Repositorio Institucional de Documentos

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Análisis transcripcional de la expresión de genes implicados en la síntesis de la cianotoxina microcistina como respuesta a lindano Memoria presentada por Laura Ceballos Laita Licenciada en Bioquímica, para optar al título de Máster en Biología Molecular y Celular por la Universidad de Zaragoza Julio 2012 2 3 MARÍA LUISA PELEATO SÁNCHEZ y LAURA CALVO BEGUERÍA CERTIFICAN: Que el proyecto fin de Máster “Análisis transcripcional de la expresión de genes implicados en la síntesis de la cianotoxina microcistina como respuesta a lindano”, ha sido realizada por la licenciada LAURA CEBALLOS LAITA en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza, bajo su dirección y que reúne, a su juicio, las condiciones requeridas para optar al título de Máster en Biología Molecular y Celular. Zaragoza, julio de 2012 Fdo: María Luisa Peleato Sánchez Fdo: Laura Calvo Beguería 4 5 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Las cianobacterias. 9 1.1.1. Las cianobacterias pueden producir toxinas. 9 1.1.1.1. Microcistinas. 10 1.1.1.2. Genes implicados en la toxicidad. 11 1.1.1.2.1. El operon mcy. 11 1.1.1.3. Ntca, regulador global del metabolismo del nitrógeno. 12 1.1.1.4. La familia Fur (Ferric Uptake Regulator). 12 1.1.2. La calidad del agua. 12 1.1.3. Panorama actual en España. 13 1.1.4. Problemática de los contaminantes emergentes. 14 1.1.4.1. Lindano. 15 1.1.4.2. Fármacos en las aguas. 17 1.2. OBJETIVOS DEL PROYECTO 19 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Estirpe utilizada. 21 2.2. Condiciones de cultivo. 21 2.2.1. Cultivo de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de lindano 22 2.2.2. Cultivo de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de otros contaminantes emergentes: paracetamol, ibuprofeno, atenolol, voltarén y benceno. 23 2.3. Contaje de células. 23 2.4. Determinación del contenido de clorofila a. 23 2.5. Determinación de carotenoides. 23 2.6. Determinación de ficobiliproteínas. 23 2.7. Determinación de Especies Reactivas de Oxígeno. 24 2.8. Extracción de microcistina-LR de cultivos de M. aeruginosa PCC 7806. 24 2.8.1. Ensayo de inhibición enzimática de la proteín fosfatasa 2A. 25 2.9. Microscopio óptico. 25 2.10. Aislamiento de RNA total de M. aeruginosa PCC 7806. 25 2.10.1. Precauciones. 25 2.10.2. Toma de muestra. 26 2.10.3. Extracción de RNA total de M. aeruginosa PCC 7806. 26 2.11. Electroforesis no desnaturalizante del RNA. 27 2.12. Determinación de la concentración de RNA. 27 2.13. Control negativo de la presencia de DNA. 28 2.14. Retrotranscripción del RNA a cDNA mediante transcriptasa inversa (RT-PCR). 28 2.15. Estudio de amplificación del fragmento del gen rrs y otros genes de interés. 28 2.16. Normalización de las muestras de cDNA de diferentes condiciones de cultivo. 29 2.17. Semicuantificación de los fragmentos de los genes: mcyD, mcyH, mcyJ, ntcA, furA, furB, furC y αfurA. 29 3. RESULTADOS 3.1. Estudio del efecto del lindano en M. aeruginosa PCC 7806. 31 6 3.1.1. Curva de tolerancia a lindano. 31 3.2. Estudio del efecto de 10 mg/l de lindano en presencia de etanol. 31 3.2.1. Curva de crecimiento. 32 3.2.1.1. Medida de la absorbancia a 700 nm. 32 3.2.1.2. Medida de la cantidad de clorofila a. 32 3.2.1.3. Recuento de número de células. 33 3.2.2. Cambios morfológicos visualizables al microscopio óptico 33 3.2.3. RT-PCR. Puesta a punto y estudio de la fase exponencial de amplificación 34 3.2.3.1. RT-PCR: Estandarización 34 3.2.3.1.1. Determinación de la fase exponencial de la amplificación del housekeeping 35 3.2.3.2. Expresión de genes del operon mcy 35 3.2.3.2.1. Estudio de mcyD como respuesta a lindano 35 3.2.3.2.1.1. Fase exponencial de amplificación del gen mcyD 35 3.2.3.2.1.2. Expresión de mcyD como respuesta a lindano 36 3.2.3.2.2. Expresión de mcyH como respuesta a lindano 36 3.2.3.2.3. Expresión de mcyJ como respuesta a lindano 37 3.2.3.3. Expresión de genes de reguladores transcripcionales del operon mcy 37 3.2.3.3.1. Expresión de ntcA como respuesta a lindano 37 3.2.3.3.2. Expresión de fur como respuesta a lindano 38 3.2.4. Cuantificación de los niveles de microcistina 39 3.3. Efecto del lindano en solución acuosa 40 3.3.1. Efecto del lindano sobre parámetros fisiológicos 41 3.3.1.1. Efecto sobre los carotenoides 41 3.3.1.2. Efecto sobre las ficobiliproteínas 42 3.3.1.3. Producción de radicales libres de oxígeno 42 3.3.2. Efecto del lindano sobre la expresión de algunos genes del operon mcy 43 3.3.2.1. Expresión de mcyD como respuesta a lindano 43 3.3.2.2. Expresión de mcyH como respuesta a lindano 43 3.3.2.3. Expresión de mcyJ como respuesta a lindano 44 3.3.2.4. Expresión de ntcA como respuesta a de lindano 44 3.3.3. Cuantificación de los niveles de microcistina 44 3.4. Efecto de otros contaminantes emergentes sobre los niveles de microcistina en M. aeruginosa PCC 7806 45 3.4.1. Efecto del benceno 46 3.4.1.1. Medida de la cantidad de clorofila a 46 3.4.1.2. Medida de la cantidad de microcistina 46 3.4.2. Efecto de distintos fármacos 47 3.4.2.1. Paracetamol 47 3.4.2.1.1. Medida de la cantidad de clorofila a 47 3.4.2.1.2. Medida de la cantidad de microcistina 47 3.4.2.2. Ibuprofeno, Atenolol y Voltarén 48 3.4.2.2.1. Medida de la cantidad de clorofila a 48 3.4.2.2.2. Medida de la cantidad de microcistina 48 4. DISCUSIÓN 51 5. CONCLUSIONES 55 6. BIBLIOGRAFÍA 57 7 ABREVIATURAS aa Aminoácido ABC ATP binding cassette Abs Absorbancia ATP Trifosfato de adenosina cm Centímetro CO2 Dióxido de carbono Da Dalton DEPC Dietilpirocarbonato DNA Ácido desoxirribonucleótido DNasaI Desoxirribonucleasa I dNTPs Mezcla de los cuatro desoxirribonucleótidos D.O Densidad óptica DTT 1,4-ditiotreitol EDTA Ácido etilendiaminotetraacético g Gramo h Hora IgG Inmunoglobulina clase G kb Kilobase kDa Kilodalton l Litro m Metro M Concentración molar mA Miliamperios MC Microcistina mg Miligramos min Minuto ml Mililitro mM Milimolar mRNA RNA mensajero ng Nanogramo nm Nanómetro NRPS Non-Ribosomal Peptide Synthetase (Péptido sintetasas no ribosomal) O2 Oxígeno °C Grado centígrado pb Pares de bases PCC Colección de Cultivos del Instituto Pasteur PCR Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa) PKS Polyketide synthase (Policétido sintasa) PM/MW Peso molecular / Molecular weight PP1 Protein-fosfatasa 1 PP2A Protein-fosfatasa 2A RNA Ácido ribonucleico RNasa Ribonucleasa rpm Revoluciones por minuto rRNA RNA ribosómico RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction s Segundo Tris Tris-hidroximetil-aminoetano V Voltios v/v Relación volumen / volumen 8 α-mRNA RNA antisentido ε Coeficiente de extinción μg Microgramos μl Microlitros μM Micromolar 9 INTRODUCCIÓN 16 citarse, por ejemplo, el Parque Nacional de Doñana que presenta periódicos y recurrentes episodios de mortandad en masa de fauna salvaje desde 1973 [70]; [73]. La cianobacteria tóxica Microcystis aeruginosa es el principal problema del fitoplancton tóxico en el Parque, apareciendo en todo tipo de aguas (lucios, charcas, canales…). Al menos tres mortandades en masa producidas en los años 2001, 2004 y 2005 se debieron a una intoxicación alimentaria por microcistina producida por esta especie; M. aeruginosa es la especie de cianobacteria que con mayor frecuencia ha causado problemas tanto a la vida salvaje como en embalses de abastecimiento. Estas cianobacterias existen en Doñana durante todo el año y cuando las condiciones ambientales son favorables proliferan dando mortíferas natas verde-azuladas, este hecho unido a la creciente eutrofización del agua, indican que estas mortandades van a producirse de forma natural y recurrente. También el río Guadiana ha presentado, de forma recurrente, blooms de cianobacterias dominados, generalmente, por cepas potencialmente tóxicas [74]. En los últimos años es frecuente encontrar noticias en prensa dando cuenta de blooms tóxicos en diversas cuencas hidrográficas (Galicia, Gerona…). 1.1.4. Problemática de los contaminantes emergentes Las numerosas actividades humanas desarrolladas en las cuencas fluviales desde la Revolución Industrial, además de reducir la cantidad del caudal circulante de nuestros ríos, provocan la llegada de numerosos contaminantes: aporte de nutrientes que provienen de aguas residuales no tratadas, fertilizantes inorgánicos industriales o extractivos, abonos orgánicos y desechos industriales [75]. La disminución de los caudales circulantes y los efectos perniciosos de los contaminantes se ven además agravadas por el cambio climático, que altera el ciclo de las sequías y las crecidas. Esta combinación de factores físicos (temperatura, radiación ultravioleta, sequía, velocidad del agua) y químicos (pesticidas, metales pesados, residuos farmacéuticos) provocan severas alteraciones de la ecología de los ríos. Estos cambios afectan especialmente a los principales responsables de la calidad del agua de ríos y embalses: fitoplancton, biofilms y bacterias. Estos organismos se encargan de la auto-depuración del agua: degradación de agentes contaminantes y reciclado de nutrientes. Por lo tanto, cualquier impacto sobre estas comunidades biológicas, también va a suponer un incremento de costes de depuración del agua para consumo humano. Hasta el momento no se conoce con detalle cómo pueden influir las variables ambientales en la producción de toxinas. Sin embargo, la presión humana sobre los residuos hídricos combinada con el cambio climático, está provocando ya un incremento en la aparición de episodios tóxicos. Durante décadas, la comunidad científica ha centrado sus esfuerzos en el estudio de los contaminantes químicos, cuya presencia en el medio ambiente ha estado regulada en las distintas legislaciones, contaminantes en su mayoría apolares, tóxicos, persistentes y bioacumulables, como los hidrocarburos aromáticos policíclicos, los policlorobifenilos o las dioxinas. El desarrollo de nuevos y más sensibles métodos de análisis ha permitido alertar de la presencia de otros contaminantes, potencialmente peligrosos, denominados globalmente como emergentes. Los contaminantes emergentes son compuestos de distinto origen y naturaleza química cuya presencia en el medio ambiente, o las posibles consecuencias de la misma, han pasado en gran parte inadvertidas, razón por la cual no se dispone de reglamentación de métodos de análisis y no han sido regulados. Son compuestos de los que se sabe relativamente poco o nada acerca de su impacto en los distintos compartimentos ambientales y en el hombre y que, por tanto, precisan investigación. Su estudio se encuentra entre las líneas de investigación prioritarias de los principales departamentos dedicados a la protección de la salud pública y medioambiental, como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Agencia para la Protección del Medio Ambiente (EPA) o la Comisión Europea. La lista de contaminantes emergentes incluye una amplia variedad de productos de uso diario con aplicaciones tanto industriales como domésticas. Algunos de ellos, a raíz de las intensas investigaciones llevadas a cabo en los últimos años, han sido incluidos en la lista de sustancias prioritarias en el agua, como los retardantes de llama. Otros, como los pesticidas, ya estaban sujetos a legislación, pero el descubrimiento de productos de 17 degradación tóxicos, ha renovado el interés por los mismos. En el caso de los fármacos, la toma de conciencia del riesgo es relativamente reciente, y no se tienen aún datos suficientes para una valoración apropiada de su impacto. Muchos de estos contaminantes son disruptores endocrinos, lo que implica que una exposición a los mismos puede dar lugar a alteraciones en el crecimiento, desarrollo, reproducción y comportamiento de los organismos vivos [76]. 1.1.4.1. Lindano La práctica de la agricultura ha ido siempre unida a la utilización de productos químicos destinados a favorecer el crecimiento y producción de las distintas especies vegetales, así como su protección frente a plagas y otros agentes que puedan llegar a arruinar las cosechas. A finales de los 50, después de la segunda Guerra Mundial, se comienzan a utilizar masivamente los productos organoclorados como pesticidas, no sólo en la agricultura, sino también como agentes de control de parásitos del hombre y de animales. La persistencia en el medio ambiente es beneficiosa para el agricultor, pero resulta perjudicial para el medio ambiente ya que aumenta la exposición de los organismos a esas sustancias tóxicas. Algunos compuestos organoclorados no son biodegradables, por lo que pueden reciclarse a lo largo de la cadena alimenticia, produciéndose un aumento de la concentración química al final de ésta. Uno de los compuestos más utilizados fue el lindano. Químicamente es uno de los cinco isómeros del hexaclorociclohexano (HCH), concretamente el isómero gamma. Estos isómeros se diferencian en cómo se encuentran unidos los átomos de cloro a los carbonos de la molécula de ciclohexano [77]. Teóricamente, son posibles ocho isómeros: Figura 3. Fórmula química del isómero γ del hexaclorociclohexano. Sin embargo, las consideraciones de tensión posibilitan únicamente cinco de ellos, que se denominan: α, β, δ, γ y ε. El lindano se sintetizó por primera vez en 1825 mediante la cloración del benceno en presencia de luz ultravioleta [78]; [79]. Sus propiedades insecticidas se descubrieron en Europa en 1941, sin embargo, en 1944 se encontró que sólo el isómero γ es responsable de estas propiedades [80]. El lindano ha sido utilizado en agricultura, veterinaria, e incluso en el ámbito de la salud humana porque es un insecticida de amplio espectro (sirve igualmente para matar a insectos fitófagos como para los parásitos de los animales). Hoy día su toxicidad ha sido comprobada, y está siendo prohibido en varios países. La primera evidencia de que el lindano podía causar toxicidad y muerte en humanos se remonta a 1953 [81]. Pero las consecuencias de la fabricación de lindano no han desaparecido. El peligro del lindano procede de que, como todos los organoclorados, además de ser tóxico tiene la capacidad de ser almacenado en los seres vivos (bioacumulación). Es dañino para la salud humana y para el ambiente. El HCH se asimila ingiriéndolo, respirándolo o por contacto y sus efectos tóxicos dependen de la cantidad de isómeros que lo formen y principalmente de la cantidad de isómero gamma que contenga. Si se toma en grandes cantidades, el HCH provoca dolores de cabeza, cansancio, debilidad, malestar, insomnio, diarreas, vómito y fiebre, e incluso la muerte, si se tomara en 18 muy grandes cantidades. A pequeñas dosis, pero en exposiciones largas (toxicidad crónica) causa problemas hepáticos, renales, hormonales, ginecológicos, sanguíneos (anemias). Se ha visto que causa alteraciones endocrinas y daños en el sistema nervioso central, donde interfiere con la función del neurotransmisor ácido γ-aminobutírico (GABA) por interacción con su receptor [82]; [83]; [84]. Por otro lado, se ha encontrado que en alguna especie animal resulta cancerígeno, y se podría pensar que también lo puede ser para el hombre, aunque esto no está demostrado todavía. La OMS recomienda tratar el HCH y sus isómeros como si fuesen cancerígenos [85]; [86]. Desde el punto de vista ambiental, al ser un compuesto apolar, el HCH es lipofílico y puede infiltrarse en la materia blanca, rica en lípidos, del cerebro [87]. Además se biodegrada lentamente y es muy estable en condiciones ambientales normales. Por lo tanto, el HCH se almacena fácilmente en los seres vivos y en el ambiente. El lindano sólido puede degradarse bajo condiciones aeróbicas; la vida media va desde los 88-1200 días. A pesar de todo esto, durante muchos años no se han tomado en serio los peligros que podía conllevar el uso del HCH y en muchos lugares, entre ellos el País Vasco y Aragón, ha sido vertido al medio ambiente sin ningún tipo de control. Hoy día nos damos cuenta de la necesidad de solucionar los problemas originados por estos vertidos, y de la dificultad de hacerlo ya que, todavía no existe un proceso viable para destruir con seguridad el lindano mezclado con tierra. Durante muchos años, dos empresas ubicadas en Euskadi han estado fabricando lindano: Bilbao Chemicals (Barakaldo 1947-1987) y Nexana (Erandio 1952-1982). En estos años han estado vertiendo los residuos de HCH sin ningún tipo de tratamiento ni medidas de seguridad. Hasta el año 1953 en el caso de Bilbao Chemicals y el 1974 en el caso de Nexana, todo el HCH (mezcla de varios isómeros) producido se vendía como insecticida. Sin embargo, a partir de estos años se comenzó a separar el isómero gamma (más efectivo) y se empezó a comercializar individualmente. La relación entre producto comercial y residuos es de 1:9, y en consecuencia, desde que se comenzó a separar el isómero gamma se empezó a almacenar numerosos residuos en pabellones, y comenzaron a verter dichos residuos sin ningún tipo de control. Esta es la causa de que se hayan vertido y mezclado con tierras unas 80.000 Tm, permaneciendo en estado puro en la fábrica de Barakaldo 4.500 Tm más al cierre de la empresa Bilbao Chemicals. Hoy día no se produce lindano en el País Vasco. Sin embargo, el problema no se ha solucionado con el cierre de Bilbao Chemicals y Nexana, ya que queda por determinar qué se va a hacer con los residuos esparcidos alrededor de las zonas de producción y con el HCH puro de Barakaldo. En la cuenca del río Gállego se construyeron aprovechamientos hidroeléctricos a comienzos del siglo XX, lo cual favoreció la instalación de numerosas industrias en el entorno de Sabiñánigo, muchas de las cuales se dedicaron a la fabricación de productos químicos (ácido sulfúrico, aluminio electrolítico, cloro, ácido clorhídrico, HCH, fósforos, etc). INQUINOSA, una empresa productora de lindano se estableció en Sabiñánigo en 1975. Los residuos de HCH (isómeros restantes, 83%) producidos en la fabricación del lindano (17%) fueron depositados durante años en varios puntos, entre ellos los vertederos de Sardas y Bailín. En 1987 comenzaron las primeras denuncias por las irregularidades en los vertidos y la contaminación del río Gállego, terminando con su cierre en 1989. En el vertedero de Sardas, en el cual se depositaron sin ningún tipo de medida de control (impermeabilización, captación de lixiviados, depuración de aguas, etc) todos los residuos industriales generados en la zona, junto con residuos urbanos y escombros de construcción. Este vertedero permaneció en explotación hasta 1987, aun cuando a partir de 1984 INQUINOSA comenzó a verter en el nuevo vertedero municipal de Bailín. Así pues, durante más de 30 años los residuos industriales de las empresas radicadas en Sabiñánigo se fueron depositando en estos dos vertederos. Ambos vertederos, Sardas y Bailín, están muy próximos al río Gállego, y en sus aguas se ha detectado puntualmente la presencia de isómeros de HCH. Las concentraciones encontradas motivaron que en diciembre de 1988, la Diputación General de Aragón (DGA) prohibiese el depósito de residuos tóxicos y peligrosos, procedentes de la fabricación de Lindano en los vertederos de la zona, y que la Confederación Hidrográfica del Ebro (CHE), prohibiese el vertido de aguas residuales procedentes de la 19 fabricación de Lindano. Durante el año 2005 se detectó residuo libre de HCH y otros organoclorados en los piezómetros de control situados aguas abajo del vertedero de Bailín y, en febrero de 2009, se comenzó a detectar residuo libre de HCH en la base del talud de la carretera que pasa junto al vertedero de Sardas. Figura 4. Noticias relacionadas con la empresa INQUINOSA publicadas en El Heraldo de Aragón en el mes de mayo de 2012. En particular, el problema de los suelos contaminados con HCH no parece tener una solución clara hoy día. Se ha decidido almacenar las tierras contaminadas en una Celda de Seguridad mientras se encuentre una tecnología adecuada. Esta medida servirá para eliminar los daños ambientales y de salud que podrían provocar estas tierras en el período de búsqueda del sistema a utilizar. 1.1.4.2. Fármacos en las aguas Los contaminantes emergentes que, probablemente, están suscitando una mayor preocupación y estudio en los últimos años son los fármacos. En los países de la Unión Europea se consumen toneladas por año, y muchos de ellos se emplean en cantidades similares a los pesticidas [88]. Una particularidad de estos compuestos es que debido a su elevada producción y consumo, y a la continua introducción de los mismos en el medio ambiente, no necesitan ser persistentes para ocasionar sus efectos negativos [76]. Las primeras evidencias de la presencia de fármacos en el medio acuático se produjeron en los años 70 al identificar ácido clofíbrico (metabolito activo de varios reguladores de lípidos en sangre) en aguas residuales de EEUU. Sin embargo, ha sido en la década de los 90 cuando el tema ha surgido con fuerza. En España, la publicación en la prensa de los resultados obtenidos por el equipo de investigación del Dr. Barceló (El Periódico, 26 Octubre 2005; El país, 17 Enero 2006; El Global, 30 Enero 2006) despertó un gran interés científico y social. Entre los fármacos más utilizados se encuentran los analgésicos/antinflamatorios como el ibuprofeno y el diclofenac, los antiepilépticos como la carbamacepina y los β-bloqueantes como el atenolol. Según las propiedades físico-químicas de los fármacos, sus metabolitos y productos de degradación, así como las características de los suelos, estas sustancias pueden llegar a alcanzar las aguas subterráneas y contaminar los acuíferos o quedar retenidas en el suelo y acumularse pudiendo afectar al ecosistema y a los humanos, a través de la cadena trófica [89]. Estos compuestos se han encontrado en concentraciones de ng/ml o µg/ml en aguas superficiales y subterráneas, como consecuencia de una eliminación incompleta en las plantas de depuración de aguas o debido a la escasa atenuación que experimentan algunos compuestos durante la filtración a través de suelos. En suelos y sedimentos, estos compuestos pueden persistir durante años, llegando a alcanzar concentraciones de hasta g/Kg [89]; [90]. En muchos casos, las consecuencias de su presencia en el medio ambiente no están claras, pero en otros, el riesgo es evidente y alarmante [91]. El equipo de investigación del Dr. Barceló ha 20 detectado en múltiples ocasiones en España la presencia de propanolol, un β-bloqueante, que se ha visto tiene efectos sobre el zooplancton y los organismos bentónicos [89]; [92]. Lo más probable es que en un futuro próximo la Unión Europea fije límites máximos que regulen la presencia de estos compuestos en el agua potable. El río Ebro ha sido objeto de estudio en los últimos años en el marco del proyecto europeo AQUATERRA (Integrated modeling of the river-sediment-soil-groundwater system). Entre los contaminantes más relevantes en esta cuenca se encuentras los fármacos, que no son completamente eliminados por las EDARs, y los plaguicidas procedentes de las actividades agrícolas. Estimaciones realizadas dentro del marco del proyecto AQUATERRA indican que se vierten al río, tras su paso por las Estaciones depuradoras de aguas residuales (EDARs), unas tres toneladas de fármacos al año, entre los que destacan: el acetaminofén (paracetamol), el ibuprofeno (antinflamatorio) o el atenolol (βbloqueante). Si además de los fármacos, tenemos en cuenta los diferentes plaguicidas, la carga anual del río Ebro puede llegar fácilmente a las 7-8 toneladas de contaminantes anuales [93]. 21 OBJETIVO Estudiar el efecto del lindano sobre la síntesis de la cianotoxina microcistina en Microcystis aeruginosa PCC 7806. Para ello, se plantearon los siguientes objetivos parciales: 1) Estudiar el crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de lindano y describir su tolerancia. 2) Estudiar los cambios inducidos por el lindano en los niveles de RNA mensajero de genes marcadores del open responsable de la síntesis de microcistina: mcy. 3) Estudiar los cambios inducidos por el lindano en los niveles de RNA mensajero de genes reguladores del operon mcy. 4) Valorar la cantidad de microcistina producida en cada caso. Además, se ha llevado a cabo la cuantificación de la microcistina de cultivos en presencia de algunos contaminantes emergentes como: paracetamol, ibuprofeno, atenolol, voltarén y benceno. 22 23 MATERIALES Y MÉTODOS 24 25 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Estirpe utilizada. Para llevar a cabo este trabajo, se ha empleado la cepa de cianobacteria Microcystis aeruginosa PCC 7806, organismo unicelular con alta capacidad productora de microcistina. Esta cepa tóxica procede de la colección de cultivos del Instituto Pasteur de París (www.pasteur.fr). 2.2. Condiciones de cultivo. Para el cultivo en medio líquido, se prepararon tres soluciones siguiendo las indicaciones del Instituto Pasteur (Medio 553). En la tabla 1, se detallan el modo de almacenamiento adecuado y la fecha de caducidad de las mismas. Solución 1 Solución 3 Componentes: Componentes: Citrato férrico amónico 30 mg H3BO3 2,86 g Ac Cítrico monohidratado 30 mg MnCl2·4H2O 1,81 g ZnSO4·7H2O 222 mg Volumen final: 25 ml en H2O Na2MoO4·2H2O 390 mg CuSO45H2O 79 mg Plazo de caducidad 10 días a t.a. en oscuridad Co(NO3)2 6 H2O 49 mg Solución 2 Volumen final: 1 L en H2O Componentes: Mg·2H2O tritriplex 100 mg Plazo de caducidad: 6 meses a 4oC Volumen final: 500 ml en H2O Plazo de caducidad 3 meses a 4oC Tabla 1. Composición de las tres soluciones previas para la preparación del medio de cultivo. Para cada litro de medio de cultivo se utilizaron los siguientes reactivos y disoluciones: (Tabla 2) Tabla 2. Composición del medio de cultivo. MEDIO 538 COMPONENTE MgSO4·7H2O 75 mg CaCl2·2H2O 36 mg Na2CO3 40 mg NaNO3 150 mg Solución 2 5 ml Solución 3 1 ml Volumen final 1 L 32 2.13. Control negativo de la presencia de DNA El estudio de la expresión génica se puede abordar con diferentes técnicas como: “Northern- Blot”, ensayo de protección de la RNAsa (“RNAse protection assay”/RPAs) y retrotranscripción del RNA a cDNA y posterior amplificación y cuantificación (RT-PCR). En este trabajo se seleccionó la RT-PCR semicuantitativa para llevar a cabo el estudio de los cambios en la expresión génica a nivel transcripcional de ciertos genes de M. aeruginosa PCC7806. Mediante la retrotranscripción del RNA a cDNA y la aplicación posterior de la amplificación en cadena de la polimerasa, se obtiene información sobre la presencia, desde un punto de vista semicuantitativo, de un determinado transcrito en la muestra de RNA total. Es esencial tener un control que asegure la ausencia de DNA en la muestra, ya que los geles de agarosa no tienen la resolución suficiente para asegurar que la muestra está totalmente libre de DNA. Para ello, se lleva a cabo una reacción de PCR con los oligos del gen rrs de todas las muestras de RNA extraído, un control negativo (con agua DEPC) y un control positivo (con el DNA genómico de M. aeruginosa PCC 7806). Las condiciones de la reacción se encuentran descritas en el siguiente apartado. 2.14. Retrotranscripción del RNA a cDNA mediante transcriptasa inversa (RT-PCR) Una vez confirmado que se dispone de RNA íntegro y libre de DNA, se obtienen los retrotranscritos de todos los mensajeros a cDNA. Para tener una representación completa de los transcritos de cada muestra se utilizaron “random primers” (oligonucleótidos en su mayoría hexámeros que hibridan al azar) de Invitrogen. I) Se preparó una mezcla inicial con 1μg de RNA total y 150 ng de “random primers”, diluido en el tampón de hibridación 1x (Tris-HCl 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM, KCl 150 mM, en stock 10x) en agua DEPC hasta un volumen final de 10 µl. La mezcla se sometió al siguiente programa de PCR: 10 minutos a 85°C para desnaturalizar el RNA y 1 h a 50°C para que tenga lugar la hibridación de los “random primers”. II) Pasado este tiempo se añadió a cada muestra: 1 μl de agua DEPC, 2 μl de una mezcla de los cuatro desoxirribonucleótidos (2.5 mM), 2 μl de DTT a 0.1 M y 4 μl de tampón 5x suministrado por la casa comercial. A continuación se añadió 1 μl con 200 U de la enzima retrotranscriptasa SuperScriptTM de GibcoBRL. La mezcla se sometió al siguiente programa del termociclador: 1 h de incubación a 47ºC para que tenga lugar la extensión de los cebadores y, posteriormente, un calentamiento de las muestras a 75ºC durante 15 min para detener la reacción. El cDNA obtenido se guarda a 4°C durante 24 h y, pasado este tiempo, se conservan congeladas a -80°C. 2.15. Estudio de la amplificación del fragmento del gen rrs y otros genes de interés Mediante la RT-PCR semicuantitativa se cuantifica la expresión de un retrotranscrito de un gen diana en diferentes condiciones, comparandolo con una muestra control. Se puede utilizar tanto para verificar cambios en la transcripción debido a diferentes condiciones de cultivo, como también cambios producidos por alguna mutación o sobreexpresión de determinados genes. Se utiliza un control interno para eliminar errores en la cantidad inicial de cDNA de cada muestra. Este control interno debe ser un gen constitutivo (housekeeping) que no presente cambios significativos de expresión en las condiciones propuestas. 33 Esta normalización de las muestras se hace con el gen de referencia durante la fase exponencial o logarítmica de amplificación, de modo que, todas las muestras presenten una misma cantidad en ng de cDNA que son ajustadas a distintos volúmenes de muestra. Pequeñas diferencias en la concentración inicial de cDNA generan efectos significativos que pueden revelar falsos resultados de cambios transcripcionales [101]. Para la determinación de la fase exponencial de amplificación, tanto del fragmento de 382pb del gen housekeeping rrs como de la secuencia de 282 pb presente en el gen mcyD, se utilizaron muestras de cDNA total obtenidas de células de Microcystis aeruginosa PCC 7806 cultivadas en condiciones estándar. Se realiza una mezcla que contenga: 1µl de muestra de cDNA total, con 0,4 mM dNTPs, 50nM de oligonucleótido, 3 mM MgCl2, 1x Buffer de reacción y 2,5 unidades Taq DNA polimerasa recombinante (ambos de la casa comercial Biotools) y agua MillQ para enrasar a 25 µL de volumen final. Se lleva a cabo una PCR utilizando el siguiente programa de amplificación (el mismo que se utilizó para analizar la presencia de DNA contaminante): 5 min a 95°C, 35 ciclos (para el gen mcyD) o 25 ciclos (para el gen rrs) de 3 etapas: desnaturalización 45 s a 95°C, hibridación de 45 s a 45°C (para el gen mcyD) o 47°C (para el gen rrs) y extensión 1min 30 s a 72°C. En esta etapa se recogieron muestras en los ciclos 20, 25, 28, 31 y 34 (para el gen mcyD) o 15, 17, 19, 22 y 25 (para el gen RRS). Para finalizar, se incubaron 7 min a 72°C y se pasaron a 4°C para mantenerlas hasta que se retiraban las muestras. 2.16. Normalización de las muestras de cDNA de diferentes condiciones de cultivo Una vez determinada la fase exponencial, se llevaron a cabo reacciones de PCR en las mismas condiciones que las anteriores utilizando los cebadores del fragmento del gen RRS (Tabla 3) y comenzando con 1 µg de cDNA por muestra, hasta conseguir igualar cuantitativamente la cantidad de DNA amplificado en todas las muestras. Para la normalización del gen de referencia se hicieron 17 ciclos de PCR utilizando las mismas condiciones descritas en el apartado anterior (1.18). Los volúmenes para los que el producto de amplificación daba resultados homogéneos variaron en un rango de 0,8 a 1,2 µL de las muestras de retrotranscripción. 2.17. Semicuantificación de los fragmentos de los genes: mcyD, mcyH, mcyJ, ntcA, furA, α-furA furB y furC Tras tener todas las muestras normalizadas por el gen constitutivo, se cuantifica la expresión del gen diana en la fase exponencial de amplificación utilizando un programa del termociclador de 33 ciclos con los volúmenes ajustados de cada muestra [102], de esta forma, el resultado de la amplificación será representativo de los cambios en la transcripción ocasionados por los estreses a los que las células han sido sometidas. La temperatura de hibridación de la reacción variaba según los oligos utilizados. 34 Tabla 4. Cebadores utilizados en el estudio de PCR semicuantitativa. Cebadores Secuencia 5’3’ Longitud cebador Tm utilizada (°C) rrs dir caa gtc gaa cgg gaa tct tc 20 47 rrs rev ctc aag tac cgt cag aac ttc 21 mcyD dir gag cat taa ggg cta aat cg 20 45 mcyD rev ctt ggt tgc ttc atc aac tc 20 mcyJ dir gcc gaa gaa aca act tat aac g 22 48 mcyJ rev cta tag cca agc ttc cac cgg g 22 RT-mcyH up ggt atg aat gca gca g 16 45 RT-mcyH dw cgc ctg gtt cga tag g 16 ntcA up gga att cca tat gga ctt atc att aat aca aga taa ac 38 54 ntcA dw ccc aag ctt tta agt aaa ttg ttg act gag ag 32 Mfur-N gtc gat cgc cca tgg ctg cct ac 23 50 Mfur-C cag ttg gga att ccc gct tag atg 24 furDir cga cga ttt acc gca gtg 18 43 furSC cac act gtt tga gac tgt g 19 furB Myc1 dir caa tct atg ggw yta gct acy gt 23 60 furB Myc1 rev1 ccg cai arw cca aaa aat tci ari gta tg 29 furC Myc dir cat yti tct gct m gig aaa ttt atg atc c 29 60 furC Myc rev cat gig aat gig aat cig aaa tak twcc 28 35 RESULTADOS 36 37 3. RESULTADOS 3.1. Estudio del efecto del lindano en M. aeruginosa PCC 7806 Este trabajo tiene por objetivo determinar el efecto ocasionado por el lindano sobre la producción de microcistina usando como modelo experimental M. aeruginosa PCC 7806. Se analizó su influencia a nivel de expresión génica y a nivel de producción de toxina. El lindano es un compuesto hidrófobo, por lo que para determinar el efecto de este pesticida se utilizó etanol como solvente, tal como estaba descrito en la literatura. Dado el efecto del solvente, que enmascaraba el efecto del lindano en sí, se llevó a cabo otra serie de experimentos en condiciones de saturación en agua, ya que resulta más fisiológico y responde a la situación real del compuesto en el medio ambiente. 3.1.1. Curva de tolerancia a lindano Se analizó el crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 a distintas concentraciones de lindano con el objetivo de determinar la concentración más adecuada para el estudio. El seguimiento del crecimiento se realizó mediante la cuantificación del contenido de clorofila a de los cultivos, tal y como se explica en el apartado (2.3.) de materiales y métodos. Se llevaron a cabo estudios preliminares durante 10 días en los que se observó una gran volatilidad del lindano que no permitía alargar el experimento en el tiempo más allá de 24 horas (datos no mostrados). Se tomaron medidas a tiempo 0, 2, 8 y 24 horas. Figura 6. Crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de distintas concentraciones de lindano con respecto al tiempo. En el eje y se representa la cantidad de clorofila que contiene cada cultivo en µg/l y en el eje x, el tiempo en horas de la toma de muestra. En la imagen se observa una afección inmediatamente después de añadir el lindano. La evolución con el tiempo muestra que las concentraciones de lindano más bajas favorecen el crecimiento en un primer momento; es a partir de los 10 mg/l cuando M. aeruginosa PCC 7806 ve comprometido su crecimiento. Se observa también que el etanol, aun en muy bajas concentraciones, afecta al crecimiento. 3.2. Estudio del efecto de 10 mg/l de lindano en presencia de etanol A la vista de los resultados anteriores se eligió 10 mg/l como concentración más adecuada para llevar a cabo el estudio del efecto del lindano sobre la síntesis de la toxina. Se realizó un seguimiento más detallado del crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de la concentración de 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2 4,4 4,6 4,8 05' 2 8,3 24 Clorofila a (µg/ml) Tiempo (horas) Control Control + EtOH (400 µl/l) 1 mg/l 5 mg/l 10 mg/l 38 pesticida seleccionada. Para ello, se midió la absorbancia a 700 nm, la cantidad de clorofila a y el número de células por mililitro. 3.2.1. Curva de crecimiento en presencia de lindano 3.2.1.1. Medida de la absorbancia a 700 nm En primer lugar, se midió la absorbancia de los cultivos a una longitud de onda de 700 nm en distintos tiempos. El resultado fue el siguiente: (Figura 7) Figura 7. Medida de la absorbancia a 700 nm, representativa de la densidad óptica del cultivo con respecto al tiempo 0, 7 y 24 horas. Se observa un aumento de la absorbancia del cultivo control con el tiempo, mientras que el cultivo tratado con lindano disminuye, alcanzando un mínimo a las 24 h. El control con el solvente ralentiza su crecimiento en un primer momento, pero se recupera posteriormente. 3.2.1.2. Medida de la cantidad de clorofila a A continuación, se midió la clorofila a a tiempos: 0, 2, 7 y 24 horas, tanto de la muestra control como del control con etanol y del cultivo tratado con lindano disuelto en etanol. Figura 8. Se representan los niveles de clorofila a en µg/ml con respecto al tiempo. Puede observarse el mismo descenso para el cultivo tratado con lindano que se veía en las medidas de absorbancia. De nuevo, el cultivo control al que se le ha añadido etanol sufre un primer descenso que se recupera a las 24 horas. Por tanto, los cultivos tratados con etanol y con lindano en etanol presentan un descenso en el crecimiento, que resulta más acentuado en el caso del lindano. 0,45 0,47 0,49 0,51 0,53 0,55 0,57 0,59 0,61 0,63 0,65 05' 724 Absorbancia (700 nm) Tiempo (horas) Control Control + EtOH (200 µl/l) 10 mg/l (+200 µl EtOH) 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 05' 2 7 24 Clorofila a (µg/ml) Tiempo (horas) Control Control + EtOH (200 µl) 10 mg/l (+200 µL/l EtOH) 39 10µm 10µm Control Lindano 3.2.1.3. Recuento de número de células Para completar los resultados obtenidos mediante la medida de la absorbancia y la clorofila a, se llevó a cabo el recuento celular de los tres cultivos a los diferentes tiempos utilizando la cámara de Neubauer. El resultado se muestra en la figura (9): Figura 9. En la gráfica se muestra el número de células por mililitro de M. aeruginosa PCC 7806 en cada uno de los cultivos en función del tiempo. Igual que para las medidas de clorofila a, se observa un descenso del crecimiento en el cultivo al que se le ha añadido el solvente y en el cultivo con lindano, más notable en el que ha sido tratado con el pesticida. Por tanto, los resultados de las tres mediciones realizadas para el seguimiento del crecimiento son coherentes entre sí. La absorbancia está muy influenciada por la turbidez de la disolución, lo que dificulta el uso de este método para el seguimiento. 3.2.2. Cambios morfológicos visualizables al microscopio óptico Con el fin de visualizar el efecto que estaba causando el tratamiento en la morfología de las células, se observaron al microscopio óptico los cultivos: control y a las 4 horas del tratamiento con lindano en etanol. Se utilizó el objetivo 100x y aceite de inmersión, con un total de 1000 aumentos. Se obtuvieron las siguientes fotografías (figura 10): Figura 10. Se muestran las imágenes obtenidas al microscopio óptico del cultivo control y del cultivo tratado con lindano en etanol a las 4h de su adición. Las células que han sido tratadas con lindano presentan un mayor tamaño; mientras las células sin tratar medían unos 3-4 µm de diámetro, las tratadas con el pesticida exhibían un diámetro de 5-6 µm aproximadamente. Congruentemente con los cambios cuantificados de clorofila a, las células 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 0 5 2 7 24 Nº Células por ml · 107 Tiempo (horas) Control Control + EtOH (200 µl/l) 10 mg/l (+200 µL EtOH) 40 1 2 3 4 5 6 7 2000 1600 1000 850 650 500 400 300 28 S 18 S mRNA 1 2 3 4 5 6 7 A) B) tratadas con lindano presentaban un color verde más pálido que las células control. En la imagen puede verse como las células tratadas han perdido la estructuración interna, se han modificado los tilacoides y las vesículas de gas que se observan en las células no tratadas, aunque mantuvieron su viabilidad a esta concentración. Las muestras fueron enviadas también a un colaborador que realiza microscopía electrónica y estamos pendientes de los resultados. En el caso del cultivo con etanol, los resultados fueron análogos al control (fotografía no mostrada). 3.2.3. RT-PCR. Puesta a punto y estudio de la fase exponencial de amplificación El análisis de la expresión de un gen específico es una herramienta muy útil para entender los diferentes mecanismos celulares que se desencadenan en diferentes condiciones [102]. Las muestras con el RNA total de los distintos tiempos fueron cuantificadas mediante el equipo de nanoVue de modo que 1µg de RNA total de cada muestra fue retrotranscrito a cDNA. Para obtener todos los retrotranscritos de todos los mensajeros a cDNA, el RNA debe estar en óptimas condiciones, lo que se confirmó con el análisis en un gel de agarosa del 1%. Además, para que la prueba sea representativa, el RNA debe carecer de DNA genómico contaminante, ya que falsearía los resultados al realizar la reacción de PCR. Los resultados de estos controles se muestran en la figura 11. Figura 11. A) Análisis de la integridad del RNA obtenido en gel de agarosa del 1%. En el carril 1 se encuentra el marcador de pesos moleculares de 1Kb (Plus DNA Ladder), en el resto de los carriles están las muestras de RNA obtenidas tras la extracción. B) Control negativo de la presencia de DNA contaminante. El gel muestra el resultado de la amplificación del RNA obtenido. El carril 1 son los marcadores de pesos moleculares. El control positivo está situado en el carril 2, los carriles 3-7 muestran el producto de amplificación del fragmento del gen mcyD. El RNA de las muestras extraídas presenta buen aspecto. Pueden distinguirse las bandas más significativas, lo que denota una buena integridad. En cuanto al control negativo de la presencia de DNA: el control positivo (DNA genómico de M. aeruginosa PCC 7806) sí que muestra banda de amplificación, mientras que el control negativo (agua DEPC) no muestra banda, ni los fragmentos digeridos del DNA que aparecen en las muestras. La ausencia de bandas en las muestras implica un RNA libre de DNA genómico contaminante. Las sombras que aparecen a pesos moleculares inferiores corresponde a los fragmentos de DNA genómicos digeridos por la DNAsa I. Por tanto, el producto de esta amplificación no reflejó ninguna traza de DNA contaminando las muestras. 3.2.3.1. RT-PCR: Estandarización En los estudios transcripcionales es imprescindible elegir un gen de referencia (“housekeeping”) cuya expresión no varíe en las condiciones de estrés estudiadas. La elección de un gen de expresión constitutiva no resulta una tarea fácil, incluso en el caso de eucariotas, donde se han estudiado y caracterizado ampliamente estos genes [103]. Estudios previos realizados en nuestro 41 grupo de investigación, determinaron el gen rrs (16S rRNA: AF139299) como housekeeping idóneo por presentar pocos cambios de expresión ante diferentes condiciones. 3.2.3.1.1. Determinación de la fase exponencial de la amplificación del housekeeping Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa utilizando 1 µg de cDNA y los cebadores que amplifican el gen de referencia, a distinto número de ciclos: 15, 17, 19, 22 y 25. Figura 12. Estudio de la fase de amplificación del gen housekeeping. Para ello se realizan ciclos crecientes de la reacción en cadena de la polimerasa (15, 17, 19, 22 y 25). El ciclo elegido como ciclo de fase logarítmica de la amplificación fue el 17, ya que a partir de éste se observaba una saturación de la amplificación de la muestra. 3.2.3.2. Expresión de genes del operon mcy La normalización de todas las muestras de cDNA con el gen de referencia durante la fase logarítmica de la amplificación, evita las diferencias en la concentración inicial de cDNA que generan efectos significativos que pueden generar falsos resultados de cambios transcripcionales [104]. Tras tener todas las muestras normalizadas, de forma que presentan una misma concentración (que es ajustada a distintos volúmenes), se cuantifica la expresión de los genes diana en la fase exponencial de amplificación [102]. 3.2.3.2.1. Estudio del gen mcyD como respuesta a lindano En primer lugar, se estudia el gen mcyD del operon mcy. Este gen codifica para una policétido sintasa y fue seleccionado por ser uno de los miembros del operon mcy cuya expresión es indispensable para la síntesis de microcistina ya que es el primero en transcribirse, junto con mcy A, por flanquear ambos al promotor bidireccional. Además, es el responsable de la incorporación del grupo Adda, responsable de la toxicidad de la molécula [27]; [26]. Es un gen considerado como marcador [105], [37], [106]. 3.2.3.2.1.1. Fase exponencial de amplificación del gen mcyD Se debe hacer un estudio individual de la fase exponencial, tanto para el gen “housekeeping” como para el gen diana, y determinar el ciclo en que se encuentra la fase logarítmica de la amplificación para evitar posibles errores por saturación de la amplificación. Figura 13. En la figura se observa el producto de la PCR en diferente número de ciclo de amplificación, indicado en la imagen (20, 25, 28, 31 y 34 ciclos,) para la secuencia del gen mcyD. Nº de ciclos M – 15 17 19 22 25 Nº de ciclos M + - 20 25 28 31 34 48 3.3.1.2. Efecto sobre las ficobiliproteínas Las ficobiliproteínas se encuentran en el espacio intertilacoidal formando complejos multimoleculares muy eficientes para captar la energía solar y transmitirla al centro de reacción del fotosistema II [107]; [108]. También se consideran una importante fuente de nitrógeno, que las cianobacterias utilizan cuando hay déficit de este nutriente [109]. El resultado del estudio se muestra en la figura 24, y muestra que al cabo de 24 horas se produce un acusado descenso de estas proteínas. Figura 24. Contenido en ficobiliproteínas en µg de las muestras tomadas a los distintos tiempos referidas a mg de peso húmedo para el cultivo control y el cultivo tratado con lindano. Se observa un descenso en el contenido de ficobiliproteínas a las 24 horas con respecto al cultivo control. El hecho de que las células tratadas con lindano no se vean afectadas a tiempos cortos, y sí al cabo de 24 horas, podría indicar que las ficobiliproteínas han sido utilizadas como fuente de nitrógeno. 3.3.1.3. Producción de radicales libres de oxígeno Los radicales libres de oxígeno se forman abundantemente en los procesos de respiración y fotosíntesis, además, el lindano puede producir radicales libres de oxígeno. Se consideró interesante estudiar la presencia de radicales libres de oxígeno en ambos tipos de células, tratadas y control, para poder relacionar los efectos con la disminución de carotenoides observada. Figura 25. Se representa µmoles de H2O2 producidos con respecto al tiempo. Se ve aumentada la producción en el cultivo tratado con lindano. 5 6 7 8 9 10 11 05' 2 7 24 µg/mg peso húmedo Tiempo (horas) Control 7 mg/l 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05 0 6 24 µmol H2O2/ mg peso húmedo Tiempo (horas) Control 7 mg/l 49 La producción de radicales libres de oxígeno estaba ligeramente aumentada en las condiciones de estrés por lindano con respecto al control, pero era menor que en la situación inicial. 3.3.2. Efecto del lindano sobre la expresión de algunos genes del operon mcy Con objeto de observar el efecto del lindano en sí mismo, se llevó a cabo el estudio de la expresión de genes mcy en las alícuotas de las muestras en saturación de lindano, 7 mg/l y sin lindano. 3.3.2.1. Expresión de mcyD como respuesta a la presencia de lindano Figura 26. En el panel A) se muestran los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para el gen mcyD en tres tiempos para los controles y en cuatro tiempos para las muestras tratadas con una concentración de lindano de 7 mg/l. En el panel B) se muestra la cuantificación, considerando la lectura a tiempo 0h como el 100 % de la señal y se normalizaron el resto de los resultados con respecto a la señal detectada. En ambos casos, puede verse un descenso de la expresión génica del gen mcyD con el tiempo. Sin embargo, las muestras tratadas con lindano no disminuyen en la misma medida que las muestras control, ya que el gen se encuentra más expresado a las 24 horas que en la muestra control. La cuantificación de las bandas mediante el equipo GelDoc permite apreciar con mayor claridad el aumento de expresión del gen mcyD al tratar el cultivo con lindano, en referencia al control sin lindano. 3.3.2.2. Expresión de mcyH como respuesta a lindano Figura 27. En el panel A) se muestran los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para el gen mcyH en tres tiempos para los controles y en cuatro tiempos para las muestras tratadas con una concentración de lindano de 7 mg/l. En el panel B) se muestra la cuantificación, considerando la lectura a tiempo 0h como el 100 % de la señal y se normalizaron el resto de los resultados con respecto a la señal detectada. Se observa un descenso de la expresión con el tiempo en los dos cultivos. La cuantificación de las bandas muestra niveles similares de expresión a las 24 horas para el cultivo control y las células tratadas con lindano. El comportamiento es similar para ambos cultivos, los niveles de expresión del transportador a las 24 horas son análogos. housekeeping 0 h 2 h 24 h 0 h 2 h 7 h 24 h mcyD rrs Control Lindano 7 mg/l mcyD A) B) A) mcyH Lindano 7 mg/l Control 0 h 2 h 24 h 0 h 2 h 7 h 24 h mcy H rrs mcyH mcyH B) 50 3.3.2.3. Expresión de mcyJ como respuesta a la presencia de lindano Figura 28. En el panel A) se muestran los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para el gen mcyJ en tres tiempos para los controles y en cuatro tiempos para las muestras tratadas con una concentración de lindano de 7 mg/l. En el panel B) se muestra la cuantificación, considerando la lectura a tiempo 0h como el 100 % de la señal y se normalizaron el resto de los resultados con respecto a la señal detectada. Se observa un descenso con el tiempo de la expresión del gen mcyJ en ambos casos. En la figura 28 se cuantifica la lectura de la densidad óptica del gel, que proporciona resultados similares para el cultivo control y las células tratadas con el pesticida. 3.3.2.3.1. Expresión de ntcA como respuesta a lindano En este caso, sólo analizamos la expresión del gen responsable de la síntesis del regulador global del nitrógeno, ya que no observamos que una concentración de lindano más elevada a la utilizada en este momento estuviera afectando a Fur significativamente. Figura 29. En el panel A) se muestran los productos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa para el gen regulador ntcA en tres tiempos para los controles y en cuatro tiempos para las muestras tratadas con una concentración de lindano de 7 mg/l. En el panel B) se muestra la cuantificación, considerando la lectura a tiempo 0h como el 100 % de la señal y se normalizaron el resto de los resultados con respecto a la señal detectada. Se observa un descenso en la expresión del gen con el tiempo. No se ve una afectación tan clara como en el experimento anterior, pero sí que parece que la expresión en las muestras tratadas con lindano es, en general, algo superior que en el control. La cuantificación muestra valores superiores para el cultivo con lindano. 3.3.3. Cuantificación de los niveles de microcistina Para completar el estudio, igual que en el experimento anterior, se determinó si el estrés estaba afectando también a la producción de la toxina. Para ello, se determinó la cantidad de housekeeping housekeeping 0 h 2 h 24 h 0 h 2 h 7 h 24 h Control Lindano 7 mg/l mcy rrs 0 h 2 h 7 h 24 h 0 h 2 h 24 h mcyJ mcyJ B) A) 0 h 2 h 24 h 0 h 2 h 7 h 24 h Control Lindano 7 mg/l ntcA rrs A) B) ntcA 51 microcistina-LR de los cultivos control y con lindano mediante el kit de inhibición de la enzima proteín fosfatasa 2A. El objetivo de este análisis era determinar si el aumento de expresión observado en la RT-PCR se traducía en un aumento en la cantidad de toxina sintetizada eliminando el efecto causado por el etanol. El resultado obtenido se observa en la figura 30: Figura 30. Medida del contenido de microcistina intracelular expresada en µg equivalentes de microcistina-LR por µg de clorofila a con respecto al tiempo en horas. Figura 31. Medida del contenido de microcistina extracelular expresada en µg equivalentes de microcistina-LR por µg de clorofila a con respecto al tiempo en horas. La cantidad de microcistina tanto intracelular como extracelular presenta niveles más altos para el cultivo tratado con lindano que para el cultivo control, igual que se observaba en el experimento en que se utilizaba el solvente. 3.4. Efecto de otros contaminantes emergentes sobre los niveles de microcistina en M. aeruginosa PCC 7806 En los últimos años están detectándose sustancias en cantidades importantes que hasta ahora habían pasado desapercibidas. En este estudio se ha analizado el efecto del benceno, solvente orgánico, y algunos de los fármacos más abundantes en nuestras aguas en los niveles de microcistina de M. aeruginosa PCC 7806. El objetivo era determinar si este tipo de contaminantes estaba afectando a la toxicidad de los blooms, cada vez más frecuentes en nuestras aguas debido a la creciente eutrofización. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 7 24 µg Equiv. MC-LR/ µg cl. a Tiempo (horas) Interior Control 7 mg/l (+200 µl/l EtOH) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 2 7 24 µg Equiv. MC-LR/ µg cl. a Tiempo (horas) Exterior Control 7 mg/l (+200 µl/l EtOH) 52 3.4.1. Efecto del benceno El benceno es un hidrocarburo aromático que se encuentra en la lista de los 20 productos químicos de mayor volumen de producción. Algunas industrias usan el benceno como punto de partida para manufacturar otros productos químicos. Se han estudiado dos concentraciones distintas: 50 µg/l y 100 µg/l, que se escogieron basándonos en los niveles encontrados en algunos de los ríos españoles [110]. 3.4.1.1. Medida de la cantidad de clorofila a Para estudiar el efecto sobre el crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 se llevaron a cabo medidas de la cantidad de clorofila a a tiempos 0, 1, 2, 3 y 4 días. El experimento no se pudo alargar más en el tiempo debido a la volatilidad del benceno. El resultado se muestra en la siguiente figura 32: Figura 32. Cantidad de clorofila a medida en los tres cultivos con respecto al tiempo en días. Se observa una ralentización del crecimiento en los cultivos tratados con benceno con respecto al cultivo control. Posteriormente, los cultivos se recuperan gracias a la volatilidad del benceno. 3.4.1.2. Medida de la cantidad de microcistina Se midió el contenido en microcistina intracelular de los distintos cultivos a tiempo 0 y 4 días. El resultado se muestra en la figura 33: Figura 33. Representación del contenido de microcistina intracelular expresada en µg equivalentes de microcistina-LR por µg de clorofila a con respecto al tiempo en horas. 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 0 1 2 3 4 Clorofila a µg/ml Tiempo (días) Control Benceno 50 µg/l Benceno 100 µg/l 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 05' 4 µg Equiv. MC-LR/ µg clorof. Tiempo (días) Control Benceno 50 µg/l Benceno 100 µg/l 53 Se observa una ligera estimulación de la síntesis de microcistina en el cultivo tratado con 50 µg/l de benceno con respecto al control. El cultivo con 100 µg/l de benceno presenta un pequeño descenso en la cantidad de microcistina a los 4 días. Sin embargo, no consideramos que el efecto sea relevante. 3.4.2. Efecto de distintos fármacos Entre los fármacos más habituales en nuestras aguas se encuentran: el paracetamol, el ibuprofeno, el atenolol o el voltarén. Se ha llevado a cabo el estudio del crecimiento de M. aeruginosa PCC 7806 en presencia de concentraciones de estos fármacos reales en nuestros ríos, y el análisis de la cantidad de microcistina producida. En todos los casos se realizó el seguimiento del crecimiento de la cianobacteria mediante medidas de la cantidad de clorofila a, y se llevó a cabo la cuantificación de la microcistina intracelular producida. 3.4.2.1. Paracetamol Datos en la literatura describen que el paracetamol aparece en nuestras aguas con concentraciones en torno a 16 µg/l [111]. Se estudió un rango más amplio de concentraciones, con 14 µg/l como mínima y 166 µg/l de máxima. 3.4.2.1.1. Medida de la cantidad de clorofila a Figura 34. Representación de la cantidad de clorofila a de los diferentes cultivos sometidos a distintas concentraciones de paracetamol con respecto al tiempo en días. No se observan cambios en el crecimiento significativos. 3.4.2.1.2. Medida de la cantidad de microcistina Se determinó la cantidad de microcistina intracelular a tiempo 0 y 4 días para todas las concentraciones estudiadas. El resultado se muestra en la figura 35: 0 1 2 3 4 5 6 7 05' 134 Clorofila a (µg/ml) Tiempo (días) Control 14 µg/l 27 µg/l 55 µg/l 166 µg/l 54 Figura 35. Medida del contenido de microcistina intracelular expresada en µg equivalentes de microcistina-LR por µg de clorofila a con respecto al tiempo 0, 5 minutos y 4 días. Los cultivos con paracetamol muestran, en general, un ligero aumento de microcistina intracelular a los 4 días. 3.4.2.1.3. Ibuprofeno, Atenolol y Voltarén Para estos tres fármacos se utilizaron concentraciones máximas diez veces superiores a las encontradas en los ríos, con el objetivo de poder determinar claramente su efecto [111]. En el caso del ibuprofeno la concentración utilizada fue de 200 µg/l. Para el atenolol 20 µg/l, y para el voltarén 20 µg/l. 3.4.2.1.3.1. Medida de la cantidad de clorofila a El seguimiento del crecimiento se lleva a cabo mediante medidas de clorofila a. Figura 36. Cantidad de clorofila a medida en cada cultivo con respecto al tiempo en días. No se observan cambios relevantes en el crecimiento. 3.4.2.1.3.2. Medida de la cantidad de microcistina Se cuantificaron los niveles de microcistina intracelular. El resultado se muestra en la figura 37: 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 05' 4 µg Equiv. MC-LR/ µg clorof. Tiempo (días) Control 14 µg/l 27 µg/l 55 µg/l 166 µg/l 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 05' 1234 Clorofila a µg/ml Tiempo (días) Control Ibuprofeno Atenolol Voltarén 55 Figura 37. Medida del contenido de microcistina intracelular expresada en µg equivalentes de microcistina-LR por µg de clorofila a con respecto al tiempo en horas. No se observa un aumento de la síntesis de la toxina para ninguno de los fármacos y la microcistina intracelular puede decirse que, en general, es ligeramente menor en los cultivos con fármacos. 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 05' 4 µg Equiv. MC-LR/ µg clorof. Tiempo (días) Control Ibuprofeno Atenolol Voltarén 56 57 DISCUSIÓN 64 65 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Kaebernick, M. and B.A. Neilan, Ecological and molecular investigations of cyanotoxin production. FEMS Microbiol Ecol, 2001. 35(1): p. 1-9. 2. Francis, G., Poisonous Australian Lake. Nature, 1878. 18((444)): p. 11-12. 3. Luukkainen, R., et al., Isolation and identification of 12 microcystins from four strains and two bloom samples of Microcystis spp.: structure of a new hepatotoxin. Toxicon, 1994. 32(1): p. 133-9. 4. Kusumi, T., Ooi, T., Watanabe, M.M., Takahashi, H., Kakisawa, H., Cyanoviridin RR, a toxin from the cyanobacterium (blue-green alga) Microcystis viridis. . Tetrahedron Letters, 1987. 28: p. 4695-4698. 5. Carmichael, W.W., et al., Partial structural determination of hepatotoxic peptides from Microcystis aeruginosa (cyanobacterium) collected in ponds of central China. Toxicon, 1988. 26(12): p. 1213-7. 6. Harada, K., et al., Microcystins from Anabaena flos-aquae NRC 525-17. Chem Res Toxicol, 1991. 4(5): p. 535-40. 7. Ueno, Y., et al., Detection of microcystins, a blue-green algal hepatotoxin, in drinking water sampled in Haimen and Fusui, endemic areas of primary liver cancer in China, by highly sensitive immunoassay. Carcinogenesis, 1996. 17(6): p. 1317-21. 8. Sivonen, K., et al., Three new microcystins, cyclic heptapeptide hepatotoxins, from Nostoc sp. strain 152. Chem Res Toxicol, 1992. 5(4): p. 464-9. 9. Lanaras, T. and C.M. Cook, Toxin extraction from an Anabaenopsis milleri--dominated bloom. Sci Total Environ, 1994. 142(3): p. 163-9. 10. Prinsep, M.R., et al., Westiellamide, a bistratamide-related cyclic peptide from the blue-green alga Westiellopsis prolifica. J Nat Prod, 1992. 55(1): p. 140-2. 11. Neilan, B.A., et al., Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria. J Bacteriol, 1999. 181(13): p. 4089-97. 12. Tonk, L., et al., Amino acid availability determines the ratio of microcystin variants in the cyanobacterium Planktothrix agardhii. FEMS Microbiol Ecol, 2008. 65(3): p. 383-90. 13. Nishiwaki-Matsushima, R., et al., Liver tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin-LR. J Cancer Res Clin Oncol, 1992. 118(6): p. 420-4. 14. MacKintosh, C. and R.W. MacKintosh, Inhibitors of protein kinases and phosphatases. Trends Biochem Sci, 1994. 19(11): p. 444-8. 15. Eriksson, J.E., et al., Hepatocellular uptake of 3H-dihydromicrocystin-LR, a cyclic peptide toxin. Biochim Biophys Acta, 1990. 1025(1): p. 60-6. 16. Runnegar, M.T., S. Kong, and N. Berndt, Protein phosphatase inhibition and in vivo hepatotoxicity of microcystins. Am J Physiol, 1993. 265(2 Pt 1): p. G224-30. 17. Moorhead, G., et al., Purification of type 1 protein (serine/threonine) phosphatases by microcystin-Sepharose affinity chromatography. FEBS Lett, 1994. 356(1): p. 46-50. 18. Fujiki, H., Suganuma, M., Unique features of the okadaic acid activity class of tumor promoters. J Cancer Res Clin Oncol, 1999. 125: p. 150-155. 19. Zhou, L., Yu, H., Chen, K., Relationship between microcystin in drinking water and colorectal cancer. Biomed Environ Sci 2002. 15: p. 166-171. 20. Goldberg, J., Huang, H.B., Kwon, Y.G., Greengard, P., Nairn, A.C., Kuriyan, J., Three-dimensional structure of the catalytic subunit of proteín serine/threonine phosphatase-1. Nature, 1995. 376: p. 745-753. 21. MacKintosh, R.W., et al., The cyanobacterial toxin microcystin binds covalently to cysteine-273 on protein phosphatase 1. FEBS Lett, 1995. 371(3): p. 236-40. 22. Shi, L., W. W. Carmichael I. Miller, Immuno-gold localization of hepatotoxins in cyanobacterial cells. Arch Microbiol 1995. 163: p. 7-15. 23. Young, F.M., Thomson, C., Metcalf, J.S., Lucocq, J.M., Codd, G.A., Immunogold localisation of microcystins in cryosectioned cells of Microcystis." J Struct Biol, 2005. 151: p. 208-14. 24. Dittmann, E., et al., Insertional mutagenesis of a peptide synthetase gene that is responsible for hepatotoxin production in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa PCC 7806. Mol Microbiol, 1997. 26(4): p. 779-87. 25. Nishizawa, T., et al., Genetic analysis of the peptide synthetase genes for a cyclic heptapeptide microcystin in Microcystis spp. J Biochem, 1999. 126(3): p. 520-9. 26. Tillett, D., et al., Structural organization of microcystin biosynthesis in Microcystis aeruginosa PCC7806: an integrated peptide-polyketide synthetase system. Chem Biol, 2000. 7(10): p. 753-64. 27. Nishizawa, T., et al., Polyketide synthase gene coupled to the peptide synthetase module involved in the biosynthesis of the cyclic heptapeptide microcystin. J Biochem, 2000. 127(5): p. 779-89. 28. Rouhiainen, L., et al., Genes coding for hepatotoxic heptapeptides (microcystins) in the cyanobacterium Anabaena strain 90. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(2): p. 686-92. 29. Christiansen, G., et al., Microcystin biosynthesis in planktothrix: genes, evolution, and manipulation. J Bacteriol, 2003. 185(2): p. 564-72. 30. Neilan B. A, P.L.A., Moffitt M. C, Mihali K. T, Kaebernick M, Kellmann R, Pomati F, ed. The genetics and genomics of cyanobacterial toxicity. ed. S.p.B.a.B.S. Cyanobacteria and Astrobiology Research Laboratory, The University of New South Wales: Sydney, NSW, Australia. 66 31. Nishizawa, T., M. Asayama, and M. Shirai, Cyclic heptapeptide microcystin biosynthesis requires the glutamate racemase gene. Microbiology, 2001. 147(Pt 5): p. 1235-41. 32. Sielaff, H., et al., The mcyF gene of the microcystin biosynthetic gene cluster from Microcystis aeruginosa encodes an aspartate racemase. Biochem J, 2003. 373(Pt 3): p. 909-16. 33. Stewart, W.D., Some aspects of structure and function in N2-fixing cyanobacteria. Annu Rev Microbiol, 1980. 34: p. 497-536. 34. Frias, J.E., E. Flores, and A. Herrero, Requirement of the regulatory protein NtcA for the expression of nitrogen assimilation and heterocyst development genes in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol Microbiol, 1994. 14(4): p. 823-32. 35. Herrero, A., A.M. Muro-Pastor, and E. Flores, Nitrogen contrl en cianobacteria. J. Bacteriol., 2001. 183: p. 411-425. 36. Martin-Luna, B., et al., Identification of a Ferric uptake regulator from Microcystis aeruginosa PCC7806. FEMS Microbiol Lett, 2006. 254(1): p. 63-70. 37. Martin-Luna, B., et al., Fur from Microcystis aeruginosa binds in vitro promoter regions of the microcystin biosynthesis gene cluster. Phytochemistry, 2006. 67(9): p. 876-81. 38. Martin-Luna, B., et al., Expression of fur and its antisense alpha-fur from Microcystis aeruginosa PCC7806 as response to light and oxidative stress. J Plant Physiol, 2011. 168(18): p. 2244-50. 39. Hantke, K., Iron and metal regulation in bacteria. Curr Opin Microbiol, 2001. 4(2): p. 172-7. 40. Bsat, N., et al., Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors. Mol Microbiol, 1998. 29(1): p. 189-98. 41. Patzer, S.I. and K. Hantke, The ZnuABC high-affinity zinc uptake system and its regulator Zur in Escherichia coli. Mol Microbiol, 1998. 28(6): p. 1199-210. 42. Diaz-Mireles, E., et al., The Fur-like protein Mur of Rhizobium leguminosarum is a Mn(2+)-responsive transcriptional regulator. Microbiology, 2004. 150(Pt 5): p. 1447-56. 43. Ahn, B.E., et al., Nur, a nickel-responsive regulator of the Fur family, regulates superoxide dismutases and nickel transport in Streptomyces coelicolor. Mol Microbiol, 2006. 59(6): p. 1848-58. 44. Crosa, J.H., Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria. Microbiol Rev, 1989. 53(4): p. 517-30. 45. Hernandez, J.A., et al., Three fur homologues from Anabaena sp. PCC7120: exploring reciprocal protein-promoter recognition. FEMS Microbiol Lett, 2004. 236(2): p. 275-82. 46. Jungblut, A.D., et al., Characterization of microcystin production in an Antarctic cyanobacterial mat community. Toxicon, 2006. 47(3): p. 271-8. 47. Harding, W.R., et al., Death of a dog attributed to the cyanobacterial (blue-green algal) hepatotoxin nodularin in South Africa. J S Afr Vet Assoc, 1995. 66(4): p. 256-9. 48. Zambrano, F. and E. Canelo, Effects of microcystin-LR on the partial reactions of the Na(+)-K+ pump of the gill of carp (Cyprinus carpio Linneo). Toxicon, 1996. 34(4): p. 451-8. 49. Soll, M.D. and M.C. Williams, Mortality of a white rhinoceros (Ceratotherium simum) suspected to be associated with the blue-green alga Microcystis aeruginosa. J S Afr Vet Assoc, 1985. 56(1): p. 49-51. 50. Carmichael, W.W., The toxins of cyanobacteria. Sci Am, 1994. 270(1): p. 78-86. 51. Matsunaga, H., et al., Possible cause of unnatural mass death of wild birds in a pond in Nishinomiya, Japan: sudden appearance of toxic cyanobacteria. Nat Toxins, 1999. 7(2): p. 81-4. 52. Hoeger, S.J., et al., Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in two Australian drinking water treatment plants. Toxicon, 2004. 43(6): p. 639-49. 53. Teixeira, C.F., et al., [The political and administrative context of the implementation of Health Districts in the State of Bahia, Brazil]. Cad Saude Publica, 1993. 9(1): p. 79-84. 54. Annadotter, H., Cyanobacterial toxins in drinking water - a study of two Swedish water plants and a literary study VA-Forsks Rapportserie. (Haessleholms Gatukontor (Sweden)), 1993. 55. Pereira, P., et al., Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon flos-aquae, isolated from Montargil reservoir, Portugal. Toxicon, 2000. 38(12): p. 1689-702. 56. Hindman, S.H., et al., Pyrogenic reactions during haemodialysis caused by extramural endotoxin. Lancet, 1975. 2(7938): p. 732-4. 57. Pouria, S., et al., Fatal microcystin intoxication in haemodialysis unit in Caruaru, Brazil. Lancet, 1998. 352(9121): p. 21-6. 58. Azevedo, S.M., et al., Human intoxication by microcystins during renal dialysis treatment in Caruaru-Brazil. Toxicology, 2002. 181-182: p. 441-6. 59. Carmichael, W.W., et al., Human fatalities from cyanobacteria: chemical and biological evidence for cyanotoxins. Environ Health Perspect, 2001. 109(7): p. 663-8. 60. Ito, E., F. Kondo, K. Terao, K. Harad, Neoplastic nodular formation in mouse liver induced by repeated intraperitoneal injections of microcystin-LR. Toxicon, 1997. 35: p. 1453-7. 61. Tang, Z.Y., Wu, M.C., Xia, S.S., Primary liver cancer, Springer-Verlag, Editor. 1989, Berlin: China Academic Publishers. 62. Hunter, P.R., Cyanobacterial toxins and human health. Symp Ser Soc Appl Microbiol 1998. 27: p. 35S-40S. 63. Yu, S., Zhao, N., Zi, X., [The relationship between cyanotoxin (microcystin, MC) in pond-ditch water and primary liver cancer in China]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2001. 23: p. 96-99. 67 64. Welker, M., von Dohren, H., Tauscher, H., Steinberg, C.E.W., Erhard, M., Toxic Microcystis in shallow Lake Muggelsee (Germany) dynamics, distribution, diversity. Arch Hydrobiol, 2003. 157: p. 227-248. 65. Fastner, J., M. Erhard, and H. von Dohren, Determination of oligopeptide diversity within a natural population of Microcystis spp. (cyanobacteria) by typing single colonies by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(11): p. 5069-76. 66. CEDEX, Cianobacterias en los embalses españoles, C.d.E. Hidrográficos, Editor, Hoyos Alonso. 67. Vidal-Celma, A., Evolution d´un lac de barrage dans le NE de l´Espagne pendant les quatre premières années de service. Verh. Internt. Verein. Limnol., 1969. 17: p. 191-200. 68. Planas, D., Distribution and productivity of the phytoplankton in Spanish reservoirs. Verh. Internat. Verein. Limnol., 1975. 19: p. 1860-1870. 69. Sabater, S., J. Nolla, Distributional patterns of phytoplankton in Spanish reservoirs: First results and comparison after fifteen years. . Verh. Internat. Verein. Limnol., 1991. 24: p. 1371-1375. 70. De Hoyos, C., A. Negro, J.J. Aldasoro, Cianobacteria distribution and abundance in the Spanish water reservoirs during thermal stratification. Limnetica, 2004. 23((1-2)): p. 119-132. 71. Diersing, N., Phytoplankton Blooms: The Basics. . in In Florida Keys National Marine Sanctuary. 2009. 72. Margalef, R., M. D. Planas, J. Armengol, A. Vidal, N. Prat, A. Guisset, J. Toja, M. Estrada, Limnología de los embalses españoles, in M.O.P. Publ. 123, D.G.d.O. Hidraúlicas, Editor. 1976: Madrid. 73. Costas E., L.-r.V., Cianobacterias tóxicas y mortandades masivas en el parque nacional de doñana: red de alerta temprana y estrategias de gestión. Proyectos de investigación parques nacionales, 2003-2006. 74. Moreno I. M., P.P., Franca S., Cameán A., Toxic cyanobacteria strains isolated from blooms in the Guadiana River (southwestern Spain). Biol Res, 2004. 37: p. 405-417. 75. Vitousek, P.M., Aber, J.D., Howarth, R.W., Likens, G.E., Pamela A. Matson, Schindler, D.W., William H. Schlesinger, Tilman, D.G., Human alteration of the global nitrogen cycle:Sources and consequences. Ecological Applications, 1997. 7: p. 737-750. 76. Petrovic, M., et al., Endocrine disrupting compounds and other emerging contaminants in the environment: a survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal Bioanal Chem, 2004. 378(3): p. 549-62. 77. Solomon, L.M., L. Fahrner, and D.P. West, Gamma benzene hexachloride toxicity: a review. Arch Dermatol, 1977. 113(3): p. 353-7. 78. IARC, ed. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Man: Some Organochlorine Pesticides., ed. I.A.f.R.o. Cancer. Vol. 5. 1973: Lyon. 47-73. 79. Sang S, P.S., Cuddeford V., ed. Lindane. A review of toxicity and enviromental fate. World Wildlife Fund. 1999: Canada. 80. Hardie, D.W.F., ed. Benzene hexachloride. 2nd edition ed. Encyclopedia of Chemical Technology, ed. R.E.a.O. Kirk, D.F. Vol. 5. 1964: New York: John Wiley & Sons. 267-281. 81. Danopoulos, E., K. Melissinos, and G. Katsas, Serious poisoning by hexachlorocyclohexane; clinical and laboratory observations on five cases. AMA Arch Ind Hyg Occup Med, 1953. 8(6): p. 582-7. 82. Sumpter, J.P., Reproductive effects from oestrogen activity in polluted water. Arch Toxicol Suppl, 1998. 20: p. 143- 50. 83. ATSDR., Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Minimal Risk Levels (MRLs) for Hazardous Substances. Internet Site http://atsdr1.atsdr.cdc.gov:8080/mrls.html, 1997a. Accessed 23/09/98. 84. ATSDR., Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Substance Information. GAMMAHEXACHLOROCYCLOHEXANE. Internet Site http://atsdr1.atsdr.cdc.gov:8080/gsql/ 1997b. Accessed 23/09/98. 85. Nolan B. A, K.M.D., Levitt M. D, Lindane toxicity: a comprehensive review of the medical literature. Pediatric Dermatology, 2012. 29(2): p. 141-146. 86. quality, B.d.f.d.o.W.G.f.d.-w., Lindane in drinking-water. WHO/SDE/WSH/03.04/102. 87. Wooltorton, E., Concerns over lindane treatment for scabies and lice. CMAJ, 2003. 168(11): p. 1447-8. 88. Jones, O.A., N. Voulvoulis, and J.N. Lester, Human pharmaceuticals in the aquatic environment a review. Environ Technol, 2001. 22(12): p. 1383-94. 89. Hernando, M.D., et al., Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments. Talanta, 2006. 69(2): p. 334-42. 90. Petrovic, M., et al., Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of pharmaceutical residues in environmental samples: a review. J Chromatogr A, 2005. 1067(1-2): p. 1-14. 91. Qian H, P.X., Chen J, Zhou D, Chen Z, Zhang L, Fu Z., Analyses of gene expression and physiological changes in Microcystis aeruginosa reveal the phytotoxicities of three enviromental pollutants. Ecotoxicology, 2012. 21: p. 847- 859. 92. Fent, K., A.A. Weston, and D. Caminada, Ecotoxicology of human pharmaceuticals. Aquat Toxicol, 2006. 76(2): p. 122-59. 93. Gros, M., M. Petrovic, and D. Barcelo, Wastewater treatment plants as a pathway for aquatic contamination by pharmaceuticals in the ebro river basin (northeast Spain). Environ Toxicol Chem, 2007. 26(8): p. 1553-62. 94. Taylor, R.F. and B.H. Davies, Triterpenoid carotenoids and related lipids. Triterpenoid carotenoid aldehydes from Streptococcus faecium UNH 564P. Biochem J, 1976. 153(2): p. 233-9. 68 95. Glazer, A.N., et al., Biliproteins of cyanobacteria and Rhodophyta: Homologous family of photosynthetic accessory pigments. Proc Natl Acad Sci U S A, 1976. 73(2): p. 428-31. 96. Thurman, R.G., H.G. Ley, and R. Scholz, Hepatic microsomal ethanol oxidation. Hydrogen peroxide formation and the role of catalase. Eur J Biochem, 1972. 25(3): p. 420-30. 97. Molin, M., et al., Ionizing radiation induces a Yap1-dependent peroxide stress response in yeast. Free Radic Biol Med, 2007. 43(1): p. 136-44. 98. Gonzalez, A., et al., Overexpression of FurA in Anabaena sp. PCC 7120 reveals new targets for this regulator involved in photosynthesis, iron uptake and cellular morphology. Plant Cell Physiol, 2010. 51(11): p. 1900-14. 99. Sevilla, E., et al., Optimization of intracellular microcystin-LR extraction for its analysis by protein phosphatase inhibition assay. Water Sci Technol, 2009. 60(7): p. 1903-9. 100. Sevilla, E., ed. Estudio de factores que inciden en la síntesis de microcistina en Microcystis aeruginosa PCC7806 y diseño de un kit para su cuantificación. Bioquímica y Biología Molecular y Celular Zaragoza: Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza. 2007. 101. Siebert, P.D., ed. Quantitative RT-PCR. Humana Press, ed. B.K. Protocols, U. Reischl. 1999: New Jersey. 61-85. 102. Breljak, D., Ambriovíc-Ristov, A., Kapitanovic, S., Cacev, T., Gabrilovac, J., Comparation of three RT-PCR based methods for relative quantification of mRNA. Food Technol. Biotechnol., 2005. 43(4): p. 379-88. 103. Thellin, O., et al., Housekeeping genes as internal standards: use and limits. J Biotechnol, 1999. 75(2-3): p. 291-5. 104. Siebert, P.D., Quantitative rt-PCR. Methods Mol Med, 1999. 26: p. 61-85. 105. Sevilla, E., et al., Iron availability affects mcyD expression and microcystin-LR synthesis in Microcystis aeruginosa PCC7806. Environ Microbiol, 2008. 10(10): p. 2476-83. 106. Kuniyoshi, T.M., et al., 2-oxoglutarate enhances NtcA binding activity to promoter regions of the microcystin synthesis gene cluster. FEBS Lett, 2011. 585(24): p. 3921-6. 107. Stainer RY, C.-B.G., Phototrophic prokaryotes: the cyanobacteria. Annual Review of Microbiology, 1977. 31: p. 225- 274. 108. W., W., Phycobilisomes: Structure and Function, in Experimental Phycology: Cell Walls and Surfaces, Reproduction, Photosynthesis, R.D.a.S.R. Wiesser W, Editor. 1990, Springer Verlag, Heidelberg. p. 158-172. 109. Figueroa, F.L., et al., Biofiltration of fishpond effluents and accumulation of N-compounds (phycobiliproteins and mycosporine-like amino acids) versus C-compounds (polysaccharides) in Hydropuntia cornea (Rhodophyta). Mar Pollut Bull, 2012. 64(2): p. 310-8. 110. Barceló L. D., l.d.A.M.J., Contaminación y calidad química del agua: el problema de los contaminantes emergentes, Panel Científico-Técnico de Seguimiento de la Política de Aguas: Convenio Universidad de Sevilla-Ministerio de Medio Ambiente. 111. Gros, M., M. Petrovic, and B.L. D., Tracing pharmaceutical residues of different therapeutic classes in enviromental waters by using liquid chromatography/quadrupole-linear ion trap mass spectrometry and automated library searching. Anal. Chem., 2009. 81: p. 898-912.