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Abstract
El plancton juega un papel muy importante en el ecosistema terrestre, ya que, además de ser el primer eslabón de la cadena trófica de los ecosistemas acuáticos, es el responsable de generar alrededor del 50% del oxígeno necesario para la vida en la Tierra y del 90% del oxígeno presente en océanos y mares. Además, este oxígeno, se genera en su mayor parte gracias a la fijación del CO2 atmosférico, actuando el plancton como uno de los principales sumideros de CO2 del planeta. El plancton interacciona con metales presentes en el medio, de tal forma que algunos de ellos son imprescindibles para su existencia, ya que actúan como cofactores de enzimas y/o elementos estructurales de diversas proteínas, ejemplo de ello son elementos como el Fe, el Cu, el Zn y el Co, alguno de los cuales actúa como cofactor de metaloenzimas como la anhidrasa carbónica y la fosfatasa alcalina. Por el contrario, estos mismos metales en concentraciones superiores y otros como el Cd, el Hg, el Pb y el As, pueden tener carácter tóxico para estos microorganismos. Por el importante papel que juega el plancton y a su vez los metales en el desarrollo del mismo, es importante la puesta a punto de una metodología analítica para la caracterización de las proteínas y de los metales asociados a las mismas en muestras de plancton. En este trabajo se ha realizado la determinación del contenido total de metales en muestras de plancton (BCR-414 y BIO 7120) mediante plasma de acoplamiento inductivo espectrometría de masas (ICP-MS) tras digestión ácida asistida por microondas, así como la caracterización de las proteínas presentes en ambas muestras aplicando métodos electroforéticos y de los metales asociados a las mismas mediante técnicas electroforéticas y ablación láser-ICP-MS (PAGE-LA-ICP-MS). Todo ello habiendo realizado una optimización completa tanto del proceso de preparación de las muestras de plancton, así como de la posterior separación de proteínas y el estudio de asociaciones metal-proteína bajo las técnicas citadas. Bertolín Pardos, Juan Ramón; Jiménez García-Alcalá, María Sierra; Gómez Cotín, María Teresa
Full text
MÁSTERENINVESTIGACIÓNQUÍMICA Caracterizacióndeespeciesquímicasen planctonporelectroforesissobregely ablaciónláser‐ICP‐MS JUANRAMÓNBE LÍNPARDOS RTO 11‐2Curso20 012
Dña.MªSierraJiménezGarcía‐Alcalá,ProfesoraTitulardelaUniversidaddeZaragoza,yDña.MªTeresa GómezCotín,ProfesoraTitulardelaUniversidaddeZaragoza,delDepartamentodeQuímicaAnalítica, CERTIFICAN: QuelapresenteMemoria: "Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ ICP‐MS" hasidorealizadaporD.JuanRamónBertolínPardosenelDepartamentodeQuímicaAnalíticade laFacultaddeCienciasdelaUniversidaddeZaragozabajonuestradirecciónparapresentarla comoTrabajoFindeMáster. AsimismoautorizanlapresentacióndedichaMemoriaparaqueseadefendidaanteel Tribunalcorrespondiente. Zaragoza,a3deseptiembrede2012 MªSIERRAJIMÉNEZGARCÍA‐ALCALÁ MªTERESAGÓMEZCOTÍN
tetrabajofindemásterhasidofinanciadoconcargoalproyecto“Especiaciónmultielemental químicayfuncionalennanopartículas,macromoléculasybiocoloidesenmediosacuosospseudomultifase”(CTQ2009‐14237‐CO2‐01),delMinisteriodeCienciaeInnovación. Es
ÍNDICE BSTRACT ABREVIATURAS 1.INTRODUCCIÓN 1.1Importanciadelametalómicaenmuestrasmedioambientales1‐2 1.1.1PAGE‐LA‐ICP‐MS2‐4 1.2Determinacióndemetalesasociadosaproteínasenplancton4‐6 1.2.1Determinacióndemetalesenplancton6 1.2.2Determinacióndeproteínasymetaloenzimasenplancton6‐7 2.OBJETIVOS8 3.EXPERIMENTAL 3.1Instrumentación 3.1.1Aparatosymateriales9‐10 3.1.2Instrumentos10‐11 3.2Reactivosydisolucionespatrón12‐13 3.3Muestras13 3.4Procedimientosexperimentales 3.4.1Determinacióndelcontenidototaldemetalesenplancton 3.4.1.1Digestiónácidaasistidapormicroondasdelasmuestras13‐14 3.4.1.2Determinacióndelcontenidototaldemetalesenplancton medianteICP‐MS14‐15 3.4.2Métodoselectroforéticos 3.4.2.1Preparacióndelasmuestras 15 3.4.2.1.aMétodosdeextraccióndelasproteínasdelasmuestras 15‐16 3.4.2.1.bMétodosdepreconcentraciónporultrafiltración 16‐17 A
3.4.2.1.cMétodosdepreconcentraciónporprecipitacióndelas proteínasdelosextractos17 3.4.2.1.dDeterminacióndelcontenidototaldeproteínasen disoluciónmedianteensayoBradford17‐18 3.4.2.2Métodosdeseparación 3.4.2.2.aMétodosdeseparación1D‐PAGE18 3.4.3.1Determinacióndelcontenidototaldemetalesenextractos 3.4.3.2DeterminacióndemetalesasociadosaproteínasporLA‐ICP‐MS trassuseparaciónmediante1D‐PAGE21‐22 sión óndedistintosmétodosdeextraccióny plancton27‐32 d 3.5.3.1 3.5.3.2 ssu 3.5.4.1SDS‐Tris‐Glicina‐PAGE37‐39 3.4.2.3Tratamientoposteriordelosgeles 3.4.2.3.aTincióndelosgeles18‐19 3.4.2.3.bDeterminacióndelospesosmolecularesdelas proteínas19‐20 3.4.3Determinacióndemetalesasociadosaproteínasenmuestrasdeplancton proteínicos,sinyconpreconcentración,porICP‐MS20 3.5Resultadosydiscu 3.5.1Determinacióndelcontenidototaldemetalesenelmaterialdereferencia certificadoBCR‐414yenelplanctonBIO712022‐24 3.5.2Optimizacióndelmétododepreparacióndemuestrasprevioalproceso electroforético24 3.5.2.1Comparaci preconcentraciónysuinfluenciaenlaconcentracióndeproteínas extraídasdeplancton24‐27 3.5.2.2Comparacióndedistintosmétodosdeextraccióny preconcentraciónysuinfluenciaenlaconcentracióndemetalesenlos extractosdeproteínasde 3.5.3Optimizacióndelmétododeseparación eproteínasenplancton32 SDS‐Tris‐Glicina‐PAGE33‐34 Blue‐Native‐PAGE35‐37 3.5.4Estudiodeasociacionesmetal‐proteínamedianteLA‐ICP‐MStra separaciónpor1D‐PAGE37
3.5.4.2 4.CONCLUSIONES 44‐49 6.ANEXOS 6.1Certificadodeanáli 6.2Electroforesissobre ‐ 6.2.1Realizacióndeungeldepoliacrilamida 6.2.2SD 6.2.3Bl 6.3Tincióndelo 6.3.1TinciónconazuldeCoomassie 6.4Prep Blue‐Native‐PAGE39‐41 42‐43 5.BIBLIOGRAFÍA sisdelmaterialdereferenciacertificadoBCR‐414 geldepoliacrilamidaenunadimensión(1D PAGE) S‐Tris‐Glicina‐PAGE ue‐Native‐PAGE sgeles 6.3.2Tinciónconplata aracióndelosgelesparasuanálisismedianteLA‐ICP‐MS
INTRODUCCIÓN Curso2011‐2012 2 reaccionesenzimáticasybioquímicas)queenlazanmetales,puedenliberarmetalesque posteriormentecaptenlasmetaloproteínas[3].Poresto,escadavezmásimportanterealizarun enfoquesistemáticoalestudiodelcontenidometálico,especiación,localizaciónyusoenlos organismosyecosistemasmedioambientales. Lasconcentracionesanivelestrazadelasmetaloproteínasyotrosmetalometabolitos requierenlacombinacióndetécnicasconunaaltaresoluciónenlaseparación,como cromatografíayelectroforesis,ytécnicassensiblesdedetección,comoEspectrometríadeMasas elementalymolecular.Latécnicadeseparaciónhadeproporcionarsuficienteresoluciónpara evitarlacoelucióndeotrasespeciesdelmismoelemento(cuandoseusaPlasmadeAcoplamiento Inductivo‐EspectrometríadeMasas(ICP‐MS)comotécnicadedetección)odeespecies fácilmenteionizablesqueevitenlaionizacióndelanalito(cuandoseusaMScomotécnicade detección).Elusodetécnicasacopladashacenecesarioquelasespeciesseancinéticamente inertes.Sedebetenerencuentalaestabilidadtermodinámicacuandosediseñanlascondiciones deextracciónydelafasemóvilcromatográfica. 1.1.1PAGE‐LA‐ICP‐MS ElacoplamientodeunsistemadeablaciónláseraunICP‐MS(LA‐ICP‐MS)dalugarauna técnicabastantepotenteparaunadeterminaciónrápidaymultielementaldemuestrassólidase inclusopermitellevaracabomedidasderelacionesisotópicas.Estatécnicaescapazdedetectary determinarelementosmayoritarios,minoritarioseinclusotrazasoultratrazasdelosmismosen lasmuestras[4]. LagranventajadelacoplamientodelICP‐MSalaablaciónláser,sonlasbuenas propiedadesanalíticasqueelICP‐MSposee,comosonlaaltasensibilidad,larapidez,elamplio rangodinámico(másde9órdenesdemagnitud)yespectrosrelativamentesimples[4]. Nielsenetal.[5],fueronlosprimerosendescribirelusodeunsistemadeLA‐ICP‐MSpara ladeterminacióndeCoenproteínasdesuerohumanoenriquecidopreviamenteconestemetaly separadasanteriormentepormétodoselectroforéticos. PosteriormenteMarshalletal.[6]emplearon31Pparaladeterminacióndeβ‐caseína medianteLA‐ICP‐MStrassuseparaciónelectroforética. Beckeretal[7]utilizaronestatécnicaparaladeterminacióndePySenproteínasdesuero trassuseparaciónmediante2D‐PAGEyparaladeterminaciónderelacionesP/Senproteínasde cerebrohumano[8].
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 3 anpublicadoalgunosreviewsquerecopilanlosprincipales estudiosrelacionadosconladeterminacióndemetalesasociadosaproteínasmedianteLA‐ICP‐MS, posterioresalaseparación.Porelloesnecesario desarro oesteproblema[14,15,16],enellosse recomie SODyADH)[17,18].Enestosestudiossellegóalamisma conclusiónqueentrabajosexpues ctroforesisnodesnaturalizantes) yademásmostraronquesmásrecomendableevitarprocedimientosdetinción,yaqueéstos puedenalterarlaestabilidaddeloscomplejosmetal‐proteína. Enloquerespectaapartefinaldelatécnica(LA),verFigura1,lamuestrasecolocaenuna celdadeablacióncerradaherméticamenteysobreellasehaceincidirlaradiacióndelláser.Esta radiaciónesabsorbidaporloselectronesdelasuperficie,transfiriéndoserápidamenteenforma delamuestradifundiendoacapasmásprofundasdelamisma,deestamanerase produce seconducehaciaelICPgraciasaunacorrientedeHeoAr,unavez quellega ionessondirigidoshaciaelanalizadordemasasdondesonseparadossegúnsu relación de Enlosúltimosañosseh trasespeciaciónmedianteelectroforesissobregel[9,10,11,12,13]. Unodelosproblemasquepresentaestatécnicaeslapérdidadelenlacemetal‐proteínaen proteínasenlasqueestasinteraccionesnosonlosuficientementefuertes.Estapérdidapuede producirse,nosólodurantelaseparaciónelectroforética,sinotambiéndurantelostratamientos previosdelamuestraasícomoenlosprocesos llarestrategiasparasepararproteínassinqueseproduzcanlarupturadelosenlaces metal‐proteína. Existendiferentestrabajosquehanestudiad ndanelectroforesisnodesnaturalizantesparaevitarlapérdidadelenlacemetal‐proteína. Peronosólolanaturalezadelprocesoelectroforéticopuedealterarelenlacemetal‐proteína;en nuestrogrupodeinvestigaciónseestudiótantolanaturalezadelprocesoelectroforético (electroforesisdesnaturalizanteono)comoeltipodeióndearrastreenlaelectroforesis,la intensidadaplicadaylosprocesosdeteñidoylavadoparadistintasproteínasconafinidadmetalproteínadiferente(tiroglobulina, tosanteriores(trabajarconele e deenergíaalrestodeelectronesdelamuestra.Loselectronesdemayorenergíaabandonanla superficie ncolisionesconlosátomosdelamuestraocasionandolafusiónyposteriorevaporación delamisma,esteprocesoacabagenerandounplasmadelamuestra. Esteaerosolgenerado alICPesvaporizado,atomizadoeionizado. Estos masa/cargaydetectadosposteriormente. Enelcasoquenosocupa,PAGE‐LA‐ICP‐MS,elresultadoobtenidoesunelectroferograma enelqueserecogeladistribución unelementoenfuncióndesuposiciónenelgel.
INTRODUCCIÓN Curso2011‐2012 4 rganismos,tantovegetalescomoanimales,que abitanecosistemasacuáticos. anismossuelenclasificarsedeunamanerasencillaendosclases: fitoplan solar,lamayoríahabitaaprofundidadesmenoresde50metrosysonlos Elzooplanctoneselplanctonanimal,setratademicroorganismosanimalesmuy diferentesentresícomoctenóforos,cnidarias,faseslarvariasdemoluscos,crustáceos,etc. Figura1.EsquemadeunsistemadeLA‐ICP‐MS 1.2Determinacióndemetalesasociadosaproteínasenplancton Elplanctonesunconjuntodemicroo h Estosmicroorg ctonyzooplancton. Elplanctonvegetaleseldenominadofitoplancton(delgriegophyton=planta),setratade unconjuntodemicroorganismosvegetalesqueobtienensualimentovíafotosintéticay constituyenelprimereslabóndelacadenatróficadelosecosistemasacuáticos.Debidoala necesidaddeluz responsablesdegeneraralrededordel50%deloxigenonecesarioparalavidaterrestre. Entrelasespeciesquedanlugaralfitoplanctondestacanlasdiatomeasocianobacterias. Diatomeas Cianobacterias
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 5 CO2atmosférico,porloquesetratadeunodelosprincipalessumiderosdeCO2 delplan FijacióndelCO enlosecosistemasmarinos tóxicoparaestosmicroorganismos[20]. rmarpartedelmetalomadelplancton,detal Figuraesquemáticadelostiposdeplanctonrelacionándolosconsutamaño Comoyasehacitadoanteriormenteelfitoplanctonesdevitalimportancia,yaquees responsabledegeneraralrededordel50%deloxígenonecesarioparalavidaterrestre,el90%del oxígenopresenteenmaresyocéanosy,además,esteoxígenosegeneraengranmedidaatravés delafijacióndel eta. 2 Otradelascaracterísticasdelfitoplanctonesquesetratadelprimereslabóndelacadena tróficadelosecosistemasacuáticos,seencuentrapresenteenocéanos,mares,estanques,ríos, lagosysuabundancialocalvaríaensentidohorizontal,verticalyestacionalmente[19]. Paraeldesarrollodelplanctonesnecesariaabundanteluzsolar,nutrientestalescomo nitratos,fosfatos,silicatosyalgunosmetalescomoelFe[20],Cu,Zn,Co,etc.Estosmetalessonde vitalimportanciayaqueenalgunoscasosactúancomocofactoresenlasestructurasdedistintas metaloenzimascomolaanhidrasacarbónica,lafosfatasaalcalina,etc. Porsuparte,estosmismosmetalesenconcentracionessuperioresuotrosmetalescomo elCd[21],Hg,Pb,As[22],etc,puedentenercarácter Enlosecosistemasacuáticosseproduceunequilibriodeloscontenidosentrelosmetales presentesendisoluciónylosmetalesquepasanafo
INTRODUCCIÓN Curso2011‐2012 6 formaque,unestudiodelosmetalesasociadosalplanctonpuedeserrepresentativodela contaminaciónpresenteenelecosistemaenelquehabita[20,23,24]. Portodoelloesimportantelaoptimizacióndeunmétodosencilloparalacaracterización delasproteínasydelosmetalesasociadosalasmismasenmuestrasdeplancton. 1.2.1Determinacióndemetalesenplancton Paraladeterminacióndelcontenidototaldemetalesenplancton,puedenusarsedistintas técnicasanalíticascomopuedenserlaEspectroscopíadeAbsorciónAtómicaconAtomización Electrotérmica(ETAAS)[25,26],laEspectroscopíadeEmisiónAtómicaconPlasmaÓpticode AcoplamientoInductivo(ICP‐OES)[24]oelPlasmadeAcoplamientoInductivo‐metríade Masas(ICP‐MS)[21,22],quees trabajoyaque,graciasasu ransensibilidadyrapidez,escapazdemedirlamayoríadelosmetalesenconcentracionesde nosbasadosenladigestiónácidaasistidaconmicroondasusando name scritootrosenlosquenoesnecesarioelmicroondas[23,29],en uestro parala in[ .Susventajasresidenenquese lativamentesimpleyaltamenteselectiva,porloquepuedeseraistinta palaplicaciónsedirigealacaracterizacióndesistemasbiológicosdeinterésymás oncretamentealaseleccióndebandasespecíficasdeproteínasparasusecuenciacióne entificación. Enloquerespectaalplancton,existenbastantesestudiosdelasproteínaspresentesenel Monchevaetal.[31,32],estudiaronlainfluenciadeloscambiosestacionalesenel crecimientodelfitoplancton,traslaseparaciónporelectroforesisengeldepoliacrilamidaen Espectro latécnicaquesevaautilizareneste g trazasyultratrazasrápidamente. Paralapuestaendisolucióndelplanctonodemuestrasbiológicasmarinas,sehan descritodistintosmétodos,algu uzcladeHFyHNO3[26]ounamezcladeHNO3yH2O2[27]osimplementeHNO3[22,28]. Aunquetambiénsehande ncasoseharecurridoaunadigestiónácidaasistidapormicroondasusandounamezcla4:1 (v/v)deHNO3yHCl[28]. 1.2.2Determinacióndeproteínasymetaloenzimasenplancton Tiseliusintrodujolaelectroforesisenladécadade1930comométodo caracterizacióndes stemasbiológicosdei terés30] tratadeuna técnicare plicablead s muestras. Suprinci c id mismo.
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 7 presenciadedodecilsulfatosódico(SDS‐PAGE)observaronbandasdeproteínasconpesos molecularesaparentesde14,29,40,48,60y72kDa,siendolasmásintensaslasde14y72kDaen veranomientrasqueenprimaveraeranlasde45y55kDa. Previamente,Tanoue[33,34,35,36],recogedosgruposdiferentesdeproteínasconpesos molecularesde45y5 funcióncatalizarlahidrataciónreversibledelCO2,porloqueesutilizadaporel fitoplanctonparaadquisicióndecarbonoinorgánicomediantelafotosíntesis(fijacióndeCO2).La anhidrasacarbónicacontieneZnensuestructura.Sinembargo,enlasaguas,dondeelcontenido deZnesbastantebajo,lasdiatomeaspuedenutilizarCdcomoátomometálicocatalítico[38]. Debidoasuimportancia,laanhidrasacarbónicahasidounaenzimamuyestudiada durantelosúltimosaños[39,40,41]. Lascianobacteriasconstituyenunaparteimportantedelfitoplancton,porloqueel estudiodeproteínaspresentesencianobacteriashasidoabordadopornumerososinvestigadores. Fillat,Peleatoetal.[42]observaron,porejemplo,quelosnivelesdeproteínasFur(reguladorasde lacaptacióndehierro)enlacianobacteriaAnabaenaPCC7120aumentabansignificativamenteen enzimaha racióndelasproteínaspor cnicas del puedenestarasociadasalasmismas. 5kDamedianteelectroforesisSDS‐PAGE. PalenikyKoke[37]observaronmediantebiotinilacióndeproteínasdesuperficiecelular unasubunidadde82kDaquepodríaasociarseaunaproteínareguladapornitrógeno. Porotraparte,unadelasproteínasmásimportantespresenteenelplanctonesla anhidrasacarbónica(CA),enzimaqueseencuentrapresenteengrancantidaddeorganismosvivos yquetienecomo respuestaalapérdidadenitrógeno. Otraproteínaimportanteeslasuperóxidodismutasa(SOD),yaquejuegaunpapel fundamentalenlaeliminacióndeespeciesreactivasdeoxígenoenlasmicroalgas.Esta sidoestudiadaenmuestrasde microalgasprocedentesdelaAntártidamediantePAGEnativa,lo quehapermitidovisualizarsusdiferentesisoenzimasasícomosusactividadesrelativas[43]. Elobjetivofinaldeestetrabajohasidolacaracterizacióndeproteínasydelosmetales asociadosalasproteínasenplanctonmedianteLA‐ICP‐MSpreviasepa té electroforéticas.Paraellosehantomadocomomodelosunamuestradeplancton certificado(BCR‐414)yunamuestradecianobacteriascultivadasenunlaboratorio departamentodeBioquímica(BIO7120).Todoelloimplicaundesarrollodemetodología adecuadaparaunaextraccióneficientedelasproteínasdelplanctonasícomodelosmetalesque
OBJETIVOS Curso2011‐2012 8 unpapelmuy portantealtenerdiversasfuncionescomoestabilizarlasproteínasypermitirreacciones s,deestamanera,algunosdeestosmetalesse Opti aconocerelgradodeextraccióndemetalespotencialmenteunidosa proteínasencadaunadelasmuestrasestudiadas. Opti Car Estu ínasdelasmuestrasporlosdistintosmétodoselectroforéticos. 2.OBJETIVOS Comosehavenidocomentandoenlaintroducción,elconocimientodequémetalesestán asociadosalasproteínasdelplanctonesmuyinteresantedebidoaqueéstosjuegan im enzimáticasydetransferenciadeelectrone presentancomoconstituyentesesencialesdedichosmicroorganismos. Másconcretamentelosobjetivosdeestetrabajohansido: • DeterminacióndelcontenidototaldemetalesenmuestrasdeplanctonmedianteICP‐MStras digestiónácida(HNO3‐HCl)asistidapormicroondas. •mizacióndelprocesodepreparacióndemuestraincluyendoelprocesodeextraccióny preconcentracióndeproteínas,teniendoencuentatantolamáximaextraccióndeproteínas, comoelmantenimientodelosenlacesmetal‐proteína. • Determinacióndelcontenidototaldemetalesenlasfraccionesproteicasdeplancton medianteICP‐MSpar •mizacióndelprocesodeseparacióndelasproteínasdelplanctonbasadoenelusode electroforesisengeldepoliacrilamidaenunadimensión(1D‐PAGE)tratandodemantenerel enlacemetal‐proteína. •acterizacióndelasproteínaspresentesenlasmuestrasdeplanctonycálculodesuspesos moleculares. •diodeasociacionesmetal‐proteínautilizandoPAGE‐LA‐ICP‐MStraslaseparacióndelas prote
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 9 .1INST 3.1.1Ap . • • ). • mCHR(Whatman,Maidstone,ReinoUnido). • • doble (Tesa, de • Espátulasdelaboratorioypinzasdelaboratorio. 3.EXPERIMENTAL 3RUMENTACIÓN aratosymateriales • HornomicroondasMARSHP‐500PlusDS(CEMCorporation,Matthews,EE.UU.) EstufaULM400(Memmert,Schwabach,Alemania). • AgitadororbitalRotamax120(Heidolph,Schwabach,Alemania). • AgitadorvortexReaxTop(Heidolph,Schwabach,Alemania). • Agitadormagnéticoconplacacalefactora230V(BibbySterilinStaffordshire,ReinoUnido). • Molinodebolas(Serviciodepreparaciónderocasymaterialesduros,ServiciosdeApoyoa laInvestigación,FacultaddeGeología,UniversidaddeZaragoza). Liofilizador(Telstar,Tarrasa,España)(proporcionadoporelDepartamentodeBioquímica delaUniversidaddeZaragoza CentrifugadorarefrigeradaHERAEUSMultifugeX1R(ThermoScientific,Buckinghamshire, ReinoUnido). • Micropipetas2‐20µL,20‐200µLy200‐1000µL(Crison,Barcelona,España). • FiltrosdecentrífugaAmiconUltra0.5ml,10kDa(MilliporeBedford,EE.UU.). • Papelparacromatografía3m Filmresistenteaaltastemperaturas(Albal,Madrid,España). • LáminadecierreextensibleParafilm“M”(Pechiney,Chicago,EE.UU.). • Tuboseppendorfde0,5y1,5mL. • TubostipoFalconde15y50mLconysinfaldón. Vasosdeprecipitados,botesdeplásticoyrecipientesdeplásticodedistintosvolúmenes. • Portaobjetos(Menzel‐Glaser,Braunschweig,Alemania). • Cintaadhesivade cara Hamburgo,Alemania). • Cuentagotasde plástico. • Vidrios reloj. • Probetasdedistintosvolúmenes.
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 10 Todoelmaterialutilizadoparaalbergarmuestrasydisolucionesquehandeser natemperaturade70ºC. . Seesperaaquesesequenlostubosy,unavezsecos,secierranysealmacenanparasuuso. .1.2Instrumentos Toledo,Greifensee,Suiza). BalanzaanalíticaGH‐200,precisión±0.1mg(AND,Tokio,Japón). ,HewlettPackard to,Canadá). EquipadoconconosdeNi,yundetectordeionesdetipocuadrupolo.Seutilizaronun )enelmodoconvencionaldeintroduccióndemuestraendisolución. Paraelacoplamientoconelsistemadeablaciónláser,lacámarayelnebulizadordel introducidasenelICP‐MS(tubosFalcon)sehansometidoaunprocesodelimpiezaconsistenteen: 1. SetomanlostubosFalconconsustapesysesumergenabiertosenunadisolucióndeHNO3 1:10duranteunmínimode48horas. 2. Sesacanlostubosyselimpianconaguamilli‐Q. 3. Secolocanlostubosenunabandejayseintroducenenlaestufaau 4 3 • BalanzaanalíticaPL2001‐L,precisión±0.1mg(MettlerToledo,Greifensee,Suiza). • BalanzaanalíticaAG245,precisión±0.01mg(Mettler • • pHmetromicropH2001(Crison,Barcelona,España). • EspectrofotómetroDiodeArray8452(HewlettPackard,Ginebra,Suiza). EspectrofotómetroDiodeArray8452 ParaICP‐MS • SistemaICP‐MSPerkinElmerElan6000DRC‐econmuestreadorautomáticoAS‐90/91 (PerkinElmer,Toron nebulizadordeflujocruzado(GemTipCross‐FlowIIRyton)yunacámaradenebulizacióndetipo Scott(RytonScott equiposedesconectanyseconectaelsistemadeablaciónláserconelICP‐MSmediantetubos TygonS‐50‐HLClassVIde3mmdediámetrointernoy55cmdelongitud.
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 11 ,Up213lasersystem(NewWaveResearch,Huntington,Reino Unido). orautomáticoAS‐90/91,PerkinElmer Sistem deLA‐ICP‐MS(serviciodeAnálisisQuímico,UniversidaddeZaragoza) ‐PROTEAN3ElectrophoresisCell(Bio‐Rad,Hercules, entaciónPowerPacBasicTMPowerSupply(Bio‐Rad,Hercules,EE.UU.). PowerPacBasicTMPowerSupply,Bio‐Rad ,EE.UU.). • LáserdeNd:YAG(213nm) Muestread a Paraelectroforesis • SistemadeelectroforesisMini EE.UU.). • Fuentedealim Mini‐PROTEAN3ElectrophoresisCell,Bio‐Rad • Sistemaparalarealizacióndegelesengradiente,Model475(Bio‐Rad,Hercules,EE.UU.). • SecadordegelesModel583GelDryer(Bio‐Rad,Hercules GelDryerModel58,Bio‐Ra d GradientdeliverysystemModel475,Bio‐Rad
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 18 lazuldeCoomassieG‐250aresiduosdeargininas, senlasproteínas.Estecomplejoformadoentreestosresiduos deestaforma,sepuede ordserealizaapartirdeunkitcomercial.Estekitestácompuestoporel edistintas concentraciones(0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5y2g∙mL‐1). Parareal ones,asícomo disolucionesdecdelas veces. zpreparadas, saña deBradford,seincubanduran minutosatemperatura proce dianteun pectrofotómeroU‐VISa595nm. line estemétodocomprendedesde0.12 –1mg∙mL‐1. Tantolosextractosdirectoscomolafraccióndeproteínasprecipitadas,sesometena ón1D‐PAGE. Entrabajosanterioresdelgruposehabíaoptimizadoelmétododeseparación obteniéndoselosmejoresresultadosparalaelectroforesisSDS‐Tris‐Glicina‐PAGEcomo electroforesisdesnaturalizanteparalacaracterizacióndeproteínasenplanctonyBN‐PAGEcomo nodesnaturalizanteparaelestudiodeasociacionesmetal‐proteínaenlasmuestrasdeplancton. Losprocedimientosparalapreparacióndelosgelesyunaexplicaciónmásexhaustivade ambostiposdeelectroforesisseincluyenenelAnexo6.2. 3.4.2.3Tratamientoposteriordelosgeles 3.4.2.3.aTincióndelosgeles Paralavisualizacióndelasproteínas,sehanutilizadodosprocedimientosdistintosparala tincióndelosgeles: TinciónconazuldeCoomassie:métododetinciónsencillo(Anexo6.3.1). Estemétodoestábasadoenlauniónde triptófanos,tirosinas,etc,presente yelazuldeCoomassieG‐250presentaunmáximodeabsorcióna595nm, llevaracabounacuantificacióndelasmismasmedianteespectrometríadeabsorciónmolecular. ElensayoBradf reactivoBradfordydisolucionespatróndelaproteínaalbúminadesuerobovinod m izarelensayosetoman100µLdecadaunodelospatr adauna muestrasdiluidas6 Unave sele de5mL delreactivo te 5ambienteysedasue medidame es V Elrango alde 5 3.4.2.2Métodosdeseparación 3.4.2.2.aMétodosdeseparación1D‐PAGE procesosdeseparaci
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 19 Tinción olecularesdelasproteínasseparadasmediante ‐Glicina‐PAGE. caso"SigmaMarkerwide molecularweights ativas.Estospatronesnosonmásque lospatronesylasmuestrasenlosgeles,serealizalaelectroforesisy,una vezecoslosgeles,secalculanlosRfdecadaunadelasproteínasdelpatrón(cocienteentreel este odos posibleinterpolarlosvaloresdeRfdelasproteínasde mues conplata:procesodetinciónmássensibleperomáscomplejoenlaformadeoperar (Anexo6.3.2). 3.4.2.3.bDeterminacióndelospesosmolecularesdelasproteínas Esposibleelcálculodelospesosm electroforesisdesnaturalizantescomoSDS‐Tris Paraello,sedisponendeunospatronescomerciales,ennuestro range6500‐200000Da"paralaselectroforesisdesnaturalizantesyel“Kitfor WideRange14000–500000Da”paralaselectroforesisn unamezcladeproteínasdedistintospesosmolecularesdedistintasconcentraciones. Seintroducen s desplazamientodelaproteínaenelgelyeldesplazamientodelfrentedelaelectroforesis),de meobtieneunrectadecalibradoenlaqueserepresentalogMr(logdelpesomoleculardela proteína)conrespectoalRf.Enestarectaes la traobteniendoasíellogMryposteriormentesuspesosmolecularesaproximados. EnlaFigura2semuestraunarectadecalibradoparalainterpolacióndelospesos molecularesdelasproteínasobtenidaconladisoluciónpatrónparaelectroforesis desnaturalizantederangodepesosmoleculares6500–200000Da(Sigma‐Aldrich). Figura2.Rectadecalibradoparalainterpolacióndelospesosmolecularesdelasproteínas. y=‐0.9840x+5.0996 R²=0.9911 4 5.2 5 4.8 4.6 logMr 4.4 4.2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Rf
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 20 teatendiendoasupeso .4.3De enextractosproteínicos,sinycon adodeProcedimientosExperimentales mentosquesegúnla ibliografíapuedenestarasociadosaproteínasometaloenzimasenestetipodemuestras[58]. osfueron:111Cd,114Cd,59Co,52Cr,63Cu,65Cu,54Fe,57Fe,55Mn,60Ni, Ni,206Pb,207Pb,208Pb,66Zn,67Zn,68Znyel103Rh. multielementalenlostamponesqueseemplearonen losdist loselementosdeinterésseencontrabanpordebajodelos límitesds d Sparanointroducirmásdel0,1%de ólidosdisueltosenelinstrumento.Porotrolado,lasfraccionesdeproteínasprecipitadasse irlasenelICP‐MS. Comorectadecalibrado,patróninterno,optimizaciónycondicionesinstrumentalesdel quelasexpuestasenelapartadodeProcedimientosExperimentales 3.4.1.2, HCl). Enprincipio,paralaselectroforesisnodesnaturalizantesnoesposibleelcálculodelos pesosmolecularesdelasproteínas,yaqueéstasnoavanzanúnicamen molecular,sinoquetambiéninfluyesuconformaciónysucargaelectrostática,sinembargo, cuandosetrabajaconBN‐PAGE,sisehanconseguidoestimarpesosmolecularestrabajandocon gelesengradiente[15,54,57]. 3terminacióndemetalesasociadosaproteínasenmuestrasdeplancton 3.4.3.1Determinacióndelcontenidototaldemetales preconcentración,porICP‐MS Seprocedealadeterminacióndelcontenidoelementalenlosextractosdeproteínasyen lasfraccionesdeproteínasprecipitadasobtenidosdelplanctontrasaplicarlosdiferentesmétodos deextracciónypreconcentración,explicadosenelapart 3.4.2.1.a,3.4.2.1.by3.4.2.1.c,medianteICP‐MS.Sólosedeterminaronele b Losisótoposmonitorizad 62 Previamente,serealizóladetección intosmétodosdeextraccióndelasproteínasdelplancton(Tabla3).Losresultados mostraronqueloscontenidosde edetecciónenlosdistintostampone empleados,porloque,parafacilitarlaexperiencia, sellevaacabolaeterminaciónmultielementalenlosextractosylasfraccionesdeproteínas precipitadasprocedentesdelplanctonmediantelosdistintosmétodosdeextracciónempleandola mismarectadecalibradoparatodosellos,preparadaenaguaultrapura. Paramedirelcontenidoenmetalesdelextracto,sediluyenlosextractosenuna proporción1/10(v/v)antesdeintroducirlosenelICP‐M s disuelvenenelaguaultrapuraparaintroduc ICP‐MSseutilizanlasmismas conlaexcepcióndequealarectadecalibradonoseleañadelacorrespondientematriz ácida(0.23%HNO3,0.03%
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 21 ‐MStrassuseparación ccióndelosmetalesasociadosalasproteínaspresentesenlosextractosyenlas accion sdeproteínasprecipitadastrassuseparaciónmediantelosdistintostiposde enlacemetal‐proteína,comofue ntaldurante ablac ñalalo rgode 1 1 ,F nlaTabla4serecogenlosparámetrosinstrumentalesutilizadosenladeterminaciónde me Tabla4.CondicionesinstrumentalesyparámetrosdeadquisicióndedatosdelICP‐MSparala deteccióndemetalesasociadosaproteínasmedianteLA‐ICP‐MSpreviaseparaciónporPAGE CondicionesinstrumentalesdeLA 3.4.3.2DeterminacióndemetalesasociadosaproteínasporLA‐ICP mediante1D‐PAGE Ladete fr e electroforesis1D‐PAGEserealizamedianteLA‐ICP‐MS. Ladeteccióndelosmetalesasociadosalasproteínasserealizasobregelessecosno teñidos,pues,latincióndelosgelesconllevapérdidasde demostradoanteriormenteporelgrupodeinvestigación[17]. Porlotanto,unavezsecadoelgelsinhaberllevadoacabosutinciónsecortacadacarril delgelcorrespondienteaunamuestraendosmitadesysecolocansobreunportaobjetos recubiertodecintaadhesivadedoblecaraparamantenerlasuperficiedelgelhorizo la ión.Esteportaobjetosseintroduceenlaceldadeablaciónysehaceincidirelláserconun barridoquerecorretodoelgel. Antesderealizarlamedidaserealizaunaoptimizacióndelinstrumentoqueestárecogida enelapartadodeProcedimientosExperimentales3.4.1.2. ElmaterialablacionadosearrastraconunacorrientedeArhastaelICP‐MS.Seusael13C comopatróninternoparacorregirladerivadelaseñalyseregistralaintensidaddelase la ltiempo. Losisótoposmonitorizadosfueron:1 1Cd,14Cd,59Co,63Cu 65Cu,54 e,57Fe,55Mn,206Pb, 207Pb,208Pb,64Zn,66Zn,y13C. E talesasociadosaproteínasmedianteLA‐ICP‐MS. FuentedeluzRing Energíadelláser70%(12Jcm‐2) Frecuencia20Hz Diámetrodelhazdelláser100μm MododedisparoContinuo(línea) LongituddelalíneaBarridodetodoelgel(60000μm) Caudaldegasportador(Ar)1Lmin‐1 Velocidaddebarrido60μms‐1 Profundidaddelcráter5μm
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 22 CondicionesinstrumentalesdeICP‐MS PotenciadeRF1100W Caudaldegasplasmógeno(Ar)14Lmin−1 Parámetrosdeadquisicióndedatos Barridos/lectura1 Lecturas/réplicaSegúnlongituddelíneadelláser Réplicas1 Tiempodeestanciaporcanal50ms AdquisicióndedatosSaltodepicoapico DetectorDual ModoAutolensSí Losdatosobtenidosparacadaunodelosisótoposseexportanaunsoftwareparala xhaustivadelapreparacióndelosgelesparasuanálisismediante A‐ICP‐MSestárecogidaenelAnexo6.4. .5RESULTADOSYDISCUSIÓN idototaldemetalesenelmaterialdereferenciacertificadoBCR‐ 414ye al, calibrac odeexactitudcomodeprecisiónparaelcálculo concali adquisiciónytratamientodelosdatos(Excell),dondeseconviertenlosvaloresdetiempoen distancia(teniendoencuentalavelocidaddebarridoalaquetienelugarlaablación). Porúltimo,secomparanlasseñalesdemetalobtenidasconlasbandasdeproteínas observadasenlosgelesteñidosparapoderasignarseñalesdelosmetalesaciertasproteínas. Unaexplicaciónmáse L 3 3.5.1Determinacióndelconten nelplanctonBIO7120 SellevóacaboladeterminacióndelasconcentracioneselementalestantodelBCR‐414 comodelBIO7120trasladigestiónácidaasistidapormicroondascomosehaexplicadoenlos apartadosdeProcedimientosexperimentales3.4.1.1y3.4.1.2. Seestudiaroncuatrotiposdecalibracionesdiferentes,calibraciónsimplenorm iónsimpleconpatróninterno,calibraciónponderadaycalibraciónponderadaconpatrón interno,obteniendolosmejoresresultadostant braciónponderadaconpatróninterno. Losresultadosyelerrorobtenidoparalamuestracertificadaasícomoellímitede detección(L.D.)ydecuantificación(L.C.)semuestranenlaTabla5.
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 23 BIO 7120 Tabla5.ConcentracióndemetalesenelBCR‐414yenelBIO7120obtenidosmedianteICP‐MScon calibraciónponderadaconpatróninterno BCR‐414 Coef.Corr.R 2LD (mg/kg) LC (mg/kg) Valorcertificado (mg/kg) Valorobtenido (mg/kg)%ErrorValorobtenido (mg/kg) 75As0.99990.313 1.04 ±0.286.08 ±0.36‐10.9‐6.82 111Cd0.99990.0180.0610.383±0.0140.403±0.0065.10.102±0.003 114Cd0.99990.0140.0460.383±0.0140.417±0.0039.00.102±0.003 59Co0.99810.0060.0201.43±0.06*1.59±0.0210.917.5±1.5 52Cr0.99810.1210.40423.8±1.224.8±3.64.21.19±0.12 63Cu0.99920.0320.10729.5±1.329.4±0.5 ‐0.333.7±3.3 65Cu0.99850.0310.10429.5±1.329.8±0.21.034.1±3.3 54Fe0.999011.237.51850±190*1647±355 ‐10.95384±466 57Fe0.99943.6212.11850±190*1878±3261.65477±481 55Mn0.99770.2670.890299±13303±0.31.5930±87 60Ni0.99860.0440.14718.8±0.821.1±0.112.45.60±0.35 62Ni0.99980.0970.32418.8 ±0.8 19.7±0.14.95.31±0.33 206Pb0.99950.0710.2363.97±0.193.38±0.06‐14.81.66±0.29 207Pb0.99930.0680.2273.97±0.193.55±0.08 ‐10.71.73±0.32 20.99900.0510.1713.97±0.193.58±0.15‐9.81.69±0.3408Pb 66Zn0.99990.2060.688111.6±2.598.1±2.5 ‐12.166.5±8.4 67Zn0.99992.628.72111.6±2.583.4±2.5‐25.255.7±7.9 68Zn0.99990.2000.667111.6±2.5100.2±3.9 ‐10.268.5±8.0 * ndicativos valores i Encolormarrónfiguranloselementosquesonmásabundantesenelmaterialdereferenciace BCR‐414en comparaciónconelplanctonBIO7120. Encolorazulfiguranloselementosquesonmásabundantesenelpl rtificado anctonBIO7120conrespectoalmaterialde encia Nofiguranlosresultadosobtenidosparalosdosblancosdeextracciónporquesus resultadosfuerondespreciables,esdecir,laadicióndemetalesolasinterferenciasdebidasala ntosaexcepcióndelFe,elMn,elCuyelCo. deregresiónentre0.9977y0.9999. Conrespectoaloslímitesdedeteccióndecirquesonbajosenlamayoríadelosisótopos (<0.267mg∙kg )aexcepcióndealgunoscomoFe(11.2mg∙kg ),Fe(3.62mg∙kg ),As(0.313 mg∙kg‐1),67Zn(2.62mg∙kg‐1),enlosquesonmásaltosdebido,engranmedida,a presencia contaminación: Fe Cl 1N refer certificadoBCR‐414. adicióndelHNO3ydelHClsobrelasmuestrasnosonsignificativas. Comosepuedeobservar,elmaterialdereferenciacertificadoBCR‐414poseemayor cantidaddelagranmayoríadeeleme CabedestacartambiénlosaltoscontenidosdeFeyMndelplanctonBIO7120. Lasrectasdecalibradosonbuenas,concoeficientes ‐154 ‐157 ‐175 mg∙kg‐1),51V(2.24 la deinterferenciaespectraleso54 (37 16O H+,40Ar14 +,...); 57Fe
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 24 Ar16O Loserrorescometidosenladeterminacióndeloselementosdelmaterialdereferencia cer ra lala alenplanctonmediantedigestiónácidaasistidapormicroondase delmétododepreparaciónde ioalprocesoelectroforético osinicialesparalaextracciónde CR‐414secomenzó procedimientodeextracción labibliografíaparalaextracciónde muestrasbiológicascomoalga rojasmarinas[59]omuestrasdepezgato almétodoutilizadoseledenominóMétodo1yeltampóndeextracciónutilizadoesTris‐HCl enpresenciadeinhibidordeprotea porrealizarelproceso cciónatemperaturaconstantede4ºC, favoreciendolaestabilidaddelasproteínas. ormenteseestudióelefectode tiempoytipodeagitación,realizandotres agitaciónmecánicadurante24hdurante48horas, sdurante20segundos, iendolosmejoresresultadostrabajando ánicadurante48horas. ezoptimizadosestosparámetros,antinuación,secompararondistintosmétodos eextracción(usandodistintostamponesdeextracciónperomanteniendolaagitaciónmecánica durante 3.5.2.1 inacióndelcontenidototaldeproteínastantodelos xtractosdirectoscomodelasfraccionesdeproteínasprecipitadasdelplanctonBCR‐414. (40 1H+,40Ar17O+,...);75As(40Ar35Cl+,38Ar37Cl+,...);51V(35Cl16O+,38Ar13C+,36Ar15N+,...)y67Zn (35Cl16O2+,33S34S+,contaminación...). tificadoBCR‐414sonengeneralbajos(<11%),dependiendodelosisótoposqueseutilicenpa cuantificacióndelelemento,porloquepodemosconcluirqueelmétodoutilizadopara determinaciónmultielement ICP‐MSesadecuado. 3.5.2Optimización muestrasprev Enestudi lasproteínasdelplanctonB trabajandoconun descritoen proteínasendistintas s [51], 25mMpH7.5 sas. Enestecasoseoptó deextra Posteri l experiencias:oras,agitaciónmecánica agitaciónconultrasonido obten conagitaciónmec Unavco d 48horasa4ºC),depreconcentraciónypurificacióndelosextractosatendiendoasu eficienciaenlaextraccióndeproteínasydelosmetalesasociadosalasmismas. Comparacióndedistintosmétodosdeextracciónypreconcentraciónysuinfluenciaenla concentracióndeproteínasextraídasdeplancton Conelobjetodedeterminarcuáleselmétododeextraccióndeproteínasmáseficientese realizóunensayoBradfordparaladeterm e
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 25 oenelapartadodeProcedimientosExperimentales3.4.2.1.a, s3.4.2.1.d. lospatronesdealbúminadesuerobovinoparala La calibrado nida y=0.5783; 901 Elnealde méto arca5mg∙ 1mg 1de Pa probaractitu méto pararo oluc deal e ntrac ocida, mouzclaa,mi inhi detr nocida. Lostamponesdeextracciónutilizados(verTabla3)asícomolosprocesosquesehande llevaracabosehanresumid 3.4.2.1.b,3.4.2.1.c. Elprocedimientodemedidadelasmuestrasydelarealizacióndelarectadecalibrado estáexpuestoenelapartadodeProcedimientosExperimentale EnlaFigura3semuestranlosespectrosdeabsorciónobtenidosparalospatronesde albúminadesuerobovino. Figura3.Espectrosobtenidosenlamedidade realizacióndelarectadecalibrado 2.5 0.125mg/ml 0.5mg/ml rectade obte fue: 1.0200x+R=0.9 2 rangoli estedoab desde0.12 mL‐1hasta ∙mL‐proteínas. racom laex ddel do,sepre ndosdis ionesbúminad conce ióncon asíco name dealbúmin oglobinaebidoripsina. EnlaTabla6semuestranlosresultadosobtenidosparacadaunadelasdisolucionesde proteínasdeconcentraciónco 0 0.5 1 1.5 2 59 790 Abs Longitu (nm) 0.75mg/ml 1mg/ml 1,5mg/ml 2mg/ml 190 290 390 490 0 690 ddeonda
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 26 mL‐1 ensayoBradford ‐1Error(%) Tabla6.Resultadosdelcontenidoenproteínasdelasdisolucionesdeconcentración conocidamedianteelensayoBradford ConcentraciónrealConcentración (mg∙)(mg∙mL ) Albúmina10.2220.2397.4 Albúmina20.8940.844‐5.5 Mezcla (Alb+Mio+Inh.Trip)0.4980.461‐7.5 Loserrorescometidosenladeterminacióndelcontenidototaldeproteínasenlasdistintas disolucionessonmenoresdel7.5%. Enlaa7figuranlosresultadosobtenidosenladeterminacióndelacantidadtotalde proteínastantoenlosextract sdirectoscomoenlaracc óndeproteínasprecipitadas. Tabl of i Tabla ‐1‐1 7.DeterminacióndelaconcentracióndeproteínasmedianteensayoBradford Extractosdirectos(mg∙g )Proteínasprecipitadas(mg∙g ) Método115.7±0.115.5±0.4 Método2A13.9±0.4‐ Método2B12.6±0.315.2±0.1 Método2A’12.4±0.112.5±0.3 Método313.2±0.211.9±0.3 Alavistadelosresultadosobtenidossepuedeconcluirquelaseficienciasdeextracción delosdistintosprocesossonsimilaresaunquemedianteelMétodo1seobtieneunaeficiencia algomayor. ParadeterminarlainfluenciadelTrisenelprocesodeextracción,secomparaelMétodo 2A(5mMdeTris),contenidomenordeTris,yelMétodo2A´(25mMdeTris)observándosecomo laextracciónmedianteelMétodo2A(13.9 mg∙g )fuealgomayorqueconelMétodo2A´(12.4 mg∙g )confirmandolosresultadosobtenidospreviamenteporSchmidtetal.[53]. EnloquerespectaalainfluenciadelSDS(1%)enelprocesodeextracción,puede observarsecomo,lapresenciadeésteeneltampóndeextracción(Método2B)(12.6mg∙g‐1)no llevaasociadounaumentosignificativodelacapacidaddeextraccióndeproteínas(Método2A) (13.9mg∙g).LapresenciadeSDSsuponeunamayorextraccióndeproteínasdemembrana hidrofóbicasporloquelafraccióndeestetipodeproteínasnoessignificativaenestetipode muestrasdeplancton. ‐1 ‐1 ‐1
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 27 nasdeplancton distintos método anresumidoenelapartadodeProcedimientosExperimentales3.4.2.1.a, 3.4.2.1. larectadecalibrado stáexp rescertificadosdeconcentracióndelosmetalesqueesmásprobable ncontrarunidosaproteínasenestetipodemuestras(Cd,Co,Cu,Pb,Zn)[58],vemosqueenel B mg∙kg‐1Pb).Portanto,esde ntracióndeposiblesmetales asociadosaproteínasseantodavíainferioresaestasconcentracionestotales. EnlaTabla8serecogenlosporcentajesdeextraccióndemetalesparacadaunodelos métodosdeextracciónutilizadostantoenlosextractosdirectoscomoenlasfraccionesde proteínasprecipitadasconacetona. EnlasFiguras4y5serecogenlosresultadosdelos%deextraccióndemetalesexpuestos enlaTabla8,peroenformadegráfico. Otradelasconclusionesquesepuedenextraerdeestasexperienciasesquela precipitaciónconacetonanoocasionaunapérdidasignificativadeproteínas,porloquepuedeser recomendableparapreconcentrarypurificarlosextractosdirectosoultrafiltradosantesdesu introducciónenlosgelesdeelectroforesis. 3.5.2.2Comparacióndedistintosmétodosdeextracciónypreconcentraciónysuinfluenciaenla concentracióndemetalesenlosextractosdeproteí Estaexperienciaserealizóconelobjetodedeterminarcuáleselmétododeextracción queescapazdeextraermayorcantidaddemetales,paraello,serealizaronmedidasdelos extractosdirectosasícomodelasfraccionesdeproteínasprecipitadas(extraídosporlos sdeextraccióndescritosenlaTabla3)delBCR‐414medianteICP‐MS. Lostamponesdeextracciónutilizados(verTabla3)asícomolosprocesosquesehande llevaracaboseh b,3.4.2.1.c. Elprocedimientodemedidadelasmuestrasydelarealizaciónde euestoenelapartadodeProcedimientosExperimentales3.4.3.1. Observandolosvalo e CR‐414algunossonbastantesbajos(0.383mg∙kg‐1Cd,1.43mg∙kg‐1Co,29.5mg∙kg‐1Cu,3.97 esperarquelosnivelesdeconce
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 34 Tabla10.PesosmolecularesdelasproteínasobservadasenelBCR‐414yenelBIO7120 BCR‐414BIO7120 114kDa 109kDa 101kDa105kDa 97kDa 69kDa67kDa 60kDa 54kDa56kDa 46kDa49kDa 42kDa kDa35 36kDa 31kDa 30kDa30kDa 28kDa26kDa 21kDa21kDa 18kDa 13kDa Seobservanalgun paraelBCR‐414yelBIO 7120,debidoaque,probablemente,poseanproteínassimilaresensusmicroorganismos. Además,enamboscasos,elgruesodelasproteínasencontradopresentapesos molecularesdeentre13y69kDa,algoquesecorrespondeconlopropuestoporotrosautores [59,60],queencontraronproteínasdeentre14y72kDasiendolasprincipalesbandasde proteínasobtenidaslasde14,29,37,48,60y72kDa. Unadelasposiblesproteínasobservadaseslaanhidrasacarbónica.Estaproteínaposee unpesomolecularaproximadode30kDaycumpleunafunciónmuyimportantedurantela fotosíntesis[31,61]. assimilitudesentrelosresultadosobtenidos
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 35 3.5.3.2Blue‐Native‐PAGE Comosehacitadoenanterioresocasiones,laelectroforesisBN‐PAGEesunaelectroforesis nodesnaturalizantequeutilizalatricinacomoióndearrastre.Estetipodeelectroforesisfacilitala preservacióndelenlacemetal‐proteínayaqueserealizaencondicionesmenosdrásticas, preservandotantolacargacomolaconformacióndelasproteínas. SerealizólaseparacióndelasproteínasextraídastantoparaelBCR‐414comoparaelBIO 7120aplicandoelmétododescritoenelAnexo6.2.3. ParalaextracciónseaplicóelMétodo1,conultrafiltraciónyprecipitación,lostres métodosseencuentrandescritosenlosapartadosProcedimientosExperimentales3.4.2.1.a, 3.4.2.1.by3.4.2.1.c. Seoptimizóelporcentajedebis/acrilamidadelosgelesrealizandodistintas pruebasy %bis/acrilamida4‐20%. Aunqueenestetipodeelectroforesislasproteínasavanzanatendiendo,nosóloasus carga(yaquenoestán observandoenquegelseobteníaunamejorresolución.Detalformaseprobarondistintas opciones. Blue‐Native‐PAGE,gelesengradienteparaconseguirmayorresoluciónenmuestrascon grancantidaddeproteínasdistintas[15,57,62]: • %bis/acrilamida4‐14% • %bis/acrilamida4‐16% • %bis/acrilamida4‐20% • %bis/acrilamida8‐16% Seobtuvomayorresoluciónparaelgelde pesosmolecularessinoquetambiéninfluyensuconformaciónysu desnaturalizadas),algunosautoreshanestimadosuspesosmoleculares[15,54,57]trabajandoen gradienteyutilizandopatronesespecialesparaelectroforesisnodesnaturalizantes. TantoenlaFigura9comoenlaTabla11semuestranlosresultadosobtenidosparael BCR‐414yelBIO7120enlaelectroforesisBlue‐Native‐PAGE4‐20%bis/acrilamidaengradiente trastinciónconazuldeCoomassie.
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 36 Figura E4‐20%bis/acrilamidaengradientetras a)BCR‐414b)BIO7120 BCR‐414BIO7120 9.Determinacióndelospesosmolecularesdelasbandasdeproteínasenlosextractostras separaciónmedianteelectroforesisBlue‐Native‐PAG tinciónconazuldeCoomassieparaela)BCR‐414yelb)BIO7120 Patrón Tabla11.PesosmolecularesdelasproteínasobservadasenelBCR‐414yenelBIO7120 397kDa 324kDa324kDa 229kDa229kDa 196kDa 182kDa 139kDa 92kDa 85kDa 65kDa65kDa 52kDa 43kDa 40kDa 26kDa24kDa 20kDa 17kDa 14kDa14kDa Enestecaso,losresultadosdelBCR‐414ydelBIO7120difierenalgomásqueenlaSDS‐ Tris‐Glicina‐PAGE,sobretodoporqueseobtienemenorresoluciónenlaseparacióndelas proteínas,aúnasí,puedenobservarseciertasproteínasqueposeensimilardesplazamiento
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 37 electroforético,algunadeduceaunaseñalbast nsacomopuedenserlas proteínasde324,229,65,40,26 y14kDa. 3.5.4Estudiodelasasociacio tal‐proteínamedianteLA trassuseparaciónpor1D‐ PAGE Porúltimo,seproce estudiodeasociacionesmoteínamedianteLA‐ICP‐MS resumidoenelAnexo6.4,tras métodoselectroforéti explicadosenelapartadode Anexos6.2.2y6.2.3. 3.5.4.1SDS‐Tris‐Glicina‐PAGE Paralaextraccióndroteínas,tantodeBCR‐414moelBIO7120,seutilizóel tinuaciónserealizólaultrafiltracióndelosextractosdirectosyposteriormentese precipit llevaron anális ‐414 eñalesdeambosmetalessecorrespondenconelfrentedelaelectroforesis. Estosdatoscorroboranlosresultadosobtenidosenanterioresestudiosrealizadospor uestrogrupodeinvestigaciónconproteínaspurasasociadosametalestrabajandomedianteSDS‐ ris‐Glicina‐PAGE,enestosestudios,sepruebaquetrabajandoconestetipodeelectroforesis uedeproducirseroturadelenlacemetal‐proteínasiéstosnosonlosuficientementefuertes, aciendoquelosmetalesavancenconelfrentedelaelectroforesis[17]. Noseobtienenseñalessignificativasparalosdemásisótoposmonitorizados. ellas,con anteinte nesme ‐ICP‐MS dióaletal‐pr losdistintos cos elaspco Método1.Acon aronsusfraccionesproteicas.Despuéssesepararonsusrespectivasfraccionesproteicas medianteelectroforesisSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE4‐10%debis/acrilamida(Anexo6.2.2)yse aisporLA‐ICP‐MS. PLANCTONBCR LosresultadosobtenidosparaelplanctonBCR‐414semuestranenlaFigura10. EnelcasodelBCR‐414,sóloseobservanseñalessignificativasparaCuyZn.Comose puedeobservar,lass n T p h
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 38 NBIO7120 elplanctonBIO7120semuestranenlaFigura11. ,ademásdelasseñalesdeCuyZnenelfrentedela unasseñalesdeFeyMncorrespondientesalabandade aparaelFe,algoqueeradeesperartraslosaltoscontenidos actosdirectosodeproteínas recipit licina‐PAGE. Figura 10.ResultadosobtenidosmedianteLA‐ICP‐MSpreviaseparaciónporSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE 4‐10%debis/acrilamidaparaelplanctonBCR‐414 PLANCTO Losresultadosobtenidospara EnelcasoelplanctonBIO7120 electroforesis,seobservantambiénalg 114‐97kDaparaelMnyde49‐36kD deestoselementosobtenidosenlosanálisisdetotalesydelosextr p adas. Sinembargo,lasseñalesmásintensasseencuentranenelfrentedelaelectroforesis,pues esposiblequeestosenlacesmetal‐proteínanoseanlosuficientementefuertescomopara soportarlascondicionesdesnaturalizantesnecesariasenlaelectroforesisSDS‐Tris‐G Noseobtuvieronseñalessignificativasparalosdemásisótoposmonitorizados.
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 39 Figura11.ResultadosobtenidosmedianteLA‐ICP MSpreviaseparaciónporSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE 3.5.4.2Blue‐Native‐PAGE Paralaextraccióndroteínas,tantodeBCR‐41 oelBIO7120,seutilizóel riormenteserealizólaultrafiltracióndelosextractosdirectosyacontinuaciónse precipit ‐ 4‐10%debis/acrilamidaparaelplanctonBIO7120 49‐36kDa 114‐97kDa elasp4com Método1.Poste aronsusfraccionesproteicas.Despuéssesepararonsusrespectivasfraccionesproteicas medianteelectroforesisBlue‐Native‐PAGE4‐20%debis/acrilamidaengradiente(Anexo6.2.3)yse llevaronaanálisisporLA‐ICP‐MS.
EXPERIMENTAL Curso2011‐2012 40 LosresultadosobtenidosparaelplanctonBCR‐414semuestranenlaFigura12. CucomoparaelZnaparecenseñalesasociadasalasproteínasconpesos olecularesaltos≈92kDayparalasproteínasdemenorespesosmoleculares26‐20kDa.Es nidaparalaseñaldeCu. tenidosmedianteLA‐ICP‐MSpreviaseparaciónporBlue‐Native‐PAGE4‐ 20%debisacrilamidaengradienteparaelplanctonBCR‐414 osresultadosobtenidosparaelplanctonBIO7120semuestranenlaFigura13. araelplanctonBIO7120seobservaronseñalesdeCu,Zn,FeyMn. nelcasodelZnyelMnlasseñalesaparecenendosbloques,primeramenteasociadasa proteínasdepesosmolecularesbastantealtos,100‐85kDa,yposteriormenteunseñalmuyancha, queabarcaproteínasdemenorespesosmoleculares,85‐24kDa. resoluciónnoesmuybavanzanmás despacioyseobtienenpeoresresoluciones. PLANCTONBCR‐414 EnelcasodelBCR‐414únicamenteseobtuvieronseñalesdeCuyZn,peroenestecasosi esposibleasociarlasadeterminadasproteínas. Tantoparael m destacablelaaltasensibilidadobte Noseobtuvieronseñalessignificativasparalosdemásisótoposmonitorizados. Portanto,podemosconcluirquelamuestradeplanctonBCR‐414tieneCuyZnasociados alasbandasdeproteínasdepesomolecular≈92yde26‐20kDa. Figura12.Resultadosob PLANCTONBIO7120 L P E CabedestacarlaaltaintensidaddelaseñaldeMnaunquecomopuedeobservarse,la uenadebidoaque,altrabajarconBN‐PAGE,lasproteínas 26‐20kDa 26‐20kDa ≈92kDa≈92kDa
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 41 ElCuporsuparteapareceasociadoaproteínasdepesosmolecularesmedios,85‐43kDa, enunaseñalbastantepequeña,difícildedistinguirdelblanco. PorúltimoelFe,apareceasociadoaproteínasdemenorespesosmoleculares,65‐24kDa, resultadosimilaralobtenidotraslaelectroforesisSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE. Noseobtienenseñalessignificativasparalosdemásisótoposmonitorizados. Portanto,podemosconcluirqueelplanctonBIO7120tieneZnyMnasociadoalasbandas deproteínasde100‐24kDa,Cuasociadoaproteínasentre85‐43kDayFeasociadoabandasde proteínasentre65‐24kDa. Figura13.ResultadosobtenidosmedianteLA‐IC MSpreviaseparaciónporBlue‐Native‐PAGE4‐ 20%debisacrilamid planctonBIO7120 P‐ aengradienteparael 85‐24kDa 85‐43kDa100‐85kDa 85‐24kDa 100‐85kDa85‐24kDa
CONCLUSIONES Curso2011‐2012 42 4.CONCLUSIONES Acontinuación,semuestranlasconclusionesmásimportantesamododeresumen: • Ladeterminaciónmultielementalenmuestrasdeplancton(BCR‐414yBIO7120)mediante ICP‐MStrasdigestiónácida(HNO3+HCl)asistidapormicroondashaproporcionadobuenas exactitudesconerroresinferioresal11%paracasitodoslosisótoposestudiados,además,se obtuvieronbuenoscoeficientesdecorrelaciónconvaloresdeR>0.997utilizandocalibración ponderada 103Rhcomopatróninterno. • Sehaoptimizadoelprocedimientodeextraccióndelasproteínasdeunamuestracertificada deplancton(BCR‐414)estudiandolainfluenciadefactorescomoeltipodeagitación,la concentracióndeTrisylapresenciadereactivoscomoSDS,TCEPyPVP,paraposteriormente llevaracabolaseparacióndelasmismasmediantetécnicaselectroforéticas.Estaoptimización sehabasadoenlamáximaextraccióndeproteínas,asícomoenelmantenimientodelenlace metal‐proteína.Elmétododeextracciónque,engeneral,proporcionómejoresresultadosen cuantoalaextraccióntantodeproteínascomodemetalesfueelqueutilizabauntampónde ueconteníaTris25mMeinhibidordeproteasas5mg∙mL‐1conagitación mecánicadurante48horas.Seobtuvieronporcentajesdeextracción,engeneralbastante el2%paraPbhastael45%paraCuenfraccionesdeproteínasde plan 7120. • Sehaoptimizadoelprocesodeseparacióndelasproteínasdelplanctonbasadoen1D‐PAGE, llegandoalaconclusióndequelaelectroforesisSDS‐Tris‐Glicina‐PAGEeslatécnicamás adecuadaparalacaracterizaciónyteínas,mientrasquelaelectroforesis BN‐altratarse deunaelectroforesisnodesnaturalizante,favorecequeelenlacemetal‐proteínasemantenga. con extracciónq bajos,quevandesde ctoncuyoscontenidoerande15mg∙g‐1. • Sehadeterminadoelcontenidototaldemetalesenlasfraccionesproteicasdelplancton medianteICP‐MS,obteniendomayoresconcentracionesdeCd,Cu,NiyZnparaelBCR‐414y deCo,Fe,MnyPbparaelBIO separacióndelaspro PAGEeslamásidóneaparaelanálisisdelosgelesmedianteLA‐ICP‐MS,yaque
Caracterizacióndeespeciesquímicasenplanctonporelectroforesissobregelyablaciónláser‐ICP‐MS Curso2011‐2012 43 • Se araelBIO7120medianteelectroforesisSDS‐Tris‐ Glici 4comoparaelBIO7120,seobtienen entr N‐PAGEse obs •s medianteLA‐IC deCuyZn enelfrentede trofo rompen enlacesmetal‐p )yedelBIO 7120seobtuvieronseñalesdeCu,ZnymásintensamenteFeyMn;lasseñalesdeCuyZnse observarontambiénenelfrentedelaelectroforesis,lasseñalesdeMnseobtuvieronenla bandadeproteínascorrespondientea114‐97kDayenmayormedidaenelfrentedela electroforesisylasseñalesdeFeaparecieronenlabandadeproteínasde49‐36kDayenel frentedelaelectroforesis.Estoindicaqueenlaelectroforesisdesnaturalizantesesigue observandorupturadeenlacemetal‐proteínatambiénparaestamuestra. • TraslaseparaciónporBN‐PAGE,electroforesisnodesnaturalizante,yanálisismedianteLAICP‐MSseobtuvoparalamuestraBCR‐414,CuyZnasociadosabandasdeproteínasconpesos moleculares≈92kDay26‐20kDa. 120seobtuvoZnyMnasociadoalas ban entre65‐ 24k molecularesde85‐43 kDa. hancaracterizadolasproteínaspresentesenlamuestrasysehancalculadosuspesos moleculares,tantoparaelBCR‐414comop na‐PAGEóBN‐PAGE,obteniendoenamboscasosresultadossimilaresalosexpuestosen labibliografíaparamuestrasdeplancton.TraslaelectroforesisSDS‐Tris‐Glicina‐PAGEla mayoríadelasproteínas,tantoparaelplanctonBCR‐41 epesosmolecularesde69a13kDa;mientrasquetraslaelectroforesisB ervan,enamboscasos,señalesintensasparalospesosmolecularesde324,229,65,40,26 y14kDa. AlsepararlasfraccionesproteicasporSDS‐Tris‐Glicina‐PAGEyllevaracaboelanálisi P‐MSdecirque,enelcasodelBCR‐414sóloseobtuvieronseñales nelcasolaelec resis(se los roteína ParalamuestraBIO7 dasdeproteínasconpesosmolecularesde100‐24kDa,Feasociadoabandasde DayenmenormedidaCuasociadoabandasdeproteínasconpesos
ANEXOS
ANEXO6.1CERTIFICADODEANÁLISISDELALDEREFERECIACERTIFICADOBCR‐414MATERI
NEXO6.2ELECTROFORESISSOBREGELDEPOLIACRILAMIDAENUNADIMENSIÓN(1D‐PAGE) 6.2.1Realizacióndeungeldepoliacrilamida ParalarealizacióndelosgelesseempleaelkitMini‐PROTEAN®3ElectrophoresisCellde BioRadysesiguenlassiguientesinstrucciones: Selavanamboscristalesconaguamilli‐Qyposteriormenteconetanol.Sedejansecar. Secolocanloscristalesunosobreelotroysesujetanconlaspinzasespecialesdetalforma quequedensujetoscomoindicalafigura. 3. Asuvez,serealizalamezclade electroforesis,aguayenalgunoscasos 4. SeborboteaN2gassobrelamezclade enladisolución,yaqueelO2librepued reaccióndepolimerización. 5. Seviertesobrelamezclalascantidadesadecuadasdepersulfatoamónico(APS),queactúa comoiniciadordelareaccióndepolimerizaciónydeN,N,N’,N’‐tetrametilendiamina(TEMED), queactúacomopropagadordelareacción. 6. Seagitalamezclayconlaayudadeuncuentagotasounmicropipetaseadicionasobreel huecodejadoporlosdoscristalesdondesevaallevaracabolapolimerización. 7. Seañadeel“peine”queharáque,unavezpolimerizadoelgel,queden“pocillos”donde posteriormentepodránintroducirselasmuestrasdisueltaseneltampóndecarga. 8. Transcurridosalrededorde30minutos,yasedisponedelgelperfectamentepolimerizado. A 1. 2. losreactivos(acrilamida/bisacrilamida,tampónde SDS)enunvasodeprecipitados. éstosdurante5‐10minutosparaeliminarelO2disuelto eactuarcomotrampaderadicaleslibresparalizandola
9. Unavezpolimerizadoelgel,setomanlosgeles,seretirandelaspinzasy,siguiendolas instruccionesquefiguranenlapáginaanterior,secolocansobrelacéluladeelectroforesis. 10. Unavezcolocadoslosgelesenlaceldade electroforesis,seañadenlostamponesde electroforesis,tantoelcatódicocomoelanódico, seretiranlos“peines”yseadicionanlasmuestras encadaunodelos“pocillos”ayudadosdeuna micropipetaydelapiezadenominada“sample loadingguide”. 11. Porúltimo,sóloquedaconectarlaceldadeelectroforesisalafuentedecorrienteeléctrica PowerPacBasicTMPowerSupplydeBio‐Radyllevaracabolaelectroforesisavoltaje constante(hasta300v)oaintensidadconstante(hasta400mA). Segúneltipodeelectroforesisconlaqueestemostrabajando,sepuedenproducir variacionesenelprocedimientoderealizacióndelgel: ‐PAGE:sesueledividirenelseparadoryenelgelconcentrador(conun%debisacrilamida muchomenor)conloqueseconsigueunaetapadepreconcentracióndelasmuestrasy,portanto, laresoluciónylareproducibilidaddelasbandasdelasproteínasobtenidas. ‐PAGE:sesueletrabajarcongelesengradiente.Para elloseutilizaelsistemaderealizacióndegelesen radiente"Model475"deBio‐Rad. Model475GradientDeliverySystem,Bio‐Rad Tantolarealizacióndelosgelescomolaoptimizacióndelporcentajedebis/acrilamidaen losgelesdelaelectroforesisBlue‐Native‐PAGEesunprocesobastantelaborioso. Elgradientedeconcentracióndebis/acrilamidadelosgelessehaceconayudadeun istemaformadordegradiente(Model475Bio‐Rad).Paraellosepreparandosdisoluciones,una onelmáximoporcentajedebis/acrilamidaquesedeseateneralfinaldelgel,yotraconel SDS mejorar BN g s c
mínimoporcentajedebis/acrilamidaquesedeseateneralprincipiodelgel.Estasdisolucionesse viertenentrelasplacasconayudadelsistemadeformacióndegradientesparaquepolimericen. Sellenandosjeringascon5mLdelasdisolucionesdealtaybajadensidadrespectivamente.Una vezmontadoelsistemaderealizacióndelosgelesyunidoalasjeringassevagirandolaruedadel sistemaformadordegradientes,estegirovamodificandolaproporcióndelasdisolucionesquese vanadicionandoentrelasdosplacasdevidriodondevaapolimerizarelgel,deestemodose formaungelengradientedebis/acrilamidaenlosgelesquevadesdeelporcentajedela disolucióndealtadensidad(enlapartefinaldelgel)hastaelporcentajedeladisolucióndebaja densidad(enelprincipiodelgel). A.‐Celdadeelectroforesis. B.‐“Peines”. C.‐“Sampleloadingguide”. D.‐Piezaparalarealizacióndegeles. Mini‐PROTEAN®3ElectrophoresisCell,Bio‐Rad
6.2.2SDS‐TRIS‐GLICINA‐PAGE Setratadeuntipodeelectroforesisdesnaturalizante,esdecir,lasproteínaspierdensus estructurastridimensionalesytomanconformacioneslineales[63]. Paraello,lasmuestrassesometenauntratamientotérmicodecalor(5minutosa≈90ºC), selesañadeSDS,quecumplelamisióndedesnaturalizaryposteriormenterecubrirlaproteínayel 2‐mercaptoetanolqueactúacomoagentereductorrompiendolospuentesdisulfuroquedandolas proteínasseparadasencadenaslinealespolipeptídicas. Comocaracterísticaprincipaldestacarquelacaracterizacióndelasproteínasyla determinacióndesuspesosmolecularesessencilla,yaque,altenerlasproteínasdesnaturalizadas ycubiertasporSDS,todasellasposeenlamismarelaciónmasa/carga,deestamanera,avanzana lolargodelgelatendiendoúnicamenteasutamañoynoasuconformaciónniasucargaespacial. Elpuntodébildeestetipodeelectroforesisesquelaadicióndealgunosreactivos(SDS,2‐ mercaptoetanol),eltratamientoprevioalquesesometenlasmuestras(≈90ºCdurante5‐10 minutos)oeliónconductordelaelectroforesis(glicina)puedenocasionarlarupturadelos enlacesointeraccionesmetal‐proteína. AcontinuaciónfiguranlaTabla1ylaTabla2enlasqueserecogenlacomposicióndelos tampones,disolucionesygelesutilizadosenlarealizacióndelaSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE. Tabla1.ComposicióndetamponesydisolucionesempleadasenSDS‐Tris‐Glicina‐PAGE Tampóndelgelseparador(4x) 1,5MTris‐HClpH8,8 Tampóndelgelconcentrador(4x) 0,5MTris‐HClpH6,8 Tampóndeelectroforesis 25mMTris 192mMGlicina 0,1%(p/v)SDS pH8,3 50mMTris‐HClpH6,8 2,4%(p/v)SDS Tampóndecarga20%(v/v)Glicerol 5%(v/v)2‐mercaptoetanol 0,02%(p/v)Azuldebromofenol SDS20% 20%(p/v)SDS APS10% 10%(p/v)APS
Tabla2.Composicióntantodelgelconcentradorcomodelgelseparador Gelconcentrador Gelseparador %Bisacrilamidaenelgel→ 4% 10%12%18% TampónGELx4(mL)2.5 2.52.52.5 Aguamilli‐Q(mL)6.04 4.013.341.34 30%Bisacrilamida(mL)1.33 3.3346 SDS20%(µL)50 50 5050 APS10%(µL)100 100100100 TEMED(µL)5 5 55 endos ador)yotrafasedelgelenlaqueseproducela Estetipodegelesserealizancongelconcentrador,esdecir,losgelesserealizan fases,unafasedelgelqueúnicamentetienecomomisiónpreconcentrarparamejorarla resoluciónylareproducibilidad(gelconcentr separacióndelasproteínas(gelseparador). Laelectroforesisserealizaaintensidadconstantede30mA.
6.2.3BLUE‐NATIVE‐PAGE Estaelectroforesispertenecealgrupodelasnodesnaturalizantes,esdecir,lasproteínas espacial[64]. etodeevitarreactivos,tratamientosdela romperlosenlacesointeracciones ezcan,lomáximoposible,ensuestado slatricina. quepresentaestetipodeelectroforesisesladeterminacióndelospesos ónfiguranlaTabla3ylaTabla4enlasqueserecogenlacomposicióndelos Tabla3.ComposicióndetamponesydisolucionesempleadasenBlue‐Native‐PAGE Tampóndelgel(10x)500mMBis‐Tris‐HClpH7,0 nopierdensuestructuratridimensionaloconformación Estetipodeelectroforesisserealizaconelobj muestraoionesconductoresdelaelectroforesisquepuedan metal‐proteína,intentandoquelasproteínasperman natural. Eliónconductordeestetipodeelectroforesise Elproblema molecularesdelasproteínas,yaqueéstasavanzanenelgelatendiendoasupesomolecular,su conformaciónysucargaelectrostática,porloquelacaracterizacióndelasproteínasporpesos molecularesesbastantecomplicada. Acontinuaci tampones,disolucionesygelesutilizadosenlarealizacióndelaBlue‐Native‐PAGE. Tampóncatódicodeelectroforesis (conCoomassie) 15mMBis‐Tris 50mMTricina 0,02%(p/v)CoomassieBrilliantBlueG‐250 pH7,0 Tampóncatódicodeelectroforesis (sinCoomassie) 15mMBis‐Tris 50mMTricina pH7,0 50mMBis‐Tris Tampónanódicodeelectroforesis pH7,0 Tampóndecarga 50mMBis‐Tris 20%(v/v)Glicerol 0,35%(p/v)CoomassieBrilliantBlueG‐250 pH7,0 APS10%10%(p/v)APS