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1. Objetivos: 1.1. El objetivo general del proyecto Explorar la eficacia de la terapia fotodinámica (TFD) con la hipericina (HYP) comparándola con la de uno de los fotosensibilizantes más utilizados en TFD antimicrobiana, el azul de metileno (AM), frente a los microorganismos patógenos que con mayor frecuencia producen infecciones en la cavidad oral: bacterias gram positivas (Streptoccocus sanguis y Streptoccocus mutans) y levadura (Candida albicans). 1.2. Objetivos concretos 1. Comparar la actividad bactericida in vitro de la TFD con hipericina y azul de metileno en S. mutans, S. sanguis. 2. Comparar la actividad fungicida in vitro de la TFD con hipericina y azul de metileno en C. albicans. 3. Comparar la actividad fungicida in vitro de la TFD con hipericina y azul de metileno frente a especies de Candida resistentes. 4. Comprobar si la hipericina y el azul de metileno presentan efecto de sinergia frente a S. mutans y S. sanguis. 5. Comprobar si la hipericina y el azul de metileno presentan efecto de sinergia frente a Candida. 6. Establecer la toxicidad in vitro de la TFD con extracto de hipericina en las células de la mucosa oral: queratinocitos y fibroblastos. 1 2. Introducción 2.1. Infecciones orales: La boca es el hábitat favorable para un complejo microecosistema para más de 300 especies de bacterias y algunos hongos debido a la presencia de nutrientes, restos de epitelio y secreciones 1. La distribución de la microbiota varía cualitativa y cuantitativamente de acuerdo con el hábitat. Muchos de los microorganismos son residentes pero algunas bacterias son ocasionales. Los géneros Streptoccocus, Lactobacillus, Corynebacterium, Veillonella, y Actinomyces constituyen en un 80% de la flora bucal 2, así como Candida albicans, la levadura más frecuente en la microbiota bucal. Todos ellos pueden ser patógenos en presencia de determinados factores predisponentes, producciendo infecciones que van desde lesiones superficiales de la mucosa a graves e invasivas diseminaciones sistémicas 3. En la cavidad bucal humana al haber mucha diversidad de microorganismos, éstos se encuentran formando agregados, estructuras que se conocen como biopelículas, o en término común placa dental, que se forman en la superficie dental 4. Los biofilms microbianos en la cavidad oral están involucrados en la etiología de diversos procesos orales, que incluyen enfermedades periodontales y endodontales, caries, halitosis, estomatitis, candidiasis así como el fracaso de implantes dentales. Por otro lado, las bacterias de la placa dental son capaces de iniciar una endocarditis bacteriana, en pacientes predispuestos; además, se las ha relacionado con partos prematuros, infecciones uterinas, diabetes e incluso demencia 5. El crecimiento en la forma natural de biofilms 6 les confiere a estos gérmenes de la boca una resistencia mayor a los antimicrobianos 7 comparado a su crecimiento en cultivos en suspensión (forma planctónica) 8, ya que se produce unos cambios en sus propiedades 9. Los agentes antimicrobianos, antibióticos y no-antibióticos, se prescriben frecuentemente para el tratamiento de la halitosis y la enfermedad periodontal. No obstante, el riesgo de resistencias y toxicidad es un problema importante 10. Además, sólo altos niveles y múltiples dosis de los mismos administrados localmente pueden tener el mismo efecto que los que se administran por vía sistémica. Por todo ello, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas diferentes a las hasta ahora utilizadas supone un importante reto para el control del crecimiento microbiano 2 en la cavidad oral. Por dicha razón estan surgiendo terapias alternativas a los antibióticos para controlar la población de microorganismos productores de caries y enfermedades periodontales en la cavidad oral. 2.2. Terapia Fotodinámica La TFD es una modalidad terapéutica bien establecida, que fue originalmente desarrollada y posteriormente aprobada para el tratamiento de tumores sólidos 11. En 1900, un científico alemán, Oscar Raab fue el primero en constatar el efecto tóxico conjunto de la luz y los colorantes, en concreto del naranja de acridina, sobre Paramecium caudatum. En 1907, von Tappeiner y Jodlbauer publicaron un libro de texto sobre esta terapia, que se conoce como un proceso de fotosensibilizantes oxigenodependiente para el tratamiento de tumores de la piel y la destrucción de las partículas infecciosas 12. La TFD se basa en la combinación de tres componentes esenciales : Un fotosensibilizante (FS) no tóxico intrínsecamente que se localiza en el tumor o células microbianas, una luz visible de adecuada longitud de onda que administrada en la zona es específicamente absorbida por el agente fotosensibilizante y en presencia de oxígeno resulta en la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) las cuales inducen la muerte específica de las células tumorales por apoptósis o necrosis, preservado los tejidos sanos circundantes 13 , ninguno de los componentes es toxico por separado. Este mecanismo se puede llevar a cabo por dos vías: bien por la transferencia de electrones (reacción de tipo I) o por la transferencia de energía (reacción de tipo II).El electrón que se transfiere puede dar lugar a la producción del anión superóxido, peroxido de hidrogeno y radicales hidroxilo. En la reacción de tipo II, se produce oxigeno singlete (1O2). El oxigeno en estado excitado es el intermediario más importante en esta reacción. Las ROS son moléculas altamente reactivas que provocan diversos efectos en las células como la inactivación de enzimas y otras proteínas o la peroxidación de lípidos dando lugar a la destrucción de membranas celulares, lisosomas y mitocondrias lo que conlleva finalmente la muerte celular 14. La destrucción celular se puede producir mediante apoptosis o necrosis lo que dependerá, fundamentalmente del fotosensibilizante utilizado, de su localización intracelular y de las estructuras celulares que resulten dañadas 15. Además, la TFD induce una respuesta vascular, inmunológica y 3 de la matriz extracelular que intervienen en su efectividad final y en su excelente resultado cosmético 16. La producción de ROS depende de la concentración del fotosensibilizante 17,18. Figura 1. Mecanismo de Acción de la Terapia Fotodinámica Antimicrobiana La TFD ha tenido un gran éxito como terapéutica de algunos cánceres, especialmente los cutáneos no melanocitarios 19, y algo menos en la degeneración macular retiniana 20 o el esófago de Barret 21, entre otros procesos. El uso de la TFD como una modalidad terapéutica para el tratamiento de infecciones localizadas representa un campo emergente de investigación. Así, diversos artículos, tanto referentes a experiencias realizadas in vitro como in vivo avalan su utilidad en el tratamiento de las infecciones producidas por bacterias, hongos, virus y parásitos, es lo que se ha denominado quimioterapia fotodinámica antimicrobiana (PACT en inglés) 22 23. 4 2.3. Terapia fotodinámica antimicrobiana Este tipo de tratamiento ofrece una serie de ventajas frente a los tratamientos antimicrobianos tradicionales: 1) Amplio espectro de acción, ya que un mismo fotosensibilizante puede actuar frente a bacterias, hongos, virus y parásitos; 2) Eficacia independiente del patrón de resistencia antibiótica; 3) Posibilidad de desarrollar protocolos de TFD que permitan una amplia reducción de la población patógena con un daño muy limitado al tejido huésped; 4) La inactivación de los microorganismos fotosensibilizados es un proceso multidiana, consecuencia de lo cual, por un lado la selección de cepas fotoresistentes es muy improbable y es un fenómeno por ahora no descrito. 5) Disponibilidad de formulaciones que permitan una liberación específica del fotosensibilizante al área infectada; 6) Uso de fuentes de luz de bajo coste para la activación del agente fotosensibilizante. 7) Compatibilidad con cualquiera de los tratamientos antibióticos o antimicóticos que se utilizan en la actualidad. Los fármacos fotosensibilizadores o fotosensibilizantes deben poseer las siguientes propiedades: • Absorción elevada en la parte roja del espectro (> 600nm) para asegurar una mayor penetración de la luz en la piel y así poder tratar infecciones internas. • Rendimiento cuántico de formación de estado triplete elevado, así como un tiempo de vida de este estado triplete suficientemente largo para ser capaz de producir oxígeno singlete. • Energía del estado triplete mayor que 94 kJ/mol, para poder fotosensibilizar al oxígeno singlete. • Rendimiento cuántico de formación de oxígeno singlete también elevado. • Elevada especificidad para asociarse a los microorganismos patógenos, • Mínima toxicidad en ausencia de luz. • Rápida eliminación del cuerpo para minimizar posibles efectos secundarios. • Pureza química y síntesis versátil y económica. 5 La carga positiva en los fotosensibilzadores, o bien el uso de agentes permeabilizantes 24-25, como el EDTA o el PMBN, acentúan su afinidad por los agentes infecciosos con una estructura exterior compleja. Es deseable clínicamente el hecho de no tener que usar agentes químicos adicionales, motivo por el cual la vía de los fotosensibilizadores con carga ha adquirido una gran relevancia. Las estructuras actualmente más prometedoras son las basadas en los fotosensibilizadores cargados positivamente a valores de pH fisiológicos. Así, se han descrito ya algunos fotosensibilizantes con actividad fotodinámica antimicrobiana in vitro tanto frente a bacterias como frente a hongos 26-27-28; En primer lugar se encuentran compuestos sintéticos no-porfirínicos, como los colorantes fenotiacinicos, entre los que se incluye el azul de metileno y sus derivados. En segundo lugar moléculas macrocíclicas como las ftalocianinas y las porfirinas. Y por último un grupo de fotosensibilizantes naturales, entre los que se encuentra la hipericina, entre otros. De todas estas sustancias es el azul de metileno el que en este momento se está desarrollando más activamente para el tratamiento fotodinámico de úlceras infectadas mediante estudios en animales 29. No obstante lo anterior, la TFD todavía no tiene ninguna indicación clínica antimicrobiana aprobada y su aplicación es anecdótica. Así, en los últimos años se han publicado casos aislados de diversas infecciones tratadas empíricamente mediante TFD con diferentes FSs con prometedores resultados: tiñas de piel lampiña 30, candidiasis 31, úlceras y tumores con sobreinfección bacteriana 32- 33, micobacterias 34, parásitos 35 e incluso ácaros 36. Todo ello apunta a que la TFD puede tener un prometedor futuro en el tratamiento de las infecciones de la piel. El uso de la TFD para uso antimicrobiano en la cavidad oral fue postulado por el Prof. Michael Wilson and colleagues 37 en el Eastman Dental Institute, University College de Londres. El azul de toluidina O (TBO), el azure B y el azul de metileno tienen un efecto bactericida sobre diversos gérmenes orales habituales, como Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans, y Fusobacterium nucleatum cuando se les expone a luz 10. Además, las bacterias orales en biofilms multi-especies pueden ser destruidas mediante el uso de TBO y luz roja 38. Por último, el uso de lámparas de diodos emisores de luz (LEDs) y TBO indujo la muerte celular y la prevención de formación de biofilms de S. mutans 39. Algunas bacterias anaeróbicas, 6 como Porphyromonas gingivalis. Fusobacterium nucleatum, y Capnocytophaga gingivalis también pueden ser fotoinactivadas por este método utilizando clorina e6 y BLC 1010 como fotosensibilizantes 40. Por todo ello, la TFD ha demostrado ser una buena alternativa a los agentes antimicrobianos convencionales para eliminar las especies subgingivales y tratar la periodontitis 18. Asimismo, la TFD puede usarse para prevenir la caries dental mediante el ataque de los microorganismos de la placa dental fermentativos así como método mínimamente invasivo de eliminar las bacterias en la lesión de caries 41. Recientemente se han comercializado 2 dispositivos de TFD para su uso en periodontitis: Periowave en Canadá, (http://www.periowave.com), consistente en un sistema laser que utiliza como fotosensibilizante el azul de metileno, otro kit que también utiliza una fenotiazina comercializado en Austria, Alemania, Suiza y Reino Unido (Helbo;Photodynamic Systems GmbH & Co. KG, Grieskirchen,Austria), y por último, Otras comañías incluyen kits con azul de toluidina O (Denfotex Ltd., Dexcel Pharma Technologies) 18. Hay una compañía que lo comercializa en España, se llama FotoSan y lo comercializa la casa Lasala dental. El uso de la TFD en las infecciones orales aporta varios beneficios: su aplicación local, no invasiva; rápida muerte de las bacterias con cortas exposiciones al fotosensibilizante y a la luz; escasa probabilidad de desarrollo de resistencias, considerando la toxicidad genérica de la TFD mediante la producción de especies reactivas del oxígeno (EROs); y la muerte de los gérmenes limitada al lugar de la irradiación y la difusión de las EROs. El principal reto de la TFD antimicrobiana es encontrar la ventana terapéutica in vivo donde las bacterias y los hongos sean destruidos sin efectos citotóxicos en los tejidos sanos circundantes. Los valores de concentración bactericida mínima (CBM) de un fotosensibilizante adecuado (cfu/ml) in vivo para matar >99,9% de las bacterias debe ser menor que la concentración de fotosensibilizante necesario para destruir las células huéspedes donde asienta la infección, en este caso de la mucosa oral. En general, se puede conseguir la erradicación de los patógenos en condiciones de una irradiación menor (40-100 mW/cm2) que la utilizada en los procesos cancerosos, y con tiempos de incubación del fotosensibilizante más cortos, lo que garantiza una alta selectividad en comparación con los principales tejidos y células huéspedes de la piel, queratinocitos y fibroblastos. Sin embargo, los estudios para investigar el efecto de la TFD antimicrobiana en la cavidad bucal son escasos 42 e inexistentes en las mucosas. 7 Los microorganismos tienen grandes diferencias en cuanto a estructura celular y organización, lo que obviamente influye en la interacción de los fotosensibilizantes añadidos de forma exógena con los constituyentes celulares, determinando la eficiencia y el mecanismo del proceso de fotoinactivación 26. Por ello son de gran interés, los estudios comparativos de eficacia entre diferentes fotosensibilizantes en distintos agentes infecciosos (bacterias y hongos) que ayuden a establecer su uso preferente en unas infecciones frente a otras 22. Es decir, estudios que nos permitan seleccionar qué fotosensibilizante funciona mejor en cada una de las infecciones sean bacterianas o fúngicas. Por otro lado, la mayoría de los trabajos publicados se han realizado in vitro, mientras que los estudios en animales de experimentación, paso previo para su uso en humanos, son muy escasos 29. Por último, la aplicación tópica del fotosensibilizante en la TFD necesita de una formulación apropiada, según las características del mismo, para alcanzar los microorganismos en la cavidad y la mucosa oral. Por ello se requieren formulaciones apropiadas, vehículos especialmente adhesivos a la mucosa oral y al esmalte dental esenciales en la penetración y/o acumulación de estos fotosensibilizantes 43. La Hipericina La hipericina (HYP) es un metabolito secundario estructuralmente pertenecen a la clase química de naphthodianthronas y tiene los componentes característicos del género Hypericum (Clusiaceae). Las plantas de este género desarrollado (que comprende aproximadamente 450 especies) están ampliamente distribuidas en todo el mundo y se han utilizado desde la antigüedad para una serie de propiedades medicinales 44, por vía externa como astringente, antiséptico y cicatrizante y por vía oral como tratamiento de las alteraciones del sueño y la depresión (300-900 mg de extrato al día). Más recientemente, se ha conocido su efecto antimicrobiano frente a bacterias, hongos y virus 45-46-47. La hipericina se aisló por primera vez de Hypericum perforatum L., que es el representante más importante y reconocido en el comercio de este género. H. perforatum, conocido comúnmente como hierba de San Juan 48, es una hierba aromática, perenne que crece hasta 1 m de altura. Sus hojas se caracterizan por la presencia de glándulas de aceite. Las flores son de color amarillo brillante, naranja, mientras que el cáliz y la corola están marcados con numerosos puntos negros glandulares 44. Es bien sabido que dicha planta, además de tener efectos beneficiosos 8 como antidepresivo y en la cicatrización de heridas, es también responsable de inducir problemas de fotosensibilidad; este hecho corroboraba la idea de que existen sustancias fotoactivas en este tipo de plantas 49. Más tarde se comprobó que la hipericina, por si sola, podría utilizarse en TFD como fotosensibilizante, donde se podría aplicar su capacidad de combinación con luz visible y oxígeno molecular para provocar la muerte de células seleccionadas 50-51. Dadas sus propiedades fotoactivas y su baja genotoxicidad se han estudiado sus aplicaciones en el fotodiagnóstico por fluorescencia y en TFD, especialmente en tumores cutáneos 52-53-54. Existen escasos estudios acerca de su poder antibacteriano con resultados contradictorios 55. Figura 2. Hypericum perforatum o Hierba de San Juan y la molécula de hipericina, su principal principio activo. Azul de metileno El azul de metileno (MB), un colorante aprobado por la FDA, es una fenotiacina cuyas moléculas anfipáticas son tricíclicos planos que poseen un átomo de nitrógeno cuaternario intrínseca y tienen una eficiencia fototóxico contra una amplia gama de microorganismos 57. Se utiliza generalmente para tratar la metahemoglobinemia y ha sido utilizado con éxito para teñir y visualizar la metaplasia intestinal en el esófago de Barrett y en el estómago para guiar la biopsia endoscópica. Es barato y está disponible rutinariamente en las farmacias. MB es también bien conocido por ser fotodinámicamente activo. Varios estudios han demostrado que la TFD mediada por MB (MB-PDT) efectivamente puede inactivar los virus y destruir las bacterias. Además, 9 El objetivo de este experimento fue comprobar que la hipericina penetra en el interior de las células de levaduras mediante estudios de coalescencia con fluoróforos intracelulares con longitudes de onda de emisión diferentes a la de la propia hipericina. Además se intentó determinar en qué lugar de la célula se localiza dicho FS mediante el uso de marcadores mitocondriales y nucleares. Este estudio no se pudo realizar en bacterias con los medios de los que disponemos dado su pequeño tamaño debido al que tamaño oscila entre 0.7 y 0.9 µm de diámetro comparado con las medidas de candida que se encuentran entre los 2-4 µm o las de fibroblastos o queratinocitos que pueden oscilar de 7-10 µm. La resolución del microscopio no era la adecuada. 3.2.4.1. Localización de hipericina en levaduras Se realizó un estudio de co-localización de hipericina con MTG (MitoTracker Green) y Dapi en Candida albicans ATCC 10231. 1- Marcaje con Hipericina. • Se mezcla el inóculo preparado en PBS con un stock de hipericina a una concentración de 5000µM, para conseguir una concentración final de HYP de 5 µM • Se incuba 24h a 35ºC y a oscuridad. • Se toma 3 eppendorfs y en cada uno de ellos, poner 1 ml de la suspensión incubada. • Centrifugar 5´a 10.000 rpm; retirar sobrenadante y resuspender en 1ml en SBL en dos y el otro restante en PBS. (Todo en oscuridad). Habrá 3 tubos para: 1- Levadura en SBL +5 µM de MTG. 2- Levadura en SBL + 1000 nM de MTG. 3- Levadura en PBS + 1000 nM de MTG 16 2- Marcaje con MTG y lavados: Se procede hacer una dilución de MTG 100 µM partiendo de la de 1000 µM. A esa dilución la llamaremos Dmt y a la de 1000 µM DMT. Centrifuga 5´a 10.000 rpm; retirar sobrenadante y resuspender cada pellet, bien en PBS, bien en SBL (Cada uno con lo que corresponda). • Tubo 1: añadir 5 µl de DMT + 995 µl de SBL. • Tubo 2: añadir 1 µl de Dmt + 999 µl de SBL. • Tubo 3: añadir 5 µl de Dmt + 999 µl de PBS. 3- Incubación Se incuban a 35ºC durante 40 minutos y oscuridad. 4- Lavados • Centrifugación 5´a 10.000rpm; retirar sobrenadante y resuspender en 1000 µl de SBL o PBS. • Centrifugación 5´a 10.000rpm; retirar sobrenadante y resuspender en 1000 µl de suero fisiológico. • Centrifugación 5´a 10.000rpm; retirar sobrenadante y resuspender en 1000 µl de SBL o PBS. • Centrifugación 5´a 10.000rpm; retirar sobrenadante. 5- Toma de muestra y montaje • Incubación con PFA 3% (paraformaldehido) 300 µl por tubo, 15 minutos a 35ºC y oscuridad. • Centrifugación 5´a 10.000rpm; retirar el PFA. • Lavar con 500 µl de agua destilada (x2), centrifuganco y retirando el sobrenadante. • Los últimos 500 µl de agua se vortean y se llevan a las microtitter-plates. • Centrifugar las placas 30 minutos a 3000rpm las placas. 17 • Retirar los cubres y ponerlos sobre un porta que contendrá 5 µl de moviol con 5 µM de DAPI. • Sellar con pintauñas. 6- Tratamiento de los cubres previo al pegado de células • Se depositan los cubres en una placa microtitter y se rocian con 100 µl de polilisina. • Dejar que la polilisina se adhiera a los cubres. • Se retira la polilisina y se lava con agua (x2). • Se retira el agua y se dejan secar los cubres al aire. 3.2.5. Estudio de la toxicidad de la TF con hipericina sobre queratinocitos y fibroblastos: La viabilidad de las células HaCaT y hNDF tras el tratamiento con hipericina se estudiará mediante el ensayo MTT para establecer los efectos adversos de dicho tratamiento sobre las células sanas de la mucosa oral. Células (típicamente a una concentración 106) se cultivarán en microplacas de 48 pocillos a 37ºC y 5% CO2 usando DMEM (FBS 10% v/v, L-glutamina 2mM, Penicilina estreptomicina 1% v/v) como medio de cultivo. Después de lavar con PBS, se incubarán con concentraciones crecientes de hipericina: 0.5, 1, 5 and 10 µM) y se irradiarán con una lámpara de LEDs de 590 nm durante, 30 y 60 minutos, correspondiente a dosis de luz de 18 and 37 J·cm-2, respectivamente 28. Las células entonces se lavarán con PBS se eliminará cualquier exceso de hipericina y se realizará el ensayo MTT a las 24 h. La toxicidad en oscuridad y la toxicidad de la luz serán los controles del experimento en las mismas condiciones 3.2.6. Localización de fotosensibilizante en fibroblastos y queratinocitos 3.2.6.1. Traspaso celular y preparación de placas. 18 Se trabaja en campana estéril (etanol 70°, UV) y con flujo constante. La placa de 60 mm debe tener una confluencia de 70-80% de las células. Una vez tengamos esas condiciones se extrae el medio con una pipeta. Agregar 1ml de buffer PBS 1x, suavemente, evitando que se despeguen las células. Dejar 30 segundos, y retirar el buffer. Agregar 300 µl de tripsina 2.5% (diluida con 900 ul de PBS 1x) y dejar reposar 3-5 minutos dentro de la incubadora. Despegar las células de la placa dándole unos golpecitos y traspasar a placa de 6 pocillos para poder continuar con el experimento. 3.2.6.2. Localización en microscopio Los experimentos se realizaron en la Universidad Autónoma de Madrid en la Facultad de Ciencias, utilizando técnicas de microscopía de fluorescencia bajo la supervisión de la Dra. Ángeles Juarranz. Se realizó un cultivo de células de la piel a partir de una biopsia cutánea de piel normal obtenida de un voluntario sano Las células se cultivaron en microplacas de 6 pocillos a 37ºC y 5% CO2 usando DMEM (FBS 10% v/v, L-glutamina 2mM, Penicilina estreptomicina 1% v/v) como medio de cultivo. Una vez la placa tuviese una confluencia al 70% se incubaron con concentraciones crecientes de hipericina 2 y 5 µM durante dos periodos de tiempo: 5 y 24 horas. Se utilizaron sondas para la inmunohistoquimica como el DIOC y Lisotracker a una concentración de 5 µM. Posteriormente se procedió a la observación microscópica y toma de imágenes. La microscopía de fluorescencia se realizó utilizando un microscopio Olympus BX61 acoplado a una cámara de captura digital Olympus DP50. 19 4. Resultados 4.1. Fotoinactivación de microorganismos con hipericina La hipericina consiguió una eficaz fotoinactivación de todos los gérmenes estudiados, aunque las concentraciones y fluencias para conseguirlo fueron diferentes y se exponen a continuación. 4.1.1. S. sanguis - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentración de 2,5 µM de hipericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. - Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 1,25µM para reducir 6 und. Log. S. sanguis 18 J/cm2 0 0,3 0,6 1,25 2,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) S. sanguis 37J/cm2 0 0,3 0,6 1,25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 4.1.2. S. mutans: - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentración de 20 µM de hipericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. 20 - Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 20 µM para reducir 6 und. Log. 4.1.3. C. albicans ATCC: ión de 40 µM de hipericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. ia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 5 µM para reducir 6 und. Log. S. mutans 18J/cm2S. mutans 37J/cm2 0 0,3 0,6 1,25 2,5 5,00 10 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentrac - Para una fluenc 8 7 0 0,3 0,6 1,25 2,5 5,00 10 20 0 1 2 3 4 5 6 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) C.albicans 18J/cm2 0 1,25 2,5 5,00 10 20 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 C.albicans 37J/cm2 0 1,25 2,5 5,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 21 4.1.4. C.albicans resistentes: 4.1.4.1. C. albicans AZN-4635: ión de 40 µM de hipericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 10 µM para reducir 6 und. Log. 4.1.4.2. C. albicans AMOZ-0267: - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentrac -Para una fluencia de C.albicans AZN 46 37 J/ cm2 0 5 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM C.albicans AZN 46 18 J/ cm2 Log 10 (CFU/mL) ión de 20 µM de hip 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 10 µM para reducir 6 und. Log. - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentrac ericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. -Para una fluencia de 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 20 40 22 C.albicans AMOZ 18 J/ cm2 0 5 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) C.albicans AMOZ 18 J/ cm2 0 5 10 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 4.1.4.3. C. albicans 456325H: - Para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una concentración de 20 µM de hipericina para reducir 6 unds. Log. con respecto al inóculo inicial. -Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 10 µM para reducir 6 und. Log. C.albicans 45 18 J/ cm2 0 5 10 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) C.albicans 45 37 J/ cm2 0 5 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 23 4.2. Comparación de la fotoinactivación de HYP frente a AM En este apartado se compara la eficacia fotoinactivadora de la HYP con respecto a AM, uno de los fotosensibilizantes más utilizados, junto al azul de toluidina, en TFD antimicrobina de cavidad oral en la literatura. 4.2.1. S. sanguis y S. mutans Tal y como se observa en las gráficas, el AM consigue fotoinactivar a S. sanguis y S. mutans con concentraciones inferiores a las de HYP. Esta diferencias son más notorias en el caso de S. mutans que en S. sanguis. Así, mientras que la concentración de HYP que produce la disminución de 6 unds. Log. es 2,5µM, a 18 J/cm2 1,25 a 37 J/cm2 en S. sanguis y para S.mutans tanto a 18 J/cm2 como a 37 J/cm2 es 20µM. , en el caso del AM estas concentraciones son tan sólo de 1,25µM a 18 J/cm2 para S. sanguis y 2,5 µM S. mutans, y de 1,25 y 0,6 µM a 37 J/cm2 para S. sanguis y S. mutans respectivamente. S. sanguis 37J/cm2 0 0.3 0.6 1.25 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) S. sanguis 18 J/cm2 0 0.3 0.6 1.25 2.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) S. mutans 37J/cm2 0 0.3 0.6 1.25 2.5 5,00 10 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) S. mutans 18J/cm2 0 0.3 0.6 1.25 2,5 5,00 10 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 24 4.2.2. C. albicans ATCC En C. albicans ATCC tanto a 18 J/cm2 como a 37 J/cm2, la concentración de HYP es menor para disminuir las 6 unds. Log. que la concentración de AM. Así, la concentración de HYP que produce la disminución de las 6 unds. Log. es 40µM a 18 J/cm2 y 5 µM a 37 J/cm2, mientras que la concentración de AM es 640 µM a 18 J/cm2 y 160 µM a 37 J/cm2 . C.albicans 18 J/ cm2 0 1.252.5 5,0010204080 160 320 640 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) C.albicans 37 J/ cm2 0 1.25 2.5 5,00 10 20 40 80 160 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 4.2.3. C. albicans resistentes En C. albicans resistentes, al igual que ocurre en la especie sensible, las concentraciones de HYP necesarias para su fotoinactivación son menores que las de AM, tanto a 18 J/cm2 como a 37 J/cm2. • 4.2.3.1. C.albicans 456325 C.albicans 18 J/ cm2 0 5 10 20 40 80 160 320 640 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno 456325 [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) C.albicans 456325 37 J/ cm2 0 5 10 20 40 80 160 0 1 2 3 4 5 6 7 8Hipericina Azul de metileno [ ] FS μM Log 10 (CFU/mL) 25 la l ra foto se parecia esa colocalización de ambos. humanas, fibroblastos, por la no co-localización con DAPI: imágenes se puede observar la distribución de HYP en l núcleo de las célu ocalización de HYP muestra una situación muy parecida a la del Lisotracker, alrededor del núcleo pero en una parte. Por último, en la terce 4.5.3. Desmostración de la no entrada de HYP en el interior del núcleo de las células Con respecto a estas fibroblastos, que es por el citoplasma y claramente la no penetración en e las. 4.6. Efecto de la terapia fotodinámica de células humanas Como se observa en las siguientes figuras, la hipericina ejerce un efecto fototóxico tanto en queratinocitos (A) como en fibroblastos (C). Dicho efecto es dependiente tanto de la concentración del fotosensibilizante como de la dosis de luz administrada. 2 tiene efecto citotóxico sobre queratinocitos (B) ni fibroblastos (D). Concentraciones superiores a 5 uM junto a fluencias iguales o superiores a 18 J/cm inducen una mortalidad del 100% de células. Sin embargo, la hipericina sin luz no 32 rafícas: A) viabilidad celular en HaCat y C) en hNDF a diferentes fluencias, 8, 18 y 30 J/cm2. C) viabilidad celu en HaCat y (D) hNDF a diferentes tiempos de incubación 15, 30, 60 min en oscuridad. Estos estudios fueron realizados por el grupo de investigación del Prof. S. Nonell en los laboratorios del IQS Universidad Ramon Llull, Barcelona, Spain en colaboración con nuestro grupo G lar 33 5. Discusión La TFD antimicrobiana con HYP como FS ejerce un efecto biocida sobre to cepas estudiadas. La concentración necesaria de FS provoca de un efecto fototóxico produciendo la reducción del crecimiento microbiano hasta en 6 unidades logarítmicas, depende de das las la especie microbiológica sobre la que se aplica la terapia, y, por tanto, de la complejidad del os ismos empleadas en este proyecto pero también fluencias mayores. ns. os estudios como los de Rolim et al (17) se prueba la actividad fototóxica de var ue o microorganismo. Estos resultados constatan con ensayos preliminares desde los añ 60, el AM probaba su efectividad sobre diferentes virus (58). Los estudios posteriores han revelado el potencial del AM sobre microorgan de mayor complejidad como bacterias que además posean mecanismos como bombas de expulsión de resistencia a antibióticos comunes (59). Por otro lado, teniendo en cuenta a la HYP como agente antibacteriano, se demuestra también su efectividad sobre especies de S. aureus en estudios como los de Engelhardt et al (60) donde se prueba la actividad fototóxica de la HYP concentraciones menores de FS que las La fluencia empleada en la terapia influye en su eficacia, de tal forma que se con mayores fluencias se necesitan menores concentraciones de FS. No obstante, este hecho no se cumple en todas las ocasiones, y se observa que hay cepas que requieren concentraciones similares empleando diferentes fluencias, como es el caso de S. muta En otr ios fotosensibilizantes como el azul de toluidina (TBO) y verde de malaquita (MG) eosina (EOS), eritrosina (ERI) y rosa de bengala (RB) viendo que el TBO y MG f eficaz en la reducción de los recuentos de S. mutans por 3 logs a una concentración de 163,5µM a 24 J/cm2. Respecto a la comparación entre cepas de Candida albicans sensibles y resistentes a antifúngicos azólicos, no existen diferencias en cuanto a su sensibilidad a la terapia fotodinámica con hipericina. Estos resultados contrastan con los obtenidos por Dovig et al en 2011 sobre biofilms de cepas de Candida azol resistentes donde se evidencia una sensibilidad mayor de las cepas reistentes a fluconazol frente a las no resistentes (61). 34 Al comparar la HYP con el AM, que es el fotosensibilizante que habitualmente está utilizand se o en la TFD clínica, especialmente en odontología (62) destaca que mientras que este último es más eficaz en los Streptoccocus spp., la HYP es más eficaz en C atacar tes, fluencias Así, en las e demostrar, visualizando las imágenes que no penetra en el núc 56). S en la célula. Si bien este hecho no puede extrapolarse a bacterias, dada la gran diferencia de complejidad estructural entre ambos tipos de células, sigue resultando una de las razones de peso por las que el mecanismo de sinergia es positivo. Otro factor que puede influir es la diferente . albicans, tanto en las especies resistentes a antifúngicos como en las sensibles. Con este hecho se demuestra que aunque la TFD en general es eficaz frente a todo tipo de gérmenes, existen FS que ejercen un efecto fototóxico de mayor importancia sobre unas especies que sobre otras, lo que demuestra sensibilidades diferentes a la TFDA según el FS empleado. Si bien podría deducirse de esto que la TFDA no podría equitativamente a un amplio espectro de microorganismos filogenéticamente diferen es posible asegurar una máxima cobertura en el tratamiento de todas las cepas estudiadas empleando ambos FSs siempre que usemos concentraciones y suficientes. Un aspecto novedoso de la presente investigación, es testar la combinación de dos fotosensibilizantes, que a la vista de nuestros resultados actúan de forma sinérgica. en todas las cepas se produce una potenciación de la eficacia de ambos FSs, ya que hay una clara disminución de la concentración fungicida o bactericida al combinarlos. El hecho de que se potencie el efecto fototóxico en la combinación de ambos FSs demuestra que su mecanismo de acción es aditivo. Esta consecuencia se debería al hecho de que cada FS posee, vías de penetración, localización y acción fototóxica diferentes al otro, lo que los convierte en bioquímica y fototoxicamente complementarios (63,56, 64). Uno de los factores que pueden determinar el diferente y complementario mecanismo de acción de nuestros fotosensibilizantes tanto en las bacterias como levaduras estudiadas es la localización de los mismos. En cuanto a la localización celular en Candida albicans, con los experimentos realizados se puede observar como la hipericina penetra en las levaduras aunque no podamos precisar en qué organelas se localiza; solo se pued leo. Sin embargo, el azul de metileno se acumula en el citoplasma y el núcleo ( Considerando la baja movilidad e intensa reactividad de los ROS generados dentro de la célula esto podría explicar una acción diferente de los F 35 pro e en el drógeno, según nuestro grupo ha demostrado reci lular en leva a a hipericina no penetra en el núcleo por lo que se evitan las mutaciones en el DN e solo se encontró en las mitocondrias, sino r y penetra en el núcleo ya que no es capaz de atravesar la membrana nuclear; La hipericina no penetra en el núcleo por lo que se evitan las mutaciones en el DNA y por lo tanto la probabilidad de desarrollo de cáncer en relación con la TFD. e abre una nueva línea de estudio debido a la toxicidad de los FSs que producen en células humanas sanas. Es utilizar nanoparticulas donde se unan estos compuestos y ectiva ya que precisamente uno de los objetivos que se ctivo que “ataque” únicamente al microorganismo causante de la infección y mantenga intactas las células sanas (65). ducción de especies reactivas del oxígeno durante el proceso fotodinámico, ya que en el caso del azul de metileno la principal es el oxígeno singlete (17).mientras qu caso de la hipericina es el peróxido de hi entemente (48). A partir de estos experimentos y técnicas utilizadas de localización ce duras solo se puede decir que la hipericina sufre una diseminación intracelular salvo en el núcleo lo que hace que exista una doble ventaja: -La TFD antimicrobiana con hipericina podría tener múltiples dianas celulares, y que se localiza de una forma difusa en el interior de la célula, lo que minimiza la posibilidad de aparición de resistencias. -L A, lo que también contribuye a impedir el desarrollo de resistencias. Una de las limitaciones de nuestro estudio con microscopía de fluorescencia es qu los fluoróforos utilizados son válidos para células eucariotas animales. Las levaduras son células eucariotas pero poseen una complejidad menor con respecto a las células animales. Todos estos marcadores funcionaron satisfactoriamente excepto el mitotracker, que en la mayoría de los casos no que se diseminó por todo el citoplasma celular. En la localización en células humanas con los experimentos realizados se puede observar como la hipericina penetra en las células y co-localiza con el Lisotracke también, pero en menos medida con el DIOC. Se demuestra que no S hacer que la TFD sea más sel buscan es un tratamiento sele 36 6. Conclusiones 1. s responsables de la 3. as y especies de Candida resistentes a azoles son susceptibles in vitro 4. fotoinactivación tanto de bacterias como de levaduras. 5. La localización de HYP en levaduras se encuentra en el citoplasma, pero no llega a pasar la membrana nuclear. 6. La localización de HYP en células humanas se distribuye en el citoplasma, y sobre todo alrededor del núcleo colocalizando con el Lisotracker y con el DIOC. 7. La HYP ejerce un efecto fototóxico en células humanas pero es dependiente de la concentración del fotosensibilizante y la dosis de luz administrada. La HYP es eficaz en la fotoinactivación de los gérmene mayoría de las infecciones de la cavidad oral, S. mutans, S sanguis y C. albicans. 2. La HYP es menos eficaz que el azul de metileno en la fotoinactivación del Streptococcus y más eficaz en Candidas. Las cep a la TFD con HYP sin diferencias respecto a las cepa sensible a azoles La combinación de HYP y AM tiene un efecto sinérgico en la 37 BIBLIOGRAFÍA 1. Marcotte H, Lavoie MC. Oral microbial ecology and the role of salivary immunoglobulin A. Microbiol Mol Biol Rev 1998;62:71-109. 2. Liñares J. Martin-Herrero JE. 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