Repositorio Institucional de Documentos
Abstract
La leishmaniosis canina (LC) en una zoonosis que ha sido estudiada con gran énfasis por veterinarios durante los últimos años, cuyo principal reservorio es el perro, y que se estima afecta actualmente a dos millones y medio de perros en el suroeste de Europa. Hasta la actualidad se ha estado estimando la prevalencia de esta enfermedad mediante estudios serológicos, los cuales han subestimado la prevalencia de la infección. Con el reciente desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular, se esta descubriendo que una gran proporción de animales asintomáticos y serológicamente negativos son portadores de este parásito en sangre, por lo que pueden transmitir la infección. En este estudio realizado sobre 98 perros asintomáticos de un área endémica de LC, se ha estimado la prevalencia actual de infectados mediante IFI y qPCR en sangre, diagnosticando a los animales entre 3 y 5 meses después de la época de exposición al vector. Se han obtenido resultados que indican que la prevalencia por qPCR (58,16%) es sustancialmente mayor a la estimada por IFI (8,16%) lo cual nos da a entender que hay muchos mas animales infectados de lo que se pensaba y que estos responden positivamente frente a la infección Sebastián Marcos, Patricia; Blas Giral, Ignacio de; Halaihel Kassab, Nabil
Full text
Situación epidemiológica de la >Ğishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica Patricia Sebastián Marcos Trabajo de Fin de Máster de Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias Junio 2012
Dr. IGNACIO DE BLAS GIRAL, Profesor Titular del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, y Dr. NABIL HALAIHEL KASSAB, Profesor Asociado del Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Zaragoza, como Directores, CERTIFICAN: Que Da PATRICIA SEBASTIÁN MARCOS ha realizado bajo nuestra dirección los trabajos correspondientes a su Trabajo de Fin de Máster de Iniciación a la Investigación en Ciencias Veterinarias titulado ” Situación epidemiológica de la leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica “ que se ajusta con la temática presentada y cumple las condiciones exigidas para optar al Grado de Máster en la Universidad de Zaragoza, por lo que autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Y para que conste, firmamos el presente certificado en Zaragoza a veintiocho de junio de dos mil doce. Dr. Ignacio de Blas Giral Dr. Nabil Halaihel Kassab
Agradecimientos Larealizacióndeesteproyectonohubierasidoposiblesinlaayudadedistintaspersonas,y creoquetodasellasmerecenunamención. EnprimerlugarquieroagradecerestetrabajoamisdirectoresNachoyNabil. ANachoporqueaunquetodaslaspersonasquecitaréacontinuaciónhansidonecesariaspara poderterminarestetrabajo,sinofueseportinisiquierasehabríaempezado.Mehas enseñadomuchísimo:epidemiología,estadísticaycasicualquiercosa,porqueyocreoque sabesdetodo.Siempremehasescuchadoymeparecequetedeboalmenosunosmil millonesdegracias. ANabil,graciasporenseñarmeatrabajarenunlaboratorioyapensarelporquédecadapaso. Heaprendidomuchograciasatugranbagajeprofesional.Hansidomuchashorasperocreo quelashemosaprovechado. AgradeceratodalaUnidaddeEnfermedadesInfecciosasporacogermeentrevosotros,me habéishechosentirrealmenteagustodurantetodoeldesarrollodeltrabajo.Pepe,Olivia, ImanolyTania.GraciasaHéctorportuinestimablecompañíaenellaboratorioyalahorade interpretarlosliososresultados;yaAnaportodatuayudaconlaencuestayestadística.Ha sidounplacertrabajarcontodosvosotros. AmifamiliayamigosporsoportaroírmehablardeLeishmaniaporaquíyporalláestosmeses. GraciasatodoslosmiembrosdelaC.V.Miralbuenoporquerercolaboraryproporcionarmeel materialparaeldesarrollodeestetrabajo.ADavidyMaiteporpermitirmeestarenvuestra clínicayseguirformándomeenelcampodelamedicinaveterinaria.ANoeliaportuayuda. YporsupuestoamisqueridasItziaryRosana,porquesencillamentesoislasmejores.Gracias porayudarmeenlarecogidademuestras,enseñarmetodoeltiempo,discutirconmigolos resultados,perosobretodoporserunasbuenasamigas.Lohepasadogenialconlasdosy realmenteesperoqueosgustemitrabajo,porquesoisparteesencialenél. GraciasalaempresaAlquizvetekS.L.porproporcionarelmaterialparalarealizacióndelas qPCRyquererdesarrollarestaidea. Yfinalmentegraciasatodosquienesleáisestetrabajo,estáhechoconlamejorintenciónylo mejorposible,noobstantecomodijoAlbertEinstein:“Unaveladaenquetodoslospresentes esténabsolutamentedeacuerdoesunaveladaperdida.”
TrabajodeFindeMáster–2012–PatriciaSebastiánMarcosI Índicegeneral Índicegeneral I Índicedetablas III Índicedefiguras V Resumen VII 1.INTRODUCCIÓN 1 2.REVISIÓNBIBLIOGRÁFICA 3 2.1.Leishmaniosis 3 2.1.1.Etiología 3 2.1.2.Ciclobiológico 4 2.2.Cuadroclínicoenperros 6 2.2.1.Mecanismospatogénicos 6 2.2.2.Sintomatologíaenelperro 7 2.2.3.Tratamientoymétodosdeprevención 9 2.2.3.1.Tratamiento 9 2.2.3.2.Métodosdeprevención 10 2.3.Técnicasdediagnóstico 12 2.3.1.DiagnósticodeLeishmaniosis 12 2.3.2.TécnicasIndirectas 12 2.3.3.TécnicasDirectas 15 2.3.3.1.Generalidades 15 2.3.3.2.PCRenTiempoReal(qPCR) 16 2.3.3.3.VentajasdelaqPCRfrentealaIFI 20 2.4.EstudiossobrelaprevalenciadeLeishmaniosis 21
SituaciónepidemiológicadelaLeishmaniosisenperrosasintomáticosenzonaendémica II 3.OBJETIVOS 23 3.1.Objetivoprincipal 23 3.2.Objetivosecundario 23 4.MATERIALYMÉTODOS 25 4.1.Descripcióndelestudio 25 4.1.1.Áreadeestudio 25 4.1.2.Periododeestudio 26 4.1.3.Seleccióndelosparticipantes 26 4.1.4.Diseñodelestudio 27 4.1.5.Extraccióndesangre 27 4.2.Técnicasdiagnósticas 28 4.2.1.DiagnósticoporIFI 28 4.2.2.DiagnósticoporqPCR 28 4.3.EncuestasEpidemiológicas 31 4.4.Análisisestadísticoyepidemiológico 32 5.RESULTADOSYDISCUSIÓN 33 5.1.Descripcióndelamuestraseleccionada 33 5.2.Concordanciadiagnóstica 36 5.3.PrevalenciasdeLeishmaniosis 37 5.3.1.Asociaciónconlasvariablesintrínsecas 37 5.3.2.Asociaciónconlasvariablesextrínsecas 41 5.3.3.Asociaciónsignosclínicos 46 6.CONCLUSIONES 49 7.BIBLIOGRAFÍA 51 ANEXO 59
TrabajodeFindeMáster–2012–PatriciaSebastiánMarcosIII Índicedetablas Tabla1.ProtocoloutilizadoenlarealizacióndelaqPCR 31 Tabla2.Distribucióndelsexoestratificadaporlaedad(n=98) 33 Tabla3.Frecuenciadeesterilizaciónestratificadaporsexo(n=98) 33 Tabla4.Caracterizacióndelpeso(kg)(media±DS)segúnelsexo(n=98) 33 Tabla5.Distribucióndelamuestraportalla 34 Tabla6.Distribucióndelascapasenfuncióndelalongituddelpelo 34 Tabla7.Distribucióndelamuestrasegúnlazonaderesidencia 34 Tabla8.Distribucióndelosanimalesencuestadossegúnelalojamiento 35 Tabla9.Desplazamientosaotroslugaresdelosanimalesencuestados 35 Tabla10.Horariosdepaseodelosanimalesencuestados 35 Tabla11.Distribucióndeanimalessegúnlautilizaciónderepelentes 36 Tabla12.ConcordanciaDiagnósticaentreIFIyqPCR 36 Tabla13.Prevalenciasycargasparasitariasdelosperrosmuestreados(n=98) 37 Tabla14.Cargasparasitarias(media±SD)delosperrospositivosporqPCR 37 Tabla15a.Prevalencias(%)estratificadassegúnlaedad 38 Tabla15b.Cargasparasitarias(media±SD)estratificadassegúnlaedad 38 Tabla16a.Prevalenciasaparentesestratificadassegúnelsexo 39 Tabla16b.Cargasparasitarias(media±SD)estratificadassegúnelsexo 39 Tabla17a.Distribucióndepositivosestratificadaporlatalla 39 Tabla17b.Cargasparasitarias(media±SD)estratificadaporlatalla 40 Tabla18a.Distribucióndepositivosestratificadaporlalongituddelpelo 40 Tabla18b.Cargasparasitarias(media±SD)estratificadaporlalongituddelpelo 40 Tabla19a.Distribucióndepositivosestratificadaporelcolordelpelo 41 Tabla19b.Cargasparasitarias(media±SD)estratificadaporelcolordelpelo 41 Tabla20a.Prevalenciasestratificadassegúnelusodepipeta 42
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 2 En los últimos años se ha avanzado mucho en cuanto a técnicas de diagnóstico basadas en biología molecular y la detección de DNA para el estudio de las enfermedades parasitarias entre otras (Zarlenga y Higgins, 2001). Dentro de este grupo de técnicas se encuentra la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), y actualmente una variedad de ésta: la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) que ha supuesto un avance incalculable debido a las ventajas que nos ofrece en comparación con el resto de técnicas y que serán detalladas más adelante en esta revisión (Francino et al, 2006). A groso modo, la qPCR nos permite cuantificar la carga parasitaria actual del animal, estimada en nuestro caso por ml de sangre. Es muy importante diferenciar entre la infección y la enfermedad. Hasta la actualidad, la gran mayoría de los estudios epidemiológicos se han basado en pruebas de diagnóstico indirecto, las cuales subestiman la prevalencia real de infección; y es conocido que los animales sanos con carga parasitaria en sangre son igualmente fuente de infección para el flebotomo (Molina et al, 1994; Michalsky et al, 2007). Por tanto, tal y como se detallará en el apartado correspondiente nuestro objetivo en este trabajo ha sido evaluar la prevalencia real de infectados asintomáticos en un área periurbana de una zona endémica de leishmaniosis canina, como es Zaragoza (Lucientes et al, 1991).
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 3 2. Revisión Bibliográfica 2.1. Leishmaniosis 2.1.1. Etiología La Leishmaniosis engloba todas las enfermedades producidas por parásitos del género Leishmania spp. que pertenecen al orden Kinetoplastida de la familia Tryoanosomatidae. Se distinguen dos formas morfológicas: amastigotes y promastigotes, sin diferenciación sexual (Pearson et al, 2001). El género Leishmania contiene 20 especies descritas, las cuales son similares morfológicamente pudiendo distinguirse por sus propiedades biológicas o bioquímicas. Mediante el análisis por medio de isoenzimas se han dividido en los siguientes grupos: L. tropica, L. aethiopica, L. major, L. donovani, L. brazilensis y L. mexicana. Cada uno de estos grupos contiene distintas especies o subespecies y numerosas distintas cepas (Ashford et al, 2000) En Europa y más concretamente en toda la región mediterránea, estamos afectados por L. infantum, la cual es la responsable de la leishmaniosis visceral y cutánea, tanto en el hombre como en el perro (reservorio principal), por lo que se considera una zoonosis de gran importancia (Ready, 2010). En cuanto al protozoo, se ha clasificado dentro del género Leishmania (Ross, 1903). La posición de este género en la clasificación de Levine y cols. (1980) es la siguiente: - Reino: Protista (Haeckel 1866) - Subreino: Protozoa (Goldfuss 1817) - Filum: Sarcomastigophora (Honigberg-Balamuth 1963) - Subfilum: Mastigophora (Deising 1866) - Clase: Zoomastigophorea (Calkins 1909) - Orden: Kinetoplastida (Honigberg 1963) - Suborden: Trypanosomatina (Kent 1880) - Familia: Trypanosomatidae (Döflein 1901) - Género: Leishmania (Ross 1903) Presenta dos estadios en función del hospedador en que se encuentra: Amastigote: Es de forma ovalada y aproximadamente 2-3 µm de diámetro, a veces puede presentar forma de torpedo cuando se encuentra en la piel (Figura 1). Se localizan en los fagolisosomas de células fagocíticas mononucleares (monocitos y macrófagos) de los hospedadores vertebrados (mamíferos). Poseen un núcleo alargado, que se localiza en la periferia y un kinetoplasto. En algunos se puede apreciar un flagelo rudimentario (rhizoplast). La división se realiza mediante fisión binaria.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 4 Figura 1. Amastigotes de L. infantum dentro de un macrófago Figura 2. Promastigotes de L. Infantum Promastigote: Es de forma alargada mide unos 20 µm, y presenta un flagelo libre que le permite desplazarse (Figura 2). Se localiza en el interior del hospedador invertebrado y su morfología varía en función del estado de crecimiento en el vector (Garnham, 1971). Existen formas del promastigote que no son infectantes, pero que poseen capacidad para dividirse: procíclicos, nectomonas, leptomonas, haptomonas y paramastigotes. El genoma de L. infantum es conocido, tiene un tamaño de aproximadamente de 33,6 Mb y se ordena en 36 cromosomas (Winker et al, 1996). Leishmania posee dos tipos de DNA: nuclear y extranuclear en la membrana mitocondrial también conocido como DNA quinetoplástico (kDNA) (Pearson 2001). El kDNA a su vez se compone de dos tipos de anillos de DNA. Unos 25-50 maxicírculos de entre 20 y 38 kb (Pearson, 2001; Pérez et al, 2010), y miles de minicírculos de 0,5 a 2 kb, se estima que hay unos 10.000 minicírculos por célula y cada uno de estos se compone de 800 pares de bases nitrogenadas (pb) de las que aproximadamente 200 pb están en la región constante y 600 están en la región variable (Perez et al, 2010). 2.1.2. Ciclo biológico Las leishmanias se transmiten principalmente mediante la picadura de un vector flebótomo (hospedador invertebrado). Los vectores capaces de transmitir Leishmania, se denominan “beatillas” o “moscas de la arena”, y están agrupadas dentro del orden Diptera, suborden Nematocera, familia Psychodidae y subfamilia Phlebotominae. En esta última se reconocen seis géneros, pero solo dos son importantes en cuanto a la transmisión de la enfermedad: Phlebotomous y Lutzomyia (Killick-Kendrick, 1999).
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 5 En España se han realizado estudios para determinar qué especies de flebótomos están involucradas en la transmisión del protozoo, siendo las de mayor importancia P. papatasi y P. perniciosus en zonas del interior y P. ariasi en áreas húmedas (Lucientes et al, 1991; Sanmartín, 1992; Galvez et al, 2010c). La hembra de flebótomo se alimenta de sangre de mamíferos, preferentemente durante el crepúsculo. Mediante su proboscis, lacera los capilares y succiona una pequeña cantidad de sangre, la cual en caso de contener macrófagos infectados con amastigotes, infecta al flebótomo (Figura 3). Figura 3. Hembra de P. perniciosus. Estos amastigotes pasan a promastigotes en el intestino de la beatilla. Los promastigotes se multiplican y se diferencian en una serie de estadios intermedios no infectantes: promastigote procíclico, nectomona y heptomona. El siguiente estadio promastigote metacíclico, ya es infectante. Mide aproximadamente 10-20 µm de largo por 1,5-3.0 µm de diámetro. Se extiende el flagelo y con ayuda de éste migra hasta la proboscis del flebótomo. En condiciones ambientales normales en zonas de trópico, este proceso requiere entre 5 y 8 días (Pearson et al, 2001; Hiepe et al, 2006a). Cuando el flebótomo ingiere sangre de nuevo, algunos de estos promastigotes metacíclicos (entre 100 y 1.000) que se distribuyen con la saliva del flebótomo, se inocularán en un nuevo hospedador vertebrado. La saliva del vector juega un papel muy importante en este proceso, pues provoca una reacción inmune local que favorece la acumulación de células hospedadoras e induce el desarrollo de una respuesta tipo Th2 dificultando la presentación de antígenos y por tanto la producción de productos oxidantes reactivos (Pearson et al, 2001; Hiepe et al, 2006a). Una vez inoculados los promastigotes serán fagocitados por macrófagos y demás células fagocitarias (células dendríticas, células de Langerhans y neutrófilos) en cuyo interior se transforma a la forma de amastigote, donde no es detectada y puede reproducirse. Estos amastigotes de Leishmania son englobados por una vacuola parasitófora que constituye un fagolisosoma, donde se multiplican hasta lisar la célula. Los amastigotes
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 6 libres circulan por el torrente sanguíneo o son fagocitados de nuevo por macrófagos o monocitos (Hiepe et al, 2006a). Así se completa el ciclo (Figura 4) Por tanto la progresión de la infección está determinada por la eficacia de la respuesta inmunitaria celular del hospedador. De este modo el animal pasa a estar infectado y ser infectante para nuevos flebótomos. En algunos muchos casos el hospedador reacciona de modo adecuado y la infección es inaparente, mientras que en otros se desarrolla una respuesta inmune humoral exagerada, causando la enfermedad. En cualquier caso, asintomáticos o enfermos, ambos son infectantes para el flebótomo. Figura 4. Esquema del ciclo de Leishmaniosis (Wikipedia: Mariana Ruiz Villarreal, 2008) 2.2. Cuadro clínico en perros 2.2.1. Mecanismos patogénicos Una vez que el flebótomo ha infectado al hospedador con promastigotes de Leishmania, se produce una reacción inflamatoria local que atrae a neutrófilos, eosinófilos y células Natural Killer (NK) en primer lugar, seguidas por la aparición de macrófagos inflamatorios. Los antígenos de Leishmania son fagocitados por células dendríticas en el lugar de inoculación o en su defecto se transportan por la linfa hacia linfonodos, donde estos antígenos son presentados con el fin de activar linfocitos T específicos y producir inicialmente una respuesta del tipo Th2. En función del tipo de citoquinas que se desarrollen se establecerá finalmente un tipo de respuesta con predominio Th1 o Th2. La respuesta Th1 se considera protectora y es la que da lugar a animales resistentes. Esta se desencadena principalmente por IL- 12 e IL- 18. Las células dendríticas que han migrado a los linfonodos son las principales productoras de IL- 12, allí provocan la activación de células NK que liberan Interferon ɣ (IFN- ɣ). Las
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 7 IL-12 estimulan la diferenciación en Th1. Estos son Th1 son activados por la producción de IFN-ɣ por los macrófagos, liberan NO citotóxico, lo cual causa la muerte del parásito. Los linfocitos Th1 también promueven la proliferación de linfocitos B y la secreción de inmunoglobulinas, aunque no estimula la producción de anticuerpos específicos. Actúan en general como auxiliares de inmunorreacciones mediadas por células promoviendo la resistencia a microrganismos intracelulares. Otro modo de destrucción de los macrófagos infectados es mediante la apoptosis de estos, la cual se produce cuando se une el ligando Fas de un linfocito T activado con un macrófago que expresa Fas. En caso de animales sensibles en los que predomina la respuesta Th2, las citoquinas presentes son IL-4, TGF-β e IL-10. Esta respuesta estimula la proliferación de linfocitos B y secreción de inmunoglobulinas. La producción inicial de IL-4 se relaciona con el antígeno LACK de Leishmania. La inmunidad frente a las reinfecciones se promueve a partir de la presencia constante de bajas cargas parasitarias durante años (Hiepe et al, 2006b). La clínica en la leishmaniosis se debe al acúmulo de anticuerpos generados cuando la respuesta inmune activa la vía Th2. Se ha comprobado que estos parásitos producen una desviación de la respuesta humoral originada por una estimulación policlonal de linfocitos B lo cual genera un exceso de inmunoglobulinas (especificas e inespecíficas). La existencia de inmunocomplejos circulantes es la causante de alteraciones en la coagulación, flujo venoso capilar y los depósitos en vasos de órganos principalmente hígado, bazo y riñón, en los cuales provocan patologías (Sanmartín, 1992). En cuanto a la transmisión, la principal vía estudiada ha sido siempre a través del vector; pero actualmente se están estudiando vías alternativas como la vía venérea (Silva et al, 2009), transfusiones de sangre (de Freitas et al, 2006), el uso de la misma aguja en caso, esto último ha sido estudiado en personas drogadictas (Cruz et al, 2002) y excepcionalmente por mordeduras (Solano-Gallego, 2011). 2.2.2. Sintomatología en el perro LC es una enfermedad sistémica que puede afectar a cualquier órgano y tejido, siendo su órgano diana la médula ósea. Los signos generales causados por esta enfermedad son inespecíficos, pudiendo citarse entre ellos: linfadenopatía generalizada, pérdida de peso, letargia, esplenomegalia, diarreas, vómitos, fiebre, síndrome poliuria/polidipsia, etc. Lo más frecuente es encontrar lesiones en la piel, destacando una dermatitis exfoliativa (Figura 5) no pruriginosa, con o sin zonas alopécicas sobre todo alrededor de los ojos y en la zona superior del hocico (cara de payaso) (Figura 6), úlceras principalmente en los salientes óseos (Figura 7), onicogrifosis (crecimiento excesivo de las uñas), y dermatitis papulares o pustulares.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 8 Además también se presentan signos oculares, entre los que se incluyen blefaritis, queratoconjuntivitis y uveitis. Otros signos que pueden observarse asociados con leishmaniosis son lesiones en la mucosa, epistaxis, cojeras, miositis atrófica, desordenes vasculares y neurológicos, etc. La presencia de uno o varios de estos signos en un animal enfermo compatible con LC nos hacen sospechar la enfermedad. Figura 5. Dermatitis exfoliativa Figura 6. Cara de payaso Figura 7. Úlcera en la cara dorsal de la muñeca Además de la evidencia clínica, la LC también altera parámetros analíticos (Figura 8). En el suero vemos hiperglobulinemia (policlonal β o gammaglobulinas), hipoalbuminemia y una disminución del ratio albumina/globulina. En la hematología de algunos pacientes se puede observar una anemia moderada no regenerativa, trombocitopenia y problemas en la hemostasia. El perfil bioquímico y el urianálisis muestran una proteinuria, azotemia y aumento de enzimas hepáticas (Solano-Gallego, 2012). La alteración de estos parámetros puede ser indicativa de LC. Sin embargo a pesar de todo lo citado en muchos casos la única manifestación clínica puede ser la enfermedad renal, provocada por el depósito de inmunocomplejos en la membrana glomerular. La enfermedad renal es la principal causa de muerte de los animales con LC, ya que lamentablemente no existe una detección precoz, la disminución de la tasa de filtración glomerular y el fallo renal comienza a dar signos cuando dos tercios de las nefronas están afectadas (Cortadellas et al, 2008).
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 9 Figura 8. Proteinograma característico de LC 2.2.3. Tratamiento y métodos de prevención El tratamiento y la prevención de la LC es algo que puede abordarse desde dos puntos de vista. Debido a su carácter zoonósico, los animales infectados deben tratarse para disminuir la carga parasitaria, y requieren una vigilancia y aplicación de métodos de prevención para evitar en la medida de lo posible la diseminación del parásito. En algunos países donde la Leishmaniosis causa serios problemas de Salud Pública como Brasil, las campañas de control para LC imponen medidas preventivas severas, como el sacrificio de todo animal infectado (Costa, 2011). Por otro lado en lugares que nos afectan, cuenca del Mediterráneo (España, Italia, Francia…), donde la incidencia de la enfermedad en humanos es baja, y los perros son animales de compañía, el tratamiento de un animal enfermo se debe establecer con el objetivo de controlar la enfermedad y la clínica del paciente. Así mismo deben establecerse medidas preventivas para evitar la diseminación (Solano-Gallego et al, 2009). 2.2.3.1. Tratamiento El tratamiento clásico que generalmente resulta más efectivo consiste en la combinación del leishmanicida Antimoniato de Meglumina (Glucantime®) con el leishmaniostático Alopurinol (Denerolle y Bourdoiseau, 1999; Manna et al, 2008b). Las pautas de dosificación varían en función del paciente, pero generalmente se trata con el Antimoniato de Meglumina durante las primeras 4 semanas, para reducir la carga parasitaria, y se realiza el mantenimiento a partir del Alopurinol con tratamientos de mínimo 6 meses (Torres et al, 2011). Los principales inconvenientes de esta terapia para el propietario, a parte del posible desarrollo de nefrotoxicidad (Beneth y Shaw, 2002), son el coste económico del
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 10 Antimoniato de Meglumina, y su dosificación a través de inyecciones subcutáneas diariamente. Por este motivo se ha invertido mucho esfuerzo en la búsqueda de tratamientos alternativos. Hay quien rebate el uso actual de este protocolo como terapia ideal (Lamothe, 2010) basándose en la existencia de estudios que defienden el uso del Alopurinol como único tratamiento (Koutinas et al, 2001), ya que éste es menos agresivo, más económico y de administración oral. Otro leishmanicida que actualmente se comercializa es la Miltefosina (Milteforan®) que ofrece como ventaja la eliminación por vía fecal, no renal, lo cual permite el uso de este fármaco en pacientes que ya han desarrollado cierto grado de enfermedad renal. Se han realizado estudios que demuestran su eficacia como leishmanicida (Manna et al, 2008a) y en combinación con Alopurinol para el control de la Leishmaniosis (Miró et al, 2009). El principal inconveniente de este tratamiento para el propietario es el elevado coste económico. Otros fármacos que también han sido descritos para el tratamiento de la Leishmaniasis son la Aminosidina, Amfotericina B, Espiramicina y Marbofloxacina, combinados de diferentes formas entre sí (Solano-Gallego et al, 2009). Actualmente se está imponiendo en el mercado el uso de terapias inmunomoduladoras, como la Domperidona (Leishguard®) que estimulan la respuesta inmune celular (Gomez-Ochoa et al, 2009). 2.2.3.2. Métodos de prevención Como ya hemos comentado, además de instaurar un tratamiento para paliar la enfermedad, es importante el uso de medidas para prevenir la picadura y así evitar la transmisión por medio del vector, ya que es la principal vía de transmisión. Teniendo en cuenta las características ecológicas del vector (mayor actividad durante el amanecer y el anochecer, mayor presencia en zonas pantanosas, etc) podemos evitar exponer los animales a la presencia del vector, no paseando durante las horas de mayor riesgo ni por lugares infestados de flebotomos. También se aconseja el uso de insecticidas dentro de casa. Pero indudablemente la prevención mediante insecticidas tópicos de larga duración aplicados sobre el animal, es lo que nos proporciona mayor seguridad. Uno de los métodos más utilizados es el collar con Deltametrina 4% (Scalibour®) (Figura 9), éste tiene una duración de hasta 34 semanas (Manzanillo et al, 2006) y su eficacia ha sido estudiada por diversos autores tanto en animales de compañía (Maroli et al, 2001) como en perreras (Manzanillo et al, 2006). La eficacia de estos collares como repelentes se estima bastante alta, mientras que como insecticida es escasa o nula (Halbig et al, 2000). En el estudio realizado por Manzanillo y cols. en 2006 obtuvieron como resultado que la tasa de protección acumulada estimada teniendo en cuenta los 2 años de su estudio fue del 50,8%
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 11 El otro método son los preparados en pipetas o tipo “spot on” con Imidacloprid 10% y Permetrina 50% (Advantix®), eficaces para proteger frente artrópodos además de flebotomos (Otranto et al, 2010). La eficacia de estos productos dura aproximadamente 1 mes (Figura 10). Figura 9. Collar de Deltametrina (Scalibour®) Figura 10. Pipetas de Imidacloprid y Permetrina (Advantix®) Sin embargo la eficacia de estos productos es algo que varía en función de la exposición al vector. Hay estudios citan que a partir de la 3ª semana la eficacia de repelencia se reduce al 72,8% y la 4ª semana es del 55,9% (Mencke et al, 2003). En otro estudio algo más reciente realizado por Miró y cols. (2007) estiman la eficacia como repelente sobre el 90% hasta la 3ª semana y un 74% a partir de la 4ª. Las variaciones entre ambos estudios pueden deberse a las diferencias en el tipo de flebótomo (P. papatasi frente a P. perniciosus) y la densidad de exposición a éste (200 insectos por perro en el estudio de Menke y cols. frente a 100 en el de Miró y cols.). En cualquier caso se debería repetir la dosificación cada 3 semanas para ser eficiente frente al flebotomo. Un estudio realizado por Ferroglio y cols. (2008) comparó la eficacia de las Deltametrinas contra concentraciones algo superiores de Permetrina, llegando a la conclusión de que la protección ofrecida por ambas es equivalente. Recientemente se han incorporado al mercado dos tratamientos nuevos como profilaxis. La Domperidona (Leishguard®), que ya ha sido citada en el apartado anterior, se ha comercializado como jarabe tanto para prevención como para tratamiento (Gomez et al, 2004 y 2009) (Figura 11), y también se ha comercializado una vacuna inyectable contra la leishmaniosis (CaniLeish®) que se basa en la fracción proteica de la proteína secretada-excretada por el parásito (Figura 12). Figura 11. Domperidona (Leishguard®) Figura 12. Vacuna CaniLeish®
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 18 Termociclador: Una vez elaborada la muestra se introduce en un termociclador, este aparato realiza los ciclos de temperaturas entre 4 y 96ºC necesarios para que se realice la PCR. En cada ciclo de temperatura se duplica la cantidad de DNA presente. A su vez recoge la fluorescencia emitida mediante fotos que se realizan en función del programa preparado. Está asociado a un ordenador donde se generan las curvas de resultados mientras se desarrollan los ciclos (a tiempo real) lo que nos permite ir viendo la evolución de la reacción. Curvas: - Curva de amplificación (Amplification Curve or Primary Grow Curve): Enfrenta la fluorescencia (eje OY) frente los ciclos (eje OX) y sirve para diagnosticar si una muestra es positiva o no. Típicamente vemos tres fases (Figura 15): fase inicial (las cantidades de ADN son indetectables), fase logarítmica-lineal (la cantidad de ADN crece linealmente) y la fase de meseta o de “plateau” (el sistema de detección se satura o alguno de los componentes de la reacción se han agotado). Figura 15.Fases de la qPCR En esta curva hay que determinar la línea de base, el ciclo umbral (CT threshold) y el valor de la CT (CT value). - El ciclo umbral se define como el número de ciclos necesarios para que se produzca un incremento significativo de la fluorescencia respecto a la señal de base y es inversamente proporcional a la cantidad de moléculas de molde. El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial del producto PCR (fase exponencial). - Valor de la CT: Este último numera el ciclo en el que se detecta un incremento en la señal que cruza el ciclo umbral. Si esta CT es baja significa que hay mucha cantidad de DNA inicial y viceversa.
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 19 Figura 16. Relación entre la escala logarítmica y los ciclos de replicación - Curva de fusión (Melting curve): Enfrenta la fluorescencia (eje OY) frente la temperatura (eje OX) se obtiene tras la amplificación por el decaimiento de la señal fluorescente, debido a la fusión del producto dependiente de la temperatura. Cada producto tiene una temperatura de disociación específica en función del tamaño y tipo de bases que contiene, y esto nos permite saber si el producto que se había formado era específico o no. La derivada de la curva de fusión revela un pico máximo correspondiente a la temperatura de fusión del producto (Tm). El área bajo la curva de este pico es proporcional a la cantidad de producto. Figura 17. Presentación de distintas curvas de fusión - Curva de estandarización o calibrado: Esta es diferente de las dos anteriores, y es la curva que debe realizarse para la puesta a punto de la prueba. Esta es una línea de ajuste que se elabora mediante diluciones seriadas de una concentración inicial conocida, para posteriormente poder cuantificar la carga de modo absoluto. Si no se realiza, el resultado se expone sin unidades y la cuantificación es relativa. La pendiente de esta curva nos informa de la eficiencia de la reacción. Si la pendiente es de -3.32 significa que la PCR es 100% eficiente.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 20 El número de copias se determina por comparación al ajuste linear entre el número de ciclos y el inverso del logaritmo de las copias en la muestra. Figura 18. Curva patrón 2.3.3.3. Ventajas de la qPCR frente a la IFI La qPCR es una herramienta que además de poder utilizarse para el diagnóstico precoz de LC en animales que aun no han seroconvertido. Se emplea como prueba de confirmación en animales dudosos, para poder descartar una posible reacción cruzada. Posee mayor especificidad y sensibilidad que IFI. La otra gran ventaja atribuible a qPCR es que permite monitorizar la respuesta al tratamiento en tiempo real, mientras que los anticuerpos pueden permanecer en sangre durante meses, de forma que el efecto de los leishmanicidas puede valorarse de inmediato mediante esta prueba. En el estudio realizado por Martínez y cols. (2011) concluyen que aquellos perros con un rango de parasitemia de medio a alto o muy alto enfermarán de LC. Cuando se pretende estimar la prevalencia de infectados, como es el objeto de este estudio, para evaluar la distribución de estos animales; las pruebas serológicas como la IFI no son suficientemente “buenas” por los siguientes motivos: - La seroconversión se produce entre los 3-6 meses posteriores a su infección en función del sistema inmunitario del animal. Lo cual puede infravalorar la prevalencia de afectados, ya que en el momento de la recogida de muestra de los animales es posible que algunos de ellos aún no hayan desarrollado anticuerpos. - Algunos animales responden adecuadamente a la infección, produciendo una respuesta celular efectiva y no humoral, por lo que no serán detectados. - Por el contrario en caso de reacciones cruzadas o falsos positivos, frecuentes en esta técnica, puede sobrestimarse la prevalencia. Por todas estas razones, es de incuestionable importancia utilizar otro tipo de técnicas de diagnóstico directo como es la qPCR, para el estudio de la prevalencia de infectados de una
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 21 región o zona, que nos permita conocer con exactitud la cantidad de animales que tienen el parásito circulante en sangre y que por ello pueden ser una fuente de infección para los mosquitos que se alimenten en ellos; posibilitando así la transmisión del parásito. Ya hemos citado que la qPCR será la técnica utilizada en nuestro estudio, ya que se trata de la prueba diagnóstica más actual y fiable, permitiendo establecer una prevalencia real de infectados, la cual varía significativamente en comparación con las prevalencias estimadas mediante IFI. 2.4. Estudios sobre la prevalencia de Leishmaniosis Desde mediados de los 80 hasta la actualidad distintos grupos de investigación han realizado estudios para establecer las prevalencias de las distintas zonas. Hasta la fecha prácticamente la totalidad de los estudios poblacionales realizados se basan en pruebas serológicas lo cual ha subestimado la prevalencia de infectados. No hay que olvidar que la presencia de anticuerpos significa que ha habido una exposición al parásito pero no implica su presencia (Morales-Yuste et al 2012). Es importante elegir la prueba diagnóstica en función con el tipo de estudio que se pretenda realizar. Las pruebas de diagnostico directo, que identifican los animales infectados son las más adecuadas para establecer las prevalencias de infección ya que los perros asintomáticos que no han desarrollado anticuerpos son igualmente infectantes para los vectores. La prevalencia de infectados se define como la proporción de casos en un momento dado. Prevalencia Puntual = Nº total de casos (nuevos + viejos) / Población total La elección del método de diagnóstico, el momento, la localización y las características de población estudiada influyen significativamente en el resultado de la prevalencia estimada (Morales-Yuste et al, 2012). Todo esto debe de tenerse en cuenta cuando se pretende comparar distintos estudios pues generalmente no están en condiciones equiparables. Entre los estudios más recientes publicados en España sobre la prevalencia de Leishmaniosis destacamos los siguientes trabajos. Solano-Gallego y cols. (2001) realizaron un estudio en Mallorca en el cual 100 perros fueron diagnosticados mediante ELISA y PCR en diferentes tejidos (médula ósea, conjuntiva y piel). En la muestra seleccionada 13 animales mostraban sintomatología y 87 eran asintomáticos. Considerando como positivos los animales con resultado positivo por alguno de estos test, se estimó una prevalencia global del 67%. Otro estudio reciente realizado en Madrid por Gálvez y cols. (2010) sobre 1076 perros, estimó por medio de IFI una prevalencia de 8,1% entre los años 2006-2007. Los autores citan que, en referencia a estudios de 1992, la prevalencia detectada fue 1,54 veces mayor. En cuanto a nuestro área de estudio, Zaragoza, podemos encontrar datos muy interesantes en la Tesis Doctoral de Ana Peris (2010), ya que en esta se realizó un estudio longitudinal durante 2 años que estableció una seroprevalencia final de 11,9% en la ciudad de Zaragoza y de 8,5% en Aragón.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 22 En referencia a estudios de prevalencia que incluyen datos estimados mediante PCR, algunos autores ya han utilizado esta prueba comparándola con pruebas serológicas. Un estudio interesante al respecto es el realizado por Morales-Yuste y cols. (2012), en cual evaluaron las implicaciones del uso de distintos métodos, concretamente IFI, ELISA y PCR; en animales agrupados en tres grupos: animales encuestados al azar, sintomáticos y un grupo control negativo proveniente de una zona libre de LC (Estrasburgo) que lógicamente resultaron negativos a todo, con la excepción de un título IFI 1/80 atribuible a una reacción cruzada. Los dos primeros grupos se seleccionaron en un área endémica (sureste de España). Utilizando el dintel 1/80, la prevalencia dentro del grupo de animales asintomáticos fue del 30% mientras que estimada por PCR en sangre fue del 49,9%. Además este grupo se subdividió en animales procedentes de zonas termomediterráneas y mesomediterráneas, observándose en esta segunda localización prevalencias superiores tanto por PCR como por IFI. El estudio realizado en Mallorca por Fernández-Bellón y cols. (2008), con objeto de evidenciar la variación de la seroprevalencia en función del momento en que se tome la muestra, antes o después del periodo de actividad del vector. Se encuestó un total de 79 animales que iban de la protectora municipal, previamente a su eutanasia. Las prevalencias estimadas por medio de pruebas moleculares (PCR a partir de muestras cutáneas) fueron significativamente mayores que las estimadas mediante IFI 24% frente el 8% en el primer periodo (Febrero). Otra conclusión que se obtuvo de este estudio fue que a diferencia de las prevalencias estimadas por PCR las prevalencias estimadas mediante IFI variaron de un 8% en Febrero a un 20% en Octubre. Este hecho nos recalca la importancia de tener en cuenta los periodos en que se han encuestado los animales cuando queremos realizar o comparar estudios sobre las seroprevalencias. Un trabajo que también resulta interesante a revisar para nuestro estudio, es el realizado por Martínez y cols. (2011) en la Universidad Autónoma de Barcelona sobre 710 perros. El interés de este estudio es que utilizan las técnicas de ELISA y qPCR. La infección se detectó en el 36,3% mientras que solo el 17,9% se clasificaron como enfermos de LC. De los animales, el 4,5% fueron positivos por qPCR, el 16,2% se detectaron por ELISA y un 15,6% fueron positivos a ambos test. También nos ha resultado interesante el trabajo realizado por Tabar y cols. (2009), los cuales encuestaron 159 animales que acudieron a la consulta del hospital de la facultad de veterinaria de Barcelona, mediante el uso de PCR en sangre periférica. Concluyendo que un 29,4% de los animales estaban infectados por L. infantum y que esto se asociaba de modo significativo con la presencia de coinfecciones. No podemos considerar estos datos para calcular la prevalencia ya que se incluyeron animales que provenían de zonas muy dispares. En cuanto a la qPCR, hemos encontrado un estudio prospectivo realizado en Francia por Aoun y cols. (2009). Se incluyeron aproximadamente 140 perros militares entre los años 1986 y 2006. Se comparó la técnica qPCR realizada con una sonda TaqMan contra las técnicas serológicas WB, obteniendo una prevalencia global del 50% y una concordancia entre las pruebas del 55%.
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 23 3. Objetivos 3.1. Objetivo principal El objetivo principal de este Proyecto de Fin de Máster es establecer las prevalencias actuales de infectados por Leishmania infantum mediante dos técnicas diferentes, IFI y qPCR en animales asintomáticos del área periurbana de una población endémica (Zaragoza). 3.2. Objetivo secundario El objetivo secundario de este estudio fue evaluar la influencia como factores de riesgo de las distintas variables encuestadas.
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 24
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 25 4. Material y Métodos 4.1. Descripción del estudio 4.1.1. Área de estudio El estudio se ha llevado a cabo a partir de perros de los clientes habituales de una clínica veterinaria situada en el municipio de Zaragoza, restringiendo el área de estudio a la zona circundante al barrio de Miralbueno (donde se localiza la clínica), que corresponde a un área periurbana en la que los animales tienen acceso a zonas con las mismas condiciones ambientales y urbanísticas, evitando que esto actúe como un factor de confusión que pueda influir en el resultado de nuestro estudio. Es importante tener en cuenta este factor cuando se realizan estudios epidemiológicos sobre localizaciones de gran extensión, ya que si no se delimita correctamente las zonas a estudiar podemos encontrarnos diferencias debidas a variaciones en la probabilidad de presentarse el vector. Por ejemplo, los animales que residen en zonas totalmente urbanizadas generalmente pasean por pequeños jardines acondicionados, y la presencia del vector en estos lugares de escasa vegetación y humedad, es significativamente menor que en los barrios del extrarradio o zonas cercanas a la rivera donde las condiciones favorecen la actividad del vector, pudiendo esto afectar a la prevalencia como se ha visto en otros estudios (Galvez et al, 2010a). Las zonas incluidas en el área de estudio se delimitaron utilizando como criterio el código postal al que pertenecen. Así pues, se realizó una primera selección según la procedencia de los animales, permitiendo solo participar a los que procedían de las distintas zonas incluidas en el estudio y que se correspondían fundamentalmente a los distritos 50011 y 50012 de Zaragoza (Figura 19). Figura 19. Distritos de la ciudad de Zaragoza
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 26 La Figura 19 muestra la distribución de las distintas zonas seleccionadas (Garrapinillos, Autovía de Logroño, Miralbueno-Oliver, Valdefierro, Bombarda-Hispanidad y Montecanal). Figura 20. Zonas incluidas en el estudio 4.1.2. Periodo de estudio Las muestras se tomaron entre los meses de Enero y Abril de 2012, época en que se realiza habitualmente la campaña de prevención frente a Leishmania, ya que el periodo de actividad de los flebótomos se prolonga a veces hasta Octubre (Galvez et al, 2010b) y el tiempo medio estimado necesario para la seroconversión en animales infectados naturalmente es de 5 meses, pudiendo variar entre 1 y 22 meses (Martínez et al, 2011). 4.1.3. Selección de los participantes Una vez definida el área de estudio y el periodo de estudio, se procedió a definir el resto de los criterios de inclusión-exclusión para la selección de los participantes. Se excluyó a los animales menores de un año de edad, para que los perros al menos hubieran estado expuestos a dos periodos de actividad del vector. No se seleccionaron animales con una sintomatología severamente manifiesta de la enfermedad (caquexia, úlceras, etc) ya que nuestro objetivo es la evaluación epidemiológica de una población asintomática. Autovía Logroño Garrapinillos Miralbueno Oliver Valdefierro Bombarda Hispanidad Montecanal
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 27 Así mismo se excluyeron a los animales que vivían constantemente en interiores, pues no tienen posibilidad de contactar con el vector. Por ello todos los animales incluidos en la muestra paseaban como mínimo una vez al día. Finalmente se excluyó a animales que ya habían sido seropositivos (mediante IFI) en años anteriores a 2011, incluso aquellos animales que en años anteriores tras un título bajo de anticuerpos, seronegativizaron. El tamaño de muestra se calculó teniendo en cuenta que la seroprevalencia en Zaragoza en 2005 a principio de la temporada de actividad del vector era de 9,2% (Peris, 2010), y asumimos una precisión del 7% y un nivel de confianza del 95%. El resultado fue de 89 animales al calcularlo con la versión 2.0 del WinEpi (http://www.winepi.net) asumiendo una distribución binomial entre 2 y 16%. Con el fin de evitar pérdidas de información se aumentó la muestra un 10%. Todos los propietarios que decidieron que sus animales participasen en el estudio, lo hicieron de modo voluntario, sin obtener ningún beneficio y sin que existiera ningún conflicto de intereses. Respetando todos estos parámetros, obtuvimos una muestra final de 98 perros de más de 1 año de edad, que habitan en el área periurbana circundante a Miralbueno. 4.1.4. Diseño del estudio Realizamos un estudio observacional retrospectivo, asimilable a un diseño caso-control, ya que establecimos el estado de infección en los animales en el momento de la toma de muestra y lo comparamos con distintas variables intrínsecas y extrínsecas correspondientes a momentos anteriores a la toma de muestras. 4.1.5. Extracción de sangre La muestra de elección para la realización de ambas pruebas se obtuvo a partir de sangre de venas periféricas, y concretamente se extrajo de la vena cefálica. A partir de los controles rutinarios efectuados en la clínica correspondientes a la campaña anual de control frente a la leishmaniosis, durante la misma visita y aprovechando la venopunción realizada para la obtención de sangre para el diagnóstico rutinario por IFI, se extrajeron a cada animal 0,5 ml de sangre adicionales para la realización de la qPCR. La muestra de sangre destinada al diagnóstico directo se mantuvo en tubos con una concentración de anticoagulante EDTA adecuada para el volumen de muestra extraída, y se almacenaron refrigeradas a temperatura entre 0-5ºC hasta su procesamiento en un plazo inferior a 48 h, con el fin de prevenir alteraciones del DNA. Por otra parte, las muestras destinadas a serología, se mantuvieron en tubos sin ningún tipo de anticoagulante para permitir que se produjese la precipitación del coágulo sanguíneo y obtener como sobrenadante el suero con los anticuerpos. Estas muestras
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 34 Debido a que los animales fueron seleccionados entre los clientes de una clínica veterinaria, y por tanto la variación de las razas no permitía establecer comparaciones entre ellas, se decidió clasificar a los animales en función de su tamaño (Tabla 5). Podemos observar que, a excepción de los animales considerados de tamaño “Toy” que representan un 10%, el resto de categorías se distribuyen de forma similar con frecuencias de aproximadamente un 30%. Tabla 5. Distribución de la muestra por talla Talla Frecuencia Toy 10,2% Pequeño 26,5% Mediano 33,7% Grande 29,6% Total (n) 98 En la Tabla 6 se muestra la distribución de la muestra según la longitud del pelo y color de la capa. Es destacable que la proporción de perros con pelo largo claro o intermedio es menor al resto. Tabla 6. Distribución de las capas en función de la longitud del pelo Longitud del pelo Color de capa Total Claro Intermedio Oscuro % n Corto 20,4% 9,2% 7,1% 36,7% 36 Medio 17,3% 11,2% 11,2% 39,8% 39 Largo 5,1% 6,1% 12,2% 23,5% 23 Total % 42,9% 26,5% 30,6% n 42 26 30 Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson, p=0,065 En la Tabla 7 se muestra la distribución de los animales encuestados en función de su lugar de residencia. Siete de cada diez perros proceden del área metropolitana de Miralbueno- Oliver, lo cual se explica teniendo en cuenta la localización de la clínica. Tabla 7. Distribución de la muestra según la zona de residencia Zona de residencia Frecuencia Garrapinillos 5,1% Autovía de Logroño 8,2% Miralbueno-Oliver 69,4% Valdefierro 9,2% Bombarda-Hispanidad 6,1% Montecanal 2,0% Total (n) 98
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 35 En la encuesta se recogió información sobre el tipo de alojamiento en que viven los animales, considerando alojamiento exterior tanto a los animales que viven en parcelas como los que viven en chalets o casas con acceso ilimitado al jardín o terraza a voluntad del animal. La Tabla 8 muestra que dos tercios de los animales encuestados viven en el interior de la casa mientras que un tercio tienen acceso continuo al exterior. Tabla 8. Distribución de los animales encuestados según el alojamiento Alojamiento Frecuencia Interior 65,3% Exterior 34,7% Total (n) 98 También se recogió información acerca de los desplazamientos puntuales a zonas que consideramos pueden aumentar el riesgo de infectarse, como son zonas de la costa mediterránea donde abundan más los flebotomos, y guarderías donde los animales están en contacto entre ellos y hay más posibilidades de que sean picados por los vectores. La Tabla 9 nos muestra que uno de cada tres perros viaja al área mediterránea, e igualmente uno de cada tres se aloja temporalmente en guarderías. Tan solo un 6% viaja a otros lugares. La estancia en uno de estos grupos no es excluyente de otro. Tabla 9. Desplazamientos a otros lugares de los animales encuestados Desplazamiento Frecuencia Mediterráneo 31,6% Guardería 30,6% Otro lugar 6,1% Sabemos que los horarios de mayor actividad de los flebotomos son el amanecer y el anochecer. Por tanto quisimos estudiar el régimen de paseos de los animales muestreados, para lo cual dividimos el día en cinco franjas no excluyentes entre ellas. La Tabla 10 nos muestra que el régimen de paseo es similar para todas las franjas horarias. Tabla 10. Horarios de paseo de los animales encuestados. Paseo Frecuencia Amanecer 61,2% Mañana 80,6% Tarde 78,6% Anochecer 82,7% Noche 73,5% Total (n) 98 Finalmente, para acabar de describir la muestra, valoramos el uso de distintos métodos de profilaxis contra la picadura del flebotomo. Los resultados mostrados en la Tabla 11 indican que la mitad de los animales muestreados utilizan collares; mientras que tres cuartas partes
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 36 utilizan pipetas. Por tanto la utilización de la pipeta está más generalizada, probablemente debido a que los propietarios consideran los collares como un método más molesto. En cualquier caso la gran mayoría de los animales no están protegidos durante todo el año, y se aplican estos productos solo durante las épocas de actividad de los insectos. Tabla 11. Distribución de animales según la utilización de repelentes Collar Total Protección anual No Sí % n Pipeta No 66,7% 33,3% 21,4% 21 91,8% Sí 40,3% 59,7% 78,6% 77 8,2% Total % 45,9% 54,1% n 45 53 Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson, p=0,031 5.2. Concordancia diagnóstica Estudiamos la concordancia entre ambas pruebas diagnósticas utilizadas en este estudio (Tabla 12). Como se puede observar ambas pruebas son totalmente discordantes, mostrando un coeficiente kappa cercano a 0. Esto concuerda con experiencias de otros autores (Morales-Yuste et al, 2012) y se explica debido a que mientras que la qPCR detecta todos los animales que han sido picados e infectados, es decir que presentan carga antigénica; la IFI solo detecta a aquellos que han seroconvertido. En nuestro estudio todos los animales considerados IFI positivos, tuvieron un resultado correspondiente a una baja titulación (título 1/80). El caso de los dos animales IFI positivos y qPCR negativos tiene varias explicaciones posibles. Pueden ser falsos positivos, debido a la presencia de reacciones cruzadas, aunque otra alternativa más probable es que estos animales sufrieran una alta parasitemia en verano que generó anticuerpos los cuales permanecen presentes durante un tiempo después de que el animal haya podido controlar la infección. En ambos casos se repitió la serología al mes y el resultado fue negativo, y ambos casos mostraban presencia de producto especifico en la qPCR pero a CT demasiado altas por lo que se consideraron negativos. Tabla 12. Concordancia Diagnóstica entre IFI y qPCR IFI Negativo Positivo Total qPCR (CT<38) Negativo 39 2 41 Positivo 51 6 57 Total 90 8 98 Coeficiente Kappa de Cohen = 0,048 (p=0,314)
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 37 5.3. Prevalencias de Leishmaniosis Para caracterizar el estatus sanitario de la muestra, estimamos la seroprevalencia (mediante IFI) y la prevalencia de infección (mediante qPCR). Este es el principal objetivo de nuestro estudio, y los resultados los muestra la Tabla 13. La seroprevalencia observada por IFI es tan solo de un 8,2%, mientras que la detectada por qPCR es 7 veces mayor. Este dato es de vital importancia para la realización de estudios epidemiológicos, pues corrobora una de nuestras hipótesis y se corresponde con estudios realizados por otros autores en la misma zona (Castillo et al, 1984; Peris, 2010), en los que se cita que las prevalencias estimadas hasta la fecha mediante técnicas serológicas subestimaban los valores reales de infección. La importancia de este dato radica en que todos los animales que no estaban siendo considerados como fuentes de riesgo en realidad son una posible fuente de infección para los flebótomos. Tabla 13. Prevalencias y cargas parasitarias de los perros muestreados (n= 98) n Prevalencia IC (95%) IFI 8 8,16% 4,19-15,29% qPCR (CT<38) 57 58,16% 48,27- 67,44% Media SD qPCR 57 73,94 83,96 CT 57 35,73 1,48 Para estudiar más a fondo estos valores, comparamos las diferencias entre la media de la carga parasitaria expresada en amastigotes/ml sangre o en CT “Cycle Threshold” o ciclo umbral. Recordemos que este término es inversamente proporcional al logaritmo del número de copias del gen en la muestra original, por tanto al ser una expresión logarítmica su variación es menor. Estudiamos las cargas parasitarias en animales seropositivos y seronegativos. La Tabla 14 no muestra diferencias significativas entre los valores de ambos grupos; obteniendo una carga media de la muestra de 73,94 amastigotes/ml y una CT de 35,73, sin observar diferencias entre animales seropositivos o seronegativos. Tabla 14. Cargas parasitarias (media ± SD) de los perros positivos por qPCR IFI n qPCR CT IFI Seronegativos 51 74,52 ± 86,99 35,75 ± 1,54 IFI Seropositivos 6 69,00 ± 57,10 35,55 ± 1,04 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 p 0,880 t 0,757 t t Significación estadística según prueba t de Student 5.3.1. Asociación con las variables intrínsecas La Tabla 15a nos muestra la relación entre la edad de los animales encuestados y la prevalencia medida por ambas técnicas. Aunque no se obtienen resultados
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 38 estadísticamente significativos, sí que podemos observar una clara tendencia de que conforme aumenta la edad aumenta el número de animales que han desarrollado anticuerpos, lo cual coincide con estudios revisados (Galvez el tal, 2010; Sousa et al 2011), mientras que el porcentaje de infectados es prácticamente el mismo. Esto nos parece lógico ya que la probabilidad de infectarse durante el último periodo de actuación del flebótomo es la misma para todos los animales independientemente de su edad. Tabla 15a. Prevalencias (%) estratificadas según la edad IFI qPCR (CT<38) Edad n % IC (95%) % IC (95%) 1-5 años 47 2,1 0,38-11,11% 53,2 41,25-68,59% 6-10 años 38 13,2 5,75-27,33% 57,9 42,19-72,15% >10 años 13 15,4 4,33-42,24% 69,2 42,37-87,32% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% P 0,083C 0,582LR C Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson LR Significación estadística según prueba Likelihood Ratio Cuando comparamos la edad con la carga parasitaria dentro de los animales positivos por qPCR (Tabla 15b), vemos una tendencia a aumentar la carga con la edad de los animales, comprensible ya que al aumentar la edad han aumentado el número de periodos de exposición a picaduras, y por tanto habrán sido infectados más veces. Por el contrario, cuando analizamos la edad respecto a la carga expresada en CT, vemos que lógicamente ésta disminuye con la edad, y en este caso de forma significativa. Tabla 15b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificadas según la edad Edad qPCR (CT<38) qPCR CT 1-5 años 26 58,04 ± 80,79 36,15 ± 1,28 6-10 años 22 78,85 ± 81,38 35,64 ± 1,43 >10 años 9 107,89 ± 96,83 34,76 ± 1,80 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,379 KW 0,048A KW Significación estadística según Kruskal-Wallis, A Significación estadística según prueba ANOVA En la Tabla 16a se muestra la diferencia en la prevalencia en función del sexo. Vemos una asociación significativa clara (p=0,001) en el caso de la seroprevalencia. En cambio en cuanto a la prevalencia estimada por qPCR no se aprecian diferencias significativas entre ambos sexos. Esto es indicativo de que el flebótomo no tiene predilección por sexos ya que ambos muestran prevalencias similares de infección, aunque en nuestra muestra fueron exclusivamente las hembras las que desarrollaron anticuerpos. Sin embargo estos resultados no coinciden con estudios realizados en un ámbito similar por Peris en 2010, que en una muestra de 687 perros no encontraron diferencias significativas de seroprevalencias según el sexo. Esta autora comenta la existencia de distintos trabajos
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 39 con resultados contradictorios en relación al papel del sexo en la infección por Leishmania, y que podría deberse a la aptitud de los animales. Tabla 16a. Prevalencias aparentes estratificadas según el sexo IFI qPCR (CT<38) Sexo n Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) Macho 53 0,00% 0,00 - 6,76% 62,26% 48,81 - 74,06% Hembra 45 17,78% 9,29 - 31,33% 51,11% 37,00 - 65,04% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% p 0,001 C 0,192 C C Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson En cuanto a la carga parasitaria, la Tabla 16b muestra las medias calculadas en función del sexo, nos muestra que los machos presentaron una carga parasitaria prácticamente doble a la de las hembras, con una significación de 0,040; mientras que si las expresamos por CT no encontramos diferencia alguna. Por tanto con la información obtenida por ambas tablas, podemos interpretar que las hembras a igual CT que los machos son más susceptibles a desarrollar la anticuerpos. Tabla 16b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificadas según el sexo Sexo qPCR (CT<38) qPCR CT Macho 34 90,40 ± 100,37 35,54 ± 1,65 Hembra 23 49,60 ± 42,34 36,01 ± 1,18 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,040 t 0,220 t t Significación estadística según prueba t de Student Hemos querido estudiar la posible influencia del tamaño del animal (Tabla 17a), y tras el análisis estadístico no podemos afirmar que haya diferencias entre los distintos tamaños de los animales, aunque parece que se observa una tendencia a que los animales de mayor tamaño tengan más probabilidad de ser seropositivos. Esto podría deberse a que en general los animales de tamaño “Toy” o “Pequeño” son animales que viven dentro de casa y están mejor cuidados que los de tamaño “Mediano” o “Grandes”, lo cual ya ha sido descrito antes (Galvez et al, 2010). Tabla 17a. Distribución de positivos estratificada por la talla IFI qPCR (CT<38) Talla n Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) Toy 10 0,0% 0,00-27,25% 60% 31,27-83,18% Pequeño 26 3,80% 0,68-18,89% 57,7% 38,95-74,46% Mediano 33 6,10% 1,68-19,61% 66,7% 49,61-80,25% Grande 29 17,2% 7,60-34,55% 48,3% 31,39-65,57% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% P 0,159LR 0,539C LR Significación estadística según Razón de Verosimilitudes. C Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 40 En cuanto a la carga parasitaria de los animales positivos, estratificados por las tallas, no observamos diferencias significativas, lo cual nos incita a pensar que todos son infectados por igual (Tabla 17b). Tabla 17b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificada por la talla Talla qPCR (CT<38) qPCR CT Toy 6 35,66 ± 35,06 36,48 ± 1,34 Pequeño 15 106,86 ± 87,70 35,23 ± 1,75 Mediano 22 80,04 ± 87,70 35,57 ± 1,47 Grande 14 45,47 ± 34,55 36,19 ± 1,07 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,151 A 0,182 A A Significación estadística según ANOVA Estudiando la posible relación con la longitud del pelo, y a diferencia de otros estudios que consideran el pelo corto como un factor de riesgo (Cortes et al, 2012) la Tabla 18a de nuestro estudio refleja que no se encontraron diferencias significativas en la prevalencia con ninguna de las dos pruebas diagnósticas. Consideramos que la longitud del pelo ha sido erróneamente clasificada como un factor de riesgo, ya que en realidad leyendo detalladamente el estudio previamente citado, vemos que la prevalencia de infectados de pelo medio y corto es prácticamente la misma, mostrando solo diferencias significativas con el pelo largo. Tabla 18a. Distribución de positivos estratificada por la longitud del pelo IFI qPCR (CT<38) Long. Pelo n Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) Corto 36 5,6% 1,54-18,14% 55,6% 39,58-70,46% Medio 39 10,3% 4,06-23,58% 61,5% 45,90-75,11% Largo 23 8,7% 2,42-26,80% 56,5% 36,81-74,37% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% p 0,746LR 0,857C LR Significación estadística según Razón de Verosimilitudes. C Significación estadística según prueba Chicuadrado de Pearson En cuanto a la carga parasitaria, tampoco se observan diferencias significativas entre las diferentes longitudes de pelo (Tabla 18b). Tabla 18b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificada por la longitud del pelo Long. Pelo qPCR (CT<38) qPCR CT Corto 20 75,25 ± 92,27 35,76 ± 1,64 Medio 24 59,48 ± 56,84 35,87 ± 1,32 Largo 13 98,61 ± 109,79 35,43 ± 1,58 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,406 A 0,693 A A Significación estadística según ANOVA
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 41 Estudiamos la influencia del color de la capa sobre las prevalencias. Se establecieron tres categorías en cuanto al color del pelo, considerando claros los animales de pelo blanco o rubio, medios los tonos grises y marrones tostados, y oscuros los animales de pelo negro, marrón chocolate y todas aquellas mezclas en que predominasen los colores oscuros. Aunque los resultados no son significativos, si se observa claramente en la Tabla 19a que los perros de colores medio y oscuro tienen más del doble de prevalencia que los de capa clara. Tabla 19a. Distribución de positivos estratificada por el color del pelo IFI qPCR (CT<38) Color Pelo n Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) Claro 42 4,8% 1,32-15,79% 54,8% 39,95-68,98% Medio 26 11,5% 4,0-28,78% 61,5% 42,53-77,57% Oscuro 30 10,0% 3,46-25,62% 60,0% 42,32-75,41% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% p 0,540LR 0,834C LR Significación estadística según Razón de Verosimilitudes; C Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson En cuanto a la carga parasitaria, los animales de color de pelo medio parecen tener menores valores de parasitemia, sin ser este dato significativo (Tabla 19b). Por tanto en cuanto a este parámetro, no podemos establecer ninguna asociación con la infección. Tabla 19b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificada por el color del pelo Color Pelo qPCR (CT<38) qPCR CT Claro 23 81,9 ± 106,04 35,75 ± 1,58 Medio 16 50,81 ± 39,15 36,12 ± 1,25 Oscuro 18 84,33 ± 81,32 35,36 ± 1,55 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,436 A 0,331 A A Significación estadística según ANOVA 5.3.2. Asociación con las variables extrínsecas Consideramos a estudio las variables extrínsecas relacionadas tanto con la profilaxis realizada (uso de collares o pipetas), el manejo del animal (horario de paseo, estancias en otros lugares) y el tipo de hábitat. La Tabla 20a estudia la relación entre el uso de pipetas (Imidacloprid + Permetrina) y las prevalencias obtenidas. Vemos que se presenta una clara tendencia (con una significación p=0,062), de que los animales a los cuales no se les aplica la pipeta presentan una prevalencia de seroconversión casi cuatro veces mayor con respecto a los que si utilizan.
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 42 Tabla 20a. Prevalencias estratificadas según el uso de pipeta IFI qPCR (CT<38) Pipeta N Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) No 21 19% 7,67-40% 57,1% 36,55-75,53% Si 77 5,2% 2,04-12,68% 58,4% 47,29-68,79% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% p 0,062F 0,915 C F Significación estadística según prueba exacta de Fisher. C Significación estadística según prueba Chicuadrado de Pearson Sin embargo, no se observan diferencias significativas respecto a la carga parasitaria de ambos grupos (Tabla 20b). Cabe comentar respecto a esta variable, que en la encuesta se consideraron animales que usaban pipeta a aquellos que la habían utilizado durante el último periodo de actividad de los vectores. Muchos de los propietarios encuestados, proporcionan a su mascota prevención durante todo el año, pero no podemos asegurar con certeza que todos los propietarios que contestaron afirmativamente a este respecto aplicasen correctamente las pipetas dentro de los intervalos de tiempo aconsejados en función de su efectividad (1 vez al mes) Tabla 20b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificadas según el uso de pipeta Pipeta qPCR (CT<38) qPCR CT No 12 82,41 ± 68,09 35,42 ± 1,52 Si 45 71,68 ± 88,25 35,81 ± 1,48 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,698t 0,421t t Significación estadística según prueba t de Student A diferencia del caso anterior, cuando estimamos las prevalencias en función del uso de collares impregnados con Deltametrina (Tabla 21a), no se observaron variaciones significativas teniendo en cuenta esta variable; sin embargo hay estudios que demuestran la efectividad de estos collares, y su influencia en la disminución de la seroprevalencia (Killick-Kendrick et al, 1997) Consideramos que generalmente el uso de los collares para la prevención de las picaduras no es bueno. La razón principal es que un elevado porcentaje de los propietarios no coloca adecuadamente el collar, pues es frecuente que estos vayan relativamente sueltos y no contacten con la piel. Además la casa comercial estima la duración de la efectividad de dichos collares en 6 meses, por tanto en el caso de propietarios que comprasen su collar en Febrero-Marzo, época en que se finaliza la campaña de diagnóstico, estos collares perderán efectividad en los meses de Agosto- Septiembre, época en que aún sigue activo el flebotomo (Galvez, Descalzo et al, 2010). Un estudio realizado por Manzanillo y cols. (2006) cita que la tasa de protección acumulada estimada teniendo en cuenta los 2 años de su estudio es del 50,8% por lo que aunque estos collares ofrecen cierta protección, realmente no es muy alta.
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 43 Tabla 21a. Prevalencias estratificadas según el uso de collar IFI qPCR (CT<38) Collar N Prev. IC (95%) Prev. IC (95%) No 45 6,7% 2,29-17,86% 64,4% 49,89-76,78% Si 53 9,4% 4,10-20,25% 52,8% 39,66-65,62% Total 98 8,16% 4,19 - 15,29% 58,2% 48,27 - 67,44% p 0,723F 0,306 F F Significación estadística según prueba exacta de Fisher Al igual que en el caso de las prevalencias, las cargas parasitarias mostradas en la Tabla 21b, no difieren entre los animales en función de si usan o no collares. Esto refuerza nuestra hipótesis de que no están siendo efectivos por fallos en la colocación. Tabla 21b. Cargas parasitarias (media ± SD) estratificadas según el uso de collar Collar qPCR (CT<38) qPCR CT No 29 65,69 ± 71,36 35,80 ± 1,50 Si 28 82,48 ± 95,87 35,65 ± 1,49 Total 57 73,94 ± 83,96 35,73 ± 1,48 P 0,455 t 0,702 t t Significación estadística según prueba t de Student Estudiamos los hábitos del animal, para ver qué influencia pueden tener estas variables sobre la parasitación. Se constata que los animales más expuestos durante los horarios de actividad de los vectores (paseos durante la tarde y el anochecer) (Killick-Kendrick 1999) presentan prevalencias por qPCR significativamente mayores (p=0,035 y p=0,036 respectivamente). También observamos mayores prevalencias por IFI aunque estas no muestran una significación estadística (Tabla 22a). Tabla 22a. Prevalencias estratificadas según hora de paseo Horario IFI qPCR (CT<38) Pasea n Prev. p Prev. p Amanecer Sí 60 11,7% 0,146F 55% 0,425C No 38 2,6% 63,2% Mañana Sí 79 8,9% >0,999 F 60,8% 0,288C No 19 5,3% 47,4% Tarde Sí 77 10,4% 0,196F 63,6% 0,035C No 21 0% 38,1% Anochecer Sí 81 9,9% 0,344F 63% 0,036C No 17 0% 35,3% Noche Sí 72 9,7% 0,677F 54,2% 0,182C No 26 3,8% 69,2% Total 98 8,2% 58,2% F Significación estadística según prueba exacta de Fisher. C Significación estadística según prueba Chi-cuadrado de Pearson
Epidemiología de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 50
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 51 7. Bibliografía 1. Acedo-Sanchez C, Martin J, Velez D, Sanchis MC, Louassini M, Maldonado JA, Morillas F. Leishmaniasis Eco-epidemiology in the Alpujarra Region (Granada province, southern Spain) Int J Parasitol. 1996; 26: 303-10. 2. Aoun O, Mary C, Roqueplo C, Marié JL, Terrier O, Levieuge A, Davoust B. Canine Leishmaniosis in south-east of France: Screening of Leishmania infantum antibodies (western botting, ELISA) and parasitaemia levels by PCR quantification. Vet Parasitol, 2009; 166: 27-31. 3. Ashford RW, Snowden KF. Dogs and protozoan zoonoses. En: Macpherson C, Meslin F, Wandeler A (eds). Dogs, zoonozes and public health. Wallingford, UK: Cab international. 2000; 5: 132-40. 4. Baneth G, Shaw S. Chemotherapy of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 2002; 106: 315-324. 5. Canileish European Registration Dossier: study F-136.010000-58060. 6. Castillo Hernández JA, Sánchez Acedo C, Gutiérrez Galindo JF, Lucientes Curdi J, Estrada Peña A, Galmés Femenias M. Estudio epidemiológico de La leishmaniosis canina en la província de Zaragoza. Resúmenes IV. Congreso Nacional de Parasitología. Tenerife, 1985; 31. 7. Cortadellas O, Fernández del Palacio MJ, Talavera J, Bayón A. Glomerular filtration rate in dogs with leishmaniasis and chronic kidney disease. J Vet Intern Med. 2008;22(2):293-300. 8. Cortes S, Vaz Y, Neves R, Maia C, Cardoso L, Campino L. Risk factors for canine leishmaniasis in an endemic Mediterranean region. Vet Parasitol. 2012 (en prensa) 9. Costa CH. How effective is dog culling in controlling zoonotic visceral leishmaniasis? A critical evaluation of the science, politics and ethics behind this public health policy. Rev Soc Bras Med Trop. 2011; 44(2):232-42. 10. Cruz I, Morales MA, Noguer I, Rodríguez A, Alvar J. Leishmania in discarded syringes from intravenous drug users. Lancet. 2002; 30;359(9312):1124-5. 11. Daniel WW. Biostatistics: A foundation for analysis in health sciences (7th edition). Wiley Series in probability and statistics. John Wiley & Sons, Inc. Singapur. 2000; 755 pp. 12. De Freitas E, Melo MN, da Costa-Val AP, Michalick MS. Transmission of Leishmania infantum via blood transfusion in dogs: potential for infection and importance of clinical factors. Vet Parasitol. 2006; 15;137(1-2):159-67. 13. Denerolle P, Bourdoiseau G. Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases). J Vet Intern Med. 1999; 13, 413-5.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 52 14. Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Inmunol Microbiol Infect Dis. 2004; 27: 305-18. 15. Dohoo I, Martin W, Stryhn H. Veterinary epidemiologic research. AVC Inc, Charlottetown, Canada. 2003; 706 pp. 16. Fernandez-Bellon H, Solano-Gallego L, Rodriguez-Cortés A, Ferrer L, Gallego M, Alberola J, Ramis A. Little evidence of seasonal variation of natural infection by Leishmania infantum in dogs in Spain. 2008. Vet Parasitol. 155: 32-6. 17. Ferroglio E, Poggi M, Trisciuoglio A. Evaluation of 65% permethrin spot-on and deltamethrin-impregnated collars for canine Leishmania infantum infection prevention. Zoonoses Pub Health. 2008; 55(3):145-8. 18. Fernández-Pérez F, Gómez-Muñoz M, Méndez S, Alunda J. Leishmania specific lymphoproliferative responses and IgG1/IgG2 immunodetection patterns by Western blot in asymptomatic, symptomatic and treated dogs. Acta Trop. 2003; 86: 83-91. 19. Ferroglio E, Centaro E, Mignone W, Trisciuoglio A. Evaluation of an ELISA rapid device for the serological diagnosis of Leishmania infantum infection in dogs as compared with immunofluorescence assay and western blot. Vet Parasitol. 2007; 144: 162-6. 20. Francino O, Altet L, Sanchez-Robert E, Rodriguez A, Solano-Gallego L, Alberola J, Ferrer L, Sanchez A, Roura X. 2006. Advantages of real-timePCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 2006; 137: 214-21. 21. Gálvez R, Miró G, Descalzo MA, Nieto J, Dado D, Martín O, Cubero E, Molina R. Emerging trends in the seroprevalence of canine leishmaniasis in the Madrid region (central Spain). Vet Parasitol. 2010a; 169:327-34. 22. Gálvez R, Descalzo MA, Miró G, Jimenez MI, Nieto J, Martín O, Dos Santos-Brandao F, Guerrero I, Cubero E, Molina R. Seasonal trends and spartial relations between enviromental/meteorological factors and leishmaniosis sand fly vector abundances in Central Spain. Acta Trop. 2010b; 115: 95-102. 23. Gálvez R, Descalzo MA, Miró G, Jiménez MI, Martín O, Dos Santos-Brandao F, Guerrero I, Cubero R, Molina E. Seasonal trends and spatial relations between environmental/meteorological factors and leishmaniosis sand fly vector abundances in Central Spain. Acta Trop. 2010c; 115 (1-2):95-102 24. Garnham PC. The genus Leishmania. Bull World Health Organ. 1971;44(4):477-89. 25. Gómez-Ochoa P. Estudio de un nuevo tratamiento de la leishmaniosis canina. Valoración del efecto inmunomodulador de la domperidona.Tesis Doctoral, Universidad de Zaragoza, Facultad de Veterinaria 2004. 26. Gradoni L. The diagnosis of canine Leishmaniasis. En: From canine Leishmaniasis; an update. Proceedings of a canine Leishmaniasis. Forum, 2002. 27. Gómez-Ochoa P, Castillo JA, Gascón M, Zarate JJ, Alvarez F, Couto CG. Use of domperidone in the treatment of canine visceral leishmaniasis: a clinical trial. Vet J. 2009; 179(2): 259-63.
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 53 28. Gomez-Ochoa P, Castillo JA, Lucientes J, Gascon M, Zarate JJ, Arbea JI, Larraga V, Rodriguez C. Modified direct agglutination test for simplified serologic diagnosis of leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol. 2003; 10(5): 967-8. 29. Halbig P, Hodjati MH, Mazloumi-Gavgani AS, Mohite H, Davies CR. Further evidence that deltamethrin-impregnated collars protect domestic dogs from sandfly bites. Med Vet Entomol. 2000; 14(2):223-6. 30. Hiepe T, Lucius R, Gottstein B. Capítulo 6. Principios de la biologia de los parásitos. En: Parasitología general con principios de inmunología, diagnostico y lucha antiparasitaria. Ed. Acribia. Zaragoza, 2006a: 115-7. 31. Hiepe T, Lucius R, Gottstein B. Capítulo 8. Aspectos inmunológicos de las infestaciones parasitarias. En: Parasitología general con principios de inmunología, diagnostico y lucha antiparasitaria. Ed. Acribia. Zaragoza, 2006b: 280-5 32. Killick-Kendrick R, Killick-Kendrick M, Focheux C, Dereure J, Puech MP, Cadiergues MC. Protection of dogs from bites of phlebotomine sandflies by deltamethrin collars for control of canine leishmaniasis. Med Vet Entomol. 1997; 11(2):105-11. 33. Killick-Kendrick R. The Biology and Control of Phlebotomine Sand Flies. Clin Dermatol. 1999;17:279-289. 34. Koutinas AF, Saridomichelakis MN, Mylonakis ME, Leontides L, Polizopoulou Z, Billinis C, Argyriadis D, Diakou N, Papadopoulos O. A randomised, blinded, placebo-controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 2001; 98(4):247-61. 35. Lachaud L, Chabbert E, Dubbesay P, Reynes J, Lamothe J, Bastien P. Comparison of various sample preparation methods for PCR diagnosis of visceral leishmaniasis using peripheral blood. J Clin Microbiol. 2001; 613-7. 36. Lamothe J. Some remarks about the LeishVet directions for the treatment of canine leishmaniasis. Vet Parasitol. 2010; 169:416-7. 37. Levine ND, Corliss JO, Cox PEG. A newly revised classification of the protozoa. J Protozool, 1980; 27: 37-58. 38. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser C, Krieger M, Scott M, Zipursky S, Darnell J. Técnicas de genética molecular y genómica. En: Biologia Celular y Molecular.(5ª Edicion) Ed. Panamericana. Nueva York; 2005; cap 9: 351-402. 39. Lucientes L, Palmer J, Guarga JL , Gracia MJ, Peribanez MA, Zarate J, Castillo JA. Risk of transmission of canine leishmaniosis in eastern Spain. Vet Rec. 2005; 156: 743-4. 40. Lucientes J, Benito MI, Castillo JA, Orcajo J. Seasonal dynamics of Larroussius species in Aragon (N.E. Spain). Parassitologia. 1991; 33:381-6. 41. Maia C, Campino L. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet Parasitol. 2008; 158: 274-87. 42. Maia C, Cristóvâo J, Campino L. Diagnosis of canine leishmaniasis: conventional and molecular techniques using different tissues. Vet J. 2009; 179(1): 142-4.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 54 43. Manna L, Gravino AE, Picillo E, Decaro N, Buonavoglia C. Leishmania DNA quantification by real-time PCR in naturally infected dogs treated with miltefosine. Ann N Y Acad Sci. 2008a; 1149:358-60. 44. Manna L, Reale S, Vitale F, Picillo E, Pavone LM, Gravino A. Real-time PCR assay in Leishmania-infected dogs treated with meglumine antimoniate and allopurinol. Vet J. 2008b; 177: 279-82. 45. Manzillo VF, Oliva G, Pagano A, Manna L, Maroli M, Gradoni L. Deltamethrinimpregnated collars for the control of canine leishmaniasis: Evaluation of the protective effect and influence on the clinical outcome of Leishmania infection in kennelled stray dogs. Vet Parasitol. 2006; 142: 142-5. 46. Maroli M, Mizzoni V, Siragusa C, D’Orazi A, Gradoni L. Evidence for an impact on the incidence of canine leishmaniasis by the mass use of deltamethrin-impregnated dog collars in southern Italy. Med Vet Entomol. 2001; 15: 358-363. 47. Martinez V, Quilez J, Sanchez A, Roura X, Francino O, Altet L. Canine Leishmaniasis: the key points for qPCR result interpretation. Parasit Vectors. 2011; 4: 57. 48. Mencke N, Volf P, Volfova V, Stanneck D. Repellent efficacy of a combination containing imidacloprid and permethrin against sand flies (Phlebotomus papatasi) in dogs. Parasitol Res. 2003; 90: Supl 3: 108-11. 49. Michalsky EM, Rocha MF, da Rocha Lima AC, França-Silva JC, Pires MQ, Oliveira FS, Pacheco RS, dos Santos SL, Barata RA, Romanha AJ, Fortes-Dias CL, Dias ES. Infectivity of seropositive dogs, showing different clinical forms of leishmaniasis, to Lutzomyia longipalpis phlebotomine sand flies. Vet Parasitol. 2007; 147(1-2):67-76. 50. Miró G, Checa R, Montoya A, Hernández L, Dado D, Gálvez R. Current situation of Leishmania infantum infection in shelter dogs in northern Spain. Parasit Vectors. 2012; 27(5):60. 51. Miró G, Oliva G, Cruz I, Cañavate C, Mortarino M, Vischer C, Bianciardi P. Multicentric, controlled clinical study to evaluate effectiveness and safety of miltefosine and allopurinol for canine leishmaniosis. Vet Dermatol. 2009; 20(5-6):397-404. 52. Miro G, Cardoso L, Pennisi MG, Oliva G, Baneth G. Canine leishmaniosis - neur concepts and insights on an expanding zoonosis: part two. Trends Parasitol. 2008; 24(8): 371-7. 53. Miró G, Gálvez R, Mateo M, Montoya A, Descalzo MA, Molina R. Evaluation of the efficacy of a topically administered combination of imidacloprid and permethrinagainst Phlebotomus perniciosus in dog. Vet Parasitol. 2007; 143(3-4):375-9. 54. Molina R, Amela C, Nieto J, San-Andrés M, González F, Castillo JA, Lucientes J, Alvar J. Infectivity of dogs naturally infected with Leishmania infantum to colonized Phlebotomus perniciosus. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1994; 88(4):491-3. 55. Morales-Yuste M, Morillas-Marquez F, Diaz-Saez V, Barón-Lopez S, Acedo-Sanchez C, Martin-Sanchez J. Epidemiological implications of the use of various methods for
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 55 diagnosis of canine leishmaniasis in dogs with different characteristics and in differing prevalence scenarios. Parasitol Res. 2012; DOI: 10.1007/s00436-011-2812-7 56. Nicolas L, Prina E, Lang T, Milon G. Real-Time PCR for Detection and Quantitation of Leishmania in Mouse Tissues. J Clin Microbiol. 2002; 40(5): 1666-9. 57. Nicolas L, Sidjanski S, Colle JH, Milon G. Leishmania major Reaches Distant Cutaneous Sites Where It Persists Transiently while Persisting Durably in the Primary Dermal Site and Its Draining Lymph Node: a Study with Laboratory Mice. Infect Immun. 2000; 68(12): 6561-6. 58. Otranto D, de Caprariis D, Lia RP, Tarallo V, Lorusso V, Testini G, Dantas-Torres F, Latrofa S, Diniz PP, Mencke N, Maggi RG, Breitschwerdt E, Capelli G, Stanneck D. Prevention of endemic canine vector-borne diseases using imidacloprid 10% and permethrin 50% in young dogs: a longitudinal field study. Vet Parasitol. 2010; 172(3-4):323-32. 59. Paiva-Cavalcanti M, Edileuza, Vieira de Souza W, De Miranda Gomes M, Abath F. The development of a real-time PCR assay for quantification of Leishmania infantum DNA in canine blood. Vet J. 2009; 182: 356-8. 60. Paiva-Cavalcanti M, Regis-da-Silva CG, Gomes YM. Comparison of real-time PCR and conventional PCR for detection of Leishmania infantum infection: a mini review. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis. 2010. 16(4). 61. Pearson RD, Joeronimo S, Sousa A. Leishmaniasis. En: Gillespie S, Pearson RD (eds) Principles and Practice of Clinical Parasitology. England 2001; pp:287-309. 62. Peres D, Lamounier D, Lopes I, Nery CE, Martins PE. Short report: Heterogeneity of Leishmania infantum chagasi Kinetoplast DNA in Teresina (Brazil). Am J Trop Hyg. 2010; 82(5): 819-821. 63. Peris A. Estudio seroepidemiologico de la dinámica de infección de Leishmania infantum en poblaciones caninas del valle medio del Ebro. Tesis Doctoral, Universidad de Zaragoza, Facultad de Veterinaria 2010. 64. Ready P. Leishmaniasis emergence in Europe. Eurosurveill. 2010; 15(10):pii=19505 65. Reithinger R, Quinnell R, Alexander B, Davies C. Rapid Detection of Leishmania infantum Infection in Dogs: Comparative Study Using an Immunochromatographic Dipstick Test, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, and PCR. J Clin Microbiol. 2002; 40(7): 2352-6. 66. Rodriguez-Cortes A, Ojeda A, Francino O, Lopez-Fuertes L, Timón M, Alberola J. Leishmania infection: Laboratory Diagnosing in the Absence of a “Gold Standard” Am J Trop Hyg. 2010; 82(2): 251-6. 67. Ross R. Note on the bodies recently described by Leishman and Donovan. Brit Med J, 1903; 2: 1261-2. 68. Sanmartin Durán ML. Avances en Parasitología. Protozoología. USC (Ed) Universidad Santiago de Compostela, 1992.
Situación epidemiológica de la Leishmaniosis en perros asintomáticos en zona endémica 56 69. Silva F, Oliveira R, Silva T, Xavier M, Nascimento E, Santos R. Venereal transmission of canine visceral leishmaniasis. Vet Parasitol. 2009; 160: 55-9. 70. Schoone GJ, Hailu A, Kroon CC, Nieuwenhuys JL, Schallig HD, Oskam L. A fast agglutination screening test (FAST) for the detection of anti-Leishmania antibodies. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2001; 95(4):400-1. 71. Solano-Gallego L, Morell P, Arboix M, Alberola J, Ferrer L. Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an área of canine leishmaniasis endemicity using PCR on several tissues and serology. J Clin Microbiol.2001; 39: 560-3. 72. Solano-Gallego L, Rodriguez-Cortés A, Trotta M, Zampieron C, Razia L, Furlanello T, Caldin M, Roura X, Alberola J. Detection of Leishmania infantum DNA by fret-based real-time PCR in urine from dogs with natural clinical leishmniosis. Vet Parasitol. 2007. 147: 315-9. 73. Solano-Gallego L, Koutinas A, Miro G, Cardoso L, Pennisi MG, Ferrer L, Bourdeau P, Oliva G, Baneths G. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatement and prevention of canine leishmaniosis. Vet Parasitol. 2009; 165: 1-18. 74. Solano-Gallego L, Miro G, Koutinas A, Cardoso L, Pennisi MG, Ferrer L, Bourdeau P, Oliva G, Baneths G. LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Paras Vectors. 2011; 4: 86. 75. Sousa S, Lopes AP, Cardoso L, Silvestre R, Schallig H, Reed SG, Cordeiro da Silva A. Seroepidemiological survey of Leishmania infantum infection in dogs from northeastern Portugal. Acta Trop. 2011; 120(1-2):82-7 76. Tabar MD, Francino O, Altet L, Sánchez A, Ferrer L, Roura X. PCR survey of vectorborne pathogens in dogs living in and around Barcelona, an area endemic for leishmaniosis. Vet Record. 2009; 164: 112-6. 77. Thrusfield M. Veterinary Epidemiology (3rd edition). Blackwell Science, Oxford, UK. 2007; 610 pp. 78. Tizard I. Inmunologia Veterinaria. (6ª Edición). Mc Graw- Hills, Philadelphia, USA, 2000; 28:207-26. 79. Torres M, Bardagí M, Roura X, Zanna G, Ravera I, Ferrer L. Long term follow-up of dogs diagnosed with leishmaniosis (clinical stage II) and treated with meglumine antimoniate and allopurinol. Vet J. 2011; 188: 346-51. 80. Vandesompele J. qPCR guide. Eurgentec. 2009; 62 pp. 81. Vasquez L. Terapeutica antileishmania: revisando el pasado, el presente y el futuro. Gac Med Caracas. 2009;117(2): 93-111. 82. WHO. Control of leishmaniases. Report of a meeting of the WHO Expert Comitee on the Control of Leishmaniases, 22-26 Marzo 2010. WHO Technical Report Series nº 949. Geneva. 2010; 1-186. 83. Wilson EB. Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical Inference. J the Am Stat Assoc, 1927; 22(158): 209-12.
Trabajo de Fin de Máster – 2012 – Patricia Sebastián Marcos 57 84. Winker P, Ravel C, Blaineau C, Pages M, Jauffret Y, Dedet JP, Bastien P. The Leishmania genome comprises 36 chromosomes conserved across widely divergent human pathogenic species. Nucl Acids Res. 1996; 24 (9): 1688-94. 85. Zarlenga D, Higgins J. PCR as a diagnostic and quantitative technique in veterinary parasitology. Vet Parasitol. 2001; 101: 215-30.
SituaciónepidemiológicadelaLeishmaniosisenperrosasintomáticosenzonaendémica 58
TrabajodeFindeMáster–2012–PatriciaSebastiánMarcos59 Anexo1 Encuestaepidemiológicaensoportepapel