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Trabajo de Fin de Master Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias USO DE LA COMBINACIÓN DE MELATONINA Y PROSTAGLANDINAS PARA LA SINCRONIZACIÓN DEL ESTRO EN OVEJAS DE RAZA RASA ARAGONESA Manuel Agustín Silva Director: José Alfonso Abecia Martínez 2012 Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Índice de Contenidos Manuel Agustín Silva 2 Índice de Contenidos Agradecimientos .............................................................................. 5 1. Resumen ..................................................................................... 7 1. Summary ..................................................................................... 8 2. Introducción ................................................................................. 9 2.1. Actividad Reproductiva en la Oveja ....................................................... 11 2.2 Control del ciclo estral............................................................................. 15 2.2.1 Métodos no farmacológicos de control sexual ................................. 15 2.2.1.1.1. Aislamiento entre sexos ............................................................... 16 2.2.1.1.2. Las hembras deben encontrarse en el período de anoestro. ........ 17 2.2.1.1.3. Los machos .................................................................................. 17 2.2.1.1.4. Las hembras ................................................................................. 19 2.2.1.1.5. Respuesta endocrina a la introducción de machos ....................... 19 2.2.1.1.6. Tipos de Respuesta ...................................................................... 20 2.2.1.1.7. Combinación con otros tratamientos ............................................. 22 2.2.1.2.1. Protocolo de uso .......................................................................... 23 2.2.2. Métodos Farmacológicos ................................................................ 24 2.2.2.1.1. Química, secreción y metabolismo ............................................... 25 2.2.2.1.2. Mecanismo de acción y efectos fisiológicos ................................. 27 2.2.2.1.3. Protocolo de uso ........................................................................... 29 2.2.2.2.1. Química, secreción y metabolismo. .............................................. 31 2.2.2.2.2. Funciones ....................................................................................... 33 2.2.2.2.3. Protocolo de uso ........................................................................... 34 2.2.2.3.1. Química, secreción y metabolismo ............................................... 37 2.2.2.3.2. Funciones ..................................................................................... 38 2.2.2.3.3. Protocolo de uso ........................................................................... 41 2.2.2.4.1. Protocolo de uso ........................................................................... 43 3. Objetivos ................................................................................... 44 4. Hipótesis .................................................................................... 44 5. Material y Métodos .................................................................... 45 5.1. Instalaciones .......................................................................................... 45 5.2. Inducción de celo ................................................................................... 45 Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Índice de Contenidos Manuel Agustín Silva 3 5.2.1. Animales ......................................................................................... 45 5.2.2. Grupos experimentales ................................................................... 45 5.3. Control de estros ................................................................................... 46 5.4. Diagnóstico de Gestación ...................................................................... 46 5.5. Monitoreo hormonal de hembras ........................................................... 46 5.6. Análisis de progesterona ....................................................................... 46 5.7. Análisis estadístico ................................................................................ 47 6. Resultados ................................................................................ 49 6.1. Porcentajes de ciclicidad ....................................................................... 49 6.2. Inducción de celo ................................................................................... 49 6.2.1. Celos de retorno (Ovejas Repetidoras) ........................................... 49 6.3. Diagnóstico de Gestación ...................................................................... 51 7. Discusión ................................................................................... 52 8. Conclusión ................................................................................. 55 9. Bibliografía: ............................................................................... 56 Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Indice de Figuras y Gráficos Manuel Agustín Silva 4 Indice de Figuras Figura 1. Épocas de reproducción y de partos en diferentes especies domésticas y en sus antecesores salvajes ...................................... 12 Figura 2. Influencia del fotoperiodo y eventos hormonales del ciclo estral en la oveja ................................................................................................ 13 Figura 3. Dinámica folicular durante el ciclo estral en la oveja ........................ 14 Figura 4. Respuesta de ovejas a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral normal ....................................................................... 21 Figura 5. Respuesta de ovejas a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral corto. ......................................................................... 22 Figura 6. Síntesis de melatonina en la glándula Pineal a partir del estimulo luminoso .......................................................................................... 26 Figura 7. Síntesis de los Eicosanoides ............................................................ 33 Figura 8. Mecanismo de la luteolisis ................................................................ 34 Figura 9. Biosíntesis de hormonas esteroideas en el ovario ........................... 38 Figura 10. Retención del cuerpo lúteo y establecimiento de la gestación ....... 40 Figura 11. Cronograma del experimento llevado a cabo en el Grupo Melatonina (M). .................................................................................................. 47 Figura 12. Cronograma del experimento llevado a cabo en el Grupo Melatonina-prostaglandinas (MP). ................................................... 47 Figura 13. Cronograma del experimento llevado a cabo en el Grupo Control (C). .................................................................................................. 48 Indice de Gráficos Gráfico 1. Porcentaje relativo de celos en los tres grupos.. ................................ 50 Gráfico 2. Porcentaje acumulado de celos en los tres grupos.. .......................... 50 Gráfico 3. Porcentaje de celos de retorno en los tres grupos.. ........................... 51 Gráfico 4. Tasa de Gestación por grupo ................................................................. 51 Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Agradecimientos Manuel Agustín Silva 5 Agradecimientos Este trabajo no hubiese podido llevarse a cabo sin la ayuda, apoyo y colaboración de mucha gente que formaron y forman parte de mi vida. A Alfonso, Gustavo, Genaro y todos los integrantes y colaboradores del Departamento de Producción Animal con quien compartí estos meses de trabajo como así también al plantel del Servicio de Apoyo a la Investigación Animal de la Facultad de Zaragoza por la colaboración brindada en el manejo de los animales.. A mi familia y amigos que con su afecto imprescindible e incondicional acortan distancias gigantes y me ayudan a seguir mi camino en la distancia. A los amigos que coseché aquí en España completos responsable de mi amena estadía y que siempre llevaré en el corazón. A todas las personas que conocí aquí, allá y donde quiera que voy. Ustedes…también son totales partícipes de este trabajo… “Por que solos no somos nada…solo somos la nada misma…” Manuel Agustín Silva Julio de 2012, Zaragoza, España Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Manuel Agustín Silva 6 La curiosidad es la base del conocimiento Aristóteles (384 A.C. - 322 A.C.) Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Resumen Manuel Agustín Silva 7 1. Resumen El objetivo del presente trabajo ha sido utilizar la melatonina exógena en combinación con prostaglandinas F2α (PGF2α) en primavera para estudiar la eficacia de dicha combinación en la sincronización de celos en ovejas. Se trabajó con 51 hembras y 4 machos de la raza Rasa Aragonesa. Las ovejas se dividieron en tres grupos experimentales (n=17/grupo) en base a los tratamientos recibidos, en un grupo se trató con melatonina (grupo M), en otro se combinó melatonina con una única inyección de PGF2α (grupo MP) y el restante se dejó como control (grupo C). Machos y hembras se mantuvieron separados hasta el término de dichos tratamientos y luego se juntaron para las cubriciones. Se tomaron muestras sanguíneas de las hembras que fueron procesadas para determinar las concentraciones de progesterona con el fin de monitorear su estado reproductivo, dichas muestras se tomaron siete días antes de la introducción de machos, el día de la introducción y a los siete días posteriores. Las concentraciones de progesterona evidenciaron que el 100% de las ovejas presentaban actividad cíclica previa a la introducción de machos. Las hembras salieron en celo a partir del día de introducción de los machos (día 0) en el corral, mostrando el grupo MP una sincronía de sus celos los primeros días del período de cubrición, mostrando el día 2 un 41% de los individuos en celo y el día 3 un 65%. Los otros dos grupos mostraron actividad sexual creciente en el tiempo, cubriéndose en un lapso de 18 días, hecho que se puede adjudicar a que las hembras ya se encontraban cíclicas y a un posible efecto de “simpatía”. En cuanto a la tasa de preñez, diagnosticada por ecografía, cabe destacar que fue baja (55%) y sin diferencias significativas entre los grupos (MP: 59%, M: 53%, C: 53%), posiblemente por el alto número de ovejas en celo en un corto período de tiempo que imposibilitó a los machos cubrir a todas y por otro lado a un efecto del stress al que se sometieron los animales durante la experiencia. En conclusión, la combinación de implantes de melatonina y una única inyección de PGF2α en primavera demostró una capacidad de sincronizar los celos del grupo tratado, aunque sin alcanzar los valores habituales del clásico tratamiento de PGF2α con doble inyección en 7-10 días. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Summary Manuel Agustín Silva 8 1. Summary The goal of this work was to use exogenous melatonin in combination with PGF2α on spring, to study its efficacy in the oestrus sinchronization in sheep. Fifty-one female and 4 male Rasa Aragonesa sheep were included in the study. Ewes were divided in three experimental groups based on the treatment received. One group was treated with melatonin, another was treated with melatonin along with a single shot of PGF2α and the last one was the control group. Rams and ewes were kept apart until the end of their treatment and were put together for the breeding. Blood samples from the female were taken and processed to establish the concentration of progesterone, in order to know their reproductive status; these samples were collected seven days prior to the introduction of males, the day of the introduction and seven days after the introduction. Progesterone concentrations showed that 100% of the female sheep had a cyclical activity before the introduction of the male sheep. Ewes were in oestrus from the day of introduction of the male into the pen, and the group treated with PGF2α showed oestrous sinchronization the first days of breeding. On day 2, 41% of the individuals were in heat. The other two groups, the one treated with melatonin and the control group, showed a fast and growing sexual activity, which can be attributed to the fact that the female were already in cyclic stage and to a likely effect of “sympathy”. Regarding the pregnancy rate, it is worth noting that it was low (55%) and with no significant differences among the groups (59% for the group treated with prostaglandine and 53% in the other two). This was possibly due to the high number of sheep in heat in a short period of time which prevented the male sheep to mate all of them and the stress the animals were subjected throughout the whole experience. In conclusion, the combination of melatonin implants and a single shot of PGF2α in spring showed the capability of sinchronizing the oestrus in the group treated, although without reaching the usual figures of the traditional treated with PGF2α and double shots within 7-10 days. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 9 2. Introducción Desde tiempos remotos el hombre ha hecho uso de los animales por diferentes motivos y propósitos, desde transporte, alimentación, vestimenta, compañía, etc. En el caso de la oveja (Ovis aries), el origen de su domesticación se encuentra en Oriente próximo, en el denominado creciente fértil, una región histórica que se correspondía con parte de los territorios del Antiguo Egipto, el Levante mediterráneo, Mesopotamia y Persia, áreas que actualmente pertenecen a territorios de Egipto, Israel, Cisjordania, la Franja de Gaza, y Líbano; amén de partes del río Jordán, Siria, Irak, el sudeste de Turquía y el sudoeste de Irán. Las pruebas señalan que la domesticación tuvo lugar en torno al VII milenio a. C. (Zohary et al., 1998). La mayoría de los estudios atribuyen el origen silvestre de la especie al muflón asiático (Ovis orientalis orientalis), descartando así otros congéneres como el argali (Ovis ammon) o el urial (Ovis orientalis vignei) que se barajaban como posibles ancestros (Hiendleder et al., 2002). Con el correr del tiempo el ser humano conoció y aprendió múltiples aspectos en los que respecta a domesticación, manejo y entendimiento de los animales, y la especie ovina fue de las más estudiadas y utilizadas. Por ejemplo, como en muchas otras ciencias, Aristóteles dedicó importantes investigaciones a la biología, y sobre todo a la clasificación y la reproducción animal, siendo el primero en describir el cuádruple estomago de los rumiantes en el siglo IV AC. Según la antigua opinión, probablemente de origen oriental, al padre correspondía el papel principal en la procreación, la participación de la madre consistía en asegurar albergue y nutrición al embrión, y fue Aristóteles quién refutó el milenario error, y admitió la cooperación más o menos igual de los padres en la procreación, y proclamó que el semen no hace más que impulsar al óvulo femenino a desarrollarse en el útero. Su doctrina preparó así la tesis del origen bigerminal de los animales superiores (Aristóteles, 1994). Este gran filósofo y científico griego ya era consciente de la estacionalidad reproductiva de algunas especies, como la oveja y la yegua, y se había Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 16 alrededor de 3 semanas el final de la misma y adelantar el inicio de la siguiente, acortando el período de anoestro alrededor de dos meses (Donovan et al. 1991). Sunderland (1990) estudió el efecto de la presencia de machos durante todo el año y pudo ver que la fecha de finalización de la temporada reproductiva se retrasaba alrededor de seis meses. Sin embargo, las ventajas de la presencia continua de machos en el rebaño desaparece en la práctica debido a que las hembras tardan más en ser cubiertas que las hembras aisladas, que son estimuladas por la introducción espontánea de los moruecos en el anoestro tardío (Notter, 1989), y esto se debe a que las hembras muestren un período de receptividad sexual más corto a los machos cuando se encuentran en permanente contacto con los mismos que en los casos de contacto espontáneo y ocasional (Parsons and Hunter, 1967; Fletcher and Lindsay, 1971). Esto se evidenció a través del trabajo de Lindsay (1975), donde vio que la presencia continua de machos en el proestro y estro adelanta la ovulación hacia el inicio del estro, debido a un anticipo del pico preovulatorio de LH. En las corderas la presencia continua de machos retrasa la primera ovulación alrededor de 2 meses, comparadas con corderas aisladas (Al-Mauly et al., 1991). El efecto agudo causado por el contacto de las ovejas con los machos es el que se conoce como el “efecto macho”. Se caracteriza por una rápida respuesta de las ovejas a la exposición espontánea con los moruecos, que inicia eventos endocrinos que llevan a la ovulación dentro de las 50 horas post contacto (Martin et al., 1986). Esta respuesta se ha visto tanto en el anoestro estacional como en el lactacional y el prepuberal (Mauléon and Dauzier, 1965; Poindron et al., 1980). Para que el efecto macho se consiga es necesario que exista un aislamiento entre sexos previo y que las hembras se encuentren en anoestro (Underwood et al., 1994; Schinckel, 1954) 2.2.1.1.1. Aislamiento entre sexos Esta es una condición absolutamente necesaria (Martin et al., 1986) y su duración es algo discutida ya que se habla de entre 2 y 6 semanas como Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 17 mínimo, existiendo factores que afecten dicho plazo, como son la edad, la raza, el período del año, la ubicación geográfica, etc. (Rosa and Bryant, 2002). En líneas generales se acepta que 4 semanas de aislamiento es suficiente. Es de importancia destacar que durante este período, en las granjas que cuentan con machos cabríos, estos también deben estar separados de las ovejas, ya que tienen la capacidad de generar un estimulo sexual en las mismas (Knight et al., 1983). El aislamiento debe ser completo, es decir, físico, olfativo y auditivo, por lo tanto es de suma importancia que machos y hembras se encuentren separados por una distancia que no permita la visualización, olfacción y audición de los machos por parte de las hembras (Martin et al., 1986). Cabe decir que algunos autores sugieren que el aislamiento no es del todo necesario, hablando de horas o incluso de la no necesidad de aislar machos y hembras, cuando los machos son nuevos (Delgadillo et al., 2009, Cohen-Tannoudji,1987; Hawken and Beard, 2009; Cushwa et al.,1992; Pearce and Oldham, 1988; Cohen-Tannoudji and Signoret, 1987). 2.2.1.1.2. Las hembras deben encontrarse en el período de anoestro. Desde que se iniciaron los estudios del “efecto macho” se consideró necesario que las hembras se encuentren sin ciclar, es decir sin el bloqueo de su eje hipotalámico-hipofisario-gonadal regido por la progesterona que se ve durante la fase luteal del ciclo estral. Sin embargo, Delgadillo et al. (2009), en una revisión exhaustiva del tema, postuló que los machos tienen la capacidad de producir efectos en el eje reproductivo de la hembra, logrando estimular la secreción de LH y alterar la distribución de los estros. Ya se mencionó también que la presencia continua de los machos alarga la temporada reproductiva, anticipando su comienzo y retrasando su finalización, sin embargo el término “efecto macho” no incluye esta variante. 2.2.1.1.3. Los machos El macho brinda un estímulo a la hembra que está compuesto por dos componentes, uno químico-físico, y otro social. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 18 La capacidad del macho para estimular es andrógeno-dependiente, y estos andrógenos son los que estimulan la producción de feromonas, que son un componente de las secreciones de las glándulas sebáceas y odoríferas (Abecia y Forcada, 2010). Asimismo, estos andrógenos son los responsables del comportamiento de los moruecos ante una hembra, que es otro componente fundamental para estimular a las mismas. Debemos saber que entre los machos, podemos encontrar algunos más activos sexualmente que otros, y por tal motivo con mayor o menor capacidad de estimular la ovulación en las hembras. Hay moruecos que brindan un mayor estímulo tanto por su producción de feromonas como por su comportamiento, asimismo cabe destacar que la inclinación sexual de los machos es determinante, ya que existen animales que son menos atraídos por las hembras (Haynes and Haresign, 1987). La edad, la raza y la experiencia sexual son factores muy importantes a la hora de elegir los machos. La edad se relaciona con la producción de feromonas, sabiendo que los machos más viejos tienen una mayor producción de las mismas en comparación con los jóvenes. La estación reproductiva es otro factor que influye en el “efecto macho”, esto pudo verse en trabajos en los que los machos fueron tratados con melatonina fuera de la estación reproductiva y demostraron mayor capacidad para estimular a las ovejas (Rosa et al., 2000). El hecho de que sean machos conocidos por las ovejas o no, también tiene relación con la respuesta buscada ya que las hembras tienen la capacidad de aprender y recordar la identidad de los moruecos. Por esta razón los machos nuevos en el rebaño muchas veces tienen mayor capacidad de estímulo que los machos con los que las ovejas están familiarizadas. Esto también se ve en el caso de ovejas cíclicas durante la temporada reproductiva cuando los machos son remplazados cada 17 días evidenciando cambios en la distribución de los estros (Hawken et al., 2007). El contacto físico es fundamental, implicando al sentido de la vista y también el olfato, esto se puede verificar en el trabajo de Pearce y Oldham (1990) en el que se separaron animales de ambos sexos mediante una valla y Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 19 por otro lado las hembras eran o no estimuladas por una máscara dispuesta en los ollares conteniendo o no lana de morueco. En cuanto al número de moruecos, una relación macho-hembra de 1:15- 1:20 es necesaria para lograr un éxito en cubriciones (Abecia y Forcada, 2010). 2.2.1.1.4. Las hembras Ya se mencionó que las hembras deben estar aisladas de los machos y deben encontrarse en anoestro para que el “efecto macho” brinde una respuesta adecuada. 2.2.1.1.5. Respuesta endocrina a la introducción de machos Al introducir los machos en el rebaño, la primera respuesta endocrina de la oveja es un incremento en la secreción basal de LH en 10-20 minutos, que se caracteriza por un aumento en la frecuencia de pulsos con una disminución en la amplitud de los mismos (Martin et al., 1980a, 1986; Poindron et al., 1980). Este patrón de secreción es seguido por un pico preovulatorio de esta hormona que se da entre 6 a 52 horas (media de 27 horas) (Abecia y Forcada, 2010) después de la introducción de los moruecos. Existen dos posibles vías por las que la señal feromonal se convierte en hormonal, ya sea a través de la percepción de las feromonas por el órgano vomeronasal o por la mucosa olfatoria para transmitir dicha señal hasta el hipotálamo. En contraste con la LH, la secreción de FSH se mantiene sin variación (Martin et al., 1980a, b) o tiende a disminuir y mantenerse baja (Atkinson y Williamson, 1985). Es de importancia que el estímulo de los machos sea duradero para que la respuesta endocrina se mantenga. Aunque la secreción de LH se incremente a los pocos minutos de la introducción de los machos, dicha secreción es alta solo durante el período en que los machos están presentes (Pearce and Oldham, 1984), y es necesaria que la concentración de dicha hormona sea sostenida para que los eventos preovulatorios tengan lugar. Por tal motivo, es un requisito que los machos deban estar presentes por un período considerable que permita esto. Lo que se traduce en que los moruecos sean mantenidos con las ovejas hasta la ovulación de las mismas (Oldham and Cognie, 1980; Signoret et al., 1982; Murtagh et al., 1984; Folch, 1990). Asimismo la presencia Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 20 de los machos es necesaria aún después de la primera ovulación, para mantener ciclos ovulatorios (Rosa et al., 2002), por eso se recomienda la permanencia de los mismos durante 45 días como mínimo. 2.2.1.1.6. Tipos de Respuesta La respuesta de las ovejas a la introducción de los machos es diferente de acuerdo a si estas se encuentran en actividad sexual o no. Si bien, como se dijo, el efecto macho se realiza en la temporada de anestro, siempre en los rebaños encontraremos hembras que se encuentran cíclicas y la cantidad de las mismas depende de varios factores, entre ellos la raza, el mes del año y la condición corporal (Abecia y Forcada, 2010). La introducción de los machos no afecta el status hormonal de estas hembras. Por tal motivo, durante los primeros 17 días tras el contacto de los machos con las ovejas, se da una serie de ovulaciones en goteo que corresponden a estas hembras. Las ovejas anoéstricas, que son el objeto del “efecto macho”, son las que van a modificar su campo hormonal como se describió previamente. En estas se encuentran dos tipos de respuestas:  Ovejas que responden a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral normal (de 17 días) (Figura 4).  Ovejas que responden a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral corto (Figura 5). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 21 2.2.1.1.6.1. Ovejas con ciclo normal: Figura 4. Respuesta de ovejas a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral normal (17 días). Introducción de machos Aumento en la frecuencia de pulsos de LH Descarga preovulatoria de LH (a las 24 hs aprox.) Ovulación Silente (Sin celo) Ciclo estral de duración Normal (17 días) (sin cubrición) Nueva Ovulación (con celo y cubrición) Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 22 2.2.1.1.6.2 Ovejas con ciclo corto: Figura 5. Respuesta de ovejas a la introducción de machos desencadenando un ciclo estral corto. 2.2.1.1.7. Combinación con otros tratamientos Se ha demostrado que el efecto macho puede combinarse con los tratamientos hormonales mejorando la estimulación del pico preovulatorio de LH y la ovulación, y con esto la sincronización de los celos. Si bien el “efecto macho” es utilizado en la etapa de anoestro, ya se mencionó que la presencia de machos tiene efectos sobre la actividad reproductiva de las hembras aún en temporada reproductiva, como así también Introducción de machos Aumento en la frecuencia de pulsos de LH Descarga preovulatoria de LH (a las 24 hs aprox.) Ovulación Silente (Sin celo y de mala calidad luteal) Niveles bajos de Progesterona y de menor duración Ciclo estral de corta duración (8 días) Ovulación Silente Ciclo estral de duración normal (17 días) Nueva Ovulación (con celo y cubrición) Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 23 en ovejas tratadas con progestágenos (Evans et al., 2004), prostaglandinas (Contreras-Solis et al, 2009) y melatonina (Palacin et al., 2011). 2.2.1.2. Control de la luz Como se dijo con anterioridad, la oveja es una hembra que presenta una estación reproductiva durante los días cortos del año. Su actividad reproductiva se dispara cuando la duración de la luz diurna decrece, es decir a finales de verano y comienzos de otoño (Abecia y Forcada, 2010). El cambio en la duración del día desde días largos a días cortos inicia el estro en las ovejas y teniendo en cuenta esto se puede pensar que modificando la duración del día es posible inducir la ovulación fuera de la temporada reproductiva (Kennedy, 2008, Chemineau, 1992). Para llevar a cabo dicho propósito es necesario crear una situación para controlar la iluminación que percibe el animal, donde días largos sean seguidos por días cortos previos al inicio de la monta fuera de estación reproductiva, que es el objetivo del método en cuestión (Kennedy, 2008) Si bien existen diferencias entre razas en respuesta a la luz, si el programa de manipulación lumínica se realiza rigurosamente la mayoría responderá, de hecho es posible alargar la estación reproductiva en las razas que presentan un período natural corto de apareamiento. 2.2.1.2.1. Protocolo de uso El programa más recomendado debería ser llevado a cabo exponiendo a las ovejas a días largos durante 8-12 semanas y luego a días cortos durante el mismo período de tiempo antes de la monta. Los machos también deben someterse a tratamiento de luz de igual modo que a las ovejas, de esta manera se logra un mayor crecimiento testicular, actividad de monta y calidad seminal (Kennedy, 2008). Hay varios factores a tener en cuenta para el buen manejo del sistema:  La diferencia de iluminación entre días largos y días cortos debe ser de 6-8 horas. Los flashes de luz o cualquier tipo de contaminación lumínica pueden alterar la percepción de oscuridad por parte de la oveja. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 24  Se requiere un mínimo de 100 lux como luz diurna y menos de 10 lux para el período de oscuridad.  El comienzo de la monta dependerá de la raza y la época del año, pero como mínimo se debe someter a las hembras a 8 semanas de tratamiento bajo días cortos.  Se debe finalizar el período de días cortos tan pronto como los machos son separados de las ovejas. Las ovejas bajo este sistema de control reproductivo pueden exhibir más de un ciclo estral similar a las hembras en estación reproductiva (Chemineau, 1992) y si el protocolo es rigurosamente llevado a cabo pueden verse tasas de concepción mayores a 80% (Kennedy, 2008). Si bien este método puede dar muy buenos resultados, hay que tener en cuenta que presenta varias desventajas. En primer lugar los animales deben mantenerse en confinamiento total y se debe contar con un sistema adaptado para el control de la luz no solo en duración de la misma sino también en intensidad. Todo esto incrementa los costos de manejo además de restringir las opciones de alimentación. Lo más importante a tener en cuenta a la hora de decidir realizar un control de la luz es llevarlo a cabo de la mejor manera posible para asegurar su éxito, ya que las ovejas que no logren cubrirse mediante dicho método entrarán en estro el siguiente otoño de 8-12 semanas más tarde de lo usual (Kennedy, 2008). 2.2.2. Métodos Farmacológicos La utilización de hormonas para el manejo reproductivo en los animales fue implementada desde hace varias décadas. Conociendo concienzudamente la fisiología y el control endocrino del ciclo, es posible modificar dichos fenómenos en las hembras. Entre las ventajas de estos métodos cabe destacar que facilitan la sincronización de celos y el uso de la inseminación artificial (I.A.) debido a la dificultad que la detección de celos presente en esta especie, y con ello también la implementación de la transferencia de embriones (T.E). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 25 Esto permite controlar los partos y obtener corderos más uniformes. Asimismo, el uso de hormonas permite adelantar el primer celo en corderas, adelantando así la pubertad y la actividad reproductiva. La desventaja radica en las restricciones de algunos países en su uso, debido a los residuos de dichas hormonas que permanecen en los animales. 2.2.2.1. Melatonina Esta molécula fue descubierta en 1958 en la Universidad de Yale, Estados Unidos (Lerner et al., 1958), se sabe que es producida principalmente por una glándula situada en el encéfalo, llamada glándula pineal, aunque hay cierta evidencia de que también puede ser sintetizada en otros lugares del organismo como la retina, timo, epitelio respiratorio, médula ósea y otros (Carpentieri et al., 2012; Lerner et al., 1959; Pandi-Perumal, 2006). Sin embargo su producción en forma rítmica solo se produce en la glándula pineal y la retina (Cassone et al., 1997). Interviene en diversos aspectos en la fisiología, y su estudio se concentró sobre todo en medicina humana, donde se sabe que es la encargada de regular el ritmo circadiano y los biorritmos estacionales como sus efectos más importantes. Pero así también se la liga con la inmunomodulación, como antioxidante (Tan et al., 2005; Reiter et al., 2005), adaptación al stress, control del peso corporal y del crecimiento tumoral, entre otros (Dubocovich et al., 2003). En los animales su estudio se situó fundamentalmente en torno a sus efectos reproductivos, es decir, el control que ejerce sobre la actividad reproductiva de ciertas especies. 2.2.2.1.1. Química, secreción y metabolismo Químicamente se trata de una indolamina que contiene dos grupos funcionales, importantes para su unión con el receptor y también por la capacidad que le dan a la molécula para entrar en cualquier célula, compartimento o fluido corporal. Se trata de una molécula muy soluble en lípidos, capaz de pasar fácilmente por difusión desde la circulación hacia cualquier otro fluido o a las células. En sangre, el 70% de la melatonina se Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 32 En la Figura 7 se puede ver que en su síntesis participan diversas enzimas como fosfolipasas, lipooxigenasas, y las ciclooxigenasas que son las encargadas de producir las prostaglandinas. La síntesis de eicosanoides comienza cuando la enzima fosfolipasa-A 2 o la fosfolipasa-C crea un intermediario a partir del diacilglicerol o fosfolípidos de membrana, el ácido araquidónico. Estas fosfolipasas son activadas por diferentes estímulos físicos, químicos y hormonales, como son: trauma, infección, infusión con solución hipertónica, trombos, endotoxinas, estiramiento mecánico, esteroides sexuales y catecolaminas (Espinoza et al., 2002). Una vez liberado el ácido araquidónico, la vía de síntesis puede tomar dos direcciones: la vía de la lipooxigenasa o la vía de la ciclooxigenasa. La vía de la 5-lipooxigenasa da lugar a varios productos denominados leucotrienos (LT), son producidos por los leucitos como resultado de una reacción anafiláctica y se consideran los principales agonistas en la producción del broncoespasmo. La vía de la ciclooxigenasa produce tromboxano, prostaciclina y prostaglandinas D, E y F. Las prostaglandinas se producen tras la oxidación secuencial del ácido araquidónico, ácido dihomo-gamma linolénico (DGLA) o ácido eicosapentaenoico (EPA) mediante ciclooxigenasas (COX-1 y COX-2) y prostaglandinas-sintasas terminales. La COX-1 es responsable de los niveles base de prostaglandinas y la COX-2 produce prostaglandinas a través de estimulación. Sin embargo, mientras que la COX-1 y COX-2 se encuentran en los vasos sanguíneos, el estómago y los riñones, los niveles de prostaglandinas aumentan mediante la COX-2 en los escenarios de la inflamación. Una tercera forma de COX, la COX-3, ha sido identificada, pero su función exacta aún no se ha determinado (Espinoza et al., 2002). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 33 Figura 7. Síntesis de los Eicosanoides. El metabolismo de las prostaglandinas tiene lugar principalmente en los pulmones, riñón e hígado. Los pulmones son importantes en el metabolismo de la PGE2 y PGF2α.pon el 2α como subíndice en todas Existe un mecanismo de transporte activo que específicamente traslada a las prostaglandinas desde la circulación a los pulmones. Por lo tanto tienen una vida media corta (3-5 minutos), y muchas veces ejercen su acción en el lugar de su síntesis. 2.2.2.2.2. Funciones Hasta el momento se han reconocido nueve receptores de prostaglandinas en diferentes tipos de células. Las prostaglandinas se enlazan a una subfamilia de receptores transmembrana de la superficie celular, los receptores acoplados a proteína G. Esta variedad de receptores significa que las prostaglandinas actúan en diversas células, y tienen una amplia variedad de acciones:  Constricción o dilatación en las células musculares lisas del tejido vascular.  Control de la permeabilidad vascular.  Agregación o desagregación plaquetaria.  Sensibilización de las neuronas espinales al dolor.  Disminución de la presión intraocular. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 34  Regulación de la mediación inflamación.  Regulación del movimiento de calcio.  Control de la regulación hormonal.  Control del crecimiento celular.  Lisis del cuerpo lúteo (Figura 8). Las prostaglandinas son potentes, pero tienen una corta vida media antes de inactivarse y excretarse, por lo tanto, ejercen sólo una función paracrina (activa a nivel local) o autocrina (actuando en la misma célula de la que se sintetiza). Figura 8. Mecanismo de la luteolisis (modificado de Melisho, 2010) (RE: receptores de estrógenos; ROT: receptores de oxitocina; IFN-R: receptores para interferón; OXT: oxitocina; E2: estrógenos; PGF2α: prostaglandina F2α; IFNT: interferón Tau; CL: cuerpo lúteo) 2.2.2.2.3. Protocolo de uso Las prostaglandinas se utilizan para el control de la reproducción en los animales por su capacidad de lisar el cuerpo Lúteo (CL), induciendo una subsecuente fase folicular y la ovulación (McCracken et al., 1972). La prostaglandina utilizada para tal fin es la PGF2α o sus análogos (cloprostenol y luprostiol) (Douglas y Ginther, 1973). La mayor ventaja del uso de estos fármacos es la posibilidad de administrarlos vía intramuscular. De esta forma se mejora el manejo y el bienestar animal si lo comparamos con los dispositivos intravaginales. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 35 Asimismo por su rápido y casi total (99%) metabolismo a nivel pulmonar, permite tener niveles de residuos muy bajos en sangre (Light et al., 1994). La desventaja radica en el hecho de que para ser efectiva, la PGF2α, debe ser aplicada en presencia de un CL, por lo tanto, los animales que fuera de estación reproductiva no responden al tratamiento. Así, esta prostaglandina debe usarse durante la estación reproductiva. Sin embargo, en las áreas tropicales donde las ovejas presentan una casi continua estación ovulatoria, puede aplicarse durante casi todo el año (Godfrey et al., 1997, 1999). El cuerpo lúteo responde a la PGF2α a partir del día 3 del ciclo estral (Rubianes et al., 2003) hasta el día de la luteolisis natural, por lo tanto los animales que se encuentren en la fase luteal temprana o en fase folicular o bien en anestro no responden a la aplicación. Teniendo en mente que no es posible conocer la fase del ciclo estral en un grupo de animales, es necesario administrar dos inyecciones de PGF2α, separadas por 9-10 días. Así, casi todas las hembras tratadas se encontrarán en la mitad de la fase luteal al momento de la segunda dosis y responderán al tratamiento con la lisis de un CL, el estro y la ovulación. Una posible solución durante el período de transición reproductiva es la administración de la prostaglandina en combinación con el “efecto macho” (Martin et al., 1986). Mediante el uso de este protocolo de dos inyecciones separadas por 9-11 días logramos sincronizar los estros, pero la fertilidad al primer servicio es de alrededor de 70%, considerablemente menor que la obtenida mediante el uso de progestágenos y el servicio natural (Boland et al., 1978; Godfrey et al., 1999). Esto podría deberse a que el intervalo de 9-11 días asegura la presencia de un CL a la segunda inyección en la mayoría de los animales, pero tal vez induce una alteración en la dinámica folicular ovulatoria, alterando la funcionalidad y la maduración final de los folículos preovulatorios y la luteogénesis normal, y/o una variabilidad en el momento de la ovulación luego de la luteolisis inducida por la PGF2α (Barrett et al., 2002; Gonzalez-Bulnes et al., 2005). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 36 La función folicular puede estar comprometida durante la fase luteal media, debido a que las altas concentraciones de progesterona de este momento induce bajos niveles de LH, y se sabe que esta última es crucial para el desarrollo final y maduración de los folículos preovulatorios (Campbell et al., 1995; Gonzalez-Bulnes et al., 2004). Teniendo en cuenta esto, el momento más oportuno para realizar el tratamiento con PGF2α debería ser durante la fase luteal temprana o tardía. Tratar las ovejas en la fase luteal temprana parece ser la mejor opción, debido a la presencia de folículos grandes en crecimiento de la primera onda de desarrollo folicular (Ginther et al., 1995; Bartlewsky et al., 1999). La experiencia indica que un gran número de animales muestran signos de estro y ovulan cuando son tratadas en esta etapa de la fase luteal (Acritopoulou and Haresign, 1980; Deaver et al., 1986; Houghton et al., 1995). Contrariamente, los folículos durante la fase luteal media pueden tener una pobre sincronía y con grandes variaciones individuales, teniendo animales que pueden tener gran crecimiento, otros con un crecimiento estático y otros con folículos atrésicos (Barrett et al., 2002, Viñoles et al., 1998). El tratamiento puede ser aplicado a partir del tercer día del ciclo, como se mencionó anteriormente, cuando el CL tiene la capacidad de responder a la PGF2α (Rubianes et al., 2003). Además, tratando en la fase luteal temprana se favorece la maduración de los folículos y la sincronización del pico preovulatorio de LH y la ovulación, debido a que la restauración de la pulsatilidad de LH se logra de forma más temprana en presencia de un CL que secreta menos progesterona (Deaver et al., 1986). Este protocolo es adecuado para IA (Menchaca et al., 2004 y 2007). La sincronización del pico preovulatorio de LH y la ovulación puede ajustarse mediante la aplicación del “efecto macho” en el momento de la segunda inyección de PGF2α. Como se mencionó anteriormente en la sección correspondiente a “efecto macho”, este método no farmacológico se puede combinar con fármacos, como la PGF2α por ejemplo. La sincronización del pico de LH y la ovulación se puede Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 37 mejorar mediante la aplicación de dicho efecto coincidiendo con la segunda dosis de PGF2α. Se ha demostrado que la combinación de PGF2α durante la fase luteal temprana con “efecto macho” es una buena alternativa para la sincronización de estros para IA en ausencia de detección de estro previa. Las tasas de fertilidad inseminando a las 48 y 55 horas después de la inyección de PGF2α varían entre 44% y 62,5% (Contreras-Solis et al., 2009). 2.2.2.3. Progesterona La progesterona, también conocida como P4 (pregn-4-ene-3,20-dione) (Allen, 1935), es una hormona esteroidea, involucrada en el ciclo estral y la gestación y que favorecen la gestación (Butenandt and Westphal, 1934). Su fuente principal es el ovario, más precisamente el cuerpo lúteo, y la placenta, aunque también puede sintetizarse en las glándulas adrenales en forma de hidroxiprogesterona en algunas especies. La progesterona fue descubierta independientemente por cuatro grupos de investigación. (Allen, 1935; Butenandt and Westphal, 1934; Hartmann and Wettstein, 1934; Slotta, Ruschig and Fels 1934) y su el nombre de progesterone derivado de progestational steroidal ketone, fue dado por Allen en 1935. 2.2.2.3.1. Química, secreción y metabolismo La progesterona, tal como todas las hormonas esteroideas (progestágenos, estrógenos, andrógenos, glucocorticoides y mineralocorticoides), es sintetizada a partir de pregnenolona, que a su vez deriva del colesterol (Applezweig, 1969). La primera reacción en convertir el colesterol en hormonas esteroides involucra la degradación del mismo, llevada a cabo por una enzima llamada desmolasa ligada a citocromo P450, el cual es el paso principal, que determina la conversión del colesterol en pregnenolona y asimismo la velocidad de la biosíntesis de esteroides y está altamente regulado (Butenandt and Westphal, 1934). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 38 A partir de la pregnenolona se sintetizan las diversas hormonas esteroides como se muestra en la Figura 9. Figura 9. Biosíntesis de hormonas esteroideas en el ovario (González Merio, 2007) 2.2.2.3.2. Funciones Como todas las hormonas esteroides, la progesterona ejerce su acción al atravesar la membrana plasmática y al unirse con su receptor intracelular. Este complejo hormona-receptor ejerce su acción al unirse a una secuencia específica de nucleótidos en el ADN de genes que producirán una reacción favorable. La interacción entre este complejo con el ADN conlleva a modificaciones en la transcripción de los genes asociados (Peluso, 2004). La progesterona ejerce su acción a nivel del tracto reproductor como ya se mencionó anteriormente. Es sintetizada por el CL la fase luteal del ciclo estral, lo que corresponde al diestro, y por la placenta durante la preñez. Trasla ovulación los niveles de P4 van en aumento, alcanzando valores entre 1 y 5 ng/ml a partir de los días 6-7 del ciclo (Abecia y Forcada, 2010). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 39 Efectos durante la fase luteal del ciclo estral:  Retroalimentación negativa sobre la liberación de GnRH  Aumenta el almacenamiento de fosfolípidos y la actividad enzimática necesaria para la producción de PGF2α en el endometrio.  Bloquea la formación de receptores endometriales para estradiol y oxitocina (dos primeros tercios de la fase luteal)  Reducción del número de sus propios receptores endometriales (último tercio de la fase luteal), desbloqueando la formación de receptores de oxitocina, cuya presencia es clave para el inicio de la luteolisis. En caso de no haber fecundación, el CL sufre una lisis (luteolisis), mediada por la PGF2α secretada por el endometrio. Esta lisis no se da en caso de resultar preñada la hembra, ya que el CL lúteo es necesario para la secreción de progesterona durante la preñez, y es el propio embrión el que evita dicho acontecimiento mediante la secreción de una proteína llamada interferón tau (INFΤ) (Abecia y Forcada, 2010) (Figura 10). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 40 Figura 10. Retención del cuerpo lúteo y establecimiento de la gestación. (Modificado de Melisho, 2010). (RE: receptores de estrógenos; ROT: receptores de oxitocina; IFN-R: receptores para interferón; OXT: oxitocina; E2: estrógenos; PGF2α: prostaglandina F2α; IFNT: interferón Tau; CL: cuerpo lúteo) Efectos durante la gestación: La progesterona es la encargada del mantenimiento de la gestación en todos los mamíferos. Estimula la secreción de la llamada “leche uterina” y crea un ambiente propicio para el desarrollo fetal. La fuente inicial de progesterona en todas las especies es el CL, pero en el caso de la oveja a partir del día 50 de la gestación es producida por la placenta (Mellisho, 2010). Además de sus efectos a nivel uterino, la P4 actúa a nivel de otros órganos y tejidos durante la gestación, como se detalla a continuación. Aparato reproductor.  Crecimiento de las glándulas endometriales,  Aumento de la vascularización  Infiltración leucocitaria. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Introducción Manuel Agustín Silva 41  Incremento de la secreción glandular, el moco vaginal se espesa y se forma el tapón mucoso.  Aumento de tamaño del útero por relajación de su musculatura y ligamentos Glándula mamaria.  Desarrollo de los conductos y alvéolos mamarios. Actuando junto a los estrógenos a este nivel. Equilibrio hídrico y electrolítico.  Aumento de la concentración de aldosterona y favorecimiento de la retención del sodio; esto junto con la retención de otros minerales hace que aumente el agua corporal. Esta acción la realiza en sincronía con los estrógenos. Sistema gastrointestinal.  Relajación generalizada del músculo liso. Se hace más lento el vaciamiento gástrico y el tiempo de tránsito intestinal aumenta. Metabolismo.  Aumento de la ingesta de alimentos debido a una respuesta del SNC a los esteroides. 2.2.2.3.3. Protocolo de uso El uso de progesterona fue el primer tratamiento publicado para el control reproductivo en ovinos a fines de los años 40 (Dutt and Casida, 1948; O’Mary et al., 1950). El tratamiento consistía de 14 inyecciones subcutáneas diarias de 10 mg de progesterona en una solución de 2 ml de aceite de maíz; el tratamiento redujo el rango en el que las ovejas eran servidas por los machos, a 8 días. Posteriormente se añadió el uso de gonadotropina coriónica equina (ecG) y gonatropina coriónica humana (hcG) (Braden et al., 1960). Debido a que la progesterona no solo actúa suprimiendo la liberación de gonadotropinas por parte de la hipófisis, sino que también tiene efectos, como se mencionó anteriormente, sobre el tracto genital, la baja fertilidad obtenida Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Material y Métodos Manuel Agustín Silva 48 Figura 13. Cronograma del experimento llevado a cabo en el Grupo Control (C). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Resultados Manuel Agustín Silva 49 6. Resultados 6.1. Porcentajes de ciclicidad Los resultados obtenidos a partir de la medición de las concentraciones de progesterona demostraron que el 100% de las ovejas presentaban actividad sexual previa a la introducción de machos. 6.2. Inducción de celo La distribución de las cubriciones diarias mostradas por los grupos experimentales se muestra en el Gráfico 1. El grupo MP mostró un pico de cubriciones de un 41% de sus integrantes a las 72 h de la introducción de los machos, mostrando diferencias significativas (p<0,05) frente a los otros dos grupos (M: 12%; C: 0%). El día 3 posterior a la introducción de machos un 65% del grupo MP ya había mostrado celo, y para el día 6 un 95% de las ovejas del citado grupo había hecho lo mismo, mientras que los grupos M y C contaban con un 54% y 36%, respectivamente a este último día. Los días 13 y 14 se observaron diferencias significativas (p<0,05), con un 12% de las ovejas del grupo M mostrando celo frente a un 0% de los otros grupos en ambos días (Gráfico 1). Se llegó al 100% de ovejas cubiertas en el grupo MP el día 15, mientras que el M alcanzó dicho porcentaje el día 17, y el C no pudo hacerlo ya que una hembra nunca mostró actividad sexual (Gráfico 2). Después de este período las hembras que salieron en celo nuevamente fueron marcadas como “ovejas repetidoras” (celo de retorno). 6.2.1. Celos de retorno (Ovejas Repetidoras) A partir del día 19 hasta el 30 las ovejas que mostraron celo fueron descritas como ovejas repetidoras. En dicho período 13 ovejas repitieron celo, entre las cuales 5 correspondieron al grupo MP (30%), 4 al M (24%) y las 4 restantes al grupo control (24%). (Gráfico 3). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Resultados Manuel Agustín Silva 50 Gráfico 1. Porcentaje relativo de celos en los tres grupos. Las barras indican el porcentaje diario de animales vistos en estro para los tres grupos (Control (C), Melatonina (M) y Melatonina+Prostaglandina (M+P)). Los asteriscos (*) indican diferencias significativas (p<0,05). Gráfico 2. Porcentaje acumulado de celos en los tres grupos. Las barras indican el porcentaje acumulado de animales vistos en estro para los tres grupos (Control (C), Melatonina (M) y Melatonina+Prostaglandina (M+P)). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Resultados Manuel Agustín Silva 51 Gráfico 3. Porcentaje de celos de retorno en los tres grupos. Las barras indican el porcentaje de celos de retorno para los tres grupos (Control (C), Melatonina (M) y Melatonina+Prostaglandina (M+P)). 6.3. Diagnóstico de Gestación Del total de los animales, el 55% se diagnosticó como gestante vía ultrasonografía transrectal. No se encontraron diferencias significativas entre los distintos grupos, mostrando el MP el mayor valor con un 59%, evidenciando los dos grupos restantes un 53% (Gráfico 4). Las ovejas diagnosticadas como negativas en el primer diagnóstico ecográfico fueron revisadas nuevamente con el mismo método y solo 3 de las mismas se habían tratado de falsos negativos, siendo dadas como positivas en esta segunda ecografía. Gráfico 4. Tasa de Gestación por grupo (Control (C), Melatonina (M) y Melatonina+Prostaglandina (M+P)). No existe diferencia significativa. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Discusión Manuel Agustín Silva 52 7. Discusión La combinación de melatonina con PGF2α consiguió concentrar las cubriciones en comparación con los otros grupos, aunque no se logró una mejora en la fertilidad. Como se mencionó en la introducción, el tratamiento con prostaglandinas no es efectivo durante los primeros 3-4 días del ciclo (inicio de la fase luteal) y los últimos dos días del ciclo estral (final de la fase luteal-inicio de la folicular), debido a que el CL es refractario al tratamiento durante dichos días; esa es la razón por la que se inyectan dos dosis de dicha hormona en los tratamientos convencionales. Teniendo en cuenta que en el presente experimento solo se administró una dosis, el porcentaje de éxito teórico del tratamiento se remonta a un 65-70% de los días que dura el ciclo (12-13 de los 17 totales), hecho que coincide con el porcentaje de aparición de celos del lote MP observado a las 72 horas de la introducción de los machos. La aparición de celos que se observó tanto en el grupo M como en el C siguió un patrón similar al obtenido en el grupo MP aunque sin un comportamiento tan súbito como en este último grupo en el día 2, y sin una marcada concentración de celos en los primeros días. Estos resultados sorprenden ya que cabía esperar un comportamiento de celo más retardado como se ha visto en experiencias previas de animales tratados con melatonina o con efecto macho, donde los celos se comienzan a ver aproximadamente a los 20 días posteriores a la introducción de machos. Tal aparición temprana de estros se relaciona con la actividad sexual existente en todas las ovejas previa a la introducción de moruecos, como también se podría pensar en un efecto de “simpatía” (Hutlet et al., 1964; Price et al., 1988; Muir et al., 1989; Zarco et al., 1995; Sanford et al., 1974) entre las ovejas por parte de las integrantes de los grupos M y C para con las pertenecientes al grupo MP que salieron en celo previamente, aunque esto no puede asegurarse ya que fueron las ovejas del grupo M las primeras en demostrar celo el día de introducción de machos. Si bien con los tratamientos basados solamente con efecto macho o la combinación de éste y melatonina cabe esperar celos por goteo durante los primeros días, los valores obtenidos en este experimento superaron los esperados normalmente (Abecia y Forcada, 2010). Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Discusión Manuel Agustín Silva 53 La actividad sexual previa a la experiencia no concuerda con la esperada para el mes de marzo en esta latitud y en esta raza (Forcada et al., 1992). Dicho fenómeno podría deberse a la elevada condición corporal de los animales en estudio. La tasa de gestación media (55%) puede considerarse baja, no encontrándose además diferencias significativas entre los grupos. Esto puede relacionarse con diversos factores como ser el ratio machos:hembras o el stress al que fueron sometidos los animales durante la experiencia. El ratio utilizado fue de 1:12,75, siendo el idóneo para el efecto macho y el tratamiento estándar con melatonina (Abecia y Forcada, 2010). La rápida y súbita salida en celo de las hembras del grupo MP probablemente llevó a que este ratio se viera superado, siendo los machos incapaces de montar satisfactoriamente a todas las hembras en celo. Asimismo el hecho de que las ovejas de los grupos M y C hayan mostrado celo de manera anticipada fue un agraviante para lo anteriormente expuesto, llevando a que el número de moruecos fuera inferior al requerido. Considerando esto se tomaría al número de machos del experimento como un factor sobre la tasa de gestación y no a la fertilidad (entendida como capacidad de preñar una oveja) de los mismos, ya que se tratan de animales con fertilidad probada, sin embargo hay que destacar que estos animales no se trataron con melatonina como normalmente se acostumbra y recomienda hacer en los protocolos de uso de los tratamientos con esta hormona. Tal y como se indica en la bibliografía, normalmente en un rebaño ovino un 18% de los machos no muestra deseo sexual y de los machos que lo tienen el 9% tiene inclinación homosexual; esto sumado a los problemas de jerarquía y predilección por determinadas hembras (Abecia y Forcada, 2010; Knight et al., 1983; Rosa, 2002), podrían haber dado lugar a la baja tasa de fertilidad obtenida. Por otra parte la experiencia impuso un elevado grado de stress diario a las ovejas ya que desde la introducción de machos estas fueron observadas diariamente y marcadas con pinturas en aerosol para facilitar su identificación, Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Discusión Manuel Agustín Silva 54 siendo necesario pasarlas por la manga cada día para llevar a cabo dichas actividades. Cualquier factor de estrés es capaz de suprimir los pulsos de GnRH/LH tanto en su amplitud como en frecuencia, esto se da en parte vía glucocorticoides tipo II y opioides endógenos en la pituitaria como así también mediante conexiones neuronales entre el hipotálamo y la hipófisis que actúan interrumpiendo la liberación de LH mediada por la GnRH y suprimiendo asimismo la liberación de GnRH y la síntesis de sus receptores (Dobson, 1988; Dobson et al., 2012; Phogat et al., 1999; Breen and Karsch, 2006,). Es así que cualquier factor de estrés es capaz de retrasar el pico preovulatorio de LH o bien suprimirlo, como así también puede afectar la concentración plasmática de estradiol durante el estro (Dobson and Smith, 1998; Battaglia et al., 2000; Saifullizam et al., 2010). Además los pulsos de LH no solo son importantes para la ovulación en si misma, sino que también tienen efectos directos sobre el ovocito vía proyecciones desde las células de la granulosa (Dobson et al., 2012). Por lo expuesto cabe pensar que las actividades y movimientos mencionados sumados a la presencia de los operarios impusieron un stress sobre los animales que podría haber llevado a fallos desde la manifestación del celo y en la ovulación, hasta pérdidas embrionarias y abortos silenciosos mediados por los mecanismos mencionados anteriormente. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Conclusión Manuel Agustín Silva 55 8. Conclusión En conclusión, la combinación de implantes de melatonina y una única inyección de PGF2α al introducir los machos en primavera demostró una capacidad de sincronizar los celos del grupo tratado, aunque sin alcanzar los valores habituales del clásico tratamiento de PGF2α con doble inyección en 7- 11 días. El alto grado de ciclicidad presentado por los animales en el mes de marzo (100%) ha impedido expresar totalmente las posibilidades de mejora de esta combinación de fármacos durante el anoestro estacional en esta especie, como método sincronizador de celos. Master en Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias: Trabajo Final. Bibliografía Manuel Agustín Silva 56 9. Bibliografía: Abecia A, Forcada F. Manejo Reproductivo en ganado Ovino. 2010. Servet Editorial. Abecia J.A., Valares J.A., Forcada F., Zúñiga O., 2002. Efecto de la colocación de implantes de melatonina tras el parto en ovejas de raza Rasa Aragonesa. Proc XXVII SEOC Congress, Valencia, Spain, Sep 20-22. pp. 961-965. Acritopoulou, S., Haresign, W., 1980. Response of ewes to a single injection of an analogue of PGF-2_given at different stages of the oestrous cycle. J. Reprod. Fertil. 58, 219–221. Adams, H. Richard (2001). 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