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I. II. III. IV. V. PROYECTOTRABAJO FIN DE CARRERA ARTRÓPODOS PARÁSITOS ASOCIADOS A CARPÓFOROS DEL GÉNERO TUBER. AUTOR: LOURDES CASTEL DUASO ENSEÑANZA: INGENIERÍA TÉCNICA AGRÍCOLA DIRECTOR/ES: JUAN J. BARRIUSO VARGAS MARÍA MARTÍN SANTAFÉ PONENTE: JOAQUÍN AIBAR LETE FECHA: JUNIO 2012 UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA AGRADECIMIENTOS Agradecimientos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Quiero expresar mi agradecimiento a todas las personas que me han apoyado y ayudado durante la realización de este trabajo: A mi director de proyecto, el Dr. Juan Barriuso por su confianza en mí y brindarme la oportunidad de colaborar en este sorprendente y novedoso trabajo. He disfrutado aprendiendo de sus conocimientos y debatiendo los resultados juntos. Has conseguido que me sintiera como una auténtica científica aportando algo de luz a este tema. Me quedo con ganas de seguir por este camino. Gracias por darme la oportunidad de trabajar con un equipo tan auténtico y descubrirme el mundo real de la investigación y la truficultura. Quiero también agradecer a mi directora de proyecto María Martín todo su esfuerzo realizado en este trabajo. Los momentos compartidos en el laboratorio han sido mucho más amenos y productivos, gracias María. Gracias al Dr. Sergio Sánchez por su disponibilidad, colaboración, por compartir sus conocimientos, experiencia y portarse conmigo como un amigo, sin conocerme de nada. Gracias por darme el apoyo y la motivación que necesitaba en la última etapa de este trabajo. Al resto del personal del Servicio de Investigación Agroalimentaria y concretamente a la Unidad de Sanidad Vegetal. Gracias a su inmejorable trato han hecho de mi estancia un periodo muy agradable. Por último, aunque no menos importante, me gustaría agradecer y dedicar este proyecto a mis padres, a mi hermano y a mi pareja. Esto no hubiera sido posible sin mi obcecación y sin el inestimable apoyo familiar a lo largo de todos estos años, con infinito cariño y paciencia, quizá el microscopio que me regalasteis a los 7 años ha influido para llegar a este proyecto. A los amigos, gracias por vuestro incondicional apoyo, por preocuparos por cómo iban las trufas aunque no entendieseis de la misa la mitad. Gracias por estar siempre ahí, ya habrá tiempo para celebraciones. RESUMEN/SUMARY Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber En los últimos años la producción de trufas silvestres ha descendido de un modo alarmante, y por el momento ni el establecimiento de un gran número de plantaciones, de árboles del género Quercus micorrizadas con este hongo han conseguido que remonten las producciones. Por otra parte encontramos que su calidad esta gravemente influida por la presencia de artrópodos parásitos. No se posee mucha información sobre las principales plagas que afectan a la trufa ni cómo controlarlas. En este trabajo se han estudiado las poblaciones de artrópodos presentes en las especies económicamente más importantes en España distintos ejemplares de trufa de verano (Tuber aestivum), trufa negra (Tuber melanosporum) y Tuber brumale, con la intención de identificar y comprobar el grado de parasitismo de las especies que afectan. Se han encontrado 5 especies diferentes: Leiodes cinnamomea, Ommatoilus sabulosus, Megaselia sp., Lycoriella sp., y Helomyza tuberivora. De estos 3 últimos se ha conseguido reproducir su ciclo biológico completo sobre Tuber y Pleurotus ostreatus. Ommatoilus sabulosus, Megaselia sp. y Lycoriella sp. son nuevas citas en cuanto al parasitismo asociado a los carpóforos del género Tuber. Los dípteros Megaselia sp, Lycoriella sp. y Helomyza tuberivora son plagas que provocan graves pérdidas en la calidad del producto, pero también ayudan al hongo a diseminar sus esporas, a la par que son indicadores de su presencia en el quemado del árbol trufero. La presencia de Ommatoiulus sabulosusse asocia como plaga secundaria, ya que parasita a T. melanosporum cuando esta se encuentra ya madura, aprovechando las galerías creadas previamente ya por otros parásitos, provocando graves perforaciones que devalúan económicamente y en calidad el producto. Se ha podido comprobar que a diferencia de lo publicado en otros trabajos respecto al coleóptero Leiodes cinnamomea, que las larvas son parásitos tanto de T. aestivum como de T. melanosporum frente a los adultos que sólo se manifiestan en T. melanosporum, produciendo tanto la larva como el adulto graves daños en los carpóforos. Con los resultados obtenidos se pretende aportar algo de luz al parasitismo asociado a carpóforos del género Tuber para poder establecer, en estudios posteriores, Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber T. aestivum Vittad. ............................................................................................ 27 3.2.1.1. EVOLUCIÓN DE LARVAS DE COLEÓPTEROS ............................................. 27 3.2.1.2. COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE LARVAS Y AISLAMIENTO DE LAS MISMAS .............................................................. 28 3.2.1.3. COLOCACIÓN DE PLEUROTUS OSTREATUS EN EL ENSAYO .................... 29 3.2.1.4. COMPROBACIÓN DEL CICLO BIOLÓGICO DE MEGASELIA SP. ................ 30 3.2.2. ENSAYO 2: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO EN CARPÓFOROS DE T. MELANOSPORUM VITTAD. ................................................................ 31 3.2.2.1. COMPROBACIÓN DEL CICLO BIOLÓGICO DE LYCORIELLA SP. Y DE HELOMYZA TUBERIVORA ................................................................................................................ 32 3.2.3. ENSAYO 3: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE LA EVOLUCIÓN FINAL DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A DISTINTOS EJEMPLARES DE TUBER ...................................................... 33 3.2.4. ENSAYO 4: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE EL LAMINADO DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A TUBER MELANOSPORUM VITTAD EN FUNCIÓN DEL GRADO DE MADUREZ ..................................................................................................... 34 3.2.4.1. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE DATOS .................................................. 38 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................ 40 4.1. IDENTIFICACIÓN DE LOS ARTRÓPODOS PARÁSITOS PRESENTES ................... 40 4.2. ENSAYO 1: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO EN CARPÓFOROS DE T. AESTIVUM VITTAD ................................................................................. 41 4.2.1. EVOLUCIÓN DE LAS LARVAS ENCONTRADAS ....................................... 42 4.2.2. OBTENCIÓN DEL CICLO BIOLÓGICO DE MEGASELIA SP. ...................... 44 4.3. ENSAYO 2: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO EN CARPÓFOROS DE T. MELANOSPORUM VITTAD ..................................................................... 48 4.3.1. Ommatoilus sabulosus ...................................................................................... 50 4.3.2. Leiodes cinnamomea ......................................................................................... 51 4.3.3. Lycoriella sp. ................................................................................................... 53 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4.3.4. Helomyza tuberivora ......................................................................................... 55 4.4. ENSAYO 3: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE LA EVOLUCIÓN FINAL DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A DISTINTOS EJEMPLARES DE TUBER: ........................................................................................................ 58 4.4.1. Tuber aestivum Vittad ....................................................................................... 58 4.4.2. Tuber melanosporum Vittad .............................................................................. 58 4.4.3. Tuber brumale Vittad ........................................................................................ 59 4.5. ENSAYO 4: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE EL LAMINADO DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A TUBER MELANOSPORUM VITTAD EN FUNCIÓN DEL GRADO DE MADUREZ ............................................................. 61 4.5.1. PRESENCIA DE GALERÍAS .......................................................................... 61 4.5.2. NÚMERO DE GALERÍAS............................................................................... 62 4.5.3. TIPO DE GALERÍAS ....................................................................................... 63 4.6. DAÑOS Y POSIBILIDADES DE CONTROL DE LOS DISTINTOS PARÁSITOS ENCONTRADOS EN TUBER ........................................................................... 66 4.6.1. COLEÓPTEROS .............................................................................................. 66 4.6.2. MIRIÁPODOS ................................................................................................. 66 4.6.3. DÍPTEROS ....................................................................................................... 67 4.6.3.1. Megaselia sp....................................................................................................... 67 4.6.3.2. Lycoriella sp ....................................................................................................... 68 4.6.3.3. Helomyza tuberivora........................................................................................... 68 4.6.3.4. POSIBLES SOLUCIONES PARA EL CONTROL DE DÍPTEROS Y RESTO DE ARTRÓPODOS EN LAS TRUFERAS ....................................... 69 5. CONCLUSIONES .............................................................................. 70 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 71 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber FIGURAS Fig.1. Distribución de suelos con aptitudes truferas para Tuber melanosporum en Europa (Reyna, 2012). ................................................................................................................ 2 Fig.2. Plantación trufera en la zona Graus (Huesca) (foto superior) y de Sarrión (Teruel) (foto inferior). . ................................................................................................................................. 3 Fig.3. Representación de las zonas españolas aptas para la producción de Tuber melanosporum y Tuber aestivum en función del tipo de suelo, ya sea silícico, calcáreo o arcilloso (Mapa cedido por Sanchez, S. 2012). ......................................................................................... 4 Fig.4. Peridio, gleba y esporas de Tuber melanosporum. ........................................................... 6 Fig.5. Peridio, gleba y esporas de Tuber aestivum. .................................................................... 7 Fig.6. Peridio, gleba y esporas de Tuber brumale. ..................................................................... 7 Fig.7. Ciclo biológico de T. melanosporum modificado de (Kües y Martin, 2011). .................... 8 Fig.8. Trufera joven con quemado en torno al árbol situada en una plantación de Valbona (Teruel). .......................................................................................................................... 9 Fig.9. Producción mundial de trufa (Reyna, 2007). .................................................................. 10 Fig.10. Producción de trufa por provincia Ministerio de Agricultura Alimentación y Medio Ambiente 2008. ............................................................................................................. 11 Fig.11. Ejemplar parasitado de Tuber melanosporum. Se aprecian diversas galerías. .............. 13 Fig.12. Helomyza tuberivora también conocida como mosca de la trufa, con esporas adheridas en las patas, lo que es indicador de la dispersión de esporas. .......................................... 15 Fig.13. Larva de díptero con esporas de Tuber tanto en el interior como adheridas en la parte externa. ......................................................................................................................... 16 Fig.14. Lotes de Tuber aestivum, el de la derecha al estar cerrado herméticamente se produjo la muerte de las larvas por asfixia. ..................................................................................... 19 Fig.15. Lote de Tuber melanosporum procedente de Sarrión. .................................................. 21 Fig.16. Pesado y etiquetado de los carpóforos. ........................................................................ 24 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig.17. Colocación de los ejemplares de Tuber a evolucionar. ................................................. 25 Fig.18. Aplicación de humedad mediante pulverizador y aislamiento del ensayo para evitar contaminaciones y evitar la incidencia de la luz. ............................................................ 25 Fig.19. Ubicación de los carpóforos dentro de los evolucionarios ........................................... .26 Fig.20. Nicho de coleópteros dentro de Tuber aestivum. .......................................................... 27 Fig.21. Estudio de las larvas de coleóptero. ............................................................................. 28 Fig.22. Ejemplares de Pleurotus ostreatusque sirven de alimento a los parásitos asociados al género Tuber. ................................................................................................................ 29 Fig.23. Colocación de ejemplares frescos para ver si desarrollaban algún tipo de plagas por ellos solos. Sin la presencia de los carpóforos. ....................................................................... 30 Fig.24. Colocación del ensayo................................................................................................. 30 Fig.25. Megaselia sp. junto los Pleurotus ostreatus. ............................................................... 30 Fig.26. Adulto de Megaselia sp. .............................................................................................. 30 Fig.27. Ubicación del ensayo en el laboratorio. ....................................................................... 31 Fig 28. Vista al microscopio de ascas y ascosporas de Tuber melanosporum en su mayoría maduras (izquierda). ..................................................................................................... 35 Fig.29. Vistas al microscopio de ascas de maduración media (derecha) .................................. .35 Fig.30. Vista al microscopio de ascas y ascosporas inmaduras. ................................................ 35 Fig. 31. Carpóforo de Tuber que presenta gran cantidad de galerías de diplopodo, coleóptero y díptero. ......................................................................................................................... 36 Fig.32. Galerías producidas por coleópteros y diplopodos (derecha) y por diplopodos (izquierda)..................................................................................................................... 36 Fig.33. Laminado de los diferentes lotes de trufa para su evaluación de daños en la gleba producido por los parásitos. ........................................................................................... 37 Fig.34. Galerías producidas por coleópteros y dípteros (izquierda) y por diplopodos (derecha). 37 Fig.35. Evaluación de la presencia de larvas vivas en el ensayo. .............................................. 42 Fig 36. Láminas de Tuber aestivum parasitadas por Leiodes cinnamomea................................ 43 Fig.37. Adulto de Leiodes cinnamomea. Su tamaño es de 0,5 cm. ........................................... 51 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig.38. Pupas de Helomyza tuberivora y Megaselia sp en el mismo carpóforo (izquierda), Helomyza tuberivora sobre Pleurotus ostreatus. ....................................................................... 59 Fig.39. Daños producidos por dípteros, coleópteros y milpiés.................................................. 63 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber TABLAS Tabla 1. Superficie dedicada al cultivo de trufa negra en España (ha) (J. Vilas, 2011). .............. 5 Tabla 2. Características de los lotes de trufas utilizadas en este trabajo. .................................. 23 Tabla 3. Número de parásitos evaluados visualmente en distintas fases, localizados en Tuber aestivum. ....................................................................................................................... 41 Tabla 4. Relación de las temperaturas junto con la evaluación visual de la presencia de larvas de coleóptero en el ensayo. ............................................................................................ 44 Tabla 5. Presencia de Megaselia sp. en el ensayo, en relación con la variación de temperaturas.45 Tabla 6. Ciclo de Megaselia sp. obtenido en el laboratorio. .................................................... 47 Tabla 7. Número de parásitos evaluados visualemente en sus distintas fases, localizados en Tuber melanosporum. ................................................................................................... 48 Tabla 8. Evolución de las temperaturas máxima, mínima y media junto con las especies de adultos parásitos propios de T. melanosporum que aparecieron durante el tiempo que perduró el ensayo, colocados en orden de aparición. ...................................................... 49 Tabla 9. Ejemplares de Ommatoilus sabulosus, encontrados parasitando la trufa, su longitud alcanza los 2 cm ........................................................................................................... .50 Tabla 10. Tabla en la que aparece reflejado los distintos estadíos observados Leiodes cinnamomea sobre Tuber melanosporum. ...................................................................... 52 Tabla 11. Evolución del ciclo de Lycoriella sp. comprobado en el laboratorio sobre Tuber melanosporum y Pleurotus ostreatus. ............................................................................ 54 Tabla 12. Evolución de las temperaturas durante el ciclo de Helomyza tuberivora. La bajada drástica de las temperaturas provocó la muerte de los adultos. ....................................... 55 Tabla 13. Comprobación del ciclo de Helomyza tuberivora sobre Tuber melanosporum y Pleurotus ostreatus. ...................................................................................................... 56 Tabla 14. Relación cuantificada de las especies vinculadas a la trufa que han sido obtenidas en el presente ensayo. ........................................................................................................ 60 Tabla 15. Tabla de contingencia que muestra las frecuencias de la presencia de galerías en función del tipo de madurez del lote de T. melanosporum. ............................................. 61 Índice Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Tabla 16. Resultados de la prueba de χ2 (valor χ2 y significación p<0,05) para cada combinación dos a dos de los grados de maduración. ns: prueba no significativa. ......... 62 Tabla 17. Separación en grupos homogéneos de frecuencia de aparición de larvas en función del grado de madurez. ................................................................................................... 62 Tabla 18. Número de trufas analizadas, número medio de galerías y desviación típica en función del grado de madurez de los lotes analizados. Resultados de la ANOVA (F y p) y separación de medias por el test de Tukey. Los lotes que no comparten letra tienen diferencias estadísticamente significativas entre sí (p < 0,05). ....................................... 63 Tabla 19. Frecuencia de aparición de daños producidos por los tres diferentes grupos de artrópodos considerados en los tres niveles de madurez de los carpóforos de Tuber melanosporum. Resultados de la prueba de χ2 (valor χ2 y significación p) para cada combinación dos a dos de los grados de maduración. ns: ausencia de diferencias significativas. Las frecuencias que no comparten letra poseen diferencias significativas entre sí; p>0,05. ............................................................................................................ 64 1. INTRODUCCIÓN Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 1 1.1 LA TRUFA Las trufas son los cuerpos fructíferos de hongos hipogeos, entre los que se encuentran géneros como Terfezia o Melanogaster. Pero las especies más apreciadas por su valor gastronómico pertenecen al género Tuber, familia Tuberaceae, orden Pezizales, clase Pezizomycetes, división Ascomycota, reino Fungi (Kirk et al., 2008). Dichos hongos se encuentran asociados a las raíces de ciertas especies vegetales como son la encina o carrasca (Quercus ilex subsp. Ballota (Desf.) Samp. In Bol. ), el quejigo (Quercus faginea Lam,), el roble pubescente (Quercus pubescens) y el avellano (Corylus avellana L.), formando unas estructuras denominadas micorrizas. La zona comprendida entre el árbol y su área superficial donde se recolectan los carpóforos se conoce como trufera. Esta fructificación suele ser muy aromática, cualidad que le confiere un alto valor culinario para los humanos y permite su recolección por medio de perros. A su vez es este aroma el que atrae a distintos tipos de parásitos que son el objetivo de estudio de este trabajo. Las truferas se desarrollan en suelos pobres, que carecen de los nutrientes esenciales para la supervivencia del árbol, siendo el hongo el encargado de proporcionar a la planta lo que ésta no es capaz de asimilar directamente del suelo. A su vez, reviste a las raíces del árbol con su micelio, protegiéndolas y formando las micorrizas. A cambio la planta aporta al hongo los productos que éste es incapaz de sintetizar por sí mismo y un sustrato sobre el que poder reproducirse. La relación hongo-planta se encuentra en un equilibrio inestable, lo que hace que la truficultura sea una ciencia/actividad difícilmente pronosticable/predecible, estando muy influida por factores climáticos y por ciertas actuaciones sobre el cultivo que pueden influir y comprometer su éxito (Martín et al., 2010). Aunque las tres especies de este estudio son objeto de un comercio muy activo, la trufa negra es la especie más importante que se recoge en nuestra zona, tanto por el volumen económico como por su relevante uso en cocina, debido a sus características organolépticas. Este hongo sólo se desarrolla de forma silvestre en los suelos calcáreos del sur de Europa [Fig.1]. Esto incluye: Francia, Italia y España, aunque en los últimos Introducción 8 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber transformaciones por parte del medio ambiente (humedad y temperatura favorables) antes de germinar. Fig.7. Ciclo biológico de T. melanosporum modificado de Kües y Martin (2011). En primavera, la espora germina en las cercanías de la raíz de un árbol hospedador, su micelio o conjunto de hifas, crece hacia ella y la envuelve formando las micorrizas. Las hifas del micelio que parten de la micorriza, colonizan el substrato e invaden otros ápices radicales instaurando las micorrizas secundarias. Empieza aquí una fase que dura varios años (entre 5 y 9), en los que el hongo se limita a seguir colonizando raíces hasta que adquiere una densidad de micorrizas suficiente para comenzar a reproducirse sexualmente, es decir, a producir trufas. Durante este periodo existe un signo externo de que dicha colonización sigue su curso correctamente, que es la aparición en el terreno de una zona desprovista de vegetación alrededor del árbol que G.C. (+) / G.C. (-) Micorrización de ápices radiculares Crecimiento de las hifas del manto en el suelo G.C.(+) G.C.(-) G.C. (+) / G.C. (-) Sexo opuesto en el suelo Unión de hifas compatibles Ascas con ascosporas Formación del ascogonio G.C.(+) / G.C.(-) Gleba sexo (+) en cuyo interior se forman las ascosporas Carpóforo creciendo y madurando Marzo- Octubre Mayo - Junio Julio –Agosto? Agosto - Febrero Noviembre - Marzo Más de 6 años tras la colonización Recolección del la trufa con perro Marzo - Abril Dispersión de las esporas Germinación de las esporas Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 9 se conoce como “quemado” [Fig. 8]. En él se produce un efecto herbicida que impide la germinación de ciertas plantas (Palazón y Barriuso, 2007). Fig. 8. Trufera joven con quemado en torno al árbol situada en una plantación de Valbona (Teruel). Los primordios de trufa se forman durante abril-mayo, ya que se produce la unión de hifas sexualmente compatibles. Este hecho estaba en duda hasta hace poco, ya que se suponía que la especie era homotálica, es decir se autofecundaba (Riccioni et al., 2008). En la actualidad ya se pueden conocer a qué tipo sexual pertenecen ciertas micorrizas (Rubini et al., 2011) e incluso se conocen los genes implicados en la compatibilidad sexual de micelios. En el mismo pie no conviven distintos tipos sexuales, ya que uno tiende a desplazar al otro, quedando todavía la incógnita por resolver de dónde procede el otro micelio necesario para que se pueda producir el cruzamiento (Rubini et al, 2011). A partir de este momento se desarrolla la trufa. En esta fase se formará el aparato esporofítico, que posteriormente dará lugar a las ascas, el peridio se cierra haciéndolo globoso y tornándose cada vez más escamoso. Durante esta fase, la trufa va engordando. Este periodo dura sobre ocho meses. Un nuevo avance en el estudio del ciclo de la trufa, permitió demostrar que la conexión entre la trufa y el árbol dura hasta la maduración del hongo (Zeller et al., 2008), a diferencia que antes se pensaba que los primordios se independizaban del ápice y comenzaban una fase denominada fase saprofítica. Introducción 10 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber En el periodo de maduración es cuando la trufa comienza a emitir distintos tipos de aromas, ya que al desarrollarse bajo tierra, las trufas necesitan la ayuda de diferentes animales (jabalíes, tejones, zorros, roedores, etc.) para diseminar sus esporas, empleando su fortísimo olor para atraerles. Ésta es la causa de que la recolección deba ser realizada con la ayuda de perros entrenados. Pero no sólo los mamíferos se ven atraídos por estos aromas, también lo hacen determinados insectos como la mosca (Helomyza sp.) y el escarabajo de la trufa (Leiodes sp.). Estudiar estos y otros artrópodos es el principal objetivo del presente trabajo. Una vez que la trufa está madura, produce en su interior las esporas que al incorporarse de nuevo al suelo cierran el ciclo. 1.1.3 SITUACIÓN ACTUAL DE LA TRUFICULTURA En España, la trufa es un recurso para zonas deprimidas. En la figura 9 se muestra la cantidad de trufa que produce cada país, nuestro país es el segundo productor del mundo pero, apenas se consumen trufas, se exportan la mayoría a Francia donde son procesadas y revalorizadas. La calidad de la trufa es muy importante, devaluándose si las condiciones no son óptimas. Fig.9. Producción mundial de trufa (Reyna, 2007). La cantidad de cosecha recolectada durante la temporada depende de la disponibilidad de agua. La producción es difícil de estimar ya que se trata de un mercado oscuro. En la figura 10 se muestra un mapa publicado por el Ministerio de Agricultura Alimentación y Medio Ambiente, en el que se puede observar la producción española de trufa. Resulta llamativo, y es fruto del mercado poco transparente que tiene la trufa, que Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 11 la mayor producción se muestre en Soria, provincia en la que hay 1.600 ha frente a las 4.000 de la provincia de Teruel. Fig.10. Producción de trufa por provincia Ministerio de Agricultura Alimentación y Medio Ambiente 2008. La producción de trufa contribuye a la forestación ya que es una alternativa en las áreas más marginales, aumentando el valor del suelo, dándole mayor rentabilidad. Como resultado se obtiene un producto ecológico y natural, que ayuda a crear puestos de trabajo y arraiga la población al medio rural. La intensificación del número de plantaciones estos últimos años, ha conllevado un aumento en la aparición de problemas fitopatológicos, demandando mayores servicios por parte de los investigadores para mitigar los daños originados por los parásitos tanto en las plantaciones como en post cosecha. 1.2 PRINCIPALES PARÁSITOS ASOCIADOS A CARPÓFOROS DEL GÉNERO TUBER En las áreas truferas destacan distintos grupos de insectos, los cuales tienen un importante papel en la biología de la trufa. Una característica común a todos ellos es su Introducción 12 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber desarrollado sentido olfativo, el cual les permite detectar y parasitar a la trufa, tanto en fase de larva como en estado adulto. Esto produce daños irreversibles junto con pérdidas organolépticas y económicas que afectan directamente a la calidad de tan apreciado producto. Los más destacados o conocidos en el mundo de la truficultura, son los pequeños escarabajos leiódidos (Coleoptera: Leiodidae) y las comúnmente denominadas “moscas de la trufa” las cuales pertenecen a 8 especies del género Helomyza (Diptera: Helomyzae) (sin. Suilla) (Coutin, 1972; Paccioni y Lalli 1990; Oliver et al 1996; Callot, 1999). En todos los manuales y guías de truficultura encontramos referencias respecto a la “caza de trufas con mosca” (Verlhac, 1990; Sourzat, 1994; Callot, 1999; Reyna 2000, 2010; Ian et al 2007). La plaga que más daño causa a la trufa negra [Fig.11] es un coleóptero micófago adaptado a las bajas temperaturas (Paccioni y Lalli, 1990) llamado Leiodes cinnamomea (sin. Liodes cinnamomea) también conocido como el escarabajo de la trufa. Tiene una generación por año y tanto las larvas como los adultos causan graves daños en los distintos ejemplares de trufa. Alessandrina Arzone en 1971 realiza el primer estudio descriptivo sobre esta plaga y Harrington et al., (2005), hacen una completísima revisión sobre la evolución y la ecología de los coleópteros micófagos. Son los investigadores húngaros Bratek et al., (2001) los que presentan el primer artículo en el Congreso de Aix en Provence en 1999 sobre los escarabajos y moscas que se alimentan de hongos hipogeos. En el tratado sobre los insectos que se alimentan de hongos, tanto epigeos como hipogeos, escrito por Coutin en 1972, se hace una revisión de todos los órdenes y familias de insectos pero no se describe a la especie de Leiodes anteriormente mencionada. Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 13 Fig.11. Ejemplar parasitado de Tuber melanosporum. Se aprecian diversas galerías. 1.2.1 CAUSAS DEL OLOR DE LA TRUFA Y DEL PORQUÉ SE VEN ATRAÍDOS DIFERENTES ARTRÓPODOS La trufa al ser un hongo hipogeo necesita aflorar del suelo para diseminar sus esporas, al contrario de los hongos que fructifican en superficie, que usan la diseminación anemócora. Debido al intenso y persistente aroma que emana la trufa cuando alcanza la madurez, cientos de animales se ven atraídos hacia ella, llegando a extraerla del suelo y provocando así la diseminación zoócora. Las sustancias volátiles que desprenden las trufas ocultas a no mucha profundidad al alcanzar la madurez, van cambiando conforme ésta evoluciona, es lo que las hace ser apetecibles. Cuando la trufa alcanza la madurez, el bosque mediterráneo no presenta otras fragancias que puedan competir con ella (Reyna, 2012). La forma en la que utilizan el olfato los coleópteros que atacan a la trufa, sobre todo las hembras, viene descrita por Hochberg et al., (2003). En dicho artículo hace referencia a que los escarabajos macho no se sienten atraídos por los olores maduros de la trufa. Son las hembras las que parasitan a la trufa, lo que sugiere que la primera en emplear una feromona para localizar trufas en distancias cortas es la hembra del escarabajo. Los escarabajos macho son atraídos por las trufas parasitadas sólo en presencia de las hembras. En contraste, los escarabajos hembra no muestran atracción Introducción 14 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber hacia la trufa infectada, lo que sugiere que emplean otras señales, posiblemente vinculadas a los olores emitidos por la trufa antes de la etapa de madurez. Hay una hipótesis que afirma que los compuestos volátiles que emite la trufa en su fase inmadura, son distintos a los emitidos en su madurez. Los insectos se ven atraídos fundamentalmente en la etapa inmadura mientras que los mamíferos lo hacen justo antes de la descomposición (Dessolas. et al., 2008). Las señales químicas son a menudo, para la mayoría de los animales, más importantes que las visuales y auditivas a la hora de hacer una valoración sobre su entorno ambiental. Los artrópodos, tienen una fuerte dependencia de los estímulos olfativos y gustativos. Los insectos se comunican principalmente a través de comunicación química, especialmente entre los de la misma especie (Gullan y Cranston, 2000). Las antenas son las estructuras sensoriales más externas, que se implican para la detección de muchos estímulos ambientales, en particular para los que tienen limitado el empleo de la vista (Sánchez Osorio, 2005). Los mensajes químicos que hacen que se orienten los insectos son los llamados semioquímicos, cuyas funciones vienen definidas por los términos feromonas, alomonas, kairomonas y sinomonas (Gullan y Cranston, 2000). En la mayor parte de las ocasiones, como sucede en el caso de las trufas, son producto de estrechas coevoluciones. 1.2.2 CÓMO ACTÚAN LOS ARTRÓPODOS EN LA DISEMINACIÓN DE ESPORAS Los artrópodos juegan un papel fundamental en la dispersión de esporas, concretamente los insectos. Los insectos son los artrópodos más abundantes de la tierra y han adoptado modos de vida muy variados. Al ser los únicos invertebrados capaces de tener un vuelo activo, junto a su pequeño tamaño y su cutícula impermeable, les ha permitido colonizar una enorme serie de hábitats, que en el caso de la trufa, contribuyen a la dispersión de las esporas, ya que en la práctica es muy difícil que la trufa logre expandir sus esporas sin la ayuda de un agente externo. Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 15 Desde comienzos del mes de diciembre hasta principios de primavera, podemos encontrar trufas maduras, de forma que las esporas ya están viables para germinar, así que la trufa emite fuertes olores según el grado de madurez para atraer a numerosos insectos, a otros invertebrados y a todo tipo de vertebrados (jabalí, roedores, zorros, tejones, etc.). Algunos tienen una vinculación específica con la trufa. Los dípteros causan daños directos e indirectos, siendo una de las principales plagas del cultivo de Tuber. La mosca de la trufa o “mosca de ojos rojos” (Suilla tuberivora, sin. S. gigantea sin. Helomyza tuberivora) es un fiel indicador de la presencia de dicho hongo en el suelo. Viven bajo tierra, en las cavidades del ascocarpo, y están dotados de un excelente y fino olfato. (García et al., 2004). Fig.12. Helomyza tuberivora también conocida como mosca de la trufa, con esporas adheridas en las patas, lo que es indicador de la dispersión de esporas. Las moscas de la trufa [Fig.12] podrían contribuir activamente a la dispersión de las esporas, ya que los adultos hacen la puesta en las trufas maduras de forma que las esporas se quedan adheridas en las pilosidades de los individuos adultos (Reyna, 2000). Sus larvas [Fig.13] se desarrollan y se alimentan en el interior de forma que contribuyen a la putrefacción del carpóforo con las galerías alimentarias que construyen. Entre las sustancias volátiles que emite la trufa cuando alcanza la madurez, encontramos una muy similar a las feromonas sexuales del jabalí macho, lo que hace que el jabalí hembra busque trufas (Delmas, 1987). De esta forma, puede transportar a otros lugares pequeñas porciones de trufa. Introducción 16 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig.13. Larva de díptero con esporas de Tuber tanto en el interior como adheridas en la parte externa. Estos animales son indispensables en el ciclo de la trufa. No sólo hay que verlos como animales que devalúan el valor comercial de nuestro producto sino como dispersores naturales de las esporas, fundamentales para la producción de trufa (Vignozzi y De Rogatis, 1990; Trappe et al., 2001). En la actualidad, en la mayoría de los artículos referidos a la trufa se nombra de manera muy poco profunda algunos de los parásitos encontrados en las diferentes plantaciones truferas (Coutin, 1972; Verlhac, 1990; Sourzat, 1994; Callot, 1999; Ian et al 2007; Reyna, 2000; 2007, 2012). Por eso es necesario seguir avanzando en este campo, ya que los artrópodos juegan un papel fundamental en la biología de la trufera, siempre que se encuentren dentro de un equilibrio. Introducción Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 1 2. OBJETIVOS Material y métodos 18 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber La escasa información existente sobre los tipos de artrópodos que afectan a la trufa, llevó a la realización de diferentes experiencias “in vivo” con el fin de observar sus singularidades de crecimiento, comportamiento y desarrollo. En este Trabajo se presentan los ensayos para determinar la evolución y el crecimiento de algunas de las especies de artrópodos que afectan a los ejemplares de Tuber aestivum, T. melanosporum y T. brumale. Para el desarrollo de dicho Proyecto se han realizado unos seguimientos detallados y exhaustivos durante dos años, desde Junio de 2010 hasta Mayo de 2012, de distintos ejemplares parasitados. Concretamente 70 carpóforos de trufa de verano, 305 carpóforos de trufa de invierno y 6 carpóforos de T. brumale. Un total de 8.419,5 gramos de trufa procedentes de distintas zonas de la geografía aragonesa. 3.1 MATERIAL FÚNGICO Los carpóforos de trufas empleados en este proyecto poseían tres características principales: - Eran trufas evaluadas de segunda calidad, ya que los carpóforos presentaban formas irregulares con grandes hendiduras con el peridio cuarteado, heladas o se aprecia alguna perforación en la gleba. - Se han estudiado distintos tipos de carpóforos pertenecientes a: T. aestivum, T. brumale y T. melanosporum, este último se separaron los ejemplares en función de su maduración. Clasificándose en T. melanosporum inmadura, T. melanosporum de maduración media y T. melanosporum madura. - Los lotes tienen distinta procedencia: Graus (Huesca), Aniés (Huesca), Sarrión (Teruel), el Toro (Castellón), Sierra del Moncayo (Zaragoza) y Valbona (Teruel). La mayoría fueron recolectadas en truferas cultivadas, a excepción de las provenientes de Aniés que han sido recolectadas (cazadas) en truferas silvestres. Las trufas se clasificaron por su procedencia y según su madurez. De cada uno de los lotes se han tomado datos respecto a sus características morfológicas más apreciables, así como de la intensidad del aroma. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 19 Además se trabajó con la especie Pleurotus ostreatus (falsa seta de cardo) con objeto de comprobar la especificidad o polifagia de los parásitos y de conseguir completar su ciclo biológico en caso de que pudiesen actuar como hospedadores secundarios. 3.1.1 MATERIAL FÚNGICO I: Tuber aestivum Se trata de 66 carpóforos de trufa de verano para el ensayo 1: Evaluación del parasitismo en carpóforos de Tuber aestivum. LOTE 1. SARRIÓN 1: El primer lote procedía del municipio de Sarrión en la Comarca de El Maestrazgo, provincia de Teruel. Contenía 14 carpóforos de trufa de verano, visiblemente afectada por distintos parásitos. La duración del ensayo fue de 14 semanas. El lote contenía carpóforos de tamaño heterogéneo los cuales, presentaban una forma irregular, con oquedades y salientes. Se podían observar ejemplares incompletos con presencia de pequeñas larvas de insectos y otros parásitos. Presentaban un fuerte aroma. LOTE 2. GRAUS 1: El segundo lote procedía del municipio de Graus, en la provincia de Huesca. Contenía 16 carpóforos de T. aestivum. Los ejemplares de trufa, llegaban en un tarro cerrado, limpios y cepillados. En ellos no se apreciaba ningún tipo de parásito ni ninguna perforación causada por alguna plaga. Su estudio se realizó durante 2 semanas. Aroma de escasa intensidad. Fig. 14. Lotes de Tuber aestivum, el de la derecha al estar cerrado herméticamente se produjo la muerte de las larvas por asfixia. LOTE 3. GRAUS 2: El tercer lote también era originario del municipio de Graus. Contenía 36 carpóforos de Tuber aestivum, en los que se apreciaba parasitismo. Material y métodos 20 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Su estudio se llevó a cabo durante 16 semanas entre el 20 de Julio y hasta el 22 de Octubre del 2010. El tamaño de los carpóforos fue heterogéneo y su aroma suave. 3.1.2 MATERIAL FÚNGICO II: Tuber melanosporum Se colocaron a evolucionar 30 carpóforos de trufa negra utilizados para el ensayo 2: Evaluación del parasitismo en carpóforos de Tuber melanosporum. LOTE 4. ANIÉS 1: El cuarto lote procedía del municipio de Aniés, en la provincia de Huesca. Contenía 26 carpóforos de Tuber melanosporum. Se apreciaban parásitos de diferentes especies en los carpóforos. Las trufas eran de tamaño heterogéneo, presentando las de mayor tamaño forma aplanada. Aroma de gran intensidad. Los distintos ejemplares del lote se colocaron en los evolucionarios y su estudio se realizó durante 25 semanas desde el 18 de Noviembre del 2010 hasta el 26 de Mayo del 2011. El material fúngico (221 carpóforos) al que se destinaron los lotes quinto, sexto y séptimo fue para realizar el ensayo 4: Evaluación del parasitismo mediante el laminado de los carpóforos pertenecientes a Tuber melanosporum Vittad en función del grado de madurez. Los tres lotes provenían del municipio de Sarrión, habían sido congelados para su posterior estudio y en ellos encontrábamos carpóforos de distinto grado de madurez, los cuales fueron clasificados en tres lotes: maduras, maduración media e inmaduras atendiendo a los criterios que se explican posteriormente. El tamaño del conjunto de trufas fue heterogéneo presentando una forma muy irregular, con hendiduras y salientes. Algunos de los ejemplares estaban incompletos. Estos lotes fueron: LOTE 5. SARRIÓN 2: El lote quinto contenía 54 carpóforos de trufa negra madura. Aroma intenso. LOTE 6. SARRIÓN 3: El lote sexto contenía 85 carpóforos de trufa negra de maduración media. Aroma muy intenso. LOTE 7. SARRION 4: El lote séptimo contenía 82 carpóforos de trufa negra inmadura. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 21 Fig. 15. Lote de Tuber melanosporum procedente de Sarrión. 3.1.3 MATERIAL FÚNGICO III: Tuber brumale, Tuber aestivum y Tuber melanosporum Las trufas pertenecientes para al ensayo 3: Evaluación del parasitismo mediante la evolución final de carpóforos pertenecientes a distintos ejemplares de Tuber correspondían a distintas zonas de la geografía aragonesa. Se evaluaron 6 carpóforos de T. brumale, 63 de T. melanosporum y 12 de T. aestivum LOTE 8. GRAUS 3: Los ejemplares de Tuber brumale procedían de Graus. LOTE 9. EL TORO 1: los carpóforos de Tuber aestivum pesaban un total de 80 gramos y procedían de una plantación del Toro (Castellón). LOTE 10. VALBONA 1: El lote décimo correspondía a Tuber aestivum procedente del municipio turolense de Valbona. Los lotes que se nombran a continuación correspondían todos a carpóforos de T. melanosporum. LOTE 11. EL TORO 2: contenía 6 carpóforos de trufa negra correspondientes a la plantación del Toro (Castellón). LOTE 12. MONCAYO: contenía 10 carpóforos de trufa negra. LOTE 13. GRAUS 4: contenía un total de 20 carpóforos. LOTE 14. SARRION 5: contenía un total de 18 carpóforos de trufas parasitadas. Material y métodos 22 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 3.1.4 MATERIAL FÚNGICO IV. Pleurotus ostreatus (Jacques Fries) Kumm Los distintos ejemplares de Pleurotus ostreatus fueron adquiridos en fresco cada vez que se necesitaba. Para evitar introducir contaminaciones en los distintos ensayos se procedió a congelarlos previamente a ser usados o bien, en el caso de ser introducidos frescos, se utilizaron como testigos de parasitismo en un evolucionario diferente para ver si desarrollaban algún tipo de plaga, evitando de esta forma introducir parásitos no relacionados con Tuber. Se emplearon ejemplares de P. ostreatus para comprobar si podían actuar como huéspedes secundarios de los parásitos del género Tuber. Su presencia es relativamente habitual en los bosques españoles (Sánchez, 2005) y la colonización de sus carpóforos ha sido estudiada en diferentes trabajos (Navarro. et al., 2004). Ya que otros dípteros que se han encontrado en truferas naturales, en algún momento han sido descritos como plaga de setas cultivadas (Gnaneswaran y Wijayagunesakara, 1999; Navarro et al., 2004). En la tabla 2 se puede ver el resumen sobre la procedencia de los distintos lotes de trufa que fueron empleados para los distintos ensayos, el peso, el número de carpóforos, el evolucionario donde fueron colocados y el tiempo de estudio: Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 23 Tabla 2. Características de los lotes de trufas utilizadas en este trabajo. LOTE PESO FRESCO (g) Nº CARPÓFOROS Nº EVOLUCIONARIOS PRESENCIA DE Pleurotus DURACIÓN DEL ENSAYO T. aestivum SARRIÓN 1 334 14 3 Sí 07/07/10 al 22/11/2010 GRAUS 1 166 16 1 Sí 07/07/10 al 20/07/2010 GRAUS 2 1548 36 2 Sí 20/07/10 al 22/11/2010 VALBONA 1 48 4 1 No 24/06/2011 al 30/05/2012 T. melanosporum ANIÉS1 636 26 3 Sí 16/11/2010 al 01/07/2011 ANIÉS 2 7,5 4 1 Sí 08/02/2011 al 26/05/2011 SARRIÓN 2 Madura 1.239 54 - - 01/05/2012 SARRIÓN 3 Maduración media 2.054 85 - - 15/05/2012 SARRIÓN 4 Inmadura 1.570 82 - - 22/05/2012 GRAUS 4 28 179 5 15 1 No 4-25/01/2011 al 30/05/2012 EL TORO 1 80 5 1 No 20/03/2011 al 30/05/2012 EL TORO 2 84 6 1 No 25/11/2011 al 30/05/2012 MONCAYO 149 10 1 No 23/11/2011 al 30/05/2012 SARRION 5 52 105 98 4 8 6 1 No 11/12/2011 23/12/2011 15/12/2011 al 30/05/2012 T. brumale GRAUS 3 42 6 1 No 01/11/2010 al 30/05/2012 T. aestivum 2096 70 T. melanosporum 6281,5 310 T. brumale 42 6 TOTAL 8419,5 386 LEYENDA Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo3 Ensayo 4 Material y métodos 24 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 3.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL En este trabajo se llevaron a cabo 4 ensayos independientes: el primero con Tuber aestivum, el segundo y el cuarto con Tuber melanosporum y en el tercero se usaron ejemplares de T. aestivum, T. melanosporum y T. brumale. En todos se realizó un estudio descriptivo sobre la evolución del material empleado. En los dos primeros ensayos tuvo lugar un conjunto de pasos que fueron comunes. Se han agrupado con el nombre de Proceso base: Recepción y colocación de los carpóforos a estudiar, el cual se comenta a continuación. PROCESO BASE: Recepción y colocación de los carpóforos a estudiar. - Etiquetado y pesado [Fig.16] en una balanza de precisión de los distintos carpóforos. Fig. 16. Pesado y etiquetado de los carpóforos. - Desinfección, montaje y sellado de los evolucionarios: Previamente a ser montados se desinfectaron, luego se sellaron para evitar cualquier tipo de contaminación del exterior. - Colocación de los ejemplares en distintos recipientes: Los ejemplares se colocaron en vasos de precipitados etiquetados junto con la arena, de esta forma los parásitos, si es que alguno completaba su ciclo fuera de la trufa, podrían continuar su desarrollo. Se llenaron hasta la mitad con la arena, y se colocaron las trufas etiquetados [Fig. 17] dentro de los evolucionarios. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 25 Fig 17. Colocación de los ejemplares de Tuber a evolucionar. - Ubicación de los evolucionarios en el lugar de estudio: Para llevar a cabo el estudio, se decidió situar los evolucionarios en el sótano de la Escuela Politécnica. Se equipó el sótano tal como aparece en la figura 18. Éstos fueron tapados con una caja de cartón, evitando de esta manera que incidiera la luz en los distintos carpóforos de Tuber con el fin de conseguir las condiciones normales de desarrollo en las que se encuentra la trufa en el suelo. Material y métodos 26 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig 18. Aplicación de humedad mediante pulverizador y aislamiento del ensayo para evitar contaminaciones y evitar la incidencia de la luz. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 27 - Aplicación de humedad: Se procedió a humedecer con un pulverizador que contenía agua destilada todos los recipientes. De esta forma, los ejemplares de Tuber estarían más húmedos, al igual que la arena, pero sin llegar a alcanzar la capacidad de campo. Esta operación se realizaba varias veces a la semana. - Toma de datos: Se llevó a cabo la toma de datos de los distintos tipos de parásitos que iban apareciendo, así como la realización de fotografías de los mismos. A su vez, se realiza un seguimiento de las temperaturas (máxima, mínima y media) tanto del interior como del exterior de la caja. Para la identificación de los diferentes estadíos se emplearon artículos específicos para cada taxon y se conservaron muestras representativas de cada uno en alcohol. Fig 19. Ubicación de los carpóforos dentro de los evolucionarios. Material y métodos 34 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 3.2.3 ENSAYO 3: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE LA EVOLUCIÓN FINAL DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A DISTINTOS EJEMPLARES DE TUBER. El objetivo del presente ensayo consiste en clasificar y contabilizar los distintos ejemplares de artrópodos que han evolucionado a partir de distintos tipos de carpóforos parasitados. El material fúngico empleado fueron los carpóforos pertenecientes a Tuber brumale que procedían del lote GRAUS 3, Tuber aestivum de VALBONA 1 (Teruel) y de una plantación EL TORO 1 (Castellón). Por último, los carpóforos de Tuber melanosporum: GRAUS 4, SARRIÓN 5, MONCAYO 1, y EL TORO 2.  DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO Conforme se recibieron los distintos lotes de carpóforos se colocaron a evolucionar directamente en recipientes con arena esterilizada. El material se instaló en distintos evolucionarios y, a diferencia de ensayos anteriores, a estos últimos no se les aplicaba alimento ni humedad. El material permaneció sin alterar hasta que se dio por concluido el ensayo el 30 de mayo del 2012 momento en que se procedió a contabilizar el número de adultos que habían salido a la superficie. También se observó a la lupa toda la arena en la que se habían colocado los distintos ejemplares de Tuber, de forma que se pudieron contabilizar los estadíos de larva, pupa y adulto de los distintos parásitos que surgieron durante la evolución. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 35 3.2.4 ENSAYO 4: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO MEDIANTE EL LAMINADO DE CARPÓFOROS PERTENECIENTES A TUBER MELANOSPORUM VITTAD EN FUNCIÓN DEL GRADO DE MADUREZ El objetivo del presente ensayo consiste en evaluar y determinar el grado de parasitismo que afecta a las trufas tanto en el peridio como en la gleba. El material fúngico empleado para la realización del mismo lo componen las trufas de los siguientes lotes: SARRION 2, SARRIÓN 3 Y SARRIÓN 4.  DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO A partir de trufas frescas, reservadas en el congelador, se procedió a laminarlas para poder evaluar el número de galerías y de daños producidos por distintos parásitos en los ejemplares, empleando el siguiente método: - Pesado: Se pesó cada carpóforo por separado, obteniendo de esta forma su peso fresco. - Clasificación en lotes: se clasificaron las trufas en tres lotes, atendiendo a maduras, maduración media e inmaduras. Para clasificarlas, se tomaba una pequeña muestra de la gleba, se colocaba en un portaobjetos con unas gotas de agua y un cubreobjetos encima. Se observaba al microscopio a 200 aumentos y se contaba el número de ascas maduras o viables (de color oscuro), en relación con las inmaduras o inviables (de color claro), cuando aparecía el 30% maduras frente al 70 % inmaduras o viceversa, se consideraban de maduración media. La evaluación se hacía sobre un número aproximado de 100 ascas (Incausa, 2001) [Fig. 28,29,30]. Material y métodos 36 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig 28. Vista al microscopio de ascas y ascosporas de Tuber melanosporum en su mayoría maduras. Fig.29. Vistas al microscopio de ascas de maduración media. Fig 30. Vista al microscopio de ascas y ascosporas inmaduras. Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 37 - Evaluación visual: Se hizo un conteo de las distintas galerías que se observaron en la parte del peridio de cada trufa y después se contabilizaron las que presentaba la gleba [Fig.31]. Fig. 31. Carpóforo de Tuber que presenta gran cantidad de galerías de diplopodo, coleóptero y díptero. - Rallado: Utilizando un laminador de trufa y una bandeja de plástico como soporte, se procedió al laminado de los carpóforos. Las láminas obtenidas [Fig.32] se reparten homogéneamente por toda la superficie y se fueron observando las galerías presentes a medida que se laminaban las trufas. Fig. 32. Galerías producidas por coleópteros y diplopodos (izquierda) y por diplopodos (derecha). Material y métodos 38 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Fig. 33. Laminado de los diferentes lotes de trufa para evaluación de daños producido por los parásitos en la gleba. - Toma de datos: Durante la realización de este paso, se cuentan las galerías que aparecen en las láminas de los diferentes ejemplares. Se especifica el peso fresco de cada carpóforo y una evaluación del grado de parasitismo, indicando si hay galerías o no en el peridio, el número de galerías en la gleba y el tipo de parásito que las ha producido, para cada ejemplar [Fig. 33, 34]. Fig. 34. Galerías producidas por coleópteros y dípteros (izquierda) y por diplopodos (derecha). Material y métodos Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 39 3.2.4.1. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE DATOS Se estudió la posible dependencia de las variables cualitativas “presencia/ausencia de galerías” y “tipo de galerías” de la variable independiente “grado de madurez”, empleando la prueba chi-cuadrado y ordenando los datos de frecuencias en tablas de contingencia. Para el establecimiento de los grupos homogéneos dentro de la variable independiente se empleó la prueba chi-cuadrado entre sus categorías dos a dos. Por otro lado cuando la variable dependiente fue cuantitativa (“número de galerías”) se comprobó su relación con la misma variable independiente “grado de madurez” mediante análisis de varianza (ANOVA) de un factor. Previamente a la realización de este análisis se comprobaron los supuestos de distribución normal de los residuos no tipificados y de homogeneidad de las varianzas, realizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov o la de Levene respectivamente. En caso de no cumplirlos se procedió a transformar la variable. Para realizar la separación de medias se empleó el test de Tukey (Guisande et al., 200). Los datos fueron analizados a través del programa SPSS, versión 15.0. y el nivel de significación empleado siempre fue del 95% (0,05). Material y métodos 40 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Resultados y discusión 46 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber La densidad de fóridos observada no fue siempre la misma. Se observó que Megaselia sp. aparece en los evolucionarios en mayor densidad en las semanas cuarta, quinta, octava y décima desde el inicio del ensayo. Esto es consecuencia de que temperaturas próximas a 24ºC favorecen que se complete el ciclo en 14 días, frente a los 37 días necesarios cuando las temperaturas rondan los 18ºC (Henry et al., 2011). Se llegan a alcanzar poblaciones de más de 300 adultos en los evolucionarios, coincidiendo con el rango de temperaturas óptimo. A partir de la décimocuarta semana desde el inicio del ensayo, la densidad de adultos de Megaselia sp. disminuyó al igual que lo hizo la temperatura [Tabla.5], quedando en los evolucionarios gran cantidad de pupas. En la tabla 6, se muestra la comprobación del ciclo biológico de Megaselia sp.. junto con una breve descripción de las imágenes obtenidas en el laboratorio como justificación del ciclo biológico. Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 47 Tabla 6. Ciclo de Megaselia sp. obtenido en el laboratorio. Evolución de Megaselia sp. Día 0: Se colocan 3 ejemplares de Megaselia sp., una hembra y dos machos, con diversos ejemplares de Pleurotus ostreatus. Las hembras son fotoselectivas. Día 6: Presencia de diversas larvas en los ejemplares. Día 13: Al estar los ejemplares de P. ostreatus ya deshidratados, se observa que las larvas de fórido salen hacia el exterior. Para evitar esto se les proporcionan nuevos ejemplares frescos de setas de ostra. Día 21: Se puede observar como las larvas han pasado al estadío de pupa. Día 26: Aparecen nuevos ejemplares de Megaselia sp. volando por el evolucionario Resultados y discusión 48 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4.3 ENSAYO 2: EVALUACIÓN DEL PARASITISMO EN CARPÓFOROS DE TUBER MELANOSPORUM VITTAD. En Tuber melanosporum se hallaron cuatro especies que se determinaron como parásitos propios de esta trufa. Tres aparecen referenciadas en el trabajo de Bratek et al (2001). y una, Ommatoiulus sabulosus (sin. Schizophyllum sabulosum) es una nueva referencia expresa de parasitismo en ascocarpos de T. melanosporum. Como se muestra en la tabla 7, los parásitos encontrados fueron Ommatoiulus sabulosus (Linnaeus), Leiodes cinnamomea (Panzer), Lycoriella sp. (Winnertz). y Helomyza tuberivora. Lográndose completar el ciclo biológico en su totalidad sobre T. melanosporum y Pleurotus ostreatus de Lycoriella sp.. (apartado 4.2.3) y Helomyza tuberivora (apartado 4.3.4). Tabla 7. Número de parásitos evaluados visualmente en sus distintas fases, localizados en Tuber melanosporum. 050 100 150 200 250 Ommatoilus sabulosus Leiodes cinnamomea Lycorella spp. Helomyza tuverivora adulto larva En la tabla 7 aparecen reflejados los diferentes parásitos de T. melanosporum y la cantidad de parásitos de cada tipo. De inicio solo hay adultos de O. sabulosus y de L. cinnamomea, mientras que hay larvas de L cinnamomea, Lycoriella sp.. y H. tuberivora. Especies encontradas Número de especies Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 49 A mediados de diciembre [Tabla.8], se registraron unas temperaturas muy bajas. Con el fin de tener unas condiciones lo más similares posible a las que se encuentra la trufa en el suelo, se procedió a colocar una estufa con termorregulador produciendo una elevación de las temperaturas tal como se observa en la tabla 8. En este ensayo se han encontrado indicios de la existencia de una posible sucesión de artrópodos que parasitan a la trufa. Las hembras de L. cinnamomea serían las primeras en ser atraídas por el aroma de la trufa (Harrington, 2005), mientras que Lycoriella sp. podría verse atraída selectivamente por el aroma de las trufas al inicio de su maduración. Conforme la trufa madura, las sustancias volátiles que emite el carpóforo maduro atraen selectivamente a H. tuberivora, indicador por excelencia de la presencia del hongo maduro en el suelo. Tabla 8. Evolución de las temperaturas máxima, mínima y media junto con las especies de adultos parásitos propios de T. melanosporum que aparecieron durante el tiempo que duró el ensayo, colocados en orden de aparición. 0 5 10 15 20 25 30 35 Tª Max Tª Min Tª media A continuación, se pasa a describir pormenorizadamente los artrópodos parásitos encontrados en T. melanosporum en función del orden en el que fueron apareciendo. Ommatoilus sabulosus Leiodes cinnamomea Lycoriella spp. Helomyza tuberivora º C Resultados y discusión 50 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4.3.1 Ommatoilus sabulosus Al recibir los lotes de T. melanosporum para ser estudiados, se observó la aparición de varios ejemplares de diplópodos (Tabla 9) (milpiés), identificados posteriormente como Ommatoilus sabulosus (sin. Schizophyllum sabulosum) (Linnaeus). Se contabilizó la presencia de 6 diplópodos adultos (Tabla 9), los cuales parasitaban las trufas generando en los carpóforos las galerías más grandes. Estos miriápodos aprovechan los orificios creados por otros insectos micófagos para alimentarse de la trufa, provocando los mayores daños observados a lo largo de este trabajo tanto en el peridio como en la gleba. Tabla 9. Ejemplares de Ommatoilus sabulosus, encontrados parasitando la trufa, su longitud alcanza los 2 cm. No se ha encontrado ningún artículo en la revisión bibliográfica en la que asocien al milpiés como parásito de la trufa. Por lo tanto, es la primera vez que se procede a evaluar en un trabajo de investigación sobre la trufa el grado de parasitismo que produce dicho diplópodo (resultados y discusión 4.5). Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 51 4.3.2 Leiodes cinnamomea Al contrario que en el ensayo de Tuber aestivum (4.1.1) en el que sólo se observaron larvas, en este caso se identificaron tanto larvas como adultos de coleóptero (Tabla 10). Por las características morfológicas que presentaban los distintos estadíos (Arzone, 1971; Quentin, 1985), se identifia como Leiodes cinnamomea (Panzer). Su presencia en el ensayo tiene lugar desde el comienzo del mismo hasta mediados de diciembre (Tabla 8). Las larvas y los imagos se encontraron en la parte interna de los carpóforos, ya que se ha podido comprobar que se alimentan de la gleba, causando daños irreparables. Son unas larvas de gran voracidad. Las larvas de L. cinnamomea presentan en su desarrollo tres etapas, tras las cuales entran en diapausa coincidiendo con el verano, para pasar al estadío de ninfa en otoño. Los adultos aparecen cuando los carpóforos de T. menalosporum empiezan a madurar (desde mediados de noviembre a mediados de mayo). Presentan una generación anual. Fig.37. Larva y adulto de Leiodes cinnamomea. Su tamaño es de 0,5 cm. Resultados y discusión 52 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Tabla 10. Tabla en la que aparece reflejado los distintos estadíos observados de Leiodes cinnamomea sobre Tuber melanosporum. Estadíos de Leiodes cinnamomea Distintas larvas de L. cinnamomea observadas al levantar un ejemplar de T. melanosporum. Crean sus nichos ecológicos tanto en el interior de los carpóforos como en la parte inferior de la trufa. Larva de L. cinnamomea. Presentan gran agresividad. Su tamaño es de 4 mm. Adulto de Leiodes cinnamomea, su tamaño alcanza los 0,5 cm. generando grandes galerías en los carpóforos. . Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 53 4.3.3 Lycoriella sp. Desde principios de diciembre hasta mediados del mes de febrero (Tabla 11), se desarrolló la plaga identificada como Lycoriella sp. (Winnertz) perteneciente a la familia de los esciáridos (Diptera: Sciaridae) (Seung-gwan et al., 2012). Los esciáridos son organismos saprófagos que habitan en la naturaleza en agrupamientos de material vegetal en descomposición. Pasan el 60% del tiempo como larva y sólo un 20% en forma de pupa (Navarro, 2004). Una vez realizada la puesta, las larvas se dirigen hacia la superficie para poder pasar a pupa y evolucionar a estadíos adultos. Se logró reproducir todo el ciclo en un evolucionario aparte sobre T. melanosporum y P. ostreatus, tal como muestran las imágenes de la tabla 11. La duración del ciclo depende de la temperatura y de la cantidad de alimento (Finley et al., 1984). En nuestro caso, la duración del ciclo fue de 38 días. Resultados y discusión 54 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Tabla 11. Evolución del ciclo de Lycoriella sp. comprobado en el laboratorio sobre Tuber melanosporum y Pleurotus ostreatus. Ciclo de Lycoriella sp. Día 0: Se coloca el carpóforo de trufa negra en un evolucionario, ya que presenta gran cantidad de larvas. Día 5: Larva de esciárido, presenta 2 mm de longitud. Día 15: Las pupas tienen un tamaño aproximado de 2mm. Inicialmente son blanquecinas, pero cuando van a eclosionar adquieren una coloración más oscura. Día 38: Aparición de los adultos, alcanzan un tamaño de 2 mm. Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 55 4.3.4 Helomyza tuberivora Desde principios de diciembre hasta mediados de febrero se desarrolló la plaga identificada como Helomyza tuberivora (Tabla 13) (antiguamente citada como Suilla tuberivora) (Coutin, 1972; Oliver et al., 1996; Paccioni y Lalli, 1990; Callot, 1999) perteneciente a la familia Helomyzae. En España encontramos dos especies: Helomyza gigantea (anteriormente Suilla tuberivora) y Suilla fuscicornis (la llamada “mosca amarilla de ojos rojos”). Ambas conocidas vulgarmente como “moscas de la trufa”. Estos dípteros están muy presentes en las áreas truferas, siendo fieles indicadores de la presencia de carpóforos en el suelo. Viven bajo tierra, en las cavidades del ascocarpo. Es una plaga muy asociada al cultivo de la trufa, se puede encontrar en multitud de guías, ya que mediante el vuelo de los adultos se puede localizar el hongo muy maduro, lo que se conoce en truficultura como “cazar trufas a la mosca” (Callot, 1999; García et al., 2004). La duración total del ciclo depende principalmente de la temperatura, aunque también se ve afectada por la cantidad de alimento disponible. En el laboratorio se consiguió reproducir el ciclo biológico de Helomyza tuberivora, pero el descenso drástico de las temperaturas (14º C), como se muestra en la tabla 12, provocó la muerte de los adultos. Tabla 12. Evolución de las temperaturas durante el ciclo biológico de Helomyza tuberivora. El descenso brusco de las temperaturas provocó la muerte de los adultos. º C Resultados y discusión 62 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Si estudiamos los grados de madurez haciendo una comparativa dos a dos, entre lotes, encontramos los resultados que figuran en las tablas 16 y 17. Tabla 16. Resultados de la prueba de χ2 (valor χ2 y significación p<0,05) para cada combinación dos a dos de los grados de maduración. ns: prueba no significativa. Valor p Lote maduras y lote maduración media 4,490 ν 0.034 < 0,05 * Lote maduras y lote inmaduras 3,974 ν 0,046< 0,05 * Lote maduración media y lote inmaduras 0,032 0,859 > 0,05 ns ν Se aplicó la corrección de Yates ya que alguna frecuencia esperada resultó ser < 5. Tabla 17. Separación en grupos homogéneos de frecuencia de aparición de larvas en función del grado de madurez. Lote maduras 100% b Lote maduración media 89,4% a Lote inmaduras 90,2% a La presencia de galerías parece ser significativamente mayor en trufas maduras frente a las de maduración media e inmaduras. Sin haber diferencias significativas entre estos dos últimos grupos. Este hecho puede ser consecuencia de la mayor concentración de aromas que emiten los carpóforos maduros frente a los inmaduros (Callot, 1999), lo que provoca que los parásitos se vean mayoritariamente atraídos hacia ellas. 4.5.2 NÚMERO DE GALERÍAS Se procedió a realizar un estudio del número de galerías detectado por carpóforo. De cada ejemplar de trufa se contabilizó el número de perforaciones que presentaba (material y métodos 2.4). Para la realización del análisis de varianza se transformó la variable mediante la raíz cuadrada para que los residuos no tipificados tuviesen una distribución normal Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 63 (prueba de Kolmogorov-Smirnov con Z=0,957 y p=0,319 >0,05) y que las varianzas fuesen homogéneas (prueba de Levene con valor= 1,564 y p=0,212>0,05). Los resultados del ANOVA realizados sobre los datos del número de galerías para cada ejemplar de cada lote se muestran en la tabla 18. En ella se observa que el número de galerías depende del grado de madurez. Siendo este significativamente mayor en las trufas maduras que en los otros dos grupos ya que éstas se encuentran más tiempo en el campo. En éstas, se obtuvo una media de 8,4 galerías por ejemplar. Tabla 18. Número de trufas analizadas, número medio de galerías y desviación típica en función del grado de madurez de los lotes analizados. Resultados de la ANOVA (F y p) y separación de medias por el test de Tukey. Los lotes que no comparten letra tienen diferencias estadísticamente significativas entre sí (p < 0,05). Nº de casos Media y p Inmaduras 82 5,9±4,5 a Maduración media 85 5,4±4,4 a Maduras 54 8,4±4,5 b H y p 7,967 0.000 4.5.3 TIPO DE GALERÍA Al proceder al laminado de la trufa, se evaluó visualmente los distintos tipos de galerías que presentaba la gleba en función del grado de maduración. Los diámetros más pequeños pertenecían a los dípteros, los que eran un poco más grandes correspondían a coleópteros y los mayores orificios a milpiés como se muestra en la figura 39. Fig. 39. Daños producidos por dípteros, coleópteros y milpiés. Resultados y discusión 64 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber Cuando se realizó el análisis de la gleba, se procedió a contabilizar el número de galerías que presentaba cada carpóforo en función del tipo de parásitos que las habían producido. Comprobando así, si la frecuencia de aparición de cada artrópodo depende de la madurez del lote. Los resultados obtenidos aparecen en la tabla 19. Tabla 19. Frecuencia de aparición de daños producidos por los tres diferentes grupos de artrópodos considerados en los tres niveles de madurez de los carpóforos de Tuber melanosporum. Resultados de la prueba de χ2 (valor χ2 y significación p) para cada combinación dos a dos de los grados de maduración. ns: ausencia de diferencias significativas. Las frecuencias que no comparten letra poseen diferencias significativas entre sí; p>0,05. Grado de madurez % Dípteros % Coleópteros % Miriápodos Maduras 74,1 % ns 75,9 % b 16,7 % b Maduración media 78,8 % ns 43,5 % a 0,0 % a Inmaduras 74,4 % ns 34,1 % a 1,2 % a χ2 y p 0,598 y 0,742 23,859 y 0,000 24,529 y 0,000  DÍPTEROS Los resultados que se muestran en la tabla 19, nos dicen que la presencia de daños producidos por los dípteros no depende de la madurez del lote. No hay diferencias significativas entre los distintos grados de madurez. Este hecho no quiere decir que cada grupo de dípteros no esté selectivamente ligado a ciertas fases de la maduración de los carpóforos como se observó en el ensayo 4.2. En este caso la apreciación a posteriori del total de daños de cada ejemplar no ha permitido hacer esta distinción.  COLEÓPTEROS La frecuencia de aparición de los coleópteros depende del grado de madurez del lote y parece ser directamente proporcional a la maduración de los carpóforos. No encontrando diferencias significativas entre los lotes maduración media e inmaduras (Tabla 19). Las trufas maduras presentan mayor cantidad de coleópteros, confirmando el trabajo de Harrington (2005), donde se señala que esta especie es la que se encuentra con mayor frecuencia en T. melanosporum maduras ya que las hembras de L. cinnamomea se sienten más atraídas hacia la trufa por sus compuestos volátiles. Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 65  MIRIÁPODOS La incidencia del daño producido por los miriápodos depende de la madurez del lote. Como se muestra en la tabla 19, los carpóforos maduros son los que mayor incidencia de daños producidos por miriápodos presentan existiendo diferencias estadísticamente significativas entre ellos y los otros dos grupos. Ninguno de los lotes presentó daños producidos únicamente por milpiés. Durante el periodo de realización de los ensayos se pudo comprobar que el milpiés aprovecha las galerías generadas por los coleópteros agrandándolas. Por sí solo parece no ser capaz de generar galerías. También hay que considerar que la dureza del peridio y de la gleba es mucho menor cuando el carpóforo sobremadura, lo que facilita la entrada de este tipo de parásitos oportunistas, ya que sus mandíbulas no son lo suficientemente fuertes como para perforar la trufa por sí solas creando nuevas galerías. Resultados y discusión 66 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4.6 DAÑOS Y POSIBILIDADES DE CONTROL DE LOS DISTINTOS PARÁSITOS ENCONTRADOS EN TUBER 4.6.1 COLEÓPTEROS Leiodes cinnamomea Los daños generados, tanto por la larva como por el adulto, son cuantiosos, ya que excavan grandes galerías tanto en el peridio como en la gleba, siendo las larvas las más agresivas, provocando su voracidad las mayores pérdidas en la gleba. Por contra, los adultos provocan graves perforaciones en la parte externa de la trufa. En el presente trabajo, se han encontrado larvas de coleóptero en ejemplares de T. melanosporum y T. aestivum a diferencia de lo que indican otros trabajos de investigación sobre coleópteros en Tuber (Arzone, 1971; Reyna, 2012). CONTROL: Se han realizado diferentes estudios sobre posibles medidas de control para Leiodes, (Femcal, 2011) realizados por la Universidad Católica de Ávila (2011), en los que se emplea un sistema basado en el trampeo masivo con feromonas de la explotación micológica, realizado de forma ecológica y selectiva. 4.6.2 MIRIÁPODOS Ommatoilus sabulosus Los diplópodos se consideran plaga secundaria, ya que parasitan productos cercanos a la podredumbre y se alimentan de la vegetación en descomposición o la materia orgánica mezclada con el suelo (Crawford, 1990). Es la primera vez que se describe esta plaga en trufa. Los daños ocasionados son galerías de gran diámetro, que provocan graves pérdidas en la gleba. Necesitan que los carpóforos se encuentren cercanos a la podredumbre, puesto que por si solos no son Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 67 capaces de crear galerías. Tal como se ha observado en este proyecto, aprovechan las galerías perforadas por los coleópteros para ampliarlas y seguir parasitando los carpóforos. Son vectores de enfermedades, ya que en sus extremidades llevan multitud de bacterias. CONTROL: Es conveniente la eliminación del resto de plagas que afectan a los ejemplares de Tuber, puesto que al ser una plaga secundaria no podrá aprovechar las galerías generadas por otros artrópodos. Los diplópodos al carecer de una cutícula cerosa son susceptibles a la pérdida de agua, y deben pasar la mayor parte de su tiempo en ambientes húmedos o mojados, necesitando tener humedad en el terreno. Se evitará que parasiten la zona de la trufera si se logra reducir la humedad. 4.6.3 DÍPTEROS 4.6.3.1 Megaselia sp. El mayor daño causado por los fóridos tiene lugar cuando se encuentran en estadío larvario, ya que producen multitud de túneles en la gleba que generan graves deterioros en la calidad. Los adultos también se consideran dañinos porque actúan como vectores de enfermedades y de plagas. Se necesita un gran número de larvas o de adultos para que afecten a la producción. En este ensayo se ha manifestado en Tuber aestivum y Tuber melanosporum, siendo en el primero donde mayor población ha desarrollado. Para evitar que la población aumente en la plantación es conveniente retirar los ejemplares de trufa de verano y cualquier tipo de carpóforo, tanto epigeo como hipogeo, evitando así que Megaselia sp., al no tener alimento, complete el ciclo y produzca daños sobre trufa negra. Resultados y discusión 68 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 4.6.3.2 Lycoriella sp. Los esciáridos permanecen en estadío larvario mucho más tiempo que los fóridos, es por ello que son más peligrosos. El estadío larvario es el que produce mayor daño a la parte interna de la trufa, afectando de forma importante a la calidad. Los adultos también son dañinos, ya que hacen sus puestas en las láminas y en la base de los pies de los carpóforos epigeos siendo usados por otras plagas para su dispersión (Clift y Larsson, 1987). En el presente proyecto, se ha podido comprobar que los adultos de Lycoriella sp. hacen su aparición en T. melanosporum unas semanas antes que lo haga Helomyza tuberivora. Esta observación, de comprobarse con certeza, podría hacer de este parásito un indicador más fiable de la presencia en el suelo de carpóforos más cercanos al punto de maduración, que además desaparecen cuando la trufa ya se encuentra madura quedando solamente H. tuberivora como parásito en estas trufas. Sin embargo, el pequeño tamaño de sus adultos, comparados con los de H. tuberivora, limitaría su uso para la “caza con mosca”. 4.6.3.3 Helomyza tuberivora La plaga causada por Helomyza tuberivora es la más común asociada al cultivo de la trufa, junto con la originada por Leiodes cinnamomea. Los helomícidos adultos depositan sus huevos sobre el terreno donde se encuentra la trufa. La puesta, muchas veces, tiene lugar en fases avanzadas de maduración del hongo, ya que es en esos momentos, cuando éste desprende mayor aroma. Esto indica hipermaduración o incluso putrefacción del ascoma (García, 2004; Callot, 1999). Son micetófagas estrictas, ya que sus larvas consumen el ascocarpo de la trufa, lo que provoca una rápida degradación por putrefacción enzimática de toda la gleba. Sin embargo, los adultos favorecen la dispersión de esporas, al quedar éstas adheridas a sus pilosidades. Los adultos también se usan como indicadores de la localización del hongo maduro, debido a que su tamaño es superior a 1 cm, a diferencia de las anteriormente citadas que no superaban los 0,3 cm. Resultados y discusión Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 69 Helomyza tuberivora presenta dos generaciones por año, ya que desde el mes de marzo se pueden observar adultos cerca de los árboles truferos. (Coutin, 1972). En el presente proyecto, dicho díptero se manifestó en T. aestivum, T. brumale y T. melanosporum, reproduciendo el ciclo sobre este último. 4.6.3.4 POSIBLES SOLUCIONES PARA EL CONTROL DE DÍPTEROS Y RESTO DE ARTRÓPODOS EN LAS TRUFERAS A modo de reflexión, sería necesario disminuir los alimentos puente sobre la que los adultos hacen la puesta para conseguir una reducción del número de individuos en la trufera. Ello implicaría la eliminación de la plantación de las setas y carpóforos epigeos e hipogeos, que actúan como fuente de alimento y lugar de reproducción, puesto que Megaselia sp. y Lycoriella sp. son insectos polífagos. En el caso de emplear el método usado en este proyecto, al haber obtenido los ciclos biológicos de Megaselia sp., Lycoriella sp. y Helomyza tuberivora, sería conveniente llevar a cabo nuevos estudios de investigación para establecer estrategias de control sobre dichos dípteros. Lo ideal sería realizar un control biológico, teniendo en cuenta que todavía no se conoce la fauna auxiliar de estos insectos. Por otro lado sería conveniente retirar las trufas parasitadas del cultivo con el fin de reducir la población de parásitos de dípteros. Además una manera, habitual entre los recolectores, de disminuir la carga parasitaria de las trufas recolectadas es aislarlo dentro de un recipiente cerrado herméticamente durante poco tiempo, de manera que los parásitos salen de las trufas y mueren por asfixia. Una vez recolectadas las trufas parasitadas o no, lo más conveniente sería alejarlos de la zona de cultivo o recolección para evitar un nuevo parasitismo de los carpóforos sanos, disminuyendo de esta manera las poblaciones de artrópodos dañinos en el ecosistema. Además, si en la zona hubiera trufas de otras especies, como de T. aestivum, si se recolectaran, evitaríamos que los artrópodos completaran su ciclo rompiendo la cadena de alimentación. Resultados y discusión 70 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber A su vez, la refrigeración rápida de las trufas eliminarían los adultos, tal como se pudo comprobar en el caso de Megaselia sp y Helomyza tuberivora. Para evitar poblaciones y daños excesivos de estos artrópodos resultaría útil realizar una pequeña labor de arado en las partes más superficiales del quemado, es decir la parte que comprendiera los primeros 30 cm del suelo. De esta forma se eliminarían los ejemplares de Tuber más someros, que son los más fáciles de parasitar. 5. CONCLUSIONES Bibliografía Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 71  ALONSO PONCE R., ÁGUEDA B., ÁGREDA T., MODREGO M.P., ALDEA J MARTÍNEZ-PEÑA. (2010). Un modelo de potencialidad climática para la trufa negra (Tuber melanosporum) en Teruel (España). Departamento de Investigación y Experiencias Forestales de Valonsadero. Consejería de Medio Ambiente. 19(2), 208-220.  ARZONE, A. (1971). Reperti ecologici ed etologici di Liodes cinnamomea Panzervivente su Tuber melanosporum Vittadini (Coleoptera Staphylinoidea). Centro di Entomologia Alpina e Forestale del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Publicazione nº 158: 317-357.  BRATEK Z., PAPP L., MERKL O. (2001). Beetles and flies living on truffle. Actes du V Congrès International. Science et Culture de la Truffe, Aix en Provence, France: 191-192.  BROWNE D.J, SCHOLTZ C.H. (1995). Phylogeny of the families os Scarabaeoidea (Coleoptera) based on characters of the hindwing articulation, hindwing base and wing venation. Systematic Entomology 20:145-173.  CALLOT, G. (1999). La truffe, la terre, la vie. Ed. INRA editions. Versailles. 7:180-187.  CLIFT, A.D. y LARSSON, S.F. (1987). Phoretic dispersal of Brennandania lambi (Kcraczal)by mushroom flies (Diptera: Sciaridae and Phoridae) 3: 11-20.  COUTIN, R. (1972). Insects et champignons. Societé Versaillaise de Sciences Naturelles: 80-90.  CRAWFORD, C.S. (1990). Millipedes as model Detritivores, 8th International Congress of Myriapodology, Innsbruck, Austria 10: 277-288.  DELMAS M. THIERRY T. (1987). Principal constituents of black truffle (Tuber melanosporum) 774-777.  DE MIGUEL VELASCO A., SÁEZ GARCÍA FALCES R. (1995). Guía practica de truficultura. I.T.G. Universidad de Navarra. 3:34-36.  DE MIGUEL VELASCO A., SÁEZ GARCÍA-FALCES R. (2008). La trufa. Guía de truficultura. Ed. instituto técnico y de gestión agrícola, S.A. ITGA. 132pp.  DESSOLAS H., CHEVALIER G , PARGNEY J-C. (2008). Nouveau Manuel de Trufficulture. Rèèdition du manuel deu Docteur Pradel (1914) rèactualisè et amendè par. Ed. Misse en Pages Perigueux (France). Pag: 35, 121-122. Bibliografía 72 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber  FEMCAL. (2011). Federación de asociaciones micológicas de Castilla y León. Insectos micófagos, estudio de la universidad de Navarra. http://www.famcal.es/index.php?option=com_content&view=category&id=41& layout=blog&Itemid=65 [en línea] consultado diciembre de 2011.  FINLEY, R.J., WUEST, P.J., TOYSE, D.J., SNETSINGER, R.J., TETRAULT, R., RINKER, D.L. (1984). Mushroom flies. Mushroom J., 139: 240-247.  GARCÍA-MONTERO, L. G., PÉREZ ANDUEZA, G., DÍAZ, P. MANJÓN, J. L. (2004). Contribución al conocimiento ecológico de los dípteros fitófagos (Díptera: Heleomyzidae) de las trufas en España. Bol. San. Veg. Plagas, 30: 679-683.  GNANESWARAN, S., WIJAYAGUNESAKARA, N. P. (1999). Survey and identification of insects pest of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) culture in central province of Sri Lanka. Tropical Agricultural Research and Extension. 2 (1): 21-25.  GRANETTI B., CIORGIO MATEROZZI A.A. (2005). Umbria terra di tartufi. Ed. Regione umbría, grupo micologico ternano. 303pp.  GULLAN, P.J.; CRANSTON, P.S. (2000). The insects. An outline of Entomology. Blackwell Science. 470 pp.  GUISANDE, C., VAAMONDE, A., BARREIRO, A. (2011). Tratamiento de datos con R, Statistica y SPSS. Ed. Díaz de Santos. 978 pp.  HARRINGTON , T. C. 2005. Ecology and evolution of mycophagous bark beetles and their fungal partners. . Ecological and Evolutionary Advances in Insects-Fungal Association. Vega, F. P, and Blackwell, M, eds., Oxford University Press, 257-291.  HENRY R., DISNEY L., WITHERS P. (2011). Scuttle flies (Diptera, Phoridae) reared from tree rotholes in France, including three new species of Megaselia Rondani. Fragmenta Faunistica 54 (1): 29-41.  HOCHBERG, M. E., BERTAULT G., POITRINEAU K., JANSSEN A. (2003). Olfactory orientation of the truffle beetle, Leiodes cinnamomea. The Netherlands Entomological Society, Entomologia Experimentalis et Applicata, 109: 147-153. Bibliografía Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 73  IAN HALL R., GORDON BROWN T., ZAMBONELLI A. (2007). Taming the Truffle. The history, Lore, and Science of the Ultimate Mushroom. Ed. Timber Press. 304pp.  INCAUSA GINÉS A. I. (2001). Estudio de la calidad esporal de los carpóforos de Tuber melanosporum Vitt. Según su procedencia y su influencia posterior en la micorrización artificial de Quercus ilex L. Universidad de Zaragoza 68pp.  KIRK, P.M., CANNON, P.F., MINTER D.W., STALPERS, J.A. (2008). Diccionary of the fungi 769 pp.  KÜES, U., MARTIN, F. (2011). On the road to understanding truffles in the underground. Fungal Genetics and Biology, 48: 555-560.  MARTÍN M, GÓMEZ E., INCAUSA A. (2010). Guía de buenas prácticas en truficultura.59pp.  MIRANDA-MIRANDA E., COSSIO-BAYUGAR R., MARTINEZ-IBAÑEZ F., BAUTISTA-GARFIAS C.R. (2011). Megaselia scalaris reare don Rhipicephalus (Boophilus) microplus laboratory cultures. Short communication Mediccal and Veterinary Entomology 25, 344-347.  NAVARRO LOZANO M.J, GEA ALEGRÍA F.J, FERRAGUT PÉRZ F.J. (2004). Biología y control del ácaro miceliófago Brennandania lambi (krczal) en los cultivos de champiñón de Castilla-La Mancha” Ministerio de agricultura, pesca y alimentación. 35-76.  OLIACH D., BONET J.A., FISCHER C.R., OLIVERA A., MARTÍNEZ DE ARAGÓN J., SUZ L. M., COLINAS C. (2005). Guía técnica para el cultivo de trufa negra (Tuber melanosporum Vitt.). Ed. Centre Tecnológic Forestal de Catalunya. 30pp.  OLIVER J.M, SAUVIGNAC J.C., SOURZAT P. (1996).Truffe et trufficulture. Ed. Fanlac.263pp.  PACCIONI, G., LALLI, G. (1990). Strategie adattative di alcuni Tuber. Atti Del Secondo Congreso Internazionale Sul Tratufo, Spoleto, Italia: 403-408.  PALAZÓN, C., DELGADO, I., BARRIUSO, J. (1999). “Instalación de truferas artificiales. Requerimientos y posibilidades de cultivo”. 1ª jornadas internacionales sobre truficultura en Aragón. Graus (Huesca). 21-22/10/1999. Bibliografía 74 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber  PALAZÓN C. Y BARRIUSO, J. (2007). Viveros y producción de planta micorrizada. En: Truficultura. Fundamentos y técnicas. S. Reyna (Ed.). Mundi prensa. 688pp.  QUENTIN D. WHEELER (1985). Larval Characters of a Neotropical Scotocryptus (Coleoptera: Leiodidae), a Nest Associate of Stingless Bees (Hymenoptera: Apidae). Journal of the New York Entomological Society Vol. 93, No. 3 (Jul., 1985), pp. 1082-1088.  REYNA DOMENECH, S. (2000). Trufa, truficultura y selvicultura trufera. Ed. Mundi-Prensa. Madrid, 229 pp.  REYNA DOMENECH, S. (2007). Truficultura. Fundamentos y técnicas. Ed Mundi-Prensa. Madrid, 688 pp.  REYNA DOMENECH, S. (2012). Truficultura. Fundamentos y técnicas. Ed Mundi-Prensa. Madrid, 720 pp.  RICARD J., CTIFL (2003). La truffe. Guide technique de trufficulture. Les editons du Centre Technique interprodessionnel des fruits et legumes. 13:223- 224.  RICIONNI C., BELFIORI B., CICHOCKI N., LABLÉ J., MORIN E. (2008). Sex and truffles: first evidence of Perigord black truffle outcrosses 260- 263.  RIVERA MEDINA S. (2009). Caracterización, descontaminación y conservación de Tuber melanosporum (trufa negra) y Tuber aestivum (Trufa de verano) 345pp.  RUBINI A., BELFIORI B., RICCIONI C., ARCIONI S., MARTIN F. PAOLOCCI F. (2011). Tuber melanosporum: mating type distribution in a natural plantation and dynamics of strains of different mating types on the roots of nursery-inoculated host plants. New Phytol. 189, 723–735.  SÁNCHEZ, J. (2005). El mundo de los hongos. En Setas de Salamanca. C.J. Valle (Coord.). Ediciones de la Diputación de Salamanca. 461 pp.  SÁNCHEZ OSORIO, I. (2005). Orientación olfativa de "Cerambyx welensii" Küster y "Prinobius germari" Dejean, principales cerambícidos xilófagos de encina ("Quercus ilex L. subsp. ballota") y alcornoque ("Quercus suber L".), para la localización de hospedantes. 209pp. Bibliografía Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber 75  SEUNG-GWAN S., HEUNG-S., SAUNGHWAN L. (2012). Dark winged fungus gants (Diptera: Sciaridae) collected from shiitake mushroom in Korea. 174-181.  SOURZAT, P. (1994). Guide practique de trufficulture. Station D’Expérimentations sur la Truffe, Cahors. 96 pp.  STEINECK HELLMUT (1987). Cultivo comercial del champiñón” Segunda edición. Ed. Acribia. 86-92.  TRAPPE J.M, CASTELLANO J., CLARIDGE A.W. (2001). Continentan drift, mycophagy, and the biogreography of hypogeus fungi. Actes du V Congrès. International. Science et Culture de la Truffe, Aix en Provence, France : 241-246.  VERLHAC A. (1990). La truffe guide pratique.Ed. CTIFL. Paris. 5:89-96.  VIGNOZZI, G., DE ROGATIS, A. (1990). Iniziative dell’E.T.S.A.F. per lo sviluppo della tartuficoltura in Toscana - Prime osservazioni in una giovane tartufaia sperimentale. Atti Del Secondo Congreso Internazionale Sul Tratufo, Spoleto, Italia: 563-577.  VILAS, J. (2011). Historia de la truficultura y situación actual. Conferencia en el curso introducción a la truficultura. Abril 2011, Biscarrués (Huesca).  WHITE, P.F. (1987). The mushroom pest complex-its affect on yield and quality. En: Cultivating Edible Fungi. 301-310.  ZELLER B., BREKET C., MANRICE J.P. LE TACON F. (2008). Saprotrophic versus symbiotic strategy during truffle ascocarp development under holm oak. A response based on C13 and N15 natural abundance. Ann. For. Sci. 65 607pp.  Études sur les truffes comestibles au point de vue Botanique, Entomologique, Foriestier et Commercial Henry Bonnet, 1869. http://books.google.com.na/books?id=gsIUAAAAYAAJ&printsec=frontcover& source=gbs_similarbooks_r&cad=2#v=onepage&q&f=false [en línea] consultado enero de 2012.  United States Department of Agriculture. Forest Service, Southern Region, Southern Research Station. Research Station. http://www.fs.fed.us/r8/foresthealth/pubs/oakpests/contents.html [en línea] consultado febrero de 2012. Bibliografía 76 Artrópodos parásitos asociados a carpóforos del género Tuber  The Government Department Responsible for the Protection and Expansion of Britain’s Forests and Woodlands. http://www.forestresearch.gov.uk/ [en línea] consultado abril de 2012. http://www.marm.es/es/biodiversidad/temas/montes-y-politica- forestal/AEF_2008_COMPLETO_tcm7-158056.pdf [en línea] consultado en mayo 2012.  http://www.faunaeur.org [en línea] consultado en junio 2012.