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El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? Diego Redondo Taberner Trabajo Fin de Máster Tutores: Esther Arias Álvarez María Eugenia Venturini Crespo Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza I ÍNDICE 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 1 1.1. Técnica agronómica del aclareo y parámetros de producción del melocotón, nectarina y paraguayo .................................................................................. 1 1.1.1. El aclareo ............................................................................................................ 1 1.1.2. Parámetros de producción del melocotón ................................................ 2 1.1.3. Parámetros de producción de la nectarina ............................................... 3 1.1.4. Parámetros de producción del paraguayo ................................................ 4 1.2. Aprovechamiento y revalorización de los subproductos de la industria alimentaria .............................................................................................................................. 5 1.3. Compuestos de interés tecnológico y/o funcional.......................................... 6 1.3.1. Los radicales libres .......................................................................................... 6 1.3.2. Los compuestos antioxidantes .................................................................... 8 1.3.3. Los compuestos fenólicos............................................................................. 9 1.3.4. Los flavonoides .............................................................................................. 10 1.3.5. Otros compuestos de interés ...................................................................... 12 1.3.6. Productos de origen vegetal con reconocida capacidad antioxidante ..................................................................................................................... 13 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL Y OBJETIVOS ..................................................... 14 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................... 15 3.1. Material vegetal ....................................................................................................... 15 3.2. Parámetros agronómicos y de calidad postcosecha ................................... 16 3.2.1. Calibre, peso y porcentaje de tipo de tejido (piel, pulpa y semilla) .. 16 3.2.2. Medida instrumental del color .................................................................... 16 3.2.3. Sólidos solubles ............................................................................................. 17 3.2.4. Acidez valorable ............................................................................................. 18 3.2.5. Índice de madurez .......................................................................................... 18 3.2.6. Textura .............................................................................................................. 19 3.2.7. Actividad respiratoria .................................................................................... 19 3.2.8. Producción de etileno ................................................................................... 20 3.3. Cuantificación de los compuestos de interés ................................................ 20 3.3.1. Extracción, cuantificación e identificación de los compuestos fenólicos ........................................................................................................................... 21 3.3.1.1. Obtención del extracto fenólico ............................................................. 21 3.3.1.2. Cuantificación de compuestos fenólicos ............................................ 21 II 3.3.1.3. Cuantificación de flavonoides ................................................................ 21 3.3.1.4. Identificación de compuestos fenólicos .............................................. 21 3.3.2. Métodos utilizados para determinar la capacidad antioxidante ........ 22 3.3.2.1. DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) ........................................................... 22 3.3.2.2. FRAP (Poder Antioxidante de Reducción Férrica) ............................ 23 3.3.2.3. ORAC (Capacidad Antioxidante frente al Radical Oxígeno) ........... 23 3.3.2.4. Poder reductor ............................................................................................ 24 3.3.2.5. Porcentaje de secuestro del radical superóxido ............................... 24 3.4. Análisis estadístico................................................................................................ 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 25 4.1. Caracterización inicial del desarrollo madurativo del fruto. Estudio de los parámetros postcosecha ........................................................................................... 25 4.2. Estudio del contenido de compuestos fenólicos en los frutos derivados del aclareo ............................................................................................................................ 27 4.3. Identificación de los compuestos fenólicos de mayor interés .................. 30 4.4. Capacidad antioxidante de los frutos derivados del aclareo ..................... 35 4.5. Análisis de las correlaciones entre los diferentes métodos ...................... 42 5. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 45 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 46 III ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Ejemplo de diferentes frutos procedentes de la técnica del aclareo en fruto. ................. 1 Figura 2. Ejemplo de ramas de melocotonero antes (izquierda) y después (derecha) de realizar el aclareo. ................................................................................................................................................... 2 Figura 3. Melocotonero en flor. ................................................................................................................ 2 Figura 4. Nectarino en flor. ....................................................................................................................... 3 Figura 5. Paraguayo en flor. ..................................................................................................................... 4 Figura 6. Estructura de los diferentes flavonoides (Rice-Evans et al. 1997). ................................. 11 Figura 7. Melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO 3' (de izquierda a derecha) en aclareo (A) y madurez comercial (B). ............................................................................. 16 Figura 8. Medida del color mediante espectrorradiómetro IS CAS 140. ......................................... 16 Figura 9. Espacio de color CIELAB. ..................................................................................................... 17 Figura 10. Refractómetro digital ATAGO DBX 55A. ........................................................................... 18 Figura 11. Titulador automático Crison Compact Titrator para la determinación de la acidez. ... 18 Figura 12. Ensayo de penetración mediante Texturómetro TA-XT2I (A) y curva característica (B). ............................................................................................................................................................. 19 Figura 13. Analizador automático de gases PBI Dansensor. ........................................................... 20 Figura 14. Cromatógrafo de gases FID para determinación de etileno. ......................................... 20 Figura 15. Soluciones estándar utilizadas para la recta patrón de Trolox (0-60 µM) en la determinación de la actividad antioxidante. ......................................................................................... 22 Figura 16. Melocotón 'Royal Glory' procedente del aclareo y cosechado en grado de madurez comercial. .................................................................................................................................................. 26 Figura 17. Nectarina 'Laura' procedente del aclareo y cosechado en grado de madurez comercial. .................................................................................................................................................. 27 Figura 18. Paraguayo 'UFO 3' procedente del aclareo y cosechado en grado de madurez comercial. .................................................................................................................................................. 27 Figura 19. Cromatograma de la pulpa del melocotón 'Royal Glory' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico; 3: ác. cumárico; 4: quercetina. 33 Figura 20. Cromatograma de la pulpa de la nectarina 'Laura' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico. ................................................................. 33 Figura 21. Cromatograma de la pulpa del paraguayo 'UFO 3' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico. ................................................................. 34 Figura 22. Evolución de la fluorescencia relativa (%) en función del tiempo (min) para la determinación de la capacidad antioxidante determinada por el método ORAC en los frutos del aclareo del melocotón, nectarina y paraguayo, con Trolox como estándar. .................................. 40 IV ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación botánica del melocotonero. ............................................................................... 2 Tabla 2. Clasificación botánica de la nectarina. .................................................................................... 3 Tabla 3. Clasificación botánica del paraguayo. ..................................................................................... 4 Tabla 4. Principales especies reactivas relacionadas con el estrés oxidativo (Ramírez 2009). ... 7 Tabla 5. Capacidad antioxidante determinada por el método FRAP de diferentes productos de origen vegetal. ............................................................................................................................................ 9 Tabla 6. Clasificación de los compuestos fenólicos (Martínez-Navarrete et al. 2008). .................. 9 Tabla 7. Contenido en fenoles de diferentes productos de origen vegetal. .................................... 10 Tabla 8. Contenido en flavonoides de diferentes productos de origen vegetal. ............................ 12 Tabla 9. Especies y variedades estudiadas. Fechas de aclareo y recolección. ............................ 15 Tabla 10. Peso, porcentaje en peso del tipo de tejido y calibre del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. ................ 25 Tabla 11. Color, sólidos solubles, acidez e índice de madurez del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. ................ 25 Tabla 12. Actividad respiratoria y producción de etileno del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. .................................. 26 Tabla 13. Contenido en fenoles del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. ...................................................................... 28 Tabla 14. Contenido en fenoles y flavonoides del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. .................................................. 29 Tabla 15. Contenido en fenoles del fruto entero del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' procedente del aclareo. ......................................................................................... 30 Tabla 16. Concentración (mg/100 g) de los fenoles identificados del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. ................ 32 Tabla 17. Ventajas y desventajas de los métodos utilizados para la determinación de la capacidad antioxidante. .......................................................................................................................... 36 Tabla 18. Actividad antioxidante determinada por DPPH, FRAP, ORAC, poder reductor y secuestro del radical superóxido del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comerciala. .................................................................... 37 Tabla 19. Actividad antioxidante determinada por DPPH, FRAP, ORAC, poder reductor y secuestro del radical superóxido del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos enteros procedentes del aclareoa. ..................................................................... 38 Tabla 20. Actividad antioxidante determinada por DPPH, FRAP, ORAC, poder reductor y secuestro del radical superóxido del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos enteros y la semilla procedentes del aclareoa. ................................................ 39 Tabla 21. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para todas las frutas analizadas ................................................................................................................................................. 42 Tabla 22. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para el melocotón 'Royal Glory'.......................................................................................................................................................... 43 Tabla 23. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para la nectarina 'Laura' .... 43 Tabla 24. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para el paraguayo 'UFO 3' 43 El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 1 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Técnica agronómica del aclareo y parámetros de producción del melocotón, nectarina y paraguayo 1.1.1. El aclareo El aclareo en fruto es una técnica agrícola cuyo objetivo es descargar el árbol de un excesivo número de frutos para obtener un producto final de mayor tamaño, evitar un peso excesivo en las ramas y conseguir una distribución uniforme de los frutos por todo el árbol. Se ha comprobado además que con la etapa del aclareo, en algunas especies frutales, se logra minimizar la llamada vecería, fenómeno que consiste en que un año el árbol tiene mucha producción mientras que al año siguiente el número de frutos es menor (figura 1). Figura 1. Ejemplo de diferentes frutos procedentes de la técnica del aclareo en fruto. Igualmente, el aclareo de frutos resulta imprescindible, debido a los efectos que tiene sobre el calibre y la precocidad. La mejor época para realizar el aclareo es después de la caída de pequeños frutos no fecundados y antes del endurecimiento del hueso, aproximadamente unos 30-40 días después de la plena floración, cuando el fruto tiene un tamaño comprendido entre 2 y 5 cm. Se suele dejar un fruto por cada 15- 20 cm de distancia en rama. El momento en el que se lleva a cabo el aclareo es determinante. Si se realiza a cabo un aclareo muy precoz se favorece la formación de frutos de mayor tamaño, mientras que si se realiza un aclareo demasiado tardío éste será poco eficaz. Igualmente, la intensidad del aclareo depende del año, si hay un buen cuajado y muchos frutos, puede llegar a ser del 80 % de las piezas del árbol. En años normales el aclareo será de aproximadamente un 50 %, retirándose la mitad de los frutos de las ramas. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 2 La selección de los frutos es muy importante, debiendo estar bien desarrollados y presentar una buena posición en la rama para que no se deformen, no tengan heridas por las ramas de alrededor y se facilite la recogida cuando esté maduro. En la figura 2 se muestra en la imagen de la izquierda, una rama de melocotón con muchos frutos (justo antes de realizar el aclareo), y en la imagen de la derecha, el estado de la rama justo después del aclareo. Figura 2. Ejemplo de ramas de melocotonero antes (izquierda) y después (derecha) de realizar el aclareo. La práctica del aclareo supone un coste adicional para el productor. Estos costes por árbol se estiman ente 25 y 30 min y entre 3,43 y 4,11 euros, por ejemplo, en el caso del melocotón (Martín et al. 2010). 1.1.2. Parámetros de producción del melocotón El melocotonero [Prunus persica (L.) Batsch] (figura 3) es una especie frutal originaria de China donde las referencias a su cultivo se remontan hace 3.000 años y actualmente su cultivo está muy extendido en todo el mundo. En la tabla 1 se muestra la clasificación botánica a la que pertenece el melocotón. Tabla 1. Clasificación botánica del melocotonero. Clase Magnoliata Subclase Rosida Orden Rosales Familia Rosaceae Subfamilia Prunoidea Género Prunus Especie persica Figura 3. Melocotonero en flor. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 3 Figura 4. Nectarino en flor. A escala mundial, el melocotonero es la segunda especie frutícola de climas templados, después del manzano, con 17,5 millones de t producidas, lo que supone el 3,5 % del total de fruta recolectada. Los principales productores son China, Italia, España, Estados Unidos y Grecia (FAOSTAT 2012). En Europa se obtienen 4,3 millones de t de melocotón. En 2009, los principales países productores fueron Italia (1,7 millones de t), España (1,1 millones de t) y Grecia (700.000 t) (FAOSTAT 2012). La producción de melocotón en España muestra una regionalización importante con 4 comunidades aportando el 82 % de la superficie productora. Estas cuatro comunidades son Cataluña, Aragón, Comunidad de Murcia y Andalucía (MAGRAMA 2012). En cuanto a la producción, en el año 2009 fue de 1.100.000 t, destacando Cataluña (320.554 t) y Aragón (202.795 t) (MAGRAMA 2012). En el melocotón, el aclareo suele realizarse unos 40 días después de la floración (entorno a finales de mayo o principios de junio) y el fruto tiene un tamaño de 2-3 cm. 1.1.3. Parámetros de producción de la nectarina El nectarino (figura 4) es un árbol derivado por mutación de los melocotoneros comunes y los únicos caracteres diferenciales son la ausencia de vellosidad en la piel del fruto. Su clasificación es Prunus persica var nectarina (figura 4). Tabla 2. Clasificación botánica de la nectarina. Clase Magnoliata Subclase Rosida Orden Rosales Familia Rosaceae Subfamilia Prunoidea Género Prunus Especie persica Variedad nectarina Las referencias históricas de la nectarina en Europa son recientes. Prácticamente no existe ningún texto escrito que la mencione hasta el siglo XVII en Inglaterra y en América, donde la llevaron los colonizadores europeos. La producción nacional de nectarina en el año 2009 fue de 438.741 t, centrándose sobre todo en Cataluña (118.823 t) y Aragón (100.302 t) (MAGRAMA 2012). Las nectarinas son frutales propios de las zonas de poca altitud, desde el mismo nivel del mar hasta alturas de 300 metros. Estas no tienen la necesidad de un largo El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 4 Figura 5. Paraguayo en flor. reposo invernal como ciertas variedades de melocotonero, prefiriendo climas de inviernos cortos y relativamente templados y veranos largos de atmósfera seca, por ser muy sensible a las humedades, ya que pueden favorecer el desarrollo de enfermedades y la pérdida del fruto por agrietamiento. El aclareo en fruto en la nectarina suele realizarse a los 45-50 días después de la floración (finales de mayo o principios de junio) y con un tamaño de fruto de 2-4 cm. 1.1.4. Parámetros de producción del paraguayo El paraguayo (Prunus persica var. platycarp) (tabla 3) es una variedad de melocotón surgida también de una mutación natural (figura 5). Conserva la piel aterciopelada y la textura de algunas variedades de melocotón, pero con una descarada forma aplastada, siendo también un fruto de menor tamaño. Tabla 3. Clasificación botánica del paraguayo. Clase Magnoliata Subclase Rosida Orden Rosales Familia Rosaceae Subfamilia Prunoidea Género Prunus Especie persica Variedad platycarp Igual que el melocotón, se dice que el paraguayo procede de Asia. Su cultivo en China se produce desde hace siglos, y parece ser que se introdujo en Estados Unidos en 1800, pero fue alrededor de 1990 cuando empezó a apreciarse mucho más y a realizarse grandes cultivos en otros países. La producción de paraguayo en España en el año 2008 fue de 51.000 t, destacando la Región de Murcia y el Valle del Ebro (Iglesias 2011). Con un porte del árbol que varía entre los 2 y los 5 metros, presenta unas exigencias de clima, suelo y cultivo similares al melocotonero y a la nectarina. En el paraguayo, el aclareo en fruto suele realizarse transcurridos 40-50 días después de la floración (finales de mayo) y con un tamaño de fruto de 2-3 cm. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 11 Figura 6. Estructura de los diferentes flavonoides (Rice-Evans et al. 1997). La actividad antioxidante de estos compuestos está relacionada primero, con la presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3’ y 4’ del anillo B, los cuales les confieren una elevada estabilidad, participando en la deslocalización del electrón, y segundo, un doble enlace entre los carbonos C2 y C3 del anillo C en conjugación con un grupo carbonilo en la posición C4, lo cual hace posible la deslocalización de un electrón en el anillo B. La potencia antioxidante se relaciona en términos estructurales con la deslocalización de un electrón en grupos aromáticos. Cuando estos compuestos reaccionan con radicales libres, los radicales fenoxilo producidos se estabilizan por el efecto resonante de los núcleos aromáticos. Finalmente los grupos hidroxilo libres en la posición 3 del anillo C y en la posición 5 del anillo A, junto con el grupo carbonilo en la posición 4 también son importantes en la actividad antioxidante (Sánchez-Moreno 2002). Entre todos los flavonoides, destaca la quercetina, un flavonoide que reúne todas estas características y que es uno de los antioxidantes naturales más potentes, y que se encuentra presente en frutas como manzanas, uvas, arándanos, cerezas y en verduras tales como cebollas o brócoli. En la tabla 8 se muestran algunos de las frutas y hortalizas con mayor concentración de flavonoides. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 12 Tabla 8. Contenido en flavonoides de diferentes productos de origen vegetal. Producto Flavonoides (mg/100g) Referencia Producto Flavonoides (mg/100g) Referencia Tomate 12,8 Marinova et al 2005 Pera 48,5 Marinova et al 2005 Melocotón 15,0 Marinova et al 2005 Mora 55,5 Marinova et al 2005 Cereza 19,6 Marinova et al 2005 Fresa 69,7 Marinova et al 2005 Manzana Limoncella 19,8 D’Abrosca et al. 2007 Uva 77,1 Marinova et al 2005 Manzana amarilla 20,9 Marinova et al 2005 Lechuga 97,2 Marinova et al 2005 Frambuesa 26,6 Marinova et al 2005 Ciruela 136,2 Marinova et al 2005 Manzana roja 32,7 Marinova et al 2005 Arándano 190.3 Marinova et al 2005 1.3.5. Otros compuestos de interés Además de fenoles y flavonoides, en la dieta se pueden introducir otras sustancias antioxidantes que ayudan al organismo a evitar el aumento de los radicales libres (Martínez-Navarrete et al. 2008): - Beta caroteno presente en zanahoria, mango, tomates, melón ó melocotón. - Vitamina E (tocoferol) es una sustancia antioxidante que mantiene la integridad de la membrana celular, protege la destrucción de la vitamina A, previene y disuelve los coágulos sanguíneos y retarda el envejecimiento celular. Se encuentra en muchas frutas y vegetales tales como: aguacate, boniato, espárragos, espinacas, tomates, bróculi, moras y zanahorias. - La vitamina C (ácido ascórbico) es otro de los antioxidantes naturales que combaten el exceso de radicales libres. Necesaria para producir colágeno y para la metabolización de las grasas, por lo que se le atribuye el poder de reducir el colesterol. Las fuentes alimentarias de vitamina C más destacables son: grosellas, pimiento verde, kiwi, limón, fresas, coliflor, coles de Bruselas, naranjas, tomates y melón. - El selenio actúa junto con la vitamina E como antioxidante, ayudando a nuestro metabolismo a luchar contra la acción de los radicales libres. También protege contra el cáncer, además de mantener en buen estado las funciones hepáticas, cardíacas y reproductoras. Las fuentes alimentarias de selenio son la carne, el pescado, los cereales integrales y los productos lácteos. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 13 1.3.6. Productos de origen vegetal con reconocida capacidad antioxidante En la actualidad, debido a la preocupación expresada por los consumidores sobre el contenido en aditivos químicos de su dieta, existe un interés creciente en la industria alimentaria para sustituir los antioxidantes sintéticos por otros de origen natural. Este hecho ha potenciado la investigación y caracterización de compuestos antioxidantes procedentes de fuentes naturales como plantas, frutas, hortalizas, tés, cereales, especias, semillas y algas, entre otros. Algunas plantas como el romero y la salvia, poseen una gran actividad antioxidante y que debida principalmente a la presencia de abietanos o diterpenos fenólicos como el carnosol y al ácido carnósico. Otras muchas plantas y frutas de colores anaranjados o rojos, como el tomate, la zanahoria, etc., son ricas en carotenoides (xantofilas, carotenos, licopenos, etc.) que son excelentes antioxidantes lipídicos. Las frutas del bosque como las moras, grosellas, etc. y otras frutas de colores azulados-rosáceos (granada) contienen antocianinas que muestran actividades antioxidantes muy elevadas. Igualmente, en el vino tinto se ha relacionado su contenido en resveratrol, flavonoides y antocianos con la disminución de enfermedades coronarias. Se ha comprobado además que los compuestos fenólicos y oleósidos de la oliva y del aceite de oliva virgen extra actúan sinérgicamente con los tocoferoles protegiendo al aceite de la actuación del oxígeno y los radicales libres sobre los compuestos lipídicos y sobre muchas otras matrices alimenticias donde se adicionan. Diversos estudios han demostrado que los ácidos clorogénicos y algunos polifenoles del café y las catequinas y flavonoides del té reducen el riesgo de padecer diabetes tipo 2, cáncer colon-rectal y de hígado y disminuyen el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. Estos compuestos parecen ejercer estas funciones tan beneficiosas para la salud humana debido principalmente a su capacidad para actuar como compuestos antioxidantes (Ramírez 2009). El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 14 2. DESARROLLO EXPERIMENTAL Y OBJETIVOS El presente trabajo está englobado dentro del proyecto “Caracterización y extracción de compuestos nutritivos y funcionales derivados del aclareo y procesado de la fruta” financiado por el departamento de Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente de la Diputación General de Aragón. El objetivo global del estudio es la caracterización, desde un punto de vista tecnológico y funcional, de diferentes frutos de hueso procedentes de la práctica agrícola del aclareo llevada a cabo en distintas zonas de cultivo de Aragón. Los frutos seleccionados para este trabajo han sido melocotón, nectarina y paraguayo. Para la consecución de este objetivo global se han planteado los siguientes objetivos parciales: 1.- Estudio del desarrollo madurativo de los frutos mediante el análisis de parámetros agronómicos, físico-químicos (calibre, peso, firmeza, acidez, ºBrix, y color) y fisiológicos (producción de etileno y actividad respiratoria). Los frutos se caracterizarán tanto en el momento del aclareo como en su madurez comercial. 2.- Determinación de la concentración de compuestos con interés tecnológico o funcional de los frutos derivados del aclareo. Como control y a modo de comparación se llevará a cabo el análisis de estos mismos compuestos en el fruto recolectado en su grado de madurez comercial. 3.- Estudio de la influencia del tipo de tejido (piel, pulpa o semilla) en la disponibilidad de los compuestos bioactivos. Todas las determinaciones se realizarán en los tres tipos de tejido (piel, pula y semilla). De esta forma se comprobará la disponibilidad de los compuestos en función de su distribución en el fruto. 4.- Identificación de los compuestos fenólicos en los distintos tipos de tejidos. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 15 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Material vegetal En la tabla 9 se detallan las especies y variedades utilizadas y sus fechas de aclareo y recolección: Tabla 9. Especies y variedades estudiadas. Fechas de aclareo y recolección. Fruto Fecha aclareo Fecha recolección Melocotón ‘Royal Glory’ 06/05/2011 08/08/2011 Nectarina ‘Laura’ 27/04/2011 11/06/2011 Paraguayo ‘UFO-3’ 28/04/2011 22/06/2011 El melocotón ‘Royal Glory’ es una variedad temprana con fecha de recolección entre finales de junio y principios de julio. Es un árbol de vigor medio a fuerte con un fruto redondeado de calibre medio a grueso que se caracteriza por la coloración rojo intenso de su piel. Su pulpa está total o parcialmente desprendida del hueso, hecho especialmente relevante cuando el fruto llega a su madurez, y posee una carne jugosa, consistente y dulce. La nectarina ‘Laura’ es una nueva variedad precoz con fecha de recolección aproximada comprendida entre el 1 y el 10 de julio. El árbol es de porte globoso con unas dimensiones medias de 4-6 metros y elevada productividad. Su elevada floribundidad implica un elevado coste de aclareo en zonas con poco riesgo de heladas. El fruto es de gran calibre y óptima calidad gustativa y el hueso no está adherido a la pulpa, de color amarillo. Su piel es lisa, de coloración rojo intenso. La variedad ‘UFO 3’ es un paraguayo temprano que se recolecta en torno a finales de junio. El fruto presenta la pulpa de color blanco, y con el hueso adherido a ella, de gran aroma y buen sabor. La piel es de color amarillo con tonalidades rojas. En el caso del paraguayo y la nectarina, los frutos procedieron de una finca perteneciente a la empresa Lafuente Tomey S.L. sita en el término municipal de La Almunia de Doña Godina (Zaragoza), mientras que el melocotón fue recolectado en una finca de la empresa Frutas García-Zurita sita en Nonaspe (Zaragoza). Inmediatamente después de la práctica del aclareo o tras la recolección (figura 7) los frutos fueron transportados al laboratorio y conservados a 0 ºC hasta su análisis El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 16 3.2. Parámetros agronómicos y de calidad postcosecha 3.2.1. Calibre, peso y porcentaje de tipo de tejido (piel, pulpa y semilla) El diámetro, tanto polar como ecuatorial y el peso se determinaron en 25 frutos de cada especie. También se calculó el porcentaje en peso de cada tipo de tejido (piel, pulpa, y hueso o semilla). 3.2.2. Medida instrumental del color La medida instrumental del color se realizó con un espectrorradiómetro IS CAS 140 (Instrument Systems; München, Alemania), con una sonda telescópica TOP 100 de medida a distancia (figura 8) y analizada mediante el software ISCOLOR (Instrument Systems Optische Messtechnik GmbH; München, Alemania. Versión 2.53, 1996). La iluminación fue suministrada por una lámpara (12V-100W) de tipo 6834 de Royal Philips Electronics (Amsterdam, Holanda). Figura 8. Medida del color mediante espectrorradiómetro IS CAS 140. Figura 7. Melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO 3' (de izquierda a derecha) en aclareo (A) y madurez comercial (B). B A El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 17 La determinación se realizó durante 3 segundos, mientras la fruta rotaba sobre sí misma 360º. Las medidas de reflexión se realizaron cada 1 nm en el espectro visible y en el infrarrojo, con un intervalo de medida de 360 nm a 900 nm. A partir de estas medidas se obtienen las coordenadas CIELAB, L*,a*,b*, que forman parte de los parámetros CIE (Comisión Internationale del Éclairage). En este espacio de color, L* indica luminosidad y a* y b* son las coordenadas de cromaticidad, que indican direcciones de colores: +a* es la dirección del rojo, -a* es la dirección del verde, +b* es la dirección del amarillo y -b* es la dirección del azul (figura 9). El centro es acromático; a medida que los valores de a* y b* aumentan y el punto se separa del centro, la saturación del color se incrementa. Se utilizaron para estos cálculos el iluminante D65 y el observador CIE31 de 2º de campo visual adecuado al tamaño de los frutos. La medida se realizó sobre 25 muestras de cada fruta. Figura 9. Espacio de color CIELAB. 3.2.3. Sólidos solubles Para la determinación del contenido en sólidos solubles se siguió la técnica descrita en los Métodos Oficiales de Análisis de Zumos de Frutas (AOAC 1984). La medida se realizó por triplicado sobre los zumos obtenidos a partir de 20 frutos, analizándose en un refractómetro digital ATAGO DBX 55A, con corrector automático de temperatura (figura 10), por lo que los resultados se expresaron en ºBrix a 20 ºC. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 18 Figura 10. Refractómetro digital ATAGO DBX 55A. 3.2.4. Acidez valorable El contenido total en ácido naturales se determinó por valoración con una solución de hidróxido sódico por el método potenciométrico (AOAC 1990). El análisis se realizó por triplicado para cada una de las frutas por el siguiente procedimiento: 10 mL de zumo obtenido para la determinación de los sólidos solubles se diluyó hasta aproximadamente 100 mL con agua destilada, y se valoraron con hidróxido sódico 0,1 N hasta alcanzar pH=8,1. Se utilizó el titulador automático Crison Compact Titrator (figura 11) para la determinación de la acidez. La acidez total se expresó en gramos de ácido málico por 100 mL de zumo, por ser éste el ácido mayoritario de las frutas estudiadas. Figura 11. Titulador automático Crison Compact Titrator para la determinación de la acidez. 3.2.5. Índice de madurez El índice de madurez se define como la relación existente entre el contenido en sólidos solubles y la acidez valorable. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 19 3.2.6. Textura La firmeza se determinó mediante un ensayo destructivo de penetración o Magness-Taylor, el cual se define como la fuerza necesaria para introducir en la zona ecuatorial del fruto un vástago cilíndrico. Las medidas instrumentales de textura se llevaron a cabo en un texturómetro TA-XT PLUS (Stable Micro Systems, Goaldming, Inglaterra) dotado con una célula de carga de 5 Kg, con el que se realizaron los ensayos de penetración sobre los frutos sin piel (figura 12A). En este ensayo se utilizó un vástago de 2 mm de diámetro, introduciéndolo hasta una profundidad de 4 mm a una velocidad de 0,83 mm/s. Los análisis se realizaron sobre 25 muestras. Como resultado del análisis se obtienen las correspondientes curvas (figura 12B). A partir de estas gráficas se obtiene el esfuerzo máximo de penetración que se corresponde con el valor máximo sobre el eje Y, expresado por unidad de superficie (Kg/cm2). Figura 12. Ensayo de penetración mediante Texturómetro TA-XT2I (A) y curva característica (B). 3.2.7. Actividad respiratoria La concentración de O2 y CO2 se midió empleando el sistema cerrado. Dicho método consistió en colocar los frutos, aproximadamente 200 g, en el interior de recipientes herméticos de 0,75 L y medir su tasa respiratoria después de 3 horas a temperatura ambiente. La medida de la concentración de gases en el espacio de cabeza de las muestras se realizó a través de un septum. Las muestras se analizaron utilizando un analizador automático de gases PBI Dansensor (figura 13), que nos permite obtener una medida inmediata del % de O2 y CO2 existente en el interior de los frascos de medida. Se realizaron 3 réplicas por cada tipo de fruta. Fuerza máxima a la penetración B A El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 20 Figura 13. Analizador automático de gases PBI Dansensor. 3.2.8. Producción de etileno El método empleado para la determinación de la producción de etileno fue el del sistema cerrado, y se utilizaron los mismos frascos de la actividad respiratoria. La extracción de las muestras se realizó a través de un septum mediante una jeringa Hamilton 1001RN Gastight especial para gases. La inyección de muestra fue de 1 mL tomado del espacio de cabeza de los frascos transcurridos aproximadamente 3 horas de respiración. La cuantificación del etileno se llevó a cabo al mediante un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 4890 dotado de un detector de ionización de llama con columna Hewlett Packard 19001A-QSO (figura 14). Figura 14. Cromatógrafo de gases FID para determinación de etileno. El tiempo de análisis fue de 5 minutos en condiciones isotermas, con el horno a 50 ºC, el detector a 200 ºC y el inyector a 50 ºC, empleándose N2 como gas portador. En estas condiciones el tiempo de retención del etileno fue 2,4 minutos. 3.3. Cuantificación de los compuestos de interés Todos los compuestos se determinaron en piel, pulpa y hueso tanto de los frutos procedentes del aclareo como de los de grado de madurez comercial. Además también se analizó su concentración en el fruto entero procedente del aclareo. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 27 Grado de madurez comercial Aclareo Grado de madurez comercial 4.2. Estudio del contenido de compuestos fenólicos en los frutos derivados del aclareo La concentración de compuestos fenólicos varió según la especie y el tejido estudiado (tabla 13), siendo en general, más elevada en los frutos recogidos tras el aclareo (respecto a los de madurez comercial) y con respecto a los tres tipos de tejido, en la semilla. Figura 18. Paraguayo 'UFO 3' procedente del aclareo y cosechado en grado de madurez comercial. Figura 17. Nectarina 'Laura' procedente del aclareo y cosechado en grado de madurez comercial. Aclareo El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 28 En el caso de los frutos del aclareo del melocotón, los valores más altos se presentaron en semilla y pulpa (156,1 y 154,4 mg ác. gálico/100 g, respectivamente) mientras que la piel mostró la menor concentración (65,4 mg ác. gálico/100 g). Esta concentración se redujo en un 93,1% (10,7 mg ác. gálico/100 g) y 30,7% (108,2 mg ác. gálico/100 g), en pulpa y semilla, respectivamente, al madurar el fruto. Sin embargo en la piel (62,1 mg ác. gálico/100 g) no se detectaron diferencias significativas. En la nectarina, los frutos del aclareo también mostraron las concentraciones más elevadas, tanto en la piel (92,5 mg ác. gálico/100 g) como en la pulpa (119,1 mg ác. gálico/100 g). Sin embargo, la semilla del fruto de madurez comercial presentó una concentración superior (278,2 mg ác. gálico/100 g) siendo además el valor más alto de todas las especies y tipos de tejidos analizados. El comportamiento observado en la tercera especie estudiada, el paraguayo, fue similar a la nectarina. En el aclareo, la mayor concentración se presentó en la semilla (167,6 mg ác. gálico/100 g), seguida de la piel y la pulpa, que no evidenciaban diferencias significativas entre ellas. En el grado de madurez de comercial de nuevo el mayor contenido se obtuvo en la semilla (175,6 mg ác. gálico/100 g). Tabla 13. Contenido en fenoles del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. Fruto Época recolección Tejido Fenoles (mg ác. gálico /100 g) a Melocotón Aclareo Piel 65,4±9,2 b Pulpa 154,4±7,6 a Semilla 156,1±24,7 a Comercial Piel 62,1±20,1 c Pulpa 10,7±0,8 b Semilla 108,2±18,7 a Nectarina Aclareo Piel 92,5±6,4 c Pulpa 119,1±2,4 ab Semilla 133,4±12,6 a Comercial Piel 64,2±10,0 b Pulpa 9,2±0,4 c Semilla 278,2±46,9 a Paraguayo Aclareo Piel 57,3±6,1 b Pulpa 51,7±3,2 b Semilla 167,6±20,2 a Comercial Piel 93,1±14,8 b Pulpa 27,6±2,4 c Semilla 175,6±19,2 a aDiferentes letras en la misma columna indican diferencias significativas entre medias (p<0,05) para cada fruto en cada época de recolección. En negrita los valores más altos de cada época de recolección. En lo que respecta al contenido en flavonoides (tabla 14), se observó un comportamiento similar a lo obtenido en el análisis de compuestos fenólicos. En todas El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 29 las frutas estudiadas, la concentración más elevada se obtuvo en la semilla de los frutos del aclareo. Tabla 14. Contenido en fenoles y flavonoides del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. Fruto Época recolección Tejido Flavonoides (mg catequina/100 g) a Melocotón Aclareo Piel 27,3±7,2 c Pulpa 83,7±0,8 b Semilla 99,6±3,6 a Comercial Piel 28,3±7,1 b Pulpa 5,2±0,5 c Semilla 68,2±14,3 a Nectarina Aclareo Piel 48,1±2,2 b Pulpa 67,9±4,8 a Semilla 68,5±8,5 a Comercial Piel 24,1±6,4 b Pulpa 6,1±0,5 c Semilla 177,4±40,5 a Paraguayo Aclareo Piel 24,8±4,1 b Pulpa 22,5±1,0 b Semilla 93,9±10,7 a Comercial Piel 43,6±6,0 b Pulpa 12,9±0,6 c Semilla 95,8±1,7 a aDiferentes letras en la misma columna indican diferencias significativas entre medias (p<0,05) para cada fruto en cada época de recolección. En negrita los valores más altos de cada época de recolección. Los resultados obtenidos en el análisis de fenoles y flavonoides presentes en frutos inmaduros, como pueden ser los procedentes de la práctica del aclareo, coinciden con lo observado por otros autores. Celli et al. (2011), estudiaron el contenido de fenoles de diferentes variedades de cerezas en distintos grados de madurez. Obtuvieron valores comprendidos entre 414 y 518 mg ác. ferrúlico/100 g para estados precoces de madurez y comprendidos entre 245 y 309 mg ác. ferrúlico/100 g para el grado de madurez comercial. Por su parte, Çelik et al. (2008) en un estudio realizado en arándanos determinaron una reducción de la concentración de los compuestos fenólicos desde 799 hasta 474 mg ác. gálico/100 g de en frutos verdes y maduros, respectivamente. Estos descensos pueden ser atribuidos a una serie de cambios ocurridos durante la maduración y que incluyen la hidrólisis de glucósidos, la oxidación de fenoles por polifenoloxidasas y la polimerización de fenoles libres (Remorini et al. 2008). Además, la biodisponibilidad de estos compuestos en función del tejido estudiado también ha sido objeto de diferentes investigaciones. Remorini et al. (2008) obtuvieron mayores concentraciones (entre 2-6 veces) de fenoles totales en la piel de melocotones que en la pulpa. Tomás-Barberán et al. (2001) también encontraron que El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 30 la piel de nectarinas, melocotones y ciruelas contenía mayores cantidades de fenoles, antocianinas y flavonoles que la pulpa. Desde el punto de vista de la utilización de estos subproductos obtenidos de la práctica del aclareo, la forma más fácil y práctica de utilizarlos sería su procesado como fruto entero. Por este motivo se llevó a cabo el análisis tanto de compuestos fenólicos como de flavonoides en el fruto entero, sin diferenciar entre los tres tejidos presentes. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 15. Tabla 15. Contenido en fenoles del fruto entero del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' procedente del aclareo. Fruto Fenoles (mg ác. gálico /100 g)a Flavonoides (mg catequina/100 g) a Melocotón 123,9±10,8 a 82,9±7,9 a Nectarina 105,9±1,2 b 67,5±4,7 b Paraguayo 59,2±4,6 c 24,5±6,1 c aDiferentes letras en la misma columna indican diferencias significativas entre medias (p<0,05). En negrita los valores más altos de cada método analizado. De los tipos de fruto estudiados, el melocotón es el que presenta la mayor concentración de fenoles y flavonoides, mientras que el paraguayo es el que presenta la menor. En este caso, en el que la máxima concentración se da en al semilla se tendría que plantear una etapa previa en el procesado que nos permitiera separar la semilla del resto del fruto. De esta forma la eficacia de la extracción sería mucho mayor. Por otro lado, resulta interesante comparar los valores de concentración obtenidos (tanto de fenoles como de flavonoides) en el análisis de nuestros frutos del aclareo, con los encontrados en distintos tipos de fruta reconocidos por su alto contenido en compuestos bioactivos, como pueden ser la cereza (105,0 mg ác. gálico/100 g), la ciruela roja (143,5 mg ác. gálico/100 g), la granada (146,9 mg ác. gálico/100 g), el arándano (171,0 mg ác. gálico/100 g), la uva (200,1 mg ác. gálico/100 g) o la mora (417,0 mg ác. gálico/100 g) (Fu et al. 2011). 4.3. Identificación de los compuestos fenólicos de mayor interés Como hemos dicho, en general a los compuestos fenólicos se les atribuyen propiedades beneficiosas para la salud. Sin embargo existen un gran número de fenoles y no todos poseen la misma actividad. Por ejemplo, a la quercetina se le atribuyen efectos metabólicos como antioxidante, antimutagénico y además ayuda a disminuir la agregación plaquetaria. Con todo ello previene la carcinogenia, el infarto de miocardio y las enfermedades cardiovascuales y cerebrovascuales. La catequina El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 31 es antimutagénica y disminuye la agregación plaquetaria, previniendo de esta forma la carcinogenia. El ác. gálico es capaz de reducir la peroxidación de lípidos y por ello es capaz de prevenir las enfermedades cardiovasculares. Y el ác. clorogénico previene el cáncer de hígado y colon (Martínez-Navarrete et al. 2008). En el caso del melocotón (tabla 16) procedente del aclareo los fenoles identificados de mayor concentración fueron el ác. gálico en la piel (31,3 mg/100 g), y el ácido clorogénico en la pulpa (77,1 mg/100 g) y en la semilla (70,6 mg/100 g). En el grado de madurez comercial desaparecieron el ác. cumárico y la epicatequina y disminuyeron el ác. gálico, el ác. clorogénico y la quercetina. En los frutos de aclareo de nectarina, el fenol con mayor presencia fue el ác. clorogénico en los tres tejidos estudiados (59,4, 22,9 y 43,9 mg/100 g para piel, pulpa y semilla, respectivamente) mientras que en los frutos de madurez comercial fue el ác. clorogénico en la piel (16,6 mg/100 g) y la semilla (35,7 mg/100 g) y la quercetina en la pulpa (5,5 mg/100 g). En este caso destaca la aparición de ácido ferrúlico, quercetina y catequina al ir desarrollándose el fruto (tabla 16). En el caso del paraguayo (tabla 16), se observa como en el momento del aclareo, el fenol más abundante es, al igual que en la nectarina, el ácido clorogénico, con concentraciones de 19,0, 4,5 y 72,8 mg/100 g en piel, pulpa y semilla, respectivamente. Al madurar se comprueba como en el fruto se mantiene como fenol principal el ác. clorogénico en la piel y la pulpa (34,6 y 8,0 mg/100 g, respectivamente), mientras que en el hueso es la catequina (12,6 mg/100 g) junto con el propio ác. clorogénico (12,3 mg/100 g). En la figura 19 se presenta, a modo de ejemplo, el cromatograma obtenido para la identificación de los distintos compuestos fenólicos en la pulpa del melocotón derivada de frutos del aclareo o cosechados en grado de madurez comercial. Se puede comprobar claramente la influencia del momento del desarrollo madurativo en el perfil fenólico del fruto y como al ir avanzando en dicho desarrollo la presencia de los compuestos fenólicos se va modificando. La degradación y síntesis de nuevos compuestos es continua durante todo el desarrollo madurativo, comenzando en los estados más precoces hasta llegar al grado de madurez organoléptico. En la nectarina y el paraguayo se observó un comportamiento similar (figuras 20 y 21). El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 32 Tabla 16. Concentración (mg/100 g) de los fenoles identificados del melocotón 'Royal Glory', nectarina 'Laura' y paraguayo 'UFO3' de los frutos del aclareo y madurez comercial. Fruto Época recolección Tejido Fenoles (mg/100 g)a Ác. gálico Ác. clorogénico Epicatequina Vainillina Ác. cumárico Ác. ferrúlico Quercetina Catequina Melocotón Aclareo Piel 31,3±7,2 a 10,4±0,2 b 5,5±0,1 c - 2,9±0,2 d - 12,1± 0,3 b - Pulpa 9,9±0,3 b 77,1±4,4 a - - 2,9±0,3 c - 5,6±0,1 b - Semilla 10,2±0,8 b 70,6±8,5 a - - 3,5±1,4 c - - - Comercial Piel 3,9±0,6 c 7,1±0,5 a - - - - 6,2±0,2 b - Pulpa 1,2±0,2 b 4,8±1,1 ab - - - - 5,4±0,1 a - Semilla 4,0±0,1 b 4,9±1,9 ab - - - 5,7±0,7 a 5,5±0,1 a - Nectarina Aclareo Piel 4,2±0,5 b 59,4±3,3 a - - 3,6±0,1 c - 5,4±0,1 b - Pulpa 3,1±0,3 b 22,9±7,8 a - - - - - - Semilla 7,5±0,9 b 43,9±1,5 a - - 5,3±0,3 c - - - Comercial Piel 3,2±0,6 c 16,6±0,9 a - - - 1,6±0,4 c 6,3±0,2 b - Pulpa - 2,6±0,1 b - - - - 5,5±0,1 a - Semilla 0,1±0,0 d 35,7±1,4 a - - 3,5±0,2 c - 5,8±0,1 b 0,4±0,1 d Paraguayo Aclareo Piel 7,1±0,3 b 19,0±0,6 a 5,4±0,1 c - 3,2±0,1 d - 5,5±0,1 c - Pulpa 2,9±0,3 b 4,5±0,1 a - - - - - - Semilla 7,0±0,7 b 72,8±2,5 a - - 4,8±0,1 c - - - Comercial Piel 0,1±0,1 d 34,6±0,5 a - - 2,9±0,1 c - 5,5±0,1 b - Pulpa 0,1±0,1 b 8,0±1,0 a - - - - - - Semilla 0,1±0,1 e 12,3±1,1 a 7,9±0,1 b 0,8±0,3 d 3,2±0,1 c 2,4±0,5 c - 12,6±0,7 a aDiferentes letras en la misma fila indican diferencias significativas entre medias (p<0,05) en cada tejido. En negrita los valores más altos. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 33 Figura 19. Cromatograma de la pulpa del melocotón 'Royal Glory' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico; 3: ác. cumárico; 4: quercetina. Figura 20. Cromatograma de la pulpa de la nectarina 'Laura' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico. A 4 1 2 3 4 2 1 2 2 1 A B B El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 34 Figura 21. Cromatograma de la pulpa del paraguayo 'UFO 3' en el aclareo (A) y en el grado comercial (B) a 280 nm. 1: ác. gálico; 2: ác. clorogénico. Zheng et al. (2012) también observaron una disminución de la concentración de compuestos fenólicos en manzana ‘Fuji’ desde el aclareo hasta el momento óptimo de su recolección. En su caso, desciende el contenido de todos los fenoles estudiados: procianidina B1, catequina, ác. clorogénico, ác. cafeico, ác. cumárico, quercetina-3- galactósido y quercetina-3-glucósido. Tomás-Barberán et al. (2001), evaluaron los cambios producidos en la composición fenólica de piel y pulpa de cultivares de melocotón y nectarina. En general, encontraron un mayor contenido en la piel de ác. clorogénico, ác. neoclorogénico, catequina, epicatequina, procianidina B1, quercetina-3-galactósido, quercetina-3- glucósido y quercetina-3-rutinósido. Como ocurre en nuestro caso, algunos de estos compuestos son detectados en la piel pero no en la pulpa. De este estudio se podría deducir que entre los compuestos que no hemos identificado y que se repiten en melocotón y nectarina se encuentran flavanoles tales como la procianidina B1 o flavonoles como la quercetina-3-glucósido. Orazem et al. (2011) también encontraron el ác. clorogénico como el fenol más abundante en la piel de 11 cultivares de melocotón, mientras que en la pulpa se alternaba entre el ác. clorogénico y el ác. neoclorogénico. En el caso del paraguayo, existen muy pocos trabajos relacionados con su estudio. Únicamente hemos encontrado una publicación (Fu et al. 2011) en la 2 1 A 2 1 B El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 35 que al igual que nosotros, también se identificó al ác. clorogénico como el compuesto fenólico más importante de la pulpa. 4.4. Capacidad antioxidante de los frutos derivados del aclareo En la bibliografía se pueden encontrar numerosas publicaciones en las que se describe la capacidad antioxidante de diferentes frutas y hortalizas determinada por distintos métodos. Entre estos métodos se encuentre el DPPH, FRAP, ORAC, ABTS (2,2-azinobis (3-etil-benzotiazolina-6-ácido sulfónico), TEAC (capacidad antioxidante de equivalentes de Trolox), poder reductor, secuestro del radical superoxido, secuestro del radical hidroxilo, reducción del cobre, fotoluminiscencia, etc. Esto conlleva un problema asociado y es que no existe un método estandarizado para la determinación de la capacidad antioxidante total lo que exige una optimización de la metodología para cada tipo de producto (Prior et al. 2005). Esta diversidad de métodos es debida a que ninguno de ellos es capaz de determinar de forma exacta la capacidad antioxidante total de un producto. Esto puede ser debido a varios factores. Uno es que existen numerosos radicales libres. Además también puede ser debido a que tanto oxidantes como antioxidantes tienen distintas características físicas y químicas. Por último, cada método posee un mecanismo de reacción diferente que puede estar basado principalmente en la transferencia de electrones (TE) o en la transferencia de átomos de hidrógeno (TAH). En el primer grupo encontramos métodos como el FRAP o el DPPH, mientras que en el segundo grupo encontramos el ORAC (Thaipong et al. 2006). En nuestro estudio, la capacidad antioxidante fue determinada por 5 métodos distintos. En la tabla 17 se indican las ventajas e inconvenientes de los diferentes métodos utilizados. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 36 Tabla 17. Ventajas y desventajas de los métodos utilizados para la determinación de la capacidad antioxidante. Método Ventajas Inconvenientes DPPH • Simple • Rápido • Espectrofotométrico • Los carotenoides pueden interferir la medida • Es más accesible para las moléculas pequeñas • Afectado por agentes reductor no antioxidantes FRAP • Simple • Rápido • Robusto • Espectrofotométrico • Tiempo reacción variable • No detecta antioxidantes con radical tiol ORAC • Utiliza una fuente de radicales libres biológica • Método estandarizado que permite una fácil comparación • Automatizado • Coste equipo necesario elevado • Sensible a cambios de pH • Elevado tiempo de análisis • Procesado de datos complejo P. reductor • Rápido • Espectrofotométrico • Repetible • Tiempo reacción variable • Límite de cuantificación alto Superóxido • Simple • Rápido • Espectrofotométrico • Precursor de otros oxidantes • No es un oxidante • Comparación difícil El método del radical DPPH mide el cambio de color desde un color violeta a un color amarillo, cuando el radical libre es reducido por un proceso de donación de electrones (Liu et al. 2008). Utilizando este método se ha comprobado como la mayor capacidad antioxidante se presenta en la semilla, tanto en el aclareo como en la madurez comercial de las tres frutas analizadas (tabla 18). Wijngaard et al. (2012) obtuvieron concentraciones similares a las nuestras en diferentes frutas y en sus subproductos derivados utilizando el método del DPPH. El residuo procedente de la elaboración de zumo de manzana ‘Pink Lady’, presentó una concentración 0,16 mmol Trolox/100 g, similar a lo que obtenemos nosotros en el análisis de la capacidad antioxidante del fruto de melocotón, nectarina y paraguayo derivado del aclareo (tabla 19). Buran et al. (2012) obtuvieron resultados de 2,7 y 2,4 mmol Trolox/100 g para las variedades de arándanos Star y Windsor, respectivamente, utilizando el método del DPPH. Celli et al. (2011) concluyeron que las cerezas de variedades moradas y rojas de origen brasileño presentan una concentración de 1,1 y 0,8 mmol Trolox/100 g, respectivamente. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 43 especies de trufas del género Terfezia, una alta correlación positiva entre la porcentaje de reducción del DPPH y los flavonoides (p: 0.966) y entre el método FRAP y los fenoles (p: 0.973). Tabla 22. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para el melocotón 'Royal Glory' Fenoles Flavonoides DPPH FRAP ORAC P. reductor Superóxido Fenoles 0,967** 0,856** 0,809** 0,170 -0,758** 0,905** Flavonoides 0,858** 0,785** 0,180 -0,713** 0,858** DPPH 0,884** 0,358 -0,850** 0,787** FRAP 0,496* -0,749** 0,579** ORAC -0,041 -0,093 P. reductor -0,770** Superóxido *:p≤ 0,05; **: p≤ 0,01 En la tabla 23, para la nectarina se detectan altas correlaciones positivas entre los fenoles y flavonoides (p: 0,950), FRAP (p: 0,889) y ORAC (p: 0,822), entre flavonoides y FRAP (p: 0,813) y entre FRAP y ORAC (p: 0,865). Sin embargo no se detecta ninguna alta correlación con el poder reductor o el radical superóxido. Para el paraguayo (tabla 24) el número de correlaciones es menor, y sólo se presenta entre fenoles y flavonoides (p: 0,981) y entre el FRAP y los fenoles (p: 0,813) y los flavonoides (p: 0,824). Tabla 23. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para la nectarina 'Laura' Fenoles Flavonoides DPPH FRAP ORAC P. reductor Superóxido Fenoles 0,950** 0,525* 0,889** 0,822** -0,063 0,415 Flavonoides 0,496* 0,813** 0,730** -0,142 0,466 DPPH 0,677** 0,656** 0,283 0,370 FRAP 0,865** 0,119 0,391 ORAC 0,460* 0,467* P. reductor 0,236 Superóxido *:p≤ 0,05; **: p≤ 0,01 Tabla 24. Correlaciones entre los diferentes métodos investigados para el paraguayo 'UFO 3' Fenoles Flavonoides DPPH FRAP ORAC P. reductor Superóxido Fenoles 0,981** 0,678** 0,813** 0,566** 0,470* 0,764** Flavonoides 0,657** 0,824** 0,569* 0,451 0,789** DPPH 0,594** 0,676** 0,270 0,555** FRAP 0,485* 0,065 0,577** ORAC 0,197 0,442 P. reductor 0,607** Superóxido *:p≤ 0,05; **: p≤ 0,01 Todo esto nos sirve para concluir que cada fruta se comporta de forma diferente, y hay que estudiarla de forma individual, ya que nos es posible extrapolar los diferentes El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 44 métodos entre las distintas frutas, si bien es verdad que en todas se produce una alta correlación positiva entre fenoles y flavonoides, debido, posiblemente como hemos dicho, a que son compuestos de la misma índole. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 45 5. CONCLUSIONES 1.- Todos los frutos estudiados (melocotón, nectarina y paraguayo) presentan una elevada concentración de fenoles totales (> 100 mg ác. gálico/100g) y flavonoides (> 80 mg catequina/100g), en su fase de desarrollo más temprana, cuando son recogidos tras la práctica del aclareo. 2.- El fruto entero del melocotón procedente de la etapa de aclareo es el que mayor concentración de fenoles y flavonoides presenta, seguido de la nectarina y por último el paraguayo. 3.- Respecto a los distintos tejidos estudiados, el mayor contenido de fenoles totales y flavonoides se encuentra en la semilla, sobre todo en los frutos procedentes del aclareo, por lo que esta parte del fruto podría considerarse como una fuente importante de compuestos bioactivos. 4.- Los compuestos fenólicos más abundantes en los frutos del aclareo son el ác. gálico y el ác. clorogénico, especialmente este último, estando presentes en todas las frutas y tejidos analizados. 5.- Los frutos enteros procedentes del aclareo presentan una elevada capacidad antioxidante (> 2 mmol/100 g determinado por el método FRAP), similar a la observada en frutas con reconocido potencial antioxidante como cereza, granada, arándano o mora. El tejido que presenta una mayor capacidad antioxidante es la semilla. 6.- Las diferencias observadas entre los distintos métodos de análisis de la capacidad antioxidante indican la necesidad de identificar otros compuestos (no analizados en el presente estudio) con poder antioxidante y que también puedan contribuir al potencial reductor del fruto, como pueden ser las vitamina C y E o algunos pigmentos como carotenoides o antocianos. 7.- Los frutos derivados de la práctica del aclareo de melocotón, nectarina y paraguayo podrían ser considerados una nueva fuente de compuestos bioactivos debido a su elevado contenido en fenoles totales y flavonoides y su alta capacidad antioxidante (principalmente, melocotón y nectarina). De esta forma, el aprovechamiento de este tipo de residuo agrícola permitiría reducir los problemas asociados a su gestión, al permitir su reutilización y disminuir los posibles problemas medioambientales que generan. El aclareo en fruto: ¿una nueva fuente de compuestos funcionales? 46 6. BIBLIOGRAFÍA Aaby K, Mazur S, Nes A, Skrede G (2012) Phenolic compounds in strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) fruits: Composition in 27 cultivars and changes during ripening. Food Chem 132:86-97 Al-Laith AAA (2010) Antioxidant components and antioxidant/antiradical activities of desert truffle (Tirmania nivea) from various Middle Eastern origins. Journal of Food Composition and Analysis 23:15-22 AOAC (1990) Official Methods of Analysis 22.060 AOAC (1984) Método nº 8 Fédération International des Producteurs de Jus de Fruits Ayala-Zavala JF, Vega-Vega V, Palafox-Carlos H, Villa-Rodriguez JA, Siddiqui MW, Dávila-Aviña JE, González-Aguilar GA (2011) Agro-industrial potential of exotic fruit byproducts as a source of food additives. Food Res Int 44:1866-1874 Babbar N, Oberoi HS, Uppal DS, Patil RT (2011) Total phenolic content and antioxidant capacity of extracts obtained from six important fruit residues. 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