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E Es st ta ab bi il li id da ad d e e i in nt te er ra ac cc ci io on ne es s d de el l d do om mi in ni io o d de e u un ni ió ón n d de el l r re ec ce ep pt to or r d de e L LD DL L T Tr ra ab ba aj jo o f fi in n d de e M Má ás st te er r M Má ás st te er r B Bi io ol lo og gí ía a M Mo ol le ec cu ul la ar r y y C Ce el lu ul la ar r A Au ut to or r: : Z Zu ur ri iñ ñe e R Ro oz za ad do o A Ag gu ui ir rr re e D Di ir re ec ct to or r: : J Ja av vi ie er r S Sa an nc ch ho o S Sa an nz z Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 2 Resumen del proyecto El receptor de lipoproteínas de baja densidad (rLDL) es una proteína de membrana que juega un papel crucial en el mantenimiento de concentraciones adecuadas de colesterol en el organismo. Su disfunción se asocia con la aparición de Hipercolesterolemia Familiar (HF), una enfermedad común caracterizada por altos niveles de colesterol en los vasos sanguíneos. El mecanismo por el cual el receptor lleva a cabo la internalización de las lipoproteínas a las células y su posterior liberación en los endosomas sigue siendo hoy en día de gran interés para entender en segundo lugar disfunciones del receptor asociadas a HF. Entre los distintos dominios del receptor, se encuentra el dominio de unión a ligando, compuesto a su vez por 7 repeticiones homólogas de unos 40 aminoácidos, conocidas como módulos LR (1-7) de los cuales los números 4 y 5 son los directamente implicados en la unión con las lipoproteínas. Todos ellos requieren la presencia de Ca2+ para adoptar una conformación estable y mantener a las LDL unidas. En este trabajo se expone un estudio de las propiedades del módulo 4 y el tándem 4-5 con objeto de estudiar sus diferencias conformacionales en presencia y ausencia de Ca2+ y Mg2+ tanto en condiciones extracelulares (pH 7) como endosomales (pH 5.5), donde se produce la liberación. Entre los estudios llevados a cabo en este trabajo, se encuentran en su mayoría ensayos cinéticos de asociación y disociación, realizado mediante el sistema de flujo detenido, de los módulos LR4 y LR5 con Ca2+y Mg2+en ambas condiciones que en algunos casos se complementan con otras técnicas termodinámicas. Por otro lado, en el trabajo se lleva a cabo la purificación y una caracterización espectroscópica preliminar del dominio de unión a ligando completo LR (1-7) Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 4 ÍNDICE 1. CAPÍTULO 1: Introducción y antecedentes 1 1.1. Las lipoproteínas y el colesterol 1 1.2. El receptor de LDL 2 1.2.1. El gen de rLDL 2 1.2.2. Estructura del rLDL 3 1.3. Ruta de internalización y liberación de LDLs 6 1.4. Antecedentes 8 2. CAPÍTULO 2: Objetivos 9 3. CAPÍTULO 3: Materiales y métodos 11 3.1. Trabajo con LR4, LR5 y LR45 11 3.1.1. Expresión y purificación de LR4, LR5 y LR45 11 3.1.1.1. Transformación en células competentes y crecimiento en placa 11 3.1.1.2. Cultivo a gran escala 12 3.1.1.3. Ultrasonación de células 12 3.1.1.4. Purificación mediante cromatografía de afinidad 13 3.1.1.5. Corte con trombina y diálisis redox 13 3.1.1.6. Cromatografía de fase reversa (HPLC) 13 3.1.1.7. Concentración y almacenamiento 14 3.1.1.8. Obtención forma apo 14 3.1.1.9. Electroforesis SDS-PAGE 15 3.1.2. Análisis e interacciones LR4, LR5 y LR4-5 con Ca2+ y Mg2+ 16 3.1.2.1. Cinética de unión 16 3.1.2.1.1. Diseño experimental y ajuste de los datos 16 3.1.2.2. Termodinámica de unión 18 Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 6 3.1.2.2.1. Ensayos de fluorescencia 18 3.1.2.2.2. Ensayos de calorimetría isoterma de titulación 19 3.2. Purificación y caracterización de LR 1-7 21 3.2.1. Expresión y purificación de LR 1-7 21 3.2.1.1. Expresión y transformación en células competentes 21 3.2.1.2. Crecimiento en placa y cultivo 21 3.2.1.3. Filtración, concentración y diálisis 21 3.2.1.4. Cromatografía de hidroxiapatito 22 3.2.1.5. Diálisis redox 22 3.2.1.6. Cromatografía de exclusión molecular 22 3.2.1.7. Electroforesis SDS-PAGE 22 3.2.2. Caracterización de LR 1-7 23 3.2.2.1. Espectrometría de masas 23 3.2.2.2. Caracterización espectroscópica 23 3.2.2.3. Desnaturalización térmica 24 4. CAPÍTULO 4: Resultados 25 4.1. Interacción de LR4, LR5 y LR4-5 con Ca2+ y Mg2+ 25 4.1.1. LR5 25 4.1.2. LR4 34 4.1.3. LR4-5 39 4.2. Purificación y caracterización de LR 1-7 44 4.2.1. Purificación de LR 1-7 44 4.2.2. Caracterización de LR 1-7 45 4.2.2.1. Espectrometría de masas 45 4.2.2.2. Caracterización espectroscópica 46 4.2.2.3. Desnaturalización térmica 47 5. CAPÍTULO 5: Discusión 49 5.1. Unión de cationes a LR4, LR5 y LR4-5 49 5.1.1. LR5 49 5.1.2. LR4 50 5.1.3. LR 4-5 51 5.2. Purificación y caracterización de LR 1-7 52 6. CAPÍTULO 6: Conclusiones 53 7. CAPÍTULO 7: Bibliografía 55 ANEXO I: Secuencias y propiedades de LR4, LR5, LR4-5 y LR 1-7 ANEXO II: Medios de cultivo Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 8 Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 1 Figura1.1: Estructura del colesterol con el grupo OH en la posición 3. CAPÍTULO 1 Introducción y antecedentes 1.1 Las lipoproteínas y el colesterol El colesterol es un lípido hidrofóbico de fórmula C27H46O esencial para el mantenimiento de la estructura de las membranas celulares y precursor de moléculas importantes como las hormonas sexuales y ácidos biliares entre otros. Está compuesto por 4 anillos seguidos de una cola hidrofóbica, siendo un grupo hidroxilo en la posición 3 su único componente polar (figura 1.1). Debido a este motivo, el transporte del colesterol no se realiza de forma soluble por el plasma sino unido a otros componentes como proteínas y lípidos formando de esta manera grandes complejos conocidos como lipoproteínas. Se conocen diferentes tipos de lipoproteínas según el porcentaje de sus distintos componentes (VLDL, LDL, IDL, HDL). Entre ellas destacan las LDL (low density lipoprotein), que presentan un alto contenido de colesterol y ésteres de colesterol. Éstas transportan el colesterol hacia tejidos o músculos con alta demanda donde el lípido es internalizado a través de endocitosis mediada por receptor. Por otro lado cabe destacar también el papel que juegan las HDL (high density lipoprotein), bajas en colesterol y que participan el transporte reverso del mismo. Existen dos vías que garantizan la disponibilidad del colesterol en el interior de las células. Una de ellas es la vía endógena, mediante la cual el colesterol es sintetizado a partir de acetil-CoA gracias a la acción de múltiples enzimas intracelulares entre las que destaca la HMG-CoAreductasa como limitante del proceso[1]. Por otro lado se encuentra la vía exógena en la que el colesterol es incorporado al interior del organismo a partir de la dieta. Es de esta forma cuando el colesterol se transporta por la circulación como lipoproteínas y es incorporado al interior de las células por medio de un receptor específico. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 8 1.4. Antecedentes En los años previos a este proyecto se ha realizado en el grupo una larga y exhaustiva caracterización de los módulos LR4 y LR5 directamente implicados en la unión a las LDL, trabajo realizado primero por Xabier Arias-Moreno y a continuación por Juan Martínez. Los ensayos se realizaron tanto a pH extracelular (pH 7) como endosomal (pH 5.5), observando las diferencias estructurales que los módulos presentan en cada una de las situaciones. 1.4.1. Estudio conformacional y funcional del LR5 El trabajo comienza con la elaboración de un protocolo de obtención y purificación para LR5, que se ha extendido al resto de construcciones empleadas (LR4 y LR4-5). En este protocolo la proteína se obtiene fusionada a GST[31] (glutatión sulfhidril-transferasa). Tras la obtención en primer lugar de LR5, se realizó una completa caracterización por técnicas tanto espectroscópicas como calorimétricas que reflejaban la importancia del ion Ca2+ en el mantenimiento de la conformación funcional del módulo, y la inestabilidad que éste último presenta en condiciones endosomales[32]. Todo ello llevó a postular un mecanismo alternativo de liberación de las LDL en el interior del endosoma basado en la bajada de pH y la pérdida de Calcio como agentes causantes de la disociación[32]. De la misma forma, más adelante se realizaron ensayos cinéticos en condiciones extracelulares del LR5 mediante la técnica de flujo detenido, Stopped-flow, midiendo la afinidad del ion Ca2+ por el módulo. 1.4.2Estudio conformacional y funcional del LR4 y LR4-5 Analizado el comportamiento y estructura del LR5, se procedió a la caracterización de LR4 y el tándem LR4-5. Los resultados indicaron que todos ellos son capaces de coordinarse con el Ca2+ de una manera similar a como lo hace LR5, reflejando de la misma forma la importancia de la coordinación en el mantenimiento de su estructura. Todos estos datos se superponían con los obtenidos para LR5, manteniéndose compatible el nuevo modelo de liberación explicando que además del módulo LR5, el resto de ellos podían presentar un comportamiento similar. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 9 CAPÍTULO 2 Objetivos El objetivo a largo plazo de este proyecto consiste en conocer el papel que los módulos del dominio de unión a ligando, y más en concreto LR4 y LR5, juegan en el proceso de internalización y liberación de las LDL. Para conseguirlo y atendiendo a los datos anteriormente descritos, se definen en este trabajo una serie de objetivos específicos: 1. Analizar exhaustivamente la cinética de unión de los módulos LR4, LR5 y LR45 con Ca2+ y Mg2+. -Medir la estabilidad y fortaleza de unión entre los cationes y los módulos LR4, y LR4-5. 2. Purificar y caracterizar el dominio de unión a ligando completo LR (1-7). Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 10 Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 11 CAPÍTULO 3 Materiales y métodos 3.1. Trabajo con LR4, LR5 y LR45 3.1.1. Expresión y purificación de LR4, LR5 y LR45 3.1.1.1 Transformación en células competentes y crecimiento en placa Todas las construcciones fueron clonadas por Xabier Arias-Moreno en el plásmido de expresión pGEX-4T-3 unidas a glutatión sulfhidril-transferasa (GST)[32]. Entre lo más destacable de este plásmido se encuentra el gen para la expresión de GST seguido de la secuencia de corte para trombina, el gen de resistencia a ampicilina con el fin de seleccionar las colonias que han incorporado el plásmido, y el promotor inducible con IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) para conseguir sobreexpresión de la proteína. El proceso de introducción del plásmido en células de Escherichia coli BL21se realiza mediante la transformación por choque térmico. Se añaden en hielo y en condiciones de esterilidad 5 µl de plásmido a una concentración de 100 ng/µl, y 90 µl de células BL21 y se incuba la mezcla 15 minutos en hielo. Seguidamente, se incuba durante 50 segundos en baño seco a 42 ºC y de nuevo se introduce en hielo 2 minutos. Pasado este tiempo se añaden 900 µL de LB fresco y se deja crecer a 37 ºC durante unas 2 horas con agitación. Finalmente se siembran 200 µl en una placa de LB-agar con ampicilina y se incuba durante 16-20 horas. El control negativo se realiza, tratando en paralelo, una muestra de células competentes a las que se adiciona agua milli-Q estéril en lugar de plásmido. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 12 3.1.1.2. Cultivo a gran escala Seleccionadas las colonias, se procede al cultivo a gran escala que permita obtener gran cantidad de proteína. En este caso el escalado tiene lugar a 10 L de cultivo por cada proteína de interés. En primer lugar y en condiciones de esterilidad, se pica una colonia de la placa crecida con una punta de micropipeta y se vierte en un falcon con 10 ml de medio LB y una concentración de ampicilina de 100 µg/ml. Este proceso se repite por litro de cultivo y cada falcon se deja crecer a 37 ºC con agitación (180 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de 0.6 U.A a 600 nm. Una vez crecidas, el contenido de cada falcon se trasvasa a un erlenmeyer autoclavado de 2 L que contiene 1 L de medio LB y una concentración de ampicilina de 100 µg/ml. Nuevamente se dejan crecer en las mismas condiciones hasta alcanzar la densidad óptica requerida (0.6 U.A), momento en el que tiene lugar la inducción con IPTG. Los cultivos se recogen pasadas 12-16 horas centrifugando durante 10 minutos a 9000 rpm en el rotor JA- 10 de la centrífuga Avanti J-25 (BeckmanCoulter) y se recoge el sedimento para continuar con el siguiente paso de purificación. 3.1.1.3. Ultrasonación de células El sedimento recogido se resuspende en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM pH 8.0 y se procede a la rotura de las células mediante ultrasonidos. La disolución se somete a 7 ciclos de ultrasonidos en el aparato UP 200 (figura 3.1). Se realizan 5 ciclos de 45 segundos separados por 30 segundos a 0.8 de potencia y 0.5 de pulso y 2 ciclos de 30 segundos a 0.8 de potencia y 1 de pulso. La disolución se mantiene en hielo para evitar el sobrecalentamiento de la misma. El siguiente paso requiere la centrifugación durante 25 min a 22500 rpm en el rotor JA-25.50 de la centrífuga Avanti J-25 (Beckman Coulter). Figura 3.1: Ultrasonador UP-200 utilizado para la rotura de las células recogidas. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 13 3.1.1.4. Purificación mediante cromatografía de afinidad (FPLC) El sobrenadante obtenido tras la centrifugación se pasa por una columna GSTPrep FF16/10 (GE-Helthcare) de afinidad a glutation conectada a una bomba peristáltica Pump P-1 (GE Helthcare). La columna se equilibra previo paso a la muestra con 5 volúmenes de columna de tampón Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8 (tampón de carga) con un flujo de 5 ml/min. La muestra se carga a un flujo de 2 ml/min con objeto de conseguir una mayor interacción con la columna. A continuación, se realiza el lavado de la columna con el tampón de carga con el fin de eliminar las interacciones inespecíficas, hasta conseguir una absorbancia en el UV-visible menor que 0.05 U.A (250-300 ml aproximadamente). Finalmente se procede a la elución de la proteína retenida con un tampón con alto contenido en glutation que compite por los sitios de unión a la columna, compuesto por Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Glutation 10 mM, pH 8.0 (5 ml/min). 3.1.1.5. Corte con trombina y diálisis redox. La separación de la proteína de fusión se realiza con Trombina (Sigma), proteasa de origen bovino que se añade a la muestra cuantificada a una concentración de 1 U/mg proteína de fusión. Para conseguir una buena eficiencia en el corte GST-proteína, la disolución se mantiene durante 16-20 horas a 20 ºC. Una vez producido el corte, y con objeto de conseguir un correcto plegamiento de la proteína y formación de puentes disulfuro, la muestra se somete a diálisis redox. El tampón de diálisis se compone de Tris 50 mM, CaCl2 10 mM, cistina 2 mM, cisteína 0.5 mM, pH 8.0. Esta diálisis se realiza en vasos de 5 L que se remplazan cada 4-5 horas manteniendo el proceso completo durante un periodo total de unas 40 horas. Debido al pequeño tamaño de las proteínas, las membranas utilizadas para la diálisis tienen un tamaño de poro de 1000 kDa (Cellusep). 3.1.1.6. Cromatografía en fase reversa por HPLC El último paso de la purificación para la separación de la proteína de sus impurezas (trombina, GST, GST-proteína…) requiere una cromatografía en fase reversa a alta presión (HPLC) con una columna C18polimérica (Sunfire). Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 14 La muestra se retira de la membrana de diálisis, se lleva a pH 2-3 con TFA al 5% para evitar interacciones electrostáticas inespecíficas con la columna y se filtra previo paso por la misma. Es importante tener en cuenta que la columna no es capaz de retener más de 150 mg de proteína a la hora de llevar a cabo la inyección y evitar en todo momento la entrada de aire en el sistema. Se utiliza una disolución de agua milli-Q al 0.1% de TFA (Ácido trifluoroacético) como Tampón A (más polar), y una disolución menos polar de acetonitrilo al 0.1% de TFA como Tampón B (más apolar). A partir de un porcentaje 80/20 de tampón A y B al inicio del ensayo, se ejecuta un gradiente hasta 35% de B, de forma que se aumenta la hidrofobicidad y disminuyen las interacciones de la proteína con la columna. La elución de LR5 tiene lugar a un 22% de Tampón B, LR4 28% y LR45 31%. Todo el proceso tiene lugar a un flujo de 5 ml/min y tras la elución de la proteína, se procede a su cuantificación a partir de su coeficiente de extinción teórico, y la muestra es alicuotada. 3.1.1.7. Concentración y almacenamiento Las proteínas purificadas del HPLC se congelan 2 h a -80 ºC y después se liofilizan durante 24 h, es decir, se someten a vacío a una temperatura de -80ºC de forma que se eliminan los componentes volátiles. Tras ello, la proteína se almacena a -20 ºC durante el tiempo deseado hasta requerir su posterior uso. 3.1.1.8. Obtención forma apo Para algunos experimentos resulta necesario la obtención de la forma apo de los módulos (apoLR). Para ello existen dos posibles alternativas: por un lado, puede utilizarse un agente quelante de metales como el EDTA[34], o por el otro, resinas secuestradoras de cationes (Chelex 100 Resin, Bio-Rad) que añadidas sobre la disolución de proteína, en proporción de 1 gramo/100 ml de disolución, consiguen retirar el Ca2+ residual unido a los LR en aproximadamente una hora[35]. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 15 3.1.1.9 Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) Obtenida la proteína de la cromatografía en fase reversa, conviene comprobar la pureza de la misma. Ésta se obtiene mediante la realización de una electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida en la que los componentes se separan según su peso molecular[36]. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 16 3.1.2. Análisis interacción LR4, LR5, LR4-5 con Ca2+ y Mg2+ 3.1.2.1 Cinética de unión La unión de los distintos módulos LR a Ca2+ y Mg2+ se analizó en función del tiempo en un sistema de flujo detenido SX17.MV de Applied Photophysics (Leatherhead, U.K.) acoplado a un detector de fluorescencia (figura 3.2). La técnica consiste en la introducción de una mezcla de componentes a la cámara de observación a través de dos jeringas, y medición del cambio de alguna señal espectroscópica de alguno de los reactivos (emisión de fluorescencia en este caso) en muy poco espacio de tiempo. Los reactivos pasan hasta la celda de observación y continúan hasta una tercera jeringa provista de un freno (jeringa de parada), que hace detener el flujo. La medida comienza tan pronto la mezcla alcanza la celda de observación por lo que es importante que el tiempo que transcurra desde que se produce la mezcla hasta la llegada a la cámara sea mínimo (tiempo muerto). De esta forma consiguen medirse reacciones transcurridas en pocos milisegundos. 3.1.2.1.1. Diseño experimental y ajuste de los datos La unión de los cationes Ca2+ y Mg2+ a los módulos LR produce un aumento de fluorescencia como consecuencia de un cambio en el entorno de los residuos aromáticos Figura 3.2: Esquema general del sistema de flujo detenido acoplado a un detector de fluorescencia (Stopped-flow)[37]. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 17 presentes en los LR. Por el contrario, la ausencia de los cationes provoca un cambio en el plegamiento de la proteína que hace que estos residuos se encuentren más expuestos al solvente que actúa apantallando la fluorescencia. Todos los ensayos se llevaron a cabo a 25 ºC utilizando como tampón Pipes 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7 para simular condiciones extracelulares, y Acetato 50 mM, NaCl 150 mM pH 5.5 simulando condiciones endosomales. La concentración de proteína requerida para llevar a cabo los ensayos es de 5 µM en el caso de LR4 y LR5, y 3 µM para LR4-5 (debido a su mayor contenido de residuos aromáticos). Para las medidas se utilizó un filtro de 305 nm que absorbe toda la radiación emitida por debajo de esa longitud de onda. Ensayos de disociación Se realizan ensayos en los que se observa la disociación de los iones unidos a la proteína, utilizando distintas concentraciones de EDTA. La hipótesis inicial sostiene que el EDTA retira el Ca2+ o Mg2+ libre sin desplazar al que se encuentra unido a la proteína. Por tanto la constante de disociación obtenida de este proceso resulta independiente de la concentración de agente quelante añadida. La bajada de intensidad de fluorescencia puede ajustarse a una ecuación mono o biexponencial según sea el caso y se calcula la obs k , que refleja esa disminución de señal, para cada concentración de agente quelante. El esquema que rige el proceso de disociación viene dado por:   2222 // MgCaLRMgCaLR El proceso de disociación sigue una cinética de orden cero en la que la velocidad del proceso viene dada por la constante observable del proceso, obs k donde offobs kk  , siendo off k la constante cinética del proceso de disociación[38]. Ensayos de asociación Se realizan ensayos de unión de los cationes Ca2+ y Mg2+a los distintos módulos LR. En este caso, en primer lugar, se quela el Ca2+ residual que acompaña a la proteína Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 24 Fluorescencia Los espectros de emisión de LR 1-7 en las distintas condiciones se llevan a cabo en el Fluorímetro Cary Eclipse (Varian). Se realizan espectros de emisión excitando a 280 nm, y se observan las diferencias entre la proteína purificada sin tratar, tras añadir EDTA y tras la adicción de Ca2+. 3.2.2.3. Desnaturalizaciones térmicas seguidas por fluorescencia El proceso de desnaturalización de las proteínas puede seguirse estudiando el cambio de fluorescencia como consecuencia del aumento de temperatura. Como consecuencia del aumento de temperatura, los módulos LR cambian de conformación de forma que se produce una mayor exposición de sus residuos aromáticos al solvente, que actúa apantallando la fluorescencia. Las desnaturalizaciones de los módulos LR (1-7) se realizan en condiciones extracelulares e intracelulares en el Fluorímetro Cary Eclipse (Varian). La concentración de proteína utilizada es de 5 μM en Pipes o Acetato 10 mM, NaCl 150 mM y con Ca2+ 5 mM. Previo a la desnaturalización se realiza un espectro de fluorescencia de la muestra entre 300 y 450 nm. A continuación, se forma un gradiente de temperatura desde los 10 hasta 90 ºC con un aumento de 1.5 ºC/min. Se observa el descenso de fluorescencia a 350 nm, con una longitud de onda de excitación de 280 nm. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 25 CAPÍTULO 4 Resultados 4.1. Interacción LR4, LR5 y LR4-5 con Ca2+ y Mg2+ 4.1.1. Resultados con LR5 Ensayos de asociación y disociación LR5-Ca2+pH 5.5: -ENSAYO DE DISOCIACIÓN Determinación de kobs para cada concentración de EDTA y la constante cinética de disociación final del proceso koff. Las curvas de disociación obtenidas se ajustan a una ecuación monoexponencial con un único centro de unión para el Ca2+. kobs Figura 4.1: Curva de disociación obtenida para LR5-Ca2+ con una concentración de EDTA 750µM. La curva se ajusta a una ecuación monoexponencial de la que puede calcularse el valor de la constante observable del proceso de disociación (kobs). El residual muestra la posible desviación existente en cada punto que tal y como se observa, es una desviación muy pequeña. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 26 Representando todas las curvas de disociación obtenidas: Debido a que kobs=koff y realizando una aproximación media de todos los valores, se obtiene un valor de koff= 3.45±0.02 s-1 -ENSAYO DE ASOCIACIÓN [EDTA]mM kobs(s-1) 0,5 3,5 0,75 3,5 1 3,5 2,5 3,3 Figura 4.2: Representación gráfica en la que se observa la disminución de la fluorescencia con el tiempo provocada por un cambio de conformación del módulo debido a la pérdida del Ca2+. LR5 5 μM, Acetato 10 mM, NaCl 150 mM. Se observa como en ausencia de EDTA no hay disminución de señal. Tabla 4.1: Valores de kobs obtenidos para cada concentración de EDTA. Se observa como kobs y por tanto koff permanecen constantes independientemente de la concentración de EDTA añadida kobs Figura 4.3: Curva de asociación obtenida para LR5-Ca2+ con una concentración de Ca2+ 25 µM. El ajuste corresponde a una ecuación monoexponencial a partir de la que se calcula el valor de la constante observable del proceso (kobs). Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 27 Representando todas las curvas de asociación en una misma figura: La reacción del módulo LR5 con Ca2+ tiene lugar de forma muy rápida, en pocos milisegundos (figura 4.4). El tiempo muerto del aparato hace que al realizarse las cinéticas se pierdan los primeros milisegundos de las curvas obtenidas, y este hecho, se hace más notorio en cinéticas rápidas como la anterior. Las concentraciones de Ca2+ representadas en la figura y en la tabla corresponden a las concentraciones reales presentes en la disolución. Estas se obtienen al realizar la diferencia entre la concentración colocada en la jeringa menos la de EDTA previamente añadida (50 μM) y, todo ello dividido entre dos, ya que se realiza una mezcla equitativa de catión y proteína. [Ca2+]μM kobs (s-1) 12.5 88.4 25 122.8 31.25 137.2 37.5 164.7 50 213.3 62.5 264 75 290.3 100 315.2 167.5 330.7 Figura 4.4. Curvas obtenidas de los ensayos de asociación de LR5 en condiciones endosomales (pH 5.5). Se observa el aumento de fluorescencia con el tiempo, obteniéndose curvas más pronunciadas según se aumenta la concentración de catión. La concentración de LR5 es de 5 μM en Acetato 10 mM, NaCl 150 mM y con EDTA 50 μM. Tabla 4.2: kobs obtenidos con concentraciones crecientes de Ca2+. kobs aumenta según lo hace la concentración de catión hasta que se alcanzan concentraciones saturantes. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 28 Gráfica 4.1: Representación gráfica kOBS vS [Ca2+]. Se observa una dependencia lineal inicial al principio de la gráfica, que se pierde al alcanzar concentraciones saturantes. Obtenidos los valores de kOBS para cada concentración de Ca2+, los datos se representan en la siguiente gráfica. Se observa al inicio de la gráfica una dependencia lineal de la señal obtenida con la concentración de Ca2+, que se curva al alcanzar concentraciones saturantes. Este intervalo lineal se utiliza para el cálculo de las constantes cinéticas, tal como se ha explicado en el apartado 3.1.2.1.1, mediante el ajuste a un modelo cinético de pseudo-primer orden. Según se ha explicado anteriormente,   offonobs kCakk  2 por lo que teniendo en cuenta los valores obtenidos del ajuste a la recta: kon= 3,53 ± 0.15 μM-1 s-1 koff= 38.1 ± 6.44 s-1 Gráfica 4.2: Representación gráfica kobs vS [Ca2+] de la parte lineal anterior, utilizada para el cálculo de las constantes cinéticas del proceso. 020 40 60 80 100 50 100 150 200 250 300 350 kobs Calcio (uM) Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 29 kon= 3.53 ± 0.15 μM-1 s-1 koff= 3.45 ± 0.02 s-1 Kd: 0.98±0.1 μM Tal y como se observa en estos últimos resultados, el valor de off k no corresponde con el obtenido para el ensayo de disociación. Una causa a esta desviación se encuentra en la pérdida del inicio de la reacción como consecuencia del tiempo muerto del equipo, que da como resultado un incompleto ajuste de la curva cinética y por tanto, desviaciones en los valores de kobs . Otro motivo reside en el hecho de que en este caso, para obtener curvas cinéticas de las que puedan extraerse datos, es necesario trabajar con bajas concentraciones de Ca2+. En este caso la aproximación de pseudo-primer orden en la que     LRcatión  no es del todo correcta y presenta algunas inexactitudes. Es por este motivo que también se realizan los ensayos de disociación en los que el cálculo de la koff resulta mucho más preciso. El cálculo y valor de kon, sí tienen lugar de forma más precisa ya que se determina por la pendiente de la recta y no a partir de un punto, por lo que los resultados obtenidos de los ensayos de asociación corresponden con valores verdaderos, Finalmente como resultado de ambos ensayos LR5-Ca2+, los valores obtenidos son: El cociente entre los dos anteriores da como resultado el valor de la constante de equilibrio de disociación para este proceso: Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 30 Ensayos de asociación y disociación LR5-Mg2+ pH 7 -ENSAYO DE DISOCIACIÓN Como kobs= koff, se obtiene una constante cinética para el proceso de disociación LR5-Mg2+, koff: 1.17 ± 0.02 s-1 -ENSAYO DE ASOCIACIÓN [EDTA]mM kobs(s-1) 2 1.20 4 1.15 5 1.17 [Mg2+]μM kobs (s-1) 11.5 1.89 36.5 2.29 61.5 2.66 111.5 3.14 236.5 4.17 361.5 4.90 486.5 5.91 1236.5 6.64 Tabla 4.3: Valores de kobs obtenidos para cada concentración de EDTA. Figura 4.6: Curvas cinéticas de asociación obtenidas para cada concentración de Mg2+.LR5 5 μM, Pipes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 100 mM. Tabla 4.4: Valores de kobs obtenidos para cada concentración de Mg2+. Figura 4.5: Curvas de disociación obtenidas para cada concentración de EDTA.LR5 5 μM, Pipes 10 mM, NaCl 150 mM Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 31 kon= 0.012± 0.0018 μM-1 s-1 koff= 1.81± 0.078 s-1 Kd: 151 ± 6.49 μM[33] Al igual que para el Ca2+, los valores de kobs se representan frente a la concentración de Mg2+ y se extrae la parte lineal para el cálculo de las constantes cinéticas (gráfica 4.3). Aplicando la ecuación de pseudo-primer orden: Ensayos de asociación y disociación LR5-Mg2+ pH 5.5 -ENSAYO DE DISOCIACIÓN koff: 3.46 ± 0.3 s-1 [EDTA]mM kobs(s-1) 2 3.5 3 3.48 4 3.45 5 3.4 Gráfica 4.3: Representación gráfica kobs vS [Mg2+] de la parte lineal Figura 4.7: Curvas de disociación obtenidas para cada concentración de EDTA.LR5 5 μM, Acetato 10 mM, NaCl 150 mM Tabla 4.5: Valores de kobs obtenidos para cada concentración de EDTA. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 32 kon= 0.050± 0.00019 μM-1 s-1 koff= 4.73± 0.082 s-1 Kd: 909.6 ± 15.8μM[33] -ENSAYO DE ASOCIACIÓN Representando los valores de kobs frente a la concentración de Mg2+: Del ajuste de la gráfica 4.4 se extrae: [Mg2+]μM kobs (s-1) 111.5 5.19 236.5 5.98 361.5 6.64 486.5 7.13 736.5 8.40 1236.5 10.63 Figura 4.8: Curvas cinéticas de asociación obtenidas para cada concentración de Mg2+.LR5 5 μM, Pipes 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 100 mM. Tabla 4.6: Valores de kobs obtenidos para cada concentración de Mg2+. Gráfica 4.4: Representación gráfica kobs vS [Mg2+] de la parte lineal Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 33 RESULTADOS PARA LR5 kon(μM-1 s-1) koff (s-1) KD (µM) Ca2+ Mg2+ Ca2+ Mg2+ Ca2+ Mg2+ pH 7 2.45* 0.012 1.33* 1.17 0.54* 151 pH 5.5 3.53 0.050 3.45 3.46 0.98 909 Tabla 4.7: Resumen de valores de constantes cinéticas de asociación, disociación y constante de equilibrio de disociación obtenidas para cada catión en distintas condiciones de pH. *Datos correspondientes a ensayos anteriores llevados a cabo en el grupo. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 40 kobs LR5= 1.57±0.03 s-1 kobs LR4=4.69± 0.09 s-1 Ensayos de disociación LR45-Ca2+ pH 5.5 ENSAYOS DE DISOCIACIÓN koff LR5= 5.03±0.1 s-1 koff LR4=12.16± 0.24 s-1 Se realizaron ensayos de asociación del tándem LR4-5 a pH 5.5. Sin embargo, la gran diferencia de afinidades que existe entre los dos módulos LR4 y LR5 dificulta enormemente el ajuste de las curvas cinéticas que se obtienen. De la misma forma resulta complicado el análisis por técnicas termodinámicas tales como fluorescencia e ITC, y resulta complicado obtener resultados fiables. Este problema se está tratando de solucionar de forma que puedan obtenerse resultados que reflejen dicha interacción. [EDTA]mM kobs LR5(s-1) kobs LR4(s-1) 0.25 4.68 12.66 0.75 5.28 11.31 4.75 5.14 12.52 Figura 4.18: Curvas de disociación LR45-Ca2+ pH 5.5. LR45 3 µM, Pipes 10 mM, NaCl 150 mM, Ca2+ 0.25 mM, pH 7. Tabla 4.12: Valores de kobs obtenidos para cada una de las concentraciones de EDTA. Se obtienen valores de kobs para los dos módulos tras el ajuste a una exponencial doble Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 41 Ensayos de asociación y disociación LR45-Mg2+ pH 5.5 -ENSAYOS DE DISOCIACIÓN Realizadas las cinéticas LR4-Mg2+ sin observar interacción entre ambas, se procede a ensayar la interacción del tándem LR45-Mg2+. Validando la hipótesis anterior, las curvas cinéticas de asociación obtenidas se ajustan a una ecuación monoexponencial con el cálculo de una única kobs correspondiente a la asociación del Mg2+ al módulo LR5. Representando todas las curvas de disociación obtenidas con cada concentración de EDTA: [EDTA]mM kobs LR5(s-1) 2 5.34 5 5.21 7.5 5.53 10 5.44 Figura 4.19: Cinética de disociación LR45- Mg2+ obtenida a una concentración de EDTA 10 mM. El ajuste se realiza a una ecuación monoexponencial a pesar de los dos posibles centros de coordinación con el catión. Figura 4.20: Curvas de disociación LR45-Mg2+ pH 5.5 LR4-5 3 µM, Acetato 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0.1 mM, Mg2+ 0.25mM Tabla 4.13: kobs obtenidos para cada una de las concentraciones de EDTA empleadas en el ensayo tras el ajuste a un sistema monoexponencial. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 42 koff= 5.38 ± 0.11 s-1 ENSAYOS DE ASOCIACIÓN Representando las curvas de asociación con cada concentración de Mg2+ [Mg2+]μM kobs (s-1) 75 4.75 150 5.22 225 5.57 350 6.16 475 7.22 Figura 4.21: Curvas de asociación LR45-Mg2+ pH 5.5. LR4-5 3 µM, Acetato 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 50 µM. Tabla 4.14: kobs obtenidos para cada concentración de Mg2+ empleada en el ensayo tras el ajuste a un sistema monoexponencial. Figura 4.21: Cinética de asociación LR45- Mg2+ obtenida a una concentración de Mg2+ 225 μM. El ajuste se realiza a una ecuación monoexponencial Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 43 Gráfica 4.7: Representación kobs frente a la concentración de Mg2+ kon= 0.052 ± 0.0002 μM-1 s-1 koff= 4.39 ± 0.04 s-1 Kd: 844.23± 7.69 μM * Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 44 4.2. Purificación y caracterización LR 1-7 4.2.1. Purificación LR1-7 Se obtuvo la proteína pura en pequeñas cantidades, tras el proceso completo de purificación. La figura 4.22 muestra lo obtenido tras cada una de las etapas de la purificación. 1-.Marcador Peso Molecular 4-. Retenido columna HA 2-. No concentrado 5-. No retenido columna HA 3-. Concentrado 6-7-8. LR1-7 pura tras exclusión molecular El cromatograma de la figura 4.23 muestra el último paso de la purificación del que se obtiene la proteína pura (V: 140 ml). Los picos estrechos son burbujas de aire, los picos a 110 ml corresponde a agregados y los de 125 ml a otra proteína que secreta P.pastorys. 1 2 4 3 5 6 Figura 4.22: Bandas correspondientes a la SDS-PAGE realizada tras la purificación del LR1-7. Figura 4.23: Cromatograma de exclusión molecular. El pico que corresponde al módulo LR1-7 se observa en un volumen aproximado de 140 ml. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 45 4.2.2. Caracterización preliminar 4.2.2.1. Espectrometría de masas (EM) Los resultados por EM realmente verifican que la proteína purificada corresponde al dominio de unión a ligando. El tratamiento con tripsina da lugar a fragmentos cuyo peso molecular se compara con bases de datos del NCBI asignando correspondencia con LR1-7. La masa total confirma que la proteína purificada corresponde a LR1-7.Por otro lado, tanto la incubación con VP como con AEMTS, resultó sin diferencias respecto a la muestra purificada sin tratar, lo que se traduce, en la ausencia de cisteínas libres en la proteína. Figura 4.24: Resultados de la espectrometría de masas demuestran que la proteína purificada es realmente la correspondiente a los módulos LR1-7. Figura 4.25: Resultados de EM muestran que no se encuentran cisteínas libres en la proteína purificada, al no verse aumentada su masa tras la incubación con VP y AEMTS. Se obtienen tres picos distintos porque la señal de exportación de la proteína al exterior de la célula puede procesarse en tres sitios indistintamente (anexo II) Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 46 4.2.2.2. Caracterización espectroscópica - Caracterización mediante Absorbancia UV-visible. En el espectro de la figura 4.27, se observa un pico de absorción a 280 nm, correspondiente a los residuos aromáticos presentes en la proteína y principalmente del triptófano. También se observa la fuerte absorción del enlace peptídico que presenta su máximo en torno a los 225 nm. Figura 4.26: Superposición de los resultados de la proteína tratada con VP con la proteína sin tratar. No se observan diferencias en la relación m/z entre ellas. Figura 4.27: Figura 4.27: Espectro de absorción de LR17 con un máximo a 280 nm, característico de los residuos aromáticos, y a 225 nm, el pico del enlace peptídico Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 47 Figura 4.28: Espectro de emisión de LR17 con su máximo a 350 nm correspondiente a los residuos de Triptófano presentes en la proteína. Figura 4.29: Espectros de emisión de LR17. En negro, emisión de los Trp presentes, rojo, espectro tras la adicción de EDTA, y en azul señal tras la adicción posterior de Ca2+. Ensayos realizados en Pipes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7. - Caracterización por fluorescencia En la caracterización por fluorescencia, se observa en primer lugar el espectro completo de emisión (300-800 nm). Presenta un pico máximo a una longitud de onda de 350 nm que corresponde a la señal proveniente de los residuos de triptófano (Trp) presentes en la proteína. Por otro lado, en la figura 4.29 se muestran los primeros ensayos de unión a Ca2+ realizados con la proteína purificada. Por un lado, al igual que en la figura 4.28 se observa la emisión de los triptófanos de la proteína purificada (negro). Tras la adicción de EDTA, que quela el Ca2+ que se encontraba unido a la proteína pura, se observa una disminución de la señal como consecuencia del cambio de conformación y entorno de los residuos de triptófano (rojo). Por último, la posterior adicción de Ca2+ provoca un aumento de la intensidad hasta valores similares a los obtenidos inicialmente en los que la proteína pura también tenía Ca2+ unido. 4.2.2.3 Desnaturalizaciones térmicas seguidas por fluorescencia Los resultados correspondientes a las desnaturalizaciones térmicas seguidas por fluorescencia a pH 7 y pH 5.5 se muestran en las figuras 4.30 y 4.31. En ambas se muestra la bajada de fluorescencia como consecuencia del cambio de entorno de los residuos aromáticos y el apantallamiento de la señal por parte del solvente. El cálculo de las constantes termodinámicas de los procesos resulta altamente complicado debido a la baja cooperatividad existente entre los módulos. Estos datos podrán determinarse cuando se realicen análisis Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 48 complementarios mediante otras técnicas (dicroísmo circular, calorimetría…) y se realice un ajuste global de todo ellos. Figura 4.30: Desnaturalización térmica de LR17 en Pipes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7. Figura 4.31: Desnaturalización térmica de LR17 en Acetato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5.5. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 49 CAPÍTULO 5 Discusión 5.1. Unión de cationes a LR4, LR5 y LR4-5 5.1.1. LR5 Los resultados reflejan grandes diferencias en los valores de kon obtenidos para el Ca2+ y Mg2+, presentando LR5 una kon notablemente superior para el Ca2+y con un cambio más notorio en condiciones endosomales. . Esto puede deberse al mayor valor de entalpía de desolvatación para el Mg2+, que al ser más pequeño, requiere más energía para arrebatarle las moléculas de agua con las que se coordina. LR5 presenta similar koff para los dos iones, presentándose cambios más notorios en función del pH. Esto refleja como era previsible aunque no estaba confirmado, que ambos comparten el mismo centro de unión a cationes, coordinándose con seis residuos de LR5, lo cual resulta novedoso ya que el Mg2+ es capaz de adoptar también una configuración coordinándose con 8 residuos. Los resultados obtenidos del proceso de disociación con LR5 y con el resto de módulos, confirman también la hipótesis inicial que sostiene que en los ensayos de disociación el EDTA no quela el Ca2+ o Mg2+ unido a la proteína sino el que se encuentra libre en disolución, ya que no las koff no varían con la concentración de EDTA. Todos los resultados anteriores han permitido el cálculo de la constante de equilibrio de disociación, KD, que refleja la afinidad del módulo por cada uno de los cationes. LR5 presenta alta afinidad por el Ca2+ tanto a pH 7 (KD= 0.54 µM) como a pH 5.5 (KD= 0.98 µM) tal como se conocía de la caracterización termodinámica*. La cinética nos muestra que los procesos de asociación y disociación, en general, son muy rápidos si se comparan con el tiempo de internalización y liberación de las LDL (20 min aproximadamente) por lo que, en condiciones endosomales, la sustitución del Ca2+ por Mg2+ en LR5 podría producirse sin que fuera necesaria la liberación de las LDL Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 56 [13] Folding, calcium binding, and structural characterization of a concatemer of the first and second ligand-binding modules of the low-density lipoprotein receptor. Bieri S, Atkins AR, Lee HT, Winzor DJ, Smith R, Kroon PA. Biochemistry. 1998 Aug 4;37(31):10994-1002. [14] Backbone dynamics of a module pair from the ligand-binding domain of the LDL receptor. Beglova N, North CL, Blacklow SC. Biochemistry. 2001 Mar 6;40(9):2808-15 at Struct Biol. 2001 Jun;8(6):499-504. 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ISBN: 0-306-48390-4. [39] Isothermal titration calorimetry. Velázquez-Campoy A, Ohtaka H, Nezami A, Muzammil S, Freire E.. (2004). Curr Protoc Cell Biol Chapter 17: 17.8. Review. [40] The Structure, Dynamics, and Binding of the LA45 Module Pair of theLow-Density Lipoprotein Receptor Suggest an Important Role forLA4 in Ligand Release. Miklos Guttman and Elizabeth A. Komives (2011). Biochemistry 50; 11001-11008. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 58 Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 59 ANEXO I Secuencias y propiedades de LR4, LR5, LR45 y LR17 LR5 10 20 30 40 DSSPCSAFEF HCLSGECIHS SWRCDGGPDC KDKSDEENCA Número de aminoácidos: 40 Peso molecular: 4353.6 Formula: C176H259N51O67S6 Número total de átomos: 559 Coeficientes de extinción: Los coeficientes de extinción están en unidades de M-1 cm-1, a 280 nm medidas en agua. Coeficiente de extinción 5875 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.349, asumiendo que todos los residuos de Cys forman cistinas Ext. coefficient 5500 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.263, asumiendo que todas las Cys se encuentran reducidas LR4 10 20 30 40 VLTCGPASFQ CNSSTCIPQL WACDNDPDCE DGSDEWPQRC Número de aminoácidos: 40 Peso molecular: 4392.7 Formula: C181H268N50O66S6 Número total de átomos: 571 Coeficiente de extinción: Los coeficientes de extinción están en unidades de M-1 cm-1, a 280 nm medidas en agua Coeficiente de extinción 11375 Abs 0.1% (=1 g/l) 2.590, asumiendo que todos los residuos de Cys forman cistinas Coeficiente de extinción 11000 Abs 0.1% (=1 g/l) 2.504, asumiendo que todas las Cys se encuentran reducidas. Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 60 LR45 VLTCGPASFQ CNSSTCIPQL WACDNDPDCE DGSDEWPQRC RGLYVFQGDS SPCSAFEFHC 70 80 LSGECIHSSW RCDGGPDCKD KSDEENCA Número de aminoácidos 88 Peso molecular: 9649.4 Formula: C401H589N113O142S12 Número total de átomos: 1257 Coeficiente de extinción: Los coeficientes de extinción están en unidades de M-1 cm-1, a 280 nm medidas en agua Coeficiente de extinción 18740 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.942, asumiendo que todos los residuos de Cys forman cistinas Coeficiente de extinción 17990 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.864, asumiendo que todas las Cys se encuentran reducidas LR17 10 20 30 40 50 60 KREAEAAVGDRCERNE FQCQDGKCIS YKWVCDGSAE CQDGSDESQE TCLSVTCKSG DFSCGGRVNR 70 80 90 100 110 120 CIPQFWRCDG QVDCDNGSDE QGCPPKTCSQ DEFRCHDGKC ISRQFVCDSD RDCLDGSDEA 130 140 150 160 170 180 SCPVLTCGPA SFQCNSSTCI PQLWACDNDP DCEDGSDEWP QRCRGLYVFQ GDSSPCSAFE 190 200 210 220 230 240 FHCLSGECIH SSWRCDGGPD CKDKSDEENC AVATCRPDEF QCSDGNCIHG SRQCDREYDC 250 260 270 280 290 KDMSDEVGCV NVTLCEGPNK FKCHSGECIT LDKVCNMARD CRDWSDEPIK EC Número de aminoácidos: 292 Peso molecular: 32298.3 Formula: C1314H2001N393O474S44 Número total de átomos: 4226 Coeficientes de extinción: Los coeficientes de extinción están en unidades de M-1 cm-1, a 280 nm medidas en agua Coeficiente de extinción 40095 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.241, asumiendo que todos los residuos de Cys forman cistinas Coeficiente de extinción 37470 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.160, asumiendo que todas las Cys se encuentran reducidas Estabilidad e interacciones del dominio de unión del receptor de LDL 61 ANEXO II YPD-Agar Yeast Extract Peptone Dextrose Medium (1 litro) 1. Disolver los siguientes componentes en 900ml de agua 10 g de extracto de levadura 182.2 g de sorbitol 20 g de peptona 2. Añadir 20 g de agar. 3. Autoclavar durante 20 minutes. 4. Añadir 100 ml de 10X D 5. Enfriar solución y añadir 1.0 ml de 100 mg/ml Zeocina. Guardar las places YPD-Agar más Zeocina a 4°C, en oscuridad. La vida media de las placas se encuentra entre 1-2 semanas. BMGY BMMY 1. Disolver 10 g de extracto de levadura, 20 g peptona en 700 ml agua. 2. Autoclavar durante 20 minutos. 3. Enfriar a temperatura ambiente, y añadir la siguiente mezcla: 100 ml 1 M tampón fosfato de potasio, pH 6.0 100 ml de 0X YNB 2 ml 500X B 100 ml 10X glicerol 4. Para BMMY, añadir 100 ml 10X de metanol en lugar of glicerol. 5. Store media at 4°C. The shelf life of this solution is approximately two months.