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Abstract
Se ha realizado el recuento y la detección de Listeria monocytogenes en 51 productos cárnicos cocido LPC, comprados en establecimiento de venta al por menor. Fueron analizados,siguiendo la normativa UNE‐EN‐ISO 11290‐1, UNE‐EN‐ISO 11290‐2, y el método de cultivo rápido Listeria PrecisTM validado por la AFNOR (Oxoid, 2010) para recuento y detección de L.monocytogenes, y la Norma Mexicana NOM‐143‐SSA1‐1995 únicamente para la detección, siguiendo el criterio de presencia o ausencia en 25 gramos. Los análisis microbiológicos se realizaron el mismo día de la compra, a mitad del periodo de duración mínima almacenados a4ºC Y 10º C y final de este periodo, almacenadas a las mismas temperaturas. De las cepas de 26 cepas L. monocytogenes y 15 de L. innocua aisladas de los 51 productos muestreados, se estudio la sensibilidad a 20 antibióticos para la especie patógeno y de 25 antibióticos para la no patógena, dada la problemática de antibiorresistencias transmitidas por alimentos. Se realizó mediante el método de difusión en placa verificando resultados con el método Epsilon test, ambos recomendados por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio Clínico (CLSI), así como por el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST). Tras el análisis por los tres métodos utilizados en 3 (5,9 %) de las 51 muestras obtuvieron recuentos de L. monocytogenes. Ninguna de las 3 muestras presentó recuentos el día de la compra, una muestra presentó recuentos a lo largo de su periodo de duración mínima almacenadas a 4º y 10 º C, siendo mayor el número de ufc/g a 10 ºC, oscilando los recuentos entre 1 x 10 a 5,9 x 102 ufc/g. En un 19,6 % de las muestras se detectó L. monocytogenes, existiendo en el almacenamiento de los productos a 10ºC, un incremento de ambas especies hasta mitad del periodo de duración mínima, aumentando la presencia de L. monocytogenes hasta el final, mientras que L. innocua permanece constante. Respecto a los métodos utilizado, se observo una mayor detección de L. monocytogenes mediante la normativa UNE‐EN‐ISO 11290‐1, que mediante los otros procedimientos utilizados, siendo el método indicado por la Norma Mexicana NOM‐143‐SSA1‐1995, el que menor detección presento. De los 20 antibióticos estudiados para ambas especies y los 5 supernumerarios estudiados únicamente para L. innocua, se observa una alta sensibilidad al 90% de los antibióticos para las cepas L. monocytogenes; mientras que en el caso de las cepas de L.innocua se comprueba una sensibilidad frente del 84% de los 25. Coincidiendo los antibióticos a los que fue muy sensible la especie patógena, con excepción de la penicilina G y la tetraciclina,frente a los cuales L. innocua se muestra intermedia o resistente. De forma que, L.monocytogenes mostró un 19,2 % de resistencia frente a clindamicina mientras que L. innocua lo fue frente a clindamicina con un 80%, tetraciclina con un 52%. Ambas especies de Listeria mostraron resistencia total a la oxacilina. Marco Ruesca, Noelia; Yangüela Martínez, Javier
Full text
Listeriamonocytogenesenproductoscárnicos LPC.Resistenciaalosantibióticos TrabajoFindeMáster MásterenIniciaciónalaInvestigaciónenCienciayTecnologíadelos Alimentos Curso2011‐2012 NoeliaMarcoRuesca Tutor:JavierYangüelaMartínez
AGRADECIMIENTOS EstetrabajodeinvestigaciónestáfinanciadoporelMinisteriodeEducacióny Ciencia(España)medianteelProyectoConsolider‐Ingenio2010;Carnisenusa(CSD 2007‐00016).También,nuestroagradecimientoalaDiputaciónGeneraldeAragónpor elproyecto:GrupoConsolidadodeInvestigación(ref.:A01/2011)“Análisisyevaluación delaseguridadalimentaria”yFondoSocialEuropeo2007‐210.
RESUMEN...............................................................................................................................1 1.INTRODUCCIÓN..................................................................................................................2 1.1.Listeriaylisteriosis.......................................................................................................2 1.1.1.Taxonomía..........................................................................................................2 1.1.2.Característicasgenerales...................................................................................2 1.1.3.Ecologíamicrobiana...........................................................................................3 1.1.3.1.Temperatura............................................................................................3 1.1.3.2.Activaddeagua........................................................................................4 1.1.3.3.EfectodelpH............................................................................................4 1.1.3.4.Efectodetratamientos............................................................................4 1.1.4.Listeriosis............................................................................................................4 1.1.4.1.Origenytransmisióndelalisteriosis.......................................................5 1.1.4.2.Principalesalimentosimplicados.............................................................5 1.1.4.2.1.Categoría1........................................................................................6 1.1.4.2.2.Categoría2........................................................................................7 1.1.4.2.3.Categoría3:.......................................................................................7 1.1.4.3.Patogenia.................................................................................................7 1.1.4.4.Poblaciónsusceptible..............................................................................8 1.1.4.5.Sintomatologíaytratamiento..................................................................8 1.1.4.6.Epidemiología..........................................................................................9 1.1.4.7.Controldelalisteriosis...........................................................................11 1.1.5.ProcedimientosderecuentoeinvestigacióndeL.monocytogenesen alimentos..............................................................................................................................12 1.1.6.LegislacióndeListeriamonocytogenesrelacionadaconlosalimentos...........12 1.1.7.Antibiorresistencias.........................................................................................13 1.1.7.1.Historia...................................................................................................13 1.1.7.2.Clasificacióndelosantibióticos.............................................................13 1.1.7.3.SensibilidadyresistenciadeListeriasppalosantibióticos...................14 1.1.7.4.ProblemáticadelaresistenciaantibióticadeListeriaspp.....................14 1.1.7.5.Métodosbásicosparaelestudiodelasensibilidadalosantibióticos..15 2.OBJETIVOS........................................................................................................................16 3.MATERIALESYMÉTODOS.................................................................................................17 3.1Materiales...................................................................................................................17
3.1.1.Mediosdecultivoysuplementos....................................................................17 3.1.2.Materialdesechable........................................................................................18 3.1.3.Materialdemetalydevidrio...........................................................................18 3.1.4.Mantenimientodecepas.................................................................................18 3.1.5.Equipos:............................................................................................................18 3.2Métodos......................................................................................................................19 3.2.1Muestrasanalizadas..........................................................................................19 3.2.2.Tomademuestras...........................................................................................20 3.2.3.RecuentoeinvestigacióndeL.monocytogenes..............................................20 3.2.3.1.Mediosdeenriquecimiento...................................................................20 3.2.3.2.EnriquecimientoencaldoFraser...........................................................20 3.2.3.2.1.RecuentosbajosdeL.monocytogenes...........................................20 3.2.3.2.2.InvestigacióndeL.monocytogenes.................................................20 3.2.3.3EnriquecimientoencaldoONE‐Listeria..................................................21 3.2.3.3.1.RecuentodeL.monocytogenes......................................................21 3.2.3.3.2.InvestigaciónL.monocytogenes......................................................21 3.2.3.3EnriquecimientoencaldoEB..................................................................22 3.2.4.RecuentodeplacasdeagarALOA...................................................................22 3.2.5.Identificaciónbioquímica.................................................................................22 3.2.6.MedidadelpH:.................................................................................................23 3.2.7.Medidadelaaw................................................................................................23 3.2.7.1.CalibraciónDecagonCX‐1:medidaaw...................................................23 3.2.8.Antibiogramaotestdesensibilidadalosantimicrobianos.............................24 3.2.8.1.Calibracióndelespectrofotómetro........................................................24 3.2.8.2.CurvadecrecimientodeL.monocytogenes..........................................25 3.2.8.3.Métododedifusiónendisco.................................................................26 3.2.8.3.1.Cepasdelosmicroorganismoscontrolestudiadas.........................26 3.2.8.3.2.CepasListeriaspp.estudiadas........................................................26 3.2.8.3.3.Preparacióndelinóculo...................................................................27 3.2.8.3.4.Estandarizacióndelinóculo.............................................................27 3.2.8.3.5.SiembradelasplacasdeagarMueller‐Hinton................................27 3.2.8.3.6.Colocaciónlosdiscosdeantibióticos..............................................27 3.2.8.3.7.Lecturaderesultados......................................................................28
3.2.8.3.7.MétodoEpsilontest(E‐test)............................................................29 4.RESULTADOS....................................................................................................................30 4.1RecuentoydeteccióndeListeriaspp.enproductoscárnicoscocidosLPC................30 4.1.1RecuentosbajosdeL.monocytogenes.............................................................30 4.1.2DeteccióndeListeriaspp..................................................................................30 4.1.3EvolucióndelapresenciadeListeriaspp.alolargodelperiododeduración mínima.................................................................................................................................31 4.2.PreconfirmaciónyconfirmaciónbioquímicadeListeriaspp.....................................33 4.3.MedidadelpHydelaactividaddeagua...................................................................34 4.3.1.Actividaddeagua.............................................................................................34 4.3.2.MedidadelpHdelenriquecimientoenelmedioEB.......................................36 4.4.Análisisestadísticodelosresultados.........................................................................37 4.4.1.Relacióndelostresprocedimientosdeenriquecimientoenladetecciónde Listeriaspp...........................................................................................................................37 4.4.2Influenciadeltiempodealmacenamientodelproducto.................................39 4.4.3Influenciadelatemperaturadealmacenamientodelproducto......................40 4.4.4.Influenciadelatemperaturayeltiempodealmacenamiento.......................41 4.4.5Relacióndelennegrecimientodelmediodeenriquecimientoconla presenciadeListeriaspp......................................................................................................41 4.5ResultadodelestudiodeantibiorresistenciaalascepasdeListeriaspp...................43 4.5.1.Determinacióndelinóculodesiembraparalarealizacióndelantibiograma.43 4.5.2.Controldecalidaddelascepasdereferencia.................................................44 4.5.3.ResultadosdelosantibiogramasdelascepasdeL.monocytogenesyL. innocua.................................................................................................................................45 4.5.3.1.Métododedifusiónendisco.................................................................45 4.5.3.2.MétododeEpsilon‐test(E‐test).............................................................46 4.5.3.3.SensibilidadoresistenciadelascepasdeL.monocytogenesyL.innocua ..........................................................................................................................................48 5.CONCLUSIONES................................................................................................................50 6.REFERENCIAS....................................................................................................................52
1 RESUMEN SeharealizadoelrecuentoyladeteccióndeListeriamonocytogenesen51productos cárnicoscocidoLPC,compradosenestablecimientodeventaalpormenor.Fueronanalizados, siguiendolanormativaUNE‐EN‐ISO11290‐1,UNE‐EN‐ISO11290‐2,yelmétododecultivo rápidoListeriaPrecisTMvalidadoporlaAFNOR(Oxoid,2010)pararecuentoydeteccióndeL. monocytogenes,ylaNormaMexicanaNOM‐143‐SSA1‐1995únicamenteparaladetección, siguiendoelcriteriodepresenciaoausenciaen25gramos.Losanálisismicrobiológicosse realizaronelmismodíadelacompra,amitaddelperiododeduraciónmínimaalmacenadosa 4ºCY10ºCyfinaldeesteperiodo,almacenadasalasmismastemperaturas. Delascepasde26cepasL.monocytogenesy15deL.innocuaaisladasdelos51 productosmuestreados,seestudiolasensibilidada20antibióticosparalaespeciepatógenoy de25antibióticosparalanopatógena,dadalaproblemáticadeantibiorresistencias transmitidasporalimentos.Serealizomedianteelmétododedifusiónenplacaverificando resultadosconelmétodoEpsilontest,ambosrecomendadosporelInstitutodeEstándares ClínicosydeLaboratorioClínico(CLSI),asícomoporelComitéEuropeodePruebasde SusceptibilidadAntimicrobiana(EUCAST). Traselanálisisporlostresmétodosutilizadosen3(5,9%)delas51muestras obtuvieronrecuentosdeL.monocytogenes.Ningunadelas3muestraspresentórecuentosel díadelacompra,unamuestrapresentórecuentosalolargodesuperiododeduraciónmínima almacenadasa4ºy10ºC,siendomayorelnúmerodeufc/ga10ºC,oscilandolosrecuentos entre1x10a5,9x102ufc/g.Enun19,6%delasmuestrassedetectóL.monocytogenes, existiendoenelalmacenamientodelosproductosa10ºC,unincrementodeambasespecies hastamitaddelperiododeduraciónmínima,aumentandolapresenciadeL.monocytogenes hastaelfinal,mientrasqueL.innocuapermanececonstante.Respectoalosmétodosutilizado, seobservounamayordeteccióndeL.monocytogenesmediantelanormativaUNE‐EN‐ISO 11290‐1,quemediantelosotrosprocedimientosutilizados,siendoelmétodoindicadoporla NormaMexicanaNOM‐143‐SSA1‐1995,elquemenordetecciónpresento. Delos20antibióticosestudiadosparaambasespeciesylos5supernumerarios estudiadosúnicamenteparaL.innocua,seobservaunaaltasensibilidadal90%delos antibióticosparalascepasL.monocytogenes;mientrasqueenelcasodelascepasdeL. innocuasecompruebaunasensibilidadfrentedel84%delos25.Coincidiendolosantibióticosa losquefuemuysensiblelaespeciepatógena,conexcepcióndelapenicilinaGylatetraciclina, frentealoscualesL.innocuasemuestraintermediaoresistente.Deformaque,L. monocytogenesmostróun19,2%deresistenciafrenteaclindamicinamientrasqueL.innocua lofuefrenteaclindamicinaconun80%,tetraciclinaconun52%.AmbasespeciesdeListeria mostraronresistenciatotalalaoxacilina.
8 respectoaalgunosdeestosdeterminantesdevirulencia,estehechonopuedecorrelacionarse conlacapacidadolaincapacidaddelorganismoparaproducirenfermedad. L.monocytogenesesunabacteriaintracelularfacultativa,yaquepuedesobreviviren macrófagoseinvadircélulasnofagocíticascomolascélulasepiteliales,hepatocitosycélulas endoteliales.Lacapacidaddelmicroorganismoparapenetrarenelcitoplasmadelacélula, proliferarydiseminarsealascélulasadyacentesesesencialparalaexpresiónplenadesu potencialpatógeno. Suuniónalacélulahuéspedseproducedebidoalaproteínaintegrina.Unavezenel interior,esfagocitadaporlacélulahuéspedyenelfagolisosomaessometidaaunambiente hostilconpHyferritinabajo,activandounaexotoxina(listeriolisinaO)queescapazdelisarla membranadelfagolisosomaen30minutosyescaparalcitoplasma.LalisteriolisinaOesuna exotoxinahemolíticaycitolíticaqueactúacomounfactorcríticodevirulenciadeL. monocytogenes.Listeriasediseminacélulaacélulasinponerseencontactoconelmedio extracelular,loqueexplicalanecesidaddeunainmunidadmediadaporcélulas(Torresycol., 2005). 1.1.4.4.Poblaciónsusceptible L.monocytogenesesunmicroorganismoqueprovocadañosseveroscontasasbajasde morbilidadperotasasaltasdemortalidadengruposvulnerables(30%),comopersonasconel sistemainmunedeprimido,entrelasqueseincluyenancianos,mujeresembarazadasyrecién nacidos.Elsistemainmunedeestoscolectivosestáamenudodeprimidoyelmicroorganismo patógenoescapaz,unavezingerido,decausarinfeccionesendiversaspartesdelcuerpoyde causarmeningitis,encefalitis,septicemiasyabscesoshepáticos. Ladosisinfectivaesde103–107ufc/g.Ladosisinfectivavariaráenfuncióndetres factores:i)estadoinmunitariodelindividuo,ii)lavirulenciadelacepa,iii)cantidaddeL. monocytogenesenelalimento. Elperiododeincubacióndelaenfermedadpuedeirdesdeunaunohasta11‐70días (ICMSF,2002). 1.1.4.5.Sintomatologíaytratamiento Lossíntomasdeestaenfermedaddetransmisiónalimentariasonvariables,desdeun cuadroleve,quesimulaunagripeconfiebre,doloresmuscularesysintomatología gastrointestinal,hastaunasepsisgrave,sobretodoenedadesextremasdelavida(recién nacidosyancianos)ypacientesinmunodeprimidos,quecausaabortoenembarazas,neumonía ygranulomasdiseminadosenreciénnacidos,meningitisymeningoencefalitis,eincluso septicemiacausandolamuertedelindividuo.Estossonlosprincipalessíntomas,aunquesehan descritootroscomo:sepsisobacteriemiaaisladaenadultos(incluyendogestantes), endocarditissobreválvulanativaoprotésica,infeccionesdeprótesisarteriales,hepatitis, abscesohepático,Peritonitisbacterianaespontánea,peritonitisenpacientescondiálisis peritonealambulatoriacontinua,osteomielitis,artritis,empiema(Ooiycol.,2005).Lasformas clínicasderivadasdelainfecciónporListeriacomprendenlacolonizaciónintestinal asintomática,laGEAautolimitada(noinvasiva)ylaenfermedadinvasora(bacteriemiaprimaria,
9 meningitis,romboencefalitisyabscesocerebral,endocarditisyotrasformasfocales)(Drevetsy Bronze,2008). Esimportantequeeltratamientosealomásprecozposible,administrandounaserie deantibióticos.Debidoaquesetratadeunaenfermedadrelativamenteraraenhumanos,no hayestudiosprospectivosycontroladosqueestablezcanelmejortratamientoantibiótico. Actualmenteseconsideraquelasmejoresopcionessonlapenicilinaolaampicilina,solaso asociadasagentamicina.Elmásutilizadoeslaasociacióndeampicilinaygentamicina.La combinacióndetrimetoprimysulfametoxazolsehautilizadoconéxitoenpacientesalérgicosa penicilinas,considerándoseenlaactualidadlaterapiaalternativaenestacircunstancia.La duraciónapropiadadeltratamientonoestámuyclara.Engeneraldossemanasparecenser suficientesenbacteriemiasmientrasqueenmeningitissedeberíanutilizarciclosmáslargos. UnestudioretrospectivoefectuadoenelServiciodeMicrobiologíadelHospital UniversitarioMiguelServetdeZaragozarealizadoentreenerode1997yoctubrede2010para eltratamientodeL.monocytogenes,muestraquede28casos(21adultosy7neonatos),enlos cualesseutilizócomotratamientodeelecciónampicilina,asociadogeneralmentea aminoglucósidos(gentamicina),endosisaltasfuemuyefectivo,probandoquelaasociaciónde ambosantibióticosejerceunefectosinérgico(Palaciánycol.,2011). 1.1.4.6.Epidemiología Laincidenciaanualdelalisteriosishumanafluctúade0,1a11casospor1.000.000de habitantes(Notermansetal.,1998),conunos0,3‐7,5casospormillóndepersonasenEuropay de3casospormillóndepersonasenAustralia.EnEE.UU.,losdatosdeCDC(Centroparael ControlyPrevencióndeEnfermedades)generadosatravésdeFoodNet(ReddeControlde EnfermedadesAlimentarias)tambiénreflejaronunaincidenciade5casospormillónde personasen1998.Sinembargo,datosmásrecientesdeFoodNetdelaño2003conrelaciónala incidenciadeenfermedadesymortalidadpormicroorganismosdeorigenalimentarioindican unareduccióndelnúmerodecasosdelisteriosisa3,3casospormillóndehabitantes. Actualmente1,12casosporcada100.000habitantesenEspaña,segúnelúltimoinforme(EFSA, 2012). Alolargodelosañossehandescritodiferentescasosdelisteriosisentodoelmundo, Seconsideraunaenfermedademergente,siendoelpanelsobrepeligrosbiológicosBIOHAZen 2007(EFSA,2007),quienconcluyoquedespuésdeldescensogeneralizadoquesedioenla décadade1990,desdeelaño2000loscasosdelisteriosishanaumentadoenEuropa. Marcos(2007)citaqueenEspañaen2005,elnúmerodecasosdebidosaL. monocytogenesfuede69segúnrecogeelSistemadeInformaciónMicrobiológicaEspañol(CNE 2005)yquelacarnefueelalimentoprincipalmenteimplicado. EnelúltimoinformedelaEFSA(2012),semuestraloscasosdelisteriosisconfirmados entre2005y2010(Tabla3).
10 Tabla3:CasosdelisteriosisconfirmadosenEspañayenlaUniónEuropea(UE)enlosúltimosaños AñoCasosEspaña CasosUE 200568 1591 200678 1581 200781 1425 200888 1654 2009121 1601 2010129 1614 Comosepuedeobservarseestáproduciendounaumentoligeroyprogresivodelos casosdelisteriosistantoenEspañacomoenlasumadetodoslospaísesdelaEU. Analizandootrosdatospublicadosporla(EFSA,2012)sepuedeverquelosproductos cárnicosfueronlosquemáscasospositivosdeL.monocytogenesobtuvieron,enmayormedida loselaboradosconcarnedecerdoybovino(32%),seguidodepescadoyproductosdelmar (29%),alimentosLPC(19%),carnedeave(13%)yotros),productoslácteos(12%),vegetales (10%),tenidoporcentajesmuchosmenoreslosquesos(1%). Dadalagrandiversidaddealimentosimplicados,yelcarácterdeL.monocytogenesde colonizarcualquierlugar,enlasúltimasdécadassehanidoproduciendodiferentesbrotes, repartidosportodoelmundo,comosemuestraenlaTabla4. Entrelosúltimosbrotesdelisteriosisocurridosdestacanporsuimportanciaelquetuvo lugarenCanadáen2008.Elbroteseoriginóenlaslíneas8y9deproduccióndedeli‐meatsde lafábricadeMapleLeafFoods.Secreequealrededorde220productospresentaron contaminacióndeL.monocytogenesdandolugara57casosdelisteriosisy23decesos. MásrecientequeelanteriorbrotehasidoelquetuvolugarenEE.UU.enjuliode2011. Elbroteseoriginóporelconsumodemelonescantaloupecontaminadosprocedentesdela compañíaJensenFarmsdeColorado.Secreequefueproducidopormalascondicionesenel envasado.Seprodujeron123casosrepartidosen26estadosdeEE.UU.,deloscuales25 fallecieron.
11 Tabla4:BrotesL.monocytogenesyalimentosimplicados AñoLugarNºcasosMuertesAlimento 1979Boston205Ensaladasy/olechepasteurizada 1980NuevaZelanda299FrutosdelMar 1981Canadá417Ensaladadecol 1983Massachusetts4914Lechepasteurizada 1985California14248Quesotipomexicano 1983/87Suiza12231QuesoVacherin(Montd´Or) 1986/87Philadelphia3616Helado/Salami 1987/89ReinoUnido>300>90Pates 1992Francia27985Lenguadecerdocongelatina 1994USA450BatidodeChocolate 1995Francia334QuesoBrie 1997Italia15940Harinademaíz 1998USA10020Salchichaalemana 1999Finlandia256Mantequillapasteurizada 2000Francia>33>10? 2002USA467Comidaturcapreparada 2007Noruega215Quesofresco 2008Canadá5723Productoscárnicos 2009Austria/Alemania>146Quesofresco 2011EE.UU12325Melones 1.1.4.7.Controldelalisteriosis Laprevencióndelalisteriosishumanacomienzaenlagranjaycontinúadurantetodoel procesodeelaboracióndelproductohastaqueesingeridoporelconsumidor.Laaplicaciónde medidasdecontrolpuedereducirelriesgodelalisteriosistransmitidaporlosalimentos. Podemosactuarendiferentespuntosdelacadenaalimentariaparalograrsucontrol. Enlasgranjastenemosqueevitarlascondicionesmedioambientalesquefavorezcansu presencia(conservacióndelensilado,higienedelagranja,etc.).Existeunacorrelaciónentrela alimentaciónconensiladoylalisteriosisenanimales. EnlaindustriaalimentariaesimportantedesarrollarunasBPHasícomolaimplantación deunsistemaAPPCCparaeliminarlapresenciadeL.monocytogenesyevitarlacontaminación demateriasprimas. Enestablecimientodeventaalpormenor,esnecesariosepararlosalimentoscrudosde origenanimaldelosalimentosLPC.Limpiarydesinfectarelmaterialqueseusaparaloncheary partirlosalimentos.Mantenerunatemperaturaadecuadadealmacenamiento(Tª<4ºC)y controlareldelosproductos.
12 Laprevenciónporpartedelpúblico,nosllevaaconsumirloantesposiblelosproductos perecederos.Asegurarquelatemperaturadelfrigoríficoes<5ºCyporlotantaladelos alimentosquecontiene.Cerciorarsequelatemperaturadecocinadoescorrecta.Efectuaruna correctahigienedemanos.Norecalentarlosalimentos.Separarlascarnesnococinadasdelas verdurasfrescas,alimentoscocinadosyalimentosLPC. 1.1.5.ProcedimientosderecuentoeinvestigacióndeL.monocytogenesenalimentos ExistenmétodosconvencionalesderecuentoeinvestigaciónparaelaislamientodeL. monocytogenesapartirdealimentos,queestándentrodelareglamentacióninternacional comosonlaAdministracióndeDrogasyAlimentos(FDA),laAsociaciónOficialdeQuímicos Analistas(AOAC),laOrganizaciónInternacionaldeEstándares(ISO11290‐1y11290‐2),el MétododelServiciodeInspecciónySeguridadAlimentariadelDpto.deAgriculturadelos EE.UU.(FSIS‐USDA)ylanormativafrancesa(NFV08‐55yXPV08‐062).Dependiendodela naturalezadelproducto,unmétodoparticularpuedesermásadecuadoqueotro,siendoel métododelaISO11920(partes1y2)eldeeleccióngeneral,losmétodosdelaFDAyAOAClos recomendadosparaelanálisisdelecheyproductoslácteos,ylametodologíadelUSDA‐FSIS paralacarnerojaydeave(crudaoLPC),huevosyderivadosymuestrasambientales. 1.1.6.LegislacióndeListeriamonocytogenesrelacionadaconlosalimentos LalegislaciónquecompeteaL.monocytogenesenalimentosvieneestablecidaenel Reglamento(CE)nº2073/2005delaComisiónde15denoviembrede2005relativoalos criteriosmicrobiológicosaplicablesalosproductosalimenticios(Anónimo,2005),enlaquese establecenloscriteriosdeseguridadalimentariaquemarcanlaaceptabilidaddeunproductoo lotedeproductos.Tambiénsecitancriteriosdehigienedelosprocesosdeproducciónde alimentoscomolosvaloresdecontaminaciónporencimadeloscuales,debemosdetomar medidascorrectoras.Tambiéncitaquesedebeestablecerelmuestreodezonasdetrabajoy equipos,cuandoseanecesarioparagarantizarelcumplimientodeloscriteriosysiemprequese produzcanalimentosLPCquefavorezcanelcrecimientodeListeria. EnelcapítuloIseestablecenloscriteriosdeseguridadalimentariadeListeria monocytogenessegúnlacategoríadealimento: AlimentosLPCdestinadosalactantesyalimentosLPCdestinadoausosmédicos especiales.Enestosalimentossefijaausenciaen25gdealimentocomercializadosdurantesu periododeduraciónmínimo(n=10,c=0).Enesteapartadotendremosquetenerencuentaque losproductosquehayanrecibidotratamientotérmicouotroprocesoeficazparaeliminarL. monocytogenes,ycuandolarecontaminaciónnoesposibletraseltratamiento,noseexige realizaranálisisregulares. AlimentosLPCquepuedenfavorecereldesarrollodeL.monocytogenes,queno seandestinadosalactantesniusosmédicosespeciales.Enestecasosefijanunoslímitesde 100ufc/genproductoscomercializadosdurantesuperiododeduraciónmínimoyausenciaen 25gdealimentoantesdequehayadejadoelcontrolinmediatodeloperadordelaempresa alimentariaquelohaproducido(n=5,c=0,m=100ufc/g,M=100ufc/g).
13 AlimentosLPCquenopuedenfavorecereldesarrollodeL.monocytogenes,no destinadosalactantesniausosmédicosespeciales.Nosindica100ufc/genproductos comercializadosdurantesuperiododeduraciónmínimo(n=5,c=0,m=100ufc/gM=100ufc/g). AestacategoríapertenecenlosproductossonpH≤4oaw≤0,92,productosconpH≤5yaw≤ 0,94,productosconunavidaútil<5días,cualquierotroproducto,siemprequesejustifique científicamente. Siendo:n,númerodeunidadesdequesecomponelamuestra;c,númerodeunidades delamuestracuyonúmerodebacteriaspodrásituarseentremyM;m,valorumbraldel númerodebacterias;M,valorlímitedelnúmerodebacterias. OtrospaísestieneunalegislaciónmuchomásexigenterespectoaL.monocytogenes, comoeselcasodeEEUU,Japón,Canadáqueestablecetoleranciacero,paraeste microorganismo. 1.1.7.Antibiorresistencias 1.1.7.1.Historia Elorigendelapalabraantibióticoprovienedelgriegoantiquesignificacontra,ybios quesignificavida.En1942,Waksmandefinióantibióticocomo“sustanciaquímicaderivadao producidapormicroorganismosquetienenlacapacidad,abajasconcentraciones,deinhibirel desarrolloodestruirbacteriasuotrosmicroorganismos”. Desdelaantigüedadelserhumanohautilizadocompuestosorgánicosparael tratamientodeenfermedadesinfecciosas,comoelextractodealgunasplantasyhongosde algunosquesos.EnelsigloXIX,elprestigiosofrancésLouisPasteurdescubrióquealgunas bacteriassaprofitaspodíandestruirlabacteriadelántrax.En1900,elbacteriólogoalemán RudolfvonEmmerichaislóunasustanciaquepodíadestruirlosmicrobioscausantesdelcólera yladifteriaenuntubodeensayo,peronopudoaplicarloeneltratamientodelas enfermedades.Sepuededecirquelahistoriadelosantibióticos,comotal,comienzaen1928, cuandoelcientíficobritánicoAlexanderFlemingdescubriólapenicilina.Nohayqueolvidarla aportacióndePaulEhrlichacomienzosdelsigloXXconelsalvarsánparaeltratamientodela sífilis(1909)talcomoloreflejaeldocumentodeUsodeAntimicrobianosenanimalesde consumo(FAO/OMS,2004). Eltérmino“agenteantimicrobiano”englobatantoalosantibióticosnaturalescomoa lossintéticos,ademásdeasustanciasrelacionadasconlosantibióticos(antivirales, antimicóticos,agentesquimioterápicos,etc.),porloqueutilizaremoslostérminos “antimicrobiano”y“antibiótico”indistintamente. 1.1.7.2.Clasificacióndelosantibióticos Seconocenmásde15familiasdiferentesdeantibióticos,condistintaestructura químicaymecanismodeacción.Porsumododeacciónsobrelosmicroorganismos,podemos dividirlosendosgrandesgrupos:I)bactericidasquevanaejercerunaacciónletaleirreversible sobreelmicroorganismoyll)bacteriostáticosqueinhibenelcrecimientoperonomatanal microorganismo.
14 Comomuestraeldocumento“ThebacterialChallenger:timetoreact”,realizadoporel CentroEuropeodePrevenciónyControldeEnfermedades(ECDC)encolaboraciónconla AgenciaEuropeadelMedicamento(EMEA),eldesarrollodenuevasfamiliasdeantimicrobianos desde1950a1960(cefalosporinasycarbapenemas),supusoungranavanceenmedicina humana,yaqueseconsiguieroncontrolarenfermedadeshastaentoncesincurables,ydeesta formafavorecerlaesperanzadevida.Trasesteéxitoenmedicinahumana,secomenzóa utilizareneltratamientodeenfermedadesdeanimalesyplantas,einclusoenindustria petroquímicaoindustriaalimentaria. Actualmenteexistenvariasfamiliasogruposdeantibióticos,entrelasquese encuentranlosbetalactámicos,penicilinas,cefalosporinas,carbapenemas,monobactámicos, aminoglucósidos,quinolonas,macrólidos,glicopéptidos,clindamicinas,sulfonamidasy trimetoprin,metronidazol,tetraciclinas,rifampicinas,cloranfenicol,fosfomicinay nitrofurantoina. 1.1.7.3.SensibilidadyresistenciadeListeriasppalosantibióticos Enelinformesobre“Listeriaylisteriosis”,publicadoporelSEIMC(1999)seseñalaque elpatróndesensibilidadalosantibióticoshapermanecidoestableconelpasodelosaños.Este microorganismoessensibleaunaampliagamadeantibióticoscomopenicilina,ampicilina, gentamicina,eritromicina,tetraciclinas,rifampicina,cotrimoxazolyvancomicina.Presentan unapobreactividadlasfluoroquinolonasactualesylascefalosporinas,especialmentelasde terceraycuartageneracióncomocefotaximaycefepima. Laresistenciaalosantibióticos(RAM),fuedefinidaporFAO/OIE/OMS(2008)comola capacidaddeunmicroorganismodemultiplicarseopersistirenpresenciadeunamayor cantidaddeagenteantimicrobianoconrelaciónalhomólogosusceptibledelamismaespecie. CasitodaslascepasdeL.monocytogenessonresistentesafosfomicina,oxacilinay linconsamidas(ComitédeL`AntibiogrammedelaSociétéFrancaisedeMicrobiologie,CASFM, 2010).Sehandescritoresistenciasamacrólidosyatetraciclinasenalgunosaislamientos,que suelenestarcodificadasporplásmidos ElInstitutoPasteurdeParísylaAgenceFrancaisedeSécuritédesAliments(AFSSA)han estudiadolasensibilidadantibióticadecepasdeL.monocytogenesdeorigenalimentarioy ambientalaisladasdurante10años(1996‐2006).Delasdoscientascepasaisladas,cuatro presentabanfenómenosderesistenciaadquirida,dosdeellasresistentesaeritromicinaydosa tetraciclinayminociclina. 1.1.7.4.ProblemáticadelaresistenciaantibióticadeListeriaspp Esbienconocidaladifusiónderesistenciasatravésdelaterapéuticahumanayanimal, perodesconocemosenquémedidalosalimentosdeorigenanimaldestinadosalconsumo humanosonportadoresderesistencias. Elusocrecientedeantibióticosparalasaludhumanayanimal,asícomoparala producciónganadera,hasidoacompañadodeldesarrollodemecanismosdeevasiónporparte demicroorganismosanteriormentesensibles,generadoungrannúmerodecepasmicrobianas resistentesaantibióticosdeusocomún.Deestemodo,desdelosaños50hastalaactualidad nohancesadodecrecerlasdescripcionesdemicroorganismosquehanadquiridoalgunaforma
15 deresistenciacontraunoomásantibióticos.Inicialmentesemonitorizólaevolucióndelas resistenciasaantimicrobianosenlosaislamientosoriginadosenlaclínicahumanay posteriormentesediogranimportanciaalanecesidaddelamonitorizaciónenlosaislamientos deorigenanimal. Sehaprestadopocaatenciónalapresenciadegérmenesresistentesenlosalimentos destinadosalconsumohumano,especialmenteenlosdeorigenanimalyquepresumiblemente puedenserportadoresderesistencias.(BalsalobreyHernández‐Godoy,2004). Losbeneficiosaportadosporelusodelosantibióticossevieronamenazadosporla apariciónypropagacióndemicroorganismosresistentesalosagentesantimicrobianos.Enel documento“Lacontencióndelaresistenciaalosantimicrobianos”difundidoporla OrganizaciónMundialdelaSalud(OMS,2005),seexplicaquelaaparicióndelaresistenciaalos antimicrobianosesunfenómenonatural,quesurgecomoresultadodelusodelosmismos, peroqueestáadquiriendounritmoacelerado,debidoalautilizacióninapropiadadeestos medicamentos. Sehandetectadodostiposderesistencia,porunladolaresistencianaturalointrínseca quepuedepresentarsemediantelainterferenciadeenzimasinactivadoras,comolas mutacionesespontáneasengenesconstitutivosdelasbacterias;yporotroladolaresistencia adquirida,quepuededarsemediantemecanismosderesistenciacromosomialeso extracromosomiales,mediadosprincipalmenteporplásmidos. Debidoatodoesto,enelaño2001,laOMSlanzólaprimeraestrategiamundialde luchacontralosproblemascausadosporlaapariciónypropagacióndelaresistenciaalos antibióticos,conocidacomo“EstrategiamundialOMSdecontencióndelaresistenciaalos antimicrobianos”,reconociéndolocomounproblemaaescalamundialyconintervencionesen todoslospuntos,desdeconsumidores,farmacéuticos,médicosyveterinarios. 1.1.7.5.Métodosbásicosparaelestudiodelasensibilidadalosantibióticos Elestudiodelasensibilidadbacterianaalosantibióticosesunadelasfuncionesmás importantesdeloslaboratoriosdemicrobiología.Losmétodosparaesteestudiopueden clasificarseenmétodoscuantitativosycualitativos.Losmétodoscuantitativossonaquellos procedimientosquepermitendeterminarlaconcentraciónmínimainhibitoria(CMI)yla concentraciónmínimabactericida(CMB). SedefinelaCMIcomolamínimaconcentracióndeantibióticoqueenunperíodode tiempopredeterminado,escapazdeinhibirelcrecimientoinvitrodeuninóculobacteriano previamenteestandarizado(concentraciónconocidadegérmenes).SedefinecomoCMBla mínimaconcentracióndeunantibióticoqueenunperíododetiempopredeterminado,es capazdeinducirlamuerteinvitrodel99,9%deunapoblaciónbacterianapreviamente estandarizada.LadeterminacióndelaCMIpuederealizarsepormicroomacrodiluciónen caldo,diluciónenagarotirasconungradientedeantibiótico. Losmétodoscualitativos(difusiónendisco)sonaquellosprocedimientosquepermiten clasificaraunmicroorganismocomosensibleoresistente.Esteesunodelosmétodosmás utilizadosenlaprácticadiaria.
16 2.OBJETIVOS 1. LaexposicióndelossereshumanosaListeriamonocytogenesseproduce fundamentalmenteatravésdelosalimentos.Portanto,esesencialconocerla prevalenciayelniveldecontaminacióndeListeriamonocytogenesenproductos cárnicostratadostérmicamentelistosparaelconsumoadquiridosenelcomercioalpor menor.Paraello: a. SeharealizadorecuentodeL.monocytogenes/g. b. SeharealizadodeteccióndeL.monocytogenes/25g. c. Sehanutilizadodiferentesmediosdeenriquecimiento(caldoFraser,caldo ONE‐ListeriaycaldoEB). 2. ElpH,laactividaddeaguaylatemperaturadealmacenamientodelproductolistopara elconsumoinfluyensignificativamenteenelcrecimientodeListeriamonocytogenes. Demodoque: a. SehamedidoelpHenelmediodeenriquecimientoEB,mediantetiras indicadoras,endiferentesfasesdelanálisis. b. Sehamedidolaactividaddeaguaenlosdistintosmomentosdelanálisis. c. Losparámetrosanterioressehanmedidoeldíadelacompra,amitadyfinal delperiododeduraciónmínima,enalmacenamientoa4ºCy10ºC. 3. Laenfermedadseconsiderapococomún,amenudograveylamortalidadeselevada, deahí,queseconsideredegranimportanciaelconocimientodelapresentaciónde antibioticorresistenciasenlascepasdeListeriaspp.Porello: a. Seestudialaresistenciamedianteelprocedimientodisco‐placaa20 antibióticosparaL.monocytogenesyde25antibióticosparaL.innocua. b. Enloscasosenlosqueexistadificultaddeinterpretacióndelhalodeinhibición porsuproximidadaloslímites,sehaconfirmadomedianteelprocedimiento Epsilon‐test(E‐test).
17 3.MATERIALESYMÉTODOS 3.1Materiales 3.1.1.Mediosdecultivoysuplementos CaldoFraser:FraserBrothBase(CM0895),Oxoid. o SuplementoFraser½:HalfFraserSelectiveSupplement(SR0166E),Oxoid. o SuplementoFraser1/1:FraserSelectiveSupplement(SR0156E),Oxoid. CaldoONE‐Listeria:OneBroth–Listeriabase(CM1066),Oxoid. o SuplementoOne:OneBroth‐ListeriaSelectiveSupplement(SR0234E),Oxoid. CaldoEB(Anónimo,1995). o TSB:TryptoneSoyaBroth(CM0129),Oxoid. o Piruvatodesodio:Pyruvicacidsodiumsalt(1.06619.0050),Merck. o Extractodelevadura:Yeastextractgranulatedformicrobiology, (1.03753.0500),Merck. o Ácidonalidixico(988780),Sigma‐Aldrich. o Cicloheximida(441894C),VWR. o Hidroclorurodeacriflavina(A‐8251),Sigma‐Aldrich. CaldoBHI:BrainHeartInfusionCM1135,Oxoid. AgarALOA:ChromogenicListeriaAgar(ISO)Base(CM1084),Oxoid. o BrillanceTMListeriaDifferentialSupplement(SR0228E),Oxoid. o OCLA(ISO)SelectiveSupplement(SR0226E),Oxoid. AgarRapid:RAPID´L.monoAgar(3555294),Bio‐Rad. AgarTSA:TryptoneSoyaAgar(CM0131),Oxoid. AgarMueller‐Hinton(CM0337),Oxoid. Aguadepeptonatamponada:Peptonewater(buffered),acc.toISO6579 (1.07228.0500),Merck. PCA:PlateCountAgar(CM0325),Oxoid. L(+)‐Ramnosamonohidratada(27386),VWR. D‐Xilosa(0181‐13‐6),Difcolaboratories. D‐Manitol(142067.1210),Panreac. Sangrecaballo:Sangredesfibrinadadecaballo(SR0050C),Oxoid. GaleriaAPIListeria(10300),Biomerieux. Discosdeantibióticos:Biodisc,Oxoid.
24 dicromatopotásico(K2Cr2O7),unatercerasolucióndesulfatodepotasio(K2SO4)yporultimo H2Odestilada.Decadaunadeellas,serealizatresmedidasparacomprobarquelasaw esperadas(NaCl:0,753,K2Cr2O7:0,980yK2SO4:0,973)secorrespondenconlosvaloresde medidadelequipo. Deformaque,talcomoseobservaenlaTabla6,traslas3replicasdecadaunadelas soluciones,tenemosunadesviaciónestándarmuypequeña,porloqueelequiposeconsidera correctamentecalibrado. Tabla6:Lectura(media±desviaciónestándar)delospatronesdecalibracióndelDecagonCX‐1. H20d (1.000) K2Cr2O7 (0,980) K2SO4 (0,973) NaCl (0,753) 1,0070,9950,9900,752 1,0070,9920,9840,767 1,0130,9890,9860,765 MEDIA1,0090,9920,9870,761 DS0,00346410,0030,003055050,008144528 Paraasegurarnoselbuenfuncionamientodelequipoalolargodeltiempodetrabajo, cadaunodelosdíasdetomademuestras,serealizalamedidadelassolucionespatrónpara comprobarelcorrectofuncionamientodelaparatoduranteeltiempodeestudio(Tabla7). Tabla7:Lectura(media±desviaciónestándar)delassolucionespatrónduranteeltiempodeestudio. NaCl(0,753)K2SO4(0,973)K2Cr2O7(0,98) MEDIA0,7570,9840,992 DS0,0050,0050,005 3.2.8.Antibiogramaotestdesensibilidadalosantimicrobianos 3.2.8.1.Calibracióndelespectrofotómetro SehallevadoacabolacalibracióndelespectrofotómetroSpectronic20paraajustar conlamayorexactitudposible,lasindicacionesdemedidadelinstrumento,conlosvaloresque hademedir.Deformaque,talcomoindicalaDecisióndelacomisióndel12deagostode2002 porlaqueseaplicalaDirectiva96/23/CEdelConsejoencuantoalfuncionamientodelos métodosanalíticosylainterpretacióndelosresultados(punto3.1.1.5Curvasdecalibración), sehanrealizadocincomedicionesdetransmitanciadecincoconcentracionesdeunasolución decromatopotásico(CrO4K2)enhidróxidopotásico(KOH)0,5N.Deestemodosecumpleel requisitodeunalecturamínimadecinconivelesdeconcentraciónquenosindicalaDirectiva paralaconstruccióndelacurva(Figura2). Elintervalodetrabajodelacurvaesde0%a100%detransmitancia,peroelfabricante delaparatorecomiendatrabajarentre20%y80%,yaquesinolaslecturaspodrían distorsionarse.
25 Calibración Spectronic 20 0 10 20 30 40 50 60 70 01020304050 mg/l Transmitancia Transmitancia Lineal (Transmitancia) Figura2:Representacióngráficadelaconcentracióndelassolucionespatrónylalecturade transmitanciaobtenidaconcadaunadeellas. Trastrazarlalíneadetendencia,laecuacióndelarectaobtenidaesy=‐1,5788x+67,89, conuncoeficientedecorrelacióndelosdatosde0,9233.Deformaquepodemosconsiderar quelacalibracióndelespectrofotómetroescorrecta. 3.2.8.2.CurvadecrecimientodeL.monocytogenes ConelfindepoderajustarlaconcentracióndeL.monocytogenesaunvalorconocido, seharealizadounacurvadecrecimiento.Paraellosehapreparadounaemulsióndeunacepa deL.monocytogenesaisladadealimentoenmedioBHIysehanrealizado15medidasde transmitanciadurantesuincubacióna37ºCconintervalosde5‐15minutos.Alavezquese realizabanlasmedidas,sehasembrandoenPCAapartirdelasdilucionesdecimales‐6,‐7y‐8 porhomogeneizaciónenmasa.Traslaincubacióndelasplacasdurante24ha37ºCyla posteriorlecturadelosrecuentossecalculaellogaritmodelapoblaciónquecorrespondecon cadaporcentajedetransmitancia.Deestemodoseconstruyelacurvadecrecimiento, representandoelporcentajedetransmitanciaalcanzadoparacadamedidafrenteallogUFC/ml obtenidoenelrecuento(Figura3). LaconcentraciónaproximadadeL.monocytogenesinicialrequeridaesde2‐5x108 ufc/ml,quesecorrespondeconloslogaritmos8,3‐8,7. SirepresentamoselporcentajedetransmitanciaenelejedeabscisasyellogUFC/ml enelejedecoordenadas,laecuacióndelarectaobtenidaesy=‐54,245x+521,16.Alsustituirel valorxporellogUFC/mlbuscado(8,3‐8,7),obtenemosunatransmitanciade50%y71% respectivamente,rangoquenosvaaasegurarqueenlosensayosobtengamosconcentraciones deL.monocytogenesde2‐5x108UFC/ml. EnelcasodeL.innocuanoseharealizadounacurvadecrecimientoperoseha comprobadoqueajustandolatransmitanciadelcrecimientodeBHIa61%mediante3réplicas, seobtienenrecuentosenPCAde2‐5x108UFC/ml.
26 Curva de crecimiento y = -0,0171x + 9,5283 R 2 = 0,9261 8,10 8,20 8,30 8,40 8,50 8,60 8,70 8,80 8,90 0 102030405060708090100 % Transmitancia Log UFC/ml Figura3:CurvadecrecimientorealizadaparaL.monocytogenes. 3.2.8.3.Métododedifusiónendisco Setratadeunmétodocualitativoysehallevadoacabosiguiendoelmétodode referenciaparadifusiónendiscorecomendadoporelInstitutodeEstándaresClínicosyde LaboratorioClínico(CLSI)yelComitédelAntibiogramadelaSociedadFrancesade Microbiología(CA‐SFM),asícomoporelComitéEuropeodePruebasdeSusceptibilidad Antimicrobiana(EUCAST),indicadoparabacteriasaerobiasnoexigentes. 3.2.8.3.1.Cepasdelosmicroorganismoscontrolestudiadas Comocontroldecalidad,porrecomendacióndelCLSI(2006),paraevaluarelmediode cultivoMueller‐Hintoneneltestdesensibilidadaantimicrobianos,bienporelmétodoE‐testo porlatécnicadedifusiónendiscoparabacteriasGram+,sehanutilizadocuatrocepasde referencia: ‐EscherichiacoliATTCC25922®:Beta‐lactamasanegativa. ‐StaphylococcusaureusATTCC25923®:Beta‐lactamasanegativa.Parademostrarla calidaddelmétodocuandoserealizasobrebacteriasGram+. ‐PseudomonasaeruginosaATTCC27853®:paragarantizaqueelcontenidodecationes yelpHseansatisfactorios,enparticularparaaminoglucósidos. ‐EnterococcusfaecalisATTCC29212®:susceptibleaampicilina,vancomicinayanieves altosdeaminoglucósidos. 3.2.8.3.2.CepasListeriaspp.estudiadas Paralarealizacióndelestudiodeantibiorresistenciasehanutilizado51cepasde Listeriaspp.,26identificadascomoaL.monocytogenesy25comoL.innocua,aisladas previamentedediferentesgruposalimentos(Tabla8)yconservadasencriovialesen congelaciónaunatemperaturade‐80ºC.
27 Tabla8:CepasListeriaspp.aisladasdelosproductoscárnicosLPCenlasquesehaestudiadola antibiorresistencia. GrupoAlimento Especie(nº)Jamón cerdoMortadelaChópedJamónpavoSalchichasOtrosTotal L.monocytogenes 164 626 L.innocua94 2 3 725 3.2.8.3.3.Preparacióndelinóculo Sehatomadounabolitadelcriovialdecadaunadelascepasdeidentificadas,en condicionesdeesterilidad,yseharesuspendidoentubosdeensayocon5mldecaldoBHI previamenteesterilizado.Sehomogeneizaenrotatubosyseintroduceenbañoconagitacióna 37ºCdurante12horas.Posteriormentesehomogenizanlostubosysetransfiereunasaa nuevotubocon12mldecaldoBHI,sehomogeneizaysellevaaestufadeincubacióna37ºC durantetodalanoche;almismotiemposeaíslamediantesiembraporagotamientoenTSA suplementadoconun0,6%deextractodelevadurayseincubanlasplacasdurante24ha 37ºC,paracomprobarquehaycultivopurodelmicroorganismo. 3.2.8.3.4.Estandarizacióndelinóculo Traslas12horasdeincubacióndelostubosde12mldeBHI,seprocedealajustedesu transmitanciaentubosdeSpectronicavaloresaproximadosde61%queaseguraobtener recuentosentre2‐5x108UFC/ml.Paracomprobarqueelajustehasidocorrecto,serealiza recuentosdelostubosdeSpectronicenPCAmediantehomogeneizaciónenmasade1mldel inóculodelasdiluciones‐6y‐7enaguadepeptonaal0,1%.Lasplacasseincubandurante24 horasa37ºC. 3.2.8.3.5.SiembradelasplacasdeagarMueller‐Hinton Trashaberajustadolatransmitanciadelacepa,serealizaunadilucióndecimalenagua depeptonaal0,1%,demodoqueseobtieneunaconcentracióndeaproximadamente2‐5x107 UFC/mlparacontaminarlasplacasdeMueller‐Hinton.Conayudadeunhisopoempapadoenel tubodedilución,sesiembranlasplacasrealizandoestríasmuypróximasalolargodetodala superficiedelaplaca.Estosellevaacabohastatresvecesgirandolaplaca60ºcadavez,de formaquetodalasuperficiequedecubierta. 3.2.8.3.6.Colocaciónlosdiscosdeantibióticos. Trashabersembradolasplacassecolocanlosdiscosdeantibióticosconayudadeun dispensadormulticanal(4o3discosporplaca).EnlaTabla9semuestranlos20antibióticos estudiadosparaL.monocytogenesyL.innocuaademásdelos5supernumerariostestadospara L.innocua,yaquesegúnlosautores,existendiferenciasenlasusceptibilidadaciertos antibióticosparalasdosespeciesdeListeria,locualesmotivodepreocupacióndadoqueL. innocuapodríatransferirsusdeterminantesderesistenciaalaespeciepatógena(Abuínycol., 1994;GeornarasyHoly,2001;Yücelycol.,2005).Acontinuaciónseincubanlasplacasdurante 24horasa37ºC
28 Tabla9:DiscosantibióticosestudiadosparaconlascepasL.monocytogenesyL.innocua. 3.2.8.3.7.Lecturaderesultados. Traslas24horasdeincubacióndelasplacasserealizalalecturadelosrecuentosen PCAparacomprobarquelosporcentajesdetransmitanciasecorrespondenconlas concentracionesesperadasde2‐5x108UFC/ml,asícomodeloshalosdeinhibicióndelas placasdeagarMueller‐Hinton. Paraladeterminacióndelaresistenciaosensibilidaddelascepasacadaantibiótico,se mideeldiámetrodelhalodeinhibiciónconunaregla,comprobandoquelaplacahatenidoun correctocrecimientobacteriano.Elresultadoescualitativoyseexpresacomosensible, intermediaoresistente,dependiendodelamedidadelhalo,comomuestralaFigura4.Si aparecencoloniasdentrodelhalodeinhibiciónpuedentratarsedemutantesresistentes, contaminaciones,opoblacionesheterogéneas. AntibióticoCarga(µg) Denominación Amoxicilina‐Ác.Clavulánico30AMC;30µg Ampicilina10AMP;10µg Ciprofloxacino5CIP;5µg Clindamicina2DA;2µg Claritromicina15CLR;15µg Cloranfenicol30C;30µg Gentamicina10CN;10µg Imipenem10IPM;10µg Levofloxacino5LEV;5µg Linezolid30LZD;30µg Meropenem10MEM;10µg Moxifloxacino5MXF;5µg Oxacilina1OX;1µg PenicilinaG10P;10µg Rifampicina30RD;30µg Sulfametoxazol‐trimetoprim25SXT;25µg Teicoplanina30TEC;30µg Tetraciclina30TE;30µg Tigeciclina15TGC;15µg Vancomicina30VA;30µg Estreptomicina*10S;10µg Eritromicina*15E;15µg Minociclina*30MH;30µg Sulfametoxazol*25RL;25µg Trimetoprim*5W;5µg *AntibióticossupernumerariosparaL.innocua.
29 Figura4:MedidahaloinhibiciónfrentealantibióticoenlasplacasdeagarMueller‐Hinton. 3.2.8.3.7.MétodoEpsilontest(E‐test) Enlascepascuyalecturadelresultadoeneltestdedifusiónendiscohayacausado algunaduda,seharealizadoelE‐testparadeterminarlaconcentraciónmínimainhibitoria (CMI).SehallevadoacabosiguiendolasrecomendacionesdeCLSIyelEUCAST.El procedimientoesigualqueenelmétododedifusiónendiscoperoenvezdedepositarlos discosdeantibióticosconeldispensadormulticanal,secolocanlastirasM.I.C.E.congradiente deantibiótico,aplicando1‐2tirasencadaplacadeagarMueller‐Hinton.Sedepositandeforma quelaescalaCMIestehaciaarribayquelaconcentraciónmáximaestácercanaalextremode laplacaPetri.Acontinuación,lasplacassellevanaincubardurante24ha37ºC.Trasla incubaciónserealizalalecturadelasplacas,deformaqueseobservaunazonadeinhibición simétricayenformadeelipse(Figura5)dondelaCMIeselvalorobtenidoenelpuntoque cortaelextremodelaelipsedeinhibiciónconlatiradeantibiótico. Figura5:Lecturadelaconcentraciónmínimainhibitoria(CMI)medianteelmétododelE‐test.
30 4.RESULTADOS 4.1RecuentoydeteccióndeListeriaspp.enproductoscárnicoscocidosLPC 4.1.1RecuentosbajosdeL.monocytogenes Delos51productoscárnicoscocidosmuestreadosanalizadoseldíadelacompra,a mitadyafinaldesuperiododeduraciónmínimaalmacenadosa4ºCy10ºC,únicamente3de lasmuestrasobtuvieronrecuentodeL.monocytogenes(5,9%),perteneciendotodasellasala categoríadejamóncocido.ComosepuedeverenlaTabla10,ningunadeellaspresentó recuentoseldíadelacompra.Unamuestra(N12)presentórecuentosalolargodetodosu periododeduraciónmínimaalmacenadaaambastemperaturas,siendomayorelnúmerode ufc/ga10ºC.Además,unamuestraalmacenadaa10ºC(N49)presentórecuentoamitadyfinal delperiododeduraciónmínimayotra(N17)almacenadaalamismatemperaturaalfinaldel periododeduraciónmínima.Losrecuentososcilaronentre1,0x10y5,9x102ufc/g. Tabla10:Recuentosbajos(ufc/g)deL.monocytogenesobtenidosalolargodelperiododeduración mínima(PDM). NºTipodealimentoMPDM4ºMPDM10ºFPDM4ºFPDM10º N12Finaslonchascabezacerdo 2,9x1023,3x1021,0x1027,0x102 N17Jamóncocidoextra<10<10<105,9x102 N49Jamóncocidoextra <101,0x102<101,0x10 MPDM,mitaddelperiododeduraciónmínima;FPDM,finaldelperiododeduraciónmínima. 4.1.2DeteccióndeListeriaspp. TrasladeteccióndeListeriaspp.enlostrespreenriquecimientosutilizados,alolargo desuperiododeduraciónmínima,losresultadosobtenidossemuestranenlaTabla11. Tabla11:PorcentajedemuestraspositivasaladeteccióndeListeriaspp./25gportipodeproducto cocidoalolargodesuperiododeduraciónmínima. Tipodeproducto (nºmuestras)Día0MPDM4ºCMPDM10ºCFPDM4ºCFPDM10ºC Paleta/Jamóncocido(20)10(5)10(15)20(10)10(15)20(20) Chóped(3)0(0)0(33,3)0(33,3)0(33,3)0(33,3) Mortadela(4)0(0)0(0)0(0)0(0)0(0) Pavo(11)0(0)0(18,2)9,1(0)9,1(0)0(0) Salchichas(6)0(0)0(16,7)0(0)0(33,3)0(16,7) Otros(7)0(0)28,6(28,6)28,6(28,6)14,3(14,3)14,3(42,9) (L.innocua). MPDM,mitaddelperiododeduraciónmínima;FPDM,finaldelperiododeduraciónmínima. Eldíacero,únicamenteun10%demuestrasresultaronpositivasaladeteccióndeL. monocytogenesyun5%aL.innocua,perteneciendotodasellasalgrupodejamóncocido.A mitaddelperiododeduraciónmínimaenlosproductosalmacenandolosa4ºC,seobtuvoun 10%demuestraspositivasparaL.monocytogenes,perteneciendotodasellasaelgrupode jamóncocidoyun28,6deotrosproductos(lomosajonia,cabezadecerdo,cabezajabalí,bull,
31 galantina,lacónasado);paraL.innocuaseobtuvoun15%enjamóncocido,un33,3%en chóped,un18%enpavo,un16,7%ensalchichasyun28,6%enotrosproductosentrelosque incluimoscabezadejabalí,bull,lomosajonia.Amitaddelperiododeduraciónmínima almacenandolosproductosa10ºCseobtuvoparaL.monocytogenesun20%demuestras positivasenjamóncocido,un9,1%enpavoyun28,6%enlacategoríadeotrosproductos; paraL.innocuaenlasmismascondicionesseobtieneun10%demuestraspositivasenjamón cocido,33,3%parachópedyun28,6%enlacategoríadeotros.Afinaldelperiododeduración mínima,alatemperaturade4ºC,seobservaun10%demuestraspositivasalaespecie patógenaenjamóncocido,un91%parapavo,yun14,3%paraotrosproductos;siendoparaL. innocuadeun15%enjamóncocido,un33,3%enchóped,un33,3%ensalchichasyun14,3% enotros.Enelmismoperiodo,peroconunatemperaturadealmacenamientode10ºC,se obtuvoun20%demuestraspositivasaL.monocytogenesparajamóncocidoyun14,3%enla categoríadeotros,siendoparaL.innocuade20%enjamóncocido,33,3%enchóped,16,7%en salchichasy42,9%enlacategoríadeotros. Lostiposdeproductoscárnicoscocidosquemayorporcentajedemuestraspositivasa L.monocytogeneshanpresentadosonjamóncocidoylacategoríadeotrosproductos, seguidosdelosproductosdepavo.Nosehanobservadomuestraspositivasenchóped, mortadela,nisalchichas. 4.1.3EvolucióndelapresenciadeListeriaspp.alolargodelperiododeduraciónmínima. Todaslasmuestrasdeproductoscárnicoshansidoanalizadasdespuésdesu almacenamientoa4ºCy10ºCdurantesuperiododeduraciónmínima.Deformaquecomose muestraenlaFigura6,lapresenciadeL.monocytogenes,cuandolosproductosson almacenadosa4ºC,aumentahastalamitaddelperiododeduraciónmínimaypermanece constantehastafinaldeéste,comportándoseigualmenteL.innocuaaestatemperatura.Enel almacenamientodelosproductosa10ºC,seproduceunincrementodeambasespecieshasta mitaddelperiododeduraciónmínima,aumentandolapresenciadeL.monocytogeneshastael final,mientrasqueL.innocuapermanececonstante. Seobservaunmayoraumentodelaespeciepatógena,duranteeltiempode conservación,quedeL.innocua,quesemantienemásestable.Además,seobservamayor númerodemuestraspositivasamitaddelperiododeduraciónmínimadelproducto,con excepciónL.monocytogenes,quetienemayornúmeroalfinalcuandolosproductoshansido almacenadosa10ºC. ElReglamento(CE)Nº1441/2007DELACOMISIÓNde5dediciembrede2007que modificaelReglamento(CE)nº2073/2005relativoaloscriteriosmicrobiológicosaplicablesa losproductosalimenticios(Anónimo,2007)señalacomocriteriomicrobiológicoparael recuentodeL.monocytogenesenlosalimentosLPCquepuedenfavorecersudesarrolloyque noseandestinadosaloslactantesniparausosmédicosespeciales,100ufc/genproductos comercializadosdurantesuvidaútil.Porlatanto,segúnnuestrosresultados,tresmuestras(2 dejamóncocidoy1decabezadecerdo)incumplenestecriteriomicrobiológicoalmenosenun análisis,llegandohastacuatroenelcasodelacabezadecerdo.
32 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DÍA 0 MPDM FPDM Tiempo Muestras positivas L.i 4ºC L.i 10 ºC L.m 10 ºC L.m 4ºC MPDM,mitaddelperiododeduraciónmínima;FPDM,finaldelperiododeduraciónmínima. Figura6:EvolucióndelnúmerodemuestraspositivasalapresenciadeListeriaspp.,alolargodel periododeduraciónmínima. RespectoaladeteccióndeL.monocytogenes/25g,elcriterioestableceenestetipode productos,ausenciadelmicroorganismoen25gantesdequeelalimentohayadejadoel controlinmediatodelexplotadordelaempresaalimentariaquelohaproducido.Demodoque, segúnnuestrosresultados,diezmuestrasnopodríansercomercializadasporqueseha detectadolaespeciepatógenaenalgunoodiferentesmomentosdelanálisisdelosproductosa lolargodesuperiododeduraciónmínima. VariosestudioshanmostradodiferentesincidenciasdeL.monocytogenesenproductos cárnicoscocidos,todasellasinferioresalaobtenidaennuestrosanálisis.19,6%positivasaL. monocytogenesdelas51muestrasanalizadas.Uyttendaeleycol.(1999)encontraronun4,9% demuestraspositivastrasanalizar3405productoscárnicoscocidos.Elsonycol.(2004) detectaronunaprevalenciamenor(2,2%)en4078muestrasdecarnecocidafileteada(2894 muestras)ydepatés(1184muestras).Estabajaprevalenciatambiénhasidomostradapor Wongycol.(2005)queanalizando300muestrasdepatésy104dejamóncocidoenvasado, detectaron1muestraconrecuentode1,7x103ufc/gyun1%demuestraspositivas respectivamente.Endosestudiosmásrecienteshanmostradoincidenciasdelabacteria patógenaenestosmismosproductosde1,1%conrecuentossiempreinferioresa100ufc/g (Uyttendaeleycol.,2009)yde7,4%(Pérez‐Rodríguezycol.,2010). Corneliusycol.(2008)realizaronunestudiodeprevalencia,enNuevaZelanda,de Listeriaspp.en301muestrasdejamóncocido,encontrandolaespeciepatógenaen10deellas, yéstajuntoaL.innocuaen3muestras.OtrosestudiosdeprevalenciaenNuevaZelanda, llevadosacaboconanterioridad,reportaronun2,9%deproductosdecerdoLPCpositivosala presenciadeL.monocytogenes(Hudsonycol.,1992)yentreun8%‐38%deprevalenciade Listeriaspp.enproductoscárnicosLPC(Hudsonycol.,1991).Segúnlosdatosproporcionados porelAustralianMeatIndustryCouncilyelHealthDepartmentofWesternAustralia,basados enlaprevalenciaestudiadaduranteelperiodode1997‐2003,el4,8%delasmuestrasdedeli meatsestáncontaminadasconL.monocytogenes(n=3351),el1,2%depatés(n=568)yel 2,8%defrankfurters(n=1118)(Rossycol.,2009).
33 4.2.PreconfirmaciónyconfirmaciónbioquímicadeListeriaspp. AlascoloniasconmorfologíatípicadeL.monocytogenesodeL.innocuaaisladasen agarALOA(Figura7)yagarRapid’L.mono(Figura8),selesrealizóunaspruebasbioquímicas preconfirmativas.Estaspruebasconsistieronenlafermentacióndetresazúcares(ramnosa, xilosaymanitol)ylaβ‐hemólisis. Figura7:ColoniastípicasdeL.monocytogenes(1)ydeL.innocua(2)enagarALOA. Figura8:ColoniastípicasdeL.monocytogenes(1)ydeL.innocua(2)enagarRapid’L.mono. EnlaTabla12semuestralalecturatipodelaspruebasbioquímicasdelascepas utilizadascomocontrolyenlaFiguraXlosresultadosdeestaspruebas. Tabla12:ResultadotipodelaspruebasbioquímicaspreconfirmativasdelascepasdeListeriautilizadas comocontrol. L.monocytogenesL.innocuaL.ivanoviiL.grayi Ramnosa++/‐ ‐ + Manitol‐ ‐ ‐ + Xilosa‐ ‐ +‐ β‐hemólisis+‐ +‐ 21 12
40 respectivamente.Seobservandiferenciasestadísticas(p<0,05)apesardequeelnúmerode análisispositivoseselmismoenambosperiodosdeanálisis. Tabla18:Tabladecontingenciadelosresultadosobtenidos,segúnelperiododealmacenamiento,enla deteccióndeL.monocytogenes,L.innocuayListeriaspp. L.monocytogenes FPDMTotal ‐ + MPDM ‐87693 +549 Total9210102 L.innocua FPDMTotal ‐ + MPDM ‐80888 +8614 Total8814102 Listeriaspp. FPDMTotal ‐ + MPDM ‐721082 +101020 Total8220102 4.4.3Influenciadelatemperaturadealmacenamientodelproducto Alobservarlainfluenciadelatemperaturadealmacenamiento,secompruebaquees significativamentemayorelnúmerodeanálisispositivosenlosproductosmantenidosa10ºC quea4ºC,sintenerencuentaeltiempodealmacenamiento,paraL.monocytogenes(Tabla 19).PeroenelcasodeL.innocuayListeriaspp.,eltotaldeanálisispositivosa4ºChasido mayorquea10ºC,mostrandodiferenciassignificativas(p<0,05). Tabla19:Tabladecontingenciadelosresultadosobtenidos,segúnlatemperaturadealmacenamiento, enladeteccióndeL.monocytogenes,L.innocuayListeriaspp. L.monocytogenes 10ºCTotal ‐ + 4ºC‐87895 +347 Total 9012102 L.innocua 10ºCTotal ‐ + 4ºC‐83386 +7916 Total 9012102 Listeriaspp. 10ºCTotal ‐ + 4ºC‐84589 +6713 Total 9012102
41 4.4.4.Influenciadelatemperaturayeltiempodealmacenamiento Sonsignificativamentemayores(p<0,05)elnúmeroderesultadospositivosparaL. monocytogenesamitadyfinaldelperiododeduraciónmínimaenalmacenamientoa10ºC,que eldía0,aligualqueessignificativoelmayornúmerodemuestrasalfinalqueamitadparaesta temperatura. Además,seobservandiferenciassignificativas(p<0,05)entrelosresultadospositivosa mitaddelperiododeduraciónmínimaentre4ºCy10ºC,siendomayoresenestaúltima temperatura.Estomismoserepitealfinaldelperiododeduraciónmínima,enlaquese obtienenmayornúmeroderesultadospositivosenalmacenamientoa10ºC. ParaL.innocuasonsignificativaslasdiferencias(p<0,05)entreelalmacenamientoa 4ºCy10ºC,siendomayoreslosresultadospositivosamitaddelperiododeduraciónmínimaa temperaturasdealmacenamientodelproductode4ºC;ysehanobtenidoelmismonúmerode análisispositivosaambastemperaturasalfinaldelperiododeduraciónmínima. Paralasdosespeciesenconjunto,siexistendiferenciassignificativas(p<0,05)entre ambastemperaturasdealmacenamientoenlosanálisisalamitadyfinaldelperiodode duraciónmínima.Ademásseobservandiferenciasestadísticas(p<0,05)entrelosresultados positivosalamitadyfinaldelperiododeduraciónmínimaalmacenadasa10ºC,siendomayor elnúmerodeanálisispositivosalfinaldelperiodo. 4.4.5Relacióndelennegrecimientodelmediodeenriquecimientoconlapresenciade Listeriaspp. LasespeciesdelgéneroListeriasonesculinapositivas.Estaactividadsedebealaacción delenzimametabólicoβ‐glucosidasaquereducelaesculinaa6,7‐dihidroxicoumarina (esculetina)dandolugaraunacoloraciónpardaanegradelmedioenpresenciadecitrato férrico.UnadelascaracterísticasdelmedioselectivocaldoFraserycaldoONE‐Listeriaes evidenciaresteennegrecimiento.AlcompararelcaldoFrasermediaconcentraciónfrenteal caldoFraserconcentraciónnormal(Tabla20)seobservaqueenelprimeroexisteunmenor porcentajedemuestrasqueresultaronpositivasalapresenciadeListeriaspp.ynomostraron ennegrecimiento,mientrasqueesmuchomayorelporcentajedemuestrasquesipresentaron ennegrecimientoynoresultaronpositivasenladetección.Encualquiercaso,estosaltos porcentajesenambosenriquecimientosmuestranqueelennegrecimientoonodelmediono esdeterminanteparadarunresultadodepositividadonegatividadalapresenciadeListeria spp. Unaposibleexplicacióndeestecomportamientodelosmediosdeenriquecimiento podríaserqueelcaldoFraseramediaconcentraciónactúemuyselectivamenteeliminando durantesuincubaciónelrestodemicrobiotapresenteenlamuestra.Deestamanera,al inocularelmedioFraseraconcentraciónnormal,solamentecreceríaListeriaspp.enelcasode estarpresenteenlamuestra.Rodriguesycol.(1995)encontraronunelevadoporcentajede muestrasdequesoenriquecidassecundariamenteencaldoFraserenlasqueseobservaba ennegrecimientodelmedioperonosedetectóListeriaspp.(59.4%).Sugierenquepuedeser debidoalapresenciadeotrosmicroorganismoscapacesdehidrolizarlaesculinayquesonmás resistentesqueListeriaspp.alefectoconservadordelosquesos.
42 Tabla20:Porcentajedelnúmeromuestrasanalizadassegúnelresultadomicrobiológicoyel ennegrecimientonegativoopositivodelcaldoFraser. Fraser1/2Fraser1/1 E+/R+E‐/R+E+/R‐ E‐/R‐ TotalE+/R+E‐/R+E+/R‐ E‐/R‐ Total AlimentoDÍA07,80,019,672,51005,92,05,986,3100 AlimentoMPDM4ºC21,63,931,443,110017,67,811,862,7100 AlimentoMPDM10ºC 25,50,025,549,010019,65,95,968,6100 AlimentoFPDM4ºC17,62,045,135,310013,75,913,766,7100 AlimentoFPDM10ºC19,62,039,239,210017,63,911,866,7100 (E+)enegrecimento+,(E‐)enegrecimento‐,(R+)resultado+,(R‐)resultado‐. MPDM,mitaddelperiododeduraciónmínima;FPDM,finaldelperiododeduraciónmínima. EnelcasodelcaldoONE‐Listeria(Tabla21),elporcentajedeanálisisenlosqueseha detectadoListeriaspp.yquenomostraronennegrecimientodelmedioesmuybajo.Noocurre lomismoenlosanálisisqueresultaronnegativosenladetecciónyquesimostraron ennegrecimiento,aunqueestosporcentajessoninferioresalosobtenidosencaldoFraser mediaconcentración. Tabla21:Relacióndelnúmeromuestrasanalizadassegúnelresultadomicrobiológicoyel ennegrecimientonegativoopositivodelcaldoONE‐Listeria. CaldoONE‐Listeria E+/R+E‐/R+E+/R‐ E‐/R‐ Total AlimentoDÍA03,90,09,886,3100 AlimentoMPDM4ºC11,80,027,560,8100 AlimentoMPDM10ºC 5,90,021,672,5100 AlimentoFPDM4ºC9,80,033,356,9100 AlimentoFPDM10ºC9,82,029,458,8100 (E+)enegrecimento+,(E‐)enegrecimento‐,(R+)resultado+,(R‐)resultado‐. MPDM,mitaddelperiododeduraciónmínima;FPDM,finaldelperiododeduraciónmínima.
43 4.5ResultadodelestudiodeantibiorresistenciaalascepasdeListeriaspp. 4.5.1.Determinacióndelinóculodesiembraparalarealizacióndelantibiograma Sehaestudiadolaantibiorresistenciade26cepasdeL.monocytogenesy25deL. innocua.TrasrealizarelajustedelatransmitanciaenelaparatoSpectronic20yrealizarel recuentoenPCA,todaslascepasestudiadasalcanzaronelcrecimientorequerido(2,5x108 ufc/ml),encontrándoseentodosloscasos,aexcepcióndeunacepadeL.monocytogenes, entre8,3y8,7logufc/ml(Figura14y15). 8 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 8,7 8,8 8,9 0 5 10 15 20 25 30 35 nº cepa L.monocytogenes Log ufc/ml Limite superior Limite inferior Media Figura14:Representacióndelosrecuentos±desviaciónestándardelascepasdeL.monocytogenes obtenidostraselajustedelatransmitancia. 8 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 8,7 8,8 8,9 0 5 10 15 20 25 30 nº cepa L.innocua Log ufc/ml Limite superior Limite inferior Media Figura15:Representacióndelosrecuentos±desviaciónestándardelascepasdeL.innocuaobtenidos traselajustedelatransmitancia. Losrecuentosdelascepasdereferenciaestudiadas(Tabla22),seencuentran, igualmente,dentrodelintervaloestablecido.
44 Tabla22:RecuentosobtenidosenPCAdelascepasreferenciatraselajustedelatransmitancia. Logufc/ml E.coli8,5 E.faecalis8,3 P.aeruginosa8,7 S.aureus8,3 4.5.2.Controldecalidaddelascepasdereferencia Losresultadosdelcontroldecalidaddelascepasdereferenciasecompararonconlos estándaresdeelComitédelAntibiogramadelaSociedadFrancesadeMicrobiología(CA‐SFM) delaño2010,conlosdelaSociedadBritánicadeQuimioterapiaAntimicrobiana(BSAC)ycon lasrecomendacionesparacontroldecalidadinternodelComitéEuropeodePruebasde SusceptibilidadAntimicrobiana(EUCAST),que,peseanosercoincidentes,sisonsimilares (Tabla23). Tablas23:Límitesdelosdiámetrosdeinhibición(mm),delascepasdereferenciaobtenidospordifusión enagar. AntibióticoE.coliP.aeruginosaS.aureusE.faecalis Amoxicilina/clavulánico23(22‐27) Ampicilina18(16‐22) 30(26‐35) Ciprofloxacino37(31‐38)28(29‐36,5)26(21‐27) Claritromicina Clindamicina30(26‐33) Cloranfenicol26(21‐27) 27(20‐26) Gentamicina23(22‐26,5)20(22‐28)27(24‐28,5)13(12‐18) Imipenem33(33‐37)26(24,5‐29,5) 29(28‐32) Levofloxacino33(29‐37)24(23‐29) Linezolid Meropenem35(28‐34)33(32‐39)24(22‐28) Moxifloxacino33(28‐35) 28(22‐28) Oxacilina26(27‐34) PenicilinaG38(31‐38,5) Rifampicina40(34‐39) Sulfametoxazol‐trimetoprim30(25,5‐30,5) 36(28‐32,5) Teicoplanina20(17‐20)19(19‐25) Tetraciclina25(18‐25) Tigeciclina24(20‐27) 24(20‐26) Vancomicina20(17,5‐20,5)20(13‐19) ComoseveenlaTabla23,paraalgunosantibióticos,losvaloresregistradosde diámetrodeinhibición(mm)noestándentrodelintervaloestablecido.Ellopuededeberseala pocaestandarizacióndelosdiscos,comosereflejaeneltrabajode(ObregónyZavaleta,2006) sobrecontroldecalidaddediscosdesensibilidadantimicrobianadediferentesmarcas
45 comercializadasenPerú,quetambiénhacenenEspaña,presentandoincideselevadosdeno conformidaddeinclusoun71,4%. 4.5.3.ResultadosdelosantibiogramasdelascepasdeL.monocytogenesyL.innocua TeniendoencuentalasrecomendacionesdelComitédeExpertosdeEstandarización biológicadelaOMS(documentonº610,1977),seformarondiferentescomités,cuyofines determinarlasensibilidadalosantimicrobianos,paraintentardeterminarlosvalorescríticos quedelimitanunascategoríasclínicas.EntreellosseencuentranCA‐SFMylaBSACambos componentesdelEUCASToelCLSI,queactualizanlosvalorescríticosdefinidosparalas concentracionesylosdiámetrosdeinhibicióndecadagrupooespeciebacteriana. EnEuropaen2002,secreóelEUCASTparaintentararmonizarloscriterios metodológicosydeinterpretacióndelostestdesensibilidadalosantibióticos. Losresultadosdeestetrabajo,obtenidostrasmedirelhalodeinhibición,se interpretancomparándolosconloscriteriosestablecidosporelCA‐SFM.Estosresultadosson cualitativosyseclasifican,segúnsupuntodecorte,delamanerasiguiente: ‐Sensible,refiriéndoseaquelaposibleinfecciónocasionadaporlacepaparalaquese determinalaCMIpodríatratarsedeformaadecuadaempleandolasdosishabitualesde antibiótico. ‐ Intermedio,elvalordeCMIseaproximaalasconcentracionesdeantimicrobiano alcanzablesensangreotejidosyquepuedeesperarseeficaciaclínicaenaquellaslocalizaciones enlasquesealcanzanaltasconcentracionesocuandoseempleandosismásaltasdelo habitual. ‐ Resistente,serefiereaaquellosmicroorganismosquenoseinhibenporlas concentracioneshabitualmentealcanzadasensangre/tejidos,oaquellosmicroorganismosen losqueexistenmecanismosderesistenciaespecíficosparaelagenteestudiadoynohahabido unaadecuadarespuestacuandosehausadocomotratamientoelcorrespondiente antimicrobiano. 4.5.3.1.Métododedifusiónendisco Eldiámetrodelazonadeinhibición(mm)esinversamenteproporcionalala concentraciónmínimainhibitoria.EnlaTabla24semuestranlosantibióticosestudiadosconla abreviaturaycargadeantibióticoasícomoelrango(mm)desensibilidadyresistencia. Delos20antibióticosestudiadosparaambasespeciesylos5supernumerarios estudiadosúnicamenteparaL.innocua,seobservaunaaltasensibilidadal90%delos antibióticos(AMC;AMP;CIP;CLR;C;CN;IPM;LEV;LZD;MEM;MXF;P;RD;SXT;TEC;TE;TGC; VA)paralas26cepasL.monocytogenes;mientrasqueenelcasodelas25cepasestudiadasde L.innocuasecompruebaunasensibilidadfrenteal84%delos25antibióticosestudiadospara estaespecie.Coincidiendolosantibióticosalosquefuemuysensiblelaespeciepatógena,con excepcióndelapenicilinaGylatetraciclina,frentealoscualesL.innocuasemuestra intermediaoresistente.
46 Tablas24:Concentracióndeantibióticodeldiscoyvalorescríticosdelosdiámetros(mm)delazonade inhibición. AntibióticoDenominaciónCA‐SFM Sensible Resistente L.monocytogenesyL.innocua Amoxicilina/clavulánicoAMC;30μg≥23 <16 AmpicilinaAMP;10μg≥21 <16 Ciprofloxacino CIP;5μg≥25 <22 ClaritromicinaaCLR;15μg≥22 <17 ClindamicinaDA;2μg≥15 <15 CloranfenicolC;30μg≥23 <19 GentamicinaCN;10μg≥18 <16 ImipenemIPM;10μg≥24 <17 Levofloxacino LEV;5μg≥20 <17 LinezolidLZD;30μg≥28 <24 MeropenembMEM;10μg≥26 <26 Moxifloxacino MXF;5μg≥24 <21 OxacilinaOX;1μg≥20 <20 PenicilinaGP;10μg≥29 <18 RifampicinaRD;30μg≥19 <14 Sulfametoxazol/TrimetoprimbSXT;25μg≥29 <29 TeicoplaninaTEC;30μg≥17 ‐ TetraciclinaTE;30μg≥19 <17 TigeciclinaTGC;15μg≥22 <22 VancomicinaVA;30μg≥17 ‐ L.innocua EritromicinabE;15μg≥25 <25 Estreptomicina S;10μg≥15 <13 MinociclinaMH;30μg≥19 <17 Sulfametoxazol RL;25μg≥17 <12 TrimetoprimW;5μg≥16 <12 bEUCAST,2011. Puestoquelalecturadelhalodeinhibicióndealgunosantibióticosenalgunascepasde L.innocuasuscitódudasdebidoasuproximidadalpuntodecortequedeterminasu susceptibilidad,serealizóunestudiodelaCMIparaconcretarelresultado. 4.5.3.2.MétododeEpsilon‐test(E‐test) LalecturadelaCMIseefectúaenlainterseccióndelaelipsedeinhibiciónconlatirade antibiótico,expresándoseelresultadoenμg/ml.Sielcrecimientotocalasecciónnegradela tira,seinterpretacomoelvalorenlasiguientesecciónblancaporencimadedondeel crecimientohafinalizado,aunquesiserequiere,puededeterminarsecomoelpunto intermedioentrelosvaloresindicadosenlasseccionesblancas(Figura16).
47 Figura16:LecturadelaCMIenlaplacadeagardelEpsilon‐test(E‐test). Sehaestudiadolasusceptibilidadde3cepasdeL.innocuafrentealciprofloxacino, dandocomoresultadosusceptibilidadintermediamedianteelmétododisco‐placa;a6cepas deestamismaespecieenlasqueseobtuvosensibilidadintermediafrentealapenicilinaG;ya 12cepasquepresentaronresistenciafrentealatetraciclinaeneltestdisco‐placa,pero próximasasusceptibilidadintermedia.EnlaTabla25semuestraelnúmerototaldecepas ensayadasdeL.innocuaysuCMIparacadaunadelosantibióticos. Tabla25.‐CMIobtenidasenlascepasdeL.innocuaestudiadasmedianteelE‐test. CMI(μg/ml) Antibiótico 0.002 0.004 0.008 0.016 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Ciprofloxacino(3) 3 PenicilinaG(6) 42 Tetraciclina(12) 12 ()Númerodecepasestudiadas. Lasconcentracionescríticasparaelciprofloxacinoestánestablecidasenmenoroigual de0,5μg/mlparalasensibilidadymayorde1μg/mlparalaresistencia.Estosignificaque3de lascepasdeL.innocuaconhalospróximosalpuntodecortedesensibilidadintermediaenel antibiogramadisco‐placa(25mm),sísonsensibles. Delas6cepasdeL.innocuaenlasquesehaestudiadosususceptibilidadfrenteala penicilinaG,enlas6sehaconfirmadosusensibilidadintermediaadichoantibiótico,yaque segúnlasrecomendacionesdelCA‐SFM,unacepaessensiblesilaconcentracióncríticaes menoroiguala0,25μg/mlyresistentecuandosuperalos2μg/ml. Traslainterpretacióndelosresultadosobtenidosdelas12cepasestudiadasmediante elE‐testfrenteatetraciclina,podemosconfirmarlaresistenciadelacepadeL.innocuaadicho antibiótico,yaquesuCMIesde16μg/ml,considerándoseresistentecuandoéstaesmayorde 8μg/ml.
48 4.5.3.3.SensibilidadoresistenciadelascepasdeL.monocytogenesyL.innocua EnlaTabla26semuestraelporcentajedecepasdeambasespeciesdeListeriasegún sususceptibilidadantimicrobianafrentealosantibióticosestudiadosmedianteelmétodo disco‐placayE‐test. Tabla26.‐Porcentajesfinalesdesusceptibilidadalosantimicrobianosensayadosen51cepasdeListeria spp.aisladasapartirdeproductoscocidos. AntibióticosAbreviatura;concentración L.monocytogenes (26cepas) L.innocua (25cepas) S*IRSIR β‐Lactámicos Amoxicilina‐ác.clavulánicoAMC;30μg100 100 AmpicilinaAMP;10μg100 100 OxacilinaOX;1μg100100 PenicilinaGP;10μg10076,0 24,0 Aminoglucósidos GentamicinaCN;10μg100 100 EstreptomicinaS;10μg100 100 Glucopéptidos VancomicinaVA;30μg100 100 TeicoplaninaTEC;30μg100 100 Macrólidos ClaritromicinaCLR;15μg100 100 EritromicinaE;15μg100 100 Tetraciclinas TetraciclinaTE;30μg100 48,0 52,0 MinociclinaMH;30μg100 100 Fluoroquinolonas CiprofloxacinoCIP;5μg100100 LevofloxacinoLEV;5μg100 100 MoxifloxacinoMXF;5μg100 100 Carbapenemas ImipenemIPM;10μg100 100 MeropenemMEM;10μg100 100 Fenicoles CloranfenicolC;30μg100 100 Oxazolidinonas LinezolidLZD;30μg100 100 Sulfamidas Sulfametoxazol‐trimetoprimSXT;25μg100 100 SulfametoxazolRL;25μg100 100 TrimetoprimW;5μg100 100 Lincosamidas ClindamicinaDA;2μg80,819,220,080,0 Glicilciclinas TigeciclinaTGC;15μg100 100 Rifampicinas RifampicinaRD;30μg100 100 S=Sensible;I=Intermedio;R=Resistente. AntibióticossupernumerariosparaL.innocua.
49 Delos25antibióticosutilizadospararealizaresteensayodesusceptibilidad antimicrobianafrenteaListeriaspp.sehacomprobadolaresistenciadeestabacteriaavarios deellos,dependiendodelaespecie.Deformaque,L.monocytogenesmostróun19,2%de resistenciafrenteaclindamicinayun100%respectooxacilina,mientrasqueL.innocualofue frenteaclindamicinaconun80%,oxacilinaconun100%ytetraciclinaconun52%.El100%de resistenciaalaoxacilinaporpartedelasdosespeciesesundatoesperadodadalaconocida resistencianaturalporpartedeListeriaspp.aesteantimicrobiano(CA‐SFM,2010),coincidiendo conlosestudiosde(Harakehycol.,2009)y(Pesaventoycol.,2009).Segúninformacióndela CA‐SFM,tambiénsepuedeesperarunaelevadaresistenciafrentealaslincosamidas (clindamicina).IgualmentecabedestacarlasusceptibilidadintermediaquemuestraL.innocua (24%),frenteapenicilinaG. Eltratamientodeeleccióndelalisteriosisesampicilinaoamoxicilinacombinadacon aminoglucósidos(generalmentegentamicina),siendolaasociacióntrimetoprim‐sulfametoxazol (cotrimoxazol)eltratamientodesegundaelecciónoalternativoparapacientesalérgicosaesos antibióticos(Mediavillaycol.,1998;OrganizaciónPanamericanadelaSalud/Organización MundialdelaSalud(OPS/OMS),2004;CentroNacionaldeReferenciadeListeria,2009). Todaslascepasestudiadashansidoaltamentesensiblesalosantibióticosdeelección utilizadoseneltratamientodelalisteriosis,resultadosqueestándeacuerdoconlosaportados porAureliycol.(2003),BalsalobreyHernández‐Godoy(2004),Zamoraycol.(2006)y Pesaventoycol.(2010).
56 monocytogenes.Parte2:Métododerecuento.Modificación1:Modificacióndelmedio recuento.AsociaciónEspañoladeNormalizaciónyCertificación. Uyttendaele,M.,Busschaert,P.,Valero,A.,Geeraerd,A.H.,Vermeulen,A.,Jacxsens,L.,Goh,K. K.,DeLoy,A.,VanImpe,J.F.,yDevlieghere,F.2009.Prevalenceandchallengetestsof ListeriamonocytogenesinBelgianproducedandretailedmayonnaise‐baseddeli‐salads, cookedmeatproductsandsmokedfishbetween2005and2007.InternationalJournal ofFoodMicrobiology,133,94‐104. Uyttendaele,M.,DeTroy,P.,yDebevere,J.1999.IncidenceofListeriamonocytogenesin differenttypesofmeatproductsontheBelgianretailmarket.InternationalJournalof FoodMicrobiology,53,75‐80. Vlaemynck,G.,Lafarge,V.,yScotter,S.2000.ImprovementofthedetectionofListeria monocytogenesbytheapplicationofALOA,adiagnostic,chromogenicisolation medium.JournalofAppliedMicrobiology,88,430‐441. Wong,T.L.,Carey‐Smith,G.V.,Hollis,L.,yHudson,J.A.2005.Microbiologicalsurveyof prepackagedpâtéandhaminNewZealand.LettersinAppliedMicrobiology,41,106‐ 107. Yücel,N.,Çitak,S.,yÖnder,M.2005.PrevalenceandantibioticresistanceofListeriaspeciesin meatproductsinAnkara,Turkey.FoodMicrobiology,22,241‐245. Zamora,J.M.,Chaves,C.,yArias,M.L.2006.Comparacióndelperfildesensibilidada antibióticosdecepasdeListeriamonocytogenesySalmonellaspp.aisladasapartirde alimentosconcepasdeorigenclínico.ArchivosLatinoamericanosdeNutrición(ALAN), 56,171‐174.