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UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA FACULTAD DE VETERINARIA TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Julio 2012 Evaluación de sensibilidad y resistencia a antibióticos de cepas de Listeria spp. aisladas de alimentos Autor: María Garcés Lambán Tutores: Antonio Herrera Marteache y Mª Carmen Rota García Departamento: Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Área: Nutrición y Bromatología Trabajo fin de máster 2012 2 Agradecimientos Al Gobierno de Aragón y Fondo Social Europeo 2007-2010 a través del Grupo Consolidado de Investigación “Análisis y evaluación de la Seguridad Alimentaria” (AO1). A CARNISENUSA CSD 2007-00016 (Consolider Ingenio 2010, MICINN), a través del subproyecto titulado: “Incidencia y prevalencia de L. monocytogenes en las industrias cárnicas” Agradezco el apoyo y la ayuda recibida por parte de mis tutores los profesores: Antonio Herrera y Carmina Rota; así como a Pilar Conchello, Javier Yangüela, Diego Góme, Ana Blasco y al apoyo técnico prestado por parte de Nieves Ortega. Trabajo fin de máster 2012 3 Índice Resumen…………………………………………………………………………………………………………..4 Introducción y revisión bibliográfica  Género Listeria…………………………………………………………………………………..6  Resistencia a antimicrobianos……………………………………………………………11  Metodología para la detección de sensibilidad o resistencia a antibióticos para cepas de Listeria………………………………16 Objetivos………………………………………………………………………………………………………….22 Material y métodos  Material, reactivos y equipos……………………………………………………………..23  Medios de cultivo……………………………………………………………………………….24  Cepas bacterianas………………………………………………………………………………25  Revivificación de cepas de Listeria spp………………………………………….……28  Ajuste de la concentración microbiana por espectrofotometría…………28  Test de susceptibilidad antimicrobiana………………………………………………31 Resultados y discusión  Ajuste de la Transmitancia…………………………………………………………………37  Método de microdilución en caldo…………………………………………………….39  Susceptibilidad antimicrobiana general………………………………….41  Comparación de la resistencia entre especies………………………..43  Adquisición de resistencia a lo largo del tiempo…………………….45  Multirresistencias…………………………………………………………………..48 Conclusiones…………………………………………………………………….……………………………..50 Bibliografía……………………………………………………………………………………………………...51 Anexos……………………………………………………………………………………………………………..56 Trabajo fin de máster 2012 4 1. Resumen El uso creciente de antibióticos para la salud humana y animal, así como para la producción ganadera, ha ido acompañado del desarrollo de mecanismos de evasión por parte de microorganismos anteriormente sensibles. De este modo, desde los años 50 hasta la actualidad no han cesado de crecer las descripciones de microorganismos que han adquirido alguna forma de resistencia contra uno o más antibióticos. Inicialmente se monitorizó la evolución de las resistencias a antimicrobianos en los aislamientos originados en la clínica humana y posteriormente se dio gran importancia a la necesidad de la monitorización en los aislamientos de origen animal. Se ha prestado escasa atención a la presencia de microorganismos resistentes en los alimentos destinados al consumo humano, especialmente en los de origen animal y que presumiblemente pueden ser portadores de resistencias. Muchos de los microorganismos ingeridos con los alimentos, como L. monocytogenes pueden ocasionar enfermedades si se dan las circunstancias apropiadas; concretamente éste patógeno con porcentaje de letalidad elevados en determinados grupos de riesgo. De ahí la necesidad de evaluar los patrones de sensibilidad y resistencia a determinados antimicrobianos de uso habitual en el tratamiento de listeriosis, en cepas de Listeria spp. aisladas de alimentos. Para este estudio se han seleccionado 32 cepas de Listeria spp. aisladas de alimentos de origen animal (queso y longaniza), que incluyen: 18 cepas aisladas en el año 1994, 5 de ellas L. monocytogenes y 13 L. innocua, y 9 cepas del 2011, 5 L. monocytogenes y 4 L. innocua. Se ha evaluado la susceptibilidad antimicrobiana de las 32 cepas de Listeria spp. a 9 antimicrobianos (ampicilina, ciprofloxacina, clindamicina, eritromicina, gentamicina, penicilina, riampicina, tetraciclina y vancomicina) mediante el método de microdilución en caldo, método cuantitativo que nos permite establecer la concentración mínima inhibitoria (MIC); método laborioso y largo, pero permite obtener resultados con mayor exactitud y fiabilidad. Los resultados de este trabajo indican que las cepas de Listeria spp. estudiadas han desarrollado resistencias a antimicrobianos a los cuales eran sensibles; además el transcurso del tiempo ha hecho que se incremente el porcentaje de cepas resistentes en un 10% y que hayan adquirido multirresistencia. Se ha observado diferencia de resistencia a los antibióticos ensayados entre las dos especies estudiadas, ya que la especie L. innocua manifestó mayor resistencia que L. monocytogenes; hecho nada desdeñable por la posibilidad de intercambio genético entre especies. Trabajo fin de máster 2012 5 Estos resultados nos indican que Listeria spp. está adquiriendo resistencia a antimicrobianos usados para el tratamiento de la infección, lo que incrementa el riesgo de listeriosis asociada al consumo de alimentos. Trabajo fin de máster 2012 6 2. Introducción y Revisión bibliográfica 2.1 Gº Listeria Listeria debe su nombre a Joseph Lister (1827-1912), cirujano y microbiólogo inglés considerado como uno de los padres de la microbiología. Este microorganismo fue descubierto en conejos, en el año 1926, por Murray, Webb y Swann, microbiólogos de la Universidad de Cambridge, quienes bautizaron a este nuevo agente como Bacterium monocytogenes. Casi simultáneamente, James Pirie describió el mismo bacilo en un roedor con fiebre y monocitosis en Kenia y lo llamó Listerella hepatolyitica. Más tarde, otros investigadores aislaron la misma bacteria y le dieron diferentes nombres. Esta confusión fue resuelta en 1957 por el alemán Heinz Seeliger, conocido taxónomo, quien en honor a Lister impuso el nombre Listeria monocytogenes, nomenclatura que se utiliza actualmente (Ledermann, 2008) El género Listeria comprende un grupo de bacterias Gram-positivas relacionadas con los géneros: Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. Como todas las bacterias Gram-positivas, Listeria posee una membrana citoplasmática y una pared celular gruesa y homogénea compuesta por peptidoglicano. Sin embargo, las bacterias Gram-negativas poseen una membrana citoplasmática y pared celular delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y a diferencia de las Grampositivas, éstas poseen una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias (Figura 2). La ausencia de membrana externa hace que las bacterias Grampositivas sean más sensibles a los antibióticos y a otros agentes antibacterianos, que las Gram-negativas. (Tortora et al., 2007) Figura 1. Joseph Lister (1827-1912) Trabajo fin de máster 2012 7 El género Listeria actualmente comprende ocho especies (NCBI):  L. monocytogenes, comprende 13 serovariedades, siendo los serotipos más frecuentes 1/2a, 1/2b, 1/2c y 4b  L. innocua  L. ivanovii  L. seeligeri  L. welshimeri  L. grayi  L. marthii  L. rocourtiae Las especies L. marthii y L. rocourtiae, han sido identificadas recientemente. (Graves et al, 2010; Leclercq et al, 2010) De todas estas especies, la única patógena para el hombre es Listeria monocytogenes, responsable de producir listeriosis, siendo ésta una enfermedad de transmisión alimentaria que se presenta produciendo tanto, casos esporádicos como brotes epidémicos. Fue a comienzos de la década de los 80, cuando esta especie se manifestó como un patógeno emergente transmitido por los alimentos (EFSA, 2011). Entre las características más importantes de esta bacteria debemos destacar su resistencia a condiciones adversas, lo que favorece la supervivencia y crecimiento de estos patógenos en los alimentos (Tabla 1). Figura 2. Estructura de la pared de bacterias Gram-positivas vs Gram-negativas Trabajo fin de máster 2012 8 Tabla 1. Factores que favorecen la supervivencia y crecimiento de L. monocytogenes (AESAN, 2011) El hábitat de Listeria spp., es muy diverso ya que se encuentra en intestino de animales y personas que actúan como portadores y, también, está ampliamente distribuida en ambientes naturales como suelo, agua, efluentes, pastos y ensilados dónde sobreviven durante períodos extensos de tiempo. También se encuentra en el suelo, paredes, techos y equipos de plantas de procesado de alimentos (Elika, 2006), lo que representa un importante problema a la industria alimentaria. L. monocytogenes puede crecer como célula plantónica o como biofilm, adhiriéndose a las superficies y formando colonias protegidas por una capa formada por polisacáridos extracelulares denominada biofilm. De este modo, la bacteria es más resistente a los agentes químicos y físicos y puede sobrevivir por largos periodos con aportes mínimos de nutrientes. La localización de estas colonias protegidas por biofilm en áreas de difícil visibilidad y acceso para su limpieza hace que este patógeno pueda sobrevivir como foco continuo de contaminación de alimentos. (Elika, 2006) Su carácter ubicuitario le confiere una importante oportunidad de llegar a los alimentos, que junto con su resistencia y multiplicación en condiciones extremas, destacando su carácter psicrotrofo, representa un importante problema sanitario. Son muchos los alimentos que pueden vehicular este patógeno, de hecho ha sido aislado de una gran variedad de alimentos de origen vegetal (ensaladas y frutas), lácteo, marino o cárnico (Elika 2009): 1. Carne de rumiantes, otros animales de abasto y aves. Aunque la prevalencia de L. monocytogenes en carnes difiere significativamente, algunos estudios han citado tasas de prevalencia de hasta el 92% de los productos analizados. Un número elevado de animales de abasto (11-52%) se consideran portadores sanos. En mataderos, la presencia de L. monocytogenes puede ser endémica, particularmente en efluentes y suelos. Factor Puede crecer Puede sobrevivir pero no crecer Límite inferior Óptimo Límite superior Temperatura(⁰C) -1,5 a +3.0 30,0 a 37,0 45,0 -18,0 pH 4,2 a 4,3 7,0 9,4 a 9,5 3,3 a 4,2 Actividad agua (Aw) 0,90 a 0,93 0,99 >0,99 <0,90 Concentración de sal (%) < 0,5 0,7 12 a 16 ≥20 Atmósfera Es un anaerobio facultativo que puede crecer en ausencia de oxígeno, por ejemplo, envasado o atmósfera modificada Trabajo fin de máster 2012 9 2. Leche y derivados lácteos. Se ha descrito en leches y derivados lácteos y en plantas de procesado de dichos alimentos, así como en productos pasterizados y en derivados frescos, probablemente, debido a una recontaminación tras su pasterización. En el caso de quesos elaborados con leche pasterizada o no pasterizada, la ausencia de L. monocytogenes depende de parámetros intrínsecos (aw, acidez, péptidos antimicrobianos, etc.) y extrínsecos (Tª, humedad, recontaminación, etc.), mientras su presencia es siempre problemática debido a su capacidad extraordinaria de supervivencia en condiciones hostiles. 3. Pescado fresco, congelado y ahumado: La presencia y supervivencia en pescado fresco y congelado es poco probable, mientras en el pescado ahumado es variable dependiendo del método de ahumado empleado (en frío o caliente), siendo este tipo de alimentos de alto riesgo. 4. Frutas y verduras: Se conoce que hasta el 10-20% de productos vegetales listos para su consumo pueden estar contaminados con L. monocytogenes incluyendo semillas germinadas (brotes), lechugas, rábanos, tomates, cebollas, pepinos, coliflores y setas cultivadas; de hecho, algunos brotes de listeriosis han sido debido al consumo de este tipo de productos. 5. Huevos y ovoderivados: La detección en este tipo de alimentos es poco frecuente. 6. Alimentos listos para consumo (RTE): Son alimentos de alto riesgo y han sido asociados a varios brotes de listeriosis. Tal es el caso de derivados cárnicos picados, ya que son alimentos con alta manipulación por lo que la posible contaminación con L. monocytogenes es muy elevada. En los derivados cárnicos fermentados, posiblemente, la presencia de L. monocytogenes es menor aunque su supervivencia es posible. La prevalencia y concentración de L. monocytogenes en los alimentos preocupa tanto a profesionales de Salud Pública como a industriales y gobiernos, ya que se trata de un patógeno de origen alimentario que presenta una elevada tasa de mortalidad en poblaciones de riesgo. Según indica el último informe de la EFSA, en el 2009 se confirmaron en la Unión Europea 1645 casos de listeriosis, mayor número de casos que los registrados años anteriores (2005-2008). La tasa de notificación fue mayor en la personas mayores de 65 años (58,5%) y el porcentaje de niños entre 0 y 4 años fue del 4,2%. La mayor parte Trabajo fin de máster 2012 16 Debido al uso desmesurado de antibióticos para la salud humana y animal, gran número de microorganismos, entre ellos el género Listeria, están desarrollando resistencias a diferentes antibióticos. El estudio de antibiorresistencias no debe limitarse sólo a la especie patógena (L. monocytogenes), ya que los genes de resistencia pueden transmitirse de unas especies a otras. Estudios como el de Hernández et al (2004) demuestran una adquisición de genes de resistencia de la especie L. monocytogenes a partir de la especie L. innocua. 2.3 Metodología para la detección de los patrones de sensibilidad o resistencia a antibióticos. La problemática actual de las resistencias de los microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible su determinación, incluso en aquellos casos en los que la sensibilidad se considera universal y no se han descrito, por el momento, mecanismos de resistencia (Aureli et al, 2003). Su detección se realiza mediante las pruebas de sensibilidad/resistencia o antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica (Jorgensen, y Hindler, 2007). El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana. Por el momento no existe un método universal que reproduzca las condiciones en las que se encuentra un microorganismo produciendo una infección y, por tanto, la situación ideal en las que deben desarrollarse las pruebas de sensibilidad (García et al, 2000). Los métodos para evaluar la susceptibilidad antimicrobiana pueden clasificarse en dos tipos: métodos cualitativos y cuantitativos.  Los métodos cualitativos o métodos de difusión en disco, son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente. Este es uno de los métodos más utilizados en la rutina diaria por la mayor rapidez, pero son varios los estudios que han demostrado que es inadecuado y poco reproducible (Gómez et al, 2009).  Los métodos cuantitativos son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) y la concentración bactericida mínima (CBM). Se define MIC como la mínima concentración de antibiótico que en un período de tiempo predeterminado, es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inóculo bacteriano previamente estandarizado (concentración conocida de gérmenes) y como CBM la mínima concentración de un antibiótico que en un período de tiempo predeterminado, es capaz de Trabajo fin de máster 2012 17 inducir la muerte in vitro del 99.9% de una población bacteriana previamente estandarizada. La determinación de la MIC puede realizarse por los métodos de micro o macro dilución en caldo, dilución en agar o por el test comercial E- test. Para que los resultados de las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos sean reproducibles y comparables, los métodos deberán estar estandarizados. Existen diferentes centros europeos de referencia en los estudios de sensibildad microbiana, como son el Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos (SRGA), el Sistema DIN de los Países Bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología (SFM) y el Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos (CLSI) (Malbrán, 2001). Las recomendaciones más utilizadas para los métodos de susceptibilidad antimicrobiana son las establecidas por el National Commitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS). Métodos de Dilución en caldo (cuantitativos) Muchos factores influyen en las interacciones in vitro e in vivo entre microorganismos y las sustancias antimicrobianos, incluyendo el medio de cultivo utilizado, la concentración del antibiótico y la cantidad de bacterias frente a las que actúa el antibiótico. El medio de cultivo utilizado para realizar las Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos debe permitir el crecimiento apropiado del microorganismo en estudio. Para la mayor parte de los microorganismos se recomienda utilizar el medio Mueller-Hinton (MH), sea en agar o en caldo. Estos medios muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes comerciales, son baratos y contienen bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclinas.(García et al 2000) A pesar de estas cualidades, algunos parámetros del medio se deben controlar en cada lote de uso, como son:  La cantidad de cationes divalentes. La variación de los cationes divalentes principalmente de Ca++ y Mg++, afecta a los resultados de antibióticos como tetraciclinas, aminoglucósidos, etc.., por lo que se recomienda la utilización del medio Mueller-Hinton con la concentración de cationes ajustada (cationadjusted Mueller-Hinton, CAMH), para asegurar resultados aceptables. Si las concentraciones de cationes son más bajas que las recomendadas, se observará una actividad incrementada de los aminoglicósidos y la tetraciclina. Por el contrario, con concentraciones de cationes más altas que las indicadas la actividad de los aminoglicósidos y la tetraciclina disminuirá. Trabajo fin de máster 2012 18  pH del medio de cultivo que debe ser ajustado a 7.2 – 7.4 (7.3 ± 0.1) a 25ºC antes de autoclavar y debe ser verificado tras la preparación final. Un pH del medio de cultivo inferior al indicado puede conducir a una actividad disminuida de los aminoglicósidos, eritromicina y clindamicina, mientras que un pH superior a 7.4 tiene el efecto contrario.  Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprim, produciendo alteraciones en las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano en la placa. Existen dos modalidades de los métodos de dilución, en las que se utilizan tubos (macrométodo) o placas de microtitulación (micrométodo) (García et al, 2000): En el método de macrodilución se emplea por cada combinación microorganismo/antimicrobiano una batería de tubos. Habitualmente se prepara la batería de tubos con 1ml de medio estéril sin antimicrobiano. Al primero de ellos se añade 1 ml de la solución inicial del tubo de antimicrobiano hasta conseguir la concentración más alta a estudiar (teniendo en cuenta que este primer paso supone la dilución a la mitad de la solución madre, y que una vez inoculados los tubos, con 1 ml de inóculo, se diluirá nuevamente la concentración de antimicrobiano a la mitad). Tras mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces como diluciones se quieran estudiar, eliminando del último tubo de la serie 1 ml de medio con antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 ml. La serie de tubos se completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 ml de caldo. En el método de microdilución cada una de los pocillos de la placa de microtitulación con pocillos de fondo en "U" representa uno de los tubos del método de macrodilución. La mayoría de placas disponibles tienen 96 pocillos (12x8). El volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100 µl, por lo que antes de la inoculación de la placa, cada pocillo debe contener 100 µl de caldo con antimicrobiano (volumen de inóculo menor de 10 µl) o 50 µl (si se van a usar también 50 µl para inocular la placa). En este último caso debe tenerse en cuenta, a la hora de calcular la concentración inicial más alta, que tras añadir el inóculo la concentración de antimicrobiano se diluirá a la mitad. Dependiendo, pues, del volumen de inóculo final, las placas se rellenan utilizando una pipeta multicanal con 100 ó 200µl de la solución más alta de antimicrobiano en la columna 1. Posteriormente se añade un volumen de 50 o 100 µl de caldo sin antimicrobiano en los pocillos de las columnas 1 a la 10 y se realiza la dilución en la Trabajo fin de máster 2012 19 forma habitual empleando la pipeta multicanal, dejando los pocillos de la última columna como controles (positivos - no antimicrobiano- y negativos - no inóculo-). Para la preparación del inóculo se debe partir de un cultivo fresco para la preparación de una suspensión en solución salina estéril o en caldo Mueller-Hinton a una turbidez equivalente a la del estándar 0.5 de la escala McFarland. La CLSI recomienda que se debe partir de una concentración de 1x10⁸ufc/ml, para que la concentración final en cada pocillo de la placa de microtitulación sea de 5x10⁵ufc/ml (García et al, 2000), aunque se aceptan concentraciones entre 3 y 7 x 10⁵ufc/ml. Esta concentración bacteriana puede ser ajustada por espectofotometría mediante la medida de la Absorbancia o Transmitancia. Los medios de cultivo inoculados deben ser incubados dependiendo de los microorganismos a 35ºC durante 18/24 horas, para todas aquellas bacterias de crecimiento rápido o a 35ºC durante 24/48 horas, para las de crecimiento lento. Otro punto importante a tener en cuenta, es la utilización de cepas de referencias en cada ensayo, con el fin de asegurar la calidad de éste y controlar la precisión y la exactitud del método. La selección de las cepas de referencia dependerá del tipo de ensayo que se vaya a realizar. Las cepas de referencia aconsejadas por el CLSI en métodos de dilución en caldo son:  Staphylococcus aureus ATCC 29213: Control para antimicrobianos usados frente a bacterias grampositivas.  Enterococcus faecalis ATCC 29212: Control para antimicrobianos usados frente a bacterias gram-positivas, y para el control de trimetoprim/sulfametoxazol.  Escherichia coli ATCC 25922: Control de antimicrobianos usados frente a bacterias gram-negativas.  Escherichia coli ATCC 35218: Control para las combinaciones de -lactámicos con inhibidores de -lactamasas.  Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: Control de antimicrobianos usados frente a bacterias gram-negativas y particularmente con aminoglucósidos. Selección de antibióticos para las pruebas de susceptibilidad in vitro En la selección de los antibióticos debe tenerse en cuenta, para incluir en el estudio, aquellos antibióticos de uso habitual en el tratamiento de las infecciones producidas por la bacteria/s objeto de estudio. También debe seleccionarse al menos un antibiótico perteneciente a cada uno de los siguientes grupos continuación (Skoog et al. 2003): Trabajo fin de máster 2012 20  ß-Lactámicos: poseen un anillo central de cuatro átomos denominado anillo ßlactámico. Su principal modo de acción es la inhibición de la síntesis de pared celular. Constituyen una amplia lista de antibióticos: Penicilinas, Cefalosporinas y todos aquellos que en su estructura tengan un anillo β-lactámico es su estructura molecular.  Glicopéptidos: Los glicopéptidos poseen una compleja estructura química y actúan inhibiendo la síntesis de la pared celular en un sitio diferente al de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo está dirigida a las bacterias Gram - positivas.  Aminoglucósidos: Los aminoglucósidos o aminósidos son un grupo de antibióticos bactericidas. Actúan a nivel de ribosomas en la subunidad 30S bacteriana, y por ende, a nivel de síntesis de proteínas inhibiéndola, creando porosidades en la membrana externa de la pared celular bacteriana. Tienen actividad especialmente frente a bacterias Gram-negativas y aeróbicas y actúan sinergísticamente frente a organismos Gram-positivos.  Macrólidos: Los macrólidos son antibióticos estructuralmente relacionados que se caracterizan por tener un anillo macrocíclico de lactona, que inhiben la síntesis proteica a nivel ribosomal.  Rifamicinas: A este grupo pertenece la Rifampicina que se une a la subunidad beta de la DNA-polimerasa RNA-dependiente, impidiendo que esta enzima se una al DNA, bloqueando la transcripción del RNA.  Tetraciclinas: La Tetraciclina es producida por una bacteria del género Streptomyces. Su mecanismo de acción se debe a la inhibición de la síntesis de proteínas a nivel ribosomal, de ciertas bacterias Gram-positivas y negativas. Actúan inhibiendo la síntesis proteica al unirse a la subunidad 30 S del ribosoma y no permitir la unión del ácido ribonucléico de Transferencia (tRNA) a este, ni el transporte de aminoácidos hasta la subunidad 50 S. Las resistencias bacterianas a este grupo son de aparición lenta, aunque mucho más rápida si se utiliza por vía tópica. El mecanismo bacteriano implicado puede ser mediante plásmido, lo que explica la reticencia al uso de Tetracilinas en el ámbito hospitalario, para evitar la aparición de resistencias simultáneas a varios antibióticos.  Quinolonas: Este grupo de compuestos incluye un número de agentes antimicrobianos íntimamente relacionados que funcionan primariamente inhibiendo la actividad de la DNA-girasa, interfiriendo en la replicación de Trabajo fin de máster 2012 21 ADN de muchas bacterias Gram-positivas y negativas. Tienen una acción bactericida rápida.  Lincosamidas: Clindamicina. A este grupo pertenece la Clindamicina tiene efecto bacteriostático. Interfiere con la síntesis de las proteínas, de forma similar a la eritromicina y cloranfenicol, uniéndose a la subunidad 50S del ribosoma bacteriano. Lectura de los resultados Tras la incubación de las placas de microtitulación se determina la capacidad de crecimiento de la bacteria en presencia del antimicrobiano mediante la valoración de la turbidez del medio por espectrofotometría. La lectura espectrofotométrica permite establecer la MIC para cada antibiótico ensayado, que se definen como la máxima dilución del antimicrobiano en la que no hay crecimiento bacteriano (García et al, 2000). Los criterios para la interpretación de las MIC o punto de corte (breakpoint) establecidos por la CLSI para Listeria, sólo están fijados para tres antimicrobianos: ampicilina, penicila G y trimetropin-sulfametaxole. Algunos autores recomiendan utilizar como referencia la MIC establecida para otra bacteria Gram positiva, como es Staphylococcus aureus. Estos criterios han sido utilizados en estudios como los de Toxter et al (2000); Conter et al, (2008); He et al (2010). Estos valores de MIC permiten clasificar las cepas como sensibles, resistentes o intermedias a difrentes antibióticos. Figura 10. Placa de microtitulación Trabajo fin de máster 2012 22 3. Objetivos Los objetivos que nos planteamos en este trabajo han sido los siguientes: 1. Evaluación del patrón de susceptibilidad/resistencia antimicrobiana de cepas de Listeria spp.de origen alimentario. 2. Estudio comparativo de la susceptibilidad antimicrobiana entre las especies del Gº Listeria: L. innocua y L. monocytogenes. 3. Evolución del patrón de sensibilidad/resistencia de las cepas anteriores a lo largo del tiempo. 4. Estudio y evolución del patrón de multirresistencia de dichas cepas. Trabajo fin de máster 2012 23 4. Material y métodos Para evaluar el patrón de sensibilidad o resistencia a diferentes antibióticos de cepas del Gº Listeria, se utilizó la técnica de microdilución en placa, método recomendado por la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) 4.1 Material, reactivos y equipos A continuación se enumeran los equipos, material y reactivos que se han utilizado a lo largo del desarrollo experimental de este trabajo. Material  Micropipetas (50μl y 1000μl)  Micropipeta multicanal (50μl)  Material plástico: puntas, placas de Petri, placas de microtitulación (96 pocillos)  Crioviales de congelación (Nirco S.L)  Tubos Spectronic Reactivos.  HCl 0,1M (Panreac)  Tampón fosfato Ph 6 0,1M (Panreac)  Etanol 95% (Panreac)  Dimetilsulfóxido (Panreac)  Penicilina (SIGMA-ALDRICH)  Ampicilina (SIGMA-ALDRICH)  Ciprofloxacina (SIGMA-ALDRICH)  Clindamicina (SIGMA-ALDRICH)  Eritromicina (SIGMA-ALDRICH)  Gentamicina (SIGMA-ALDRICH)  Rifampicina (SIGMA-ALDRICH)  Tetraciclina (SIGMA-ALDRICH)  Vancomicina (SIGMA-ALDRICH) Equipos  Balanza granatario monoplato Kern 440-45N  Rotatubos. IKA (03.169125).  Estufa de cultivo 30 °C de J.P.Selecta (2000237).  Estufa de cultivo 37 °C de Memmert (D06062).  Lector ELISA (Multiskan Ex (Thermo labsystem)  Spectronic 20 (PACISA)  Autoclave (P. Selecta)  Cabina de flujo laminar (Telstar SA) Trabajo fin de máster 2012 24 4.2 Medios de cultivos Los medios de cultivo utilizados en el estudio, así como su modo de preparación se detallan a continuación:  Caldo BHI (caldo infusión cerebro corazón, MERCK) Método de preparación: - Suspender 37g del medio en un litro de agua purificada. - Agitar suavemente hasta conseguir que se haya diluido por completo. - Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos.  Agar BHIA (agar infusión cerebro corazón, OXOID) : Método de preparación: - Suspender 52 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. - Agitar para conseguir una disolución parcial. - Calentar agitando frecuentemente y hasta llegar a ebullición. - Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. - Verter sobre las placas de Petri y dejar solidificar.  Caldo Mueller-Hinton (MERCK): Método de preparación: - Suspender 21g del medio en un litro de agua purificada. - Agitar para conseguir una dilución parcial. - Calentar agitando hasta llevarlo a ebullición. - Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. - Atemperar en la estufa de mantenimiento de agares hasta su uso.  Agar PCA (Recuento en placa agar, MERCK) Método de preparación: - Suspender 23,5g del medio en un litro de agua purificada - Agitar suavemente hasta conseguir que se haya diluido por completo. - Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Figura 11. Placas medio BHIA Figura 12. Placa Agar PCA Trabajo fin de máster 2012 25 4.3 Cepas bacterianas 4.3.1 Cepas de referencia La cepa de referencia utilizada en nuestro trabajo ha sido Enterococcus faecalis ATCC 29212, adquirida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Esta cepa fue conservada en congelación en viales de criocongelación a -80 °C. Cada vial compuesto por bolitas de vidrio poroso y de líquido criogénico, facilita la adherencia de los microorganismos y asegura la supervivencia del máximo número de bacterias posibles durante su conservación a temperatura de congelación. 4.3.2 Cepas a estudiar Las cepas ensayadas para el estudio de sensibilidad y resistencia han sido cepas de Listeria pertenecientes a las especies L. innocua y L. monocytogenes. Estas cepas fueron aisladas en estudios previos a partir de productos cárnicos (longaniza fresca, semicurada y curada) y productos lácteos (queso fresco y madurado) La longaniza es un derivado cárnico, compuesto por una mezcla de carne picada o troceadas de cerdo, grasa de cerdo, sal, y especias, amasada y embutida en tripas naturales o artificiales. Dependiendo del tratamiento posterior puede ser fresca, curada o semicurada. El queso es el producto lácteo fresco o madurado, sólido o semisólido, obtenido de la leche, de la leche total o parcialmente desnatada, de la nata, del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o de todos estos productos, coagulados total o parcialmente por la acción del cuajo u otros coagulantes apropiados, antes del desuerado o después de la eliminación parcial de la parte acuosa, con o sin hidrólisis previa de la lactosa, siempre que la relación entre la caseína y las proteínas séricas sea igual o superior a la de la leche (Real Decreto 1113/2006):  Queso fresco: es el que está dispuesto para el consumo al finalizar el proceso de fabricación. Figura 13. Enterococcus faecalis Trabajo fin de máster 2012 32 Fórmula 1 Pesada de ATB (mg) = Volumen de SE (ml) x Concentración de SM (µg/ml) Potencia de ATB (µg/mg) Fórmula 2 Volumen de SE (ml) = Pesada de ATB (mg) x Potencia de ATB (µg/mg) Concentración de SM (µg/ml) Cada antibiótico se pesó en una balanza analítica calibrada, con una precisión igual o superior al décimo de miligramo. Si al realizar la pesada se obtiene un exceso de antimicrobiano, se aplica la fórmula 2 para conocer el exacto volumen de solvente a agregar para obtener la concentración deseada. En la preparación de cada solución de antibiótico se tuvo en cuenta los siguientes factores:  La MIC cercana a las bacterias objeto de estudio.  Los puntos de corte establecidos para estas bacterias: resistente, sensible o intermedia.  La MIC de la cepa de referencia o control utilizada en el test de susceptibilidad antimicrobiana.  La concentración más alta de antibiótico utilizada en el test de susceptibilidad antimicrobiana. La dilución madre de cada uno de los antibióticos objeto de estudio, se preparó a una concentración de 1280μg/ml. A partir de estas se realizó una dilución la 1/10 con el fin de obtener una concentración final de 128 μg/ml. Los diluyentes utilizados, la potencia y pureza de cada uno se los antibióticos se describen en la Tabla 4. Trabajo fin de máster 2012 33 Tabla 4: Características de cada uno de los antibióticos ensayados Antibiótico Pureza Potencia Solvente Diluyente Ampicilina 93,8% 938 μg/mg Tampón fosfato Ph 6 0,1M Tampón fosfato Ph 6 0,1M Eritromicina 93,7% 937 μg/mg Etanol 95% Agua destilada estéril Clindamicina 99,0% 990 μg/mg Agua destilada estéril Agua destilada estéril Ciprofloxacina 98,7% 987 μg/mg HCl 0,1N Agua destilada estéril Gentamicina 59,9% 599 μg/mg Agua destilada estéril Agua destilada estéril Pencilina G 99,6% 996 μg/mg Agua destilada estéril Agua destilada estéril Rifampicina 98,0% 980 μg/mg Dimetilsulfóxido Agua destilada estéril Tetraciclina 97,1% 971 μg/mg Agua destilada estéril Agua destilada estéril Vancomicina 102,9% 1029 μg/mg Agua destilada estéril Agua destilada estéril A partir de la solución madre (1280 μg/ml) se realizó la dilución 1/10: En la tabla 5 se indican los pesos (mg) utilizados de cada uno de los antibióticos ensayados y el volumen (ml) de solvente. SM 45 ml 5 ml 900 μl 128,0 μg/ml Trabajo fin de máster 2012 34 Tabla 5: Peso de cada antibiótico /volumen solvente mg de antimicrobiano Volumen solvente (ml) Ampicilina 136,46 mg 100,10 ml Ciprofloxacina 129,68 mg 99,99 ml Clindamicina 129,30 mg 100,00 ml Eritromicina 136,60mg 99,99ml Gentamicina 213,68 mg 100,00 ml Penicilina 128,50 mg 99,90 ml Rifampicina 136,60 mg 99,90 ml Tetraciclina 131,80 mg 99,98ml Vancomicina 124,40 mg 100,00 ml 4.6.3 Método de Microdilución en placa El ensayo se realizó en placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocilllos (12 x 8), con fondo en U. En cada una de las placas de microtitulación se estudió la sensibilidad/resistencia de 3 cepas diferentes de Listeria spp. a un mismo antibiótico. La cepa de referencia utilizada en cada una de éstas ha sido Enterococcus faecalis ATCC 29212, adquirida de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (figura 17) Todas las cepas se ensayaron por duplicado. Además en cada una de las placas se incluyó un control positivo y negativo. A B C D E F G H I J K L 1 2 3 4 5 6 7 8 C + C- Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 E. fecalis Figura 17. Distribución de la placa de microtitulación Trabajo fin de máster 2012 35 Los pasos a realizar fueron los siguientes (figura 18):  Se añaden 50 µl de caldo Mueller-Hinton estéril en cada pocillo, excepto en el pocillo del control negativo donde se añaden 100 µl.  Se añaden 50 µl del inóculo de los diferentes microorganismos, a una concentración de 5 x 105 CFU/ml, aproximadamente, excepto en el control negativo. Es importante añadir el inóculo dentro de los 15 minutos posteriores a su ajuste por transmitacia. La concentración inicial ajustada con el Spectronic 20 fue de 1x10⁸ufc/ml, aproximadamente. A continuación se realizó una dilución 1:100 en Mueller-Hinton y posteriormente se diluyó a la mitad en cada pocillo, de este modo se obtuvo una concentración final del inóculo de 5 x 105 CFU/ml, aproximadamente.  Por último, se añaden 50 µl del antimicrobiano objeto de estudio a cada uno de los pocillos de la primera columna y con pipeta multicanal se realizan diluciones ½, traspasando 50 µl de un pocillo a otro con el fin de obtener concentraciones decrecientes de cada antimicrobiano. De este modo se obtuvieron 10 diluciones para cada antibiótico comprendidas en el rango: 64 a 0,125µl/ml. A los pocillos del control positivo y negativo no se adicionó antibiótico. 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 C+ C- Figura 18. Esquema método microdilución en placa  Todas las placas fueron incubadas a 37⁰C durante 24 horas. Para evitar diferencias de temperatura en la incubación las placas de microtitulación se apilaron en grupos de no más de cuatro o cinco placas. 50 µl Mueller-Hinton 50 µl microorganismo 50 µl antibiótico 50 µl Antibiótico 50µl 50μl 50μl 50μl 50μl 50μl 50μl 50μl Trabajo fin de máster 2012 36  Lectura de la MIC para cada antibiótico. La MIC se define como la menor concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microorganismo estudiado. La lectura las placas se realizó con el fotómetro Multiskan EX (Thermo labsystem), fotómetro básico para lectura de microplacas de 96 pocillos en ensayos cinéticos y de punto final, especialmente adaptado para aplicaciones de inmunoensayos enzimáticos (ELISA). Se homogeneizaron las placas con la opción “ shake” del aparato a 1020 rpm durante 30 segundos. La absorbancia se midió por espectrofotometría a longitud de onda de 620 nm.  Interpretación de la MIC obtenidos, utilizando como referencia los establecido para S. aureus y los que están establecidos para Listeria ssp. para la penicilina G y la ampicilina por la CLSI. Las cepas de Listeria ssp. que tengan un MIC superior al establecido, serán resistentes, aquellas que estén por debajo serán sensibles y las que estén dentro del rango intermedias. En la siguiente tabla se pueden observar los MIC usados como referencia: Antibióticos MIC Listeria spp. Penicilina G ≤2 Ampicilina ≤2 Staphyococcus aureus Ciprofloxacina ≤2 Clindamicina 1-2 Eritromicina 1-4 Gentamicina ≤8 Rifampicina ≤2 Tetracilina ≤8 Vancomicina 8-16 Figura 19. Multiskan Ex (Thermo labsystem) Tabla 6. MIC establecidos para Listeria spp y S. aureus (CLSI) Trabajo fin de máster 2012 37 5. Resultados y discusión 5.1 Transmitancia La correlación entre el porcentaje de Transmitancia y la concentración microbiana (log ufc/ml) para la cepa CECT 935, se puede observar en la Tabla 7. Para obtener un recuento de 1x10⁸ufc/ml, el porcentaje de transmitancia debe ser ajustado a valores entorno al 80%. Se puede observar que a menor Transmitancia, aumenta la concentración microbiana. Valores de Transmitancia y recuentos (ufc/ml) de las cepas objeto de estudio. Previo al estudio de susceptibilidad microbiana, se ajustó el porcentaje de Transmitancia y posterior recuento en placa de las 32 cepas de Listeria objeto de estudio, así como de la cepa de referencia E. faecalis ATCC 29212. En la Tabla 8 se pueden observar los % de Transmitancia y los recuentos obtenidos (ufc/ml) de las 32 cepas de Listeria spp, así como la cepa de referencia. La Transmitancia varía en función al microorganismo y medio de cultivo utilizado. Los resultados de Transmitancia obtenido para cepas de Listeria spp., no son extrapolables a la cepa de referencia E. faecalis ATCC 29212. En este caso, la concentración de 1x10⁸ ufc/ml, se correlacionó con un porcentaje de Transmitancia del 72%, aproximadamente. Los porcentajes de Transmitancias para Listeria se ajustaron entre 80-84% que se han correspondido con recuentos entre 7x107 y 1,5x108. En la misma tabla podemos ver que las concentraciones finales del inóculo (pocillos de las placas de microtitulación) se encuentran en el rango (3 y 7x10⁵ ufc/ml). Estas concentraciones de inóculo son las recomendadas para el estudio de susceptibilidad antimicrobiana en el método de microdilución en caldo. Transmitancia (%) Ufc/ml Log ufc/ml 100 4,16 E6 6,61909333 92,5 7,7E6 6,88649073 79,5 2,43E8 8,38560627 67,9 5,22E8 8,71725431 51,5 1,06E9 9,02530587 38 1,9E9 9,2787536 26 3,41E9 9,53275438 16 3,47E9 9,53970324 Tabla 7: Transmitancia y recuento microbiano (log ufc/ ml) Trabajo fin de máster 2012 38 Nº de Cepa Cepa % Transmitancia Recuento inicial (ufc/ml) Recuento placa de microtitulación (ufc/ml) 1x10⁸ ufc/ml (CLSI) 3-7x10⁵ ufc/ml (CLSI) 1994 1 L. innocua 81% 1,2X 10⁸ ufc/ml 6x10⁵ufc/ml 2 L. innocua 81% 1,28X 10⁸ ufc/ml 6,4x10⁵ufc/ml 3 L. monocytogenes 81% 1,1X 10⁸ ufc/ml 5,5x10⁵ufc/ml 5 L. innocua 80% 1,15X 10⁸ ufc/ml 5,7x10⁵ufc/ml 8 L. innocua 80% 1,5X 10⁸ ufc/ml 7,5x10⁵ufc/ml 9 L. monocytogenes 80% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 11 L. innocua 83% 8X 10⁷ ufc/ml 4x10⁵ufc/ml 12 L. innocua 80% 1X 10⁸ ufc/ml 5x10⁵ufc/ml 13 L. innocua 83% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 14 L. innocua 83% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 16 L. innocua 82% 1,4X 10⁸ ufc/ml 7x10⁵ufc/ml 17 L. innocua 82% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 18 L. innocua 82% 8X 10⁷ ufc/ml 4x10⁵ufc/ml 19 L. innocua 81% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 22 L.monocytogenes 81% 8X 10⁷ ufc/ml 4x10⁵ufc/ml 23 L. monocytogenes 81% 1X 10⁸ ufc/ml 5x10⁵ufc/ml 25 L. monocytogenes 83% 1,4X 10⁸ ufc/ml 7x10⁵ufc/ml 27 L. innocua 82% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 66 L. innocua 80% 1,23X 10⁸ ufc/ml 6,1x10⁵ufc/ml 68 L. innocua 80% 1,08X 10⁸ ufc/ml 5,4x10⁵ufc/ml 70 L. innocua 80% 1,29X 10⁸ ufc/ml 6,4x10⁵ufc/ml 71 L. innocua 80% 1,24X 10⁸ ufc/ml 6,2x10⁵ufc/ml 72 L. innocua 80% 1,35X 10⁸ ufc/ml 6,7x10⁵ufc/ml 2011 4 L. innocua 84% 1X 10⁸ ufc/ml 5x10⁵ufc/ml 5 L. innocua 83% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 6 L.monocytogenes 81% 1,3X 10⁸ ufc/ml 6,5x10⁵ufc/ml 7 L. innocua 83% 1,1X 10⁸ ufc/ml 5,5x10⁵ufc/ml 8 L.monocytogenes 80% 1,4X 10⁸ ufc/ml 7x10⁵ufc/ml 12 L. innocua 84% 1,4X 10⁸ ufc/ml 7x10⁵ufc/ml 17 L.monocytogenes 80% 1,1X 10⁸ ufc/ml 5,5x10⁵ufc/ml 20 L.monocytogenes 85% 1X 10⁸ ufc/ml 5x10⁵ufc/ml 26 L.monocytogenes 83% 9X 10⁷ ufc/ml 4,5x10⁵ufc/ml Cepa de referencia ATCC 29212 E. faecalis 73% 1,1X 10⁸ ufc/ml 5,5x10⁵ufc/ml Tabla 8: % de Transmitancia y recuentos (ufc/ml) de las cepas ensayadas Trabajo fin de máster 2012 39 5.2 Método de microdilución en caldo 5.2.1 Test de susceptibilidad antimicrobiana En este estudio se evalúo la susceptibilidad antimicrobiana de 32 cepas de Listeria spp., pertenecientes a dos especies: L. innocua y L. monocytogenes, frente a 9 antibióticos diferentes con el objetivo de conocer su patrón de resistencia y sensibilidad. Mediante el test de microdilución en placa, se ha obtenido la MIC de cada una de las cepas estudiadas (Tabla 9). CEPA AMP CIP CLI ERI GEN PEN TCY VAN RIF Año 1994 L. innocua 1 0,5 2 8 0.5 2 1 2 0,125 0,125 L. innocua 2 0,5 2 8 0.5 2 1 1 0,125 0,125 L. mono. 3 2 4 8 0,5 1 1 1 0,125 0,125 L. innocua 5 1 2 8 0,25 2 1 0,5 0,125 0,125 L. innocua 8 0,5 2 16 1 1 1 2 0,125 0,125 L. mono. 9 0,25 1 16 0,25 2 2 0,25 0,125 0,125 L. innocua 11 4 4 16 4 4 2 32 4 2 L. innocua 12 2 4 8 4 4 2 8 4 2 L. innocua 13 4 4 16 2, 4 4 2 16 4 1 L. innocua 16 4 4 8 2 8 2 8 4 1 L. innocua 17 4 4 8 2 8 2 8 4 1 L. innocua 18 4 8 8 2 8, 4 2 8 4 1 L. innocua 19 2 1 16 2 8 2 8 4 1 L. mono. 22 2 2 8 2 2 2 8 8, 4 0,5 L. mono. 23 2 1 8 2 4 1 8 4 0,5 L. innocua 14 4 4 8 2 16 8 8 4 1 L. mono. 25 8 8 4 2 4 2 4 4 1 L. innocua 27 8 8 8 2 4 8 8 4 1 L. innocua 66 1 4 16 0,25 0,5 0,5 1 0,125 0,125 L. innocua 68 1 2 8 1 1 0,5 1 0,125 0,125 L. innocua 70 1 2 8 0,5 1 4 1 0,125 0,125 L. innocua 71 1 4 8 0,5 1 4 1 0,125 0,25 L. innocua 72 1 2 8 0,5 1 1 1 0,125 0.125 Tabla 9. MIC de las 32 cepas de Listeria spp. Trabajo fin de máster 2012 40 AMP (ampicilina), CIP (ciprofloxacina), CLI (clindamicina), ERI (eritromicina), GEN (gentamicina), PEN (penicilina), TCY (tetraciclina), VAN (vancomicina) y RIF (rifampicina). Sombreado en azul (véase apartado 4). A partir de estos datos se ha evaluado la: 1. Susceptibilidad antimicrobiana general de las 32 cepas de Listeria spp. 2. Comparación de la susceptibiidad antimicrobiana entre las especies L. innocua y L. monocytogenes. 3. Evolución del patrón de sensibilidad/resistencia de cepas aisaladas en los años 1994 y 2011. 4. Patrón de multirresistencia de las cepas anteriores. Año 2011 L. innocua 6 1 4 16 2 8 8 4 4 0,25 L. innocua 8 2 2 4 1 1 2 2 4 0,5 L.mono. 17 2 1 4 0,125 8 8 16 4 0,25 L. innocua 12 2 4 16 2 8 2 4 4 1 L.mono. 20 2 2 4 0,5 1 2 4 2 0,5 L. innocua 26 2 2 4 2 8 2 8 4 0,25 L.mono. 4 4 4 8 4 4 4 4 4 1 L.mono. 5 4 4 4 4 16 8 4 4 0,5 0,125 L.mono. 7 2 4 4 2 4 2 4 4 0,25 Trabajo fin de máster 2012 41 1. Susceptibilidad antimicrobiana general En la Tabla 10 se muestra el número de cepas de Listeria que son resistentes, sensibles o presentan sensibilidad intermedia a los diferentes antimicrobianos ensayados Antibiótico/Especie Sensibles Intermedias Resistentes Ampicilina 22 - 10 Ciprofloxacina 15 - 17 Clindamicina - - 32 Eritromicina 11 21 - Gentamicina 30 - 2 Penicilina 24 - 8 Rifampicina 32 - - Tetraciclina 29 - 3 Vancomicina 31 1 - En la figura 20 se representan gráficamente el porcentaje de cepas de Listeria spp. sensibles (color azul), sensibilidad intermedia (color morado) y resistentes (color verde) a los antibióticos ensayados. 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 68,70% 46,80% 34,30% 93,80% 75% 100% 90,60% 96,90% 65,60% 3,10% 31,30% 53,20% 100% 6,20% 25% 9,40% Susceptibilidad antimicrobiana Resistentes Intermedias Sensibles Tabla 10: Nº de cepas de L. innocua y L. monocytogenes sensibles, intermedias y resistentes Figura 20: Gráfica del porcentaje de cepas de Listeria spp. sensibles, intermedias y resistentes Trabajo fin de máster 2012 48 4. Patrón de multirresistencia. Se ha evaluado el número de cepas de Listeria multirresistentes (Tabla 14) Como se puede observar en la tabla anterior 19 cepas (59, 4%) presentaron resistencia a dos o más antibióticos, en estudios como el de Pesavento et al (2010), obtuvieron resultados similares donde el 27,5% de las cepas de L. monocytogenes y el 27,6% de L. innocua fueron multirresistentes. Fallah et al (2011) estudiaron el patrón de multirresistencia de cepas de diferentes especies de Listeria, comprobando que el 60,2% de las cepas de L. monocytogenes y el 50,9% de L. innocua presentaron multirresistencia. Estos datos presentan similitud con los nuestros ya que el 59,4% de nuestras cepas Listeria spp. fueron resistentes a dos o más antibióticos. Si comparamos el patrón de multirresistencia de las cepas aisladas en el año 1994 con las del año 2011, se observa un incremento un 10%, resultado que demuestra el aumento de las resistencias bacterianas a lo largo de tiempo. En estudios anteriores como el de Alonso et al (2012) se demuestra un incremento de las multirresistencias (60%) a lo largo del tiempo (de 1993 a 2006). En la siguiente tabla se puede observar el número y porcentaje de cepas resistentes a 2, 3, 4 y 5 antibióticos: Resistencia Antibióticos Nº de cepa 1994 2011 2 antibióticos CIP-CLI 3 (13,04%) 2 (22,2%) CLI-PEN 1 (4,3%) 3 antibióticos AMP-CIP-CLI 4 (17,4%) CIP-CLI-PEN 1 (4,3%) 1 (11,1%) CLI-PEN-TCY 1 (11,1%) 4 antibióticos AMP-CIP-CLI-TCY 2 (11,1%) AMP-CIP-CLI-PEN 1 (4,3%) 1 (11,11%) 5 antibióticos AMP-CIP-CLI-GEN-PEN 1 (4,3%) 1 (11,1%) El patrón de multirresistencia con mayor prevalencia fue CIP-CLI con un 35,2%. El resto de los patrones se presentaron con porcentajes similares de alrededor del 16%, a excepción de CLI-PEN con un 4,3% de presentación. La justificación de estos resultados es la demostrada adquisición de genes de resistencia de Listeria ssp. a diferentes antibióticos a través de la transferencia de Tabla 14: Número y porcentaje de cepas multirresistentes (1994/2011) Trabajo fin de máster 2012 49 plásmidos y transposones de los géneros Enterococcus y Streptococcus al Gº Listeria, así como entre diferentes especies de este mismo género (Charpentier y Courvalin, 1999. La multirresistencia a diferentes antimicrobianos es un grave problema de salud pública, ya que disminuye la eficacia de los tratamientos antibióticos de infecciones de transmisión alimentaria (Pesevato et al. 2010). Trabajo fin de máster 2012 50 6. Conclusiones Las conclusiones obtenidas de los resultados anteriores son las siguientes: 1ª. Las cepas de Listeria spp. de origen alimentario que han sido ensayadas es este estudio, han mostrado una resistencia generalizada a varios de los anrtimicrobianos de uso habitual en el tratamiento de la listeriosis. 2ª. Con los antimicrobianos ensayados se ha comprobado un mayor porcentaje de resistencias en las cepas de la especie L. innocua que en las de L. monocytogenes; dada que está demostrada la capacidad de transferencia de genes de resistencia desde L. innocua a la especie patógena se pone de manifiesto la importancia de estudiar la prevalencia de resistencia en esta especie. 3ª. En el estudio comparativo de cepas de Listeria spp aisladas de alimentos en los años 1994 y 2011, se observa un incremento de prevalencia en la resistencia a antibióticos y en la multirresistencia a lo largo del tiempo. 4ª. El hecho manifestado en la conclusión anterior puede incrementar el riesgo de listeriosis de origen alimentario, ya que Listeria es una bacteria que adquiere lentamente la resistencia microbiana. Es por ello se considera importante llevar a cabo una vigilancia continuada de las resistencias emergentes de este patógeno y con ello contribuir a la garantía de seguridad en el tratamiento eficaz de la listeriosis humana. 5ª. A partir de los resultados obtenidos en este estudio parece necesario ampliar el número de cepas de Listeria de origen alimentario y de antibióticos, así como el estudio de genes de resistencia a determinados antibióticos, con el fin de contribuir al mejor conocimiento del riesgo de listeriosis asociada a los alimentos. Trabajo fin de máster 2012 51 Bibliografía  Alonso-Hernando, A., Prieto, M., García-Fernández, C., Alonso-Calleja C., Capita R (2012). 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