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Universidad de Zaragoza Facultad de Veterinaria Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos Estudio de propiedades de interés probiótico y tecnológico de dos cepas de Lactobacillus plantarum María Cermeño Ainsa Máster en Iniciación a la Investigación en Ciencia y Tecnología de los Alimentos Trabajo fin de Máster dirigido por: Pilar Mañas Pérez 04-Julio-2012 Agradecimientos Debo agradecer a mi directora Pilar Mañas por permitirme realizar este trabajo con ella, por transmitirme su conocimiento en la materia y por ayudarme durante todos estos meses. Gracias a todos los profesores del máster, ya que en mayor o menor grado, han contribuído a mi formación académica y personal. Gracias a todos mis compañeros del máster, porque todos me han sacado al menos una sonrisa y han amenizado esas interminables horas de trabajo. Sobre todo, gracias por las carcajadas a la hora de comer. Gracias a mis compañeros/as de laboratorio, por toda la ayuda prestada Gracias a Bea y Laura, que han sido mis compañeras de batalla Especial mención para Carmen, por nuestras pequeñas charlas, por poner el autoclave, por aprender a grabar cds y porque se lo merece, gracias. Gracias a mis padres, Pedro y Milagros, por su apoyo, porque creen en mí, por los momentos duros, porque siempre han sabido cuando darme un empujoncito en el momento adecuado, y por fín he aprendido a darlo yo misma. Gracias a mis hermanos, Pedro y Sergio, porque son los dos, mis grandes modelos a seguir, porque admiro su constancia y esfuerzo en el trabajo y en aprender, porque ójala yo fuera como ellos. Gracias a Enea, por todo y más. Milioni di rantantis! 2 Resumen Lactobacillus plantarum es una bacteria ácido láctica de gran interés tanto probiótico como tecnológico. La capacidad probiótica de algunas cepas de L. plantarum ha sido ampliamente estudiada, habiéndose demostrado su capacidad de colonizar la mucosa intestinal. Por otro lado, es una de las principales especies involucradas en procesos de fermentación, sobre todo en productos de origen vegetal. El objetivo general de este trabajo fue estudiar la influencia de las condiciones de crecimiento de L. plantarum en algunas características de interés para su posterior utilización como microorganismo probiótico. Asimismo se estudió la capacidad de fermentación de diversos azúcares, de interés tanto tecnológico como probiótico. Para ello se escogieron dos cepas, una caracterizada como cepa probiótica, y otra cepa aislada de un producto vegetal fermentado. Los aspectos estudiados incluyeron una caracterización de la capacidad de crecimiento de ambas cepas bajo diferentes condiciones experimentales, lo cual nos permitiría escoger las condiciones más adecuadas para la obtención de cultivos de L. plantarum con tasas de crecimiento y densidades celulares elevadas. Por otro lado se estudió la capacidad de supervivencia de L. plantarum frente a las dos barreras más importantes a las que se puede enfrentar en el tránsito gastrointestinal , el jugo gástrico y las sales biliares, y se evaluó la influencia sobre la misma de las condiciones de obtención del cultivo. Ello nos permitiría escoger las condiciones de crecimiento más adecuadas de acuerdo a criterios de aptitud probiótica evaluada in vitro. Se estudió la capacidad antimicrobiana de ambas cepas frente a cuatro patógenos de interés, con el objetivo final de escoger las condiciones de crecimiento que favorecieran este carácter. i Por último se estudió la capacidad para utilizar diversos azúcares con obje- to de prever la adecuación de diferentes materias primas como sustrato de fermentación y/o obtención del cultivo. Los resultados obtenidos han mostrado que las dos cepas de L. plantarum fueron capaces de crecer bajo las diferentes condiciones experimentales utilizadas (aerobiosis, anaerobiosis, aerobiosis a pH 5 y aerobiosis a pH 7), y que las condiciones de crecimiento utilizadas modificaban su supervivencia posterior al jugo gástrico simulado. El ajuste del pH del medio de crecimiento a un valor de 7 provocó una disminución notable de la resistencia celular al jugo gástrico, mientras que el ajuste a pH 5 la incrementaba. Por otro lado, las células más resistentes al jugo gástrico no mostraron una mayor resistencia a las sales biliares y viceversa. Estos resultados dificultan el poder escoger unas condiciones de crecimiento óptimas para favorecer la supervivencia de L. plantarum durante el tránsito gastrointestinal. Las dos cepas estudiadas mostraron capacidad de inhibir el crecimien- to de Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli y Staphylococcus aureus . Este efecto inhibidor era debido principalmente a la capacidad de disminución del pH de L. plantarum, probablemente a través de la producción de ácidos orgánicos. Por último se estudió la capacidad de utilización de azúcares, encontrándose diferencias entre las dos cepas objeto de estudio. ii Índice general Índice general iii Índice de figuras iv Índice de tablas vi 1 Introducción 1 1.1. Bacterias ácido lácticas y fermentación láctica . . . . . . . . . 1 1.2. Utilización en la industria alimentaria . . . . . . . . . . . . . . 4 1.3. Lactobacillus plantarum ...................... 8 2 Justificación y Objetivos 11 3 Material y Métodos 13 3.1. Medios de cultivo y de tratamiento . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.2. Microorganismos, suspensiones y curvas de crecimiento . . . 13 3.3. Determinación de resistencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.4. Estudio de la capacidad antimicrobiana . . . . . . . . . . . . . 19 3.5. Utilización de distintas fuentes de carbono . . . . . . . . . . . 21 4 Resultados y Discusión 23 4.1. Estudio de las condiciones de crecimiento . . . . . . . . . . . . 23 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal . . . 28 4.3. Componentes antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 4.4. Utilización de diferentes fuentes de carbono . . . . . . . . . . 37 5 Conclusiones 41 Bibliografía 43 iii Índice de figuras 1.1. Árbol filogenético de las bacterias lácticas y otras Gram + . . . 1 1.2. Rutas metabólicas en bacterias lácticas . . . . . . . . . . . . . . . 3 3.1. Metodología utilizada para la obtención de las suspensiones en faseestacionaria. ............................ 15 3.2. Ecuación de Gompertz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 3.3. Metodología empleada para la determinación de la resistencia al jugo gástrico y sales biliares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.4. Ensayo antimicrobiano. A.Listeria monocytogenes, B.Salmonella Typhimurium .............................. 19 3.5. Ensayo antimicrobiano. C.Escherichia coli, D.Staphylococcus aureus .................................... 20 4.1. Curvas de crecimiento en anaerobiosis y aerobiosis. . . . . . . . . 23 4.2. Colonias en medio sólido en aerobiosis y anaerobiosis. . . . . . . 24 4.3. Variación del pH durante el crecimiento de L.plantarum. . . . . . 25 4.4. Crecimiento de L.plantarum a pH constante. . . . . . . . . . . . . 26 4.5. Curvas de crecimiento de las dos cepas de L.plantarum estudiadas. 27 4.6. Gráficas de supervivencia frente al jugo gástrico simulado . . . . 29 4.7. Gráficas de supervivencia al jugo gástrico simulado . . . . . . . . 30 4.8. Fracción de supervivientes frente a sales biliares tras 0 y 2 horas de exposición a diferentes concentraciones . . . . . . . . . . . . . 32 4.9. Fracción de supervivientes tras 1 hora de exposición frente a las sales biliares a concentración 0.5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 4.10. Ensayo antimicrobiano con Listeria monocytogenes ySalmonella Typhimurium .............................. 35 4.11. Ensayo antimicrobiano con Escherichia coli yStaphylococcus aureus .................................... 36 iv 4.12. Curvas de crecimiento de L.plantarum en presencia de diferentes azúcares.................................. 38 4.13. pH y recuento de microorganismos alcanzado tras 24 horas de incubación con diferentes hidratos de carbono . . . . . . . . . . . 39 v Índice de tablas 3.1. Cepas utilizadas y sus características más relevantes . . . . . . . 14 3.2. Diseño del ensayo antimicrobiano por espectofotometría. . . . . . 21 3.3. Componentes de caldo MRS sin azúcares. . . . . . . . . . . . . . 21 3.4. Azúcares utilizados en el ensayo por espectrofotometría . . . . . 22 4.1. Parámetros obtenidos para la modelización de las curvas de crecimiento ................................. 27 vi — Capítulo 1— Introducción 1.1. Bacterias ácido lácticas y fermentación láctica 1.1.1. Características Las bacterias acido lácticas engloban un grupo heterogéneo de microorganismos que tienen en común una serie de características morfológicas, metabólicas y fisiológicas. De acuerdo a la taxonomía, el grupo de las bacterias lácticas comprende doce géneros, todos de la división Firmicutes, orden Lactobacillales. Las bacterias ácido lácticas pueden ser agrupadas en un solo grupo filogenético, junto a otras bacterias gram positivas con bajo porcentaje de G+C (guanina y citosina). Figura 1.1: Árbol filogenético de las bacterias lácticas y otras Gram + 1 1.3. Lactobacillus plantarum de fabricación. Por el contrario, existen microorganismos probióticos que además son capaces de fermentar las materias primas alcanzando concentraciones elevadas al final del proceso productivo, son los denominados estárter probióticos. Por último, numerosas cepas probióticas son administradas en forma de preparado alimenticio. 1.3. Lactobacillus plantarum 1.3.1. Características El género Lactobacillus, al que se refiere este trabajo, es el grupo más amplio formado por más de 80 especies y se caracteriza por su alta heterogeneidad. En concreto la especie estudiada Lactobacillus plantarum se caracteriza por presentar células en forma de bacilos largos y extendidos cuya longitud y curvatura depende de la edad del cultivo, la composición del medio y la tensión de oxígeno. Las colonias de Lactobacillus plantarum en medios sólidos son pequeñas (2-5µm), convexas, opacas y sin pigmentos. Lactobacillus plantarum es una bacteria láctica heterofermentativa facultativa, metabólicamente muy flexible y versátil que se encuentra en un gran rango de ambientes, incluyendo los productos lácteos y cárnicos fermentados o el tracto gastrointestinal humano (Kleerebezem et al. 2003). Sin embargo, su nicho más habitual son los alimentos fermentados de origen vegetal. Lactobacillus plantarum difiere del resto de especies Lactobacillus en los siguientes aspectos: 1. Posee un genoma relativamente grande con numerosos genes que codifican su capacidad de adaptación a diversas condiciones (Kleerebezem et al. 2003). 2. Puede fermentar gran cantidad de carbohidratos. 3. Requiere una alta concentración de manganeso para su crecimiento, y lo acumula de manera intracelular. El manganeso provee a Lactobaci- 8 1.3. Lactobacillus plantarum llus plantarum de una defensa frente al estres oxidativo. (Archibald y Fridovich 1981). 4. Tiene una alta tolerancia al pH bajo lo que implica que frecuentemente predomine en fermentaciones ácido lácticas espontáneas e incluso, sea capaz de sobrevivir a través del tracto gatrointestinal humano (Johansson et al., 1993). Es ampliamente utilizada como stárter en productos vegetales o animales (Salovaara et al., 2004), como probiótico para humanos debido a sus actividades de mejora de la salud (Goossens et al., 2005) y últimamente como un vehículo para la producción de compuestos terapéuticos (Mercerier et al., 2003). 1.3.2. L. plantarum 299v L.plantarum 299v es una de las cepas probióticas de Lactobacillus más estudiadas. Esta cepa ha sido aislada del intestino humano, lo que explica su amplio poder beneficioso en el tracto gastrointestinal. Tiene excelentes características de adhesión mediante la unión de manosa en células de la mucosa, coloniza el tracto intestinal e impide por tanto que otras bacterias se adhieran, Además, L.plantarum 299v ha demostrado estimular la producción de mucina en las células, evitando la colonización por patógenos. Se utiliza además como microorganismo modelo para la producción de bacteriocinas (Gyu-Sung et al., 2010). Algunas de las propiedades demostradas de L. plantarum 299v son: Se adhiere a las células del colon formando una barrera defensiva. Disminuye de distensión abdominal en pacientes con síndrome de intestino irritable. Mejora el estado de la mucosa por disminución de bacterias gram negativas. 9 1.3. Lactobacillus plantarum Reduce la inflamación de la mucosa intestinal. Incrementa la concentración de ácidos carboxílicos en heces. Disminuye la concentración de fibrinógeno en la sangre (evitando la coagulación). Actualmente se comercializa en España bajo el nombre de Protransitus (Laboratorios Salvat), presentado en cápsulas digeribles, e indicado para pacientes con síndrome de intestino irritable. 10 — Capítulo 2— Justificación y Objetivos La tendencia actual al desarrollo de nuevos alimentos fermentados a partir de materias primas diferentes y preferiblemente con efectos beneficiosos para la salud del consumidor está impulsando un fuerte esfuerzo investigador para aislar, caracterizar y optimizar la utilización de cepas de bacterias ácido lácticas con propiedades adecuadas. Lactobacillus plantarum se está mostrando como una especie de gran interés dada su capacidad de ejercer de cultivo iniciador, es decir, es capaz de fermentar las materias primas con eficacia, incluyendo matrices de origen vegetal, y además, muchas cepas presentan probada capacidad probiótica. El objetivo general de este trabajo fue estudiar la influencia de las condiciones de crecimiento de L.plantarum en algunas características de interés para su posterior utilización como microorganismo probiótico. Asimismo se estudió la capacidad de fermentación de diversos azúcares, de interés tanto tecnológico como probiótico. Se plantearon los siguientes objetivos parciales: Estudiar la influencia de las condiciones de cultivo (presencia y ausencia de oxígeno, pH) en la tasa de crecimiento y densidad máxima celular alcanzada por L. plantarum 299v y CECT 748. Estudiar y comparar la supervivencia de las dos cepas en un sistema modelo de jugo gástrico y sales biliares. Establecer si las condiciones de obtención del cultivo (presencia y ausencia de oxígeno, pH) influyen sobre la supervivencia de L.plantarum al jugo gástrico y a las sales biliares. Estudiar la capacidad antimicrobiana frente a diversos microorganis- 11 mos patógenos de interés en alimentos (L. monocytogenes, S. typhimurium, S. aureus y E. coli). Analizar la capacidad de fermentación de diferentes carbohidratos y determinar si existen diferencias intraespecíficas. Para ello se escogieron dos cepas que a priori podían presentar diferente comportamiento: L.plantarum 299v y L.plantarum CECT 748. La primera de ellas es una cepa aislada del intestino humano y considerada con capacidad probiótica, que se utiliza como suplemento farmacéutico en individuos con alteraciones en la función intestinal. La segunda es la cepa tipo de la colección americana, la ATCC 14917, cuyo origen es col fermentada. 12 — Capítulo 3— Material y Métodos 3.1. Medios de cultivo y de tratamiento El agar y el caldo de cultivo Man, Rogosa, Sharpe (MRS) así como el agar tripticasa-soja (TSA) y el caldo triticasa-soja (TSB) fueron administrados por la firma Biolife (Milán, Italia), y se prepararon siguiendo las instrucciones del fabricante. Los medios TSB y TSA fueron suplementados con 0,6% de extracto de levadura (EL, Biolife). Para llevar a cabo las diluciones decimales se utilizó como diluyente Maximum Recovered Diluent (MRD) (Oxoid). Todos los medios, una vez preparados, se esterilizaron en un autoclave durante 20 minutos a 121○C y se almacenaron hasta su posterior uso. 3.2. Microorganismos, suspensiones y curvas de crecimiento 3.2.1. Microorganismos Para este estudio se utilizaron las cepas microbianas presentes en la Tabla 3.1. Todas las cepas se conservaron en crioviales (Scharlau, Barcelona, España) a -80○C. 3.2.2. Suspensiones de trabajo Las suspensiones de L. plantarum se prepararon a partir del criovial en congelación. Se sembraron placas de agar MRS por agotamiento y se 13 3.2. Microorganismos, suspensiones y curvas de crecimiento Microorganismos Características Procedente del intestino humano Lactobacillus plantarum 299v y aislada del preparado comercial Protransitus LP (Laboratorios Salvat, SA, Barcelona). Lactobacillus plantarum CECT 748 Fermentación vegetales. Aislada a partir de col. Listeria monocytogenes CECT 4032 Serotipo 4b Staphylococcus aureus CECT 4459 Productora enterotoxina tipo B Escherichia coli O157:H7 No productora de enterotoxina Salmonella enterica serovar Typhimurium CECT 878 Tabla 3.1: Cepas utilizadas y sus características más relevantes incubaron durante 24 horas a 37○C en la cámara de anaerobiosis MACS VA500 (Don Whitley Scientific Limited, Shipley, Reino Unido). A partir de una colonia aislada se sembraron frascos que contenían 10 ml de caldo MRS estéril, se incubaron durante 12-16 horas a 37○C en agitación y de nuevo en condiciones anaeróbicas. Tras ese tiempo se inocularon 50 µl del precultivo en frascos de 50 ml de caldo MRS estéril obteniéndose una concentración inicial de aproximadamente 106UFC/ml. Posteriormente los frascos se incubaron en la cámara de anaerobiosis o, en caso de condiciones aerobias, en estufas de aire forzado (modelo HOTCOLD UL, Selecta). En ambos casos en agitación continua y a 37○C hasta alcanzar la fase de crecimiento deseada. El tiempo de incubación necesario para la obtención de suspensiones en fase estacionaria de crecimiento se determinó a partir de las curvas de crecimiento. En el caso de los microorganismos patógenos reseñados en la tabla 3.1, se siguió el mismo procedimiento pero utilizando caldo TSB-EL y agar TSA-EL como medios de cultivo, en condiciones de crecimiento a 37○C y aerobiosis. 14 3.2. Microorganismos, suspensiones y curvas de crecimiento Figura 3.1: Metodología utilizada para la obtención de las suspensiones en fase estacionaria. 3.2.3. Obtención de suspensiones a diferentes condiciones de pH Para estudiar la influencia del pH en el crecimiento y la resistencia celular se inocularon 100 µl de precultivo en frascos Erlenmeyer con 100 ml de caldo MRS en el cual se sumergió un electrodo de pH conectado a un titrador automático (Modelo pH Burette 24, Crison Instruments S.A., Alella, Barcelona, España). Este equipo permite la medida continua del pH y su mantenimiento a un valor constante preestablecido mediante la adición de volúmenes adecuados de una solución de ácido o de álcali. Además, el equipo dispone de un interface de conexión a un ordenador, para la adquisición y registro de los valores de pH y los volúmenes de reactivos añadidos a lo largo del tiempo de incubación. En esta investigación se obtuvieron suspensiones de L. plantarum en condiciones de pH constante de 5.0 y 7.0, utilizando como reactivos HCl 1N para acidificar el medio, y NaOH 1N para alcalinizarlo. Estos cultivos se obtuvieron siempre en condiciones de aerobiosis y se utilizó un sistema de agitación magnética para garantizar la homogeneidad. 15 3.2. Microorganismos, suspensiones y curvas de crecimiento 3.2.4. Curvas de crecimiento Para la elaboración de las curvas de crecimiento, se extrajeron 0.1 ml de muestra tras periodos de tiempo predeterminados. Se realizaron las correspondientes diluciones decimales y se sembraron en superficie en placas de agar MRS que se incubaron en cámara de anaerobiosis a 37○C durante 24 horas. El recuento se realizó de forma manual, y las curvas de crecimiento se elaboraron representando el logaritmo del número de UFC/ml frente al tiempo de incubación. Las curvas se obtuvieron al menos por duplicado para cada condición experimental (anaerobiosis pH sin controlar, aerobiosis pH sin controlar, aerobiosis pH 5,0 y aerobiosis pH 7,0) y para cada cepa (L. plantarum 299v y L. plantarum CECT 748). Las curvas de crecimiento se modelizaron utilizando el modelo de Gompertz (Gibson et al., 1988) para lo que se utilizó el programa Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Co., Redmond, Washington, EE. UU.) y la herramienta Solver. Dicho modelo viene definido por la siguiente ecuación: Figura 3.2: Ecuación de Gompertz La ecuación de Gompertz es uno de los modelos primarios más ampliamente utilizados para describir el crecimiento bacteriano. Representa un modelo de regresión no lineal. Su forma sigmoidal está representada por los siguientes parámetros: Nt; número de microorganismos a tiempo t (UFC/ml) N0: logaritmo decimal del número inicial de microorganismos (log UFC/ml) C: logaritmo del recuento en la fase estacionaria M Tiempo al cual el cultivo alcanza su máxima velocidad de crecimiento (horas) 16 3.3. Determinación de resistencia B: velocidad de crecimiento relativo en el punto M (horas -1) 3.3. Determinación de resistencia 3.3.1. Determinación de la resistencia al jugo gástrico simulado Para determinar la resistencia al jugo gástrico se utilizó el sistema modelo descrito por Vinderola et al. (2003). Como medio de tratamiento se utilizó tampón fosfato sódico 0.1M, (según Dawson R.M.C., 1974) que se esterilizó en el autoclave y se almacenó hasta su uso. Posteriormente se le añadió un 0.3% de pepsina (Sigma), 0.1% de NaCl y se acidificó con HCl hasta los valores deseados de pH (1.5, 2.0 y 2.5). Para ello se utilizó un pHmetro (modelo Basic 20, Crison Instruments S.A., Alella, Barcelona, España) al que se conectó un electrodo de pH (modelo 52 03, Crison Instruments S.A., Alella, Barcelona, España). Posteriormente se procedió a la esterilización por filtración con un filtro de 0.2 µm. Una vez filtrado se inocularon los microorganismos a una concentración inicial de aproximadamente 107UFC/ ml, en un volumen de trabajo de 10 mL. Se extrajeron muestras de 0.1 ml a intervalos de tiempo predeterminados neutralizándolas con tampón fosfato no acidificado, y tras las diluciones correspondientes se sembraron en superficie en placas de MRS para su posterior incubación. 3.3.2. Determinación de la resistencia a sales biliares Como medio de tratamiento se utilizó el tampón fosfato previamente esterilizado como se comenta en la determinación anterior. En este caso, se prepararon 10 ml de tampón fosfato, no acidificado (pH 7.0), en tubos estériles y se les añadió una cantidad determinada de Sales Biliares (Biolife, Milán, 17 4.1. Estudio de las condiciones de crecimiento cultivaron en condiciones en ausencia de oxígeno. La mayoría de las bacterias lácticas suelen desarrollarse mejor en sistemas anaeróbicos, aún cuando, como Lactobacillus plantarum son bacterias aero-anaerobias facultativas. Sin embargo, las dos cepas de estudio crecieron de manera muy similar bajo aerobiosis y anaerobiosis. El cultivo en condiciones de anaerobiosis no provocó la obtención de tasa de crecimiento más elevada (ver Tabla 4.1). Por el contrario, el crecimiento en condiciones de aerobiosis fue incluso más ventajoso, ya que, como se aprecia en la Figura 4.1, pasadas 48 horas el recuento en anaerobiosis había disminuído de manera más acusada. Sin embargo, este efecto no se confirmó en medio sólido MRS, donde el tamaño de las colonias era mucho menor cuando se incubaban en presencia de oxígeno (Figura 4.2), aunque los recuentos microbianos permanecían idénticos. Figura 4.2: Colonias en medio sólido en aerobiosis (izquierda) y anaerobiosis (derecha). 4.1.2. Crecimiento a distintos pH Como ya se ha mencionado en la introducción, las bacterias lácticas fermentan los azúcares del medio, produciendo su acidificación. Esta disminución del pH del medio, se cree es responsable de la inhibición del crecimiento y de la entrada en fase estacionaria de los cultivos, en la Figura 4.3, se muestra la variación del pH conforme aumenta el crecimiento microbiano de ambas cepas cultivadas en condiciones de aerobiosis y de anaerobiosis. 24 4.1. Estudio de las condiciones de crecimiento Figura 4.3: Variación del pH durante el crecimiento de L.plantarum. Se observa cómo el inicio de la bajada de pH comenzaba aproximadamente a las 2-3 horas de incubación, cuando el cultivo se encuentra en su fase exponencial y que el pH disminuía progresivamente a valores de aproximadamente 3.6-3.8, en los cuáles se estabilizaba una vez alcanzada la fase estacionaria para las dos cepas estudiadas y las dos condiciones de crecimiento. Dada la importante acidificación que se produce en el medio de cultivo, la neutralización del mismo es un recurso utilizado en la obtención industrial de cultivos iniciadores para conseguir una mayor densidad celular y con ello una mayor eficacia en el proceso de producción. Con objeto de comprobar este extremo, se obtuvieron las curvas de crecimiento de L. plantarum 299v y CECT 748 en condiciones de pH controlado, mediante el uso de un titrador automático. La Figura 4.4 muestra las curvas de crecimiento a dos niveles de pH (pH neutro 7.0 y pH ligeramente ácido 5.0) de las dos cepas objeto de estudio. Estas suspensiones se obtuvieron siempre en condiciones de aerobiosis. 25 4.1. Estudio de las condiciones de crecimiento Figura 4.4: Crecimiento de L.plantarum a pH constante. La Figura 4.5 muestra las curvas de crecimiento obtenidas para las dos cepas y las cuatro condiciones estudiadas a efectos comparativos. Es importante resaltar que las curvas correspondientes a las denominación de aerobiosis y anaerobiosis fueron obtenidas en condiciones de ausencia de control de pH (Figura 4.3) 26 4.1. Estudio de las condiciones de crecimiento Curvas crecimiento 299v 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 299v ana 299v aero 299v pH 7 299v pH 5 Tiempo (horas) Log Nº microorganismos (UFC/ml) Curvas crecimiento CECT 748 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 748 ana 748 aero 748 pH 7 748 pH 5 Tiempo (horas) Log Nº microorganismos (UFC/ml) Figura 4.5: Curvas de crecimiento de las dos cepas de L.plantarum estudiadas. Anaerobiosis( ), aerobiosis(∎), pH 7 constante(▲), pH 5 constante(▼). Los datos experimentales se ajustaron al modelo de Gompertz que describe la curva de crecimiento microbiana hasta el momento de comienzo del declive. Los coeficientes de determinación (r2) de todos los ajustes fueron superiores a 0.975. Los parámetros cinéticos obtenidos se incluyen en la Tabla 4.1. No C B M Recuento máx. (Log UFC/ml) (Log UFC/ml) (1/horas) (horas) (Log UFC/ml) 299v ana 6.099 3.549 0.235 3.421 9.648 299v aero 6.393 2.808 0.353 4.383 9.201 299v pH7 6.695 2.638 0.197 6.306 9.333 299v pH5 6.650 2.997 0.367 5.454 9.647 748 ana 6.323 3.111 0.301 5.204 9.434 748 aero 6.446 2.786 0.548 3.588 9.232 748 pH7 6.319 3.107 0.294 5.204 9.426 748 pH5 6.475 3.153 0.319 5.854 9.628 Tabla 4.1: Parámetros obtenidos para la modelización de las curvas de crecimiento Al comparar el crecimiento en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis se puede observar que, para las dos cepas estudiadas, se obtuvo una tasa de crecimiento más rápida en aerobiosis (parámetro B), aunque el recuento máximo alcanzado fue inferior. 27 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal Respecto al pH, se observa que a pH 5.0 se obtuvieron mayores concentraciones microbianas finales, y que a pH 7.0, las tasas de crecimiento fueron más bajas, sobre todo en la cepa 299v. Por otro lado, al comparar las etapas finales de la curva de crecimiento, no incluidas en la modelización de Gompertz, se observa que efectivamente el control del pH a un valor de 5.0 retrasaría la fase de declive en los dos microorganismos estudiados. En la siguiente sección se comprobará cuales de estas condiciones son las más adecuadas para los diferentes estudios de supervivencia. 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal Una de las principales características de los microorganismos probióticos es la capacidad de atravesar el sistema gastrointestinal para ejercer su función beneficiosa. El jugo gástrico y las sales biliares son las barreras más importantes a las que se ve expuesto un microorganismo probiótico en nuestro organismo. Pese a su importancia, no se conoce con detalle cómo podrían influir los factores fisiológicos celulares en la resistencia microbiana. En esta parte de la investigación se llevó a cabo un estudio para caracterizar y comparar la resistencia a jugo gástrico simulado y a sales biliares de las dos cepas objeto de estudio, y se evaluó la influencia de las condiciones de obtención del cultivo en dicha resistencia. 4.2.1. Resistencia a Jugo Gástrico simulado 4.2.1.1. Caracterización El jugo gástrico humano puede mostrar un pH variable, generalmente comprendido entre valores de 1.0 y 3.5, dependiendo de diversos factores 28 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal fisiológicos, como son entre otros, la presencia de bolo alimenticio. Inicialmente se caracterizó la resistencia a distintos valores de pH de las dos cepas cultivadas en condiciones de anaerobiosis (pH 1.5, 2.0 y 2.5), siguiendo la técnica que se cita en la sección 3.3.1. De este modo se escogieron las condiciones de trabajo más adecuadas para el estudio posterior. 299v anaerobiosis 0 20 40 60 80 100 120 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 pH 2 pH 1,5 pH 2,5 Tiempo(minutos) Log (Nt/No) 748 anaerobiosis 0 20 40 60 80 100 120 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 pH 2 pH 2.5 pH 1.5 Tiempo(minutos) Log (Nt/No) Figura 4.6: Gráficas de supervivencia frente al jugo gástrico simulado a pH 1.5(▲), 2.0( ) y 2.5(∎). La Figura 4.6 muestra las gráficas de supervivencia a los tres valores de pH estudiados en ambas cepas. La velocidad de inactivación fue menor conforme el pH del jugo gástrico simulado aumentaba, de hecho a pH 2.5 pasadas dos horas de tratamiento no existió tan apenas inactivación. Ambas cepas mostraron una cinética de inactivación muy similar, si bien la cepa CECT 748 fue ligeramente más resistente. Esta mayor resistencia se debe a la presencia de un fenómeno de hombro, que fue de mayor duración en la cepa 748 y que también se observó en las gráficas de supervivencia realizadas a pH 1.5. La presencia de fenómenos de hombro en las gráficas de supervivencia frente a los agentes químicos es un hecho frecuente (Cebrián et al., 2008), y se atribuye a la necesidad de que se produzca un número elevado de daños subletales en las células antes de que comience la inactivación celular. También se ha propuesto que el hombro podría ser el reflejo de un retraso 29 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal en el comienzo de la inactivación celular debido a la necesidad por parte del agente químico de atravesar las envolturas celulares antes de alcanzar sus dianas en el interior de las bacterias. Para llevar a cabo los estudios de resistencia bajo las diferentes condiciones de crecimiento, se eligió como pH de trabajo 2.0, ya que permitía obtener una gráfica de supervivencia en un tiempo de trabajo adecuado. 4.2.1.2. Influencia de las condiciones de cultivo A continuación se estudió la resistencia a jugo gástrico simulado (pH 2.0) con los cultivos crecidos en anaerobiosis, aerobiosis, a pH 7.0 constante y a pH 5.0 constante de ambas cepas obteniendo los siguientes resultados: 299v pH 2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 299v a pH 5 299v a pH 7 299v aerobiosis 299v anaerobiosis Tiempo(minutos) Log (Nt/No) 748 pH 2 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -5 -4 -3 -2 -1 0 1748 anaerobiosis 748 pH 5 748 aerobiosis 748 pH 7 Tiempo(minutos) Log (Nt/No) Figura 4.7: Gráficas de supervivencia frente al jugo gástrico simulado en condiciones de anaerobiosis( ), aerobiosis(∎), pH 7 constante(▲), pH 5 constante(▼). Como se puede observar en la gráfica, la influencia de las condiciones de crecimiento en la supervivencia al jugo gástrico fue similar para las dos cepas estudiadas. El cultivo obtenido a pH 7.0 fue el menos resistente. Por lo que respecta a la influencia de la presencia de oxígeno en el medio de cultivo, las células crecidas en aerobiosis mostraron mayor resistencia, si bien el efecto observado fue de pequeña magnitud. 30 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal Finalmente, las células crecidas a pH 5.0 mostraron la mayor capacidad de supervivencia frente al jugo gástrico simulado. Este efecto fue más evidente tras tiempos de exposición prolongados; por ejemplo, tras 120 minutos de tratamiento, se inactivaban únicamente 1.5 y 2.5 ciclos logarítmicos de la población de L. plantarum 748 y 299v respectivamente. Sin embargo para el resto de condiciones de cultivo el número de ciclos de inactivación superó los 4 ciclos definidos como límite de detección en el sistema experimental utilizado en este estudio. Una observación importante es que los hombros que mostraban las gráficas de supervivencia frente al jugo gástrico de las células obtenidas en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis a pH sin controlar, desaparecieron para aquellos cultivos obtenidos a pH controlado, 7.0 y 5.0. Estos resultados sugieren que las condiciones de cultivo, en particular el control del pH, provocan cambios en las células que determinan no solo su capacidad de supervivencia frente al jugo gástrico, sino también el modo por el cual dicho jugo gástrico inactiva a las células. El hecho de que las células cultivadas a pH 5.0 sean más resistentes que aquellas cultivadas a pH 7.0 era esperable, ya que se ha demostrado que la exposición continua a un pH ácido provoca respuestas adaptativas en los microorganismos, que adquieren resistencia a estreses ácidos aplicados posteriormente (Alvarez Ordoñez, et al., 2008). 4.2.2. Resistencia a las Sales Biliares 4.2.2.1. Caracterización Del mismo modo que en la resistencia a jugo gástrico simulado, para el estudio de la resistencia a las sales biliares, se realizó un primer estudio exponiendo a las dos cepas a concentraciones crecientes de sales biliares, según se describe en el apartado 3.3.2. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4.8. 31 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal 299v 0.15 0.30 0.50 1 2 5 -4 -3 -2 -1 0 Concentraciones SB Log (Nt/No) 748 0.15 0.30 0.50 1 2 5 -4 -3 -2 -1 0 2horas 0horas Concentraciones SB Log (Nt/No) Figura 4.8: Fracción de supervivientes frente a sales biliares tras 0 y 2 horas de exposición a diferentes concentraciones . Como se puede observar, en este caso, la cepa 748 mostró una mayor resistencia a las sales biliares que la 299v, a pesar de ser esta última la cepa con capacidad probiótica probada. La supervivencia celular fue menor conforme aumentó la concentración de sales biliares. Aunque tras dos horas de exposición no existieron diferencias estadísticamente significativas entre los resultados correspondientes a concentraciones de entre 0.30 y 5% para la cepa 299v (p <0.05). En ambas cepas, el mayor descenso en el número de supervivientes se produjo al inicio del experimento, sin embargo tras dos horas de ensayo los recuentos se mantuvieron prácticamente constantes. Este descenso inicial fue más acusado para la cepa L. plantarum 299v, de modo que concentraciones de 1, 2 y 5% produjeron una disminución de 2.5- 3.5 ciclos logarítmicos en el número de células viables inmediatamente tras añadir el inóculo. En la cepa CECT 748, los ciclos de inactivación observados tras la exposición a esas mismas concentraciones fueron de entre 0.5 y 1.5 ciclos logarítmicos. 4.2.2.2. Influencia de las condiciones de cultivo A continuación se estudió la influencia de las condiciones de cultivo, en anaerobiosis (pH sin controlar), aerobiosis (pH controlado), pH 7 constante 32 4.2. Estimación de la resistencia al tránsito gastrointestinal (aerobiosis) y pH 5 constante (aerobiosis), en la resistencia a las sales biliares (0.5% y 1 hora de exposición). Los resultados obtenidos se muestran en la figura 4.9. 299v 299v ana 299 aero 299v pH 7 299v pH 5 -4 -3 -2 -1 0 Log (Nt/No) CECT 748 748 ana 748 aero 748 pH7 748 pH 5 -4 -3 -2 -1 0 Log (Nt/No) Figura 4.9: Fracción de supervivientes tras 1 hora de exposición frente a las sales biliares a concentración 0.5% A diferencia de los resultados en la resistencia a jugo gástrico, se observa cómo las células crecidas a pH 5.0 en aerobiosis y las crecidas en anaerobiosis resultaban inactivadas en mayor grado que las crecidas en condiciones de aerobiosis a pH sin controlar o a pH 7.0. No obstante, únicamente se detectaron diferencias estadísticamente significativas (p <0.05) para la cepa 299v y entre las células crecidas en anaerobiosis y aerobiosis y entre las crecidas en anaerobiosis y pH 7. En el caso de la cepa 748 las diferencias no fueron estadísticamente significativas debido sin duda al bajo nivel de inactivación observado bajo las condiciones experimentales utilizadas dada la mayor resistencia de esta cepa. Por lo tanto, los resultados demuestran que aquellas condiciones de crecimiento que favorecen la supervivencia frente a la barrera estomacal (pH 5.0), no favorecen la supervivencia a las sales biliares. De igual modo, las células crecidas a pH 7.0, que se habían mostrado altamente sensibles al jugo gástrico, resultaron más tolerantes frente a las sales biliares, 33 4.4. Utilización de diferentes fuentes de carbono principalmente en vegetales y legumbres, cuya escisión requiere del enzima α-galactosidasa, que no está presente en nuestro intestino. Su presencia en el intestino provoca flatulencia debido a la utilización por parte de bacterias productoras de gas. Las bacterias lácticas capaces de utilizar estos oligosacáridos, como L. plantarum CECT 748, ejercen un efecto beneficioso, ya que son capaces bien de utilizarlos durante el proceso de fermentación de las materias primas alimentarias, como por ejemplo, una matriz a base de soja, o bien en el propio intestino, produciendo ácidos de cadena corta como principales metabolitos, evitando por tanto la formación de gas. 40 — Capítulo 5— Conclusiones 1. El comportamiento de las dos cepas de L. plantarum con respecto a las modificaciones en las condiciones de crecimiento es similar. Las tasas de crecimiento más bajas se obtuvieron en condiciones de aerobiosis a pH 7.0, y los recuentos máximos en fase estacionaria se obtuvieron en condiciones de anaerobiosis sin control de pH y en aerobiosis a pH 5.0. No obstante los máximos recuentos difirieron en, como máximo, 0.5 ciclos logarítmicos entre las cuatro condiciones de crecimiento y las dos cepas utilizadas. 2. Las condiciones de obtención del cultivo modifican la capacidad de supervivencia de L. plantarum al jugo gástrico, y del mismo modo para las dos cepas estudiadas. 3. Las células obtenidas en condiciones de pH 5.0 mostraron una mayor capacidad de supervivencia al jugo gástrico en comparación a las obtenidas a pH 7.0, en las dos cepas estudiadas. 4. La obtención de los cultivos en condiciones de anaerobiosis, en comparación a las condiciones de aerobiosis, provocó una disminución en la resistencia a las sales biliares de L. plantarum 299v. 5. La cepa L. plantarum 299v mostró menor resistencia a las sales biliares que la cepa CECT 748. 6. Las dos cepas de L. plantarum son capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos de interés alimentario como L. monocytogenes, Salmonella Typhimurium, S. aureus yE. coli. El efecto inhibidor del crecimiento que se ha observado es debido al pH ácido del caldo de cultivo. 7. El patrón de fermentación de azúcares dependió de la cepa. Así, se observaron diferencias en la capacidad de utilización de rafinosa y de lactosa. Ninguna de las dos cepas estudiadas sería un buen cultivo iniciador para fermentar productos de origen lácteo, por el contrario, las dos cepas mostraron 41 capacidad de fermentar azúcares abundantes en los productos vegetales, a excepción de dextrinas y almidón. 42 Bibliografía [1] Salminen MK,Rautelin H,Tynkkynen S,Poussa T,Saxelin M,Valtonen V,Jarvinen A.. Lactobacillus bacteremia, clinical significance, and patient outcome, with special focus on probiotic L. rhamnosus GG.(2004) Clin Infect Dis. 38:62-9. [2] Alvarez-Ordóñez A, Fernández A, López M, Arenas R, Bernardo A. Modifications in membrane fatty acid composition of Salmonella typhimurium in response to growth conditions and their effect on heat resistance. (2008) Int J Food Microbiol 30;123(3):212-9 [3] Archivald F,Fridovich I. Manganese and Defenses against Oxygen Toxicity in Lactobacillus plantarum. 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