Repositorio Institucional de Documentos

Jessika Valero González Proyecto dirigido por Dr. Ramón Hurtado-Guerrero Master en Biología Molecular - Universidad de Zaragoza Búsqueda de inhibidores frente a la proteína O-fucosiltransferasa 1 (PoFUT1) Índice.( ! Índice.(........................................................................................................................................(1! Introducción.(...........................................................................................................................(3! Vía(de(señalización(Notch(y(su(regulación.(............................................................................(3! O=fucosil(transferasa(1((PoFUT1).(............................................................................................(4! Estructura(de(CePOFUT1.(.............................................................................................................(5! Búsqueda(de(compuestos(inhibidores(frente(a(PoFUT1.(..................................................(6! Objetivos(..................................................................................................................................(9! Estrategia(experimental.(.................................................................................................(11! Materiales(y(métodos.(.......................................................................................................(13! Expresión(y(purificación(de(CePOFUT1.(..............................................................................(13! Electroforesis(desnaturalizante(en(gel(de(poliacrilamida=SDS((SDS=PAGE).(..........(14! Cribado(Masivo((High(throughput(screening).(..................................................................(14! Dicroísmo(circular.(.....................................................................................................................(16! Saturation=Transfered=Difference((STD).(...........................................................................(17! Calorimetría(de(titulación(isotérmica((ITC).(......................................................................(18! Cristalización(de(compuestos(con(la(proteína(silvestre.(................................................(20! Resultados.(...........................................................................................................................(22! Cribado(masivo(de(compuestos(..............................................................................................(22! Caracterización(biofísica(de(la(unión.(..................................................................................(25! Dicroísmo!circular!.....................................................................................................................................!25! Calorimetría!de!titulación!isotérmica.!..............................................................................................!27! STD!del!compuesto!3!...............................................................................................................................!31! Cristalización!...............................................................................................................................................!32! Discusión(...............................................................................................................................(35! Conclusiones(........................................................................................................................(38! Referencias(...........................................................................................................................(40! Relación(de(abreviaturas(.................................................................................................(43! ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 2! ! ! ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 3! Introducción.( ! Vía(de(señalización(Notch(y(su(regulación.( ! Tan! solo! un! pequeño! número! de! vías! de! señalización! son! utilizadas! iterativamente!con!el!fin!de!regular!la!proliferación!o!la!muerte!celular!en!el!desarrollo! de! organismos.! La! vía! de! señalización! de! Notch! es! una! de! ellas.! Esta! vía! está! ampliamente!conservada!en!el!reino!animal.! En!esta!vía!de!señalización!se!pueden!diferenciar!dos!elementos!principalmente:! el!receptor!y!los!ligandos.!El!receptor!Notch!es!una!proteína!transmembrana!tipo!I!en! el! que! se! diferencian! tres! dominios! (Figura( 1).! Los! ligandos! que! interaccionan! con! Notch,! las! proteínas! Delta! y! Serrate! (Jagged! en! mamíferos),! también! son! proteínas! transmembrana! tipo! I! con! una! estructura! muy! similar! a! Notch.! Por! ese! motivo,! la! interacción!entre!receptor!y!ligando!queda!restringida!a!células!vecinas!(Bray, 2006).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! En! la! Figura(2(se! observa! un! esquema! de! la! vía! de! señalización.! Puede! distinguirse!que!la!transducción!de!la!señal!no!tiene!mensajeros!secundarios!y!que!la! unión!de!los!ligandos!al!receptor!implica!dos!rupturas!proteolíticas!en!el!mismo!que! libera!el!dominio!intracelular.!Una!vez!liberado,!éste!se!dirige!al!núcleo!donde!coopera! con!la!proteína!de!unión!a!DNA!CSL!y!su!coUactivador!Mastermind!para!promover!la! transcripción.! Figura( 1.(Estructura)esquemática)proteíca)de)Notch.)Se)diferencian)la)región) extracelular)compuesta)por)entre)29)y)36)motivos)EGF,)la)región)regulatoria) negativa)(NRR))y)la)zona)intracelular.)Se)distinguen)también)los)dos)puntos)de) ruptura) proteolítica) S1) y) S2) que) provocarán) la) liberación) del) dominio) intracelular.) (Bray, 2006)) Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 4! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Esta! vía! esta! regulada! por! diferentes! mecanismos,! como! son!procesos! de! endocitosis! y! tráfico! intracelular,! así! como! por! modificaciones! postUtraduccionales! como!la!ubiquitinación,!la!fosforilación!o!la!glicosilación!!(Bray, 2006).!! En!los!últimos!años!se!han!descrito!numerosas!glicosiltransferasas!que!modifican! los!dominios!EGF!de!Notch.!Sin!embargo,!de!los!estudios!genéticos!de!eliminación!de! los!genes!que!codifican!estas!glicosiltransferasas!se!deduce!que!tanto!PoFUT1!como! Fringe!son!enzimas!esenciales!para!la!vía!de!señalización,!y!demuestran!que!Notch!tan! solo! es! funcional! cuando! queda! glicosilado! por! al! menos! estas! dos! enzimas! (Jafar- Nejad, 2010),)(Okajima, 2003).! ! O>fucosil(transferasa(1((PoFUT1).( ! La! OUfucosil! transferasa! 1! (PoFUT1)! es! una! fucosiltransferasa! de! inversión! que! pertenece! a! la! familia! GT65! compuesta! por! unos! 300! aminoácidos.! Este! enzima! transfiere!un!residuo!de!fucosa!usando!GDPUfucosa!como!sustrato!donante!a!motivos! ricos!en!cisteínas!similares!al!factor!de!crecimiento!presentes!en!un!gran!número!de! Figura(2.(Vía)de)señalización)Notch.)La)unión)del)ligando)Delta)al)receptor) Notch)de)una)célula)vecina)provoca)la) ruptura)y)liberación)del)dominio) intracelular)(Nicd).)Éste)se)dirige)al)núcleo,)donde)su)interacción) con)el) complejo)CSL)provoca)el)inicio)de)la)transcripción.) (Bray, 2006)) Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 5! proteínas.! PoFUT1! se! encuentra! solamente! en! organismos! eucarióticos! superiores! y! está!localizada!en!el!retículo!endoplasmático!debido!a!la!secuencia!“RDEF”!localizada! en!el!carboxilo!terminal,!al!contrario!que!la!mayoría!de!las!glicosiltransferasas!que!se! encuentran!en!el!aparato!de!Golgi (Lira-Navarrete, 2011), (Shi, 2003), (Wang, 1998),.) El!sustrato!aceptor!mejor!estudiado!del!enzima!PoFUT1!es!la!proteína!Notch.!El! enzima!fucosila!serinas!y!treoninas!de!EGFs!que!contienen!el!motivo!C2UX(4U5)U[S/T]UC3,! donde!C2!y!C3!son!la!segunda!y!tercera!cisteínas!conservadas.!Dentro!de!los!dominios! EGF,!los!EGF!11,!12!y!13!resultan!ser!los!más!interesantes!biológicamente!ya!que!es!el! lugar! donde! los! ligandos! de! Notch! se! unen! (Figura( 1)! (Artavanis-Tsakonas, 1999),) (Bray, 2006),!(Takeuchi, 2010) (Wang Y, 2001).!! Además,! se! ha! descrito! que! PoFUT1! tiene! también! función! chaperona! que! promueve! la! unión! y! el! transporte! de! Notch! desde! el! retículo! plasmático! a! la! membrana!celular,!sin!ser!esta!función!un!efecto!secundario!de!la!glicosilación.! ! Estructura(de(CePOFUT1.( ! Estudios!recientes!han!propuesto!la!estructura!de!la!OUfucosil!transferasa!1!de! Caenorhabditis)elegans!(CePOFUT1)!en!su!forma!nativa!y!formando!complejo!con!GDP! y!GDPUfucosa!(Lira6Navarrete,)2011)!.!Esta!especie!fue!escogida!por!su!elevado!grado! de!similitud!con!la!proteína!humana!HsPOFUT1!y!porque!además!al!contrario!que!otras! proteínas! homologas! de! otros! organismos,! CePOFUT1! carece! de! sitios! de! NU glicosilación!lo!que!implica!que!su!cristalización!resulte!más!favorable.! CePOFUT1! es! una! proteína! predominantemente! monomérica! (Figura( 3),! tal! y! como! demuestran! los! experimentos! de! cromatografía! de! filtración! en! gel! y! de! ultracentrifugación!analítica.!En!la!estructura!se!observan!dos!dominios,!!conservados! en! proteínas! análogas! superiores.! Tanto! el! dominio! NUterminal! como! CUterminal! adoptan!una!estructura!tipo!Rossman,!que!está!formada!por!una!lámina!beta!central! rodeada!por!hélices!alfa!en!ambos!lados.!Esta!estructura!constituye!un!típico!ejemplo! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 6! de!plegamiento!tipo!GTUB.!La!proteína!presenta!cuatro!puentes!disulfuro!conservados,! dos!en!cada!dominio!(Figura(3).) Basándose!en!las!estructuras!observadas!y!en!estudios!de!mutagénesis!dirigida! sobre!varios!aminoácidos!del!centro!activo,!se!propone!al!residuo!Arg240!como!clave! en!la!unión!y!catálisis!del!sustrato!(Lira6Navarrete,)2011).! ! ! ! ! ! ! ! ! ( ( ( ( Búsqueda(de(compuestos(inhibidores(frente(a(PoFUT1.( ! La! vía! de! señalización! Notch! es! esencial! para! el! desarrollo! en! animales! y! sus! defectos! están! involucrados! en! una! serie! de! enfermedades! humanas!(Jundt, 2008),) (Pancewicz, 2010).!Algunas!de!estas!enfermedades!tales!como!el!Síndrome!de!Alagille! o! la! Disostosis! Espondilocostal! se! presentan! en! la! etapa! de! ! desarrollo.! Otras! enfermedades!como!CADASIL,!esclerosis!múltiple!y!algunos!tipos!de!cáncer!como!la! Figura(3.(Estructura)de)CePOFUT1.)A))Estructura)cristalina)de)la)proteína)en)complejo) con)GDP6Fucosa.)B))Representación)de)la)superficie)de)CePOFUT1,)coloreada)según)el) grado)de)conservación)con)la)secuencia)(de)rosa)(100%)de)identdidad))a)gris)(menos) del)50%)))(Lira6Navarrete,)2011).) A( Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 7! leucemia!linfoblástica!aguda!(TUALL)!se!presentan!en!la!edad!adulta.!!Algunos!autores! señalan!que!se!han!detectado!mutaciones!en!el!receptor!Notch1!en!más!del!50%!de! pacientes!con!este!tipo!de!cáncer!(Weng, 2004).! En!este! proyecto!se!propone! la!búsqueda!de!compuestos! inhibidores!frente! a! CePOFUT1!por!dos!motivos:!es!una!enzima!con!una!identidad!del!100%!con!respecto!a! la!humana!a!nivel!del!sitio!activo,!y!además,!hemos!conseguido!expresarla!en!grandes! cantidades! cosa! que! no! sucede! con! la! proteína! humana.! Como! se! ha! comentado! anteriormente,!la!OUfucosilación!que!realiza!el!enzima!PoFUT1!sobre!los!motivos!EGF! de! Notch! es! esencial! para! su! funcionalidad,! siendo! de! especial! relevancia! en! su! plegamiento!y!en!las!interacciones!de!Notch!con!sus!ligandos.!Por!tanto,!un!compuesto! inhibidor! de! la! actividad! fucosiltransferasa! de! PoFUT1! permitiría! el! control! del! mecanismo! de! OUfucosilación! sobre! el! sustrato! Notch! y! por! tanto! de! la! vía! de! señalización!Notch.!! Hasta! la! fecha! no! se! han! descrito! compuestos! inhibidores! de! esta! fucosiltransferasa,! por! lo! que! este! trabajo! resulta! ser! novedoso! y! con! una! gran! proyección!al!ser!el!punto!de!partida!en!la!búsqueda!de!fármacos!contra!muy!diversas! enfermedades,!entre!las!que!se!encuentran!diferentes!tipos!de!cáncer.!Además!estos! inhibidores!podrán!ayudar!a!estudiar!el!papel!de!la!OUfucosilación!en!distintas!etapas! del!desarrollo!embrionario!y!en!distintas!condiciones!fisiológicas.!! ! ! ! ! ) ) ! ) ) ) ! ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ( ( Objetivos)( Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 15! principios! activos! farmacológicos! y! que! responden! a! la! regla! de! cinco! de! Lipinski! (Lipinski, 1997).!! Esta! regla! permite! evaluar! cualitativamente! la! adecuación! de! un! compuesto! químico! para! su! uso! farmacológico! o! actividad! biológica! .! Describe! las! propiedades! moleculares!que!pueden!tener!importancia!farmacocinética!en!el!cuerpo!humano,!a! saber! absorción,! distribución,! metabolismo! y! excreción.! La! regla! dice! que! ningún! compuesto! activo! para! consumo! oral! puede! violar! más! de! una! de! las! siguientes! consideraciones:! 1) No! debe! contener! más! de! cinco! donantes! de!enlaces! por! puentes! de! hidrógeno.! 2) No! debe! contener! más! de! diez! aceptores! de! enlaces! por! puentes! de! hidrógeno.! 3) Debe!poseer!un!peso!molecular!inferior!a!500!u.m.a.! 4) Debe!poseer!un!coeficiente!de!reparto!octanolUagua!(log!P)!inferior!a!53.! Para! el! cribado! masivo! se! utilizó! la! quimioteca! Maybridge! HitUFinder! (Maybridge),!la!cual!se!presenta!en!125!placas!de!96!pocillos,!con!80!compuestos!por! placa!lo!que!hace!un!total!de!10.000!compuestos.!Todos!los!compuestos!se!encuentran! disueltos!en!100%!de!DMSO!a!una!concentración!inical!de!4!mM.!Los!experimentos!se! realizaron! en! un! fluorímetro! FluoDia! T70! (Photal! Otuska! Electronics)! (Cummings,) 2006).!! La!técnica!utilizada!es!la!fluorescencia!con!rampa!de!temperatura!y!se!basa!en!la! desnaturalización!de!la!proteína,!registrando!la!señal!de!fluorescencia!que!se!obtiene! por!la!interacción!de!un!fluoróforo!con!la!proteína!al!desnaturalizarse.!El!fluoróforo!es! un! compuesto! altamente! hidrófobo,! por! lo! que! tiene! cierta! afinidad! por! zonas! hidrófobas! que! van! quedando! expuestas! conforme! la! proteína! se! desnaturaliza! al! aumentar! la! temperatura! en! el! experimento.! En! este! experimento! se! observa! la! temperatura! característica! de! cada! proteína! donde! la! mitad! de! la! población! de! la! misma!se!encuentra!en!estado!nativo!y!la!otra!mitad!desnaturalizado!(Tm).!! Una!vez!determinada!esta!temperatura,!se!estudia!la!mezcla!compuesta!por!la! proteína,! el! fluoróforo! y! uno! o! varios! compuestos! inhibidores.! Si! uno! de! los! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 16! compuestos!resulta!tener!afinidad!por!la!proteína!observaremos!una!estabilización!en! la!Tm,!es!decir,!un!desplazamiento!hacia!la!derecha!en!el!eje!de!ordenadas.!! Todos!los!experimentos!se!llevaron!a!cabo!en!una!solución!de!20!mM!de!HEPES,! 200!mM!de!NaCl!a!pH!7!y!se!utilizó!el!fluoróforo!ANS!en!una!concentración!de!100!μM.! Una!solución!de!proteína!20!μM!en!presencia!de!un!6%!de!DMSO!en!un!volumen!final! de! 100! μl! se! utilizó! como! control! en! cada! una! de! las! placas.! Estos! controles! se! colocaban! en! la! fila! número! uno! de! las! placas! de! 96! pocillos.! Posteriormente,! soluciones!de!20!μM!de!proteína!se!pipetearon!en!todos!los!pocillos!!con!excepción!de! la! fila! número! doce! que! quedaba! vacía.! A! continuación,! se! pipetearon! 2! μl! de!! compuesto! en! cada! pocillo,! poniendo! un! total! de! 3! compuestos! por! pocillo.! La! concentración!final!de!cada!compuesto!es!de!80!μM.!Las!rampas!de!temperatura!se! establecieron!entre!los!20!y!los!70!ºC.! De!cada!experimento!de!fluorescencia!derivan!88!curvas!de!fluorescencia,!donde! el!eje!X!representa!la!temperatura!en!grados!centígrados!(ºC)!y!el!eje!Y!representa!la! señal!de!fluorescencia.!Cada!placa!se!analizó!con!el!programa!PRISMA!ajustando!los! datos!a!una!función!de!Boltzman!según:! 𝒚=(𝑨+𝑩𝑩!𝑨 𝟏!𝐞𝐱𝐩 𝑻𝒎!𝒙 𝑪 )(( Ecuación(1.(Ajuste)sigmoidal)de)Boltzman.)Los)parámetros)A)y)B)corresponen)al)valor)mínimo)y)máximo)de)señal;)C) al)valor)de)la)pendiente.) ! Además,!se!utilizó!la!aplicación!de!Excel!“Excel!script!for!DSF”!para!analizar!todos! los! datos! de! una! placa! al! mismo! tiempo! (http://thermofluor.org/resources/DSF- Analysis-Manual-v3.0.pdf).! ! Dicroísmo(circular.( ( Esta! técnica! permite! medir! la! desviación! de! un! plano! de! la! luz! elípticamente! polarizada!al!incidir!sobre!los!diferentes!centros!quirales!de!la!muestra.!Se!obtienen! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 17! gráficas!de!elipticidad!versus!longitud!de!onda!o!bien,!fijando!un!valor!de!longitud!de! onda!y!variando!la!temperatura,!elipticidad!versus!temperatura.! Podemos!entonces!aplicar!una!rampa!de!temperatura!a!la!muestra!y!obtener!!un! valor!de!temperatura!Tm!característico.!En!presencia!de!un!compuesto!inhibidor,!se! producirá! un! desplazamiento! en! la! Tm! análogo! a! la! fluorescencia! con! rampa! de! temperatura.! Todos! los! experimentos! se! realizaron! en! un! Appiled! Phophysics! Chrioscan.! Se! realizaron! experimentos! con! esta! técnica! para! los! ocho! compuestos! seleccionados! con! el! cribado.! La! línea! base! se! realizó! con! un! blanco! de! 20! mM! en! HEPES!!y!200!mM!en!NaCl!a!pH!7,!que!se!utilizó!en!el!resto!de!experimentos!como! solución!madre.!A!continuación,!se!realizaron!los!espectros!en!la!región!de!ultravioleta! lejano,!correspondientes!a!la!proteína!a!una!concentración!20!μM!y!a!la!proteína!a!esa! misma!concentración!con!un!2.5%!en!DMSO.!Los!máximos!de!la!señal!se!obtuvieron!a! 220!nm!y!228!nm!respectivamente.! Una! vez! fijada! la! longitud! de! onda! en! 228! nm,! se! realizaron! las! curvas! de! desnaturalización!para!los!compuestos!seleccionados!a!una!concentración!de!250!μM! y!un!volumen!final!de!100!μl.!Como!control!se!estableció!la!curva!de!desnaturalización! correspondiente!a!la!proteína!silvestre!en!presencia!de!2.5%!de!DMSO.!Las!rampas!de! temperatura!se!establecieron!entre!los!20!y!los!70!ºC.! Los!análisis!de!las!curvas!obtenidas!se!realizaron!con!el!programa!ORIGIN!versión! 7,!ajustando!los!datos!a!una!función!sigmoidal!de!Boltzman!(Ecuación(1).! ! Saturation>Transfered>Difference((STD).( ( Este! método! se! fundamenta! en! la! técnica! de! la! resonancia! magnética! nuclear! (NMR),!más! concretamente! en! el! Efecto!Overhausser!Nuclear! (NOE).! Se! basa! en! un! fenómeno!de!interacción!dipoloUdipolo!que!provoca!lo!que!se!denomina!una!relajación! cruzada! entre! dos! espines! cercanos! en! el! espacio.! Por! tanto,! se! puede! establecer! relaciones!entre!átomos!situados!próximos!en!el!espacio.! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 18! El! método! de! SaturationUTransferedUDifference! (STD)! está! basado! en! el! efecto! transferred!NOE!(trNOE).!En!este!método,!se!satura!el!ligando!que!se!encuentra!unido! a! la! proteína! cuando! se! irradia! selectivamente! a! la! misma (Meyer, 2003),! (Mayer, 1999),!(Lepre, 2004).! Al!saturar! la! proteína,!todo!aquel! ligando! que! esté!unido!a! su!centro!activo! y! posteriormente!se!intercambie,!también!se!satura!debido!al!efecto!trNOE.!Mientras!se! produce! el! intercambio,! la! molécula! saturada! se! desplaza! a! la! disolución,! donde! es! detectada.! Al! sustraer! este! espectro! de! uno! de! referencia! en! el! que! no! se! haya! irradiado! la! proteína,! obtendremos! un! espectro! diferencial! en! el! que! sólo! observaremos!las!señales!correspondientes!a!los!átomos!que!se!unan!al!centro!activo! de!la!proteína.! Para!realizar!este!experimento!era!necesario!un!compuesto!totalmente!soluble! en!las!condiciones!de!trabajo,!y!que!fuera!positivo!en!el!experimento!de!fluorescencia! con!rampa!de!temperatura.!Utilizando!esos!criterios!se!seleccionó!un!compuesto.!En! las! condiciones! en! las! que! se! realizaron! las! diferentes! medidas! la! proteína! se! encontraba! a! una! concentración! de! 50! μM! y! el! compuesto! seleccionado! a! 1! mM,! disueltos! en! tampón! fosfato! a! pH! 8! en! agua! deuterada.! Se! realizaron! diferentes! experimentos!a!0.5,!2!y!4!segundos!de!saturación!de!la!proteína.!El!instrumento!fue!un! BRUKER!de!400MHz!con!una!sonda!directa!BBO.! Estos! experimentos! se! llevaron! a! cabo! bajo! la! supervisión! del! técnico! en! resonancia!magnética!nuclear!de!la!Universidad!de!Zaragoza!Iñaqui!Delso.! ! Calorimetría(de(titulación(isotérmica((ITC).( ( Dentro!de!la!calorimetría!podemos!distinguir!varias!técnicas.!Sin!embargo,!es!la! calorimetría! de! titulación! isotérmica! (ITC)! la! que! más! comúnmente! se! utiliza! en! los! estudios!de!asociación/disociación!de!ligandos!con!macromoléculas.!! El! procedimiento! se! basa! en! una! serie! de! inyecciones! del! ligando! sobre! la! macromolécula,! que! provocarán! absorción! o! desprendimiento! de! calor! debido! a! la! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 19! interacción! entre! ellos.! Como! el! nombre! de! la! técnica! indica,! se! precisa! que! el! procedimiento! sea! isotérmico,! por! lo! que! el! mecanismo! aportará! o! retirará! energía! para!mantener!la!temperatura!constante!en!el!aparato.! Se!mide!la!cantidad!de!energía!en!μcal/s!necesarias!para!mantener!constante!la! diferencia!de!temperatura!entre!la!muestra!y!la!celda!de!referencia.!El!perfil!de!una! curva!obtenida!con!un!experimento!de!ITC!es!el!que!se!observa!en!la!Figura(4.!Se!trata! de!un!perfil!tipo!sigmoidal!en!el!que!se!observa!un!punto!de!inflexión!que!coincide!con! el!ratio!molar!(n).!Este!parámetro!representa!la!estequiometria!del!complejo!formado! entre! la! proteína! y! el! ligando.! Además! se! observan! otros! parámetros! como! la! constante!de!asociación!(KB)!y!la!variación!de!entalpía!(ΔH),!que!se!pueden!obtener! directamente!de!un! solo!experimento.! El!procesamiento! de!los!datos!consiste!en!la! integración!del!área!de!cada!uno!de!los!picos! (Velazquez-Campoy, 2004).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura( 4.( Figura) representativa) de) un) experimento)de)ITC.)) Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! !Jessika!Valero!González! ! !! ! ! ! ! ! 20! Los! experimentos! fueron! llevados! a! cabo! a! 25! ºC! con! una! concentración! de! CePOFUT1!de!20!μM,!y!con!concentraciones!de!los!distintos!inhibidores!entre!500!μM! y!1!mM!en!soluciones!25!mM!TRIS!pH!8.5!o!bien!PBS!a!pH!7.!Todas!las!muestras!fueron! preparadas!al!5%!de!DMSO.!! El!instrumento!utilizado!fue!un!AUTO!ITC!Microcal!Auto.iTC200.!El!análisis!de!los! datos!se!realizó!con!el!programa!de!ajuste!ORIGINUITC!(Microcal)!utilizando!un!modelo! de!ajuste!de!un!sitio!de!unión.! ! Cristalización(de(compuestos(con(la(proteína(silvestre.( ( Con!los!resultados!obtenidos!en!los!experimentos!de!ITC,!se!seleccionaron!varios! compuestos.!Estos!compuestos!se!cocristalizaron!con!CePOFUT1.!La!técnica!escogida! para!la!cristalización!fue!la!de!gota!sentada!a!temperatura!constante!de!18ºC.!Una!vez! terminadas!las!placas!de!cristalización!éstas!se!instalaron!en!un!aparato!de!toma!de! imágenes!automatizado!Rock!imager!de!Formulatrix.!Dicho!aparato!fue!programado! para!la!toma!de!imágenes!de!todos!los!pocillos!de!las!placas!durante!un!periodo!de!21! días.! Para!la!obtención!de!los!cristales!se!realizaron!dos!tipos!de!procedimientos:! • CePOFUT1!a!30!mg/ml!en!una!solución!de!25!mM!TRIS!pH!8.5!se!incubó! con!!2!mM!de!cada!uno!de!los!compuestos!por!separado.!La!solución!de! cristalización!contenía!100!mM!HEPES!a!pH!entre!7!y!8,!PEG!3350!entre! 12%!y!el!24%!y!MgCl2!constante!a!50!mM!(Lira6Navarrete,)2011).! • CePOFUT1!a!30!μM!con!500!μM!de!los!diferentes!compuestos!en!25!mM! de!TRIS!pH!8.5!en!un!volumen!final!de!500!μl!se!incubó!durante!dos!horas! a!4ºC!con!rotación.!Posteriormente!se!concentraron!las!soluciones!hasta! que!la!proteína!alcanzó!la!concentración!de!30!mg/ml.!Esa!fue!la!solución! que!se!colocó!en!la!placa!de!cristalización,!junto!a!la!solución!madre!de! idénticas!características!a!la!del!apartado!anterior.!! ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ( ( ( Resultados( ( Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 22! Resultados.( ! Cribado(masivo(de(compuestos( ( Se! realizó! el! cribado! masivo! de! compuestos! de! la! quimioteca! HitFinder! de! Maybridge!utilizando!!varios!experimentos!de!fluorescencia!con!rampa!de!temperatura! (Ver)Materiales)y)Métodos).!De!cada!uno!de!los!experimentos!derivaron!88!curvas!de! desnaturalización.!Ocho!debidas!a!los!controles!y!80!debidas!a!los!experimentos!con! los! posibles! inhibidores.! Con! los! ocho! controles! se! determinó! la! Tm! media! de! la! proteína!silvestre!en!esas!condiciones,!siendo!aproximadamente!Tm=48.5!ºC!en!todos! los! experimentos! y! la! desviación! estándar! correspondiente! (σ)! (Ver) Materiales) y) Métodos).! Se! obtuvieron! una! serie! de! temperaturas! características! (Tm)! para! cada! curva.!Posteriormente,!se!establecieron!las!variaciones!de!Tm!(ΔTm)!para!cada!pocillo! según:! ∆𝑇𝑚 =𝑇𝑚!"#!−𝑇𝑚!"#$%"&! ! ! ! Se! consideraron! positivos! aquellos! pocillos! en! los! que! la! variación! de! Tm! (Ecuación(2)!era!superior!a!dos!grados!centígrados!a!la!Tm!media!del!control!más!tres! veces!su!desviación!estándar:! ∆𝑇𝑚 ≥2+𝑇𝑚!"#$%"& +3∙𝜎! ! ! ! Con!este!criterio!se!establecieron!ocho!positivos*,!de!los!que!se!obtuvieron!las!! siguientes!curvas!de!desnaturalización:! Ecuación(2.(Cálculo)de)la)variación)de)Tm)para)cada)pozo)de)la) placa)de)96)pocillos.)Se)estableció)como)referencia)la)Tm)media) de)los)controles)de)cada)placa)en)cada)experimento.)) Ecuación( 3.( Cálculo) de) la) variación) de) Tm) con) la) que) se) consideraron)los)compuestos)como)positivos.)Se)estableció)como) referencia)la)Tm)media)de)los)controles)de)cada)placa)en)cada) experimento.)) Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 23! ! ( ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ( ΔTm!Fluorescencia!(ºC)! Compuesto!1! 2.7±0.06! Compuesto!2! 5.7±0.08! Compuesto!3! 2.2±0.06! Compuesto!4! 7.7±0.09! Compuesto!5! 3.6±0.09! Compuesto!6! 2.1±0.07! Compuesto!7! 2.7±0.09! Compuesto!8! 3.2±0.08! 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 !"#$%&'(&)(*+, -#.+./ 0&12&%&3#%+, -45/ , 5$)3%$" , 5$12#&'3$, 6 , 5$12#&'3$, 7 , 5$12#&'3$, 8 , 5$12#&'3$, 9 , 5$12#&'3$, : , 5$12#&'3$, ; , 5$12#&'3$, < , 5$12#&'3$, = Figura( 5.( Curvas) de) desnaturalización) térmica) de) los) compuestos) positivos) según) la) variación)de)la)señal)de)fluorescencia.)Se)observa)el)desplazamiento)de)la)Tm)de)estos) con)respecto)al)control)(negro). ) Tabla( 1.( Valores) de) las) variaciones) de) Tm) ( ∆ 𝑻𝒎 )) para) los) compuestos)positivos)y)su)desviación)estándar)(σ ).)Estos)cálulos)se) realizaron)utilizando)las)Ecuación(2(y)(Ecuación(3. ) ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 24! Los! datos! recogidos! en! la! Tabla( 1! son! los! correspondientes! a! los! obtenidos! a! partir!de!los!ajustes!matemáticos!de!las!curvas!de!la!Figura(5.!Visualmente!se!observa! que! los! distintos! desplazamientos! de! los! compuestos! respecto! a! la! curva! control! corresponden! a! los! datos! obtenidos! de! sus! respectivos! ajustes! matemáticos,! a! excepción! del! compuesto! 2.! La! variación! de! temperatura! (ΔTm)! obtenida! para! este! compuesto!es!de!5,7!ºC,!aunque!no!se!aprecia!que!la!curva!de!desnaturalización!se! desplace!esa!magnitud.!El!perfil!de!la!curva!también!se!observa!diferente,!por!lo!que! puede! deducirse! que! el! ajuste! matemático! es! erróneo! y! pueda! tratarse! de! un! artefacto.!Por!otro!lado,!los!datos!obtenidos!en!el!ajuste!de!los!compuestos!4,!5!y!7! presentan!una!desviación!estándar!ligeramente!elevada!debido!a!una!forma!anómala! de!la!curva!de!desnaturalización.! De!este!experimento!tan!sólo!podemos!deducir!que!los!compuestos!estabilizan! de! algún! modo! la! estructura! proteica.! Normalmente! esta! estabilización! se! produce! mediante!la!unión!del!sustrato!o!compuesto!a!alguna!zona!hidrofóbica!de!la!proteína.! Además,!al!tratarse!de!compuestos!altamente!hidrofóbicos,!queda!favorecido!el!factor! entrópico!de!la!unión!entre!el!ligando!y!la!proteína!ya!que!el!ligando!interaccionará! preferentemente!en!el!bolsillo!hidrofóbico!de!cualquier!proteína,!por!lo!que!este!tipo! de!cribados!puede!aportar!falsos!positivos.! Por!este!motivo,!los!resultados!de!este!apartado!han!de!corroborarse!con!otras! técnicas! biofísicas! y! mediante! ensayos! enzimáticos! que! analicen! la! capacidad! inhibitoria!del!compuesto!sobre!la!actividad!de!la!proteína.! ! *Las)estructuras)de) los)compuestos) no)van) a)ser)mostradas)en)este) trabajo,)ya)que)se) está) estudiando)la)posibilidad)de)establecer)una)patente)una)vez)terminados)los)estudios)pertinentes.! ! ! ( ( ( Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 31! STD)del)compuesto)3) ! Se!escogió!el!compuesto(3!para!realizar!este!tipo!de!experimentos!al!ser!el!único! totalmente! soluble! en! las! condiciones! de! trabajo! y! así,! poder! optimizar! la! técnica.! Hasta! el! momento,! no! se! han! comprobado! los! compuesto( 6,( 7( y( 8! pero! se! está! estudiando! el! uso! de! solución! TRIS! deuterado! para! minimizar! los! problemas! de! solubilidad!de!los!mismos.! Se!realizaron!los!experimentos!según!el!apartado!“Materiales(y(Métodos”!!y!se! obtuvieron!los!espectros!siguientes:! Figura(9.!Espectros!STD!sobre!CePOFUT1!con!compuesto!3.!El)primero)de)los)espectros)(A))corresponde)al)compuesto) en)disolución.)Los)espectros)(B),)(C))y)(D))son)los)espectros)diferenciales)correspondientes)a)los)experimentos)STD) obtenidos)con)tiempos)de)saturación)progresivos)de)0.5,)2)y)4)s)respectivamente.)) Espectro!A! Espectro!B! Espectro!C! Espectro!D! Estudios!previos!demuestran!que!la!técnica!STD!puede!emplearse!para!el!estudio! de! las! interacciones! proteína! ligando,! así! como! para! el! cálculo! de! constantes! de! disociación!(Meyer, 2003).! En!la!Figura(9(se!observan!los!espectros!STD!obtenidos!a!diferentes!tiempos!de! saturación!de!la! proteína.!Se!observa!que,!al!aumentar! el!tiempo!de! saturación,!las! señales!correspondientes!al!compuesto(3!se!hacen!más!intensas!lo!que!indica!unión! entre!el!ligando!y!la!proteína.!De!no!existir!dicha!unión,!las!señales!del!compuesto(3!no! serían!visibles!a!ningún!tiempo!de!saturación.!No!obstante,!se!deduce!que!esta!unión! es! débil! ya! que! son! necesarios! 2! segundos! de! saturación! para! comenzar! a! ver! las! señales!del!ligando!(Meyer, 2003).! Estos!datos!concuerdan!con!la!constante!de!disociación!obtenida!mediante!ITC! para!el!compuesto(3,!donde!se!establece!una!KD=!82.2!μM!(Tabla(3),!valor!que!implica! una!unión!moderada!entre!el!enzima!y!el!compuesto.! ! Cristalización) ! Con! los! resultados! obtenidos! con! los! experimentos! de! ITC! se! escogieron! los! compuestos(3,(6,(7(y(8!para!cristalizarlos!con!la!proteína!silvestre.!La!técnica!escogida! fue!la!de!cocrisalización!en!la!condición!en!las!que!la!proteína!silvestre!cristalizó!en! trabajos!anteriores!(Lira6Navarrete,)2011).!Presuponiendo!que!la!condición!en!la!que! podían! cristalizar! los! compuestos! con! la! proteína! podían! variar! con! respecto! a! la! condición!inicial,! se!probaron!condiciones!cercanas!a!la!misma.!Se!variaron! tanto!la! concentración!de!precipitante!PEG!3350!como!el!pH.! Se!obtuvieron!varios!cristales!con! los! cuatro! compuestos! antes! nombrados! en! diferentes! condiciones,! utilizando! las! dos! técnicas! explicadas! en! el! apartado! “Materiales(y(métodos”.!Sin!embargo,!se!observó!que!en!varias!de!las!condiciones!en! las!que!aparecieron!cristales,!éstos!se!desintegraron!al!paso!de!unos!días.!Este!hecho! puede! deberse! a! la! cantidad! de! DMSO! que! contenía! la! gota! proveniente! de! la! disolución!original!de!los!compuestos.!! ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 33! ! No!obstante,!varios!cristales!perduraron!íntegros!en!el!tiempo.!! ) ! ! ( ! ( ! ! ! ! ! ! ! ! ! En!este!momento!se!está!procurando!obtener!datos!de!difracción!para!obtener! las!estructuras!tridimensionales!correspondientes.! ! Figura(10.!(Cristales)de)CePOFUT1)con)los)complejos)3,)6,)7)y)8.)Las)condiciones)utilizadas)fueron:) A:)Compuesto)3)a)2)mM)en)solución)HEPES)pH)7,5,)PEG)3350)18%,)MgCl2)50)mM.)Técnica)A)descrita)en) “Materiales)y)métodos”.)) B:)Compuesto) 6)a) 2)mM)en) solución) HEPES) pH) 8,) PEG) 3350) 16%,) MgCl2)50) mM.) Técnica) A) descrita) en) “Materiales)y)métodos”.)) C:)Compuesto) 7) a)2) mM)en) solución)HEPES) pH) 8,) PEG) 3350) 22%,) MgCl2) 50) mM.)Técnica) A) descrita) en) “Materiales)y)métodos”.)) D:)Compuesto) 8)a) 2)mM)en) solución)HEPES) pH) 8,)PEG) 3350)16%,) MgCl2)50)mM.) Técnica) B)descrita)en) “Materiales)y)métodos”.)) A! B! C! D! ! ! !! ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ) ( ( ( Discusión( ( Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 35! Discusión( ! La! actividad! del! enzima! OUfucosiltransferasa! 1! (PoFUT1! )! es! esencial! para! el! correcto! funcionamiento! de! la! vía! de! señalización! Notch.! Realiza! una! de! las! modificaciones! postUtraduccionales! que! sufre! la! proteína! Notch,! además! de! estar! involucrada!en!su!correcto!plegamiento!(Bray, 2006).!Recientes!estudios!demuestran! que! defectos! en! esta! vía! están! relacionados! con! la! aparición! de! diferentes! enfermedades,!entre!ellas!varios!tipos!de!cáncer!como!la!leucemia!linfoblástica!aguda! (TUALL)!(Jundt, 2008) (Pancewicz, 2010).)) Por!tanto,!la!elección!de!la!proteína!PoFUT1!como!diana!terapéutica!resulta!muy! acertada!y!novedosa,!al!no!haberse!descrito!hasta!el!momento!ningún!compuesto!que! actúe!como!inhibidor!de!esta!glicosiltransferasa.! En!este!trabajo!se!han!propuesto!cuatro!compuestos!como!posibles!inhibidores! de! la! actividad! OUfucosiltransferasa! del! enzima! PoFUT1!de! C.elegans.! Se! ha! demostrado! la! existencia! de! interacción! entre! dichos! compuestos! y! la! proteína! mediante!diferentes!técnicas!biofísicas!como!la!fluorescencia,!el!dicroísmo!circular!y!la! resonancia!magnética!nuclear.!Además,!se!ha!cuantificado!esta!unión!con!la!técnica! calorimétrica! de! ITC! y! se! han! obtenido! cristales! mediante! la! cocristalización! de! los! cuatro!compuestos!con!la!proteína.! De! estos! cuatro! compuestos! cabe! destacar! el! compuesto( 3.( Se! trata! de! un! compuesto! muy! soluble,! lo! cual! ha! facilitado! los! estudios! realizados! y! supone! una! ventaja! a! largo! plazo! con! respecto! a! otros! compuestos.! Además,! resulta! tener! la! constante!de!disociación!más!baja,!por!lo!que!su!unión!al!enzima!es!mayor!que!en!los! otros!tres!casos.! Según!los!resultados!obtenidos!en!este!trabajo,!se!plantea!la!continuidad!de!la! investigación!en!varios!puntos,!que!se!describen!a!continuación.! En! primer! lugar,! la! resolución! de! las! estructuras! cristalinas! obtenidas! en! este! trabajo!aportará!información!estructural!que!nos!permitirá!estudiar!las!interacciones! específicas!que!los!compuestos!forman!con!el!sitio!activo!de!la!proteína,!en!caso!de! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 36! que!sea!ese!el!lugar!donde!se!unen.!Una!vez!realizado!este!estudio,!se!propondrán! modificaciones!estructurales!de!los!compuestos!que!maximicen!estas!interacciones!y! minimicen!otras!interacciones!no!específicas!provocadas,!por!ejemplo,!por!los!efectos! de!solvatación!del!compuesto!y!de!este!modo!aumentar!su!afinidad.! Por! otro! lado,! una! vez! optimizadas! las! estructuras! de! estos! compuestos,! se! verificará!su!acción!sobre!la!proteína!PoFUT1!de!Homo)sapiens!ya!que!la!inhibición!de! esta! enzima! es! el! objetivo! final! de! nuestros! estudios.! Además,! nuestro! grupo,! en! colaboración! con! el! grupo! de! Síntesis! Asimétrica! de! la! Universidad! de! Zaragoza,! se! encuentra!elaborando!un!ensayo!enzimático!capaz!de!cuantificar!la!acción!inhibitoria! de! compuestos! sobre! enzimas! que! utilicen! nucleótidos! azucarados! como! sustratos.! Para! ello,! se! está! trabajando! en! la! síntesis! de! un! fluoróforo! que! interacciona! específicamente!con!el!nucleótido!formado!en!la!reacción!enzimática!llevada!a!cabo! por!glicosiltransferasas!(Ojida, 2006).!! En!resumen,! tanto! los! resultados!obtenidos!como!las! perspectivas! !de!trabajo! presentan! una! línea! de! investigación! muy! interesante! en! la! búsqueda! de! nuevos! fármacos! contra! la! diana! terapéutica! PoFUT1,! además! de! que! estos! compuestos!! aportarán! información! sobre! el! papel! de! la! OUfucosilación! en! distintas! etapas! del! desarrollo!embrionario!y!en!distintas!condiciones!fisiológicas.! ! ! ! ! ( ( ( ( ( ( ( ( ( ! ! Conclusiones( ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 38! Conclusiones( ! En!este!trabajo!se!ha!realizado!un!cribado!masivo!de!compuestos!orgánicos!en! busca!de!posibles!inhibidores!contra!la!actividad!de!la!proteína!CePOFUT1.!! Se! ha! cuantificado! la! unión! de! estos! compuestos! a! la! proteína! utilizando! diferentes!técnicas!biofísicas!y!se!ha!cristalizado!el!enzima!con!estos!compuestos.! En! conclusión,! en! el! presente! trabajo! se! han! propuesto! cuatro! compuestos! inhibidores!de!la!actividad!del!enzima!PoFUT1!de!la!especie!C.elegans,)que!serán!el! punto!de!partida!en!la!búsqueda!de!fármacos!contra!esta!diana!terapéutica.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Referencias( ! Búsqueda)de)inhibidores)frente)a)la)proteína)O6fucosiltransferasa)1)(PoFUT1)! ! Jessika!Valero!González! ! ! ! ! ! 40! Referencias( ArtavanisUTsakonas,!S;!Rand,!M.D;!Lacke,!R.J!(1999).!Notch!Signaling:!cell!fate!control! and!signal!integration!in!development.!Science!,)284,!770U776.! ! Bray,!S.!J.!(2006).!Notch!signalling:!a!simple!pathway!becomes!complex.!Nature!,)7.! Copland,!R.!A.!(2005).!Evaluation)of)enzyme)inhibitors)in)drug)discovery.!Canada:!WileyU interscience.! Cummings,!M.D;!Farnum,!M.A.;!Nelen!M.I.!(2006).!Universal!screenind!methods!and! applications!of!ThermoFluorR.!J)Biomol)Screen!,)11.! Gashaw,!I;!Ellinghaus,!P;!Summer,!A;!Asadullah,!K!(2011).!What!makes!a!good!drug! target?!Drug)discovery)today!,)16!(23/24).! http://thermofluor.org/resources/DSFUAnalysisUManualUv3.0.pdf.!(s.f.).! JafarUNejad,!H;!Leoanrdi,!J;!FernandezUValdivia,!R.!(2010).!Role!of!glycans!and! glycosyktransferases!in!the!regulation!of!Notch!signaling.!Glycobiology!,)20!(8),!931U 949.! Jundt,!F;!Schwarzer,!R;!Dörken,!B.!(2008).!Notch!signaling!in!leukemias!and! lymphomas.!Curr)Mol)Med!,)8,!51U59.! 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