas en el ELISA magnético y tras las correspondientes etapas de lavado, el conjugado formado se resuspendió en un volumen pequeño (15 µl) consiguiendo así la concentración de los reactivos sobre la superficie de la partícula. Este pequeño volumen será el que se mida sobre el electrodo serigrafiado mediante una reacción electroquímica, tal y como se muestra en el esquema de la Figura 18. Figura 18: Esquema del inmunosensor electroquímico competitivo para DON La reacción que se produce sobre el SPCE, consiste en una reacción enzimática (10 min) en la que la HRP del conjugado realiza la oxidación de la HQ a p-Benzoquinona (pBQ) en presencia de H2O2. Una vez oxidada la HQ, y por acción del barrido de potencial (o salto del impulso de potencial en cronoamperometría) se produce de nuevo la reducción de pBQ a HQ. En cronoamperometría se realizó la medida a los 80 s (señal estable) de aplicar un salto de potencial de 0 a -0,25 V, produciéndose la reducción catódica de la pBQ. 3.4.1 Reactivos e instrumentación - Potenciostato Autolab PGSTAT12, (Nº serie AUT71572) Figura 19: Potenciostato Autolab PGSTAT12 26 Capítulo 3: Experimental - SPCEs cerámicos (DropSens, Asturias,España) - Agitador tipo Vórtex (Reax-control) - Agitador Thermomixer Compact, para 24 viales eppendorf (Eppendorf Ibérica, Madrid, España) - Viales tipo eppendorf (500 y 1500 µl) - Separador magnético Z5342 (Promega, Madison, USA) 3.4.2 Reactivos y tampones Reactivos de inmunoensayo: - Micropartículas magnéticas Dynabeads Tosylactivated, MBs-To (30 mg ml-1, Ø=2,8 µm) (Invitrogen) - Micropartículas magnéticas Dynabeads M-280 Sheep anti-rabbit IgG, MBs-aIgG (10 mg ml-1, Ø=2,8 µm) (Invitrogen) - Micropartículas magnéticas Dynabeads MyOne Carboxylic Acid, MBs-COOH (10 mg ml-1, Ø=1 µm) (Invitrogen) - Deoxinivalenol (Sigma-Aldrich, referencia D0156) - Anticuerpo policlonal selectivo a DON (pAbDON), 1000 mg l-1. D01F-1 lote 1 (Antiprot) - Conjugado DON-HRP (sintetizado en nuestro laboratorio) - Enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). EC Nº 1.11.1.7 (Sigma Aldrich) - Extravidina Peroxidasa, eaHRP (Sigma-Aldrich) - Albúmina serica bovina (BSA) EC Number 232-936-2 (Sigma-Aldrich) Reactivos de uso general: - Sales de sodio: NaH2PO3, Na2HPO3, NaCl… - Tween20 (Sigma-Aldrich) - Agua Milli Q - Hidroquinona (HQ), (Sigma-Aldrich) - H2O2 30% (Sigma-Aldrich) Tampones y disoluciones: Para cada una de las partículas magnéticas, se recomienda el uso de unos tampones muy específicos, que se muestran en los anexos correspondientes junto a cada protocolo de trabajo. 3.4.3. Procedimiento experimental: - Optimización de las condiciones de la reacción enzimática sobre el SPCE: Las condiciones electroquímicas y las concentraciones de los sustratos del enzima HRP (HQ y H2O2) fueron optimizadas para obtener la mayor sensibilidad posible en la etapa de transducción electroquímica. Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 27 Debido a la inestabilidad de la HQ en disolución se va a utilizar una concentración relativamente baja. En la bibliografía [14, 45] se utiliza preferentemente una concentración de HQ de 1,8 mM, además de pasar una corriente de N2 previamente y mantenerla en la oscuridad mientras se lleva a cabo el análisis. La HQ se oxida rápidamente en medios alcalinos (oxidación instantánea pH > 7), por ello la etapa de detección amperométrica se ha decidido realizar a un pH de 6,5 que aumenta la actividad enzimática de la HRP a la vez que previene en parte la oxidación de la HQ. - Inmunosensor con partículas magnéticas funcionalizadas con el grupo Tosilo (MBs-To) Tras la optimización de las condiciones del inmunosensor mediante ELISA magnético con el esquema MBs-To-pAbDON-DON-HRP/DON se quiere trasladar su medida a la técnica de cronoamperometría. El procedimiento de inmovilización del pAbDON sobre las MBs-To y las reacciones posteriores se detalla en el Anexo II. - Inmunosensor con partículas magnéticas funcionalizadas con un anticuerpo genérico (MBsaIgG) Además del uso de MBs-To se decidió estudiar otros posibles esquemas directos competitivos utilizando otras partículas magnéticas modificadas con diferentes grupos reactivos. En este caso se utilizaron MBs funcionalizadas con un anticuerpo genérico aIgG. El protocolo de trabajo llevado a cabo se resume en el Anexo III. - Inmunosensor con partículas magnéticas modificadas con grupos carboxilos (MBS-COOH) Con el objetivo de encontrar las condiciones de trabajo que proporcionen los mejores resultados, se llevó a cabo un nuevo esquema en el que el pAbDON se inmovilizó sobre partículas magnéticas modificadas con grupos carboxilos (MBs-COOH) y que por lo tanto tienen capacidad de unirse mediante enlace amida al grupo amino de los anticuerpos por el procedimiento de la carbodiimida. El protocolo de trabajo que se realizó se resume en el Anexo IV. 3.4.4 Resultados y discusión: - Optimización de las condiciones de la reacción enzimática sobre el SPCE: Con el fin de caracterizar electroquímicamente uno de los sustratos de la reacción enzimática, se realizó una voltametría cíclica con HQ (1,8 mM) en las siguientes condiciones:  Potencial inicial -0,6 V 28 Capítulo 3: Experimental  Potencial final: 1 V  Velocidad de barrido de potencial: 50 mV s-1 Con la voltametría cíclica realizada en primer lugar se provocó la oxidación de la HQ para posteriormente llevar a cabo la reducción, de igual forma que se realizará en la etapa final del inmunosensor sobre el SPCE. El voltagrama cíclico obtenido fue: Figura 20: Voltametría cíclica HQ (1,8 mM) de -0.6 a 1 V a 50 mV s-1 Con este voltagrama se seleccionó el salto de potencial óptimo para realizar cronoamperometría para ello se tomó la posición del pico catódico (-0,16 V) y se eligió un salto de potencial de 0 a - 0,25 V (reducción). Es importante observar que al potencial inicial de la medida cronoamperométrica (0 V) todavía no se ha producido la oxidación electroquímica de la HQ debido a la irreversibilidad (separación de los picos anódico y catódico) del voltagrama cíclico. - Optimización concentración H2O2: Se realizaron diferentes experiencias para optimizar las concentraciones de reacción de la peroxidasa con HQ y H2O2 por cronomaperometría (salto de potencial desde 0 hasta -0,25 V). En primer lugar se evalúo la reacción en ausencia del enzima para constatar que la reacción no puede tener lugar. Los valores de intensidad obtenidos se muestran en la siguiente tabla: Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 29 EXPERIENCIA Sin HQ Con HQ (1,8 mM) I (µA) I (µA) H2O2 (0 mM) -0,059 -0,134 H2O2 (0,4 mM) -0,068 -0,110 H2O2 (0,6 mM) -0,073 -0,085 H2O2 (1 mM) -0,098 -0,142 H2O2 (1,8 mM) -0,102 -0,143 H2O2 (2,4 mM) -0,113 -0,140 Tabla 5: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 – 2,4 mM), en ausencia de HQ y con HQ (1,8 mM) y en ausencia de eaHRP Se observó que la H2O2 en solitario, para cualquier concentración no produce señal electroquímica en ausencia de la enzima HRP (corrientes del orden de nA). Cuando se añadió además HQ (1,8 mM) y todavía en ausencia de la enzima HRP la corriente registrada aumenta, pero en principio no se puede considerar interferente (aprox. -0,1 µA). Este aumento en el valor de la corriente registrada en presencia de la HQ y el H2O2 fue debido a la oxidación espontánea de la HQ en el aire y la posterior reducción de la p-benzoquinona (pBQ) que se genera sobre la superficie del electrodo de trabajo, lo que demuestra la inestabilidad de la disolución de HQ que es preciso preparar justo antes de cada medida electroquímica. Otro factor a tener en cuenta es el efecto de la presencia de la HQ o no en contacto con la HRP. En este caso se inmovilizó la enzima (eaHRP comercial, se tomó como patrón de la concentración de HRP) durante 24 h sobre la superficie del electrodo de trabajo (4 µl) a 4ºC, y se midió la corriente generada mediante la técnica de cronoamperometría tras 10 min de reacción enzimática, contados desde la adición del H2O2 sobre el SPCE. Tras la reacción enzimática catalizada por la HRP se produjo la oxidación de la hidroquinona (HQ) a pBQ, y posteriormente se realizó la reducción a HQ sobre el SPCE con el pulso producido con la cronoamperometría. Los resultados obtenidos son: EXPERIENCIA Sin HQ Con HQ (1,8 mM) I (µA) I (µA) H2O2 (0 mM) -0,057 -0,023 H2O2 (0,4 mM) -0,033 -0,421 H2O2 (0,6 mM) -0,033 -0,831 H2O2 (1 mM) -0,033 -1,52 H2O2 (1,8 mM) -0,023 -2,34 H2O2 (2,4 mM) -0,026 -2,44 Tabla 6: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 – 2,4 mM), en ausencia y con HQ (1,8 mM) y en presencia de eaHRP (0,13 µg) tras 10 min de reacción 30 Capítulo 3: Experimental Con los resultados de la Tabla 6, quedó demostrado que para que la reacción enzimática se produzca tienen que intervenir los 3 reactivos (enzima + sustrato + mediador de transferencia de carga). En ese caso, se observó un aumento proporcional de la señal con el aumento de la concentración de H2O2 hasta la saturación de la señal a partir de H2O2 (1,8 mM). Figura 21: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (0 – 2,4 mM), con HQ (1,8 mM) y en presencia de eaHRP (0,13 µg) tras 10 min de reacción A la vista de los resultados se seleccionó la concentración óptima del H2O2 (1 mM). Las condiciones seleccionadas como óptimas que se van a utilizar en el desarrollo del inmunosensor son:  HQ (1,8 mM)  H2O2 (1 mM)  Cronoamperometría (0 a -0,25 V) Una vez decididas las condiciones se realizó un calibrado con un rango de concentraciones de HRP entre 0,0001 y 2 mg l-1, poniendo cantidades crecientes de DON-HRP (se inmovilizó la concentración teórica deseada de HRP (DON-HRP) durante 24 h sobre la superficie del electrodo de trabajo (4 µl) a 4ºC. Los resultados obtenidos son: Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 31 [HRP] mg/l Sin HQ Con HQ (1,8 mM) I (µA) I (µA) 0,0001 -0,108 -12,5 0,05 -1,40 -160 1 -1,76 -184 1,5 -2,33 -289 2 -2,55 -279 Tabla 7: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (1 mM), y HQ (1,8 mM) con concentraciones HRP (0,0001-2 mg l-1). Reacción 10 min. Figura 22: Resultados cronoamperometría entre 0 y -0,25 V con H2O2 (1 mM), y HQ (1,8 mM) con concentraciones DON-HRP ([HRP] 0,0001-2 mg l-1). Reacción 10 min. Se observó que en el caso del DON-HRP la señal de intensidad va aumentando de forma proporcional al aumento de la cantidad de HRP inmovilizada. En esta experiencia se confirmó que la reacción electroquímica entre el DON-HRP con HQ (1,8 mM) y H2O2 (1 mM) por cronoamperometría (0 a - 0,25 V) sucede de forma satisfactoria, y existe una variación lineal en la señal con respecto al aumento de la concentración del conjugado. - Inmunosensor con partículas magnéticas funcionalizadas con el grupo Tosilo (MBs-To) Antes de comenzar con reacciones competitivas en las condiciones óptimas se comprobó si la señal obtenida en la reacción enzimática entre HRP y los sustratos del enzima (HQ y H2O2) sobre el electrodo puede determinarse correctamente mediante transducción electroquímica. 38 Capítulo 4: Conclusiones C Ca ap pí ít tu ul lo o 4 4: : C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S En este trabajo Fin de Máster se ha realizado un estudio de las condiciones óptimas de trabajo con el objetivo de diseñar un inmunosensor electroquímico competitivo para la determinación de deoxinivalenol en muestras de alimentos empleando un anticuerpo policlonal. Se estudió en primer lugar la reacción de afinidad entre la micotoxina y el anticuerpo para posteriormente optimizar la reacción competitiva del DON y el DON-HRP. Las conclusiones de cada apartado del trabajo se resumen a continuación: I) Estudio de la reacción de afinidad entre pAbDON y DON-HRP por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR) - Se produce una correcta inmovilización del pAbDON sobre el chip de dextrano, como se deduce de las medidas RU en este proceso (7328,3 RU) - En el estudio de la afinidad del DON sobre el anticuerpo inmovilizado sobre la superficie del chip se obtiene una señales muy bajas (RU < 4,5) para todas las concentraciones de DON estudiadas, debido a que la sensibilidad del SPR no es capaz de detectar el bajo peso molecular del DON (296,32 Da) - No existen uniones inespecíficas entre el enzima HRP y el pAbDON (RU < 3,8) - Se observa un aumento de señal proporcional a la concentración del conjugado DON-HRP, lo que significa afinidad del anticuerpo pAbDON sobre este conjugado que permite esquemas directos y competitivos de inmunoensayo II) Estudio de la reacción competitiva entre DON-HRP y DON mediante ELISA (convencional y con partículas magnéticas) - Se han optimizado las condiciones de medida del ELISA convencional. Se inmovilizó el pAbDON sobre el pocillo de poliestireno, sin agitación y a 4ºC durante 24 h en tampón carbonatos (0,05 M pH 9,6). Además se aumentó el tiempo de incubación del DON-HRP durante 1 h con agitación y a T ambiente con lo que se consiguió un aumento notable de las señales de absorbancia - Existe una elevada unión no específica en ausencia de pAbDON (0,374 unidades de absorbancia para una concentración de DON-HRP de 5 mg l-1) sobre la superficie del pocillo de las placas ELISA, por lo que es necesario su bloqueo - Se ha demostrado la posibilidad de emplear partículas magnéticas en un sistema ELISA espectrofotométrico convencional, en donde el consumo de anticuerpo y conjugados es menor Diseño de un biosensor competitivo electroquímico basado en la reacción de afinidad entre el deoxinivalenol y su anticuerpo policlonal 39 - Las condiciones optimizadas para el inmunoensayo competitivo entre DON y DON-HRP en el ELISA con partículas magnéticas son: 1. Inmovilización del pAbDON (2 µg según la capacidad teórica de unión) sobre las MBs-To 2. Volumen de MBs-To-pAbDON en 15 µl para cada experiencia como volumen óptimo de trabajo 3. Concentración óptima de DON-HRP (0,08 mg l-1) para la competición con concentraciones de DON entre 0 y 0,1 mg l-1 - La sensibilidad del inmunosensor en las condiciones óptimas anteriores fueron: IC50 de 0,0005 mg l-1 y la sensibilidad es de 2,733 l mg-1 de DON. III) Estudio de la reacción competitiva entre DON y DON-HRP sobre pAbDON inmovilizado sobre partículas magnéticas mediante transducción electroquímica - Se optimizaron las concentraciones óptimas de los sustratos de la HRP para la reacción enzimática (10 min) sobre el SPCE, que se han fijado en HQ (1,8 mM) y H2O2 (1 mM). El salto de potencial óptimo empleado en cronoamperometría (de 0 a -0,25 V) permite la reducción electroquímica de la pBQ generada enzimáticamente, sin oxidación electroquímica del HQ. - Se ha observado una alta unión no específica del DON-HRP sobre las partículas magnéticas modificadas con el grupo tosilo, debido probablemente a un bajo rendimiento de la inmovilización del pAbDON (defecto de pAbDON inmovilizado dejando grupos Tosilo de las MBs- To libres) o por una inmovilización con la zona de reconocimiento Fab no accesible al antígeno - Se estudiaron MBs funcionalizadas con anticuerpo genérico aIgG, capaces de unirse al pAbDON por su región Fc, dejando más accesible la parte Fab del anticuerpo. Sin embargo, se observó una fuerte adsorción inespecífica del conjugado DON-HRP. - Estudiando otras MBs funcionalizadas con COOH, se ha comprobado que la inmovilización del pAbDON sobre MBs-COOH mediante una reacción con EDC/NHS, para pAbDON (1,5 µg l-1) y su reacción con DON-HRP (6 µg l-1) producen una correcta reacción de biorreconocimiento y señales de competitividad con la que se obtiene un aumento de intensidad del 47,6% entre la experiencia en ausencia y en presencia de pAbDON. - En las mismas condiciones se estudió la reacción de competición con DON (0 - 1 mg l-1). Se observa competición satisfactoria DON-HRP (6 µg l-1) para concentraciones de DON (0 – 0,01 mg l-1), produciendo una disminución de señal del 68% entre la experiencia libre de DON (corriente máxima obtenida -0,250 µA) 40 Capítulo 4: Conclusiones - La continuación de este trabajo de investigación está ligado a la optimización del inmunosensor a partir de los estudios y conclusiones detalladas en esta memoria. En estos momentos se ha comenzado a trabajar con un nuevo anticuerpo monoclonal altamente selectivo y específico para el DON y un conjugado DON-HRP que es reconocido eficientemente con este anticuerpo. El nuevo conjugado además produce menores adsorciones inespecíficas. Las bases establecidas en este trabajo y el comportamiento de las diferentes partículas magnéticas que se han descrito están permitiendo la rápida optimización de un nuevo inmunosensor de la micotoxina, en concentraciones menores a las permitidas por la legislación de la Unión Europea [6]. Un estudio posterior que se va a llevar a cabo como consecuencia de este trabajo es la determinación simultánea de varias micotoxinas (ocratoxina A y fumonisina B1 junto al deoxinivalenol) empleando sus diferentes anticuerpos como ligandos de afinidad selectivos. ANEXOS ANEXO I: PROTOCOLOS DE TRABAJO EN ENSAYOS ELISA - ELISA convencional Para realizar el ensayo ELISA convencional, inicialmente se llevaron a cabo los siguientes pasos: 1. Lavado de los pocillos con tampón CB (2 veces) 2. pAbDON diferentes diluciones (50 µl por pocillo) 3. Incubar 24 h con agitación a T ambiente 4. Lavados con PBS 0,1 M (3 veces) 5. Etapa de bloqueo con PBS 0,1 M con caseínato de sodio (2% m/v)), 200 µl por pocillo (30 minutos con agitación y a T ambiente) 6. Lavados con PBS 0,1 M (3 veces) 7. Adición DON-HRP desde 0 a 5 mg l-1 (50 µl por pocillo) 8. 30 minutos con agitación y a T ambiente 9. Lavados con PBS 0,1 M (3 veces) 10. 50 µl TMB: reacción con agitación 20 minutos a T ambiente. 11. Adición de 50 µl H2SO4 0,5 M para parar la reacción 12. Medida de la absorbancia a 450 nm - ELISA con partículas magnéticas MBs-To: A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-To: - Tampón fosfato (PBS): HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 - Tampón lavado (PBST): PBS con Tween20 (0,02% m/v) - Tampón almacén y bloqueo: PBS con BSA (0,1 % m/v) En primer lugar se llevó a cabo la inmovilización del pAbDON sobre las MBs-To teniendo en cuenta la capacidad de unión (20 µg de pAbDON por mg de MBs-To): 1. Agitar durante 5 minutos las MBs-To y tomar la cantidad deseada (100 µg) 2. Lavado y acondicionamiento de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS 3. Añadir 2 µl de pAbDON (1000 mg l-1) en tampón PBS 4. Agitar durante 24 h a temperatura ambiente 5. Lavado de las MBs-To: 2 lavados PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS 6. Resuspender MBs-To-pAbDON en tampón de almacenamiento y bloqueo (PBS con BSA (0,1 % m/v)) y almacenar a 4ºC hasta su uso Una vez que las partículas magnéticas están modificadas con el pAbDON, se llevó a cabo el siguiente protocolo de trabajo: ANEXOS 1. Añadir un volumen fijo de MBs-To-pAbDON 2. Lavado de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS (0,1 M) con ayuda de un campo magnético 3. Añadir concentraciones diferentes del conjugado enzimático DON-HRP según la experiencia (y DON si la experiencia es competitiva) 4. Agitar durante 1 h T ambiente 5. Lavado de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS (0,1 M) con ayuda de un campo magnético 6. Resuspender en el volumen de partida de MBs-To-pAbDON en PBS (0,1 M) 7. Añadir un volumen fijo de MBs-To-pAbDON-DON-HRP/DON en cada pocillo 8. Añadir 50 µl de TMB (preparado para usar en ELISA), y dejar reaccionar en el pocillo durante 20 minutos a T ambiente y agitación 9. Añadir 50 µl de H2SO4 (0,5 M)como reactivo de parada de la reacción enzimática entre la HRP y el TMB 10. Medir el valor de la absorbancia en un lector ELISA a una longitud de onda de 450 nm ANEXOS ANEXO II: PROTOCOLO DE TRABAJO CON MBs-To CON DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-To: - Tampón fosfato (PBS): HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 - Tampón lavado (PBST): PBS con Tween20 (0,02% m/v) - Tampón almacén y bloqueo: PBS con BSA (0,1 % m/v) En primer lugar se llevó a cabo la inmovilización del pAbDON sobre las MBs-To teniendo en cuenta la capacidad de unión (20 µg de pAbDON por mg de MBs-To). El protocolo de inmovilización es semejante a la inmovilización realizada para el ELISA magnético: 1. Agitar durante 5 minutos las MBs-To y tomar la cantidad deseada (100 µg). 2. Lavado y acondicionamiento de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS 3. Añadir 2 µl de pAbDON (1000 mg l-1) en tampón PBS, (2 µg pAbDON) 4. Agitar durante 24 h a temperatura ambiente 5. Lavado de las MBs-To: 2 lavados PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS 6. Resuspender la suspensión MBs-To-pAbDON en tampón de almacenamiento y bloqueo (PBS con BSA (0,1 % m/v) y almacenar a 4ºC hasta su uso Una vez que las partículas magnéticas están modificadas con el pAbDON, se llevó a cabo el siguiente protocolo: 1. Añadir un volumen fijo de MBs-To-pAbDON en cada vial eppendorf. 2. Lavado de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS (0,1 M) con ayuda de un campo magnético 3. Añadir concentraciones diferentes del conjugado enzimático DON-HRP según la experiencia (y DON si la experiencia es competitiva) 4. Agitar durante 1 h T ambiente 5. Lavado de las MBs-To: 2 lavados con tampón PBST (0,02% m/v) y 1 lavado con tampón PBS (0,1 M) con ayuda de un campo magnético. 6. Resuspender en el volumen de partida de MBs-To-pAbDON en PBS (0,1 M, pH 7,4) 7. Depositar 10 µl de la suspensión de MBs-To-pAbDON sobre la superficie del electrodo de trabajo del SPCE. 8. Añadir 25 µl de HQ (4,3 mM) y 25 µl de H2O2 (2,4 mM) para cubrir la superficie de los tres electrodos. Las concentraciones que quedan sobre el electrodo son HQ (1,8 mM) y 25 µl de H2O2 (1 mM) 9. Dejar la reacción enzimática durante 10 minutos. 10. Aplicar mediante la técnica electroquímica de cronoamperometría un salto de potencial desde 0 a -0.25 V y tomar el valor de la corriente a un tiempo constante de 80 s ANEXOS ANEXO III: PROTOCOLO DE TRABAJO CON MBs-aIgG CON DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-aIgG: - Tampón lavado inicial de MBs-aIgG: NaH2PO4 (1,16 mM), Na2HPO4 (6,90 mM), NaCl (0,138 M) pH 7,4 - Tampón de reacción, PBS: HPO4-2/H2PO4- (0,1 M) y NaCl (0,138 M) pH=7,4 - Tampón lavado PBST: PBS con Tween20 (0,02% m/v) En este caso la capacidad unión es 2,5 µg por mg de MBs-aIgG. El protocolo de trabajo que se siguió con estas partículas magnéticas se describe a continuación: 1. Agitar las partículas magnéticas durante 3 min. 2. Lavar las partículas magnéticas (30 µg) con el tampón de lavado (tres lavados con el tampón de lavado inicial MBs-aIgG 3. Añadir el la cantidad necesaria pAbDON según la capacidad de unión de las MBs-aIgG (0,075 µg pAbDON) 4. Incubar la suspensión de MBs-aIgG con el pAbDON durante 10-60 min a T ambiente 5. Separar las MBs-aIgG modificadas con el pAbDON con ayuda de un separador magnético 6. Realizar tres lavados con tampón PBS (0,1 M pH 7,4) 7. Añadir DON-HRP en tampón PBS (0,1 M, pH 7,4) según la experiencia (y DON si la experiencia es competitiva) 8. Agitar durante 1 h a T ambiente 9. Lavar las MBs-aIgG-pAbDON con tampón PBS (0,1 M, pH 7,4) por triplicado. 10. Resuspender las MBs-aIgG-pAbDON en tampón PBS (0,1 M, pH 7,4) 11. Depositar 10 µl de la suspensión de MBs-aIgG-pAbDON sobre la superficie del electrodo de trabajo del SPCE. 12. Añadir 25 µl de HQ (4,3 mM) y 25 µl de H2O2 (2,4 mM) para cubrir la superficie de los tres electrodos. Las concentraciones que quedan sobre el electrodo son HQ (1,8 mM) y 25 µl de H2O2 (1 mM). 13. Dejar la reacción enzimática durante 10 minutos. 14. Aplicar mediante la técnica electroquímica de cronoamperometría un salto de potencial desde 0 a -0.25 V y tomar el valor de la corriente a un tiempo constante de 80 s. ANEXOS ANEXO IV: PROTOCOLO DE TRABAJO CON MBs-COOH CON DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA En el Anexo IV se detalla el protocolo de trabajo seguido para la inmovilización del pAbDON sobre las MBs-COOH y reacciones de incubación posteriores, así como la detección electroquímica por cronoamperometría. A continuación se recogen los tampones específicos necesarios para trabajar con MBs-COOH: - Tampón MES (15 mM, pH 6) - EDC, 10 mg ml-1 en agua -Tampón fosfatos: NaH2PO4 (1,88 mM), Na2HPO4 (8 mM), NaCl (0,15 M) pH 7,4 - Tampón fosfatos con Tween20 (0,1% m/v) En este caso la capacidad unión es 50 µg por mg de MBs-COOH. La inmovilización del pAbDON se produce mediante una reacción con una carbodiimida (EDC) que activa los grupos carboxilo de las partículas magnéticas para unirse con el anticuerpo mediante un enlace amida. El producto de reacción entre el ácido carboxílico y la carbodiimida es muy lábil (se hidroliza rápidamente) por lo que la inmovilización del anticuerpo debe producirse inmediatamente después de la etapa de activación. 1. Resuspender las MBs-COOH con agitación durante 30 min 2. Colocar 30 µg de las MBs-COOH en un eppendorf y separarlas con ayuda de un bloque magnético para posteriormente retirar el sobrenadante. 3. Lavar las MBs-COOH por duplicado con 1 ml de tampón MES (15 mM, pH 6) 4. Resuspender en 100 µl de tampón MES (15 mM, pH 6) 5. Añadir 100 µl EDC (10 mg ml-1 en H2O mili Q) 6. Incubar durante 30 min con agitación a T ambiente 7. Añadir el pAbDON según la capacidad de unión indicada de las MBs-COOH (1,5 µg pAbDON) 8. Incubar durante toda la noche a T ambiente con agitación. 9. Lavar con tampón PBS-Tween (0,1% m/v) por duplicado durante 10 min con agitación y una vez con PBS (0,1 M) 10. Añadir los volúmenes necesarios de DON y DON-HRP para llevar a cabo la etapa de competición durante 1 h en tampón PBS 11. Lavar por duplicado con tampón PBS-Tween (0,1%) y 1 vez con tampón PBS 12. Resuspender las MBs-COOH en el volumen inicial 13. Depositar 10 µl de la suspensión de MBs-COOH-pAbDON sobre la superficie del electrodo de trabajo del SPCE. 14. Añadir 25 µl de HQ (4,3 mM) y 25 µl de H2O2 (2,4 mM) para cubrir la superficie de los tres electrodos. Las concentraciones que quedan sobre el electrodo son HQ (1,8 mM) y 25 µl de H2O2 (1 mM) ANEXOS 15. Dejar la reacción enzimática durante 10 minutos 16. Aplicar mediante la técnica electroquímica de cronoamperometría un salto de potencial desde 0 a -0.25 V y tomar el valor de la corriente a un tiempo constante de 80 s. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] R. Krska, S. Baumgartner, R. 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