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Epidemiología y caracterización de β – lactamasas plasmídicas (BLEES, AmpC y carbapenemasas) presentes en Enterobacterias de portadores fecales de origen hospitalario y ambulatorio Ana Garrido Buenache Dirigido por: F. J. Castillo García C. Seral García Universidad de Zaragoza - Curso 2011-2012 Proyecto Fin del Máster Iniciación a la Investigación en Medicina 1 ÍNDICE 1 Introducción ......................................................................................................................................... 3 1.1 Familia Enterobacteriaceae......................................................................................................... 3 1.2 Antibióticos β-lactámicos ............................................................................................................ 7 1.2.1 Mecanismo de acción de los antibióticos β-lactámicos ......................................................... 7 1.2.2 Estructura y clasificación de los antibióticos β-lactámicos ..................................................... 9 1.3 Mecanismos de resistencia a los antibióticos β-lactámicos...................................................... 17 1.3.1 β-lactamasas ......................................................................................................................... 19 1.3.2 Clasificación de las β–lactamasas ......................................................................................... 20 1.3.3 β-lactamasas cromosómicas ................................................................................................. 25 1.3.4 β-lactamasas plasmídicas ..................................................................................................... 27 1.3.5 β-lactamasas de espectro extendido CTX-M ........................................................................ 33 2 Objetivos ............................................................................................................................................ 39 3 Material y métodos ............................................................................................................................ 41 3.1 Detección fenotípica de mecanismos de resistencia ................................................................ 41 3.1.1 Test de sinergia de doble disco............................................................................................. 41 3.1.2 Prueba de Epsilon-test (ε-test®) ........................................................................................... 43 3.2 Detección molecular de las β-lactamasas plasmídicas ............................................................. 44 3.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa................................................................................... 44 4 Resultados .......................................................................................................................................... 52 4.1 Selección de los aislamientos .................................................................................................... 52 2 4.2 Detección de los fenotipos de resistencia ................................................................................ 52 4.3 Presencia de BLEES ................................................................................................................... 55 4.3.1 Confirmación de BLEEs mediante métodos moleculares ..................................................... 55 4.3.2 Caracterización de las BLEEs ................................................................................................. 59 4.3.3 características de los portadores fecales de BLEEs............................................................... 61 4.4 Presencia de AmpC ................................................................................................................... 64 4.4.1 Confirmación de las ampc plasmídicas mediante métodos moleculares ............................. 64 4.4.2 Características de los portadores fecales de Ampc .............................................................. 65 4.5 Prevalencia de las β-lactamasas plasmídicas ............................................................................ 66 5 Discusión............................................................................................................................................. 67 5.1 Epidemiología de las β-lactamasas de espectro extendido ...................................................... 67 5.1.1 Epidemiología de las BLEEs en nuestra región ..................................................................... 67 5.1.2 Epidemiología de las BLEEs en España ................................................................................. 68 5.1.3 Epidemiología de las BLEEs en europa ................................................................................. 70 5.1.4 Epidemiología de las BLEEs en asia ....................................................................................... 71 5.1.5 Epidemiología de las BLEEs en áfrica .................................................................................... 72 5.2 Epidemiología de las AmpC ....................................................................................................... 73 5.3 Interés del estudio .................................................................................................................... 73 6 Conclusiones ....................................................................................................................................... 74 7 Limitaciones del estudio ..................................................................................................................... 75 8 Bibliografía .......................................................................................................................................... 76 1. Introducción 3 1 INTRODUCCIÓN 1.1 FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE La familia Enterobacteriaceae, denominada así por Rahn en 1937 (1), está formada por un conjunto de bacilos gramnegativos, heterogéneos en cuanto a su hábitat y capacidad patógena, pero incluidos en ella por la semejanza en sus caracteres estructurales y fisiológicos y su homología genética. En la actualidad conforman un grupo de más de 157 especies (2) incluidas en 66 géneros, englobando además a todo un conjunto de enterobacterias no clasificadas con un elevado grado de homología estructural y fisiológica (3). Las enterobacterias son microorganismos ubicuos. Muchos miembros de esta familia forman parte de la microbiota comensal estable o transitoria del tracto intestinal de los humanos y de los animales, aunque también pueden colonizar otros nichos ecológicos como el agua, el suelo o ser parásitos de vegetales (4, 5). Son resistentes a agentes externos, de ahí su amplia distribución. Fisiológicamente, su tamaño oscila entre 2-6 μm por 0,3-0,6 μm, no esporulados. Estos organismos crecen bien en medios convencionales simples, tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, ya que son anaerobias facultativas. En medio sólido (agar sangre o chocolate), suelen presentar una morfología de las colonias muy similar, en forma de cúpula, lisa y amarillenta. Son catalasa positiva (con la excepción de Shigella dysenteriae), oxidasa negativa (menos Plesiomonas shigelloides), reducen los nitratos a nitritos y fermentan la glucosa por la vía ácidomixta o del butanodiol. Degradan también a un amplio conjunto de otros carbohidratos y las diferencias metabólicas han servido clásicamente para establecer los criterios para la identificación de las especies (identificación bioquímica). Pueden ser móviles (con flagelos peritricos) o inmóviles (como Shigella, Klebsiella, y Yersinia pestis a 37ºC). Además de los flagelos, muchas especies producen fimbrias (pili). Las fimbrias están presentes en casi todas las especies y son responsables de la fijación de las células bacterianas a otras bacterias, a las células huéspedes o actúan como receptores de bacteriófagos. También pueden poseer una cápsula bien definida o una cubierta laxa y mal definida, de estructura polisacárida, o sin cubierta (5). La pared celular de las enterobacterias está formada por una bicapa lipídica, conocida como membrana externa, que contiene proteínas, tales como las porinas, formadoras de canales que permiten el paso de moléculas hidrofílicas no mayores de 1.000 daltons (Da). También Se localizan en esta membrana 1. Introducción 4 externa los fosfolípidos y el lipopolisacárido (LPS), cuya región más interna, conocida como lípido A, es una endotoxina formada por ácidos grasos insaturados (Figura 1). Dicha región es la principal responsable de la menor fluidez de la membrana externa y de la poca permeabilidad a muchas moléculas hidrofílicas, incluyendo a muchos antibióticos. La región de polisacáridos del LPS la forman el núcleo o core al cual se ancla la región más distal, denominada polisacárido específico O, cuya especificidad viene determinada por una secuencia repetitiva de azúcares, a menudo ramificados. Las variaciones en las ramificaciones constituyen el antígeno somático O. Esta porción condiciona la virulencia de las bacterias gramnegativas patógenas, por lo que debe ser esencial en la interacción hospedador-huésped. Además, en la parte interna de la membrana externa se localiza un complejo denominado lipoproteína, con funciones de anclaje entre la membrana externa y el péptidoglicano. El péptidoglicano es otro componente importante de la pared celular y se encuentra inmerso en un compartimento llamado espacio periplásmico, comprendido entre la membrana citoplásmica y la membrana externa. Está constituido por una o varias monocapas formadas por repeticiones de una unidad disacárida, N-acetilglucosamina (NAG) unidas, por un enlace β-1,4, al ácido N-acetilmurámico (NAM). Las uniones cruzadas entre las monocapas refuerzan la estructura, dotándola de una estabilidad química y una resistencia mecánica que, junto con la membrana externa, impide la lisis en medios especialmente hipotónicos y contribuye a mantener la forma celular (6). Figura 1. Representación esquemática de las envueltas de E. coli 1. Introducción 5 Además de las características inmunogénicas del antígeno O del LPS, las proteínas formadoras de los flagelos en las cepas móviles (flagelinas) y la cápsula de las cepas que la producen son, entre otros, elementos altamente antigénicos conocidos como el antígeno H y el antígeno K, respectivamente. La determinación de estos tres tipos de antígenos es un método de clasificación serotípica muy importante (7). La mayoría de las especies son capaces de ocupar indistintamente hábitats muy variados en el medio ambiente, las plantas y el tubo digestivo de los animales; otras ocupan hábitats más restringidos, como los sistemas acuáticos, vegetales o el tubo digestivo de ciertos animales. Algunas se hallan adaptadas estrictamente al hombre. La familia incluye especies comensales y patógenas para las plantas y los animales. Con respecto al hombre, existen especies que son primariamente patógenas y otras comensales estables o transitorias del tubo digestivo que pueden producir infecciones oportunistas. Existe un tercer grupo de enterobacterias: normalmente son microrganismos comensales, pero se pueden convertir en patógenos cuando adquieren genes con factores de virulencia presentes en plásmidos, bacteriófagos o islas de patogenicidad (E. coli asociada a gastroenteritis). Las infecciones por enterobacterias se pueden originar de un reservorio animal, portador humano o de la diseminación endógena de los microrganismos en un paciente vulnerable (ej. E. coli) y pueden afectar virtualmente a todas las zonas corporales. Figura 2. E. coli teñido en tinción de Gram Los organismos entéricos han sido siempre los agentes más comunes de las infecciones del tracto urinario, pero ahora son también los agentes etiológicos predominantes en diversas infecciones sistémicas de origen endógeno e infecciones nosocomiales que se observan en la actualidad. Mientras que las infecciones entéricas graves han disminuido en los países desarrollados, organismos entéricos ordinariamente inofensivos se encuentran cada vez más relacionados con diversas formas de enfermedad extraintestinal, como resultado de su selección por el uso de antibióticos por la existencia de enfermos con disminución de su respuesta inmune por su enfermedad o como consecuencia de la administración de agentes inmunosupresores y citotóxicos. Las implicaciones médicas y económicas de 1. Introducción 6 las infecciones nosocomiales se tornan evidentes cuando se considera que en España la prevalencia de este tipo de infecciones se aproxima al 10%, lo que incrementa la morbimortalidad y los costes para el sistema sanitario (8). Desde su descubrimiento, los antibióticos han sido el tratamiento más eficaz contra las infecciones causadas por las enterobacterias tanto patógenas como oportunistas. Su utilización masiva ha generado una fuerte presión selectiva que ha conducido, desde la década de los 40, a la selección de bacterias resistentes a toda clase de antibacterianos naturales y sintéticos. Esto supone un gran problema clínico para el tratamiento de estas infecciones. Todos los bacilos entéricos oportunistas son capaces de causar enfermedades similares, pero la epidemiología, la frecuencia, la gravedad y el tratamiento de estas enfermedades difieren para las distintas especies. Alguno de los microorganismos de esta familia que causan infecciones oportunistas con más frecuencia son Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, y Morganella morganii entre otras. Otras especies de enterobacterias poseen capacidad patógena primaria (factores moleculares de patogenicidad), pudiendo causar infecciones en personas previamente sanas sin factores predisponentes, como Shigella, Salmonella, Yersinia y Escherichia coli (variedades patógenas) (9). E. coli es el principal habitante anaerobio facultativo del intestino grueso y es único entre los microorganismos que integran la flora normal por cuanto también es el microorganismo aislado, con mayor frecuencia como agente causal de infecciones de las vías urinarias, de heridas, de neumonía, de meningitis y de septicemia, tanto en las infecciones comunitarias como en las adquiridas en el hospital (10). La especie del género Klebsiella que se aísla con mayor frecuencia es K. pneumoniae. Se encuentra en las heces de los individuos sanos (del 5 al 10%) y es con frecuencia un invasor secundario del aparato respiratorio de enfermos con enfermedad pulmonar crónica. Como otras enterobacterias oportunistas, K. pneumoniae puede ocasionar infecciones en aproximadamente el 3% de todas las neumonías bacterianas agudas y es el segundo patógeno más común del tracto urinario. También pueden causar infecciones de heridas. Es la segunda especie después tras E. coli causante de bacteriemia por gramnegativos. Producen una cápsula y por esta razón se desarrollan en forma de colonias grandes y húmedas, frecuentemente muy mucosas. K. oxytoca se parece morfológicamente a K. pneumoniae y desde el punto de vista clínico pueden considerarse semejantes (10). 1. Introducción 7 1.2 ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS La familia de antibióticos mayoritariamente empleada en el tratamiento de las enfermedades infecciosas causadas por enterobacterias es la de los β-lactámicos. Cabe destacar que la existencia de metabolitos antagonistas del crecimiento bacteriano en hongos pertenecientes al género Penicillium, fue ya descrita por científicos como Tyndall, Lister, Huxley y Duchesne durante la segunda mitad del siglo XIX. La importancia del descubrimiento de Alexander Fleming en 1928 del primer antibiótico de éxito terapéutico, producido por el hongo Penicillium notatum, significó el inicio de la edad de oro de los antimicrobianos. La Penicilina G (bencilpenicilina) comenzó a utilizarse en clínica en 1942, revolucionando el tratamiento de las enfermedades infecciosas en la primera mitad del siglo XX, como la fiebre escarlata, la neumonía, la gonorrea y las infecciones por estafilococos. Desde el descubrimiento de las penicilinas hasta la actualidad, se han empleado una gran variedad de antibióticos β-lactámicos naturales y derivados semisintéticos para el control de enfermedades infecciosas. Estas moléculas representan más de la mitad del consumo total de los antibióticos, principalmente por su alta efectividad y baja toxicidad. 1.2.1 MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS Los antibióticos β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, monobactámicos y carbapenémicos) son moléculas químicamente diversas que tienen en común la presencia de un anillo β-lactámico en su estructura. Figura 3. Anillo β-lactámico La similitud estereoquímica del anillo β-lactámico con el dipéptido d-alanina-d-alanina del pentapéptido que enlaza las cadenas de NAG y NAM del peptidoglicano (11) les permite interaccionar con dichas proteínas situadas en la superficie de la membrana plasmática bacteriana. 1. Introducción 8 Figura 4. Semejanza estructural entre la molécula de β–lactámico y D-alanina-D-alanina Los antibióticos β-lactámicos son agentes bacteriolíticos ya que provocan la lisis celular. Ejercen su acción a nivel de la pared celular en crecimiento, inhibiendo la última etapa de biosíntesis del péptidoglicano, la formación de las uniones cruzadas entre las cadenas lineales de NAG y NAM, conocida como transpeptidación. Las enzimas transpeptidasas y carboxipeptidasas que participan en esta etapa son también capaces de unirse covalentemente a las penicilinas y a otros antibióticos β-lactámicos. De ahí que se denominen proteínas de unión a la penicilina o PBP (12). La serina del sitio activo de las PBP ataca al carbonil del anillo β-lactámico generando un intermediario enzimático acilado con el anillo β-lactámico abierto. Este compuesto inactivo se va acumulando en la bacteria ya que es de degradación lenta. Figura 5. Ataque suicida de las transpeptidasas (TPase) a la penicilina (12) La inactivación de las PBP impide la formación de uniones cruzadas entre las cadenas de peptidoglicano de la pared celular en crecimiento. Esto se traduce en una mayor laxitud de esta envuelta. Además, este efecto se incrementa también gracias a la acción de las autolisinas que degradan determinadas zonas del péptidoglicano para permitir el crecimiento celular. El resultado de todo ello es la lisis celular fruto de las fuerzas osmóticas y mecánicas que actúan sobre la pared celular (acción bactericida). Las bacterias que carecen de autolisinas son inhibidas pero no destruidas. Para actuar, por tanto, los β-lactámicos deben llegar a las PBPs. Eso es fácil en los microorganismos grampositivos, pero más difícil en gramnegativos y micobacterias. Por eso, en gramnegativos, deben aprovechar la presencia de poros proteicos (porinas). Además, la acción del β-lactámico no es posible si 1. Introducción 15 Aunque son posibles otras combinaciones, el ácido clavulánico se encuentra disponible asociado a amoxicilina, sulbactam asociado a ampicilina y tazobactam a piperacilina. La asociación con ácido clavulánico supone la recuperación de la actividad de amoxicilina frente a microorganismos de las especies productoras de β-lactamasas y la amplía a bacterias resistentes por producción natural de enzimas (P. vulgaris, Klebsiella spp, P. pseudomallei, Aeromonas spp, B. fragilis, C. jejuni, H. influenzae). La asociación con sulbactam supone las mismas ventajas que para el caso del ácido clavulánico. Por otra parte, frente a Acinetobacter spp únicamente es activa la asociación ampicilinasulbactam, debido a la mayor afinidad de éste último por PBP-2 (20). La asociación con tazobactam restablece la actividad de piperacilina frente a especies productoras de β-lactamasas como E. coli, Klebsiella spp, M. morganii, P. vulgaris, C. diversus, y es la asociación β-lactámico-inhibidor de β-lactamasas más efectiva frente al grupo de B. fragilis (21). Las indicaciones de la combinación amoxicilina-ácido clavulánico incluyen las infecciones del aparato respiratorio, tanto superior como inferior, del tracto urinario, infecciones obstetroginecológicas, infecciones de piel, tejidos blandos y osteoarticulares, infecciones odontógenas y periodontales. Las indicaciones de ampicilina-sulbactam son similares a las anteriores, además de las infecciones graves por Acinetobacter spp multirresistentes, en las que ésta puede ser una de las escasas opciones terapéuticas. Por su parte, piperacilina-tazobactam está indicada en el tratamiento de infecciones polimicrobianas graves o producidas por microorganismos resistentes a otros antibióticos: bacteriemias, infecciones intraabdominales, ginecológicas y neumonías graves adquiridas en la comunidad, en las que se sospeche la presencia de P. aeruginosa, y en las nosocomiales. 1. Introducción 16 Cuadro resumen de los principales antibióticos β-lactámicos de interés clínico: Tabla 1. Clasificación de los antibióticos β-lactámicos 1. Introducción 17 1.3 MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos. Figura 11. Mecanismo de resistencia a β-lactámicos en gramnegativos. 1. El antibiótico llega a su lugar de acción (PBP) a través de las porinas. 2. Resistencia por alteración de la permeabilidad (alteración en la porina). 3. Modificación de la diana de acción. 4. El antibiótico es expulsado al exterior por unos complejos proteicos (bombas de expulsión). 5. La bacteria produce unos enzimas que hidrolizan el antibiótico, produciendo una resistencia por inactivación bacteriana La base genética de estos mecanismos puede ser cromosómica, conocida como resistencia natural o intrínseca, la cual es una característica estructural o funcional presentada por algunas cepas bacterianas. Sin embargo, la aparición de mutaciones en el cromosoma o la adquisición de información genética, contenida en plásmidos, transposones o integrones pueden hacer que las bacterias presenten nuevas resistencias a antimicrobianos. Este tipo de resistencias se conoce como resistencia adquirida. 1. Introducción 18 Figura 12. Estructura simplificada de elementos móviles que permiten la transferencia horizontal de genes entre las bacterias La adquisición de DNA exógeno puede realizarse mediante transformación, transducción y transferencia célula a célula por conjugación (22), siendo este último mecanismo uno de los más importantes, ya que genes de resistencia a los antimicrobianos suelen localizarse en plásmidos o transposones conjugativos. Figura 13. Mecanismo de conjugación: transferencia genética a través del contacto directo entre dos bacterias En general, en las bacterias gramnegativas causantes de infecciones, el mecanismo de resistencia mayoritario frente a los β-lactámicos es la hidrólisis enzimática, causada por la presencia de βlactamasas en el espacio periplasmático. El grado de resistencia que generan estas enzimas se correlaciona con su concentración, afinidad por los diferentes β-lactámicos y propiedades hidrolíticas. La síntesis de las β-lactamasas puede ser constitutiva, como ocurre en el caso de algunas de ellas codificadas en el cromosoma o en plásmidos. En este último caso, la concentración de la enzima está en relación al número de copias del plásmido. No obstante, también se conocen β-lactamasas cuya síntesis es inducible, las cuales están típicamente codificadas en el cromosoma. Una característica a resaltar es que los propios antibióticos β-lactámicos pueden ser agentes inductores de la síntesis de β-lactamasas, si bien no todos ellos tienen la misma potencia inductora (23). 1. Introducción 19 Otros mecanismos implicados en la resistencia a los β-lactámicos son: a. alteración de la permeabilidad de la membrana externa, debida generalmente a mutaciones en las proteínas formadoras de los canales de membrana b. alteraciones de las bombas de eflujo, como consecuencia de mutaciones en las proteínas transmembrana, las cuales amplían su sustrato y bombean al exterior el antimicrobiano c. alteración de la diana del antibiótico por mutaciones en las PBP que comportan una pérdida de la afinidad de los β-lactámicos por las mismas, disminuyendo así su actividad (24). 1.3.1 β-LACTAMASAS La detección de bacterias resistentes al primer antibiótico β-lactámico conocido se describió incluso antes del uso en clínica de la penicilina (25) y ha ido en aumento a raíz de la utilización masiva de estos antibacterianos en el tratamiento de infecciones. Se cree que las β-lactamasas son fruto de una evolución de las PBP, ya que comparten un alto grado de homología con ellas (26). De hecho, se ha sugerido que la excreción de las proteínas PBP funcionó como un mecanismo de defensa ante la presencia de antibióticos β-lactámicos en el medio. La mejora de este mecanismo de detoxificación habría dado lugar a enzimas específicos sin actividad transpeptidasa, pero capaces de hidrolizar a los β-lactámicos. De esta forma, parece que las proteínas ancestrales de las βlactamasas estarían involucradas en el metabolismo de la pared celular y en la protección frente a antibióticos segregados por hongos (27) y por ciertos tipos de bacterias. En la actualidad, las β-lactamasas han ampliado enormemente su espectro de acción, a la vez que los genes que las codifican se han movilizado desde el cromosoma a plásmidos e integrones. Se sabe que el mecanismo de acción de determinadas β-lactamasas pasa por la actuación de la serina de su sitio activo, mientras que otras requieren un ion zinc en su sitio activo para atacar al anillo βlactámico (metalobetalactamasas). El resultado es la hidrólisis del anillo β lactámico, generando un antibiótico inactivo y una enzima activa de nuevo. 1. Introducción 20 Figura 14. Mecanismo de acción de las β–lactamasas. Las fases de la reacción son: (I) Se produce una unión reversible y no covalente entre la enzima y el anillo β–lactámico. (II) El grupo hidroxilo libre del residuo de serina del sitio activo rompe el anillo β–la lactámico, formándose un enlace acil covalente. (III) Hidrólisis del enlace acil mediante la intervención de una molécula de agua, liberándose el antibiótico y la β–lactamasa activa (27) 1.3.2 CLASIFICACIÓN DE LAS β–LACTAMASAS La necesidad de clasificar a estas enzimas surgió cuando se descubrió que determinadas β-lactamasas eran capaces de degradar a las cefalosporinas, lo cual las diferenciaba del resto de las enzimas conocidas hasta el momento, activas solamente frente a penicilinas. La primera clasificación, realizada por Sawai y colaboradores en 1968 (28), ordena a las cefalosporinasas y penicilinasas en función de su respuesta al antisuero. El esquema propuesto por Richmond y Sykes en 1973 (29) incluye a todas las β-lactamasas de gramnegativos descritas hasta el momento y se basa en 1. Introducción 21 sus perfiles de sustrato. Posteriormente, se actualizó en 1976 con la inclusión de las β-lactamasas plasmídicas (30). En 1980, Ambler dividió a estas enzimas en cuatro clases en función de su estructura molecular (clases A, B, C y D), incluyendo en la clase B a todas aquellas β-lactamasas que contenían zinc en su sitio activo (31). Figura 15. Clasificación molecular de Ambler adaptado por Frere (32) Más tarde, el esquema propuesto por Bush en 1989 (33, 34)y revisado en 1995 por Bush y colaboradores (35), correlaciona por primera vez el tipo de sustrato, la capacidad inhibitoria y la estructura molecular de las enzimas y engloba a las enzimas en cuatro grupos. En 2010, realizaron una nueva revisión que es la que actualmente se utiliza(36). 1. Introducción 22 Tabla 2. Clasificación esquemática de las β-lactamasas bacterianas (36) A continuación se exponen las características más importantes de los distintos grupos de β-lactamasas. a. Grupo 1: Según su secuencia de aminoácidos pertenecen a la clase C. Presentan un residuo de serina en el centro activo. Hidrolizan a la mayoría de β-lactámicos, incluidas las cefamicinas, pero no a los carbapenems. El sustrato principal son las cefalosporinas, de ahí que se use el término para referirse a este grupo como cefalosporinasas o cefamicinasas. No se inhiben por ácido clavulánico. Incluye: • β-lactamasas cromosómicas inducibles (AmpC) de Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., y P. aeruginosa. • β-lactamasas cromosómicas constitutivas (AmpC) de E. coli. • β-lactamasas plasmídicas (MIR-1, MOX-1, FOX-1) de P. aeruginosa, E. coli y K. pneumoniae, que son el resultado de la incorporación de genes cromosómicos (AmpC) en plásmidos. b. Grupo 2: forman un grupo heterogéneo constituido por seis grupos (2a, 2b, 2c, 2d, 2e y 2f) que según su secuencia de aminoácidos todos pertenecen a la clase A excepto el 2d que pertenece 1. Introducción 23 a la clase D. Todas presentan un residuo de serina en el centro activo. Se inhiben por ácido clavulánico. Incluye: • Penicilinasas cromosómicas y plasmídicas de bacterias grampositivas (Staphylococcus spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Enterococcus spp.). • β-lactamasas plasmídicas clásicas (TEM-1, TEM-2, SHV-1) de Enterobacteriaceae. • β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido u oxiimino-β-lactamasas de Enterobacteriaceae (por modificación del centro activo de TEM-1, TEM-2 y SHV-1). • β-lactamasas derivadas de TEM que confieren resistencia a los inhibidores de β-lactamasas o enzimas IRT de Enterobacteriaceae. • β-lactamasas cromosómicas constitutivas de K. pneumoniae (SHV-1) y K. oxytoca (K1). • β-lactamasas cromosómicas inducibles de P. vulgaris (o cefuroximasa). • Oxacilinasas clásicas plasmídicas de P. aeruginosa. • Oxacilinasas de espectro extendido plasmídicas de P. aeruginosa y Acinetobacter spp. (por cambios en el centro activo de OXA 1 a 10). • Carbapenemasas cromosómicas de E. cloacae, S. marcescens y P. aeruginosa. El subgrupo 2a engloba las penicilinasas de bacterias grampositivas con capacidad de hidrolizar la penicilina G pero no las penicilinasas semisintéticas. Son inhibidas por el ácido clavulánico. Pueden estar codificadas en el cromosoma o en plásmidos. El subgrupo 2b engloba la mayoría de las β-lactamasas de amplio espectro, que hidrolizan las penicilinas y si su expresión es elevada, pueden conferir resistencia a las cefalosporinas de 1ª generación. Son inhibidas por el ácido clavulánico. En este grupo se encuentran las enzimas tipo TEM y SHV. De estas derivan, por mutaciones puntuales que comportan un cambio aminoacídico el subgrupo 2be, denominadas β-lactamasas de espectro ampliado (BLEE), descritas por primera vez en Alemania en 1983 (37). Son enzimas capaces de hidrolizar penicilinas, todas las cefalosporinas (excepto las cefamicinas), y los monobactamas (aztreonam) pero mantienen su sensibilidad frente a los carbapenems. Son más sensibles que los de amplio espectro en cuanto a la inhibición por ácido clavulánico. Actualmente se han descrito más de 150 BLEE descritas en diferentes géneros de enterobacterias y P. aeruginosa (38). Predominan tres grandes grupos: • TEM: derivan de TEM-1 y TEM-2; han sido descritas mayoritariamente en E. coli y K. pneumoniae y han causado brotes nosocomiales severos. • SHV: derivan de SHV-1. La mayoría ha sido aislada de cepas de K. pneumoniae aunque también se han descrito en C. koseri, E. coli, P. aeruginosa y Acinetobacter spp. • CTX- M: se han aislado en casi todas las enterobacterias, en particular en K. pneumoniae, E. coli y Enterobacter. Son enzimas con una potente actividad hidrolítica frente a cefotaxima. 1. Introducción 24 El subgrupo 2br comprende las β-lactamasas resistentes a los inhibidores (IRT). Los IRT, descritos en Francia en 1993, se caracterizan por presentar el mismo perfil de hidrólisis que las β-lactamasas plasmídicas de amplio espectro pero son resistentes a los inhibidores de βlactamasas como el ácido clavulánico, el tazobactam y el sulbactam. La mayoría deriva de las TEM, de ahí el nombre de IRT (inhibitor resistant TEM-type). El subgrupo 2c son las carbenicilinasas, CARB o PSE. Estas enzimas hidrolizan preferentemente las carboxipenicilinasas (carbenicilina y ticarcilina) y son menos sensibles al ácido clavulánico. El subgrupo 2d son las denominadas oxacilinasas, debido a su capacidad para hidrolizar la oxacilina. Su perfil de hidrólisis es similar al de β-lactamasa de amplio espectro pero son más resistentes a la acción del ácido clavulánico. Algunas oxacilinasas pueden hidrolizar a los carbapenems. El subgrupo 2e incluye cefalosporinasas cromosómicas propias de P. vulgaris, C. koseri y C. sedlakii. A diferencia de las cefalosporinasas de grupo 1, éstas pertenecen a la clase A de Ambler y son inhibidas por el ácido clavulánico. En el subgrupo 2f se incluyen las serin β-lactamasas de clase A que hidrolizan a los carbapenems y son parcialmente inhibidas por el ácido clavulánico pero no por EDTA. c. Grupo 3: Según su secuencia de aminoácidos y la presencia de Zinc (ya que necesita para su acción enzimática la acción de cationes divalentes) pertenecen a la clase B de Ambler (31) (metalobetalactamasas).Son inactivadas por agentes quelantes (EDTA). Hidrolizan penicilinas, cefalosporinas y carbapenems (no al aztreonam). No se inhiben por ácido clavulánico. Inicialmente se aislaron en el cromosoma de ciertas especies como A. hydrophila o Bacillus spp. Actualmente se han descrito en plásmidos que se encuentran en principalmente en bacilos gramnegativos no fermentadores. Incluye: • β-lactamasas cromosómicas de S. maltophilia. • β-lactamasas plasmídicas IMP de P. aeruginosa, S. marcescens y K. pneumoniae. d. Grupo 4: Son penicilinasas no inhibidas por ácido clavulánico y cuya caracterización molecular final está aún por realizar por lo que no se puede incluir en ningún grupo de la clasificación hecha por Ambler (31). Incluye la penicilinasa de B. cepacea. 1. Introducción 31 La expresión de todos los genes AmpC es constitutiva con la excepción de las tipo DHA-1, -2, CMY-13 Y ACT-1 que es inducible. (60-62). La nomenclatura de estas enzimas es en función de su perfil de resistencia a cefamicinas (CMY), cefoxitina (FOX), moxalactam (MOX), latamoxef (LAT); el lugar donde se descubrió Hospital Miriam en Providence (MIR-1) o el nombre del paciente donde se aisló por primera vez BIL-1. (62). Las representantes mejor caracterizadas son MIR-1, MOX-1, CMY-1, CMY-2, BIL-1, LAT-1 y FOX-1. En algunos casos se conocen la secuencia de nucleótidos de los genes que controlan la producción de estas enzimas. Barnaud y cols secuenciaron la β-lactamasa DHA-1 y demostraron una alta similitud con la cefalosporinasa cromosómica de Morganella morganii (63). En el año 2001, Fortineau y cols describen una nueva cefalosporinasa inducible DHA-2 en K.pneumoniae (64). Actualmente, estas enzimas se han descrito con mayor frecuencia en E. coli, principalmente del tipo CMY-2, seguida de DHA-1, pero también en C. freundii, Enterobacter spp o K. pneumoniae. En un estudio multicéntrico realizado en España en 2009 por Navarro et al. se obtuvo una prevalencia de AmpC plasmídicas entorno al 0,6%. En la actualidad disponemos de test fenotípicos que permiten diferenciar las β-lactamasas AmpC plasmídicas de las cromosómicas, alguno de ellos descrito en el apartado de Material y métodos. (65). 1.3.4.3 Carbapenemasas Los carbapenems, son el grupo de antibióticos -βlactámicos más estables a la hidrólisis por las βlactamasas. Dentro de este grupo se encuentran imipenem, meropenem y ertapenem. Son resistentes a la acción de la mayoría de las enzimas, incluso a AmpC y β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido de tipo TEM, SHV, CTX-M y OXA. Las carbapenemasas son activas frente a las oximino-cefalosporinas, cefamicinas y carbapenems. (66). La primera carbapenemasa conocida fue descrita en Bacillus cereus (β-lactamasa II). Posteriormente se describió en Stenotrophomonas maltophilia, Chryseobacterium odoratum, Legionella gormanii y Bacteroides fragilis. Recientemente se han identificado y caracterizado carbapenemasas plasmídicas en Pseudomonas aeruginosa, en diferentes especies de la familia Enterobacteriaceae y en Acinetobacter lo que ha generado un mayor interés por su estudio y puede suponer un nuevo reto para la antibioterapia. 1. Introducción 32 La resistencia a los carbapenems no sólo es debida a la producción de carbapenemasas, ya que existen otros mecanismos que pueden afectar a su actividad, como son: pérdida de porinas especificas, bombeo o expulsión del antibiótico y modificaciones en las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) (67). Atendiendo a la clasificación molecular de Ambler (31), las carbapenemasas pueden clasificarse en tres grupos: • Carbapenemasas clase A. Pertenecen al grupo 2f de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros. Son inhibidas débilmente por el ácido clavulánico pero no por el EDTA (35). Puede ser de producción cromosómica (NMC-A, Sme-1, Sme-3 y IMI-1) en Enterobacter cloacae y Serratia marcescens, o codificadas por plásmidos, como KPC-1 en K. pneumoniae y GES-2 en Pseudomonas aeruginosa (66). Los primeros aislamientos se produjeron en Japón en 1990 tanto en especies de enterobacterias como en Pseudomonas y Acinetobacter. Más tarde han sido informados aislamientos en otras partes del mundo como Europa, Canadá y Brasil (68).En la actualidad se ha informado en un aislamiento de Enterobacter asburiae (con IMI-2) la primera carbapenemasa codificada por plásmidos e inducible(69). • Carbapenemasas clase B. Son las carbapenemasas más significativas desde el punto de vista clínico. Pertenecen al grupo 3 de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros, son metaloenzimas, requieren zinc para su actuación y son generalmente de naturaleza cromosómica, aunque recientemente se han asociados a plásmidos conjugativos e integrones. (70). Son inhibidas por EDTA, pero no por ácido clavulánico. Estas enzimas hidrolizan a las penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas pero no al aztreonam. (40). • Carbapenemasas clase D. A este grupo pertenecen algunas β-lactamasas tipo OXA que presentan una débil actividad carbapenemasa. (67, 71). Han sido descritas en Acinetobacter baumannii y disminuyen la sensibilidad a imipenem y meropenem (66). 1.3.4.4 β-lactamasas resistentes a inhibidores de β-lactamasas (IRT) Aunque las IRT no son propiamente dichas BLEEs, también derivan de las enzimas clásicas TEM y SHV. En los primeros años de la década de los 90 se describieron β-lactamasas plasmídicas resistentes a la inhibición por ácido clavulánico. Se caracterizan por conferir resistencia a amino-, carboxi- y ureidopenicilinas, son insensibles a la acción de los inhibidores de β-lactamasa, y no tienen actividad sobre el resto de β-lactámicos. Como consecuencia de que las IRT son resistentes a la inhibición por 1. Introducción 33 ácido clavulánico y sulbactam, muestran resistencia clínica al uso de las combinaciones de antibióticos β-lactámicos con inhibidores de β-lactamasas como amoxicilina-ácido clavulánico, ticarcilina-ácido clavulánico y ampicilina-sulbactam. La mayoría de los aislamientos presentan escasa sensibilidad a cefalosporinas de amplio espectro, cefamicinas y carbapenemas. 1.3.5 β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO CTX-M Este grupo de enzimas es una nueva familia de β-lactamasas con un espectro ampliado de sustrato que hidrolizan preferentemente a la cefotaxima. A principios de 1989, en Alemania, Bauernfeind y cols informan de un aislamiento clínico de una cepa de E.coli resistente a cefotaxima, la cual es productora de una BLEE no TEM, no SHV denominada CTX-M-1, en referencia a su mayor actividad frente a cefotaxima. (72). El nombre CTX refleja la potente actividad hidrolítica de estas β-lactamasas frente a cefotaxima (activas frente a la cefotaxima, aislada en Munich y de ahí su nombre). Estas enzimas presentan mayor actividad hidrolítica frente a cefotaxima y ceftriaxona que frente a ceftazidima. Los microorganismos productores de estas β-lactamasas suelen tener unas CMI para cefotaxima > 64 µg/ml y para ceftazidima en el rango de sensibilidad 2-8 µg/ml; pero en algunos casos las CMI para ceftazidima alcanzan valores de 256 µg/ml (73), como por ejemplo las β-lactamasas CTX-M- 15 y CTX-M-32 difieren de CTX-M-3 en la sustitución de Asp-240→Gly lo que hace que estas enzimas presenten actividad frente a ceftazidima. (74, 75). Las CMIs para aztreonam son variables. Estas β-lactamasas son mas activas frente a cefepime que el resto de las BLEE, presentando CMIs para cefepime más altas. Por último, tazobactam presenta mayor actividad frente a las BLEE tipo CTX que el ácido clavulánico. No hay que olvidar que un mismo organismo puede contener BLEE tipo CTX junto con SHV o junto βlactamasa tipo AmpC, lo que implica un cambio en su fenotipo de resistencia. (73). Se reconocen más de 65 variantes de β-lactamasas CTX-M (su número sigue creciendo), las cuales se clasifican filogenéticamente en cinco grupos en función de la homología en la secuencia de aminoácidos: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 y CTX-M-25. Se encuentran distanciados evolutivamente unos de otros ya que no comparten más de un 94% de identidad (76). Esto lleva a pensar que la divergencia a partir de un antecesor común ocurrió en los primeros estadios. Estas enzimas muestran tan sólo un 40% de similitud con las β-lactamasas tipo TEM y SHV, sin embargo, los genes blaCTX-M poseen un alto grado de similitud con los genes cromosómicos blaKLUA que 1. Introducción 34 codifican las β-lactamasas del género Kluyvera. El grupo 1 y 2 derivarían de β-lactamasas cromosómicas de Kluyvera ascorbata (77) mientras que el grupo 8 y 9 derivarían de β-lactamasas cromosómicas de Kluyvera georgiana (78) . Las enzimas KLUA de K. ascorbata se incluyen en el grupo CTX-M-2, mostrando la KLUA-2 un 100% de similitud con la CTX-M-5. La KLUG-1, enzima codificada en el cromosoma de K. georgiana, difiere de la CTX-M-8 tan sólo en tres aminoácidos. Por otra parte, la β-lactamasa cromosómica de K. cryocrescens (KLUC-1) comparte aproximadamente un 85% de similitud con las enzimas del grupo CTX-M-1, por lo cual se ha sugerido que la KLUC-1 podría formar un sexto grupo de CTX-M. Las enzimas cromosómicas presentan grados de similitud en sus regiones flanqueantes de entre un 83- 88%, característica también descrita entre las β-lactamasas CTX-M plasmídicas (74, 76). Sin embargo, se han expresado una alta variedad de variantes de las enzimas CTX-M, por lo que otros autores opinan que es muy improbable que estas enzimas tengan un mismo origen filogenético (79). El grupo CTX-M-1 incluye 10 enzimas mediadas por plásmidos (CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-10, CTX-M-12, CTX-M-15, CTX-M-22, CTX-M-23, CTX-M-28, CTX-M-32 y CTX-M-117), el grupo CTX-M-2 incluye 8 (CTX- M- 2, CTX-M-4, CTX-M-4L, CTX-M-5, CTX-M-6, CTX-M-7, CTX-M-20 y Toho-1), el grupo CTX-M-8 incluye un sólo enzima, CTX-M-8, el grupo CTX-M-9 incluye 10 (CTX-M-9, CTX-M-13, CTX-M-14, CTX-M-16, CTX- M-17, CTX-M-19, CTX-M-21, CTX-M-24, CTX-M-27 y Toho-2) y por último, el grupo CTX-M-25 incluye CTX-M-25 y CTX-M-26 (68, 76, 80). Toho 1 y Toho 2 son β-lactamasas relacionadas estructuralmente con las β-lactamasas tipo CTX y como estas presentan una actividad más potente frente a cefotaxima. La denominación de Toho se refiere al nombre del hospital en Japón donde fue aislada una cepa de E.coli portadora de esta β-lactamasa. En la actualidad son CTX-M-44 y 45 respectivamente. (73). Las β-lactamasas CTX-M excepto Toho-2 poseen 291 residuos aminoacídicos. El rango de pI es de 7.4-9 (76). Al igual que ocurre con las β-lactamasas SHV y TEM existe una relación importante entre estructura y función. Los aminoácidos en posición 240 y 267 juegan un papel importante en la evolución de estas βlactamasas. Las enzimas CTX-M-15, CTX-M-27, CTX-M-16, derivan de CTX-M-3, CTX-M-9, CTX-M-14 respectivamente, por sustitución de Gly-240→Asp presentando una potente acción frente a ceftazidima (74). La β-lactamasa CTX-M- 19 deriva de CTX-M-18 por sustitución de Pro-167→Ser lo que le proporciona mayor actividad frente a ceftazidima. (81). Otros residuos aminoacídicos juegan también un papel importante como son Arg-276. La sustitución de asparragina por arginina confiere bajo nivel de resistencia a cefotaxima, ceftriaxona y aztreonam. Estos 1. Introducción 35 resultados indican que la Arg-276 podría estar implicada en la hidrolisis de los oximino β-lactámicos, por otra parte el residuo Arg-276 ocupa el mismo lugar que el residuo Arg-244 en otras β-lactamasas de la clase A (82). Todas estas enzimas presentan un residuo de serina en la posición 237, el cual juega un papel muy importante en su espectro ampliado de sustrato (83). La sustitución Ser-237→Ala induce a una disminución de la actividad hidrolítica frente a cefotaxima (84). Los residuos Asn104, Asn132, y Asp240 establecen puentes de hidrogeno con los grupos amido de la cadena de la cefotaxima, lo que facilitaría su hidrolisis. La sustitución Asp-240→Gly en CTX-M-1 da lugar a CTX-M-32 aumentando la capacidad de hidrolítica frente a ceftazidima. (75). Figura 16. Dendrograma de la familia CTX-M (74) 1. Introducción 36 Finalmente, en la actividad cefotaximasa de CTX-M interviene no solo los ajustes producidos en el centro activo de la enzima sino también la situación global del giro ω y la lamina β3. (76) Figura 17. Secuencia aminoacídica de la enzima CTX-M-15 de la cepa de E. coli D253 1.3.5.1 Epidemiología de las enterobacterias productoras de BLEEs. Las enterobacterias productoras de BLEEs se han aislado tanto en muestras procedentes de pacientes hospitalizados, como en muestras de origen comunitario. Estos aislamientos pueden aparecer de forma esporádica, sin relación epidemiológica, o dar lugar a brotes nosocomiales. La localización plasmídica de estas β-lactamasas, su fácil transferencia por conjugación y su localización entre secuencias de inserción y en integrones (85, 86) ha facilitado su diseminación entre diversas especies bacterianas por varias zonas del mundo. Así, podemos detectar brotes debidos a la diseminación de un plásmido (diferentes especies de enterobacterias con un plásmido común), o bien a la diseminación de una cepa resistente (epidemia clonal). Además, estos plásmidos pueden llevar asociada resistencia a otros grupos de antimicrobianos (aminoglucósidos, tetraciclinas, trimetoprimsulfametoxazol...) por lo que nos encontramos con microorganismos multirresistentes. Todo ello determina que las opciones terapéuticas para las infecciones causadas por bacterias que producen BLEEs sean muy limitadas. Hasta finales de 1990s las BLEEs más frecuentemente encontradas eran derivadas de TEM y SHV principalmente en K. pneumoniae y en pacientes hospitalizados (87). En la actualidad las enzimas CTX-M han reemplazado a las TEM y SHV y está aumentando el porcentaje de aislamientos en E.coli y en pacientes comunitarios. En España la CTX-M predominante es el grupo CTX-M-9 (80). La expansión de estas enzimas ha estado más focalizada en brotes e infecciones nosocomiales en el este de Europa, Sudamérica y Asia (76). Cabe destacar, sin embargo, la existencia de ciertas enzimas que se 1. Introducción 37 han identificado inicialmente en zonas concretas de Europa occidental como la CTX-M-9 y CTX-M-14 (88-90) y la CTX-M-10 (91). Actualmente, las enzimas CTX-M-14, CTXM-3 y CTX-M-2 son las que tienen una mayor dispersión geográfica localizándose, incluso, en cepas aisladas de animales sanos, lo cual sugiere que éstos podrían comportarse como reservorio de cepas productoras de estas β-lactamasas (76). El microorganismo en el que más frecuentemente se han descrito brotes nosocomiales de BLEEs es K. pneumoniae. Probablemente está relacionado con el hecho de que esta especie forma parte de la flora normal, sobrevive durante bastante tiempo sobre la piel y los fómites y acepta con cierta facilidad plásmidos conjugativos. Las primeras epidemias de infección hospitalaria por K. pneumoniae productora de BLEEs fueron descritas en Francia a finales de los ochenta (92). Desde entonces se han documentado por todo el mundo, incluida España, numerosos brotes nosocomiales causados por enterobacterias productoras de BLEEs. Es un hecho reconocido la relación existente entre la observación de estos brotes epidémicos y un amplio consumo de antibióticos, especialmente de cefalosporinas de tercera generación. El consumo elevado de estos antibióticos favorecería la aparición de estos clones de K. pneumoniae productores de BLEEs, que se diseminarían con particular facilidad en centros o unidades con factores predisponentes para la transmisión cruzada entre pacientes sometidos a múltiples manipulaciones (93). Los brotes, tanto nosocomiales como de aparente adquisición en la comunidad, se han extendido de forma muy notable a E. coli, y en menor medida a otras enterobacterias. 1.3.5.2 Colonización fecal por enterobacterias productoras de BLEES El tubo digestivo actúa como reservorio de estos microorganismos multirresistentes; además es el nicho ecológico adecuado para que la resistencia se transmita a otras especies bacterianas. Diversos estudios han demostrado que las personas sanas actúan como portadores fecales. En algunos casos de epidemia la colonización fecal de los pacientes ingresados en unidades de riesgo ha llegado a más del 40%. Algunos factores de riesgo asociados a la colonización fecal por K. pneumoniae productor de BLEEs son la gravedad del proceso clínico al ingreso, la cateterización arterial, la nutrición parenteral, el sondaje vesical, la ventilación mecánica o la terapia antibiótica previa. Todos estos factores están relacionados con el tiempo de estancia en UCI y la posibilidad de contacto horizontal a través del personal sanitario. El incremento en la proporción de portadores en la comunidad aumenta el riesgo de que otras personas se conviertan en portadores como consecuencia de la transmisión de persona a persona o a través del medio ambiente de bacterias resistentes (94), enriqueciendo el gen de resistencia y facilitando la adquisición de mecanismos de resistencia por bacterias susceptibles (95, 96). 1. Introducción 38 El aumento de la prevalencia de portadores fecales de cepas productoras de BLEE en situaciones de ausencia de un brote en pacientes hospitalizados y el establecimiento de estas cepas en la comunidad con coresistencia a los antibióticos no β-lactámicos, incluyendo quinolonas, representan una oportunidad para que estos aislados puedan convertirse en endémicos (96). La colonización con aislados multirresistentes, incluyendo los aislamientos productores de BLEEs, es considerado un prerrequisito para la infección. Se ha destacado la importancia de la detección de portadores de estas bacterias multirresistentes no sólo para los pacientes sino también para la población sana (96, 97). El estudio de los portadores fecales sería útil para el seguimiento de las tendencias de BLEE (98-100) ya que según señalan algunos estudios, las BLEEs caracterizadas producidas por aislados de portadores fecales fueron similares a las obtenidas en la práctica clínica en España en el momento de realizar dicho estudio. Otros dos estudios españoles demostraron que la tasa de portadores fecales de cepas de E. coli productoras de BLEE en los pacientes de la comunidad que tenían infecciones urinarias causadas por este patógeno fue de alrededor de 70%, que es mucho más alto que el de las personas con infecciones no asociadas con BLEE (100-102). Curiosamente, la colonización fecal en los contactos familiares de los pacientes con una infección por E. coli productores de BLEE oscilaron entre el 16,7% a 27,4% en estos dos estudios. Esto llevó a la sugerencia de que la colonización fecal con bacterias productoras de BLEE es un factor de riesgo para la adquisición de infección del tracto urinario causadas por estos patógenos y una fuente potencial de transmisión entre los hogares (96, 100). No hay muchos estudios realizados en la investigación de la colonización fecal por enterobacterias productoras de BLEEs pero todos los que se han realizado están demostrando que los portadores actúan como vehículo de bacterias cada vez más resistentes a los antibióticos de uso habitual y que su propagación va en aumento. Esto se demuestra en un estudio que se realizó en Madrid en 2003, donde se observó un aumento importante de portadores fecales de Enterobacteriaceae productoras de BLEEs respecto a un estudio anterior en 1991 (96). 2. Objetivos 39 2 OBJETIVOS La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, y en particular la producción de β-lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), ha sido uno de los principales problemas de resistencia a los antibióticos β-lactámicos durante las dos últimas décadas. La codificación plasmídica de este tipo de resistencia otorga a estas enzimas algunas características importantes como la facilidad de transmisión por conjugación entre diversas especies bacterianas o la asociación de resistencia a otros grupos de antibióticos, por lo que nos encontramos con microorganismos multirresistentes. El fracaso en la detección de los productores de BLEE repercute en un informe clínico que lleva a tratamientos inadecuados y una proliferación incontrolada de estas cepas. Cada vez es más importante conocer la distribución y el tipo de β-lactamasas de espectro extendido presentes en nuestro medio, para así poder utilizar el mejor procedimiento diagnóstico. Los cultivos de heces para detectar a los portadores fecales de bacterias productoras de BLEEs han demostrado ser un instrumento útil como herramienta para el control de brotes nosocomiales así como para el control epidemiológico de la población portadora de cepas de enterobacterias portadoras de BLEEs. En la actualidad, no existen muchos datos sobre la prevalencia y la capacidad de difusión de estas resistencias en otros ambientes que no sea el hospitalario. Por tanto, el objetivo de este proyecto serán el estudio de la prevalencia de β-lactamasas plasmídicas (BLEEs, AmpC y carbapenemasas) en pacientes portadores de enterobacterias productoras de dichas βlactamasas en el tracto intestinal del sector III de Zaragoza (muestras de heces recibidas en el H. C. U. Lozano Blesa), la caracterización de los genes que codifican dichas enzimas y el estudio de su epidemiología. En este marco, los objetivos de este proyecto son los siguientes: • Detección de enterobacterias productoras de β-lactamasas plasmídicas (AmpC, BLEEs y carbapenemasas) presentes en muestras fecales de pacientes del sector III de Zaragoza. • Estudio de la sensibilidad antibiótica de las cepas bacterianas que posean una β-lactamasa plasmídica procedentes de los portadores fecales. • Determinación de los diversos fenotipos de resistencia en las cepas estudiadas. 2. Objetivos 40 • Caracterización de las β-lactamasas plasmídicas encontradas en los portadores fecales. • Determinación de la prevalencia de enterobacterias portadoras de β-lactamasas plasmídicas en portadores fecales. • Estudio de la epidemiología de las resistencias de las β-lactamasas plasmídicas objeto de la investigación. 3. Material y Métodos 47 La técnica de PCR se lleva a cabo siguiendo los siguientes pasos: 1. Extracción del DNA. Una colonia de cultivo fresco de Mueller-Hinton se resuspende en un eppendorf de 0.2 con 200 µl de agua bidestilada estéril. Estos eppendorf se introducen en un Termoblock a una Tª de 90- 95ºC durante 20 minutos para lisar las células. Transcurridos los 20 minutos, se centrifuga durante 5 minutos y nos quedamos con el sobrenadante que es el que contiene el DNA. 2. Preparación de los primers. La solución de los cebadores siempre es de 100 μM. Para la PCR se suelen utilizar a una concentración de 10 μM. Así, en un eppendorff añadiremos 90 μl de agua bidestilada y 10 μl de la solución madre para obtener la concentración deseada (dilución 1/10). Tabla 5. Primers utilizados en las distintas PCR realizadas Primer Secuencia 5´-3´ Tamaño (pb) Referencia CTX - M - 3G F GTTACAATGTGTGAGAAGCAG 1017 Pagani et al, 2003 (106) CTX - M - 3G R CCGTTTCCGCTATTACAAAC 1017 Pagani et al, 2003 (106) CTX - M - 9 F GTGACAAAGAGAGTGCAACGG 856 Weill et al, 2004 (107) CTX - M - 9 R ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC 856 Weill et al, 2004 (107) CTX - M - 10 F CCGCGCTACACTTTGTGGC 962 Coque et al, 2002 (108) CTX - M - 10 R TTACAAACCGTTGGTGACG 962 Coque et al, 2002 (108) CTX - M uni F CGATGTGCAGTACCAGTAA 540 Weill et al, 2004 (107) CTX - M uni R TTAGTGACCAGAATCAGCGG 540 Weill et al, 2004 (107) TEM F ATAAAATTCTTGAAGACGAAA 1080 Weill et al, 2004 (107) TEM R GACAGTTACCAATGCTTAATC 1080 Weill et al, 2004 (107) SHV F GGGTTATTCTTATTTGTCGC 930 Díaz et al, 2010 (109) SHV R TTAGCGTTGCCAGTGCTC 930 Díaz et al, 2010 (109) MOX F GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT 520 Pérez - Pérez, 2002 (110) MOX R CACATTGACATAGGTGTGGTGC 520 Pérez - Pérez, 2002 (110) CIT F TGGCCAGAACTGACAGGCAAA 462 Pérez - Pérez, 2002 (110) CIT R TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC 462 Pérez - Pérez, 2002 ( 110) DHA F AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT 405 Pérez - Pérez, 2002 (110) DHA R CCGTACGCATACTGGCTTTGC 405 Pérez - Pérez, 2002 (110) ACC F AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA 346 Pérez - Pérez, 2002 (110) ACC R TTCGCCGCAATCATCCCTAGC 346 Pérez - Pérez, 2002 (110) EBC F TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG 302 Pérez - Pérez, 2002 (110) EBC R CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT 302 Pérez - Pérez, 2002 (110) FOX F AACATGGGGTATCAGGGAGATG 190 Pérez - Pérez, 2002 (110) FOX R CAAAGCGCGTAACCGGATTGG 190 Pérez - Pérez, 2002 (110) 3. Material y Métodos 48 La identificación de BLEEs se realizó mediante PCR con primers para CTX-M universal, grupo CTX-M-1, grupo CTX-M-9, grupo CTX-M-10, SHV y TEM. Cada una de estas PCR tienen unas condiciones diferentes de tiempos y Tª. La identificación de pAmpC se realizó mediante PCR multiplex con las seis familias de primers. Los primers tipo MOX amplifican para los genes MOX-1, MOX-2, CMY-1 y CMY-8 a CMY-11; los tipo CIT, para LAT-1 hasta LAT-4, CMY-2 a CMY-7 y BIL-1; DHA, DHA-1 y DHA-2; ACC para los genes ACC; EBC para MIR-1T y ACT-1; y FOX, para FOX-1 hasta FOX-5b. 3. Preparación de la Master Mix. Hay que calcular la cantidad de producto necesario para la PCR por muestra y luego multiplicar por el nº total de muestra a estudio, añadiendo siempre la cantidad de reactivos necesaria para dos muestras más, una para el control positivo y otra para el control negativo. Según la PCR que estemos realizando, los cálculos son diferentes aunque el volumen final del eppendorf con el DNA incluido debe ser de 50 µl. El buffer siempre tiene que ser el 10% del total (5 µl). La cantidad de MgCl 2 , que tiene una concentración de 25 mM, dependerá de la especificidad que necesite la reacción y la Taq polimerasa (a menor cantidad, mayor especificidad). Los dNTPs se usan a 10mM y la Taq a 5U/µl. La cantidad de DNA varía según el tipo de PCR que estemos realizando (lo normal, es añadir 2 ó 2.5 µl). Para las PCR multiplex de AmpC los primers se preparan en una solución A de cebadores que cuenta con los primers: MOXMR, MOXMF, CITMR, CITMR, DHAMR, DHAMF, solución B que cuenta con los primers: ACCMR, ACCMF, EBCMR, EBCMF, y la solución C que contiene los primers: FOXMR, FOMF. Según los cálculos que se utilicen, incluyendo el DNA, se añade agua bidestilada hasta completar el volumen de 50 µl. Todos los reactivos que se utilizan menos el agua destilada se conservan a -20ºC, por lo que se deben sacar del congelador un rato antes de preparar la Master Mix. La Taq polimerasa debe conservarse a -20ºC hasta el momento en que se añada, y una vez utilizado, rápidamente debe volver al congelador. Por lo tanto, se irá distribuyendo en los distintos eppendorf que hayamos preparado identificados para cada muestra (tantos como muestras a analizar más un control positivo) la cantidad de Master Mix que corresponda por muestra más el DNA de la muestra. 3. Material y Métodos 49 4. Electroforesis en geles de agarosa Es una técnica utilizada para separar, identificar y aislar fragmentos de DNA a partir de una mezcla heterogénea. Se basa en la migración unidireccional del DNA a través de una matriz porosa cuando se le aplica un campo eléctrico. A pH neutro, el DNA tiene carga negativa, lo que comporta su migración desde el cátodo (polo negativo) al ánodo (polo positivo). La movilidad electroforética de los diferentes fragmentos depende, sobre todo de su tamaño y conformación, y está poco afectada por la composición de bases o por la secuencia. Los factores que influyen en la migración a través del gel son: • Longitud del DNA. Las moléculas de DNA lineal migran a través de un gel a una velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. De esta manera, utilizando marcadores de peso molecular conocido podemos determinar la longitud de un fragmento de DNA desconocido o comprobar que un fragmento tiene una longitud determinada. • Conformación estructural del DNA. Una misma secuencia de DNA plasmídico puede presentarse en tres formas diferentes (DNA circular cerrado, DNA circular relajado, DNA lineal), pudiéndose desplazar cada una de ellas a diferente velocidad en un gel. Las movilidades relativas dependen esencialmente de la porosidad del gel, de la corriente aplicada, de la fuerza iónica del tampón utilizado para correr el gel y de la densidad de giros superhelicoidales de la molécula circular cerrada. • Porosidad del gel. Existe una relación directa entre el logaritmo de la movilidad electroforética de un fragmento de DNA y la porosidad del gel que viene determinada por la concentración de agarosa. • Corriente eléctrica aplicada: La velocidad de migración de los fragmentos de DNA lineal es proporcional al voltaje aplicado. La visualización de los fragmentos de DNA se consigue mediante la incorporación al gel de un colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que se intercala entre las dos cadenas de DNA. Este reactivo revela la presencia de una banda de DNA al ser iluminada con luz ultravioleta de longitud de onda corta (310 nm). 3. Material y Métodos 50 5. Preparación de un gel de agarosa La concentración de agarosa que se utiliza está condicionada por el tamaño de los fragmentos de DNA a separar. Para visualizar los fragmentos de DNA amplificados por PCR la concentración de agarosa que utilizamos fue al 1% debido al tamaño de banda de los primers. Los geles de agarosa se prepararon según se describe a continuación: a. Primero se prepara el TBE (Tris 0,44M, ácido bórico 0,44 M, EDTA 12,5 mM pH 8) que se va a utilizar. Para ello, se mezclan 100 ml de TBE buffer con 900 ml de agua bidestilada. b. Después, se mezcla la cantidad correspondiente de agarosa con el TBE preparado y se lleva a ebullición para su total disolución. c. Se deja enfriar hasta unos 55ºC y se añade una solución acuosa de bromuro de etidio (0,5 µg/ml). d. Se vierte la solución en una cubeta de electroforesis previamente sellada y con el correspondiente peine y se deja solidificar. e. Se retira el peine sin dañar los pocillos. Y se coloca el gel en la cubeta de electroforesis llena de tampón TBE asegurando que cubra el gel. f. La muestra con el DNA obtenido tras la amplificación se mezcla con una solución de carga (1% SDS, 50% glicerol, 0,05% azul de bromofenol). El primer pocillo se cargan 4 μl del marcador de peso molecular, HyperLadder I (Bioline), que separa 200 pb y a continuación se van cargando los pocillos con las muestras seguidas del control positivo. Las condiciones de electroforesis son a 95 V durante aproximadamente 1 hora con el fin de que las bandas queden bien separadas. El gel se visualiza en un transiluminador con luz ultravioleta (310nm). También se ha utlizado el Gel Doc EZ Imager con el software Image Lab (Bio- Rad) que permite visualizar las bandas en un ordenador. 3. Material y Métodos 51 6. Secuenciación. La secuenciación se realizó en un secuenciador XL3500 previa purificación del DNA amplificado obtenido en la PCR. Se utilizaron los primers de cada PCR a una concentración de 10 µM. Las secuencias obtenidas fueron analizadas mediante el programa ChromasPro® y la página web BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) (111). 4. Resultados 52 4 RESULTADOS 4.1 SELECCIÓN DE LOS AISLAMIENTOS De las 3965 muestras de heces que fueron procesadas en el Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa entre el 1 de Enero y el 30 de Junio de 2010 pertenecientes a 2685 pacientes (75,8 % de origen ambulatorio), se aislaron 178 enterobacterias resistentes a cefalosporinas de tercera generación (cefoperazona 32 mg/L) con un fenotipo compatible con la presencia de una βlactamasa que hidrolizaba la cefalosporina de tercera generación presente en el medio de cultivo utilizado para el screening, CCDA. Descartados 8 aislamientos compatibles con la presencia de una βlactamasa cromosómica inducible AmpC, seleccionamos para este estudio un total de 170 aislamientos. 4.2 DETECCIÓN DE LOS FENOTIPOS DE RESISTENCIA Las 170 enterobacterias fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas habituales (Kligler, SIM, Lisina) dando como resultado 159 E. coli, 9 K. pneumoniae y 2 K. oxytoca. Figura 20 A los 170 aislamientos seleccionados por su resistencia a cefoperazona se les realizó los test de sinergia descritos y la sensibilidad a distintos antibióticos con/sin inhibidores de β-lactamasas mediante E-test 93,5% 5,3% 1,2% Clasificación por especie de los 170 aislados estudiados E. coli K. pneumoniae K. oxytoca 4. Resultados 53 para clasificarlos según su fenotipo en aislamientos posibles productoras de BLEE, cefamicinasas y/o carbapenemasas. De los 170 aislamientos, fenotípicamente 20 fueron posibles productores de AmpC plasmídica (11,8%) y 150 fueron posibles productores de BLEE (al menos uno de los test realizados para BLEE positivos) (88,2%). La mayoría de los aislamientos con una posible β-lactamasa plasmídica fueron E. coli (en el caso de BLEEs, 141 de 150, y en las AmpC, 18 de 20). Figura 21. Aislamientos con posibles fenotipos de β-lactamasas plasmídicas Los aislamientos con fenotipo compatible con producir una BLEE fueron clasificados por su resistencia a cefotaxima y ceftazidima en dos categorías diferentes, aquellos cefotaxima resistente y ceftazidima sensible (CTX R CAZ S) (fenotipo RS), y los que eran cefotaxima y ceftazidima resistentes (CTX R CAZ R) (fenotipo RR), clasificación que nos sirvió para establecer el algoritmo de trabajo con una búsqueda orientada de los genes de resistencia responsables del fenotipo observado. Los aislamientos con fenotipo compatible con producir una cefamicinasa plasmídica fueron todos clasificados como fenotipo AmpC para su posterior estudio molecular. Tabla 6. Bacterias seleccionadas por su compatibilidad de fenotipo como productoras de BLEE Bacterias según su especie Fenotipo RR Fenotipo RS Total E. coli 66 7 5 141 K. pneumoniae 6 1 7 K. oxytoca - 2 2 T otal 73 7 8 15 0 A continuación se describen mediante dos algoritmos el número de aislamientos seleccionados por posibles productores de BLEE y posibles productores de AmpC plasmídica y el modo de proceder a continuación dependiendo del fenotipo encontrado y de la sensibilidad a cefotaxima, ceftazidima, cefepime y cefoxitina. 150 20 BLEES AmpC plasmídica 4. Resultados 54 Figura 22. Número de aislamientos a los que se les realizó el algoritmo de trabajo de posible BLEE según el fenotipo de resistencia obtenido En aquellos aislamientos que independientemente de su fenotipo de resistencia (RR o RS) presentaban sensibilidad disminuida o resistencia a cefoxitina y sensibilidad disminuida o resistencia a amoxicilina/ácido clavulánico se les investigó la presencia de AmpC plasmídicas (20 aislamientos) y sólo aquellas que dieron un resultado negativo fueron seleccionadas para investigar la presencia de BLEE (4 aislamientos). A continuación se muestra el algoritmo que se siguió en aquellos aislamientos que independientemente de su resistencia a cefotaxima y ceftazidima fueron resistentes a cefoxitina. Figura 23. Número de aislamientos a los que se les realizó el algoritmo de trabajo con un fenotipo de posible AmpC BLEEs: 150 aislamientos (CT/CTL, TZ/TZL, PM/PML) CTXRCAZR: 73 aislamientos CTX-M (PCR bla CTXuni, CTX-M- 1, CTX-M-9) SHV (PCR blaSHV) TEM (PCR blaTEM) CTXRCAZS: 77 aislamientos CTX-M (PCR bla CTXuni, CTX-M- 1, CTX-M-9, CTX-M-10) Cefoxitina resistente (< ó = 14 mm) 20 aislamientos pAmpC (CN/CNI) PCR 6 familias pAmpC PCR blaCMY-2 PCR blaDHA-1 4. Resultados 55 En cuanto a la presencia de carbapenemasas, se les realizó un test de screening a todos los aislamientos con ertapenem. siendo éste para todos los aislamientos sensible por lo que no se encontró ningún portador fecal de enterobacteria con carbapenemasa. 4.3 PRESENCIA DE BLEEs Se investigó la presencia de BLEEs a 150 aislamientos a los que hay que añadir aquellos que tenían la cefoxitina resistente y fueron incluidos en el grupo de estudio de presencia de AmpC plasmídica pero resultaron ser negativas (4 aislamientos). 4.3.1 CONFIRMACIÓN DE BLEEs MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES Tras la realización de las distintas PCR de las β-lactamasas tipo CTX-M (universal, 1, 9 y 10), SHV y TEM se obtuvo un resultado positivo de portadores fecales (positiva al menos una BLEE) en 151 de los casos (3,8% del total de coprocultivos analizados que significa el 5,6% de los pacientes estudiados) siendo el grupo mayoritario de BLEEs el grupo CTX-M-9 (52,3 %), seguido del grupo CTX-M-1 (35,1 %). Tabla 7. Resultados obtenidos diferenciando según fenotipos para las distintas PCR de grupos de BLEEs realizadas Grupo BLEE s Fenotipo RR Fenotipo RS Total CTX - M - 9 13 66 79 CTX - M - 1 44 9 53 CTX - M - 10 - 1 1 CTX - M - UNI 12 2 14 TEM 31 NR 31 SHV 13 NR 13 4. Resultados 56 Figura 24. Gráfica comparativa diferenciando según fenotipos RR o RS para las distintas PCR de grupos de BLEEs realizadas 37 aislamientos (24,5%) resultaron ser positivos a la presencia de dos enzimas; 27 al grupo CTX-M (14 del grupo CTX-M-1; 3 del grupo CTX-M-9; y 5 de CTX-M-universal) más TEM (17,9%); y los 10 restantes a CTX-M (4 del grupo CTX-M-9; y 2 del grupo CTX-M-1) más SHV (6,6%). Además, 4 aislamientos presentaron una CTX-M (3 del grupo CTX-M-1, y 1 de CTX-M-universal), una SHV y una TEM (2,65% del total de BLEEs). Figura 25. Porcentaje de aislamientos positivos según el tipo de BLEE encontrada 0 10 20 30 40 50 60 70 RR RS 47 22,5 0,7 5,3 0,7 0 9,3 2,6 3,3 1,3 2,6 2 2 0,7 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4. Resultados 63 Entre los tres tipos de CTX-M más predominantes (CTX-M-1, CTX-M-14 y CTX-M-15), el que presentó menores diferencias según el origen del paciente fue la enzima CTX-M-15 (un 9,3% de origen hospitalario y un 11,2% de origen ambulatorio). Figura 37. Gráfica que relaciona el origen del paciente y los tipos de CTX-M aislados Dentro los aislamientos de origen hospitalario, fue en el Servicio de Digestivo donde se aislaron más BLEEs, con un 26%, seguido de Urgencias y Medicina Interna, ambos con un 16%. Figura 38. Resultados de los pacientes de origen hospitalario por servicio 0 10 20 30 40 50 60 Hospitalizados Ambulatorios 0 2 4 6 8 10 12 14 4. Resultados 64 4.4 PRESENCIA DE AmpC Del total de los coprocultivos estudiados se seleccionaron 20 aislamientos con fenotipo AmpC para investigar los genes de resistencia responsables del fenotipo AmpC. Los 20 aislamientos resultaron tener un fenotipo de cefotaxima resistente y ceftazidima resistente, además de la cefoxitina resistente. En cuanto al cefepime, el 85% de los aislamientos resultaron ser sensibles. 4.4.1 CONFIRMACIÓN DE LAS AmpC PLASMÍDICAS MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES Tras realizar PCR a todos los aislamientos con 6 parejas de primers y posterior secuenciación obtuvimos que 13 de los aislamientos producían una enzima CMY-2 y 3 aislamientos una enzima DHA-1. Cuatro cepas resultaron ser negativas a las seis familias de AmpC plasmídicas estudiadas por lo que se estudió la posible presencia de BLEE. De ellas, tres resultaron ser positivas para una enzima CTX-M. Cabe destacar que los 16 aislamientos productores de AmpC plasmídica fueron identificados como E. coli. Figura 39. Resultados de la caracterización de las AmpC plasmídicas producidas por los 16 E. coli 0 5 10 15 DHA-1 CMY-2 4. Resultados 65 4.4.2 CARACTERÍSTICAS DE LOS PORTADORES FECALES DE AmpC Respecto al sexo de los pacientes, el 31,25% fueron hombres y el 68,75% mujeres. Según la edad, un 50% de los casos procedían de pacientes de grupo de edad de mayores de 65 años, seguidos de los pacientes de grupo de edad entre 0 y 14 años, y del grupo de edad entre 26 y 50 años, con un 18,75%. En los tramos de edad entre 15 y 25, y 51 y 65, solamente se aisló una β-lactamasas plasmídica tipo AmpC en cada una de ellos (6,25% en cada rango). Figura 40. Gráfico de las AmpC obtenidas distribuidas por rangos de edad Según su procedencia, el 56,3 % de los pacientes que portaban enterobacterias productoras de AmpC plasmídicas eran pacientes ingresados en nuestro hospital mientras que el 43,7% de los pacientes procedían de la comunidad, sector III de Zaragoza. De los pacientes hospitalizados, el 30 % procedían del Servicio de Digestivo, seguido de Pediatría Lactantes y Medicina Interna con un 20 %. El resto de los pacientes estaban ingresados en diferentes servicios del hospital. Figura 41 0 2 4 6 8 0-14 15-25 26-50 51-65 >65 3 1 3 1 8 33,4% 22,2% 11,1% 11,1% 11,1% 11,1% Origen de las AmpC plasmídicas de ámbito hospitalario Digestivo MIC Angiología Endocrino Urgencias Pediatría Lactantes 4. Resultados 66 4.5 PREVALENCIA DE LAS β-LACTAMASAS PLASMÍDICAS La prevalencia de BLEEs en los portadores fecales estudiados fue de un 5,6% en nuestro entorno. Los tipos de BLEEs CTX-M con mayor predominio en los portadores fecales de nuestro sector fueron CTX-M-14 (2,7%), seguido de CTX-M-15 (1,2%), porcentajes referidos respecto al total de pacientes analizados. Del resto de tipos de BLEE, ninguno alcanzó una prevalencia superior al 1%. De estas enzimas más minoritarias, destacan la CTX-M-1 con 0,5% y la CTX-M-32 con un 0,3%. Tabla 9. Distribución de los portadores fecales de AmpC respecto al total de pacientes (2685) GRUPO CTX-M-1 GRUPO CTX-M-9 Tipos de CTX-M CTX-M-1 CTX-M-3 CTX-M-15 CTX-M-32 CTX-M-9 CTX-M-14 CTX-M-24 CTX-M-27 Total enzimas aisladas 13 1 31 8 5 72 1 1 % de portadores fecales 0,5 0,04 1,2 0,3 0,2 2,7 0,04 0,04 Las β-lactamasas plasmídicas AmpC tuvieron una prevalencia en portadores fecales de 0,6%. La prevalencia de la CMY-2, AmpC mayoritaria, fue de 0,5% respecto al total de pacientes analizados. Tabla 10. Distribución de los portadores fecales de AmpC respecto al total de pacientes (2685) Tipos de AmpC CMY - 2 DHA - 1 13 3 % de portadores fecales 0,5 0,1 5. Discusión 67 5 DISCUSIÓN 5.1 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO 5.1.1 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BLEEs EN NUESTRA REGIÓN Los datos de nuestro trabajo indican durante el periodo estudiado (entre 1 de Enero a 30 de Junio de 2010) una prevalencia de 5,6% de portadores fecales de bacterias productoras de BLEE pertenecientes al Sector III de Zaragoza En nuestro hospital se realizó un estudio de características similares durante dos períodos de tiempo separados entre sí 17 meses (112). Entre Abril de 2002 y Febrero de 2003 se obtuvo un 2,3% de portadores fecales de aislamientos productores de BLEEs, y entre Agosto de 2004 y Julio de 2005 se encontró un 7,4% lo que denota un aumento significativo, siendo un 2,5% de portadores fecales de origen hospitalario y un 2,1% de origen ambulatorio en 2002, y en el caso de 2004, fueron un 8,1% y 7,2%, respectivamente (112). Comparando estos estudios con el trabajo llevado a cabo actualmente, se puede observar que desde 2005 las cifras se mantienen en un porcentaje considerable, si bien parece que incluso ha disminuido la prevalencia de portadores en nuestro sector. En nuestro trabajo, los pacientes portadores fecales de origen hospitalario representaron el 1,9% mientras que los de origen ambulatorio fueron un 2,8%. Como se puede observar, el porcentaje de los pacientes portadores fecales de origen ambulatorio fue mayor que los de origen hospitalario siendo una diferencia con los estudios llevados a cabo anteriormente donde en los dos casos el porcentaje mayoritario fue de pacientes portadores fecales de origen hospitalario. En dicho estudio (112), el 75,5 % de los pacientes analizados procedía de origen ambulatorio mientras que en nuestro estudio fue de un 75,8%, por lo que la relación entre pacientes de origen ambulatorio y hospitalario fue similar. 5. Discusión 68 5.1.2 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BLEEs EN ESPAÑA En España, se realizó un estudio nacional en el año 2000 en el que participaron cerca de 40 hospitales para establecer un mapa de la epidemiología de las BLEEs en España por comunidades (99). Desde entonces, el panorama nacional ha cambiado bastante como veremos a continuación. Las BLEEs SHV y TEM ya no son las más abundantes y han dejado paso a la familia CTX-M. Figura 42. Mapa de España de distribución de las BLEEs en 2005 en muestras clínicas (97) En un estudio realizado de portadores fecales en Madrid, durante dos períodos de tiempo, aislaron BLEEs en el 0,3% y 0,7% en 1991, y en el 11,8% y 5,5% en 2003 (en pacientes de origen hospitalario y ambulatorio, respectivamente) (96). En el mismo hospital realizaron un nuevo estudio en 2010 en el que los pacientes hospitalizados representaban el 8,9% y los de origen ambulatorio el 7,9%. (113). En nuestro trabajo, los datos obtenidos de pacientes portadores fecales según su origen son de 7,7% en pacientes hospitalizados (50 de 649 pacientes) y de 5% de origen ambulatorio (101 de 2036 pacientes). Observamos que la prevalencia de pacientes portadores de BLEE de origen hospitalario es mayor que los de procedencia ambulatoria, aunque se observa que en los dos casos hay una tendencia al alza. 5. Discusión 69 En otro estudio que se llevó a cabo en Barcelona durante tres períodos entre 2001 y 2002, se investigó la prevalencia de portadores fecales de BLEEs en pacientes ambulatorios, y obtuvieron unos datos de 2,1%, 3,8% y 7,5% de aislamientos de E. coli y E. cloacae con BLEE en cada período de tiempo, respectivamente. También podemos ver que hay un aumento de la aparición de BLEEs en un breve espacio de tiempo (114). Esto se correlaciona con los datos obtenidos en los demás estudios. Respecto a las BLEES encontradas, en nuestro estudio, un 52,3% pertenecían al grupo CTX-M-9 y un 35,1% al grupo CTX-M-1. La β-lactamasa plasmídica mayoritaria fue la CTX-M-14 con un 43,1%. Dentro del grupo CTX-M-9, la BLEE mayoritaria fue la CTX-M-14 (47,7% del total), seguida de la CTX-M-9 (6,3%). En cuanto al grupo CTX-M-1, un 20,5% del total de BLEEs resultó ser CTX-M-15 y de CTX-M-1 se aislaron un 8,6%. En el estudio realizado por Valverde y col. en 2004 (96), obtuvieron un 32,1% de CTX-M-14, un 21,4% de CTX-M-9 y un 3,6% de CTX-M-10. Rodríguez-Baño y col. obtuvieron en 2008, un porcentaje superior a 64% de portadores fecales de BLEE, aunque el grupo en el que realizó el estudio tenían una infección de tracto urinario (ITU) adquirida en la comunidad con un cultivo positivo para E. coli portador de BLEE. Además, se analizaron en grupo de pacientes no relacionados con los pacientes con ITU y se obtuvo una prevalencia de 7,4 %(102). Otro estudio realizado en el 2008 en el que se incluían muestras clínicas y portadores fecales, mostró que el grupo CTX-M-9 es el más representado en España, y en particular, el grupo CTX-M-14 en E. coli (115). En el trabajo realizado por Paniagua y col. en 2010 estudiando la presencia de portadores fecales, un 40% de las BLEEs encontradas pertenecían al grupo CTX-M-9, siendo la mayoritaria la CTX-M-14, seguida del grupo CTX-M-1 donde la predominante fue la enzima CTX-M-15. En este último trabajo, un 38% de las BLEEs en pacientes ambulatorios fueron CTX-M-14, mientras que en los pacientes hospitalizados, un 75% fueron CTX-M-15. Además, asilaron un 29% de SHV y un 4,4% de TEM (113). Comparando nuestros resultados con los trabajos anteriormente expuestos, se puede observar que el grupo mayoritario de BLEE es CTX-M-9 seguido del grupo CTX-M-1. La CTX-M-14 es la enzima predominante en estos trabajos. Cabe destacar que la CTX-M-15 es la segunda enzima más abundante. Por el contrario, en nuestro estudio sólo se encontró una enzima CTX-M-10, que comparado con otros estudios, su presencia es inferior. En cuanto a los demás grupos de BLEES, se obtuvo un 20,5% de TEM y un 8,6% de SHV, resultados invertidos a los obtenidos en el trabajo de Paniagua, donde se aprecia que la presencia del grupo SHV fue superior al grupo TEM. 5. Discusión 70 5.1.3 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BLEEs EN EUROPA La prevalencia de BLEEs en Europa es más alta que en Estados Unidos pero más baja que en Asia y Sudamérica aunque se han observado importantes diferencias entre países europeos (115). (Cantón, 2008) En dicho estudio establecieron la distribución de las β-lactamasas plasmídicas CTX-M en Europa, como vemos en el siguiente mapa: Figura 43. Distribución de las CTX-M en Europa en 2008 (115) En un estudio multicéntrico en el que participaron hospitales de varios países europeos se encontró un 3,2% de BLEEs, en el que el 0,5% correspondió a E. coli y el 2,7% a K. pneumoniae. Esto es una gran diferencia con nuestros datos ya que E. coli representó el 5,8% frente al 0,3% de K. pneumoniae (99, 115). En un estudio de vigilancia epidemiológica europeo en 2005 se observó una prevalencia alta de BLEEs en diversos países del este de Europa como Bulgaria con un 28% o Rumanía, con un 16% (incluían la presencia de BLEEs en portadores fecales) (116, 117). 5. Discusión 71 Es notable que la β-lactamasa CTX-M-15 es la enzima dominante del oeste de Europa; en Reino Unido, Italia, Francia y Portugal esta enzima se está expandiendo rápidamente (80). En un estudio realizado en Francia, la prevalencia de portadores fecales de BLEEs fue de un 15,8%. Separadas por grupos, las prevalencias fueron de 9,2% para TEM, 5,9% para CTX-M 0,7% para SHV. Dentro del grupo de las β-lactamasas CTX-M, el 89% fueron CTX-M-15; y dentro de las BLEEs, las enzimas del grupo TEM fueron las más abundantes con un 58,3%. (118) En Suecia, se observó en 2008 una prevalencia de portadores fecales de BLEEs del 1,9% y en 2010 del 5%. El grupo CTX-M-1 fue el grupo dominante dentro de las β-lactamasas plasmídicas. Otros estudios recientes demuestran que en Suecia las bacterias productoras de BLEEs están en aumento. (119) Todos estos datos que se corresponden con países europeos muestran como grupo mayoritario el CTX- M-1, y dentro de él, la CTX-M-15, mientras que en España, y en concreto en nuestro estudio, el grupo predominante es el grupo CTX-M-9, y en concreto, la CTX-M-14. 5.1.4 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BLEEs EN ASIA Un estudio realizado en la India en el año 2010 sobre portadores de BLEEs en la UCI mostró una alta tasas de colonización, en la que predominaban las BLEEs del grupo CTX-M (83,3%), seguidas de las TEM (54.3%) y de las SHV (32.6%) (120). En Indonesia, en un trabajo realizado en 2012 se obtuvo un 9,5% de portadores fecales de BLEEs. La CTX-M-15 resultó ser la enzima más prevalente (43%). La enterobacteria en la que se aislaron más BLEEs fue el E. coli con un 92,6%, distribuyéndose las enzimas que codificaron en CTX-M-15, con el 47,1%, en CTX-M-14 con un 10,3%, y en CTX-M-9, con un 7,4%. En el resto de enterobacterias, se aislaron un 35,9% de CTX-M-15, y un 5,1% de CTX-M-9. En total de las enterobacterias, la CTX-M-14 y la CTX-M-9 supusieron un 6,5% cada una(121). Se obtuvo una prevalencia de 20,3% de portadores de BLEEs en un estudio llevado a cabo en Corea en el año 2012, siendo el E. coli la enterobacteria mayoritaria con un 96,6% (122). En un estudio similar en Japón, el resultado de portadores fecales de BLEEs fue, sin embargo, de un 69,3%. El grupo CTX-M supuso un 65,7% del total de β-lactamasas plasmídicas encontradas, siendo el 60,6% del grupo CXT-M-9, y el 38,7% del grupo CTX-M-1. La bacteria predominante fue el E. coli con un 85,4% (123). En Asia se observa una alta tasa de portadores fecales en comparación con Europa, y en concreto, con el estudio del presente documento. 5. Discusión 72 En el siguiente mapa se observa la distribución de las CTX-M en el año 2006 (124): Figura 44 Distribución de las áreas geográficas de las CTX-M en el año 2006 (124) 5.1.5 EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BLEEs EN ÁFRICA En un estudio llevado a cabo en Túnez en 2011, tuvieron una prevalencia de portadores fecales de un 7,3%, siendo el grupo predominante el CTX-M-1 con un 81,8% (125). En otro trabajo de 2011, en Madagascar, un 10,1% del total de pacientes analizados resultaron ser portadores fecales de BLEEs. Dentro del grupo CTX-M-1, resultó ser la CTX-M-15 la enzima mayoritaria (126). En los datos presentados en un estudio en Camerún en el año 2012, dividieron los pacientes entre ambulatorios, con un 23,1% de portadores fecales de BLEEs, y voluntarios sanos, con 6,7%. El grupo mayoritario fue el CTX-M-1 con un 97% (de ellas, 98%, CTX-M-15, y un 2%, CTX-M-1) (127). En África, los datos son un poco dispares en cuanto a la prevalencia de portadores fecales de BLEEs, pero sí coincide en todos los casos que la enzima predominante fue del grupo CTX-M-1. Esto es una diferencia respecto a nuestro estudio ya que el grupo mayoritario obtenido fue el CTX-M-9. 8. Bibliografía 79 51. Tzouvelekis LS, Bonomo RA. SHV-type beta-lactamases. Curr Pharm Des. 1999 Nov;5(11):847- 64. 52. Huletsky A, Knox JR, Levesque RC. Role of Ser-238 and Lys-240 in the hydrolysis of thirdgeneration cephalosporins by SHV-type beta-lactamases probed by site-directed mutagenesis and three-dimensional modeling. J Biol Chem. 1993 Feb;268(5):3690-7. 53. Barlow M, Hall BG. Phylogenetic analysis shows that the OXA beta-lactamase genes have been on plasmids for millions of years. J Mol Evol. 2002 Sep;55(3):314-21. 54. Jacoby GA. Beta-lactamase nomenclature. 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