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MASTER EN INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN MEDICINA UTILIDAD DE LA TROPONINA COMO BIOMARCADOR DE RIESGO CARDIOVASCULAR Y BÚSQUEDA DE NUEVOS BIOMARCADORES DE INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO (microRNAs) Por: Cecilia Asinari Director: Sebastian Menao Guillén Departamento Anatomía Patológica, Medicina Legal y Forense y Toxicología Servicio de Bioquímica Clínica Hospital Clínico Universitario Losano Bleza Zaragoza, España 2012 Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 2 Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 3 1. ÍNDICE Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 4 1. ÍNDICE ________________________________________________________________ 3 2. INTRODUCCIÓN ________________________________________________________ 5 2.1. Epidemiología del Síndrome coronario agudo ____________________________________ 6 2.2. Definición y fisiopatología del Síndrome coronario agudo __________________________ 7 2.3. Clasificación del Síndrome coronario agudo _____________________________________ 9 2.4. Definición y diagnóstico del Infarto de miocardio ________________________________ 10 2.5. Biomarcadores del Infarto agudo de miocardio __________________________________ 11 2.6. Papel de la Troponina en la estratificación de riesgo cardiovascular _________________ 12 2.7. Necesidad de nuevos biomarcadores ___________________________________________ 14 2.8. microRNAs: Definición, descubrimiento y biogénesis _____________________________ 16 2.9. Aplicaciones de los microRNAs _______________________________________________ 18 2.10. microRNAs y Síndrome coronario agudo ______________________________________ 20 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS _______________________________________________ 22 3.1. Hipótesis __________________________________________________________________ 23 3.2. Objetivos__________________________________________________________________ 24 4. MATERIAL Y MÉTODOS ________________________________________________ 25 4.1. Estudio retrospectivo de la Troponina I como marcador de riesgo cardíaco __________ 26 4.1.1. Pacientes ______________________________________________________________________ 26 2.4.2. Criterios de clasificación _________________________________________________________ 26 4.1.3. Análisis de datos ________________________________________________________________ 28 4.2. Determinación de microRNAs y Troponina I ____________________________________ 28 4.2.1. Pacientes ______________________________________________________________________ 28 4.2.2. Extracción de muestras y almacenamiento ____________________________________________ 29 4.2.3. Preparación del RNA y qRT-PCR __________________________________________________ 29 4.2.4. Análisis de troponinas ____________________________________________________________ 31 4.2.5. Análisis estadístico ______________________________________________________________ 31 5. RESULTADOS__________________________________________________________ 32 5.1. Estudio retrospectivo de Troponina I como marcador de riesgo cardíaco ____________ 33 5.1.1. Análisis del riesgo de la población general ____________________________________________ 33 5.1.2. Seguimiento de los pacientes con riesgo de presentar un evento adverso futuro _______________ 36 5.2. Determinación microRNAs mediante RT-qPCR y su comparación con TnIc__________ 39 7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES __________________________________________ 40 8. BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________________ 44 Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 5 2. INTRODUCCIÓN Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 6 2.1. Epidemiología del Síndrome coronario agudo Las enfermedades del sistema circulatorio constituyen la principal causa de muerte para el conjunto de la población española. En 2010, último año para el que hay datos publicados, produjeron 119063 muertes lo que supone un 31,2% de todas las defunciones (1) (Figura 1). Figura 1. Causas de defunción según CIE (Clasificación internacional de enfermedades) A nivel mas detallado de enfermedades, las isquémicas del corazón en 2010 causaron 35259 muertes, lo que supone un 9,22% de todas las defunciones, de las cuales 15039 defunciones ocurrieron en las mujeres (42,7%) y 20220 en los varones (57,34%) (2). Dentro de la enfermedad isquémica del corazón, el infarto agudo de miocardio es la más frecuente. Desafortunadamente, esta patología es muy letal y las tasas de reingreso se han estimado en 50% en los pacientes de menos de 45 años y en 38% en los de más de 75 años (3). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 7 Le siguen en frecuencia las Enfermedades cerebrovasculares, el Cáncer de bronquios y pulmón, la Insuficiencia cardíaca y por último las enfermedades crónicas de las vías respiratorias inferiores (Figura 2). Las isquémicas fueron la primera causa en los hombres y las cerebrovasculares en las mujeres con un 58,1% (2). Figura 2. Defunciones según las principales causas de muerte Muchas de las muertes por isquemia miocárdica se producen en la fase de descompensación de la enfermedad arteriosclerótica coronaria que se conoce como Síndrome coronario agudo (SCA). La gravedad del SCA y, en consecuencia, la morbi-mortalidad asociada al mismo depende de manera muy importante de que durante el mismo se produzca o no necrosis miocárdica. 2.2. Definición y fisiopatología del Síndrome coronario agudo El término síndrome coronario agudo hace referencia a todos los cuadros clínicos relacionados con la isquemia miocárdica aguda. La isquemia es una situación producida por la deprivación de oxígeno causada por una disminución del Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 8 flujo sanguíneo a través de las arterias coronarias (4). La causa mas frecuente de la isquemia es la reducción del flujo producida por una disminución u obstrucción de la luz arterial debidas principalmente a lesiones aterosclerosas de las grandes arterias epicárdicas coronarias. Otras causas menos frecuentes de la isquemia son los espasmos coronarios, trombosis coronaria, embolias, disección espontánea de las arterias coronarias, enfermedad de los pequeños vasos y arteritis. En los primeros segundos, después del cese del flujo sanguíneo, se agota el oxígeno y el metabolismo se convierte en anaerobio, esto hace que se alteren las propiedades elásticas del miocardio, que cese la actividad contráctil, que disminuya el potencial de acción y por lo tanto aparecen cambios electrocardiográficos. Además, la isquemia provoca la liberación celular de diferentes sustancias que estimulan las terminaciones nerviosas y provocan el dolor característico de la isquemia miocárdica. Otra consecuencia de la isquemia es la alteración de las propiedades eléctricas de las células cardíacas, al reducir la energía necesaria para el funcionamiento de la bomba de sodio. Esta alteración eléctrica provoca a menudo arritmias cardíacas que pueden ser letales. Por último, la disminución del flujo coronario puede ser tan profunda que determine la muerte celular o produzca necrosis miocárdica (4). Por lo tanto, las consecuencias de la isquemia son: el dolor coronario o angina de pecho, la disfunción diastólica o sistólica y su consecuencia la insuficiencia cardíaca, las arritmias que pueden determinar la muerte súbita y, por ultimo, la necrosis, es decir el infarto de miocardio. Estas patologías constituyen las formas de presentación más habituales de la cardiopatía coronaria y en un paciente determinado la enfermedad puede comenzar con cualquiera de ellas, es más, en su Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 9 evolución es habitual que estén presentes más de una. La angina de pecho es la forma inicial de presentación mas frecuente seguida por el infarto de miocardio y la muerte súbita. 2.3. Clasificación del Síndrome coronario agudo El electrocardiograma (ECG) permite subdividir rápidamente a los pacientes con SCA en dos grandes grupos según si presentan o no elevación del segmento ST (5). Es importante su diferenciación dado que el riesgo inmediato, tratamiento y gestión difieren según el grupo.  Pacientes con elevación del segmento ST: En presencia de síntomas sugestivos de isquemia miocárdica, la elevación del segmento ST en el ECG, o la existencia de un bloqueo de rama agudo, identifica al subgrupo de pacientes con mayor riesgo de complicaciones cardiovasculares graves a corto plazo. El diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM) se confirmará posteriormente a la obtención del ECG mediante la determinación de marcadores biológicos como veremos mas adelante. Habitualmente estos pacientes presentan un IAM secundario a una oclusión coronaria completa que en ausencia de repermeabilización coronaria derivará la mayoría de las veces en un infarto de miocardio con onda Q (IMQ). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 16 patología. Así surgen los microRNA, pequeños RNA no codificantes que regulan la expresión génica a nivel post transcripcional. 2.8. microRNAs: Definición, descubrimiento y biogénesis Los microRNAs (miRNA o miR) son RNAs de cadena sencilla, de 21 a 22 pares de bases de longitud, que han demostrado tener un papel clave en la supervivencia, el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular. Los genes que los codifican están ubicados en los cromosomas y la mayoría se encuentran agrupados. Podemos agrupar los microRNAs, según su localización en el genoma, en dos categorías: a) miRNAs intergénicos, se encuentran entre los genes codificantes de proteínas y b) miRNAs intragénicos, se encuentran dentro de estos genes. Los intragénicos pueden ser intrónicos o exónicos, según se encuentren dentro de los intrones o exones del gen codificante de proteínas, y a su vez pueden estar en la región no codificante 3` o 5`. La mayoría de los RNAs que se han identificado en humanos son intergénicos (42%) e intragénicos intrónicos (44%) (23). Fueron descubiertos por Ambros et al. en 1993 mientras estaban estudiando el desarrollo larval del C. elegans. Describieron el primer RNA: el lin-4 (24). Hoy sabemos, que solo en el genoma humano existen cientos de RNAs. Según miRBase, la base de datos en línea que contiene información sobre microRNAs, existen actualmente 6200 secuencias de microRNAs maduros publicados que incluyen los más de 700 microRNAs encontrados en humanos (25). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 17 Los microRNAs se generan a partir de transcripciones primarias, llamadas miRNAs primarios (pri-miRNAs), producidas por la ARN polimerasa II o por la RNA polimerasa III. Un complejo de proteínas nucleares llamado "microprocesador" (que consiste en la proteína Drosha tipo RNasa III, la doble cadena ARN-proteína de unión DGCR8, y una serie de otras proteínas), escinde los pri-miRNAs generando microRNAs precursores (pre-miRNAs) y permitiendo su exportación al citoplasma. Allí, los pre-miRNAs son procesados por un complejo de proteínas que contiene a la proteína Dicer RNasa tipo III que escinde al microRNA a su tamaño maduro. El microARN maduro se asocia con un complejo de proteínas finales llamado miRISC (complejo microRNA-silenciación inducida), que lleva a cabo el silenciamiento de los genes dirigido por el microRNA (26). Figura 5. Biosíntesis de los microRNAs Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 18 2.9. Aplicaciones de los microRNAs A partir de su descubrimiento se han ido postulando diversas aplicaciones de los microRNAs, primero determinando la expresión en tejidos y luego, a partir de su demostración en sangre periférica, la determinación en suero/plasma. La mayoría de las veces solo un microRNA regula la expresión de varios genes con funciones relacionadas y así modificar procesos biológicos complejos. Los microRNAs regularían la apoptosis celular y estarían implicados en la fisiopatología de muchas enfermedades asociadas con proliferación celular y apoptosis. Actuarían reprimiendo la expresión de genes tanto proapoptóticos como antiapoptóticos. Además, se cree que podrían ser utilizados como nuevas dianas terapéuticas para estas enfermedades (23). Se esta evaluando si los microRNA podrían usarse como marcadores de progresión de las enfermedades, como factores pronósticos y para estratificar el riesgo, principalmente en el área de la oncología ya que podrían comportarse como supresores de tumores y oncogenes. Actualmente se esta evaluando su relación con diferentes clases de tumores como Cáncer de próstata, Carcinomas escamosos de cabeza y cuello, Cáncer de mama, Leucemia linfoblástica aguda, Mesoteliomas malignos, entre otros (27-29). En el campo de la Endocrinología y el metabolismo se ha demostrado que la sobreexpresión de miR-375 inhibe la secreción de la insulina promovida por la Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 19 glucosa (30). Y un estudio reciente demuestra que miR-122 regula el metabolismo lipídico en el hígado (31). La mayoría de los estudios se basan en la detección de los miRNA en los tejidos pero también pueden ser detectados en sangre periférica y podrían ser usados como biomarcadores potenciales (32). Por eso, nos ofrecen una oportunidad única para el diagnóstico de diversas enfermedades, ya que algunos son producidos específicamente dentro de las células de diferentes tejidos existiendo la posibilidad de poder ser empleados como marcadores de la patología específica de cada uno (33). El mecanismo de liberación a la sangre periférica todavía no es claro, pero se cree que serían secretados en micro vesículas llamadas exosomas (34). También se ha postulado que los microRNA circulantes o incluidos en estas micro vesículas tendrían una función de comunicación celular y de autorregulación entre células distantes (35). Los microRNA se han convertido rápidamente en un objetivo farmacológico para el tratamiento de las enfermedades vasculares. El descubrimiento de los anti-miR (oligonucleótidos antisentido con la secuencia reversa complementaria de los miRNA objetivo) y de los miRNA-imitación (RNA sintético en el que una hebra es idéntica al microRNA maduro y esta destinada a imitarlo) ha permitido inhibir, de una manera relativamente fácil y rápida, la actividad de miRs individuales in vitro e in vivo (36, 37). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 20 2.10. microRNAs y Síndrome coronario agudo Un buen biomarcador de cualquier patología debe ser accesible utilizando técnicas no invasivas, económico, específico de la patología en cuestión y un indicador seguro de la enfermedad antes que aparezcan los síntomas clínicos. Dado que los microRNAs son abundantes, fáciles de medir y relativamente estables en suero/plasma, la sangre periférica es una fuente particularmente atractiva para la determinación rutinaria de estas moléculas. A partir de esta premisa, diversos estudios han intentado demostrar que en muestras de plasma de pacientes con infarto agudo de miocardio se encuentran elevados diversos microRNAs. Un estudio realizó un análisis de expresión en tejido miocárdico de los diversos tipos de miRNA usando RT-PCR y encontraron que 43 miRNAs diferentes se expresan en diversas patologías cardíacas (38). Varios estudios los han implicado en la regulación de la hipertrofia cardiaca en modelos con ratas en respuesta al estrés tanto patológico como fisiológico (39, 40), en la regulación de la apoptosis de los cardiomiocitos (41), en la regulación de las arritmias por isquemia (42) y de la angiogénesis post isquemia (43). Otros demostraron que diversos subtipos de microRNAs se elevan en el plasma en diversas patologías cardíacas, y por tanto podrían ser usados como biomarcadores del infarto de miocardio (44-48). Se ha demostrado que el miR-208 solo se expresa en los miocitos cardíacos (39) y estudios en animales demuestran que podría se usado como un biomarcador potencial de daño miocárdico comparado con la Troponina I (49). En un estudio que analizó pacientes con angor demostró que los niveles plasmáticos de miR-208 Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 21 podían detectar pacientes con IAM con una sensibilidad del 90.9% y una especificidad del 100% en las primeras 4 horas de iniciados los síntomas de enfermedad isquémica cardíaca. Este miR, que resulto ser el mas sensible y específico de los cuatro miRs investigados en este estudio, pudo detectarse en todos los pacientes mientras que la Troponina medida paralelamente solo puedo detectarse en el 85% (45). Otro trabajo postula a los subtipos -1 y -133 como biomarcadores de la cardiopatía isquémica, ya que en humanos se elevaron antes que las troponinas (44). Se estudio también el papel del miR-499 en el infarto de miocardio y se concluyó que se produce casi exclusivamente en el corazón y está elevado en individuos con IAM pero están por debajo del límite de detección en pacientes sanos del grupo control (46). Todos estos estudios apoyan la hipótesis de que los microRNAs presentes en sangre periférica pueden convertirse en biomarcadores útiles y seguros en la enfermedad coronaria y en otras enfermedades cardiovasculares. Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 22 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 23 3.1. Hipótesis Las troponinas son los biomarcadores de elección en la actualidad, diversos estudios han demostrado su buena sensibilidad y especificidad. Además, se ha confirmado su utilidad como predictoras y estratificadoras de riesgo ya que valores altos de Troponina predicen el riesgo de sufrir eventos adversos en el futuro y la magnitud de su elevación se correlaciona con ese riesgo. Se postula que valores intermedios, comprendidos entre 0,05 y 0,5 ng/mL, que no se traducen fisiopatológicamente en necrosis miocárdica ni clínicamente en IAM, podrían predecir estos eventos isquémicos graves en el futuro. En el SCA es muy importante realizar un diagnóstico precoz para poder instaurar el tratamiento oportuno lo antes posible. Se cree que los microRNAs se transcriben a nivel celular cuando las células miocárdicas sufren un daño mínimo que no llega a la muerte celular, en este caso por isquemia, y por ello podrían realizar un diagnóstico más precoz que los biomarcadores actuales permitiendo la instauración del tratamiento oportuno disminuyendo así la morbi-mortalidad de esta patología. Además, podrían ser utilizados como predictores y estratificadores de riesgo ya que pequeños cambios en su concentración en sangre periférica, es decir antes de que se produzca un daño celular irreversible, nos indicaría el riesgo de sufrir un evento adverso en el futuro. Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 24 3.2. Objetivos  Evaluar la utilidad pronostica de valores intermedios de Troponina I en pacientes con clínica de dolor torácico en relación con infarto en episodios posteriores.  Otro de los propósitos de este estudio es verificar la utilidad como prueba de cribado de los valores de microRNA en sangre, para establecer el diagnóstico de IAM, en especial cuando las cifras de Troponinas no otorguen suficiente evidencia diagnóstica.  Además se intentará demostrar la utilidad de los microRNAs en el diagnóstico en humanos y sus posibles ventajas (sensibilidad, especificidad y pronóstico) frente a los marcadores bioquímicos utilizados en la actualidad. Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 25 4. MATERIAL Y MÉTODOS Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 32 5. RESULTADOS Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 33 5.1. Estudio retrospectivo de Troponina I como marcador de riesgo cardíaco Se determinaron 36359 Troponinas en el Laboratorio e Urgencias, las cuales pertenecen a 14251 pacientes. Se excluyeron los pacientes con más de dos eventos con el propósito de unificar criterios a la hora de clasificarlos y facilitar el seguimiento de los mismos. 5.1.1. Análisis del riesgo de la población general En un primer análisis el objetivo fue probar la capacidad de las Tn con valores intermedios para estimar el riego de presentar en un evento futuro un posible infarto. Para ello, se partió de la población inicial (n=13315) y se excluyeron los pacientes que en un primer evento tuvieron un valor de Tn alto (>0,50 ng/mL) ya que estos pacientes presentaron un infarto en el primer evento y el riesgo de presentar otro esta condicionado. También se excluyeron aquellos pacientes que en un segundo evento tuvieron un valor medio (entre 0,05 y 0,5 ng/mL) ya que constituyen una zona indefinida que solo podrán evaluarse en el futuro. Finalmente se trabajo con 11108 pacientes. La probabilidad de sufrir un posible infarto (Tn>0,50 ng/mL) dado que en el primer evento el valor de las Tn fueron bajas es del 0,79%, mientras que la probabilidad de sufrir un posible infarto aumenta a 2,31% cuando en el primer evento el valor de las Tn fue medio. En la Tabla 1 se presentan los resultados en la tabla de Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 34 contingencia. Se realizó una prueba de Chi cuadrado y se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las probabilidades de infarto (p<0,01). Por lo tanto, podemos decir que un posible infarto de miocardio es 3 veces mas probable si en el primer evento se determinan Tn medias (OR=2,99). 1º Evento Normal Posible IAM Total Tn bajas 9090 72 9162 Tn medias 1901 45 1946 Total 10991 117 11108 X2 obervasdo = 35,89 X2 ajustado = 34,44 Prob = 2,1E-09 X2 crítico al 99% = 6,63 Tabla 1. Probabilidad de posible infarto 2º Evento Como se muestra la Tabla 2, la probabilidad de sufrir un evento adverso coronario (IAM, SCA sin elevación del ST, Angor, Cardiopatía isquémica en general o exitus) es del 0,36% si en el primer evento el valor de las Tn fue bajo, pero esta probabilidad asciende al 1,23% si el valor fue medio. Al realizar el Test estadístico de Chi cuadrado se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las probabilidades de un evento coronario (p<0,01). Por lo tanto, podemos decir que la probabilidad de que un paciente que en el primer evento tuvo valores de Tn medios presente un efecto adverso es del 78% comparado con un paciente que en el primer evento tuvo valores de Tn bajos (OR=3,45). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 35 1º Evento Sin EAC Con EAC Total Tn bajas 9129 33 9162 Tn medias 1922 24 1946 Total 11051 57 11108 X2 obervasdo = 23.97 X2 ajustado = 22.29 Prob = 9.79E-07 X2 crítico al 99% = 6,63 Tabla 2. Probabilidad de evento adverso coronario 2º Evento Se realizó el estudio estadístico por separado según el diagnóstico en el segundo evento, IAM o Exitus, y se encontró que en estos casos también existen diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (p<0,01). Los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4. 1º Evento Sin IAM Con IAM Total Tn bajas 9145 17 9162 Tn medias 1935 11 1946 Total 11080 28 11108 X2 obervasdo = 9.20 X2 ajustado = 7.76 Prob = 2.41E-03 X2 crítico al 99% = 6,63 Tabla 3. Probabilidad de IAM 2º Evento 1º Evento Sin Exitus Con exitus Total Tn bajas 9147 15 9162 Tn medias 1932 14 1946 Total 11079 29 11108 X2 obervasdo = 19.04 X2 ajustado = 16.96 Prob = 1.3E-05 X2 crítico al 99% = 6,63 Tabla 4. Probabilidad de Exitus 2º Evento Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 36 5.1.2. Seguimiento de los pacientes con riesgo de presentar un evento adverso futuro Partiendo de los resultados del anterior análisis se realizó un seguimiento de los pacientes con riesgo de presentar un evento adverso en el futuro (IAM o Exitus). Se partió desde la misma población inicial que el anterior análisis y se seleccionó una subpoblación (n=527) en la que en algún evento los valores de Tn estuvieron entre 0,05 y 0,50 ng/mL, por lo tanto se excluyeron a los pacientes a los cuales en los dos eventos las Tn fueron bajas o altas (Figura 1). Figura 6. Determinaciones de Tn en dos eventos 62% 12% 26% Tn bajas en los dos eventos Tn altas en los dos eventos Tn medias al menos en un evento A esta subpoblación se la clasifico en grupos según los valores de Tn para poder realizar un mejor análisis de los datos (Figura 7). Hay 319 hombres y 207 mujeres (61% y 39% respectivamente) y según la distribución por edad, la mayoría de los pacientes (67%) están comprendidos entre los 70 y los 90 años de edad (Tabla 2). Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 37 Figura 7. Clasificación según valores de Tn 57 189 45 145 72 19 Grupo I - Falso pronóstico Grupo II - Futuro riesgo Grupo III - Pronóstico correcto Grupo IV - Posible Riesgo Grupo V - No pronosticado Grupo VI - Condicionados EDAD Grupo I - Falso pronóstico Grupo II - Futuro riesgo Grupo III - Pronóstico correcto Grupo IV - Posible riesgo Grupo V - No pronosticado Grupo VI - Condicionados Total general 20-29 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 30-39 0% 0% 0% 0% 0% 0% 1% 40-49 1% 1% 0% 1% 1% 0% 3% 50-59 0% 4% 0% 4% 1% 1% 10% 60-69 3% 5% 1% 3% 2% 1% 15% 70-79 4% 13% 4% 8% 5% 1% 35% 80-89 3% 12% 3% 10% 4% 0% 32% 90->100 0% 2% 0% 1% 1% 0% 4% Total general 11% 36% 9% 28% 13% 4% 100% Tabla 2. Distribución de edades según clasificación Se escogieron el grupo III, de pronóstico correcto, (Tn entre 0,05 y 0,5 ng/mL en un primer evento que son seguidas por valores mayores a 0,5 ng/mL en el segundo) y el grupo V, no pronosticados (Tn que en un primer evento son menores a 0,05 ng/mL y que en el segundo evento tienen valores mayores a 0,5 ng/mL) para comparar el riesgo de sufrir un evento adverso en el futuro. Se revisaron los diagnósticos clínicos en el primer y segundo evento y se contabilizaron los pacientes Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 38 que presentaron patologías cardíacas en el segundo evento relacionadas con el SCA, especialmente IAM y Exitus (Figura 8). 9 9 7 8 6 9 0 4 14 15 IAM SCASEST ANGOR CI EXITUS Figura 8. Diagnóstico en el segundo evento según grupos Diagnóstico 2 evento Grupo III - Pronóstico correcto Diagnóstico 2 evento Grupo V - No pronosticado Se analizo también, el tiempo que pasa entre el primer y el segundo evento, encontrando que la mayoría (63%) vuelve antes del primer año y que en los primeros tres meses vuelve un 30% de los pacientes (Figura 9). 44% 30% 11% 17% 11% 4% 9% 11% 7% 14% 11% 9% 7% 14% 0% 3% 3 meses 6 meses 9 meses 1 año 1 año y 1/2 2 años 3 años 4 años Figura 9. Tiempo entre el primer y segundo evento Grupo III - Pronóstico correcto Grupo V - No pronosticado Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 39 5.2. Determinación microRNAs mediante RT-qPCR y su comparación con TnIc Se presenta la elección de la metodología y los materiales que van a ser utilizados, así como los resultados esperados del experimento que va a ser desarrollado en los próximos años durante la Tesis Doctoral. Se utilizará como kit de extracción miRCURY RNA Isolation kits (Exiqon) debido a su compatibilidad con la marca del equipo de RT-qPCR. Se decide utilizar el kit Universal cDNA síntesis kit (Exiqon) para la síntesis de cDNA y el kit mircury LNA universal RT microRNA PCR system (Exiqon) que utiliza marcadores fluorescentes genéricos (SYBR Green master mix, Exiqon) y diferentes “primers” para cada tipo de microRNA que queramos determinar. El análisis de los datos de las curvas de fusión se realizarán de manera relativa utilizando genes de referencia internos (control primer sets, Exiqon). Esta etapa del trabajo se encuentra en fase de recolección de muestras pero se espera encontrar niveles elevados de miR-1, miR-133a, miR-499 y miR-208 en suero de pacientes con IAM así como demostrar su utilidad como biomarcadores en la urgencia médica ya que permitirán realizar el diagnóstico más precozmente que la Troponina I, con niveles de sensibilidad y especificidad similares. Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 40 7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 41 Las enfermedades cardiovasculares son un problema de salud muy importante en España. Las Troponinas cardíacas son el pilar diagnóstico sobre el que se apoya la clínica y la terapéutica de muchos de los Síndromes coronarios que se evalúan en los Servicios de Urgencias y además, han demostrado su utilidad para la estratificación del riesgo cardiovascular (5). Un ligero aumento de las Troponinas se asocian a tasas mas altas de eventos cardiovasculares comparadas con niveles normales en el contexto de un SCA, pero el significado de estas Troponinas con pequeñas elevaciones en pacientes sin clínica es muy variado (16), por lo tanto el objetivo de esta investigación ha sido comprobar la utilidad de la Troponina I con valores ligeramente elevados como biomarcador de riesgo. Diferentes estudios demostraron que pacientes con Tn iniciales medias presentaron una elevación posterior de Tn pero concluyeron que estas no indican un SCA por sí mismas (15). Por otra parte, un estudio demostró que los valores intermedios de Tn son un marcador pronóstico independiente de mortalidad pero sólo en pacientes ingresados en la Unidad de Cuidados Intensivos y sin diagnóstico inicial de SCA (16). Hay que mencionar que en todos los estudios que evalúan la utilidad de las ligeras elevaciones de Tn no hay un consenso con respecto al rango de valores. En el presente estudio se recopilaron las determinaciones de TnI de los últimos cuatro años que se realizaron en el Hospital Clínico Universitario de Zaragoza. De acuerdo con esta investigación, aquellos pacientes con un valor de TnI ligeramente elevado presentaron mayor riesgo de tener un importante aumento de TnI en el futuro compatible con SCA. Al analizar detalladamente los diagnósticos clínicos de estos pacientes se encontró que la probabilidad de sufrir un infarto agudo Master Iniciación a la Investigación en Medicina Cecilia Asinari 48 37. Morrisey EE. The magic and mystery of miR-21. J Clin Invest. 2010 Nov;120(11):3817-9. PubMed PMID: 20978356. Pubmed Central PMCID: PMC2964999. eng. 38. Ikeda S, Kong SW, Lu J, Bisping E, Zhang H, Allen PD, et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiol Genomics. 2007 Nov;31(3):367-73. PubMed PMID: 17712037. eng. 39. van Rooij E, Sutherland LB, Qi X, Richardson JA, Hill J, Olson EN. Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA. Science. 2007 Apr;316(5824):575-9. PubMed PMID: 17379774. eng. 40. Carè A, Catalucci D, Felicetti F, Bonci D, Addario A, Gallo P, et al. MicroRNA- 133 controls cardiac hypertrophy. Nat Med. 2007 May;13(5):613-8. PubMed PMID: 17468766. eng. 41. Tang Y, Zheng J, Sun Y, Wu Z, Liu Z, Huang G. 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