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ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO (DIRECTOR-TUTOR: DR. JOSÉ BENITO RODRÍGUEZ GÓMEZ) MEMORIA PROYECTO FIN DE MÁSTER MÁSTER OFICIAL DE INICIACIÓN A LA INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS VETERINARIAS CURSO 2011-12 Autor: ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO Título: EVALUACIÓN DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA Memoria Proyecto Fin de Máster (Curso 2011/2012) Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza (C/ Miguel Servet 177, 50013, Zaragoza, España) “El éxito es conseguir lo que persigues, la felicidad querer lo que consigues” ANÓNIMO AGRADECIMIENTOS: Al Dr. Jose Benito Rodríguez Gómez, por su constante apoyo y consejo, por abrirme las interesantes puertas de la Oftalmología Veterinaria, y por brindarme la oportunidad de seguir aprendiendo día a día. Al Dr. Jose Ángel Cristóbal Bescós, por la confianza depositada en mí para iniciar un proyecto que supone una de las etapas más importantes en mi corta vida profesional. Al Dr. Jose Antonio Gámez Vintaned, por su ánimo, su paciente ayuda, y por aportarme parte de su exitosa experiencia en el mundo de la investigación. A la Dra. Begoña Calvo Calzada y a la Dra. Elena Lanchares Sancho, por su predisposición y apoyo desinteresado desde el primer momento que me inicié en el mundo de la investigación. A Dña. Amaya de Torre Martínez, por su ayuda, disposición y colaboración en cada momento, así como por permitirme trabajar a su lado aprendiendo cada día algo nuevo. Y en definitiva, a todos los animales que hacen posible cada día que la ciencia avance en beneficio de todos. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 7 TABLA DE CONTENIDO  RESUMEN .................................................................................................................... 9  INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 13 ‐ OBJETIVOS DE ESTUDIO ............................................................................................. 15 ‐ LUGAR DE REALIZACIÓN ............................................................................................ 15 ‐ REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................... 16  METODOLOGÍA ......................................................................................................... 39 ‐ MODELO ANIMAL EXPERIMENTAL ............................................................................... 41 ‐ ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS ........................................................................... 47  RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 49 ‐ ESPESOR CENTRAL DE LA CÓRNEA (ECC) ...................................................................... 51 ‐ ESPESOR DORSAL DE LA CÓRNEA (EDC) ....................................................................... 54 ‐ ESPESOR VENTRAL DE LA CÓRNEA (EVC) ...................................................................... 57 ‐ ESPESOR LATERAL DE LA CÓRNEA (ELC) ....................................................................... 60 ‐ ESPESOR MEDIAL DE LA CÓRNEA (EMC) ...................................................................... 63 ‐ VARIABILIDAD DEL ESPESOR CORNEAL EN LOS PUNTOS ESTABLECIDOS ................................ 66 ‐ COMPARACIÓN DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................... 68  CONCLUSIONES ........................................................................................................ 71 - FUTUROS OBJETIVOS Y LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN .......................................................... 73  REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 75  APÉNDICE I ................................................................................................................ 87  APÉNDICE II ............................................................................................................... 95 ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 14 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 15  OBJETIVOS DE ESTUDIO o Determinar los valores medios del espesor corneal in vivo, en perros oftalmológicamente sanos de la raza Beagle (hembras castradas), en distintos puntos preestablecidos de la estructura corneal, y comprobar la variabilidad existente entre los mismos. o Establecer las correlaciones estadísticas y variabilidad de los valores del espesor corneal, obtenidos por medición en distintos puntos simétricos de la córnea, con las variables edad y peso. o Comparar la coincidencia o correlación de las medias estadísticas obtenidas, con los estudios publicados para dicha especie, raza, edad, sexo y peso. o Verificar la adecuación e idoneidad de la paquimetría ultrasónica como técnica de medición del espesor corneal en la especie canina. o Determinar la importancia de la paquimetría ultrasónica como técnica útil y aplicable de forma rutinaria, desde el punto de vista clínico, para el diagnóstico y tratamiento médico y quirúrgico de patologías del segmento ocular anterior, y concretamente de la estructura corneal. o Establecimiento de futuras líneas de investigación en el campo de la paquimetría corneal, basadas principalmente en datos estadísticos que incluyan diferentes razas, además de variables como sexo, edad, y peso.  LUGAR DE REALIZACIÓN FACULTAD DE VETERINARIA (UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA) - Hospital Veterinario de la Universidad de Zaragoza - Unidad de Cirugía del Departamento de Patología animal ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 16  REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La córnea es el elemento refractivo más importante del dioptrio ocular. Para que esta importante función pueda ser desempeñada, la cualidad de la transparencia ha de mantenerse de forma constante y ser capaz de enfrentarse a los cambios que el crecimiento y envejecimiento natural de los tejidos van a provocar durante la vida, así como tener la capacidad de regenerarse frente a las diferentes agresiones externas que la vida va a deparar. Todas las estructuras de lo que hoy llamamos superficie ocular, tienen como principal objetivo el mantenimiento adecuado de la estructura corneal, sin la cual la transparencia, y con ello la función visual del ojo, quedaría seriamente comprometida. La superficie ocular es una unidad funcional donde los párpados, aparato lagrimal, conjuntiva y limbo, se comportan como un todo para el mantenimiento de la córnea. La transparencia corneal exige el mantenimiento de su hidratación, oxigenación, nutrición, eliminación de elementos de desecho, barrera inmune y capacidad de reparación.  APROXIMACIÓN ANATÓMICA, FISIOLÓGICA Y FUNCIONAL DE LA CÓRNEA La córnea se forma a partir de la porción externa del tejido mesodérmico, forma junto a la esclera la capa externa o túnica fibrosa del ojo, recubre una sexta parte de la superficie total del globo ocular y ocupa una posición central. Es una estructura transparente, avascular, sin color, ricamente inervada que puede provocar intenso dolor a su contacto, y no presenta vasos linfáticos u otros canales para fluidos1-3 (Figura 1). Las dos principales características de la córnea son su transparencia y su función como superficie de refracción, que permite una transmisión y enfoque óptimo de la luz sobre la retina. Además, actúa como una barrera física entre el medio ambiente y el interior del ojo 4,5. Por su carácter avascular, los requerimientos de oxígeno para su actividad metabólica provienen del aire atmosférico que se disuelve en el film lagrimal, durante el parpadeo, al cerrarse los párpados, el oxígeno penetra también desde los capilares de la conjuntiva. La mayoría de los nutrientes como hidratos de carbono, vitaminas, aminoácidos y otros sustratos, alcanzan la córnea a través del endotelio y, en menor medida, desde las arcadas vasculares limbares. Algunos factores de crecimiento, elementos inmunes y otros productos como el ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 17 retinol, son segregados por la glándula lagrimal y alcanzan la córnea a través de las lágrimas. El C02 y otros productos de desecho metabólico, pueden eliminarse bien a través del endotelio vía cámara anterior y humor acuoso, o bien a través del film lagrimal o incluso de los vasos limbares4,6. Figura 1. Estructura básica del globo ocular. (http://www.drsoler.com) La córnea cuando es observada a simple vista tiene una forma ligeramente elíptica, siendo más largo su diámetro horizontal que el vertical. Sin embargo, cuando la observamos tras su disección, desde su cara posterior, esta tiene un aspecto circular con ambos diámetros, vertical y horizontal, de similares longitudes3. Tanto su diámetro como su grosor, van aumentando durante el desarrollo por el engrosamiento y crecimiento en número de las láminas de colágena. Por norma general, la córnea es más delgada en el centro y va aumentado su grosor hacia el limbo3. El radio de curvatura de la córnea es significativamente menor que el radio de curvatura que por término medio presenta la esclera, el resultado es una zona de transición entre ambas estructuras, formando el llamado surco escleral, donde la córnea, que es más curva, se ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 18 transforma y aplana al convertirse en esclera3. En la especie canina, la cornea presenta una forma elíptica, con un radio de curvatura promedio de 8,5 mm y un rango del radio de curvatura horizontal de 13 a 15 mm y vertical de 12 a 16 mm7. Es fundamental conocer no sólo la estructura general del globo ocular sino también las particularidades de la anatomía corneal, para poder entender así tanto sus principios fisiológicos como su funcionalidad en el conjunto del sentido de la visión. De ésta forma, podemos distinguir diversas zonas en su extensión: limbo, córnea periférica y córnea central. Pero, sin duda, lo más relevante es su disposición estructural en capas concéntricas y las características de cada una de ellas. Así, la córnea presenta un total de cuatro capas, que desde la capa más externa a la más interna son: epitelio y membrana de Bowman, estroma corneal, membrana basal de Descemet y endotelio corneal5-7(Figura 2). Figura 2. Esquema de la estructura en capas de la córnea. (http://www.scielo.isciii.es) En la zona de transición entre esclera y córnea, se sitúa una región especial denominada limbo, que muestra un color azulado que lo identifica con facilidad. Tiene gran importancia por ser el lugar donde se encuentran las «Stem-cell» o células madre epiteliales, y posiblemente también las endoteliales, en su interior se encuentra el trabeculum para la salida del humor ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 19 acuoso, aquí se sitúan las células inmunocompetentes y es donde tienen su origen diversos tumores3. Esta zona anatómica presenta además otras múltiples e importante funciones, como la nutrición de la córnea periférica, la cicatrización corneal, la inmunovigilancia de la superficie y las respuestas de hipersensibilidad8. Su epitelio es pues la zona de transición entre el epitelio conjuntival columnar y el corneal estratificado. Típicamente, se producen pliegues de conjuntiva con vasos sanguíneos de forma radial, que se alternan con otros de epitelio corneal y que se denominan empalizadas de Vogt, y se estima que es exactamente aquí donde se localizan las «Stem-cells» o células madre3 (Fotografía 1). Fotografía 1. Localización y estructura del limbo corneal. Microscopía óptica (x 100). (Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Argentina) Así pues, el limbo corneal es el lugar de origen de las células con capacidad para repoblar el epitelio corneal tras su pérdida. Las «Stem-cells» o células madre se caracterizan por tener una larga vida, con ciclo celular corto y alto potencial de proliferación. Además, poseen una alta actividad mitótica y carecen de marcadores de queratina, quedando por tanto fenotípicamente diferenciadas9,10. Estas células proliferan de dos maneras: la primera de ellas consiste en su desplazamiento centrípeto hacia la zona central de la córnea, diferenciándose en «Transient Amplifying cells (TAC)», que pasan a constituir el estrato basal del epitelio corneal y que producirán células ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 20 postmitóticas suprabasales, llamadas células aladas o «Wing cells», que ocupan el estrato medio del epitelio corneal. Las células madre tienen alta capacidad de diferenciación, mientras que las células TAC tienen alta capacidad de proliferación. La segunda forma es mediante proliferación en dirección vertical, con ella se desarrolla la función de barrera8. Fotografía 2. Estructura en capas de la córnea. Microscopía óptica (x 100). (Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Argentina) A continuación, se procede a explicar las características básicas de cada una de las capas que componen la estructura corneal (Fotografía 2):  EPITELIO CORNEAL Es un epitelio escamoso, estratificado y no queratinizado, no secretor, transparente, y para que se mantengan en la mejores condiciones, es fundamental que este continuamente bañado por una película lagrimal precorneal adecuada en cantidad y estructura funcional. Tiene la doble función de barrera frente al medio exterior, así como ser una superficie óptica homogéneamente suave y lisa para la refracción, que consigue gracias a esa interacción con la película lagrimal5-7. Su grosor en los carnívoros menores es de 25 a 40 μm5. Esta formado por células bien diferenciadas que se continúan desde el epitelio de la conjuntiva tras su transición por el limbo. En él podemos diferenciar 3 tipos de células (basales, aladas o poliédricas y escamosas superficiales no queratinizadas) que forman, a su vez, tres capas del epitelio corneal5-8: ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 21 - Capa basal Es una única capa de células cuboides o columnares, de base plana y ápex en forma de cúpula. Están unidas entre sí de forma muy estrecha, por lo que el núcleo de las mismas es desplazado a su porción celular apical. Está situada en la zona más profunda del epitelio, y sus células presentan capacidad de mitosis y segregan colágeno tipo IV y VII, laminina, heparina y pequeñas cantidades de fibronectina, fibrina y proteoglicano de heparán sulfato, constituyentes fundamentales de su membrana o lámina basal4,13. Dicha membrana o lámina basal está situada justo por debajo de la capa basal corneal, y presenta una estructura y composición similar a la de las láminas basales de otros epitelios escamosos5 (Fotografía 3). Fotografía 3. Capa basal del epitelio corneal. A: microscopía electrónica de transmisión (x3000), se observa membrana basal (Mbs) y membrana de Bowman (MB). B: microscopía confocal (x400), se observa epitelio basal (Epi), membrana de Bowman y membrana basal epitelial (MB), plexo nervioso basal (Nv). (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 23.) Por otro lado, las células basales presentan un nivel de actividad metabólica y de síntesis mayor que el de las células más superficiales y, por tanto, poseen un citoplasma lleno de filamentos que constituyen su citoesqueleto, así como organelas (mitocondrias, retículo endoplásmico y aparato de Golgi), y también reservas importantes de glucógeno5,6. Es importante tener en cuenta, que son la única fuente de células nuevas que se incorporan al epitelio corneal. Su origen, como se ha mencionado, reside en las células madre localizadas en la capa basal del epitelio del limbo corneal3,8. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 22 Las células basales, y por tanto todo el epitelio, se encuentran fuertemente unidas a la lámina basal, a la membrana de Bowman subyacente y al estroma por medio de hemidesmosomas5,14. Los hemidesmosomas, en la lámina basal, se unen a las fibras de colágeno denominadas fibrillas de anclaje (colágeno tipo VII), penetrando en el estroma y ramificándose de forma intrincada entre las fibrillas de colágeno, para finalizar en unas estructuras denominadas palcas de anclaje14. Por su parte, las células basales, aladas y superficiales se encuentran unidas entre sí mediante desmosomas15. - Capa media Esta capa está constituida por células de la capa basal que proliferan desplazándose verticalmente hacia la superficie corneal tras su división celular, de forma que dan lugar a dos o tres capas de células poliédricas o aladas («Wing-cells»). Denominadas así por sus prolongaciones laterales, forman una fase intermedia de diferenciación del epitelio corneal, y se encuentran histológicamente entre las células basales y las superficiales5,6 (Fotografía 4). Fotografía 4. Estrato epitelial intermedio, células aladas («Wing-cells»). A: microscopía electrónica de transmisión (x15000), se observa núcleo, diversas organelas y desmosomas, algunos de ellos degenerados. B: microscopía confocal (x400), se observa arquitectura regular “en mosaico” típica de este estrato. (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 23.) Se caracterizan por su abundancia en tonofilamentos de queratina intracelular, no expresando citoesqueleto queratinizado típico de las células epidérmicas, causa por la que este epitelio es denominado no queratinizado4. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 23 - Capa superficial Está formada por cuatro o cinco capas de células más superficiales y aplanadas, que forman la barrera epitelial, y presentan una diferenciación y degeneración de carácter terminal a partir de las capas anteriormente mencionadas, como queda demostrado por su escasez relativa de organelas celulares, su bajo nivel de ácido ribonucleico y por la condensación de la cromatina celular6. Éstas células acaban desprendiéndose en un proceso que da lugar al recambio de todo el epitelio aproximadamente en 7 -10 días5,11,12 (Fotografías 5 y 6). Fotografía 5. Epitelio corneal superficial en descamación con alteraciones nucleares. A: microscopía confocal (x400). B: microscopía electrónica de transmisión (x8000). C: Miroscopía electrónica de barrido (x600). (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 21.) Los estudios de microscopia electrónica de barrido de la superficie de la córnea en animales (ratón, conejo, gato, perro y mono), las han descrito como una trama irregular de células poligonales, planas de bordes lisos, que se han clasificado como células, pequeñas y grandes, o claras y oscuras. Las primeras corresponden a células jóvenes (pequeñas y claras) que han alcanzado recientemente la superficie corneal, mientras que las segundas (grandes y oscuras) son células maduras que se encuentran en proceso de descamación4,5. En determinados puntos se observan los denominados “orificios de descamación”, que corresponden a áreas en las que una célula epitelial está en proceso de desprendimiento de la superficie corneal, y forma de esta manera un orificio a través del cual es posible observar la célula superficial adyacente16,17. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 30 Fotografía 9. Endotelio corneal. Microscopía confocal (x400), se observa una estructura homogénea de células con su clásica forma hexagonal regular. (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 28.) A pesar de la normal pérdida celular con la edad del endotelio, parece no existir un incremento de la permeabilidad normal en córneas más ancianas, solo cuando se reduce mucho dicha densidad o existe un daño celular agudo, esta puede incrementarse. Si permanecen suficientes células viables como para emigrar y repoblar la zona dañada, se restablecerán las uniones intercelulares y se restaurará la función de barrera endotelial47. Fotografía 10: Microvilis de la cara posterior del endotelio corneal. Microscopía electrónica de barrido (x5000); se observan los microvilis del endotelio en la cara posterior del mismo, en contacto con el humor acuoso. (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 28.) ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 31 Una función secundaria del endotelio es la secreción de matriz extracelular, creando la membrana de Descement (membrana basal del endotelio corneal). Aunque algunas fibrillas del estroma posterior se unen a esta membrana, no existen complejos de unión o de adhesión en ella. Es una membrana muy elástica y fuerte, compuesta de colágeno tipos IV y VIII, así como glicoproteínas (fibronectina, laminina, trombospodina). En el nacimiento tiene un gran grosor, presenta numerosos espacios, y esta formada por fibras colágenas en banda. Tras el nacimiento, se va añadiendo nueva membrana durante el crecimiento, aunque resulta distinta de la inicial, ya que no presenta bandas y contiene fibras de colágena de pequeño diámetro, que se alinean en una matriz en enrejado5-7,48.  FACTORES DE INFLUENCIA EN EL ESPESOR CORNEAL Existen algunos factores fisiológicos como especie, raza, sexo, edad o momento del día que, pese a no afectar a la integridad de la córnea de forma directa, si pueden suponer un cambio en sus dimensiones o propiedades en un momento determiando49,50,51-53. Además de estos, existe otro grupo de factores patológicos que sí llega a producir variación o alteración en las propiedades de la córnea54,55. Por otra parte, hay determinados fármacos y otros agentes químicos que, si bien no producen modificaciones permanentes, si las pueden producir de forma inmediatamente posterior a su administración, desapareciendo su efecto si su aplicación es suprimida.  FACTORES FISIOLÓGICOS - Edad-Raza Es uno de los principales factores estudiados que pueden influir en el espesor de la córnea. La influencia y relevancia de este factor depende fundamentalmente de la especie estudiada. En la especie humana, los datos publicados son un tanto contradictorios, ya que mientras determinados estudios muestran que existe un adelgazamiento corneal a medida que avanza la edad de los pacientes52,56, otros autores establecen que no existen pruebas concluyentes que permitan correlacionar estadísticamente la edad de los pacientes con los cambios en el espesor corneal57,58. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 32 Los datos publicados relacionados con la especie canina y felina, han establecido una correlación estadísticamente significativa que determina un incremento del espesor corneal a medida que aumenta la edad de los animales49,59,60. En cuanto a la raza, se establece que existe un incremento significativo del espesor corneal en individuos de razas de mayor tamaño49,59, así como también en aquellos de mayor peso49. - Sexo Respecto a la influencia del sexo sobre el espesor corneal, en varios estudios se ha indicado que en la especie canina, los machos presentan córneas de un mayor grosor que las hembras49,59. Sin embargo, en la especie felina no se presenta dicha diferencia entre machos y hembras50. En el caso de estudios realizados en caballos, se ha determinado una baja correlación entre la edad y el espesor corneal, no llegándose a encontrar una diferencia estadísticamente significativa entre machos y hembras51,61,62. - Variaciones diurnas Las modificaciones diurnas del espesor corneal han sido publicadas en multitud de especies, entre las que cabe destacar el conejo63, el gato64, los primates65, y el ser humano66. A primeras horas del día, existe un espesor corneal mayor debido al cierre de los párpados durante las horas de sueño. Ello se produce por una restricción en la llegada de oxígeno atmosférico a la superficie de la córnea, lo cual induce la activación del metabolismo anaeróbico, que por sí mismo causa un incremento de la concentración de lactato dentro del estroma corneal, generando así un gradiente osmótico que atrae agua al interior de la córnea67, por lo que se produce un engrosamiento en torno a un 5%. Éste fenómeno es denominado edema nocturno.  FACTORES PATOLÓGICOS En estado normal, la córnea sana está íntimamente relacionada e influenciada por la película lagrimal precorneal, el humor acuoso, la presión intraocular (PIO) y por los párpados. Cualquier modificación en alguno de estos factores puede ocasionar alteraciones a nivel de la estructura corneal4. Dependiendo de la alteración ocular, el espesor corneal puede sufrir un engrosamiento o adelgazamiento más o menos acentuado. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 33 En cualquier especie, y como es lógico pensar, toda aquella alteración que curse con edema corneal presentará un aumento del espesor corneal, y aunque la paquimetría no es fundamental en su diagnóstico, si es considerada de interés en el seguimiento de dichas alteraciones. Un ejemplo importante es la Diabetes Mellitus, ya que las personas que padecen ésta enfermedad sufren cambios en el espesor corneal, debido a una mayor permeabilidad del endotelio corneal68, hecho que también ha sido demostrado en perros con ésta patología, en los que se ha observado una diferencia estadísticamente significativa del espesor corneal central, aumentando éste respecto a perros libres de la enfermedad69. Las principales alteraciones que cursan con una disminución del espesor corneal son el queratocono70 y la queratoconjuntivitis seca71, hecho no descrito en animales en la bibliografía consultada.  FÁRMACOS El espesor de la córnea puede también verse afectado por la administración de anestésicos, anticolinérgicos, simpaticomiméticos y simpaticolíticos72-75. Entre ellos destacan fármacos tales como midriáticos72, anestésicos tópicos73,74 y beta-adrenérgicos75. Se ha establecido que el uso de oxibuprocaína 0,4% no afecta significativamente al espesor corneal, sin embargo, sí produce variaciones individuales significativas, tanto de incremento como de disminución del espesor corneal74. Por otra parte, se ha observado que el uso de proparacaína 0,5% produce un incremento significativo del espesor corneal central de hasta un 2,9%, detectable durante los 15 minutos siguientes a la instilación, con un pico máximo a los 2 minutos73. Se ha estudiado además el efecto de la instilación de una asociación de tropicamida 0,5% (anticolinérgico) y fenilefrina 0,5% (alfa-estimulante) sobre el espesor corneal, estableciendo que el uso de esta combinación produce un aumento significativo del espesor corneal en los pacientes, entre un 3,68% y un 5,09% del espesor corneal total medido 1,5 horas después de la instilación de la asociación72. Otro de los estudios publicados, valora el espesor corneal bajo el efecto de fármacos activos sobre receptores alfa y beta adrenérgicos (simpaticomiméticos y simpaticolíticos) usando para ello fenilefrina 10% (alfa-estimulante), fentolamina 10% (alfa-bloqueante), isoprenalina 0,5% (betaestimulante) y timolol 5% (beta-bloqueante), estableciendo que los medicamentos que actuan sobre los receptores alfa adrenérgicos no modifican el espesor corneal, mientras que los beta ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 34 adrenérgicos sí lo modifican, produciéndose una disminución (beta-estimulante) o engrosamiento (beta-bloqueante) del espesor corneal, sugiriendo por ello que los receptores endoteliales betaadrenérgicos juegan un papel importante en la regulación del espesor corneal75.  TÉCNICAS Y APLICABILIDAD DE LA PAQUIMETRÍA Se denomina paquimetría a la técnica con la cual se realiza la medición del espesor corneal “in vivo”. Los primeros estudios de paquimetría se remontan a los realizados en el ojo humano por Blix (1880). En la actualidad, existen gran variedad de técnicas que permiten establecer el espesor corneal. Son clasificadas primariamente de acuerdo a la información que se obtiene de éstas, por lo que obliga a diferenciarlas en técnicas paquimétricas cualitativas o cuantitativas. Tabla I. Técnicas de paquimetría. (Molleda C. Evaluación clínica del espesor central de la córnea y la presión intraocular en el perro [tesis doctoral]. Córdoba: Universidad de Córdoba; 2009. p. 23.) ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 35 A su vez, es posible en las técnicas cualitativas reconocer dos tipos, de acuerdo al método utilizado para su valoración. Si ésta se realiza por una observación directa de la córnea, o si su evaluación se realiza por la presencia de parámetros que son dependientes del estado de la córnea sin necesidad de su observación directa, por lo que se les denominan técnicas cualitativas directas o indirectas, respectivamente76 (Tabla I). Las técnicas utilizadas tradicionalmente para establecer el espesor corneal en animales han sido las de tipo cuantitativo, ya que se adaptan con mayor facilidad a las características propias de cada especie animal y no requieren de una respuesta consciente o de la agudeza visual del paciente. De entre éstas, la paquimetría óptica y la ultrasónica han sido las más empleadas.  PAQUIMETRÍA ÓPTICA Esta técnica es utilizada principalmente para medir el espesor central de la córnea (ECC) en humanos, y en la actualidad está siendo reemplazada por técnicas con mayores prestaciones tecnológicas76. Se basa en un sistema desdoblador de imagen adaptado a la lámpara de hendidura, que permite obtener un valor del espesor de la sección óptica observada cuando las imágenes de la superficie anterior y posterior de la córnea coinciden. Este valor es asociado al índice de refracción y a la curvatura corneal, y esto permite establecer el valor del espesor corneal76,77. Fotografía 11. Paquímetro óptico modelo Slit Lamp BX 900 (MMC Optical, Kastrup, Denmark). (http://www.mmcoptical.dk) ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 36 La principal desventaja para su utilización en animales, es la necesidad de experiencia o alto entrenamiento del observador, así como la necesidad de que el tejido corneal siempre sea translúcido78,79. Además, se debe garantizar el alineamiento perpendicular del paquímetro a la superficie de la córnea y una correcta fijación del paciente, lo que frecuentemente es difícil, siendo entonces la necesidad de sedación otra desventaja a considerar para su uso en animales. Debido a todo ello, existe una limitación en el uso de la paquimetría óptica en los animales, por lo que esta técnica únicamente se ha utilizado en estudios de investigación con animales de laboratorios como ratas, ratones y conejos80, y en un trabajo que permitió establecer el espesor corneal en gatos bajo anestesia general81, pero no se han publicados trabajos relacionados con la paquimetría óptica en el perro.  PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA El uso de los ultrasonidos en las investigaciones oftalmológicas se remonta a los trabajos realizados por Mundt y Hugehes (1956)82. Uno de estos métodos es la paquimetría ultrasónica, que frente a la paquimetría óptica, presenta algunas ventajas como son la rapidez, objetividad, facilidad de uso, movilidad del instrumento15, mayor precisión en la medición del espesor corneal49,50 y una alta repetibilidad entre observadores y entre sesiones83. Se basa en un emisor de ultrasonidos que, al contactar con la córnea, emite unas ondas ultrasónicas y recibe la reflexión “eco” de la interfaz córnea/humor acuoso, donde se produce un cambio de las propiedades acústicas (impedancia acústica) del medio de propagación, lo cual es recibido y procesado por el paquímetro76. En función del tiempo de latencia transcurrido entre la emisión y la recepción de los ecos, y teniendo en cuenta la velocidad de calibrado para el medio (córnea), se obtiene el espesor corneal mediante la siguiente relación76: Espesor = ½ (Tiempo de latencia x Velocidad de Calibrado). La técnica de medición con paquimetría ultrasónica únicamente requiere de anestesia tópica ocular. La sonda debe ubicarse perfectamente perpendicular a la superficie corneal, intentando un leve contacto con la película lagrimal precorneal, cuya finalidad es que esta sirva de unión entre la sonda y la córnea, para garantizar la recepción del eco proveniente de la superficie posterior de la córnea. En general, la oblicuidad al colocar la sonda impedirá que sean registrados los ecos, por lo que no se producirá una medida en el paquímetro. Los movimientos oculares que se producen en los animales sin sedación o anestesia general, ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 37 pueden producir errores que afecten a la precisión de la técnica. A pesar de ello, existen estudios realizados en conejos que demuestran que estas variaciones debidas al movimiento son despreciables58. El uso de la paquimetría ultrasónica también ha sido descrita en caballos 51,54,61, gatos50,84 y perros 49,55,85. Fotografía 12. Paquímetro ultrasónico modelo DGH 5100E (PachetteTM, DGH Technology Inc., Pennsylvania, USA). (http://www.dghkoi.com)  VALORACIÓN DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA Como se ha mencionado con anterioridad, la paquimetría ultrasónica es de fácil realización en los animales domésticos, altamente reproducible y posee una baja variación interobservador49,50,79. No se ve influida de manera significativa por los súbitos, bruscos e impredecibles movimientos de la cabeza o del ojo, como ocurre frecuentemente en los perros, por lo que ha sido el principal método utilizado para establecer el espesor corneal en esta especie51,54,61,84. Los estudios hasta ahora realizados del espesor corneal en la especie canina son resumidos en la Tabla II. En primer lugar, se establece que la parte central es el área de menor espesor de la córnea, mientras que de las áreas periféricas, la de mayor espesor se presenta en el cuadrante dorsal, seguido por el cuadrante lateral49. El valor medio del espesor corneal central en la especie canina se ha establecido entre 499 y 660 μm49,59,69,85-87. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 38 Por otro lado, se ha establecido que no se presentan diferencias estadísticamente significativas entre los valores de espesor corneal obtenidos entre los ojos derecho e izquierdo de un mismo animal49,59,87. Sin embargo, se ha establecido que existe una diferencia estadísticamente significativa de acuerdo al sexo, donde los machos presentan un espesor corneal mayor que el de las hembras49,59. De este mismo modo, se presentan variaciones directamente proporcionales de acuerdo al peso corporal, existiendo un menor espesor corneal en animales de menor peso corporal y viceversa49. Respecto al espesor corneal y la edad, cabe destacar que en la especie canina se presenta un aumento significativo del espesor corneal a medida que aumenta la edad49. Por otra parte, hay que recalcar que los cachorros al momento de abrir los ojos por primera vez (10-15 días de vida), presentan un espesor corneal mayor que a los 8 meses de edad85. Tabla II. Espesor corneal en la especie canina (μm). (Molleda C. Evaluación clínica del espesor central de la córnea y la presión intraocular en el perro [tesis doctoral]. Córdoba: Universidad de Córdoba; 2009. p. 30.) ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 39 METODOLOGÍA ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 46 - Procedimiento En primer lugar, se inmoviliza la cabeza del sujeto y de manera cuidadosa se procede a la apertura de los párpados superior e inferior, evitando ejercer ningún tipo de presión sobre el globo ocular. Previamente a cualquier toma de medidas, se realiza un lavado del globo ocular objeto del estudio mediante suero salino fisiológico para arrastrar todo tipo de partículas y secreciones que pudieran dar interferencias tanto en el funcionamiento del equipo como en el registro de mediciones. Las mediciones se registran en micrómetros, y para que cada medida sea significativa, en cada uno de los puntos a medir se realizan cinco tomas, de manera que en la medición final registrada de un solo punto se recoge una media de las cinco medidas previas. Entre las mediciones realizadas en cada córnea se realiza una limpieza de la sonda con alcohol de 96º, que posteriormente se lava con suero salino fisiológico. A la hora de la toma de medidas, es importante guardar la perpendicularidad sobre la córnea en las distintas zonas que se pretenda medir, así como no ejercer una presión excesiva, para no modificar la medida del espesor y que los registros sean así lo más reales posible (Fotografía 20). Fotografía 20. Toma de medidas del espesor corneal (sonda perpendicular). ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 47  ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS DATOS La base de datos que recoge la totalidad de medidas realizadas sobre las distintas variables se reflejada de forma detallada en el Apéndice I. Dichos datos son utilizados para llevar a cabo el análisis estadístico de forma estandarizada según los objetivos previamente planteados. Como procedimiento inicial, y para cada uno de los cinco puntos de medida del espesor corneal (central, dorsal, ventral, lateral y medial), se realizan pruebas t de Student para muestras pareadas sobre los datos tomados tanto en el ojo derecho como en el izquierdo, con el objetivo de verificar la existencia (si P<0,05, para un intervalo de confianza del 95%) o no (si P>0,05, para un intervalo de confianza del 95%) de diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los valores de ojo derecho e izquierdo. Una vez demostrada, mediante esta prueba estadística, la no existencia de diferencias significativas entre ojo derecho e izquierdo para ninguno de los cinco puntos de medición, puede asumirse que los datos pareados de cada animal sean tratados como uno solo, para lo que se calcula su media aritmética. A continuación, se realiza un análisis descriptivo de los datos; en primer lugar, de los correspondientes al espesor corneal en el ojo derecho y en el izquierdo de cada animal, por separado para cada ojo; a continuación, de los valores medios de los dos ojos de cada animal. Todo ello realizado para las cinco medidas de espesor practicadas en los cinco puntos preestablecidos de la córnea. Como complemento a dicha información, se incluye un histograma para cada valor medio del espesor corneal en cada punto analizado. La comparación estadística de las medias del espesor corneal en cada uno de los puntos preestablecidos con los grupos de edad y peso se lleva a cabo mediante el test paramétrico ANOVA para un factor (con determinación de la homogenidad de varianzas u homocedasticidad), utilizando como tests post hoc Bonferroni y HSD de Tukey. Para ello, previamente se comprueba la normalidad de las variables utilizadas (peso, edad y medias del espesor corneal en los cinco puntos) mediante la aplicación de la prueba de Kolmogorov- Smirnov para una muestra (con P>0,05 indicativo de normalidad). La prueba ANOVA permite determinar la existencia o no de diferencias estadísticamente significativas entre más de dos medias de las distintas variables de estudio. Respectivamente: si P<0,05 (para un intervalo de confianza del 95%), se deduce la no igualdad de medias (existencia de diferencias ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 48 estadísticamente significativas); si P>0,05 (para un intervalo de confianza del 95%), se deduce la igualdad de medias (no existencia de diferencias estadísticamente significativas). Posteriormente, se realiza una comparación estadística entre los valores del espesor corneal central y los de cada uno de los puntos periféricos, mediante pruebas t de Student para muestras independientes sobre los datos tomados tanto en el ojo derecho como en el izquierdo, con el objetivo de verificar la existencia (si P<0,05, para un intervalo de confianza del 95%) o no (si P>0,05, para un intervalo de confianza del 95%) de diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los valores centrales y periféricos. Por último, mediante el coeficiente de correlación de Pearson (R2), se establece y analiza la relación existente entre los valores medios del espesor corneal en los diferentes puntos preestablecidos (central, dorsal, ventral, lateral y medial) con las categorías de edad y peso, como información complementaria a las conclusiones extraídas del análisis mediante ANOVA. En los resultados que se muestran a continuación se reflejan, para cada uno de los puntos corneales de medida preestablecidos, los valores medios obtenidos del estudio de los 32 globos oculares (n=16), tanto en el ojo izquierdo como en el derecho, además de los valores obtenidos por la media de ambos. Así mismo, y también para cada punto, se determina la relación existente entre los valores medios del espesor corneal y los grupos de edad y peso propuestos. Finalmente, se representa el estudio de variabilidad del espesor entre la zona central y periférica de la córnea en los individuos analizados. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 49 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 50 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 51 1. ESPESOR CENTRAL DE LA CÓRNEA (ECC) Tras el estudio de las medidas en los 32 ojos de los 16 animales estudiados, el valor medio del ECC ± desviación estándar es de 588,81 ± 29,96 μm (Tabla V y Gráfica 1). Los valores del ECC medios ± desviación estándar de los ojos derecho e izquierdo son 587,38 ± 30,38 μm y 590,25 ± 30,46 μm respectivamente, no existiendo una diferencia estadísticamente significativa entre ambos ojos (P=0,342). Los valores límite del ECC se encuentran entre un valor máximo de 657 μm y un mínimo de 538 μm. Tabla V. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados. ECC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo O. derecho 16 587,38 30,38 538 657 O. izquierdo 16 590,25 30,46 542 655 Total 32 588,81 29,96 538 657 Gráfica 1. Histograma poblacional del ECC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio). ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 52 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL ECC Y CATEGORÍA DE EDAD Tras la verificación de la normalidad de las variables edad (P=0,138) y media del ECC (P=0,868), el estudio estadístico y la comparación de las medias del espesor corneal central en relación a los grupos de edad, demuestra un valor medio del ECC ± desviación estándar de 583,00 ± 5,65 μm en individuos ≤ 2 años, de 588,00 ± 28,79 μm en > 2 y < 6 años, y de 591,83 ± 38,47 μm en ≥ 6 años (Tabla VI). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el ECC varíe de acuerdo con la edad. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,002) (Gráfica 2). Tabla VI. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) según la categoría de edad. ECC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤2 años 2 583,00 5,65 579,0 587,0 >2 y <6 años 8 588,00 28,79 540,0 636,0 ≥6 años 6 591,83 38,47 559,0 656,0 Total 16 588,81 29,85 540,0 656,0 Gráfica 2. Correlación y regresión lineal del ECC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 53 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL ECC Y CATEGORÍA DE PESO Cuando el ECC es analizado de acuerdo a los grupos de peso (variable normal, P=0,964), el valor medio del ECC ± desviación estándar es de 583,90 ± 16,19 μm en individuos ≤ 13 Kg, de 594,21 ± 32,05 μm en > 13 y < 16 Kg, y de 585,50 ± 43,91 μm en ≥ 16 Kg (Tabla VII). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el ECC varíe de acuerdo con el peso. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,006) (Gráfica 3). Tabla VII. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) según la categoría de peso. ECC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤13 Kg 5 583,90 16,19 561,5 606,5 >13 y <16 Kg 7 594,21 32,05 564,0 656,0 ≥16 Kg 4 585,50 43,91 540,0 636,0 Total 16 588,81 29,85 540,0 656,0 Gráfica 3. Correlación y regresión lineal del ECC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 54 2. ESPESOR DORSAL DE LA CÓRNEA (EDC) Tras el estudio de las medidas en los 32 ojos de los 16 animales estudiados, el valor medio del EDC ± desviación estándar es de 665,28 ± 42,10 μm (Tabla VIII y Gráfica 4). Los valores del EDC medios ± desviación estándar de los ojos derecho e izquierdo son 665,50 ± 42,36 μm y 665,06 ± 43,23 μm respectivamente, no existiendo una diferencia estadísticamente significativa entre ambos ojos (P=0,899). Los valores límite del EDC se encuentran entre un valor máximo de 763 μm y un mínimo de 601 μm. Tabla VIII. Valores medios del espesor corneal dorsal (EDC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados. EDC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo O. derecho 16 665,50 42,36 601 757 O. izquierdo 16 665,06 43,23 612 763 Total 32 665,28 42,10 601 763 Gráfica 4. Histograma poblacional del EDC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio). ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 55 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL EDC Y CATEGORÍA DE EDAD Tras la verificación de la normalidad de las variables edad (P=0,138) y media del EDC (P=0,928), el estudio estadístico y la comparación de las medias del espesor corneal dorsal en relación a los grupos de edad, demuestra un valor medio del EDC ± desviación estándar de 626,75 ± 23,68 μm en individuos ≤ 2 años, de 666,62 ± 37,74 μm en > 2 y < 6 años, y de 676,33 ± 50,08 μm en ≥ 6 años (Tabla IX). Estos valores no presentan una diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el EDC varíe de acuerdo con la edad. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,064) (Gráfica 5). Tabla IX. Valores medios del espesor corneal dorsal (EDC, μm) según la categoría de edad. EDC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤2 años 2 626,75 23,68 610,0 643,5 >2 y <6 años 8 666,62 37,74 606,5 717,5 ≥6 años 6 676,33 50,08 615,5 760,0 Total 16 665,28 42,26 606,5 760,0 Gráfica 5. Correlación y regresión lineal del EDC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 62 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL ELC Y CATEGORÍA DE PESO Cuando el ELC es analizado de acuerdo a los grupos de peso (variable normal, P=0,964), el valor medio del ELC ± desviación estándar es de 656,90 ± 26,98 μm en individuos ≤ 13 Kg, de 661,07 ± 39,43 μm en > 13 y < 16 Kg, y de 638,50 ± 47,22 μm en ≥ 16 Kg (Tabla XVI). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el ELC varíe de acuerdo con el peso. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,057) (Gráfica 12). Tabla XVI. Valores medios del espesor corneal lateral (ELC, μm) según la categoría de peso. EDC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤13 Kg 5 656,90 26,98 621,0 686,5 >13 y <16 Kg 7 661,07 39,43 607,5 720,0 ≥16 Kg 4 638,50 47,22 592,0 699,5 Total 16 654,12 36,77 592,0 720,0 Gráfica 12. Correlación y regresión lineal del ELC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 63 5. ESPESOR MEDIAL DE LA CÓRNEA (EMC) Tras el estudio de las medidas en los 32 ojos de los 16 animales estudiados, el valor medio del EMC ± desviación estándar es de 620,31 ± 38,97 μm (Tabla XVII y Gráfica 13). Los valores del EMC medios ± desviación estándar de los ojos derecho e izquierdo son 619,13 ± 35,23 μm y 621,50 ± 43,53 μm respectivamente, no existiendo una diferencia estadísticamente significativa entre ambos ojos (P=0,667). Los valores límite del EMC se encuentran entre un valor máximo de 735 μm y un mínimo de 564 μm. Tabla XVII. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados. EMC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo O. derecho 16 619,13 35,23 579 690 O. izquierdo 16 621,50 43,53 564 735 Total 32 620,31 38,97 564 735 Gráfica 13. Histograma poblacional del EMC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio). ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 64 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL EMC Y CATEGORÍA DE EDAD Tras la verificación de la normalidad de las variables edad (P=0,138) y media del EMC (P=0,902), el estudio estadístico y la comparación de las medias del espesor corneal medial en relación a los grupos de edad, demuestra un valor medio del EMC ± desviación estándar de 584,75 ± 10,96 μm en individuos ≤ 2 años, de 629,50 ± 44,44 μm en > 2 y < 6 años, y de 619,91 ± 30,36 μm en ≥ 6 años (Tabla XVIII). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el EMC varíe de acuerdo con la edad. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,019) (Gráfica 14). Tabla XVIII. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) según la categoría de edad. EMC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤2 años 2 584,75 10,96 577,0 592,5 >2 y <6 años 8 629,50 44,44 587,5 712,5 ≥6 años 6 619,91 30,36 580,5 658,5 Total 16 620,31 38,08 577,0 712,5 Gráfica 14. Correlación y regresión lineal del EMC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 65 o CORRELACIÓN ENTRE MEDIA DEL EMC Y CATEGORÍA DE PESO Cuando el EMC es analizado de acuerdo a los grupos de peso (variable normal, P=0,964), el valor medio del EMC ± desviación estándar es de 616,20 ± 55,32 μm en individuos ≤ 13 Kg, de 627,07 ± 21,28 μm en > 13 y < 16 Kg, y de 613,62 ± 45,52 μm en ≥ 16 Kg (Tabla XIX). Estos valores no presentan diferencias estadísticamente significativas (igualdad de medias, P>0,05), por lo que no se puede afirmar que el EMC varíe de aceurdo con el peso. La inexistente correlación entre ambas variables queda reflejada en el análisis de regresión lineal (R2=0,022) (Gráfica 15). Tabla XIX. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) según la categoría de peso. EDC Nº Media D. Estándar Mínimo Máximo ≤13 Kg 5 616,20 55,32 577,0 712,5 >13 y <16 Kg 7 627,07 21,28 587,5 658,5 ≥16 Kg 4 613,62 45,52 580,5 680,0 Total 16 620,31 38,08 577,0 712,5 Gráfica 15. Correlación y regresión lineal del EMC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 66  VARIABILIDAD DEL ESPESOR CORNEAL EN LOS PUNTOS ESTABLECIDOS El objetivo es comparar la variabilidad del ECC respecto a los diferentes puntos periféricos establecidos en el mapa de medición corneal (EDC, EVC, ELC, EMC), tanto en el ojo izquierdo como en el derecho, para comprobar si existen diferencias estadísticamente significativas (si P<0,05, para un intervalo de confianza del 95%) entre los espesores centrales y periféricos, de manera que se pueda llegar a concluir que el espesor corneal periférico es mayor que el central.  OJO DERECHO - ECC y EDC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y dorsal son 587,38 ± 30,38 μm y 665,50 ± 42,36 μm respectivamente (Tabla XX). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,000), lo que refleja un mayor espesor corneal dorsal (periférico) que central. - ECC y EVC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y ventral son 587,38 ± 30,38 μm y 632,25 ± 34,56 μm respectivamente (Tabla XX). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,001), lo que refleja un mayor espesor corneal ventral (periférico) que central. - ECC y ELC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y lateral son 587,38 ± 30,38 μm y 653,00 ± 34,49 μm respectivamente (Tabla XX). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,000), lo que refleja un mayor espesor corneal lateral (periférico) que central. - ECC y EMC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y medial son 587,38 ± 30,38 μm y 619,13 ± 35,23 μm respectivamente (Tabla XX). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,010), lo que refleja un mayor espesor corneal medial (periférico) que central. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 67 Tabla XX. Valores medios del espesor corneal central (μm) y periférico (μm) en el ojo derecho. OD Media D. Estándar Mínimo Máximo ECC 587,38 30,38 538 657 EDC 665,50 42,36 601 757 EVC 632,25 34,56 580 710 ELC 653,00 34,49 605 707 EMC 619,13 35,23 579 690  OJO IZQUIERDO - ECC y EDC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y dorsal son 590,25 ± 30,46 μm y 665,06 ± 43,23 μm respectivamente (Tabla XXI). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,000), lo que refleja un mayor espesor corneal dorsal (periférico) que central. - ECC y EVC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y ventral son 590,25 ± 30,46 μm y 633,81 ± 34,39 μm respectivamente (Tabla XXI). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,001), lo que refleja un mayor espesor corneal ventral (periférico) que central. - ECC y ELC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y lateral son 590,25 ± 30,46 μm y 655,25 ± 41,66 μm respectivamente (Tabla XXI). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,000), lo que refleja un mayor espesor corneal lateral (periférico) que central. - ECC y EMC Los valores medios del espesor corneal ± desviación estándar del punto central y medial son 590,25 ± 30,46 μm y 621,50 ± 43,53 μm respectivamente (Tabla XXI). Existe una diferencia estadísticamente significativa entre ambos (P=0,025), lo que refleja un mayor espesor corneal medial (periférico) que central. ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 68 Tabla XXI. Valores medios del espesor corneal central (μm) y periférico (μm) en el ojo izquierdo. OD Media D. Estándar Mínimo Máximo ECC 590,25 30,46 542 655 EDC 665,06 43,23 612 763 EVC 633,81 34,39 590 705 ELC 655,25 41,66 579 733 EMC 621,50 43,53 564 735  COMPARACIÓN DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN El uso de la paquimetría ultrasónica (DGH 500 PachetteTM, DGH Technology Inc., USA), como método para la medición del espesor corneal en los 16 perros estudiados, no ha mostrado ningún tipo de dificultad o complicación técnica a lo largo del estudio. No se ha observado, durante la medición o posterior a ella, ningún tipo de alteración del estado fisiológico o general de los animales evaluados, así como tampoco se han presentado lesiones irritativas o daños en el epitelio corneal en ninguno de los ojos estudiados. Así, sólo con aplicación de anestesia tópica, es posible realizar una medición atraumática del espesor corneal en su estado fisiológico, evitando así las complicaciones e inconvenientes derivados del uso de la sedación o anestesia general, que como ha sido publicado por diversos autores, por la acción de distintos fármacos pueden causar modificaciones significativas en la medición del espesor corneal72-75. Tras el análisis de los datos, no se han observado diferencias estadísticamente significativas (P>0,05) entre las medidas del espesor corneal obtenidas en el ojo derecho e izquierdo de un mismo animal. Dicha conclusión, también es extraída de los estudios realizados por Gilger et al (1991)49, Montiani-Ferreira et al (2003)59, y Staplento y Peiffer (1979)87. Por el contrario, si se han encontrado diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre el espesor corneal central y el periférico (dorsal, ventral, lateral y medial), en cada una de las comparaciones realizadas para ambos ojos en cada animal, mostrando un menor espesor en la zona corneal central respecto a la periférica. Esta diferencia entre el espesor corneal central y periférico, también ha sido obtenida en diversos estudios, como el realizado por Gilger et al (1991)49. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 69 Los valores medios de espesor corneal central (ECC), en los 32 globos oculares estudiados (n=16), presentan una media de 588,81 ± 29,96 μm (Tabla V). Dicho valor, se encuentra entre el máximo y el mínimo (499-660 μm) establecido por distintos autores para la especie canina49,59,69,85-87. Los valores obtenidos, son inferiores a los publicados por Staplento y Peiffer (1979)87 y Gwin et al (1983)86, en estudios realizados con una muestra inferior a la del presente estudio (n=7 y n=14, respectivamente), y son también inferiores respecto a los obtenidos por Gwendolyn et al (2006)69, en una muestra con mayor número de individuos (n=35) que el utilizado en éste. Respecto a los datos recogidos por Montiani-Ferreira et al (2003)59 en perros de raza Beagle, tanto machos como hembras, los valores establecidos por dichos autores son inferiores a los obtenidos en este estudio. Por otra parte, los valores obtenidos por Gilger et al (1991)49, son ligeramente inferiores respecto a los obtenidos en este estudio, siendo mayor en este caso la muestra utilizada (n=49). En cuanto a los valores del espesor corneal dorsal (EDC) y lateral (ELC), en los 32 globos oculares estudiados (n=16), se observa una media de 665,28 ± 42,10 μm y 654,13 ± 37,64 μm, respectivamente (Tablas VIII y XXI). Dichos valores, son superiores a los establecidos por Gilger et al (1991)49, en cuyo estudio se utilizo una muestra con mayor número de animales (n=49). Por otro lado, no ha sido posible comparar los valores obtenidos en la toma de medias en la zona media y ventral, debido a la inexistencia de estudios publicados que reflejen mediciones en tales localizaciones. Respecto a estos puntos de medición, cabe recalcar, que han presentado una mayor dificultad en la toma de medidas en el modelo experimental seguido, respecto a los puntos dorsal y lateral, posiblemente debido a la disposición anatómica palpebral y del globo ocular. En el caso del punto medial, podría ser debido a la presencia de la glándula lacrimal, la membrana nictitante y la escotadura medial palpebral, mientras que en el ventral, podría serlo debido a la presencia del párpado inferior y a la disposición de la membrana nictitante que, a menudo, y al igual que ocurre en el punto medial, debido a la función defensiva del globo ocular de esta estructura, se superpone sobre la córnea cuando el animal siente molestias oculares de cualquier tipo, incluso en caso de haberse aplicado anestesia tópica, dificultando así la toma de medidas en éste punto. En relación a los resultados obtenidos de la comparación del espesor corneal central y periférico respecto a los grupos de edad y peso establecidos, en ningún caso se han encontrado diferencias estadísticamente significativas (P<0,05) entre los mismos, no pudiendo llegar a afirmar que el espesor corneal en cualquiera de los puntos medidos varíe de acuerdo ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 70 al peso o a la edad. En contra de estos resultados, el estudio realizado por Gilger et al (1991)49, muestra que en la especie canina existe un aumento significativo del espesor corneal a medida que aumenta la edad y el peso de los individuos. En el presente trabajo, el análisis de regresión lineal entre la edad de los individuos y el espesor corneal en los puntos establecidos (Gráficas 2, 5, 8, 11 y 14), y de igual manera en el caso del peso (Gráficas 3, 6, 9, 12 y 15), reflejan coeficientes de correlación de Pearson indicativos de la inexistencia de correlación entre las variables edad-espesor corneal y peso-espesor corneal, en la totalidad de grupos de edad y peso estudiados (n= 16). Sobre este aspecto no se ha encontrado datos en la revisión bibliográfica efectuada. Toda la variabilidad del espesor corneal reflejada en los distintos estudios publicados, y para las diferentes variables, no es atribuible al instrumento utilizado, a la técnica o a causas iatrogénicas, ya que la paquimetría ultrasónica es una técnica que, tanto en el ser humano como en animales, muestra una mayor precisión en la medición del espesor corneal respecto a la paquimetría óptica49,50, además de presentar una alta repetibilidad entre observadores y entre sesiones83. También es posible descartar las variaciones, generadas durante la toma de medidas del espesor corneal, atribuibles a movimientos oculares propios o a causas iatrogénicas por parte de los observadores, ya que, Chan et al (1983)58 demostraron, tras un estudio con paquimetría ultrasónica en conejos, que estas variaciones son despreciables. Por último, es importante tener en cuenta que, en la bibliografía consultada, los individuos analizados pertenecen a distintas razas, además de incluir ambos sexos y mayores rangos de edad y peso, por los que los resultados obtenidos en el presente estudio no son totalmente comparables a estos análisis, ya que la muestra de perros utilizada incluye una sólo raza y sexo, por lo que dichos resultados en ocasiones no se aproximan o muestran diferencias importantes entre sí. ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 71 CONCLUSIONES ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 78 12. Petrick S, van Rensburg I. Corneal anatomical differences in the aetiology of chronic superficial keratitis. J Small Anim Pract 1989; 30(8): 449-453. 13. Funderburgh JL, Funderburgh ML, Brown SJ, Vergnes JP, Hassell JR, Mann MM, Conrad GW. Sequence and structural implications of a bovine corneal keratan sulfate proteoglycan core protein. 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ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 86 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 87 APÉNDICE I ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 94 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 95 APÉNDICE II ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 96 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 97 O ÍNDICE DE FIGURAS - FIGURA 1. Estructura básica del globo ocular ...................................................................... 17 (http://www.drsoler.com) - FIGURA 2. Esquema de la estructura en capas de la córnea ................................................ 18 (http://www.scielo.isciii.es) O ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS - FOTOGRAFÍA 1. Localización y estructura del limbo corneal ................................................. 19 (Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Argentina) - FOTOGRAFÍA 2. Estructura en capas de la córnea. Microscopía óptica (x 100) .................... 20 (Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Argentina) - FOTOGRAFÍA 3. Capa basal del epitelio corneal .................................................................... 21 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 23.) - FOTOGRAFÍA 4. Estrato epitelial intermedio, células aladas o «Wing-cells» ....................... 22 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 23.) - FOTOGRAFÍA 5. Epitelio corneal superficial en descamación con alteraciones nucleares ... 23 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 21.) - FOTOGRAFÍA 6. Estrato superficial corneal ............................................................................ 24 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 24.) ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 98 - FOTOGRAFÍA 7. Queratinocito ................................................................................................ 27 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 25.) - FOTOGRAFÍA 8. Estroma superficial y membrana de Bowman ............................................. 28 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 25.) - FOTOGRAFÍA 9. Endotelio corneal .......................................................................................... 30 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 28.) - FOTOGRAFÍA 10. Microvilis de la cara posterior del endotelio corneal ................................ 30 (Montero J. Concepto de córnea sana. In: Cezón J, editors. Técnicas de modelado corneal, desde la Ortoqueratología hasta el Cross-Linking. Sevilla: SECOIR; 2009. p. 28.) - FOTOGRAFÍA 11. Paquímetro óptico modelo Slit Lamp BX 900 (MMC Optical, Kastrup, Denmark) ............................................................................................................................. 35 (http://www.mmcoptical.dk) - FOTOGRAFÍA 12. Paquímetro ultrasónico modelo DGH 5100E (PachetteTM, DGH Technology Inc., Pennsylvania, USA) .................................................................................. 37 (http://www.dghkoi.com) - FOTOGRAFÍA 13.Oftalmoscopia indirecta (valoración segmento posterior) ........................ 42 - FOTOGRAFÍA 14. Tonometría de aplanación (medición de la presión introcular) ................ 43 - FOTOGRAFÍA 15. Oftalmoscopia directa (valoración segmento posterior) .......................... 43 - FOTOGRAFÍA 16. Examen con lámpara de hendidura del segmento anterior ...................... 43 - FOTOGRAFÍA 17. Realización del test de fluoresceína (instilación de fluoresceína y lavado con suero fisiológico) y lámpara de Wood utilizada para evidenciar reflejo verde fluorescente mediante luz ultravioleta .............................................................................. 44 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 99 - FOTOGRAFÍA 18. Instilación del colirio anestésico tópico ..................................................... 45 - FOTOGRAFÍA 19. Paquímetro ultrasónico y sonda de medición ........................................... 45 - FOTOGRAFÍA 20. Toma de medidas del espesor corneal (sonda perpendicular) ................. 46 O ÍNDICE DE TABLAS - TABLA I. Técnicas de paquimetría ........................................................................................ 34 (Molleda C. Evaluación clínica del espesor central de la córnea y la presión intraocular en el perro [tesis doctoral]. Córdoba: Universidad de Córdoba; 2009. p. 23.) - TABLA II. Espesor corneal en la especie canina (μm) ........................................................... 38 (Molleda C. Evaluación clínica del espesor central de la córnea y la presión intraocular en el perro [tesis doctoral]. Córdoba: Universidad de Córdoba; 2009. p. 30.) - TABLA III. Clasificación y número de animales según edad ................................................. 41 - TABLA IV. Clasificación y número de animales según peso ................................................. 41 - TABLA V. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 51 - TABLA VI. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) según la categoría de edad ..................................................................................................................................... 52 - TABLA VII. Valores medios del espesor corneal central (ECC, μm) según la categoría de peso ..................................................................................................................................... 53 - TABLA VIII. Valores medios del espesor corneal dorsal (EDC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 54 - TABLA IX. Valores medios del espesor corneal dorsal (EDC, μm) según la categoría de edad .............................................................................................................................................. 55 ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 100 - TABLA X. Valores medios del espesor corneal dorsal (EDC, μm) según la categoría de peso .............................................................................................................................................. 56 - TABLA XI. Valores medios del espesor corneal ventral (EVC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 57 - TABLA XII. Valores medios del espesor corneal ventral (EVC, μm) según la categoría de edad ..................................................................................................................................... 58 - TABLA XIII. Valores medios del espesor corneal ventral (EVC, μm) según la categoría de peso ..................................................................................................................................... 59 - TABLA XIV. Valores medios del espesor corneal lateral (ELC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 60 - TABLA XV. Valores medios del espesor corneal lateral (ELC, μm) según la categoría de edad .............................................................................................................................................. 61 - TABLA XVI. Valores medios del espesor corneal lateral (ELC, μm) según la categoría de peso ..................................................................................................................................... 62 - TABLA XVII. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) en los 32 ojos de los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 63 - TABLA XVIII. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) según la categoría de edad ..................................................................................................................................... 64 - TABLA XIX. Valores medios del espesor corneal medial (EMC, μm) según la categoría de peso ..................................................................................................................................... 65 - TABLA XX. Valores medios del espesor corneal central (μm) y periférico (μm) en el ojo derecho ................................................................................................................................ 67 ESTUDIO MEDIANTE PAQUIMETRÍA ULTRASÓNICA DEL ESPESOR CORNEAL EN LA ESPECIE CANINA 101 - TABLA XXI. Valores medios del espesor corneal central (μm) y periférico (μm) en el ojo izquierdo .............................................................................................................................. 68 O ÍNDICE DE GRÁFICAS - GRÁFICA 1. Histograma poblacional del ECC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio) ........................................................................................................... 51 - GRÁFICA 2. Correlación y regresión lineal del ECC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 52 - GRÁFICA 3. Correlación y regresión lineal del ECC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 53 - GRÁFICA 4. Histograma poblacional del EDC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio) ........................................................................................................... 54 - GRÁFICA 5. Correlación y regresión lineal del EDC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 55 - GRÁFICA 6.Correlación y regresión lineal del EDC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 56 - GRÁFICA 7. Histograma poblacional del EVC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio) ........................................................................................................... 57 - GRÁFICA 8. Correlación y regresión lineal del EVC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 58 - GRÁFICA 9. Correlación y regresión lineal del EVC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 59 - GRÁFICA 10. Histograma poblacional del ELC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio) ........................................................................................................... 60 ÁNGEL LUIS ORTILLÉS GONZALO 102 - GRÁFICA 11. Correlación y regresión lineal del ELC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 61 - GRÁFICA 12. Correlación y regresión lineal del ELC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 62 - GRÁFICA 13. Histograma poblacional del EMC (μm) de los 32 globos oculares estudiados (16 animales de estudio) ..................................................................................................... 63 - GRÁFICA 14. Correlación y regresión lineal del EMC (μm) y la edad (años) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................... 64 - GRÁFICA 15. Correlación y regresión lineal del EMC (μm) y el peso (kg) en los 16 animales estudiados ........................................................................................................................... 65