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Caracterizaci´on de las propiedades contr´actiles a fatiga del m´usculo esquel´etico. Metodolog´ıa experimental y de simulaci´on. Marta Sierra Arregui Memoria Proyecto Fin de M´aster Directora: MaJes´us Mu˜noz Gonzalvo M´aster de Iniciaci´on a la Investigaci´on en Ciencias Veterinarias Curso 2011-2012 Agradecimientos A MaJes´us, por permitirme trabajar en un proyecto tan interesante y haberme abierto la puerta a tantas oportunidades. A Jorge, por su paciencia en la ense˜nanza de nuevos conocimientos y su inestimable ayuda en la elaboraci´on de este trabajo. A Javier y Fernando por su imprescindible colaboraci´on para sacar adelante este trabajo. A Carlos y Aitor por su predisposici´on y buen hacer en las tareas de laboratorio. Y por ´ultimo, a todos los animales que han hecho posible este proyecto. ´ Indice general ´ IndicedeFiguras................................ 2 ´ IndicedeTablas................................. 4 1. Resumen.................................. 6 2. Introducci´on................................ 7 2.1. Antecedentes ........................... 7 2.2. Objetivos ............................. 9 3. Revisi´on bibliogr´afica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.1. El m´usculo esquel´etico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 3.2. Modelos computacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4. Material y M´etodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.1. Dispositivo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.2. Modelos de simulaci´on computacional . . . . . . . . . . . . . . 30 5. Resultados................................. 36 6. Discusi´on ................................. 40 7. Conclusiones................................ 42 Bibliograf´ıa ................................... 42 2 ´ Indice de figuras 1. Esquema de la fibra muscular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2. Esquema de la fibra muscular (Victor L. Katch, 2006) . . . . . . . . . 11 3. Esquema del interior de la fibra muscular. . . . . . . . . . . . . . . . 12 4. Esquema del sarcomero (Jos´e L´opez Chicharro, 2006) . . . . . . . . . 12 5. Mol´ecula de la miosina (Copyright c 2007 Pearson Education, Inc, publishing as Benjamin Cummings.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 6. Mol´ecula de la actina, con las prote´ınas Troponina y Tropomiosina asociadas (Copyright c 2007 Pearson Education, Inc, publishing as Benjamin Cummings.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 7. Esquema de la contracci´on (Copyright c 2007 Pearson Education, Inc, publishing as Benjamin Cummings.) . . . . . . . . . . . . . . . . 15 8. Tipos de acci´on muscular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 9. Relaci´on longitud-tensi´on. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 10. Imagen que ilustra la diferencia entre los distintos tipos de fibras, tanto a nivel de fuerza como de tiempo de mantenimiento de la misma. 21 11. Imagen histol´ogica que diferencia entre las fibras lentas (tipo I) y las fibras r´apidas (tipo II). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 12. Disecci´on del m´usculo TA paso a paso . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 13. Posici´on del m´usculo EDL, TA y S´oleo en la m´aquina de ensayos. . . 28 14. M´aquina Instron. Tomada y modificada de Instron Corporation 2000 29 15. Generador de se˜nal el´ectrica CIBERTEC CS-20 . . . . . . . . . . . . 29 16. Representaci´on de la funci´on ftren para cuatro valores de la frecuencia de est´ımulo (90, 60, 30 y 10 Hz). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3 4 17. Evoluci´on de la fuerza isom´etrica en el tiempo para: (a) M´usculo TA. (b) M´usculo EDL. (c) M´usculo S´oleo. (d) Tasa de fatigabilidad para los tres m´usculos, expresada en N/s. .................. 36 18. Curvas de ajuste siguiendo el modelo unidimensional propuesto por Ram´ırez et al.. (2010): (a) M´usculo TA. (b) M´usculo EDL. (c) M´usculoS´oleo. .................................. 38 ´ Indice de cuadros 1. Tabla de enzimas en relaci´on al tipo de fibras (Victor L. Katch, 2006). 21 2. Caracter´ısticas de los tipos de fibra muscular (Victor L. Katch, 2006). 23 3. Tiempo empleado por los diferentes m´usculos para alcanzar la fuerza m´axima y porcentaje de reducci´on de esa fuerza al finalizar el est´ımulo. 37 4. Datos de ajuste utilizando el modelo propuesto por Ram´ırez et al.. (2010) ................................... 39 5 6 1. Resumen El objetivo principal de este trabajo es la caracterizaci´on de las propiedades contr´actiles de tres m´usculos diferentes de rata (Tibialis Anterior, Extensor Digitorium Longus y S´oleo) sometidos a contracciones isom´etricas m´aximas sostenidas hasta que llegan a fatiga. Este estudio pretende obtener los par´ametros necesarios para el desarrollo de un modelo computacional de simulaci´on. Los experimentos se han realizado “in vivo” en tres grupos (n= 5) de ratas Wistar macho (313±81,14g) utilizando un protocolo dise˜nado expresamente para estas experiencias. Los m´usculos han sido sometidos a est´ımulos el´ectricos con el objetivo de alcanzar la contracci´on tet´anica durante diez segundos. La metodolog´ıa propuesta permite obtener las propiedades del m´usculo esquel´etico en fatiga y relacionarlas con los diferentes tipos de fibras presentes en los m´usculos y los cambios en la geometr´ıa producidos durante la contracci´on. Adem´as, se ha procedido a ajustar un modelo matem´atico desarrollado previamente con los nuevos datos experimentales recogidos para desarrollar futuros modelos computacionales basados en el m´etodo de elemetos finitos. Estos datos tambi´en han permitido verificar el buen planteamiento de dicho modelo. 7 2. Introducci´on 2.1. Antecedentes El trabajo que se presenta ha sido realizado dentro de una l´ınea de investigaci´on multidisciplinar que tiene como objetivo el modelado del tejido m´usculo-esquel´etico. Los modelos matem´aticos se han utilizado de manera creciente en la investigaci´on y simulaci´on de sistemas biol´ogicos, especialmente en procesos de rehabilitaci´on, procedimientos de cirug´ıas reconstructivas, estudios en biomec´anica del deporte, etc. Los modelos computacionales que incorporan formulaciones matem´aticas del comportamiento mec´anico de los tejidos est´an siendo utilizados actualmente de manera general y son objeto de continuo estudio y desarrollo. El m´etodo de Elementos Finitos es la herramienta m´as utilizada para simular el comportamiento mec´anico de tejidos vivos. Los modelos desarrollados con esta t´ecnica incorporan diferentes niveles de sofisticaci´on y pueden ser utilizados para entender, por ejemplo, los fen´omenos asociados con el comportamiento muscular a niveles microsc´opicos. Adem´as, los modelos computacionales pueden ser una herramienta efectiva en el estudio del comportamiento biomec´anico de las articulaciones y muchos otros sistemas biol´ogicos (Majors and Wayne, 2011). La precisi´on de estos modelos de simulaci´on est´a directamente relacionada con los par´ametros que caracterizan el comportamiento mec´anico de los tejidos reales. En el caso del m´usculo esquel´etico que causa el movimiento de las articulaciones, son necesarias tanto las propiedades pasivas como activas del m´usculo. Tanto el comportamiento pasivo de las estructuras el´asticas del m´usculo como su comportamiento activo generado por su actividad contr´actil han sido los primeros que se han caracterizado a partir del animal “in vivo” por el grupo de investigaci´on, con el fin de desarrollar un modelo matem´atico b´asico que describa el comportamiento del m´usculo. 8 Este modelo se ha obtenido a partir de datos experimentales, sometiendo al m´usculo Tibial Anterior (TA) de rata a contracciones de muy corta duraci´on (1ms). Es bien sabido que si estas contracciones se mantienen en el tiempo, la capacidad de contracci´on del m´usculo disminuye y esto se ve influenciado por el diferente comportamiento de los diferentes tipos de fibras musculares. 15 sitio activo de la actina, situ´andose a 90ocon respecto a los filamentos. Cuando el Pi se libera, la cabeza de la miosina rota y desplaza al filamentod de actina, por ´ultimo se libera el ADP y la miosina vuelve al estado inicial, a 45ocon respecto a los filamentos (Figura 7) Figura 7: Esquema de la contracci´on (Copyright c 2007 Pearson Education, Inc, publishing as Benjamin Cummings.) La fuerza muscular, desde un punto de vista mec´anico, ser´ıa la capacidad de la musculatura para deformar un cuerpo o modificar su aceleraci´on. El m´usculo esquel´etico est´a dise˜nado para producir fuerza. Y esta fuerza se entiende como la capacidad que tiene el m´usculo para producir tensi´on cuando se activa. Tanto si esta tensi´on es generada por la oposici´on de una resistencia externa como si se produce por la tensi´on simult´anea de los m´usculos agonistas y antagonistas, esta tensi´on produce una deformaci´on en el m´usculo. La magnitud de la deformaci´on es un indicador del estr´es producido por las fuerzas que originan dicha deformaci´on. En este caso, la fuerzas de tensi´on son las que tiran internamente de las estructuras sometidas a la tensi´on Por lo tanto, la tensi´on del m´usculo se puede definir como el grado de estr´es mec´anico producido por el eje longitudinal del m´usculo cuando las fuerzas internas 16 tienden a estirar o separar las mol´eculas que constituyen las estructuras musculares y tendinosas (Gonz´alez-Badillo JJ., 2002). Se denomina unidad motora al conjunto de neurona motora y las fibras que inerva. De acuerdo a la cantidad de fuerza que se solicita al m´usculo, se recluta una cantidad mayor o menor de fibras musculares. Henneman (1957) describi´o el proceso de reclutamiento seg´un el principio de tama˜no: a medida que se solicita mayor fuerza, se van uniendo las unidades motoras de menor tama˜no y las m´as grandes se unen cuando se requieren mayores niveles de fuerza. Como se explica m´as adelante, las fibras lentas son las de menor tama˜no y ser´ıan las primeras en ser reclutadas, seguidas de las r´apidas. Este proceso se denomina sumaci´on espacial. El impulso nervioso genera una ´unica contracci´on siempre y cuando su amplitud sobrepase el umbral. En este caso se cumple la ley del todo o nada, todas las fibras de la unidad motora que se estimula por encima de su umbral se contraen al m´aximo de intensidad. En el m´usculo, lo normal es que haya una mayor cantidad de UM con umbrales de reclutamiento bajos y una poca cantidad con umbrales altos (Fuglevand et al.., 1993). La segunda estrategia para aumentar la fuerza requerida es la sumaci´on temporal de respuestas. Un ´unico est´ımulo provoca una respuesta de sacudida (“twitch”) y est´ımulos repetidos causan un aumento de la fuerza. Cuando la fibra muscular se estimula con m´as de un pulso de manera repetitiva, ´este responde con contracciones repetidas. En el caso de que el m´usculo no pueda relajarse entre un est´ımulo u otro, har´a que sume la respuesta actual a la anterior, aumentando la fuerza. Con la repetici´on de est´ımulos, el mecanismo de contracci´on se produce sin que haya relajaci´on alguna, en este caso, hay un m´aximo de Ca2+ en el citosol y un m´aximo n´umero de puentes cruzados entre la miosina y la actina, esta situaci´on se conoce como t´etanos o contracci´on tet´anica (Jos´e L´opez Chicharro, 2006). 17 Tipos de acci´on muscular La tensi´on se produce durante la activaci´on o contracci´on del m´usculo que tiene lugar cuando llega al m´usculo un impulso nervioso, se libera energ´ıa y se produce el solapamiento de los filamentos de actina y miosina, acortando el sarc´omero. Esta activaci´on siempre tiende a provocar acortamiento pero, en funci´on de la voluntad del sujeto o la relaci´on que se establezca con las resistencias externas, podemos encontrar tres tipos de acciones (Figura 8): - Acortamiento o acci´on din´amica conc´entrica: superaci´on de la resistencia externa, la fuerza ejercida es capaz de mover la carga. - Alargamiento o acci´on din´amica exc´entrica: cesi´on ante la resistencia externa, la carga es mayor que la fuerza ejercida. - Mantenimiento de la longitud o acci´on isom´etrica: la fuerza muscular es equivalente a la carga externa. En este estudio, se han realizado barridos para encontrar la longitud ´optima del m´usculo en cada experiencia para obtener la m´axima fuerza posible Figura 8: Tipos de acci´on muscular. La fuerza que puede llegar a ejercer el m´usculo depende de muchos factores, a continuaci´on se explica su interacci´on con dos de los m´as importantes: la longitud y la velocidad. 18 Relaci´on longitud-tensi´on El mecanismo intr´ınseco para la generaci´on de fuerza es el deslizamiento de los filamentos ligeros sobre los filamentos pesados, lo que permite el acercamiento de las l´ıneas Z. La energ´ıa necesaria para este proceso se obtiene de la hidr´olisis del ATP por la ATPasa de la cabeza de la miosina que se produce de manera c´ıclica en un proceso denominado ciclo de los puentes cruzados, que se ha explicado anteriormente. De acuerdo con esto, el grado de fuerza ejercida por el m´usculo, depende del n´umero de puentes cruzados activos en un momento dado (a mayor fuerza, m´as puentes cruzados). Si la longitud del sarc´omero se modifica, tambi´en cambia el solapamiento de actina y miosina provocando cambios en el n´umero de sitios activos de los filamentos de actina que pueden entrar en contacto con la miosina. Estos cambios en el n´umero potencial de puentes cruzados, provocan que la tensi´on ejercida por el m´usculo est´e influenciada por la longitud del sarc´omero (Huxley, 1966; Enoka, 2002; Gonz´alez-Badillo JJ., 2002). Por lo tanto , hay una longitud ´optima en la que el m´usculo ejerce la fuerza m´axima (Figura 9). Figura 9: Relaci´on longitud-tensi´on. Relaci´on fuerza-velocidad La capacidad para desarrollar fuerza depende tambi´en de la velocidad de acci´on del m´usculo. La velocidad con la que se acorta un m´usculo va a depender de la carga que tiene que mover. A mayor carga, la tensi´on que hay que hacer es mayor y, como 19 es l´ogico, la velocidad a la que se acorte el m´usculo ser´a menor. Durante las acciones conc´entricas, el desarrollo de la fuerza m´axima decrece progresivamente a velocidades m´as altas (cuando levantamos un objeto muy pesado, lo hacemos lentamente, maximizando la fuerza que vamos a realizar). Sin embargo, las acciones exc´entricas r´apidas permiten la aplicaci´on m´axima de la fuerza (Jos´e L´opez Chicharro, 2006) Tipos de fibras musculares Existen diferentes tipos de fibras musculares seg´un sus caracter´ısticas morfol´ogicas y funcionales. El tipo de fibras predominante en un m´usculo influye, como es l´ogico, en su fuerza de contracci´on, su velocidad m´axima y su resistencia a la fatiga (Bodine et al.., 1987; Bottinelli et al.., 1991; Lutz and Lieber, 2002). Los diferentes tipos de fibras se encuentran en diferente proporci´on en cada m´usculo atendiendo a la funci´on que ´este ha de realizar. Las fibras musculares se han clasificado a lo largo del tiempo en funci´on de su velocidad contr´actil, la expresi´on de la cadena pesada de la miosina y su capacidad metab´olica. A nivel morfol´ogico, como se ha comentado antes, la mol´ecula de miosina est´a compuesta por seis cadenas polipept´ıdicas, dos cadenas pesadas que se enrollan entre s´ı en espiral y cuatro cadenas ligeras. Las diferentes isoformas de las cadenas pesadas son las que determinan la diferencia de las fibras a nivel morfol´ogico, lo que revierte en una diferencia funcional a nivel de la velocidad de actuaci´on de la ATPasa de la cabeza de la miosina. En general, se considera que en los m´usculos de los mam´ıferos adultos pueden estar presentes, agrupadas en grandes grupos, cuatro isoformas de la cadena pesada de la miosina; un isoforma lenta (MHCI) y tres isoformas r´apidas (MHCIIa, MHCIIx, MHCIIb). La nomenclatura cl´asica, propuesta por Brooke y Kaiser en 1970, est´a basada en la tinci´on histoqu´ımica de la ATPasa de la cabeza de la miosina, clasificando a las fibras en lentas (tipo I) y r´apidas (tipo II), con subtipos: IIa, IId, IIb) en base a patrones de tinci´on histol´ogica. Bas´andose en la evidencia inmunohistoqu´ımica, se 20 ha visto que hay una alta relaci´on entre la clasificaci´on histol´ogica en tipos I, IIA y IIB y la expresi´on de las diferentes isoformas de la cadena pesada de la miosina (Schiaffino et al.., 1989; Termin et al.., 1989a; Rivero et al.., 1998). Actualmente, los m´etodos utilizados en la diferenciaci´on de fibras son la histoqu´ımica, la inmunolog´ıa y la electroforesis. Hoy en d´ıa, tambi´en se considera la existencia de fibras h´ıbridas, que expresan m´as de una isoforma de la cadena pesada de la miosina y se ha comprobado experimentalmente que existe la posibilidad de que se produzcan transiciones fibrilares en funci´on de las necesidades mec´anicas a las que est´a sometido el m´usculo (Termin et al.., 1989b; Pette and Staron, 2000). Los distintos tipos y subtipos de fibras, adem´as de diferenciarse en el plano morfol´ogico y en la velocidad de contracci´on, presentan diferencias en el tama˜no (de m´as peque˜na a m´as grande: I<IIA<IIX<IIB) y tambi´en se observan diferencias en la capacidad metab´olica, capacidad de almacenamiento de calcio, etc. A nivel metab´olico, en numerosos trabajos se ha estudiado, en especial, la actividad ATPasa de la cabeza de la miosina pero tambi´en la actividad de la Succina- to Deshidrogenasa, la Lactato Deshidrogenasa, la Citrato sintasa, la Glicerofosfato deshidrogenasa, etc. (Schiaffino et al.., 1970; Pullen, 1977; Delp and Duan, 1996; Rivero et al.., 1998; Tasi´c et al.., 2011), todas ellas relacionadas con los diferentes tipos de metabolismo predominantes en las diferentes fibras (anaer´obio, aerobio, etc.) (Tabla 1). Las fibras r´apidas, o de tipo II, est´an inervadas por motoneuronas capaces de transmitir a altas frecuencias y a gran velocidad. Como resultado, estas fibras son capaces de contraerse r´apidamente pero pueden mantener la tensi´on poco tiempo (Bottinelli et al.., 1991) (Figura 10). Esta mayor velocidad de acci´on podr´ıa explicarse porque estas fibras r´apidas tienen un ret´ıculo sarcopl´asmico m´as desarrollado que las fibras lentas, siendo m´as propenso a la liberaci´on del calcio cuando se estimula estas fibras. Dentro de este grupo, se encuentran tres subgrupos que se diferencian entre s´ı en la isoforma de la miosina que presentan y, por lo tanto, en su velocidad 21 Tipos de fibras humanas por ensayo histoqu´ımico Tipo de fibra Actividad ATPasa (r´apida o lenta) Actividad SDH Actividad α-GPD Fibras r´apidas glicol´ıticas alta baja alta Fibras r´apidas oxidativas glicol´ıticas alta alta alta Fibras lentas oxidativas baja alta baja Tabla 1: Tabla de enzimas en relaci´on al tipo de fibras (Victor L. Katch, 2006). de contracci´on. En general, las fibras IIB ser´ıan las m´as r´apidas, las IIA ser´ıan las m´as lentas dentro de las r´apidas y las IID presentar´ıan una actividad intermedia. Estos tipos de fibras se corresponden con las isoformas de la cadena pesada de la miosina: MHCIIB, MHCIIA y MHCIID, respectivamente. Numerosos trabajos han confirmado que las fibras r´apidas (tipo II) presentan una actividad ATPasa de alta velocidad, mayor en las fibras IIB, intermedio en las fibras IID y el m´as lento en las fibras IIA (Rivero et al.., 1998). Figura 10: Imagen que ilustra la diferencia entre los distintos tipos de fibras, tanto a nivel de fuerza como de tiempo de mantenimiento de la misma. La actividad de estas fibras r´apidas se basa en sistemas glicol´ıticos, lo que explica que los m´usculos con predominancia de fibras r´apidas sean aquellos que requieren una respuesta r´apida con un nivel alto de fuerza, utilizando un metabolismo anaerobio. Dentro de los subtipos de fibras r´apidas, las de tipo IIB son las que presentan una mayor capacidad glucol´ıtica anaerobia y menor oxidativa mientras que las IIA, presentan mayor capacidad oxidativa que glucol´ıtica anaerobia. La capacidad de las 22 fibras tipo IID se encontrar´ıa entre las IIA y las IIB. Otra nomenclatura, relacionada con el tipo de metabolismo, denomina fibras glucol´ıticas oxidativas r´apidas o FOG las de tipo IIA y fibras glucol´ıticas r´apidas o FG a las de tipo IIB (Tabla 2). Las fibras lentas (de tipo I) est´an inervadas por motoneuronas que transmiten a frecuencias y velocidades m´as bajas, pueden mantener una tensi´on menor durante m´as tiempo (Figura 10). Presentan una actividad de ATPasa que es la de menor velocidad m´axima (son las que m´as despacio hidrolizan el ATP para contraerse) y est´an adaptadas para la obtenci´on de energ´ıa aerobia gracias a la actividad de enzimas oxidativas. Esta necesidad de ox´ıgeno, se les aporta por medio de numerosos capilares, que son los que dan el tono rojizo a los m´usculos con predominancia de este tipo de fibras (Figura 11). Estas fibras se han llamado SO, por su lenta velocidad de contracci´on y su metabolismo oxidativo (Tabla 2). Figura 11: Imagen histol´ogica que diferencia entre las fibras lentas (tipo I) y las fibras r´apidas (tipo II). Por lo tanto, a nivel metab´olico, en el citoplasma de las c´elulas musculares que forman las fibras r´apidas encontramos una mayor concentraci´on de enzimas glucol´ıticas anaer´obicas (Ej. Lactato Deshidrogenasa), mientras que en las fibras lentas encontramos un mayor n´umero de enzimas oxidativas (Ej. Succinato Deshidrogenasa, Citrato Sintasa). Tambi´en se han estudiado las diferencias de inervaci´on en los diferentes tipos de 23 Fibras lentas oxidativas Fibras r´apidas oxidativas glicol´ıticas Fibras r´apidas glicol´ıticas Velocidad para alcanzar la m´axima tensi´on lenta intermedia r´apida Actividad miosina ATPasa lenta r´apida r´apida Di´ametro peque˜no medio grande Duraci´on de la contracci´on larga corta corta Actividad de la Ca2+- ATPasa en el RS moderada alta alta Resistencia resistente a la fatiga resistente a la fatiga f´acilmente fatigable Uso oxidativa, aer´obica glicol´ıtica con incremento del comportamiento oxidativo con el entrenamiento glicol´ıtica m´as anaer´obica Tabla 2: Caracter´ısticas de los tipos de fibra muscular (Victor L. Katch, 2006). fibras. Se ha visto que una neurona motora puede inervar de 10 a 180 fibras lentas o de 300 a 800 fibras r´apidas, as´ı pues, la diferencia en el desarrollo de la fuerza en las unidades motoras no depende de cada fibra si no en el n´umero de ellas que se activa a partir de una ´unica neurona. En este trabajo, y con el objetivo de estudiar la influencia del tipo de fibra en el comportamiento mec´anico de los m´usculos, se ha trabajado con el m´usculo Tibial Anterior (TA), el m´usculo Extensor Largo de los dedos (EDL) y el m´usculo S´oleo. Numerosos autores (Eng et al.., 2008; Ariano et al.., 1973; Schiaffino et al.., 1970; Pullen, 1977) han estudiado estos m´usculos para determinar su composici´on de fibras. Los trabajos difieren en funci´on del m´etodo utilizado para su determinaci´on, en un comienzo fue la histolog´ıa, la tinci´on histoqu´ımica de la ATPasa y a lo largo de los a˜nos se ha llegado hasta la inmunofluorescencia (Bloemberg and Quadrilatero, 2012), lo que ha permitido acercarse m´as a la composici´on exacta. 24 En un principio, se consider´o que el m´usculo EDL s´olo ten´ıa fibras r´apidas, algo que se ha ido modificando a lo largo de los a˜nos y, actualmente, se considera que el EDL es un m´usculo que presenta una proporci´on de fibras mixta (tipo IIA, IIB e incluso I). El S´oleo, que es un m´usculo anti gravitatorio, siempre se ha considerado un m´usculo con predominancia de fibras lentas, igual que otros m´usculos que tambi´en ejercen este tipo de funci´on. El TA se clasifica como m´usculo r´apido, con una proporci´on alta de fibras r´apidas. En estos m´usculos se buscan los valores de fuerza durante la contracci´on isom´etrica y para ello, como se ha comentado anteriormente, es necesario encontrar la longitud ´optima en reposo de cada m´usculo antes de comenzar con los ensayos. 3.2. Modelos computacionales La mayor´ıa de los modelos matem´aticos propuestos para la simulaci´on del comportamiento mec´anico del m´usculo esquel´etico se basan en los modelos matem´aticos desarrollados por Hill (Blemker et al.., 2005; Johansson et al.., 2000) y algunos en los modelos de Huxley (Gielen et al.., 2000; Oomens et al.., 2003). En el primer caso, el modelo se basa en el fen´omeno de la contracci´on en un m´usculo completo, deducido por una relaci´on termodin´amica que se deriva de las mediciones de fuerzavelocidad del m´usculo. En el segundo caso, el modelo representa la fuerza causada por el deslizamiento de la actina sobre la miosina y a la propiedad de acoplamien- to entre ellas. Es decir, el modelo de Hill ser´ıa un modelo macrosc´opico, en el que se tienen en cuenta las propiedades biomec´anicas del m´usculo con par´ametros que pueden medirse a nivel macrosc´opico mientras que el modelo de Huxley se centra en la composici´on microsc´opica del m´usculo. Se han planteado modelos matem´aticos con diferente grado de complejidad de acuerdo al objetivo del estudio que se quiera realizar. Si el inter´es de la investigaci´on radica en conocer el efecto de los m´usculos sobre el sistema esquel´etico para producir movimientos articulares, ser´a suficiente el uso de modelos fenomenol´ogicos unidimensionales (Delp et al.., 1990). Sin embargo, si el objetivo est´a relacionado con 31 FM´usculo =Fpasiva +Factiva (1) La fuerza pasiva Fpasiva es la fuerza con la que se opone el m´usculo a un estiramiento o compresi´on sin est´ımulo. La respuesta pasiva del tejido suele formularse a trav´es de relaciones de comportamiento en grandes deformaciones bajo los denominados modelos de comportamiento hiperel´asticos (B¨ol and Reese, 2008; Calvo et al.., 2010) La fuerza activa Factiva ejercida por el m´usculo, puede expresarse como una serie de relaciones que escalan en mayor o menor medida, la denominada fuerza isom´etrica m´axima. El n´umero de estas relaciones puede incrementarse con la complejidad del modelo, por ejemplo, teniendo en cuenta par´ametros de tipo qu´ımico adem´as de los fundamentalmente mec´anicas (i. e. nivel de gl´ucogeno y ATP en el m´usculo). En trabajos futuros, se pretende introducir en los modelos la relaci´on existente entre los niveles de reservas energ´eticas y la fuerza ejercida por el m´usculo. El modelo aqu´ı propuesto para la fuerza activa se expresa como el producto entre la fuerza isom´etrica m´axima y una serie de factores adimensionales tomando valores entre cero y uno. Estos factores se obtienen de la relaci´on fuerza-longitud y otros englobados dentro de la dependencia entre la fuerza y la se˜nal de activaci´on. Mientras esta fuerza se observa experimentalmente a nivel macrosc´opico, con el modelo propuesto, se introducen fen´omenos que tienen su origen a nivel microsc´opico (nivel de solapamiento de los filamentos de actina y miosina). De esta forma, la fuerza activa puede expresarse como: Factiva =F0fλfα(2) La funci´on fαque define la relaci´on entre le fuerza y la se˜nal de activaci´on, describe el acoplamiento excitaci´on-contracci´on y depende de las propiedades de la se˜nal el´ectrica, como el voltaje, la frecuencia y la respuesta caracter´ıstica intr´ınseca de las fibras. Se considera pues una relaci´on multiplicativa para esta funci´on resultando: 32 Factiva =F0fλfVft(3) Las expresiones que definen estas funciones se muestran a continuaci´on. Relaci´on fuerza-longitud Se sabe que el m´usculo ejerce su m´axima fuerza cuando se encuentra en una longitud denominada ´optima. Se han propuesto numerosas relaciones para recoger este efecto entre el estiramiento presente en el m´usculo y la fuerza. Por ejemplo, Blemker et al.. (2005) describen la relaci´on fuerza-longitud como una definida a tramos. B¨ol and Reese (2008) proponen una funci´on suave, utilizando una constante adimensional, denominada alargamiento (λ), que se define como el cociente entre las longitudes final (estirado/comprimido) e inicial (m´usculo en reposo). El alargamiento ´optimo del m´usculo, en el que ´este desarrolla su fuerza m´axima se representa como λopt. La relaci´on que utiliza el modelo matem´atico adoptado en este trabajo, es la propuesta por Ram´ırez et al.. (2010) que hace uso de una funci´on sigmoidal que presenta una mejor adaptaci´on a los resultados experimentales: fλ=e−(λ−λopt)2 2(1−β)2(4) Puesto que los ensayos experimentales han sido llevados a cabo bajo contracciones isom´etricas a la longitud en la que ejerce la m´axima fuerza, se tiene que λ=λopt con lo que fλ= 1. Relaci´on fuerza-voltaje El reclutamiento de las fibras se realiz´o con una se˜nal el´ectria aplicada en el nervio, descrita en el apartado experimental. Incrementando la amplitud de esta se˜nal (voltaje) se consigue un mayor reclutamiento de las fibras hasta conseguir la activaci´on de todo el m´usculo. Este efecto puede recogerse utilizando la siguiente relaci´on para amplitudes de la se˜nal mayores de 2 V: 33 fV= 1 −e(a−V)/d V≥2 (5) Donde aes el punto de corte con el eje de ordenadas y dcontrola la curvatura. Los par´ametros que ajustan los datos experimentales, son a= 1,609 y d= 1,4737. Como se ha comentado, los m´usculos en los ensayos se estimulan para que realicen su fuerza isom´etrica m´axima, con lo cual, el voltaje de la se˜nal utilizado es aquel que maximiza esta relaci´on. Este voltaje se ha tomado como V= 8 Vque resulta en fV= 1. Relaci´on fuerza-tiempo Si el est´ımulo es un ´unico pulso, la unidad motora responde con una contracci´on caracterizada por s´olo dos par´ametros: la amplitud de la contracci´on (P) y el tiempo de contracci´on (Tc) (Fuglevand et al.., 1993). Al considerar todo el m´usculo bajo el est´ımulo de un ´unico pulso, se define un tiempo de contracci´on aparente T′ cque representa el tiempo que se tarda en llegar a la fuerza m´axima. Esta suposici´on implica que el tiempo medio de contracci´on de todas las unidades motoras, es el mismo. La amplitud aparente de la fuerza P′se define como el pico de fuerza alcanzado en T′ c, suponiendo una contracci´on isom´etrica ideal. La funci´on fpulso que representa esta contracci´on aparente puede expresarse como: fpulso(P′, T′ c, t) = P′t T′ c e1−(t T′ c)(6) P′yT′ cse determinan a partir de los datos experimentales. Cuando en lugar de un ´unico pulso, se aplica un tren de pulsos a una determinada frecuencia, las contracciones de las unidades motoras se suman de manera no lineal (Fuglevand et al.., 1993). Cuando el pulso de frecuencias es suficientemente alto, se alcanza una zona de meseta en la relaci´on fuerza-tiempo (Figura 16). Es en esta situaci´on, cuando no se distingue la oscilaci´on de la carga en la respuesta del m´usculo, cuando se dice que se ha alcanzado el t´etanos. 34 Tomando el m´usculo como una unidad, la fuerza total se obtiene por la sumaci´on de los pulsos de respuesta dependientes del tiempo de intervalo del est´ımulo ∆stim. Este par´ametro representa el intervalo de tiempo entre dos pulsos y es, en realidad, la inversa de la frecuencia. La funci´on ftren que representa la sumaci´on de las contracciones de todas las unidades motoras es: ftren = n X i=1 P′t−∆stim(i) T′ c e 1− t−∆stim(i) T′ c!!ffr (7) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 tiempo (s) Fuerza (%) 90 Hz 60 Hz 30 Hz 10 Hz Figura 16: Representaci´on de la funci´on ftren para cuatro valores de la frecuencia de est´ımulo (90, 60, 30 y 10 Hz). Donde ffr es: ffr = 1 −re(−frnorm)/c (8) frnorm es el producto entre la frecuencia fr y el tiempo de contracci´on, rdetermina el cociente entre la contracci´on y la fuerza tet´anica, ces la tasa de incremento en la fuerza con el incremento en la frecuencia normalizada y nes el n´umero de pulsos de est´ımulo. 35 Para contemplar el fen´omeno de la fatiga (ca´ıda de la fuerza durante el est´ımulo mantenido) desde un punto de vista ´unicamente de intercambio i´onico, puede interpretarse como una saturaci´on gradual de los sitios de troponina con el calcio remanente de los sucesivos est´ımulos. Cannell and Allen (1984) demostraron que la saturaci´on de las c´elulas musculares depende de la asociaci´on Ca-calsequestrina. La Calsequestrina es una prote´ına del ret´ıculo sarcopl´asmico con una funci´on de almacenamiento de calcio en la forma de ca-calsequestrina. El calcio cae r´apidamente durante el impulso y se recupera m´as lentamente, principalmente debido a la liberaci´on del calcio unido a la calsequestrina. Este efecto puede modelarse por medio de una ecuaci´on de Hill como la relaci´on propuesta por Konishi and Watanabe (1998), para ajustar los datos experimentales de Ca-fuerza. fSat =[A]h [Am]h+ [A]h(9) Donde Aes la concentraci´on de una sustancia gen´erica (no se ha medido ninguna sustancia experimentalmente) en el sarcoplasma. El coeficiente de Hill hes la medida de la pendiente y [Am] es la concentraci´on de Aque da la mitad de la m´axima fuerza. La concentraci´on [A] cambia en el tiempo como en Fernandez et al.. (2005): [A] = [A0] + ([Amax]−[A0])t−∆stim(i) t[Amax] e(1−(t−∆stim(i)))/t[Amax](10) [A0] es el nivel de concentraci´on basal, que por simplicidad se ha tomado igual a 0. t[Amax]es el tiempo en el que se alcanza el valor m´aximo de [Amax] siendo ´esta la m´axima concentraci´on de la sustancia. Finalmente, cogiendo toda la serie de relaciones anteriores la fuerza activa desarrollada por el m´usculo puede escribirse como: Factive =F0fλfVftrenfSat (11) 36 5. Resultados Los resultados de la evoluci´on de la fuerza isom´etrica m´axima a lo largo de los 10 s del est´ımulo, pueden observarse en la Figura 17 para los tres m´usculos analizados (TA, EDL y S´oleo). En dicha figura se muestra la media y la desviaci´on est´andar de las cinco muestras ensayadas. La Figura 17.d muestra la denominada tasa de fatigabilidad que representa la pendiente (derivada con respecto al tiempo) de las curvas fuerza frente al tiempo de los tres m´usculos (Figuras 17.a, 17.b y 17.c). 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 Time (s) Force (N) Tibialis Anterior (a) 0 2 4 6 8 10 0 0.5 1 1.5 2 Time (s) Force (N) Extensor Digitorum Longus (b) 0 2 4 6 8 10 0 0.5 1 1.5 2 Time (s) Force (N) Soleus (c) 0 2 4 6 8 10 −5 −4 −3 −2 −1 0 Time (s) Fatigability rate (N/s) Tibialis Anterior Extensor Digitorum Longus Soleus (d) Figura 17: Evoluci´on de la fuerza isom´etrica en el tiempo para: (a) M´usculo TA. (b) M´usculo EDL. (c) M´usculo S´oleo. (d) Tasa de fatigabilidad para los tres m´usculos, expresada en N/s. En el caso del TA (Figura 17.a), el valor m´aximo promedio de fuerza alcanzado 37 TA EDL S´oleo Tiempo para alcanzar Fm´ax 0,1080 ±0,0069 0,1150 ±0,0319 0,1474 ±0,0408 Reducci´on de fuerza ( %) 67,45 % 82,17 % 79,57 % Tabla 3: Tiempo empleado por los diferentes m´usculos para alcanzar la fuerza m´axima y porcentaje de reducci´on de esa fuerza al finalizar el est´ımulo. es de 8,88 ±0,34 N, en un tiempo de 0,108 ±0,0069s. El valor de la fuerza cay´o, posteriormente hasta un valor de 2,89 ±0,38 N cuando finaliz´o el estimulo. El peso promedio de los m´usculos ensayados fue de 0,570±0,03 g. Desde el punto de maxima fuerza alcanzada hasta el final de la contraccion, se puede observar una caida uniforme de la fuerza con una pendiente de aproximadamente −0,5 N/s (Figura 17.d). El m´usculo EDL (Figura17.b) alcanz´o una fuerza m´axima de 1,06 ±0,16 N en un tiempo de 0,115 ±0,0319 s. Durante el estimulo, se observ´o una disminucion de la fuerza hasta 0,189 ±0,04 N en el instante en el que se detiene el est´ımulo. Como se puede observar, el comportamiento del EDL es diferente del TA, apareciendo una gran pendiente inicial durante los dos primeros segundos de contracci´on para posteriormente suavizarse a un valor de aproximadamente −0,1 N/s (Figura 17.d). El peso medio de este m´usculo fue de 0,165 ±0,02 g. Por ´ultimo, en el caso del S´oleo, sus valores m´aximos de fuerza fueron 0,93±0,14 N en un tiempo de 0,147 ±0,0408s y el valor m´ınimo de 0,19 ±0,07 N en 10s. La media de su peso fue de 0,193 ±0,03 g. Aunque la velocidad de fatiga del Soleo es similar a la del EDL, su pendiente inicial es menos pronunciada (Figura 17.d). 38 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 tiempo (s) Fuerza (N) Ajuste Experimental (a) 0 2 4 6 8 10 12 0 0.5 1 1.5 2 tiempo (s) Fuerza (N) Ajuste Experimental (b) 0 2 4 6 8 10 12 0 0.5 1 1.5 2 tiempo (s) Fuerza (N) Ajuste Experimental (c) Figura 18: Curvas de ajuste siguiendo el modelo unidimensional propuesto por Ram´ırez et al.. (2010): (a) M´usculo TA. (b) M´usculo EDL. (c) M´usculo S´oleo. La Tabla 3 recoge, a modo de resumen los tiempos empleados por los diferentes m´usculos para alcanzar la fuerza m´axima. Se muestra tambi´en la reducci´on de fuerza, expresada en tanto por ciento, desde el valor m´aximo hasta el instante en el que se detiene el est´ımulo. La Figura 18 muestra, junto con las curvas experimentales, los resultados obtenidos del ajuste de par´ametros del modelo de Ram´ırez et al.. (2010). En l´ınea discontinua se han representado los ajustes a los resultados experimentales que aparecen en l´ınea continua. Por ´ultimo, en la Tabla 5 aparecen los par´ametros utilizados para los tres diferentes ajustes. 39 TA EDL SOLEUS Fuerza isom´etrica m´axima F0= 8,88 N F0= 1,06 N F0= 0,93 Relaci´on fuerza-longitud λ= 1 λ= 1 λ= 1 λopt = 1 λopt = 1 λopt = 1 β= 0,837 β= 0,837 β= 0,837 Relaci´on fuerza-voltaje a= 1,609 V a= 1,609 V a= 1,609 V V= 8 V V= 8 V V= 8 V d= 1,474 V d= 1,474 V d= 1,474 V Relaci´on fuerza-tiempo P′= 0,16 N P′= 0,15 N P′= 0,11 N T′= 0,04 s T′= 0,03 s T′= 0,04 s fr = 90 Hz fr = 90 Hz fr = 90 Hz r= 1,054 r= 1,054 r= 1,054 c= 1,125 c= 1,125 c= 1,125 h=−1,5h=−0,8h=−0,8 [Am] = 4 ·10−3µmol [Am] = 5,5·10−4µmol [Am] = 5,5·10−4µmol [Amax] = 0,1−0,001 µmol [Amax] = 0,002 −0µmol [Amax] = 0,0016 −0µmol Tabla 4: Datos de ajuste utilizando el modelo propuesto por Ram´ırez et al.. (2010) 40 6. Discusi´on Varios autores han demostrado previamente (Schiaffino et al.., 1970; Pullen, 1977; Delp and Duan, 1996; Rivero et al.., 1998; Tasi´c et al.., 2011) que la composici´on de fibras de los tres m´usculos seleccionados presenta diferencias bioqu´ımicas. Como se ha comentado anteriormente, hoy en d´ıa la clasificaci´on del tipo de fibras musculares que predomina en el m´usculo esquel´etico de los mam´ıferos est´a basada en la expresi´on de las isoformas de la cadena pesada de la miosina. Los grupos m´as importantes son: tipo I, IIa, IIx, y IIb. Las isoformas de la cadena pesada de la miosina determinan la velocidad de establecimiento de los puentes cruzados y por lo tanto, la velocidad de acortamiento m´axima de una c´elula muscular, siendo las de tipo I las m´as lentas, las de tipo IIa intermedias y las de tipo IIx/IIb las m´as r´apidas (Bottinelli and Reggiani, 2000). La composici´on de fibras del TA, EDL y S´oleo de rata ha sido investigada en numerosos trabajos, utilizando diferentes m´etodos de an´alisis cuantitativo. La mayor´ıa de los trabajos, consideran al TA un m´usculo compuesto, predominantemente, por fibras r´apidas (IIb), mientras que en el S´oleo predominan fibras lentas de tipo (I) y en el caso del EDL, se considera que la mayor parte de ´el est´a compuesto tanto por fibras IIa como por fibras IIb (Ariano et al.., 1973; Maltin et al.., 1989; Staron et al.., 1999; Torrella et al.., 2000; Soukup et al.., 2002; Eng et al.., 2008). Esta composici´on diferente es la base de sus diferencias de funcionamiento. As´ı, el S´oleo est´a considerado como un m´usculo lento mientras que el TA presenta un comportamiento de contracci´on r´apida. Los resultados obtenidos no muestran diferencias significativas en el tiempo de respuesta al est´ımulo entre los m´usculos estudiados, sin embargo, se observa una tendencia que indica que el m´usculo TA alcanza antes la fuerza m´axima que el S´oleo (p < 0,10). El EDL, que tiene una composici´on intermedia de fibras, no muestra diferencias significativas al comparar su tiempo de respuesta con el de los otros dos m´usculos (p > 0,05). 47 Markus B¨ol and Stefanie Reese. Micromechanical modelling of skeletal muscles based on the finite element method. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering, 11(5):489–504, Oct 2008. C. A. Yucesoy, B. H. Koopman, P. A. Huijing, and H. J. Grootenboer. Threedimensional finite element modeling of skeletal muscle using a two-domain approach: linked fiber-matrix mesh model. Journal of Biomechanics, 35(9):1253– 1262, 2002. R. R. Lemos, M. Epstein, and W. Herzog. A framework for structured modeling of skeletal muscle. 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