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Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 1! TRABAJO FIN DE MÁSTER Máster en Iniciación a la Investigación en Medicina DIFERENCIAS EN LA ANGIOGÉNESIS DE LOS CARCINOMAS CUTÁNEOS DE CÉLULAS BASALES Y ESCAMOSAS Autor: Tamara Gracia Cazaña Director: Mariano Ara Martín Facultad de Medicina Zaragoza 2012 Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 2! “ La ciencia, a pesar de sus progresos increíbles, no puede ni podrá nunca explicarlo todo. Cada vez ganará nuevas zonas a lo que hoy parece inexplicable. Pero las rayas fronterizas del saber, por muy lejos que se eleven, tendrán siempre delante un infinito mundo de misterio“ Gregorio Marañón Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 3! DIRECTOR Dr. Mariano Ara Martín Profesor Asociado de Dermatología Médico-Quirúrgica y Venereología. Facultad de Medicina. Universidad de Zaragoza Médico Adjunto de Dermatología. Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa”. Zaragoza. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 4! ÍNDICE _______________________________________________ Introducción…………………………………………………………………………...4 Revisión bibliográfica………………………………………………………………22 Justificación…………………………………………………………………………..42 Hipótesis……………………………………………………………………………...44 Objetivos……………………………………………………………………………...46 Material y Métodos………………………………………………………………….48 Resultados…………………………………………………………………………….60 Discusión……………………………………………………………………………...69 Conclusiones…………………………………………………………………………73 Bibliografía…………………………………………………………………………...75 Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 5! INTRODUCCIÓN _______________________________________________ Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 6! GENERALIDADES El cáncer de piel es la forma mas frecuente de tumor maligno en la población caucásica. Entre ellos los tipos mas comunes son: el Carcinoma Basocelular, Carcinoma Espinocelular y a distancia en cuanto a su frecuencia el Melanoma, que presentan unas características clínicas e histológicas muy distintas. Según los estudios estadísticos, la incidencia de estos tres tipos de tumores ha ido en aumento en todo el mundo en los 20 últimos años, sin embargo se ha mantenido estable su tasa de mortalidad. Este incremento de la incidencia, sobre todo en el caso de los Carcinomas Baso y Espinocelulares, probablemente sea consecuencia de la combinación de varios factores, como aumento de la exposición al sol o a los rayos UVA, mayor participación de la población en actividades que se realizan al aire libre, cambios en el tipo de vestimenta, aumento de la esperanza de vida y otros factores, como pérdida de la capa de ozono y situaciones de inmunodepresión, en algunos casos como consecuencia de la edad y en otros inducida por algunos de los tratamientos modernos. Los Carcinomas Baso y Espinocelular suponen más de un tercio de todos los cánceres diagnosticados en EEUU, con una incidencia estimada de 600.000 casos por año, de los cuales 500.000 son Epiteliomas Basocelulares y 100.000- 150.000 Carcinomas Espinocelulares. La incidencia de estos tipos de tumores es 18-20 veces superior que la del Melanoma. De todos modos, los datos estadísticos oficiales pueden estar sesgados, ya que los registros tradicionales de cáncer, con frecuencia no incluyen el Epitelioma Basocelular, generalmente debido en la mayoría de los casos a su buen pronóstico. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 7! CARCINOMA BASOCELULAR Definición El Carcinoma Basocelular (CBC) es un tumor derivado de las células pluripotentes de la capa basal de la epidermis y del epitelio folicular con diferentes formas clínicas e histopatológicas que le confieren un pronóstico variable. Epidemiología Es el tumor maligno mas frecuente del ser humano, representa mas del 75%del total de los tumores malignos de piel y se caracteriza por un crecimiento lento que sin tratamiento, produce invasión local con importante daño funcional o estético. La presencia de metástasis es poco frecuente y oscila entre el 0,0028% y el 0,5% 1. Cada año se diagnostican en Estados Unidos 900.000 casos, con tasas de incidencia de 407/100.000 en varones de raza blanca y 212/100.000 en mujeres de raza blanca 2. Se estima que la tasa de incidencia crece a un ritmo del 3-10% anual en la población de la raza blanca. Esta neoplasia es mas frecuente en varones con un ratio de 2:1 3,4. El CBC tiene un buen pronóstico, sin embargo, debido a su alta incidencia consume muchos recursos. Factores de riesgo I. Factores ambientales y estilo de vida: radicación ultravioleta, radiación ionizante, arsénicos y otros agentes químicos, tabaquismo. II. Factores de riesgo individuales: antecedentes al cáncer cutáneo no melanoma previo, estados de inmunosupresión (trasplantes, sida), nevus sebáceo, dermatofibroma. III. Síndromes genéticos: Xeroderma pigmentoso, albinismo, Síndrome del carcinoma basocelular nevoide, Síndrome de Bazex, Síndrome de Rombo. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 8! Clínica El aspecto clínico es muy variado. Existen muchas clasificaciones, la mas usada es en función de las formas de comienzo, las formas de estado, formas pigmentadas, formas finales y las formas especiales 5. Formas de comienzo: -Formas superficiales: se localizan generalmente en el tronco. Son lesiones con escasa sintomatología y crecimiento muy lento. Podemos diferenciar tres subtipos: • Superficial eritematoso • Superficial pagetoide • Superficial esclerodermiforme. -Formas perladas: son las mas frecuentes y se presentan como una tumoración circunscrita, infiltrada eritematosa o blanco-amarillenta; es la característica perla. Puede aparecer una variante que se denomina perlada ulcerada (figura 1). -Ulcus rodens: es una forma de comienzo del CBC que está ulcerado desde el principio. Suele comenzar como una úlcera que no responde al tratamiento. Figura 1. Lesión tumoral eritematosa perlada con telangiectasias centrales. Formas de estado: CBC perlado quístico, CBC perlado ulcerado, CBC plano cicatricial, CBC ulcero-cicatricial y CBC vegetante. Formas finales: corresponde a estadíos terminales a los que se llega por la negativa de los pacientes a recibir tratamiento o bien porque el tratamiento recibido ha sido ineficaz. Se denomina CBC terebrante, es de peor pronóstico y se localiza con frecuencia en las suturas embrionarias, por las cuales penetra, infiltrando cartílago y hueso. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 9! Formas pigmentadas: pueden contener melanina, esto no posee transcendencia pronóstica; pero puede plantear confusión con el melanoma. Histopatología Existen unos criterios comunes para el diagnóstico del CBC, los dos mas importantes: • El tipo de las células que lo constituyen, que son de pequeño tamaño, con núcleos redondeados u oveales, usualmente monomorfos y de escaso citoplasma. Son lo que se demonizan células basalioides. • El segundo criterio es la disposición de las células en la periferia de los agregados tumorales, que al menos focalmente, son columnares y ordenadas de tal forma que recuerdan a una empalizada (figura 2). Figura 2. Empalizada en la periferia de los nidos tumorales. Los patrones básicos son: 1. CBC de patrón expansivo ( tipo nodular). 2. CBC de patrón infiltrativo. 3. CBC superficial. 4. CBC micronodular. Tratamiento A) NO QUIRÚRGICO INMUNOMODULADORES TÓPICOS: IMIQUIMOD (IMQ) IMQ es un medicamento comercializado desde 1999 para el tratamiento del CBC su mecanismo de acción es: Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 16! • grado I cuando el tumor tiene más del 75% de sus células diferenciadas. • grado II sería cuando éstas comprenden entre el 50 y 75% del tumor. • grado III cuando las células diferenciadas están entre el 25 y 50%. • grado IV cuando son menos del 25%. En la práctica habitual dividimos los CEC en bien diferenciados, moderadamente diferenciados o pobremente diferenciados; lógicamente, son estos últimos los que presentan un comportamiento más agresivo11 Tratamiento 12, 13 La mayoría de los CEC son de bajo riesgo y susceptibles a ser tratados exitosamente con diferentes métodos. La extirpación quirúrgica, incluida la cirugía micrográfica de Mohs, es el método de elección para el tratamiento del CEC, por permitir la extirpación total del tumor y el estudio histológico de los márgenes quirúrgicos. Esto no resulta posible con otras técnicas. CIRUGÍA CONVENCIONAL Es el tratamiento de primera elección para la mayoría de los CEC. Se realiza la extirpación del tumor con margen de piel sana peritumoral. La extirpación de tejido sano peritumoral se efectúa para asegurar la remoción completa del tumor abarcando la extensión subclínica del mismo. Para los CEC de bajo riesgo, el margen de seguridad recomendado es de por lo menos de 4-5 mm. En CEC con factores de mal pronóstico, el margen de seguridad debe ser entre 6-10 mm. El margen profundo debe abarcar la totalidad del tejido celular subcutáneo. CIRUGIA MICROGRÁFICA DE MOHS Es el método de elección y de mayor índice de curación para el tratamiento de los CEC primarios. Es particularmente útil para CEC ubicados en zonas de alto riesgo y recurrentes. Se diferencia de la cirugía convencional porque efectúa la resección de los tumores en forma de capas horizontales, y la metodología empleada permite el examen histológico del 100% de los márgenes de sección. CURETAJE Y ELECTROCOAGULACIÓN Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 17! Con esta técnica se han obtenido buenos porcentajes de curación en CEC primarios, intraepidémicos, de tamaño pequeño, bien delimitados, bien diferenciados y ubicados en zonas expuestas al sol. Se contraindica su práctica en CEC de alto riesgo o ubicados en las localizaciones especiales. Se requiere de anestesia, repara lentamente y deja cicatriz. Este método no permite el control histopatológico de los márgenes. CRIOCIRUGÍA Método de destrucción tumoral por congelamiento, que ha demostrado índices importantes de curación en CEC de bajo riesgo, especialmente en CEC “in situ”. Está contraindicada para el tratamiento de CEC de alto riesgo o ubicados en las localizaciones especiales. Este método no permite el control histopatológico de los márgenes y deja cicatriz LASER DE CO2 Útil para CEC “in situ”. RADIOTERAPIA Es un tratamiento relativamente incruento y conservador. Es útil para el tratamiento de determinados CEC, pero como otras técnicas distintas de la cirugía, presenta la imposibilidad de controlar los márgenes. Esta indicada especialmente en pacientes añosos, en lesiones extensas de difícil reconstrucción quirúrgica (párpados, mucosas) y en pacientes que se niegan a la cirugía o que presenten contraindicaciones para la misma (cardiopatías, coagulopatías). Desventajas: radiodermitis, retracción, fibrosis, en general son raros de observar y se producen a largo plazo (10 años o más). También es útil como adyuvante en el postoperatorio luego de resecciones incompletas (que no admitan una nueva cirugía) o en tumores con factores de mal pronóstico (infiltración perineural). Está contraindicado en la variedad adenoide y en el carcinoma verrucoso. Dosis total de 6.000 cGy, fraccionada en dosis diaria de 200 a 500 cGy. TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO • Interferón: el interferón (IFN) alpha-2b intralesional puede ser de utilidad en CEC “in situ”o invasores de bajo riesgo, como alternativa Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 18! terapéutica cuando otras modalidades están contraindicadas o son impracticables. • Imiquimod : solamente para casos especiales, portadores de CEC “in situ”, enfermedad de Bowen o eritroplasia de Queyrat. El imiquimod en crema al 5% por sus efectos inmunomoduladores y antitumorales (ver CBC), podría resultar de utilidad para CEC “in situ” de tamaño pequeño (en estudio Fase III). Aprobado por la FDA para queratosis solares. • 5 fluoracilo: pertenece al grupo de análogos de las pirimidinas que bloquea el timidilatosintetasa, inhibiendo la síntesis del ADN. Se comercializa en ungüento al 5%. Colocar con un aplicador no metálico 1 o 2 veces por día durante 3 a 4 semanas o más, según las características de la lesión o la localización. En determinados pacientes se puede emplear 3 veces por semana en días alternos. Proteger áreas vecinas (especialmente mucosas). Se debe advertir al paciente que puede producir: irritación, inflamación severa, erosiónulceración. No exceder los 500 cm2 de superficie cutánea a tratar por vez. Se utiliza en forma tópica en lesiones superficiales múltiples (enfermedad de Bowen). TERAPIA FOTODINÁMICA Permite tratar lesiones múltiples “in situ”; es bien tolerada y los resultados cosméticos son muy buenos. Estaría indicada cuando está contraindicada la cirugía. TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD REGIONAL (MULTIDISCIPLINARIO) Ante la existencia de ganglios linfáticos palpables se debe realizar el estudio histopatológico de los mismos (aspiración con aguja fina o biopsia quirúrgica). De encontrarse comprometidos, las opciones terapéuticas son la disección ganglionar, la radioterapia o la combinación de ambos. Quimioterapia para casos especiales. La disección ganglionar profiláctica no está indicada en forma rutinaria y sus Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 19! posibles beneficios permanecen indefinidos. En pacientes con CEC de muy alto riesgo y que no presentan ganglios palpables, se puede recurrir a la identificación de micrometástasis ganglionares regionales, con la técnica del ganglio centinela. Para formalizar su indicación se necesitan más estudios. Los investigación del paciente se completarán con radiografías, resonancia magnética, tomografía, ultrasonido, etc. TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD A DISTANCIA (MULTIDISCIPLINARIO) Con mal pronóstico, las opciones terapéuticas para las metástasis a distancia son la cirugía, la radioterapia, la quimioterapia o la combinación de las mismas. Evolución y pronóstico El pronóstico depende de diferentes factores: sitio anatómico (en orden creciente: áreas expuestas, labios, orejas, de novo en piel de zonas no expuestas, sobre dermatosis previas: radiodermitis, bocas de fístulas, úlceras, inflamación crónica y mucosas); tamaño (más de 2 cm); profundidad (más de 4mm); velocidad de crecimiento; etiología; diferenciación histológica; invasión perineural y status inmunológico del paciente; además de tratamientos previos (recurrencia). El potencial metastásico del CEC que aparece sobre las queratosis actínicas es del 3-4 % en CEC y aumenta del 18 al 31 % en tumores que asientan sobre dermatitis por radiación, cicatrices de quemaduras y fístulas de osteomielitis crónica. Los tumores de cavidad oral, labio, piel de escroto y mucosa genital pueden presentar crecimiento rápidamente invasivo y mayor el potencial metastático . Por lo general, las metástasis aparecen en primer lugar en ganglios linfáticos regionales, aunque pueden desarrollarse a distancia. Inmunosupresión 13 Los CEC se ven modificados por la inmunosupresión en: trasplantes de órganos, VIH, leucemia linfoide crónica u tratamientos inmunosupresivos en diversas enfermedades inflamatorias. o nuevos medicamentos modificadores biológicos. El CEC es más frecuente (65 veces o más) en trasplantados. Su incidencia es Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 20! mayor a la del carcinoma basocelular (4/1), a la inversa que en inmunocompetentes (1/4). Se incrementa con el paso del tiempo post transplante (expresión tardía). También depende de la latitud geográfica, con mayor desarrollo de los tumores en zonas expuestas. Aparecen a edad más temprana que en el resto de la población. Pueden ser múltiples, más agresivos ( invasión perineural), con mayor recurrencia local, metástasis y muerte (5%); por lo que requieren de mayor margen de seguridad quirúrgico, terapéutica adyuvante (ej.: retinoides orales al perineural) y seguimiento más estricto. En el 90% de los CEC de transplantados se detecta la presencia de VPH que actuarían como promotores tumorales. En menores de 18 años es aún más agresivo. Es el cáncer cutáneo con mayor mortalidad en trasplantados. Los pacientes con VIH tienen una relación entre CBC/CEC similar a los inmunocompetentes. Los CEC aparecen a edad más temprana y tienen comportamiento biológico agresivo. Las recurrencias, metástasis y sobrevida no dependen del número de infecciones oportunistas o del recuento de CD4. Seguimiento Realizar examen clínico cutáneo-mucoso y ganglionar cada 3-6 meses por 2 años, cada 6-12 meses por 3 años y anualmente de por vida. (95 % de recurrencias locales y de las metástasis ganglionares ocurren antes de los 5 años). Si hay enfermedad regional, examen clínico cutáneo-ganglionar cada 3 meses por 2 años, cada 4 meses por un año , cada 6 meses por 2 años y anualmente de por vida. Durante el seguimiento se puede realizar detección temprana de recurrencias, de nuevas lesiones tumorales cutáneo-mucosas o ganglionares, además de ser útil para la educación del paciente y examen de sus familiares directos. Solicitar periódicamente estudios por imágenes. La educación del paciente, incluye autoexamen y protección solar. ANGIOGÉNESIS TUMORAL Hoy se acepta que un tumor avascular raramente sobrepasa los 2-3 mm2 y que su crecimiento se acelera posteriormente a la vascularización. Ese cambio hacia el fenotipo angiogénico involucra múltiples factores y complejos procesos, tales Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 21! como la regulación positiva de moléculas pro-angiogénicas y la regulación de inhibidores generados tanto por el tumor como por el huésped. El cambio puede ser desencadenado por diversas señales, entre ellas el estrés metabólico o mecánico, la respuesta inflamatoria y la alteración génica. En cuanto a los factores de crecimiento endoteliales, los de crecimiento vascular (VEGF) y las angiopoyetinas, son consideradas tanto in vivo como in vitro, los más relevantes en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular, posibilitando el reclutamiento y proliferación de las células endoteliales por parte del tumor, y por tanto estimulando la angiogénesis intratumoral. Aunque numerosos estudios han establecido la asociación entre angiogénesis tumoral y metástasis, fueron Weidner et al en 1991 que propusieron que la vascularización de un tumor podía ser utilizada para predecir su agresividad 14,15,16,17. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 22! REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA _______________________________________________ • Revisión histórica del concepto de angiogénesis • Mecanismos de vascularización en el Cáncer • Metodología de cuantificación de angiogénesis en tumores sólidos • Revisión de estudios inmunohistoquímicos sobre angiogénesis en CBC y CEC Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 23! REVISIÓN HISTÓRICA DEL CONCEPTO ANGIOGÉNESIS El término angiogénesis, hace referencia a la formación de los nuevos vasos sanguíneos. Los estudios llevados a cabo a lo largo de los últimos 40 años han proporcionado información importante sobre el proceso de angiogénesis y su papel en la biología del cáncer con más de 28.000 artículos publicados en este tópico. Virchow, uno de los fundadores de la Anatomía Patológica, se dio cuenta del elevado número de vasos sanguíneos en la masa tumoral y describió en 1865 la presencia de redes capilares en estromas tumorales. Años más tarde, la vascularización tumoral fue estudiada de forma sistemática por primera vez por Goldman en 1907, utilizando inyecciones intra-arteriales de bismuto en aceite para demostrar la presencia de una respuesta vasoproliferativa en órganos en los que se estaba desarrollando un tumor 18. Estos estudios continuaron a lo largo del siglo XX. En 1927, Lewis describió la morfología de la vascularización de varios tumores en ratones, y se dio cuenta, de que la arquitectura vascular de cada tipo de neoplasia era diferente, llegando Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 24! a la conclusión de que el microambiente tumoral influye en el crecimiento y en las características estructurales de los vasos sanguíneos. En 1928, Sandison utilizó una cámara transparente que podía introducirse en el oído del conejo y que permitía observación microscópica de los tejidos vivos 19. El perfeccionamiento del uso de este tipo de cámaras por Clark y sus colaboradores 20 permitieron el estudio de los vasos sanguíneos y linfáticos in vivo, incluso con utilización de medios de contraste. En 1931, Ide utilizó una cámara similar a la que utilizó Sandison para investigación de la correlación entre el crecimiento del carcinoma trasplantado al conejo y el desarrollo de la vascularización, observando que el aumento del tamaño tumoral se acompañaba de una rápida y extensa formación de nuevos vasos sanguíneos. Asimismo, señalaron que cuando la neovascularización no se producía, el tumor no tenía capacidad para crecer. Ide y sus colaboradores han sido los primeros en sugerir que las células neoplásicas producen factores específicos capaces de estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos 21. En 1945, Algire y Chalkley se dieron cuenta de que las neoplasias malignas pueden provocar desarrollo de los nuevos capilares a partir de la red vascular del huésped. Asimismo, introdujeron un enfoque cuantitativo para evaluar el desarrollo de los vasos sanguíneos mediante la realización de cuantificación diaria de los vasos y comparando este valor con el tamaño del tumor. En sus estudios utilizaban una cámara transparente implantada en la piel de gato, para valorar la respuesta vasoproliferativa en una herida o tras implantación de tejidos tumorales, observando que la proliferación vascular inducida por presencia de células tumorales fue más importante y su aparición más temprana en el tiempo que la inducida por una herida. Llegaron a la conclusión Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 25! de que el crecimiento tumoral está estrechamente vinculado al desarrollo de una red vascular intrínseca 22. Pietro Rondoni, Profesor de Patología general en la Universidad de Milán y director del Instituto de Cáncer de Milán, en su tratado “Il Cancro”, publicado en 1946, describe la capacidad del tumor de inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de aquellos que lo rodean. Asimismo, él también afirma que la actividad angiogénica ocurre en el estroma. La actualidad de los hallazgos de Rondoni es evidente. Habla tanto de la capacidad angiogénica del tumor, como de la importancia del estroma en la neoformación vascular asociada al proceso tumoral 23. En 1968, Tannock estudió la relación entre las células endoteliales y la proliferación de las células tumorales, demostrando que el índice mitótico de las células tumorales disminuía al aumentar la distancia de las células endoteliales, proporcionando una evidencia directa de que la difusión de oxígeno y nutrientes a través del endotelio vascular es un factor limitante en el crecimiento del tumor. CRECIMIENTO TUMORAL Y ANGIOGÉNESIS En 1971, Folkman publicó en New England Journal of Medicine, su hipótesis sobre la neovascularización en el cáncer. Según Folkman, el crecimiento tumoral es dependiente de angiogénesis y el autor fue primero en sugerir que la inhibición de la misma puede tener efectos terapéuticos. (Folkman, 1971) En este artículo también se introduce el término “anti-angiogénesis”. Según esta hipótesis, las neoplasias pierden la capacidad de proliferación cuando el tumor alcanza un tamaño más allá de 1-2 mm3, si no se produce el proceso de reclutamiento de los nuevos capilares sanguíneos que aseguren el aporte de oxígeno y de nutrientes a las células tumorales. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 32! REVISIÓN DE ASPECTOS METODOLÓGICOS DE CUANTIFICACIÓN DE ANGIOGÉNESIS Metodología de cuantificación de angiogénesis La cuantificación de la angiogénesis no es una tarea sencilla, puesto que se trata de un proceso dinámico. La mayoría de los estudios se han centrado en la evaluación del producto final de la angiogénesis : el número de microvasos en las preparaciones histológicas del tumor. Se han descrito varias técnicas para realizar la cuantificación de los vasos intra- y peritumorales, cuyas ventajas e inconvenientes describiremos a continuación. Por otro lado, como consecuencia del descubrimiento e introducción en la práctica clínica de las terapias anti-angiogénicas, ha surgido la necesidad de desarrollar nuevas técnicas que, de una forma sencilla y no invasiva permitiesen valorar la vascularización del tumor in vivo para monitorizar la respuesta tumoral al tratamiento. Por lo tanto, haremos una breve mención de estas técnicas. Valoración de angiogénesis mediante inmunohistoquímica 1. Cuantificación de las microvellosidades (técnica propuesta por Weidner) La técnica que se ha empleado con mayor frecuencia en la cuantificación de angiogénesis en melanoma es la descrita por Weidner en 1991 36 en un estudio en el que investigaba el valor pronóstico del número de vasos en el cáncer de mama invasivo. El método se basa en la enumeración de las vellosidades en las denominadas áreas con mayor densidad de vasos. Para la tinción de sus preparaciones Weidner empleó un anticuerpo panendotelial, factor VIII (o factor de von Willebrand). El primer paso en la técnica de Weidner es la identificación de los denominados “áreas calientes” o “hot spot”, mediante el análisis de toda la preparación a pequeño aumento (x10). Posteriormente, se realiza la cuantificación de las microvellosidades a mayor aumento (x200) en áreas Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 33! previamente seleccionados. Se considera como ´microvellosidad´, y, por tanto, se cuenta, cualquier célula o cluster de células teñidas, claramente separado de las vellosidades adyacentes, incluso si no se puede identificar la luz vascular. Se toma el valor más alto de los identificados en cada hot spot. 2. Técnica de Chalkley Fue descrita por Chalkley en 1943 37. En el segundo consenso internacional de cuantificación de angiogénesis en tumores sólidos esta técnica fue considerada como técnica de elección. Su principal ventaja consiste en que evita uno de los pasos más subjetivos del método propuesto por Weidner: la decisión de considerar dos estructuras adyacentes positivas para la tinción empleada como vellosidades independientes o como una única estructura 38. En primer lugar, la preparación se examina a pequeño aumento y se seleccionan los “puntos calientes”, o dicho de otro modo aquellas zonas que presentan una mayor densidad de vasos. A continuación se introduce la llamada gratícula de Chalkley en el ocular del microscopio y se examinan a mayor aumento los ¨hot spot¨ seleccionados previamente para cuantificar aquellos puntos que estén situadas sobre las células teñidas o sobre la luces de aquellos vasos cuyas paredes estén claramente teñidas con el marcador endotelial. Esta técnica será la que emplearemos en nuestro estudio. 3. Análisis computarizado automático Beliën y sus colaboradores han desarrollado un programa informático que permite identificar y cuantificar las vellosidades en toda la superficie del tumor, y no sólo en los puntos “calientes”. El programa crea de forma automática un mapa completo de la distribución de los vasos marcados previamente con alguno de los anticuerpos específicos del endotelio vascular. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 34! (Copia de la publicación original de Beliën. Mapa de microvascularización del tumor de mama invasivo en estadío T2). La principal ventaja de este sistema es que ofrece una valoración mucho más objetiva del sistema vascular del tumor. Los dos principales inconvenientes – son el tiempo requerido para la evaluación de cada preparación (se requieren tres horas y media para examinar 1 cm cuadrado) junto con la necesidad de soporte técnico específico. Probablemente, estas son las razones que han dificultado la difusión y han impedido el uso universal de esta técnica para la valoración de la neovascularización en el cáncer, a pesar de sus indiscutibles ventajas 39. 4. Fracción de células endoteliales en proliferación En primer lugar se realiza una doble tinción de los cortes del tejido con un marcador del endotelio vascular y un marcador de células en proliferación. Esta técnica nos permite evaluar simultáneamente la proporción de las células tumorales y endoteliales que están en proceso de división, lo que a su vez permite calcular la ratio de proliferación tumoral frente a la proliferación vascular (TCP/ECP) 38. El valor obtenido nos permite hacer una idea sobre el papel de la angiogénesis en la proliferación tumoral. Por ejemplo, si obtenemos un Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 35! valor alto, nos indicará que la velocidad de expansión del tumor es más alta de lo que cabría esperar si analizamos la velocidad de desarrollo del árbol vascular. Lo que significa que la proliferación de la neoplasia es, al menos en parte, independiente de angiogénesis. Dicho en otras palabras, existen otros mecanismos de vascularización que son capaces de asegurar un adecuado aporte de oxígeno y nutrientes al tumor, aparte de la formación de nuevos capilares (´endothelial sprouting´) Hillen comparó la densidad de los microvasos calculada según la técnica clásica de Weidner con la fracción de células endoteliales en proliferación (ECP), y su capacidad de predecir la aparición de metástasis en pacientes con Melanoma. Según los resultados, sólo ECP tenía valor pronóstico en este tipo de tumor, mientras que la MVD no tenía ningún tipo de relación con la evolución de los pacientes 40. La ECP podría tener interés en la selección de pacientes candidatos al tratamiento con fármacos antiangiogénicos. 5. Otros parámetros a tener en cuenta Otro parámetro que nos permite hacer una idea sobre el estado de madurez y estabilidad de las vellosidades es la presencia y la cantidad de los pericitos. Eberhard llevó a cabo un estudio en el que valoraba la fracción de las vellosidades sanguíneas que tenían cobertura por pericitos en una amplia muestra de tumores. Según el autor, la fracción observada variaba en función del tipo del tumor: desde un 10% en el caso de los glioblastomas hasta aproximadamente un 70% en carcinomas colorrectales 41. Se ha demostrado experimentalmente que la remodelación de las vellosidades sanguíneas, sólo es posible si el vaso no está rodeado por pericitos 42. En otras palabras, los pericitos estabilizan las vellosidades e impiden su proliferación. Todavía quedan muchas dudas sobre el papel de los pericitos en la neoangiogéneis tumoral, pero tenemos que tener en cuenta que los diferentes tejidos sanos pueden tener, de base, un porcentaje variable de pericitos. Por lo tanto, al menos una parte de las diferencias encontradas por Eberhard, podrían deberse a las diferencias entre los tejidos en los que se origina el tumor. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 36! Para monitorizar la respuesta tumoral al tratamiento con fármacos antiangiogénicos puede ser útil la cuantificación de las vellosidades sanguíneas que están en progreso de regresión. Además de la comparación de la cantidad de vasos antes y después del tratamiento, puede ser útil el cálculo de la fracción de células endoteliales apoptóticas, lo que refleja de forma directa el efecto del tratamiento sobre sus células diana. Anticuerpos del endotelio vascular La cuantificación de angiogénesis mediante técnicas de inmunohistoquímica requiere elección de un anticuerpo adecuado. Actualmente existen dos grandes grupos de marcadores endoteliales: los anticuerpos pan-endoteliales y los específicos de las células en proliferación. Así, los primeros se caracterizan por producir la misma intensidad de tinción tanto en las vellosidades pequeñas, como en las más grandes y maduras, y generalmente se pueden utilizar tanto en tejido fresco congelado como en muestras embebidas en parafina. De este grupo, los anticuerpos más utilizados en las muestras en parafina son el CD31 y el CD34. El anticuerpo CD31 reacciona con una glicoproteína de 130 kDa conocida como ´platelet endothelial cell adhesion molecule-1´ (PECAM-1), y su principal desventaja es la posibilidad de tinción de células inflamatorias, pero éstas pueden distinguirse de las células endoteliales en base a sus características morfológicas. Otro inconveniente descrito en la literatura es la frecuente pérdida de antigenicidad en aquellas muestras en las que se han utilizado sustancias fijadoras? con ácido acético 38, lo que daría lugar a la infravaloración del número de vasos, pero este problema se soluciona mediante la recuperación antigénica en estufa. En lo que se refiere al CD34, su antígeno se ha identificado también en el endotelio linfático, células perivasculares y otros elementos estromales, por lo que todas estas estructuras pueden dar un resultado falsamente positivo y llevar a una sobrevaloración de la vascularización tumoral 43. En los últimos años se han identificado y se han comercializado anticuerpos específicos del endotelio en proliferación, lo que supuso un importante avance en la investigación de angiogénesis tumoral, puesto que ha permitido Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 37! diferenciar las vellosidades preexistentes de las neoformadas. Preferentemente se deben utilizar en tejidos frescos o congelados, debido a que su actividad en los tejidos embebidos en parafina puede variar en función del método de fijación utilizado. Uno de los anticuerpos más representativos es el CD 105, una glicoproteína de membrana de células endoteliales, que se sobreexpresa en el endotelio vascular tumoral y forma parte del complejo del receptor del ´transforming growth factor-beta´, involucrado en el desarrollo y remodelación vascular. En algunos estudios, la densidad de los vasos intratumorales determinada mediante CD 105 ha demostrado tener una clara relación con la evolución de la enfermedad, en cambio los autores no han encontrado ningún valor pronóstico del número de vellosidades CD34-positivas en la misma muestra de tumores de mama 44 y, más recientemente, de neoplasias de pulmón de células no pequeñas 45. En la siguiente tabla resumimos las principales características de los anticuerpos específicos del endotelio vascular. Anticuerpo Sensibilidad Especifidad T. fresco T. en Parafina Anti-CD31 Tiñe vasos pequeños y grandes con la misma intensidad en tejido sano y tumoral No específico en tejido fresco congelado. Ocasionalmente tiñe de células plasmáticas. + + Anti-FVIII Tiñe de forma variable los vasos grandes y capilares. Ac policlonal es más sensible Ac monoclonal es más específico. Con el Ac policlonal tinción de estroma + + UEA Tiñe vasos pequeños y grandes con la misma intensidad en tejido sano y tumoral Baja: tiñe células tumorales y vasos linfáticos. + + Anti-CD34 Tiñe vasos pequeños y grandes con la misma intensidad en tejido sano y tumoral Alta. Ocasionalmente tiñe vasos linfáticos y estroma perivascular + + Anti-CD36 Tinción intensa de vasos pequeños – variable/débil de vasos grandes Tiñe monocitos y plaquetas + ?/+ PAL-E Tiñe vasos pequeños y grandes con la misma intensidad en tejido sano y tumoral Alta + - BMA120- BW200 Tiñe vasos pequeños y grandes con la misma intensidad en tejido sano y tumoral Alta. Ocasionalmente tiñe células tumorales y serosa + + EN-4 Tiñe vasos pequeños y Tiñe células tumorales, + ?/+ Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 38! grandes inflamatorias y estroma (depende de fijación) CD105 (activado) Pequeños vasos intratumorales positivos, grandes vasos negativos Tinción débil de vasos en tejido sano + + (depende de fijación) LM609 (activado) Preferentemente tiñe vasos de pequeño calibre en tejido tumoral Tinción débil de vasos en tejido sano + + (depende de fijación) TEC-11 (activado) Positivo en >80% de vasos tumorales Tiñe débilmente vasos en tejido sano y estroma + - Recomendaciones del consenso internacional para cuantificación de angiogénesis A pesar de que muchos estudios han identificado la MVD como un factor pronóstico independiente en tumores sólidos, algunos han cuestionado esta relación. Por supuesto, las discrepancias encontradas pueden deberse a las distintas características propias del comportamiento biológico de cada tumor, pero parece que, al menos una parte, puede ser explicada por la falta de estandarización de las tinciones inmuhistoquímicas. En el año 2002 Peter Vermeulen en colaboración con otros expertos internacionales en angiogénesis, publicó el segundo consenso internacional en cuantificación de angiogénesis en tumores sólidos, donde propuso una serie de recomendaciones a seguir con el fin de estandarizar la metodología de cuantificación de vascularización tumoral. A continuación, de forma esquemática, exponemos las características clave de las técnicas consideradas de elección en la valoración de los distintos parámetros relacionados con angiogénesis. • Estimación de área vascular: técnica de elección ´Chalkley count´ o Unidad: no tiene unidades. o Metodología: tinción con el anticuerpo CD34 de una de las secciones representativas del tumor; posteriormente aplicación del método de Chalkley: tras examinar la preparación con pequeño aumento se seleccionan los puntos calientes y a mayor aumento Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 39! (x200) se realiza la cuantificación de los puntos de la gratícula que coincidan con las estructuras CD34-positivas. o Comentario: se requiere un período de entrenamiento previo; hay determinados tipos de tumores que no tienen ´hot spot´ evidentes. • Fracción de células endoteliales en proliferación o Unidad: porcentaje. o Metodología: se realiza doble inmunotinción con anticuerpos CD34 (o CD31) y Ki67. Los campos se seleccionan aleatoriamente y se realiza la cuantificación de las células positivas para ambos anticuerpos (células endoteliales en proliferación), dividiéndose este valor por el número total de las células endoteliales (CD34+Ki67-). o Comentario: se considera que este valor puede ser útil para valorar la indicación y predecir la eficacia de las terapias antiangiogénicas. • Índice de cobertura por pericitos o Unidad: porcentaje. o Metodología: doble inmunotinción con anticuerpos contra CD34 (o CD31) y contra la actina de músculo liso. Los campos se seleccionan aleatoriamente. o Comentario: el valor obtenido tiene que ser interpretado teniendo en cuenta el índice de cobertura por pericitos en tejido sano adyancente. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 40! ESTUDIOS INMUNOHISTOQUÍMICOS SOBRE ANGIOGÉNESIS EN CARCINOMAS BASOCELULARES Y ESPINOCELULARES. Introducción La inmunohistoquímica es un procedimiento histopatológico que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con una enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico, correctamente fijada e incluida en parafina. A pesar del desarrollo de múltiples técnicas novedosas para valoración no invasiva de la angiogénesis tumoral, la utilización de la inmunohistoquímica en las muestras histológicas del tumor sigue siendo, con diferencia, la técnica más empleada. A continuación, revisaremos de forma sistemática los estudios que valoran la angiogénesis mediante técnicas inmunohistoquímicas en carcinomas basocelulares y espinocelulares. Resumen de los estudios identificados en la literatura En el año 2000, Strieth y colabodoradores 46, realizaron un estudio en el que comparaban la angiogénesis entre queratosis actínicas, queratosis actínicas hipertróficas y carcinomas espinocelulares; para ello realizaron inmunohistoquímica con VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Los autores observaron una falta de correlación entre la expresión de VEGF y el estadío tumoral, lo que podría indicar que este factor no sea decisivo en la progresión tumoral, y que se debía a otros factores. El primer estudio comparando el carcinoma basocelular y espinocelular se realizó en el 2003 por Loggini y colaboradores 47. En el observaron una asociación entre MVD y el aumento del diámetro, la ulceración del tumor y descenso de la supervivencia. Posteriormente en este mismo año también se realizó otro estudio en el que comparaban ambos tumores; Chin y sus colaboradores 48 intentaron observar el Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 41! distinto comportamiento entre CBC, CEC y Tricoepiteliomas mediante la tinción inmunohistoquímica con CD 31. Entre los resultados mas relevantes del estudio fue la ausencia de correlación entre MVD con la profundidad de la invasión y la diferencia cualitativa entre los patrones de angiogénesis tumoral (CBC los vasos estaban en el estroma peritumoral y en CEC estaban peri e intratumorales. Chin propone un modelo en el cual los tumores invasivos inducen un estroma con agio y linfangiogénesis. En estos tumores la MVD se correlaciona con el pronóstico. El último estudio se ha realizado en el año 2011 por Florence 49 publicado en Clinics. En este estudio se valora la progresión del CEC usando marcadores endoteliales (panendoteliales [CD 34] y marcadores de neoangiogénesis [CD105] ); en el concluyen que el cambio de la angiogénesis ocurre muy temprano en el CEC, y la tasa de neovascularización es paralela a la progresión del tumor. En contraste con los marcadores panendoteliales, el uso de CD 105 permite una dinámica evaluación de la angiogénesis tumoral. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 48! MATERIAL Y MÉTODOS _______________________________________________ Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 49! A- MATERIAL La evaluación de la reactividad de los anticuerpos monoclonales CD 31 y CD 105 se realizó a partir de material sobrante después del diagnóstico de biopsias y exéresis en las secciones obtenidas de los bloques incluidos en parafina pertenecientes al archivo del laboratorio de dermatopatología del Hospital Clínico Lozano Blesa de Zaragoza. La obtención de las muestras se había realizado mediante biopsia con bisturí clásico, punch y curetaje-biopsia con bisturí eléctrico bajo anestesia local, exceptúen algún caso que las muestra procedía de lesiones extirpadas en quirófano bajo anestesia general. Seguidamente a la obtención del tejido, éste había sido introducido en solución acuosa de formalina al 10% para su fijación en un periodo no superior a 48 horas. La inclusión en parafina se realizó mediante el procesador automático “Autotechnicon”. Este aparato realiza el procesado de los tejidos de modo automático introduciendo las piezas secuencialmente en: 1. Etanol 70º: 2 horas 2. Etanol 70º: 2 horas 3. Etanol 70º: 2 horas 4. Etanol 96º: 1 hora 5. Etanol 99º: 1 hora 6. Etanol 99º: 1 hora 7. Etanol 100º: 1 hora 8. Tolueno: 2 horas 9. Tolueno: 2 horas 10. Parafina:1 hora 11. Parafina: 1 hora El proceso finaliza mediante la introducción del tejido en parafina líquida dentro de un molde. Posteriormente, una vez que el bloque adquiere consistencia sólida, se puede proceder al corte de las secciones. SECCIONES ESTUDIADAS Se obtuvo un listado informático de todos aquellos pacientes con diagnóstico codificado de Carcinoma Basocelular y Espinocelular entre 2009 y 2010, procedentes del archivo histopatológico de Dpt. de Dermatología Médico- Quirúrgica y Venereología del Hospital Clínico “Lozano Blesa” de Zaragoza. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 50! Se revisaron las preparaciones hasta seleccionar 35 CCB y 42 CCEE, que tuviesen tamaño y calidad suficientes que permitiesen realizar 4 cortes de cada pieza y su posterior tinción con los marcadores. MATERIAL DE LABORATORIO -Parafinador automático Autotechnicon e.m.Myr. -Refrigerador para conservar los reactivos. -Microtomo rotatorio HM 325. -Cubeta térmica, marca E.M.Myr. -Hornillo calentador. -Balanza de precisión Cobos, modelo M-150. -Termómetro. -Cronómetro. -Canastillas de trasiego. -Canastillas de trasiego para las coloraciones. -Portaobjetos y cubreobjetos. -Pipetas. -Probetas graduadas. -Papel de filtro. -Guantes desechables de látex. -Mascarillas. -Papel de filtro. MATERIAL ESPECÍFICO PARA LAS TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS -Esterilizador de biberones (Prenatal). -Cámara húmeda de vidrio para realizar la incubación de anticuerpos. -Cámara húmeda oscura para preservar la exposición a la luz durante el proceso de revelado. -Micropipeta para realizar la dilución de los anticuerpo. - Dako Autostainer Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 51! Fig.4. Dako Autostainer. Sistema que está diseñado para automatizar los métodos manuales de tinción utilizados de la forma rutinaria en inmunohistoquímica y histoquímica. MATERIAL PARA VALORAR LOS RESULTADOS OBTENIDOS -Microscopio óptico binocular (Zeiss 473356). -Microscopio óptico Axioskop 40 Zeiss -Gratícula de Chalkey -Cámara para microscopía de alta velocidad Axiocam ERc5s Zeiss -Soporte informático:  Ordenador Mac Os 1,5 pulgadas: 2,5GHz. Core i5 de Intel con cuatro núcleos a 2,5 GHz  Ordenador HP L1950 REACTIVOS UTILIZADOS ANTICUERPOS ANTI CD 31 Sinónimos: PECAM-1 (molécula 1 de adhesión entre células endoteliales y plaquetas). Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 52! El CD 31 es una protéina transmembrana monocatenaria tipo 1 con una masa molecular aproximada de 135 kD, que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La CD 31 se une tanto de manera hemofílica como heterofílica. Entre los ligandos heterofílicos se encuentran los glucosaminglicanos de heparan sulfato, la heparina y la integrina avb3. La CD31 participa en las interacciones adhesivas entre las células endoteliales adyacentes así como entre los leucocitos y las células endoteliales. La CD31 se expresa en todo el endotelio continuo, como el de arterias, arteriolas, vénulas, venas y capilares no sinusoidales. Anticuerpo monoclonal de ratón listo para usar, suministradi en forma líquida en un tampón que contiene proteína estabilizante y 0.015 mol/L de azida de sodio. (Dako Denmark) ANTI CD 105 Sinónimos: GP 120 o Endoglina La endoglina es una proteína transmembrana tipo I de 95 kD que se expresa altamente en las células endoteliales vasculares humanas. Se ha demostrado la regulación por aumento de la expresión de la endoglina en células proliferativas y en la vasculatura tumoral, lo que sugiere que es un marcador de las células endoteliales asociado a proliferación. El anticuerpo anti-endoglina, SN6h, es un anticuerpo monoclonal murinosuministrado de forma líquida como sobrenadante de cultivo de tejido (con suero bovino fetal), dializado con tampón Tris- HCl 0.05 mol/L, pH 7,2 y ázida sódica 0,015 mol/L. Contiene proteína estabilizante.(Dako Denmark). B- MÉTODO REVISIÓN SISTEMÁTICA DE LA LITERATURA Se ha realizado la búsqueda bibliográfica en la base de datos PubMed con el objetivo de identificar todos los artículos relevantes publicados en inglés, hasta la fecha de realización de la revisión (Mayo 2012) para angiogénesis en CBC y CEC. La estrategia de búsqueda empleada fue “Carcinoma, Basal Cell” [Mesh] Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 53! AND "Carcinoma, Squamous Cell"[Mesh] AND(“Neovascularization, Pathologic” [Mesh] OR “Microvessels” [Mesh]). La búsqueda inicial dio como resultado el número total de 9 publicaciones sobre angiogénesis en cáncer cutáneo no melanoma. Esta búsqueda fue ampliada mediante la función ofrecida por PubMed de ´related articles´ (artículos relacionados), así como se han revisado las listas de las referencias bibliográficas de los artículos relevantes con el objetivo de identificar aquellos artículos que no han sido capturados mediante la búsqueda computarizada. Sólo se han incluido aquellos estudios realizados en muestras de CBC y CEC en humanos y en los que se ha empleado alguna de las técnicas de cuantificación de angiogénesis basada en inmunohistoquímica. Asimismo, para incluir en la revisión, los artículos tenían que ofrecer información completa y clara sobre los anticuerpos, metodología seguida para la realización de las tinciones y también a la hora de interpretación de los resultados. Finalmente, se han incluido en la revisión 4 artículos sobre angiogénesis en Carcinomas Basocelulares y Espinocelulares basados en técnicas inmunohistoquímicas. SELECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS La selección se realizó de manera aleatoria entre los CBC y CEC. Esta selección se hizo de modo retrospectivo entre los bloques existentes en el archivo del laboratorio en el momento del estudio. A- CRITERIOS DE INCLUSIÓN • Lesiones con diagnóstico histológico de Carcinoma Basocelular, extirpados o biopsiados en el Hospital Clínico “Lozano Blesa” de Zaragoza. • Lesiones con diagnóstico histológico de Carcinoma Espinocelular, extirpados o biopsiados en el Hospital Clínico “Lozano Blesa” de Zaragoza. B- CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Muestras no valorables (preparaciones n las que no es posible un buen análisis): • Borde libre tumoral muy escaso Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 54! • Preparaciones muy artefactas • Aquellas que no tengan un tamaño suficiente SELECCIÓN DE ANTICUERPOS Y TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Los anticuerpos se han seleccionado en base a la revisión bibliográfica ,seleccionando un anticuerpo panendotelial (CD 31) y un anticuerpo específico de las células endoteliales en proliferación (CD 105). METODOLOGÍA PARA LA TINCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA 1. Se extraen los bloques de tejido del archivo. Se realizan 4 cortes del tejido de 3-4 micras de grosor utilizando el microtomo, posteriormente se toma el corte con agujas histológicas y se colocan en el baño de flotación hasta que los cortes queden completamente estirados y sin burbujas. Se recoge con el porta objetos el corte y se colocan en gradillas La sección de los bloques se realizó con un espesor de 3 micras mediante el microtomo rotatorio, posteriormente se introducían en un recipiente con agua a 37º C para que flotasen en la superficie, se elongaran en toda su amplitud y poder montarlos en el portaobjetos ya gelatinados previamente. La gelatinización de los portaobjetos se obtuvo mediante la inmersión de los mismos en una solución obtenida mediante calentamiento a 40º C de 100 ml. de agua destilada, a la que se le había añadido: 0,50 gramos de gelatina en primer lugar y posteriormente 0,40 gramos de alumbre de cromo. Tras el proceso de inmersión de los portaobjetos, éstos se dejaban secar en una rejilla en posición vertical. 2. Se generan las etiquetas con el número nuevo asignado al caso. La etiqueta señala: número de caso, número de biopsia, anticuerpo y clon, así como las iniciales del doctorando. Las etiquetas se orientan y se pegan en la zona esmerilada procurando que quede centrada y alineada con los bordes. El resto de la tinción se ha realizado en el Servicio de Anatomía Patológica. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 55! 3. Se desparafinan los cortes en dos baños de Toluol durante 3 minutos cada uno. 4. Se rehidratan los cortes siguiendo los pasos siguientes: a. 2 baños de Isopropanol-Alcohol 100% por 3 minutos cada uno; b. Un baño de Metanol durante 5 minutos y, por último c. Baño de agua destilada durante 10 minutos. 5. Recuperación antigénica en solución buffer de citrato. Durante la fijación de tejido y en los métodos post-inclusión, muchos epítopos pueden ser enmascarados, lo que daría lugar a un resultado débil o falso negativo en la detección de algunas proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica. La solución buffer de citrato rompe los enlaces cruzados entre proteínas, desenmascarando los antígenos y los epítopos en los tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina, lo que incrementa la intensidad de tinción de los anticuerpos. a. Se calienta la solución buffer de citrato hasta 95-100º en baño de vapor; b. Se colocan los cortes en el portaobjetos y éste se introduce en el recipiente con solución buffer de Citrato, donde se incuba durante 30 minutos. c. Una vez transcurrido este tiempo, se apaga el baño de vapor de agua, se extrae el recipiente de tinción y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. d. Se realiza lavado de los cortes en buffer de lavado (Wash Bufer RTU). 6. Inhibición de la Peroxidasa endógena. Dado que el anticuerpo secundario que utilizaremos está conjugado con peroxidasa (HRP), realizamos bloqueo de esta para evitar señal inespecífica. Para ello se incuban los cortes con una solución de peróxido de hidrógeno durante 10 minutos. (Utilizaremos Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use de Dako Citomation). 7. Lavado durante 3 min con buffer de lavado. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 56! 8. 1 corte se incuba con el anticuerpo nº1: CD 31 (Dako) en dilución 1/20, a temperatura entre 2 y 8 ºC minutos. El anticuerpo se une a su antígeno específico allí donde esté presente. El otro corte se incuban con el anticuerpo nº 2: CD 105 (Dako) en dilución 1/2000. Los otros dos cortes se guardaron para realizar una nueva tinción en los casos negativos. 9. Lavado con buffer de lavado durante 3 minutos. 10. A continuación, los cortes se incuban con reactivo de visualización (env k4061) a temperatura ambiente durante 30 minutos. También se conoce con el nombre de anticuerpo secundario, y en este caso, está unido covalentemente al enzima peroxidasa. Este paso permite amplificar el resultado de la reacción, ya que varias moléculas del anticuerpo secundario pueden unirse a cada molécula del anticuerpo primario, aportando, por tanto, una mayor intensidad de tinción. 11. Se realizan 2 lavados de 3 minutos cada uno con buffer de lavado. 12. El producto de reacción de peroxidasa es revelado utilizando como sustrato 3,3´diaminobencidina (DAB), que al oxidarse, forma un producto marrón insoluble (cuya precipitación interpretaremos como positividad de la tinción). 13. Se realizan 4 lavados de 3 minutos cada uno con buffer de lavado. 14. Contratinción con hematoxilina: colocamos los cortes en un portaobjetos y lo sumergimos en hematoxilina durante 1 minuto. 15. Transcurrido este tiempo, realizamos lavado abundante con agua destilada. 16. Montaje de las preparaciones: colocamos el portaobjetos con el corte de tejido sobre la mesa y aplicamos el gel que nos permitirá fijar el cubreobjetos (Dako Glycergel Mounting Medium). Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 57! Fig.5 Esquema sobre la tinción inmunohistoquímica VALORACIÓN DE LAS TINCIONES Se eligió la técnica de cuantificación de Chalkley counting para valorar la angiogénesis. El motivo por el cual se eligió esta técnica es porque en el segundo consenso internacional de cuantificación de angiogénesis en tumores sólidos esta técnica fue considerada como técnica de elección. Se examina la preparación a bajo aumento (x5) para seleccionar los puntos con mayor densidad de vasos sanguíneos. Posteriormente, esos puntos se examinan a mayor aumento (x20) y se cuantifican aquellos puntos de la gratícula de Chalkley que se superponen sobre los vasos sanguíneos o células individuales positivas para el endotelio vascular. En cada caso, se seleccionan las tres puntuaciones mas altas y se calcula la media aritmética de las mismas. Este último número es e que se empleara para el análisis estadístico de los datos. CREACIÓN DE BASE DE DATOS. Se han revisado las historias clínicas de los pacientes (previo consentimiento de Dirección médica del Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa”) y se han recogido los diferentes parámetros: • Número de Historia Clínica • Número de Biopsia • Fecha de nacimiento Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 64! B. RESULTADOS DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO 1. Las tinciones han sido positivas y evaluables en 31 casos de Carcinoma Basocelular y 39 casos de Carcinoma Espinocelular. 2. La media de los vasos sanguíneos teñidos con CD 31 y cuantificados mediante el método de Chalkley counting fue de 5.9 en Carcinoma Basocelular (95%CI:4.8-7.0) y 7,76 en Carcinoma Espinocelular (95%CI:5.5-10.02), resultando la diferencia estadísticamente significativa (p<0,05). 3. La media de los vasos sanguíneos teñidos con CD 105 y cuantificados mediante el método de Chalkley counting fue de 5,2 (95%CI:4.0-6.4) en Carcinoma Basocelular y 8,4 (95%CI:6.7-10.1) en Carcinoma Espinocelular, resultando la diferencia estadísticamente significativa (p<0.05). Análisis estadístico. Utilizaremos la prueba t de Student para muestras independientes. Para comprobar si se cumple la condición de igualdad de varianzas, emplearemos la prueba de Levene. Definición de casos utilizados: los estadísticos de cada análisis se basan en los casos que no tienen datos perdidos ni quedan fuera de rango de cualquiera de las variables del análisis. 4. Comparación de medias de MVD-CD31 entre Epitelioma Basocelular y Carcinoma Espinocelular. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 65! 5. Comparación de MVD valorado con CD105 entre Epitelioma Basocelular y Carcinoma Espinocelular. 6. La diferencia entre la MVD en BCC valorada con CD 31 no fue estadísticamente significativa en comparación con MVD cuantificada con CD 105. (p>0.05). 7. La diferencia entre la MVD en SCC valorada con CD 31 tampoco fue estadísticamente significativa en comparación con MVD cuantificada con CD 105. (p>0.05). 8. En algunos casos de SCC se encontraron vasos sanguíneos en el interior de la masa tumoral, mientras que no se observaron vellosidades sanguíneas intratumorales en el caso de los BCC. (p<0.05). Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 66! 9. Histológicamente el número de vasos es mayor en aquellos tumores que han dado metástasis o recidiva, pero la diferencia no alcanza la significación estadística. 10. Se ha realizado el análisis estadístico para comprobar si hay diferencia de la densidad de vasos entre hombres y mujeres, así como entre diferentes localizaciones, tanto en CBC como en CEC No hay diferencias en ninguno de los grupos (p>0.05). 11. Patrón de angiogénesis. A diferencia de otros tumores sólidos, no se encontró el patrón de vascularización en “hot spot” descrito en varios tipos de tumores sólidos, no se ha objetivado en ninguno de los dos tipos de tumores estudiados. En el caso de CBC sólo se han encontrado vasos en el estroma peritumoral (Fig.6), mientras que en CEC se observaron vasos sanguíneos tanto en el interior de la masa tumoral (intratumorales) como en el exterior (peritumoral) (Fig.7,8 y 9). Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 67! Fig.6 Imagen inmunohistoquímica de CBC teñido con CD 105. Donde se observan los vasos peritumorales. No se aprecian vasos dentro de la masa tumoral. ! Fig.7 Imagen inmunohistoquímica de CEC teñido con CD 105. Donde se observan los vasos peritumorales e intratumorales. ! Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 68! Fig.8 Imagen histológica de CEC teñido con CD 105 (marcador de neoangiogénesis) Fig.9 Imagen histológica de CEC teñido con CD 31 (marcador panendotelial) Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 69! DISCUSIÓN _______________________________________________ Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 70! DISCUSIÓN Presentamos los resultados del estudio en el que el objetivo principal era comparar el diferente potencial angiogénico y su posible relación con el diferente comportamiento clínico en el cáncer de piel no melanoma. Nuestro estudio tiene una serie de limitaciones: El tamaño de muestra limitado, se debe al coste elevado de los reactivos que utilizaremos en nuestro estudio y la falta de financión del estudio. Limitaciones técnicas. En ocasiones existen limitaciones técnicas que dificultan la valoración de la inmunohistoquímica. Entre las más importantes están los problemas de fijación del tejido, el anticuerpo utilizado o la pérdida de antigenicidad en cortes almacenados más de 24 horas antes de la realización de la técnica. No solo es importante conocer la especificad del anticuerpo, sino que se deben recordar los artefactos que pueden aparecer en estas preparaciones, como la tinción inespecífica de los márgenes del corte de tejido (artefacto del borde) o en zonas de necrosis, la difusión o capacitación del antígeno por los tejidos o células adyacentes y la reactividad cruzada de algunos anticuerpos. Valoración de las muestras teñidas. No es posible cuantificar exactamente el número de células teñidas, y además, en un mismo tumor, se podría observar distintas áreas con mayor o menor intensidad de tinción. Seguimiento de los pacientes. Dado que la edad media de los pacientes con carcinoma Basocelular y Espinocelular es elevada, en muchos de los casos es imposible realizar un seguimiento longitudinal de la evolución clínica postquirúrgica (muchos de los pacientes presentan co-morbilidades importantes, y en el caso de fallecimiento, será complicado identificar la causa del mismo, y que en la mayoría de los casos no estará relacionada con la neoplasia cutánea). Poder estadístico del estudio. Una de las limitaciones importantes de nuestro estudio es el poder estadístico del trabajo, condicionado por el tamaño de la muestra (una muestra mayor tendría mayor potencia estadística). La repercusión más importante de un tamaño muestral limitado, radica en que al interpretar los resultados en que no encontramos significación estadística, no se puede descartar que esto no sea debido al tamaño de la muestra. Esta situación, no afectaría a los resultados positivos o estadísticamente significativos. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 71! Muchos estudios han documentado que el crecimiento tumoral y las metástasis requieren de un aporte persistente de vascularización 58. La hipótesis general número uno (“la expresión de los marcadores de angiogénesis será diferente en Carcinomas Espinocelulares frente a Basocelulares) se ha confirmado en su totalidad, tanto para el marcador panedotelial CD 31 (hipótesis operativa 1.1) como para el marcador inmunohistoquímico de neoangiogénesis CD 105 (hipótesis operativa 1.2). Esta diferencia en la densidad microvascular pueden explicar, al menos en parte, el diferente comportamiento biológico de estos tumores. La hipótesis Operativa 2.1: “La mayor expresión de CD 31 y CD 105, se relaciona con la mayor MVD (Microvessel density); y esta, a su vez, se relaciona con la mayor agresividad del tumor”. La mayor MVD es más alto en CEC frente a CBC, los tumores espinocelulares son mas agresivos que los basocelulares. Desde este punto de vista es cierto. Pero dentro de cada gurpo de tumor, no se ha comprobado que los que han metastatizado tienen mayor número de vasos. Pero la explicación más probable es que el número de metástasis es muy pequeño. En los estudios previos se ha comprobado que CD 105 es mas bajo estadísticamente que CD 31. Baptistella y colaboradores 49 en el 2011 observaron que los marcadores panendoteliales no son diferentes en los diferentes estadíos de CEC, sin embargo CD 105 se correlacionó con la progresión del Carcinoma Espinocelular. En nuestro estudio no se observado la diferencia que cabría esperar según la bibliografía, en nuestro caso la progresión no se correlacionó con ningún de los dos marcadores esto puede ser como consecuencia de que CD 105 no sea específico de células endoteliales en formación o por falta de tamaño muestral y por lo tanto el bajo número de metástasis. No hemos encontrado diferencias en MVD entre hombres y mujeres, ni tampoco entre diferentes localizaciones, lo que sugiere que la MVD es una factor intrínseco del tumor. Sobre el patrón de angiogénesis, la ausencia de vasos sanguíneos en el cuerpo de CBC podría ser una explicación a su tendencia a ulcerarse y que estos vasos Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 72! se sitúen en el estroma peritumoral podría también explicar las telangiectasias que esta neoplasia presenta en superficie. Straume 59 demostró que un incremento de MVD está asociado significativamente con la ulceración, el aumento del diámetro y el descenso en la superviviencia. La ausencia del potencial metastático de BCC podría deberse a la ausencia de vasos y por el otro lado la presencia de vasos intratumorales le confiere capacidad invasiva y metastásica. El que no observen vasos intratumorales pude explicarse como en otros tumores en los que el estroma angiogénico se produce, pero debe haber una zona entre la angiogénesis y el borde de ataque del tumor donde los vasos sanguíneos se someten regresión completa; se desconoce aquellos factores antiangiogénicos que interfieren. En cuanto a las variables clínico-demográficas: La edad al diagnóstico es de 68 en CBC y de 79 en CEC, el que aparezca en edades tardías se debe en parte a la relación con un daño solar acumulado, inmunosupresión y a la mayor esperanza de vida. En cuanto al sexo hemos comprobado que es mas frecuente en varones tanto CBC y CEC, como demuestran otros estudios. La explicación puede deberse a la realización de trabajos por parte de los varones al aire tales como agricultura, construcción. La localización mas frecuente es la cara probablemente sea consecuencia de la combinación de varios factores, como aumento de la exposición al sol o a los rayos UVA, mayor participación de la población en actividades que se realizan al aire libre, cambios en el tipo de vestimenta. El tamaño al diagnóstico es mayor en CEC frente a CBC, ya que tiene un crecimiento más rápido CBC pueden permanecer muchos años y seguir una evolución mas crónica hasta que el paciente se lo observa. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 73! CONCLUSIONES _______________________________________________ Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 80! 40. Hillen F, van de Winkel A, Creytens D, Vermeulen AH, Griffioen AW. Proliferating endotelial cells, but not microvessel density, are a prognostic paramenter in human cutaneous melanoma. Melanoma Res 2006;16:453-457 41. Ebernhard A, Kahlert S, Goede V, Hemmerlein B, Plate KN, Augustin HG. Heterogeneity of angiogenesis and blood vessel maturation in human tumors: implications for angiogenic tumor therapies. Cancer Res 2000;60:1388-1393 42. Benjamin LE, Hemo I, Keshet E. A plasticity window for blood vesel remodelling is defined by pericite coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development 1998;125:1591-1598 43. (revisado en Hasan J, Byers R, Jayson GC. Intra-tumoral microvessel density in human solid tumours. BJ Cancer 2002;86:1566-1577) 44. Kumar S, Ghellal A, Li C, Byrne G, Haboubi N, Wang JM, Bundred N. Breast cancer: vascular density determined using CD105 antibody correlates with tumor prognosis. Cancer Res 1999;59:856-861 45. Tanaka F, Otake Y, Yanagihara K, Kawano Y, Miyahara R, Li M, Yamada T, Hanaoka N. Evaluation of angiogenesis in non-small cell lung cancer: comparison between anti-CD34 antibody and anti-CD105 antibody. Clin Cancer Res 2001;7:3410-3415. 46. Strieth S, Hartschuh W, Pilz L, Fusenig NE. Angiogenic switch late in squamous cell carcinomas of human skin. Br J Cancer 2000; 82: 591-600. 47. Loggini B, Boldrini L, Gisfredi S, Ursino S, Camacci T, De Jeso K, et al. CD 34 Microvessel density and VEGF expression in basal and squamous cell carcinoma. Pathol Res Pract 2003; 199: 705-712. 48. Chin CWS, Foss AJ, Stevens A, Lowe J. Differences in the vascular patterns of basal ans squamous cell skin carcinomas explain their differences in clinical behaviour. J Pathol 2003; 200: 308-313. 49. Baptistella ME, Massuda JY, Bröcker, EB, Metze K, Cintra ML, de Souza EM. Angiogenesis in the progression of cutaneous squamous cell carcinoma: Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 81! an immunohistochemical study of endothelial markers. Clinics 2011; 66: 465- 468. 50. Laquer V, Hoang V, Nguyen A, Kelly KM. Angiogenesis in cutaneous disease: part II. J Am Acad Dermatol 2009; 61:945-58. 51. Amoroso A, Del Porto F, Di Monaco C, Mnafredini P, Afeltra A. Vascular endothelial growth factor: a key mediator of neoangiogenesis. A review. Eur Rev Med Pharmacol Sci 1997; 1:17-25. 52. Ria R, Reale A, Castrovilli A, Mangialardi G, Damaco F, Ribatti D, Vacca A. Angiogenesis and progression in human melanoma. Dermatol Res Pract 2010; pp.1-6. 53. Redondo P, Sánchez- Carpintero I, Bauzá A, Idoate M, Solano T, Mihm MC Jr. Immunologic escape and angiogenesis in human malignant melanoma. J Am Acad Dermatok 2003; 49:255-263. 54. Lin DC, Du XL, Lang MR. Protein alterations in ESCC and clinical implications: a review. Dis Esophagus 2009; 22:9-20. 55. Bowden J, Brennan PA, Umar T, Cronin A. Expression of vascular endothelial growth factor in basal cell carcinoma and cutaneous squamous cell carcinoma of the head and neck. J Cutan Pathol 2002; 29:585-589. 56. Kalvankrishna S, Grandis JR. Epidermal Growth Factor Receptor biology in head and neck cancer. J clin Oncol 2006; 24:2666-2672. 57. 21. Hong DY, Lee BJ, Lee JC, Choj JS, Wang SG, Ro JH. Expression of VEGF, HGF,IL-6, IL-8, MMP-9, Telomerase in peripheral blood of patients with Head and Neck Squamous cell carcinoma. Clin Exp Otorhinolaryngol 2009; 2:189-19 58. Folkman J, et al. Tumor angiogenesis. Cancer medicine 2000; 5:132-152. 59. Straume O, Akslen LA. Expression of vascular endotelial growth factor, its receptors (FLT-1, KDR) and TSP-1 related to microvessel density and patient outcome in vertical growth phase melanomas. Am J Pathol 2001; 159: 223-225. Trabajo fin de Máster Zaragoza 2012 ! ! 82!