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Rol de FurC en Anabaena sp. PCC 7120 TRABAJO FIN DE MÁSTER Dirigido por María F. Fillat Curso 2011/2012 ESTHER BROSET BLASCO Máster en Biología Molecular y Celular Rol de FurC Anabaena sp. PCC 7120 RESUMEN La proteína FurC es una de las tres proteínas de la familia Fur (Ferric Uptake Regulator) que posee Anabaena sp. PCC 7120. Esta familia de proteínas es la encargada de regular la homeostasis del hierro, aunque también se ha visto que son capaces de realizar otras funciones. En concreto FurA modula la respuesta de la cinaobacteria al estrés oxidativo y FurB se une inespecíficamente al DNA para protegerlo del daño oxidativo. Sin embargo, FurC es la menos conocida y por ello este trabajo consiste en realizar un estudio de su papel. Para la realización de este trabajo se ha obtenido un mutante de Anabaena sp. 7120 que sobreexpresa FurC (EB2770FurC). También se ha analizado la transcripción de furC en un cultivo de Anabaena WT a distintos tiempos después de retirar el nitrógeno del medio. Y se ha realizado un ensayo de pull-down para determinar a qué proteínas se une FurC. Los resultados fueron que la transcripción de furC se activa en déficit de nitrógeno y que FurC se une a dos proteínas linker que forman parte de los ficobilisomas de Anabaena. Por otro lado, los estudios con el mutante de sobreexpresión de FurC revelaron que EB2770C posee un mayor ratio de ficobiliproteínas/proteínas totales en presencia o ausencia de nitrógeno en el medio de cultivo. Con estos resultados se ha propuesto un modelo de acción de FurC. Este modelo propone que un déficit de ficobiliproteínas aumenta la expresión de FurC, que actúa uniéndose a los ficobilisomas y estabilizándolos. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1 1.1. Las cianobacterias ................................................................................................... 1 1.1.1. Clasificación ...................................................................................................... 1 1.1.2. Características generales .............................................................................. 1 1.1.3. Diferenciación celular y metabolismo de nitrógeno ............................... 2 1.1.4. Ficobilisomas .................................................................................................... 3 1.2. Anabaena sp. PCC 7120 ......................................................................................... 4 1.3. La familia de proteínas Fur .................................................................................... 4 1.3.1. Características generales de las proteínas Fur ....................................... 4 1.3.2. Función y mecanismos de regulación de Fur .......................................... 5 1.4. La proteína FurC de Anabaena sp. PCC 7120 ................................................... 6 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 7 3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 8 3.1. Técnicas de cultivo y cepas empleadas............................................................. 8 3.2. Manipulación de ácidos nucleicos ...................................................................... 9 3.2.1. Extracción de RNA ......................................................................................... 10 3.2.2. Extracción de DNA genómico de Anabaena sp. para PCR de colonia ............................................................................................................................. 11 3.2.3. Retrotranscripción semicuantitativa (RT-PCR) ...................................... 11 3.3. Métodos genéticos ................................................................................................. 12 3.3.1. Transformación mediante choque térmico en E.coli ............................ 12 3.3.2. Conjugación triparental en Anabaena PCC 7120 .................................. 12 3.4. Manipulación de proteínas .................................................................................. 13 3.4.1. Purificación de FurC-GST y GST ................................................................ 13 3.4.2. Extracción de proteínas totales de Anabaena sp. 7120 ....................... 14 3.4.3. Dot-blot.............................................................................................................. 14 3.4.4. Ensayo de Pull-down ..................................................................................... 15 3.5. Métodos analíticos ................................................................................................. 16 3.5.1. Determinación de clorofila ........................................................................... 16 3.5.2. Determinación de carotenoides ................................................................. 17 3.5.3. Determinación de ficobiliproteínas ........................................................... 17 3.5.4. Determinación de proteínas totales .......................................................... 17 3.6. Microscopía ............................................................................................................. 17 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 18 4.1. Análisis de la transcripción de furC en deficiencia de nitrógeno ............. 18 4.2. Ensayo de pull-down ............................................................................................. 19 4.3. Obtención del mutante de sobreexpresión de FurC en Anabaena sp PCC 7120. ........................................................................................................................... 21 4.3.1. Conjugación triparental ................................................................................. 21 4.3.2. Comprobación de la sobreexpresión de FurC ........................................ 23 4.4. Caracterización del mutante EB2770FurC ....................................................... 24 4.4.1. Curva de crecimiento ..................................................................................... 24 4.4.2. Comportamiento en deficiencia de nitrógeno ........................................ 28 4.4.3. Análisis de la transcripción de HetR y NtcA. .......................................... 33 4.5. Modelo de acción de FurC ................................................................................... 34 5. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 35 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 36 INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Las cianobacterias 1.1.1. Clasificación Las cianobacterias anteriormente clasificadas como algas, ahora constituyen uno de los reinos Bacteria. En cuanto a su significado evolutivo se piensa que estos microorganismos fueron los primeros seres que, siendo aerobios, contribuyeron, gracias a la fotosíntesis, a la formación de la actual atmósfera oxigénica. Por otra parte, las cianobacterias ejercieron un papel fundamental en el desarrollo de los eucariotas fotosintéticos porque son los precursores de los cloroplastos. Su forma de división y su morfología son muy variadas. Atendiendo a esto se pueden clasificar en cinco secciones (Cavalier-Smith 2002): I. Chroococcales: Unicelulares aisladas o agregados celulares que se dividen por fisión binaria o gemación II. Pleurocapsales: se reproducen por formación de pequeñas células esféricas llamadas baeocitos producidos por fisión múltiple. III. Oscillatoriales: filamentosas que se dividen por fisión binaria en un plano único no formadoras de heterocistos (especializadas en la fijación de nitrógeno) IV. Nostocales: células filamentosas que producen heterocistos, como Anabaena utilizada en este trabajo. V. Stigonematales: células filamentosas formadoras de heterocistos y ramificaciones. 1.1.2. Características generales Las características más importantes de las cianobacterias son: Tamaño variable, desde el típico de una bacteria (0,5-1 µm) hasta unos 60 µm. Pared celular similar a la de las bacterias Gram negativas. Algunas producen envueltas de mucina, vainas, etc., que reúnen a muchas células o filamentos. Fotótrofas obligadas, aunque algunas especies asimilan compuestos orgánicos como glucosa y acetato en presencia de luz y otras lo pueden hacer sin luz (Stal & Moezelaar, 1997). Muchas pueden producir neurotoxinas como las microcistinas. Sólo poseen una clase de clorofila, la clorofila a. Poseen pigmentos fotosintéticos (ficobilinas), que se asocian con ficobiliproteínas formando los ficobilisomas. Estos ficobilisomas actúan uniéndose al fotosistema II INTRODUCCIÓN 2 (por la parte externa del tilacoide) para captar la energía luminosa ejerciendo como antenas. Algunas especies toleran muy bien los ambientes extremos. Muy ubicuas, existen prácticamente en todos los suelos y aguas. Son muy eficaces en el establecimiento de relaciones simbióticas, sobre todo con líquenes protozoos y hongos. Además, las que fijan nitrógeno forman asociaciones con diversas plantas. 1.1.3. Diferenciación celular y metabolismo de nitrógeno Como se ha dicho, algunas son capaces de diferenciarse formando hormogonios, akinetos o heterocistos en respuesta a cambios ambientales. Los hormogonios son cadenas cortas y pequeñas, poseen vacuolas y por ello pueden moverse flotando para colonizar zonas más iluminadas, por el contrario no pueden fijar nitrógeno. El desarrollo de hormogonios se produce en respuesta al déficit de nutrientes o de iluminación. Son la forma infectiva de la cianobacteria por lo que pueden ser importantes en el proceso de simbiosis. Los akinetos son células grandes con gruesa pared celular y abundantes gránulos de reserva. Se forman ante malas condiciones ambientales como la baja temperatura o falta de energía. Actúan como formas de resistencia y pueden volver a germinar ante condiciones favorables. Sólo las cianobacterias formadoras de heterocistos pueden desarrollar los akinetos; se cree que los heterocistos se forman a partir de los akinetos (Meeks & Elhai, 2002). Los heterocistos se diferencian en ausencia de nitrógeno combinado. (Figura 1.1.3.) En ellos se lleva a cabo la fijación de N2 atmosférico gracias a la nitrogenasa que lo reduce a NH4+. Como esta enzima se inactiva en presencia de oxígeno, en estos heterocistos se crea un ambiente microaerobio (Golden & Yoon, 2003) que permite esta fijación. Para la creación de este entorno se forman gruesas envueltas celulares que impiden la difusión de gases, la pérdida del fotosistema II que evita el desprendimiento de oxígeno fotosintético y expresión de superóxidodismutasa que elimina radicales resultantes de la reducción del oxigeno en el fotosistema I. Los heterocistos también tienen débil pigmentación por degradación de ficobiliproteínas que se usan como precursores para la síntesis proteica. Además, el heterocisto maduro carece de ribulosa bisfosfato carboxilasa (enzima ciclo de Calvin), por lo que carece de la ruta principal de fijación de CO2. Estos profundos cambios morfológicos y metabólicos que se dan en la diferenciación a heterocisto están fuertemente controlados por reguladores INTRODUCCIÓN 3 Figura 1.1.3.- Tipos celulares en cianobacterias formadoras de heterocistos. (a) Filamentos de Anabaena cylindrica con heterocistos (flecha negra) y akinetos (aki). (b) Filamentos de Nostoc sp. PCC 9203 con células vegetativas y heterocistos, y un hormogonio (hrm; notar el pequeño tamaño de estas células). (Adaptado de Flores & Herrero 2010) transcripcionales, entre ellos destaca la proteína NtcA. Su estructura cristalina ha sido resuelta para Anabaena sp. PCC7120 (Wisen et al., 2004). NtcA es necesaria para la formación de heterocistos y parece ser que actúa sensando el balance C-N en la célula gracias a la molécula de 2-oxoglutarato (Tanigawa et al., 2002). Según sea el nivel de 2-oxoglutarato, NtcA modula la transcripción de genes formadores de heterocistos (hetR) y responsables del metabolismo del nitrógeno (nifHDK; genes estructurales de la nitrogenasa). (Herrero et al., 2001) 1.1.4. Ficobilisomas Los ficobilisomas son complejos proteicos que actúan en la captación de luz y transmisión de energía al fotosistema II. Las ficobiliproteínas que los forman absorben en regiones del visible donde la clorofila a no es muy eficiente. Esto hace que las cianobacterias puedan sobrevivir en zonas poco luminosas. Los ficobilisomas de Anabaena sp. PCC 7120 están compuestos por un core o núcleo y una “envuelta” o rod. El core está formado por aloficocianina y el rod por ficocianina que se une al core y ficoeritrocianina. (Ducret et al.; 1996) La luz es captada por la ficoeritrocianina que tiene el pigmento de más alta energía. Esta energía se transfiere luego a los pigmentos de menor energía, ficocianina y aloficocianina. Por último se transfiere a la clorofila a del fotosistema II al que se une el ficobilisoma. (Figura 1.1.4.) MATERIALES Y MÉTODOS 10 3.2.1. Extracción de RNA Consideraciones previas Fue necesario minimizar las contaminaciones con RNasas porque son muy estables y activas y con pequeñas cantidades se destruye el RNA. Para evitar esta destrucción fue imprescindible el uso de guantes sin polvo, lavar las superficies cercanas al área de trabajo con NaOH 0,4 N. Usar agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato), que es un inhibidor de RNasas ya que reacciona rápidamente con los grupos amino. Otra consideración fue el uso de material estéril autoclavado e incluso comercial libre de RNasas. Para el aislamiento de RNA de cianobacterias se sigue el siguiente protocolo (adaptado de Ausubel et al., 2000): Toma de muestra Se recogieron las células por centrifugación a 4000 rpm, 5 min a 4ºC. Se resuspendió el pellet en 600 µl de Tris 50 mM (pH 8), EDTA 100 mM y 130 µl de cloroformo. Se incubaron 3 min en hielo, se centrifugaron 5 min a 13000 rpm. Se eliminaron la fase acuosa y orgánica y el pellet se congeló con N2 líquido y se guardó inmediatamente a -80ºC. Esta congelación con N2 líquido sirve para parar la maquinaria de transcripción, si se congela poco a poco se empiezan a transcribir genes de respuesta al frío cambiando las condiciones que nos interesan. Extracción de ácidos nucleicos Se resuspendió la muestra obtenida en la etapa anterior en 300 µl de buffer de resuspensión (sacarosa 0.3 M, acetato de sodio 10 mM pH 4.5), 100 µl de Na2- EDTA 250 mM pH 8, 400 µl de buffer de lisis (SDS 2%, acetato de sodio 10 mM pH 4.5) y 1 ml de fenol ácido a 65ºC. Se homogeneizó con un vortex y se incubó a 65ºC 2.5 min. Se repitió este paso. Se centrifugó 5 min a 13000 rpm. Se recogió la fase acuosa y se extraía con 1 ml deTrizol y 0.2 ml de cloroformo. Se volvió a extraer con un volumen de cloroformo. Se añadió a la fase acuosa 2 volúmenes de isopropanol y se sumergió en N2 líquido. Se centrifugó 30 min a 14000rpm y 4ºC. Se descartó el sobrenadante y lavó el pellet casi transparente en EtOH al 70%. MATERIALES Y MÉTODOS 11 Tratamiento con DNasaI: Se resuspendió el pellet en 180 µl de H2O–DEPC, 20 µl de buffer de DNasa y 2 µl de DNasaI. Se incubó 1 hora a 35ºC. Se ajustó el volumen a 400 µl con H2O–DEPC, se extrajo con fenol: cloroformo (1:1) y luego con cloroformo. Se añadió a la fase acuosa 1/5 V de LiCl 10 M y 2 V de EtOH absoluto. Se sumergió el eppendorf en N2 líquido y se centrifugó 30 min a 14000 rpm y 4ºC. Se lavó el pellet con EtOH al 70%. Se resuspendió el pellet en 20 µl de H2O–DEPC para un volumen inicial de 30 ml de cultivo. Sobre este RNA se realizó una PCR para comprobar que no hubiera restos de DNA genómico. Finalmente, se comprobó la integridad de RNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. 3.2.2. Extracción de DNA genómico de Anabaena sp. para PCR de colonia Se cogió con un asa de platino un poco de cultivo de una placa y se resuspendió en 200 µl de Tris 1mM pH 8, EDTA 1mM, tritón 1%. Se incubó 4 min a 95ºC. Se realizaron tres extracciones con cloroformo (1:1) y se realizó una PCR cogiendo 20 µl de este DNA como molde en un volumen final de reacción de 50 µl. 3.2.3. Retrotranscripción semicuantitativa (RT-PCR) Esta técnica permite, de un modo semicuantitativo, detectar la concentración relativa de transcritos en diferentes muestras de RNA. Para ello, lo primero que se hace es obtener cDNA a partir de una muestra de RNA (retrotranscripción): Se incubaba aproximadamente 1 μg de RNA con 150 ng de primer inespecíficos (Invitrogen, permiten la obtención de cDNA de cualquier mRNA de la muestra) y 1 μl de tampón de hibridación 10x (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1mM, KCl 150mM (1x)). Esto se llevaba a un volumen final de 10 μl con H2O-DEPC y se incubaba 10 min a 85ºC (desnaturalización) y luego 1 h a 50ºC (hibridación de cebadores) en un termociclador. Se añadía a la mezcla anterior 2 μl de dNTP 2.5 mM, 2 μl de DTT 0.1 M, 1 μl de Retrotranscriptasa 200 U (Invitrogen), 4 μl de tampón comercial 5x y 1 μl de H2O- DEPC. Se incubaba 1h a 47ºC (extensión cebadores), 15 min a 75ºC (detención reacción) y 24h a 4ºC. MATERIALES Y MÉTODOS 12 Sobre este cDNA se realizaba una PCR usando los oligos rnpB, que es un gen “Housekeeping”, cuyo nivel de transcripción no varía cuando cambian las condiciones celulares. El número de ciclos usados fue 23 (ciclo de fase exponencial de PCR para este gen). La cantidad de cDNA fue variando hasta obtener la misma intensidad de banda en un gel de agarosa del 1% para todas las muestras. Tras esto, se realizó una PCR con los oligos del gen a analizar con 30 ciclos (ciclo exponencial) y con la misma cantidad o proporcional de cDNA usada para igualar el housekeeping. 3.3. Métodos genéticos 3.3.1. Transformación mediante choque térmico en E.coli Se llevó a cabo una transformación en la cepa E.coli DH5α para obtener plásmidos en gran cantidad para realizar la clonación y conservar el constructo creado. En la cepa BL21 (DE3) se transformó para realizar la sobreexpresión de la proteína GST- FurC o GST. El proceso consiste en adicionar 1-10 µl de DNA a 200 µl de células competentes descongeladas en baño de hielo, mezclar suavemente e incubar 30 minutos en hielo. Tras esto, se realiza un choque térmico de 90 segundos a 42ºC y 1 minuto en hielo. Se adicionan 800 µl de LB estéril sin antibiótico y se incuba durante 45 minutos. Se transfieren 200 µl del cultivo a una placa de LB con antibiótico, el resto de cultivo se centrifuga, se desecha el sobrenadante dejando unos µl; se resuspende y se siembra en otra placa de LB con antibiótico. Estas placas se incuban O/N a 37ºC. 3.3.2. Conjugación triparental en Anabaena PCC 7120 La transferencia de DNA a Anabaena sp.es un proceso difícil debido a su gruesa pared celular y a que es un bacteria filamentosa. Se han descrito varios métodos, pero el más eficaz es la conjugación triparental usada en este trabajo y descrita por Peter Wolk (Elhai y Wolk, 1988b), mejorado en 1997 por el descubrimiento de enzimas de restricción de Anabaena sp. Estas enzimas disminuían la eficiencia de la conjugación (Elhai et al., 1997) por lo que se decidió usar cepas de E.coli con metilasas para estos sitios y así aumentar la eficiencia. El proceso es el siguiente: Se cultivaban toda la noche las estirpes de E.coli que se iban a usar: -- E.coli ED8654; contiene el plásmido pRL443 con los genes necesarios para la formación del pili conjugativo. -- E.coli cpb1893; que contiene el plásmido pAM2770FurC (el plásmido de carga queremos introducir en Anabaena) y el pRL623 que contiene las metilasas de los MATERIALES Y MÉTODOS 13 sitios de restricción AvaI, II y III de Anabaena y que metilan el plásmido a transferir para que no sea degradado. El plásmido pRL623 también contiene el gen mob que codifica para la proteína responsable de cortar la secuencia bom u oriT; secuencia de movilización. Se refrescaban los cultivos anteriores en fase estacionaria al 2.5 % en LB con el respectivo antibiótico y se incubaban 2.5 horas. Se recogían las células por centrifugación y se lavaban dos veces con LB estéril y se resuspendían en unos 60 µl de LB. Se tenía especial cuidado con la cepa ED8654 para no romper el pili. Se mezclaban las dos cepas de E.coli durante 2 horas a Tª ambiente sin agitación. En este paso la cepa ED8654, le transfiere el plásmido que codifica para el pili a la cpb1893. Se concentraba un cultivo de Anabaena PCC 7120 en fase de crecimiento exponencial y se medía la cantidad de clorofila. Se añadió el equivalente de células Anabaena sp. a 3 µg de clorofila a la mezcla de E.coli anterior. Se ponía un filtro de nitrocelulosa (Millipore) estéril sobre una placa de medio BG11+5% LB sólido. Se extendía la mezcla de conjugación del paso anterior sobre el filtro. Las placas se incubaron 2 horas a 30ºC en oscuridad y 24 horas a 20 μE de intensidad lumínica. A continuación, los filtros se trasladaban a una placa nueva de BG11 sin LB, y a las 24 horas a una placa de BG11 con el antibiótico necesario. Estos filtros se trasladaban a placas frescas de BG11 con antibiótico cada 48 horas para eliminar las colonias que no hubieron adquirido el plásmido de interés. A las tres semanas comenzaron a aparecer las colonias resistentes que se cultivaron en medio sólido sin el filtro. Sobre estas colonias se realizó una PCR con los oligos seq2770 para verificar que tenía el plásmido pAM2770 con el inserto furC. Las colonias positivas se cultivaron en medio líquido BG11 suplementado con neomicina y con 1 mM de CuSO4. Para comprobar la sobreexpresión de furC se realizó una RT-PCR. Sería más adecuado realizar un Western pero no se poseían anticuerpos anti-FurC. 3.4. Manipulación de proteínas 3.4.1. Purificación de FurC-GST y GST Para la purificación de la proteína de fusión GST-FurC y GST se utilizó la cromatografía por afinidad a glutation. La matriz usada fue Glutathione Sepharose 4 Fast FLow de Amersham Biosciencies. MATERIALES Y MÉTODOS 14 El primer paso fue homogeneizar la biomasa que sobreexpresaba la proteína de interés con 5 volúmenes (v/w) de Buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 2 mM, PMSF 3 mM) en baño de hielo. Luego se lisaron las células mediante 10 ciclos de sonicación en baño de hielo. Cada ciclo consta de 45 seg de sonicación (80% de amplitud y 0,5 de ciclo) y 30 seg de descanso. Se centrifugó el lisado 3 veces a 4ºC y 18000 rpm durante 20 minutos recogiendo el sobrenadante y desechando el pellet. Tras esto, se pasó por un filtro de 0,8 µm y luego por otro de 0,45 µm para eliminar restos que obstruyan la columna. Seguidamente, se aplicó el lisado a la columna previamente empaquetada y equilibrada con 5 volúmenes de Buffer de unión (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM). Se continuó pasando Buffer de unión hasta que la absorbancia a 280 nm fue menor de 0,08. Se eluyó con 4 volúmenes del Buffer de elución (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, DTT 1mM, Glutatión 20 mM); se recogieron alícuotas del eluido de aproximadamente 1 ml. Posteriormente, se analizó la presencia de proteína en las alícuotas mediante una electroforesis desnaturalizante de poliacrilamida. La matriz se lavó y se regeneró siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.4.2. Extracción de proteínas totales de Anabaena sp. 7120 Para la extracción de proteínas totales de Anabaena sp. se partía de 50 ml de un cultivo líquido. Se colectó el pellet por centrifugación durante 5 min a 4000 rpm. Dicho pellet se resuspendió en 1 ml de Tris-HCl 50 mM pH 8, PMSF 1mM. Esta suspensión se sometió a 5 ciclos de 45 segundos de sonicado (0.8 amplitud y 0.5 ciclo) y 30 de descanso, en hielo. Se centrifugó el sonicado durante 1 min a 14000 rpm y se recogió el sobrenadante que contenía las proteínas totales. 3.4.3. Dot-blot Un dot-blot es similar a un Western-blot pero lo que se hace es añadir las proteínas directamente en una membrana de PVDF, en vez de transferirlas desde un gel de poliacrilamida. En concreto en este trabajo: Se incubó la membrana de PVDF en metanol 10 segundos y luego 2 min en buffer de transferencia (Tris-HCl 25 mM pH 8.3, glicina 0.2 M, SDS 0.1% y metanol 20%). Esto se hace para que la membrana se vuelva más afín por el agua, ya que es muy hidrofóbica. Se pusieron las gotas (~1 μg de proteína) sobre la membrana de PVDF. MATERIALES Y MÉTODOS 15 La membrana se incubó con TBST (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, Tween- 20 al 0.1%) + 4% de leche desnatada en polvo 1h a Tª ambiente o toda la noche a 4ºC con agitación. Se incubó 1 h a Tª ambiente con el anticuerpo (Anti-FurA o Anti-FurB (Hernández et al., 2002)) 1:1000 en TBST. Se lavó tres veces con TBST durante 5 min. Se incubó 1h a Tª ambiente con el anticuerpo secundario Anti-IgG conjugado con peroxidasa (Sigma A6154) 1:10000 en TBST. Tras esta incubación, se lava la membrana tres veces con tampón fosfocitrato (ácido cítrico 24.3 mM pH 5.3, Na2HPO4 51.4 mM). Se reveló la membrana añadiendo 20 mg de DONS (dioctilsulfosuccinato) disuelto en 5 ml de EtOH y 80 mg de TMB (tetrametilbencidina) disuelto de 5 ml de EtOH. Se añadió 15 μl de H2O2 al 30 % y se dejó desarrollar el color. La reacción se paró sumergiendo la membrana en agua destilada. 3.4.4. Ensayo de Pull-down Para identificar proteínas de unión a FurC se realizó un ensayo de Pull-down, (Horiuchi et al., 2010), (Marteyn et al., 2009) que consistía en mezclar la proteína FurC fusionada a GST con un extracto crudo de Anabaena sp., para que FurC se una a las proteínas más afines. Después se purificó esta mezcla con una matriz de unión a GST. Se cargó la mezcla resultante en un gel de SDS-PAGE para recortar las bandas diferenciales en comparación a un control con GST y otro control con extracto crudo sólo. En concreto se realizó de la siguiente forma: Se colectaron las células de 50 ml de cultivo por muestra de Anabaena sp. en fase exponencial (3-5 µg clorofila/ml) por centrifugación durante 10 min a 4000 rpm. Se lavó este pellet dos veces con PBS, DTT 10 mM, PMSF 1 mM, y se resuspendió en 500 µl por muestra de dicho buffer. Se sonicó durante cinco ciclos de 45 segundos (80% de amplitud y 0,5 de ciclo) con descansos de 30 segundos. Se eliminaron los restos celulares por centrifugación durante 10 min a 14000 rpm y 4ºC. De este sonicado se pasaron 500 µl a un eppendorf como control, 500 µl a otro al que se le añadió 400 µg de GST-FurC y 500 µl a otro al que se le añadió 400 µg de GST. Se incubó 2 h a 4ºC y con agitación suave. Se añadieron 40 µl de matriz Glutathione-Sepharose pre-equilibrada con el buffer anteriormente citado. Se incubaron otras 2 h a 4ºC y agitación suave. MATERIALES Y MÉTODOS 16 Se lavó la matriz con 200 µl de buffer hasta que se observó la matriz de color blanco. Se eluyó con 30 µl del buffer y 10 µl de buffer de carga desnaturalizante. Se hirvió 5 min, se centrifugó a máxima velocidad 5 min y se cargaron 15 µl de la muestra en un gel de SDS-PAGE de 7.5% o del 15%. Tras teñir con Coomasie y desteñir, se buscaron las bandas diferenciales y se mandaron al Servicio Científico Técnico de proteómica del Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Secuenciación peptídica por espectrometría de masas En el citado servicio, las bandas fueron analizadas por espectrometría de masas (MALDI-TOF MS y MS/MS). Con esta técnica lo que se hace es digerir las muestras con tripsina, con ello obtenemos una mezcla de péptidos que son analizados con el espectrómetro de masas 4800plus MALDI-TOF/TOF MSMS y Tempo LC-MALDI (Applied Biosystems). Este espectrómetro ioniza los péptidos, estos se separan en función de su relación carga/masa gracias a un campo magnético. Esta relación carga/masa es detectada por el aparato, que no proporciona como resultado la masa de todos los péptidos resultantes de la digestión con tripsina. Con estas masas se puede averiguar la secuencia aminoacídica de los péptidos que se comparan con los registrados en la base de datos Mascot (www.matrixscience.com). Por comparación y homología, esta base de datos nos da el nombre de la proteína, que con más probabilidad está en nuestra banda. 3.5. Métodos analíticos 3.5.1. Determinación de clorofila Para hacerse una idea del estado de un cultivo de cianobacterias se suele medir la concentración de clorofila. Se utilizó el método descrito por Mackinney en 1941. Para ello se tomaron 200 μl de cultivo, se le añadió 1 ml de metanol, se agitó durante 2 min, y se centrifugó 2 min a 14000 rpm. Se midió la absorbancia del sobrenadante a 665 nm. El valor obtenido se dividió por el coeficiente de extinción (ε= 74.46 mg-1 ml cm-1) y se multiplicó por el factor de dilución (61200/200). El proceso se debe realizar en oscuridad. MATERIALES Y MÉTODOS 17 3.5.2. Determinación de carotenoides Otro parámetro para caracterizar un cultivo de cianobacterias es la cuantificación de carotenoides (Davies 1976).Estos pigmentos están formando parte de la cadena de transporte fotosintético como fotoprotectores. Se centrifugaron 10 ml de cultivo a 5000 x g durante 5 min, se lavó el pellet con agua destilada y se resuspendió en 2 ml de agua destilada. Esta suspensión se sonicó durante cuatro periodos de 45 segundos (a 80% de amplitud y 0,5 de ciclo) y 30 segundos de descanso en hielo. Después se centrifugó a 2500 x g durante 5 min, se cogió el sobrenadante y por cada ml de sonicado se añadieron 4 ml de acetona. Se midió la absorbancia a 480, 465 y 663 nm frente a acetona al 80%. La absorbancia neta de los carotenoides viene dada por la siguiente fórmula, tomando ε480= 250 mg -1 ml cm-1. A480 (carotenoides)=A480+0.144 ·A663 – 0.638·A465 3.5.3. Determinación de ficobiliproteínas Para la determinación de ficobiliproteínas se siguió el procedimiento descrito en el apartado anterior pero sin adicionar acetona al sonicado (Glazer 1976). Se mide la absorbancia a 620 nm del sonicado después de centrifugar frente a agua. El coeficiente de extinción es 7.41 mg -1 ml cm-1. 3.5.4. Determinación de proteínas totales La determinación de proteínas totales se realizó con un kit comercial basado en el método del ácido bicinchonínico (BCATMProteinAssay Kit, Thermo Fisher Scientific). Este método es similar al de Lowry, se preparó una recta de calibrado con albumina sérica bovina entre 2 y 0.025 mg/ml. Se tomaron 50 μl de cada muestra o punto de la recta y se le añadió 1 ml del reactivo A+B (50 partes de A y 1 parte de B). Se incubó durante 30 min a 37 ºC y se midió la absorbancia a 562 nm. Esta absorbancia se interpolaba en la recta de calibrado para calcular la concentración de proteínas totales. 3.6. Microscopía El examen microscópico de Anabaena sp., tanto óptico como de fluorescencia, fue realizado con un microscopio Nikon Eclipse 50i Epi-Fluorescence. Las fotografías fueron tomadas con una cámara Nikon DXM1200F acoplada a este microscopio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 18 Figura 4.1.a.- Integridad del RNA aislado de Anabaena a diferentes tiempos con y sin nitrato en el medio de cultivo. En cada pocillo se cargó 1 μl de RNA. Como se indica las bandas más altas corresponden al rRNA la estela inferior al mRNA y las bandas más bajas al tRNA. También se indica en la parte inferior los μl de RNA que se usaron como molde para la retrotranscripción. Las muestras cargadas fueron de izquierda a derecha: t=0 h, 2 h, 6 h y 26 h, donde se indica -NO3se eliminó el nitrato del medio de cultivo. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Análisis de la transcripción de furC en deficiencia de nitrógeno Se tomaron muestras de Anabaena sp. 7120 a distintos tiempos después haber retirado el nitrato del medio de cultivo. En concreto a tiempo 0, 2 h, 6 h y 26 h; como control se tomaron muestras a los mismos tiempos de un cultivo al que no se le había retirado el nitrato. Sobre estas muestras se realizó extracción de RNA siguiendo el procedimiento del apartado 3.2.a, se comprobó la integridad del RNA (Figura 4.1.a) y la ausencia de DNA tras tratar la muestra con DNasaI. Se realizó una retrotranscripción utilizando entre 2 y 1 μl de RNA según se observara más RNA, así se obtendrá una cantidad más equilibrada de cDNA en las diferentes muestras. En concreto, se usó la cantidad que se indica en la figura 4.1.a. Sobre el cDNA obtenido se realizó una PCR con los oligos rnpB_up/dw. Inicialmente, se usaron 0,5 μl de cDNA y se fue variando esta cantidad hasta igualar la intensidad de la todas la bandas. (Figura 4.1.b) Luego, con esta misma cantidad, se realizó otra PCR con los oligos FurC_up/dw. Como apenas se observaba amplificación se decidió utilizar el doble de cantidad de cDNA. El resultado fue que furC se transcribe más a las 6 horas tras retirar el nitrato del medio de cultivo. Esto indica que furC cumple algún papel en el complejo proceso de diferenciación a heterocisto, en concreto en los eventos intermedios (6-12 h) en los RESULTADOS Y DISCUSIÓN 19 Figura 4.1.b.- Retrotranscripción semicuantitativa de furC cuando a Anabaena se le retira el nitrato del medio de cultivo. En la imagen superior se ve el housekeeping (rnpB) igualado para las distintas muestras. Debajo de esta imagen se muestran los μl de cDNA utilizados para conseguir la misma intensidad de amplificación para el gen rnpB. El doble de esta cantidad se utilizó para amplificar el mensajero de furC. cuales comienzan a aparecer pro-heterocistos. Uno de estos eventos intermedios, es la formación de la envuelta del heterocisto para crear el ambiente anaerobio necesario para la fijación de nitrógeno (Adams 2000). Otro, es la degradación de los ficobilisomas del heterocisto para ser utilizados como fuente de aminoácidos en la síntesis de otras proteínas, necesarias en el proceso de diferenciación (Grossman et al., 1993). 4.2. Ensayo de pull-down Una forma de averiguar la posible función de una proteína es saber con qué otras proteínas interacciona. Para comprobar si FurC interaccionaba con alguna proteína de Anabaena sp. 7120 se llevó a cabo el ensayo de pull-down siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.4.4. Las proteínas GST y GST-FurC utilizadas fueron purificadas como se indica en el apartado 3.4.a. En el caso de GST-FurC, en la purificación se obtuvieron dos bandas (Figura 4.2.a) de la cuales la de menos peso molecular se corresponde con una FurC procesada o proteolizada. El ensayo se llevó a cabo con tres muestras: extracto de Anabaena con GST- FurC, con GST y sin proteína como control. De estas muestras, se cargaron 15 μl en un gel de SDS-PAGE al 15%. Tras tinción con Coomasie se buscaron las bandas diferenciales, las que aparecían en la muestra con GST-FurC (carril 2) y no en los demás carriles. También, se buscó que estas bandas no aparecieran como impurificaciones de la proteína GST-FurC. Con todo esto, se decidió recortar las bandas 1(~8 kDa) y 2 (~34 kDa) señaladas en la figura 4.2.a. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 26 Figura 4.4.1.c.- Concentración de ficobiliproteínas y proteínas totales a lo largo del crecimiento del mutante EB2770C en comparación con la cepa wild-type PCC 7120 Las líneas verticales se refieren a la desviación estándar de dos experimentos independientes en la estirpe EB2770C (negro) y WT (gris). Parece que la estirpe mutante EB2770FurC contiene menos ficobiliproteínas que la wild-type. Pero, EB2770C también tiene menos proteínas totales por lo que para obtener más información podemos relacionar las ficobiliproteínas con las proteínas totales en forma de %. También se hizo esto para la clorofila y los carotenoides como se muestra a continuación. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 27 Figura 4.4.1.d.- Porcentaje de ficobiliproteínas, clorofila y carotenoides a lo largo del crecimiento del mutante EB2770C en comparación con la cepa wild-type PCC 7120. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28 A pesar de que el mutante parecía tener menos ficobiliproteínas que la estirpe WT, fijándonos en la ratio, se ve que la estirpe mutante tiene más porcentaje de estas proteínas. Es decir, aunque la concentración de proteínas totales (tener en cuenta que la DO de ambas estirpes es el mismo por tanto debería contener la misma cantidad de proteínas) y ficobiliproteínas son menores en la estirpe EB2770C que en la WT; la relación es mayor. Esto se podría interpretar como que la estirpe EB2770C sintetiza menos proteínas en general, pero esta disminución no afecta tanto a las ficobiliproteínas. Lo mismo ocurre con los demás pigmentos analizados. La diferencia de parámetros entre WT y EB2770C es siempre mayor en la fase exponencial. Este resultado, junto con el del pull-down (FurC une ficobiliproteínas), parece indicar que la sobreexpresión de FurC podría estabilizar a las ficobiliproteínas impidiendo que se degraden tanto como las demás proteínas. Esta estabilización también afectaría a la clorofila, ya que está formando los fotosistemas a los que se unen los ficobilisomas. En cuanto a los carotenoides, aumentarían porque forman parte del aparato fotosintético. Esto tendría consecuencias en un aumento de la eficiencia fotosintética que debería ser comprobado con futuros experimentos. 4.4.2. Comportamiento en deficiencia de nitrógeno Para terminar de enlazar los resultados obtenidos, se analizó qué ocurría con las ficobiliproteínas en la estirpe EB2770C cuando estaba frente a una deficiencia de nitrógeno. Este análisis venía motivado por el hecho de que el mRNA de furC se transcribía más en estas condiciones. Para ello se eliminó el nitrato del medio en la fase exponencial de cultivo de la estirpe mutante, y de manera simultánea, en la wildtype. Se tomaron fotografías a distintos tiempos después de la retirada de nitrógeno con el microscopio Nikon Eclipse 50i Epi-Fluorescence para ver si había diferencias en el patrón de diferenciación a heterocistos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29 En esta imagen a tiempo cero, se ve que la estirpe mutante y la WT se diferencian en la longitud de las cadenas. EB2770C tiene filamentos largos como la WT pero también muchos cortos. En cuanto al color y fluorescencia son similares. Tras seis horas en ausencia de nitrato en ambas estirpes aún no se aprecian heterocistos. La longitud de las cadenas se ha igualado, probablemente por las condiciones del cultivo (el burbujeo hace que se rompan más cadenas). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 30 Tras 26 horas sin nitrato comienzan a apreciarse diferencias ya que en la estirpe WT aparecen heterocistos (señalados con flechas), según el patrón habitual (uno por cada 10-20 células vegetativas). Vemos que en una cadena hay dos heterocistos separados por 13 células vegetativas. Sin embargo, en la mutante la frecuencia de aparición de heterocistos es menor. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 31 Tras dos, tres y cuatro días ya no se observan diferencias entre la estirpe mutante y WT. Parece haber una diferencia si nos fijamos en el día 2, la estirpe mutante tiene menos intensidad de fluorescencia; puede que esto esté relacionado de nuevo con las ficobiliproteínas, que son las responsables de la autofluorescencia de Anabaena. Además, a simple vista el cultivo de la estirpe mutante tiene un color distinto (más amarillo) que la wild-type (Figura 4.4.2.a). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 Figura 4.4.2.a- Evolución de un cultivo del mutante EB2770C en comparación con la cepa wild-type PCC 7120 cuando se le elimina el nitrato del medio de cultivo. Figura 4.4.2.b.- Evolución de las ficobiliproteínas y proteínas del mutante EB2770C en comparación con la cepa wild-type PCC 7120 cuando se le elimina el nitrato del medio de cultivo. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 3 %Ficobiliproteínas t (días) % Ficobiliproteínas EB2770C % Ficob. WT % Ficob. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 3 μg proteínas/ml cultivo t (días) Ficobiliproteínas & proteínas totales EB2770C ficob. WT ficob. EB2770C prot. WT prot. Por esta observación y todos los resultados anteriores se decidió medir las ficobiliproteínas de estos cultivos. Tabla 4.4.2.- Evaluación de la concentración de pigmentos en las estirpes Anabaena sp. 7120 y EB2770C a lo largo del crecimiento cuando se elimina el nitrato del medio de cultivo. t (días) DO 750 Clorofila (μg/ml cultivo) Ficobiliproteínas (μg/ml cultivo) Proteínas totales (μg/ml cultivo) % Ficobiliproteínas EB2770C WT EB2770C WT EB2770C WT EB2770C WT EB2770C WT 0 0,42 0,42 3,41 3,62 28,19 28,54 42,73 41,89 65,97 68,120 3 0,53 0,70 2,27 2,91 8,15 14,76 11,57 34,07 70,47 43,34 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 En los datos obtenidos vemos que, efectivamente, la estirpe EB2770C tiene muchas menos ficobiliproteínas totales, por ello se aprecia un color más amarillo. Pero también es cierto que tiene muchas menos proteínas totales y densidad óptica a 750 nm. Por eso, es más informativo prestar atención al dato del porcentaje de ficobiliproteínas. Este dato nos dice que la estirpe mutante, a pesar de haber crecido peor y tener menos proteínas totales, tiene mucho más porcentaje de ficobiliproteínas. Es decir, la estirpe mutante degrada menos las ficobiliproteínas que las demás proteínas. Este resultado concordaría con el obtenido en la curva de crecimiento, FurC estabiliza a las ficobiliproteínas. Este hecho podría ser perjudicial para Anabaena cuando se elimina el nitrógeno, ya que le faltarían metabolitos procedentes de las ficobiliproteínas para realizar con éxito la diferenciación a heterocisto. Esto provocaría que sobrevivieran menos células, y por ello vemos menos densidad óptica y menos proteínas totales. Así se explicaría también porqué a las 26 horas de eliminar el nitrógeno vemos menos heterocistos en la estirpe mutante que en la WT. Que se observe esta diferencia a las 26 horas, podría indicar que FurC puede ejercer su papel de forma más predominante en los estadíos intermedios de la diferenciación a heterocisto. 4.4.3. Análisis de la transcripción de HetR y NtcA. Por todos los resultados que se habían obtenido, se decidió realizar RT-PCR sobre el DNA del mutante y Anabaena sp. 7120 para ver si había alguna diferencia en los principales reguladores del metabolismo del nitrógeno en Anabaena: HetR (regulador de la formación del heterocisto) y NtcA (sensor del balance carbono: nitrógeno). Para ello se usaron 0,5 μl de cDNa para rnpB, NtcA y HetR; y 1 μl para amplificar furC. El cDNA provenía de un cultivo de Anabaena y del mutante en medio BG11 con 1,35 mg/ml de NO3-. El resultado se muestra en la figura 4.4.3. Como vemos, furC se transcribe más en EB2770C; sin embargo, NtcA se transcribe muy poco en ambas estirpes y HetR no se transcribe en ninguna de las dos. Es decir, la mayor expresión de furC no parece afectar a la transcripción de los reguladores generales del nitrógeno HetR y NtcA. Sería interesante continuar este análisis transcripcional con muchos otros genes como NblA. La proteína NblA es la encargada de degradar a las ficobiliproteínas (Baier et al. 2004) en el proceso de diferenciación a heterocisto. Otros genes RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34 Figura 4.4.3.- Comprobación de la transcripción de furC, HetR, NtcA y rnpB en Anabaena WT y en EB2770C en medio BG11 con NO3- . En la figura se muestra el resultado de la PCR sobre cDNA con los oligos para amplificar los genes citados. Figura 4.5.- Modelo propuesto para la acción de FurC. Cuando hay déficit de ficobiliproteínas la trascripción de FurC se activa, dicha proteína se une a los linker de los ficobilisomas y los estabiliza. interesantes a estudiar serían los que codifican para ficobiliproteínas y linker asociados a estas, ya que FurC se une a los linker. 4.5. Modelo de acción de FurC Con los resultados obtenidos se podría establecer la siguiente hipótesis: cuando hay déficit de ficobiliproteínas (por las condiciones ambientales o la degradación que se produce en déficit de nitrógeno) se activa la transcripción de furC. FurC se traduce y se une a dos linker del ficobilisoma. Con esta unión estabiliza al ficobilisoma y evita su degradación. Como consecuencia de esta estabilización también aumentan los pigmentos fotosintéticos como la clorofila o los carotenoides. Esto es debido a que el ficobilisoma está asociado a al fotosistema II y participa activamente en la fotosíntesis ejerciendo como antena captadora de fotones. En posteriores investigaciones se deberá concretar que señal es la que induce la trascripción de furC. Podría tratarse de un producto de degradación de ficobiliproteínas o de alguna otra señal celular como respuesta al incremento de la ratio carbono/nitrógeno. Con la figura 4.5 se resumiría este modelo de acción: CONCLUSIONES 35 5. CONCLUSIONES Tras la realización de este trabajo de investigación las conclusiones obtenidas son las siguientes: 1. La transcripción de furC en Anabaena WT se induce en déficit de nitrógeno combinado. Esta inducción es mayor a las 6 horas de haber retirado el nitrógeno. 2. FurC se une al péptido linker del ficobilisoma de 7.8 kDa asociado a aloficocianina y al péptido linker del ficobilisoma de 34.5 kDa asociado a ficoeritrocianina. Dos proteínas que actúan como linker estabilizando los ficobilisomas. 3. Se ha logrado sobreexpresar FurC en Anabaena sp. PCC7120 a partir del plásmido pAM2770FurC. Como resultado se ha obtenido el mutante de Anabaena sp., al que se le ha llamado EB2770FurC. 4. El mutante EB2770C tiene un porcentaje mayor de ficobiliproteínas, carotenoides y clorofila, con respecto a las proteínas totales, que la estirpe wild-type. Aunque el tiempo de duplicación es el mismo. 5. El mutante EB2770C, en déficit de nitrato, tiene mayor porcentaje de ficobiliproteínas, pero crece peor y tiene menos proteínas totales que la estirpe wildtype. 6. El mutante EB2770C, a las 6 horas de haber retirado el nitrato del medio de cultivo tiene menos heterocistos que la estirpe wild-type. 7. El mutante EB2770C en presencia de nitrato no presenta diferencias en la transcripción de hetR y ntcA con respecto a la estirpe wild-type. 8. Todos estos resultados nos han permitido proponer un modelo de actuación de FurC en Anabaena sp. PCC7120. Este modelo se detalla en el apartado 4.5.